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Carlos Alberto Castillo Sarmiento

MECANISMOS DE REGULACIN DE LOS RECEPTORES DE ADENOSINA Y METABOTRPICOS DE GLUTAMATO EN CLULAS NEURONALES Y DE GLA.
IMPLICACIN EN PROCESOS DE EXCITOTOXICIDAD Y MUERTE CELULAR

I.S.B.N. Ediciones de la UCLM 978-84-8427-711-8

Cuenca, 2009

FacultaddeCienciasQumicas DepartamentodeQumicaInorgnica,OrgnicayBioqumica

MecanismosdeRegulacindelosReceptoresdeAdenosinay MetabotrpicosdeGlutamatoenClulasNeuronalesydeGla. ImplicacinenprocesosdeExcitotoxicidadyMuerteCelular.


CarlosAlbertoCastilloSarmiento

Marzo2009

FacultyofChemistry DepartmentofInorganic,OrganicandBiochemistry

RegulationofAdenosineReceptorsandMetabotropicGlutamate ReceptorsinCorticalNeuronsandGlia. RoleinExcitotoxicityandCellularDeath.


CarlosAlbertoCastilloSarmiento

March2009

Da.MairenaMartnLpez,CatedrticaE.U.deBioqumicayBiologaMoleculardela Escuela Universitaria de Enfermera y D. Jos Luis Albasanz Herrero, Profesor Contratado DoctordelaFacultaddeCienciasQumicas,ambosprofesoresdelDepartamentodeQumica Inorgnica,OrgnicayBioqumicadelaUniversidaddeCastillalaMancha,

Certifican:
QueeltrabajodeinvestigacintituladoMecanismosdeRegulacindelosReceptores deAdenosinayMetabotrpicosdeGlutamatoenClulasNeuronalesydeGla.Implicacin enprocesosdeExcitotoxicidadyMuerteCelularconstituyelaMemoriadeD.CarlosAlberto CastilloSarmiento,LicenciadoenBioqumicaporlaUniversidadAutnomadeMadrid,para optaralgradodeDoctorenCienciasQumicas. As mismo, certifican que este trabajo ha sido realizado bajo su tutela en el departamento de Qumica Inorgnica, Orgnica y Bioqumica de la Facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad de Castilla la Mancha, y que cumple todos los requisitos necesariosparasupresentacin. Paraqueasconste,firmanelpresentecertificadoenCiudadReala18deDiciembre de2008. Fdo.Dra.MairenaMartnLpez

Fdo.Dr.JosLuisAlbasanzHerrero


ParaPoloyJuanInMemoriam. DespusdeengaaraCaronteconelcambio sefueronadarguerraalotroladodelalagunaEstigia.


Unavezms,noquedasinobatirse ArturoPrezReverte,ElCapitnAlatriste.

EltrabajoaquexpuestohasidorealizadoensutotalidadenellaboratorioDra.CuberoLlabrs,del readeBioqumicadelaFacultaddeCienciasQumicasdelaUniversidaddeCastillalaMancha,conayuda deunabecapredoctoralparalaFormacindePersonalInvestigadorotorgadaporlaConsejeradeEducacin yCienciadelaJuntadeComunidadesdeCastillaLaMancha. PartedeltrabajorecogidoenlapresenteMemoriahasidoplasmadoenlassiguientespublicaciones cientficas: CastilloC.A.,AlbasanzJ.L.,FernndezM.yMartnM.(2007)EndogenousexpressionofadenosineA1,A2and A3receptorsinratC6gliomacells.NeurochemRes32,10561070. Iglesias I., Castillo C. A., Len D., Ruiz M. A., Albasanz J. L. y Martn M. (2007) Metabotropic glutamate receptor/phospholipaseCsysteminfemaleratheart.BrainRes1153,111. Len D., Castillo C. A., Ruiz M. A., Albasanz J. L. y Martn M. (2007) Metabotropic glutamate receptor/phospholipaseCpathwayisincreasedinratbrainattheendofpregnancy.NeurochemInt50, 681688. CastilloC.A.,LenD.,RuizM.A.,AlbasanzJ.L.yMartnM.(2008)ModulationofadenosineA(1)andA(2A) receptorsinC6gliomacellsduringhypoxia:involvementofendogenousadenosine.JNeurochem. Len D., Albasanz J. L., Castillo C. A. y Martn M. (2008a) Effect of glutamate intake during gestation on adenosine A(1) receptor/adenylyl cyclase pathway in both maternal and fetal rat brain. J Neurochem 104,435445. LenD.A.,AlbasanzJ.L.,CastilloC.A.,IglesiasI.yMartnM.(2008b)Effectofchronicgestationaltreatment with the adenosine A1 receptor agonist Rphenylisopropyladenosine on metabotropic glutamate receptors/phospholipaseCpathwayinmaternalandfetalbrain.JNeurosciRes86,32953305. CastilloC.A.,AlbasanzJ.L.,LenD.,JordnJ.,PallsM.,CaminsA.yMartnM.(2009)Relatedexpressionof AdenosineReceptorsinBrainfromtheSenescenceAcceleratedMouse.ExpGerontol(enviado). Lorenzo A.M., Len D., Castillo C. A., Ruiz M. A., Albasanz J. L. y Martn M. (2009) Maternal caffeine intake during gestation and lactation downregulates adenosine A1 receptor in rat brain from mothers and neonates.JNeurosciRes(enviado). Castillo C. A., Len D., BallesterosYez I, Iglesias I., Martn M y Albasanz J. L. (2009) Glutamate differently modulates metabotropic glutamate receptors natively expressed in neuronal and glial cells. Eur J Neurosci(enviado). LenD.,CastilloC.A.,AlbasanzJ.L.yMartnM.(2009)DownregulationanddesensitizationofadenosineA1 receptor/adenylylcyclasepathwayafterchronicRPIAintakeduringpregnancy.Neuroscience(enviado).

NDICEDECONTENIDOS NDICEDEILUSTRACIONES......................................................................................................................................V NDICEDETABLAS...................................................................................................................................................V NDICEDEFIGURAS...............................................................................................................................................VII ABREVIATURAS.....................................................................................................................................................XIII Resumen................................................................................................................................................................XV Abstract................................................................................................................................................................XIX Introduccin............................................................................................................................................................1 I.1.ReceptoresacopladosaprotenasGodesietedominiostransmembrana.................................................3 I.1.1.EstructuradelosGPCRs........................................................................................................................5 I.1.2.ClasificacindelosGPCRs.....................................................................................................................6 I.1.3.LasuperfamiliadelasGTPasas.MecanismosdetransduccindelosGPCRs.......................................7 I.1.4.RegulacindelosGPCRs.....................................................................................................................11 I.2.Elglutamatoysusreceptores.....................................................................................................................13 I.2.1.Clasificacindelosreceptoresmetabotrpicosenfuncindesuestructura,bioqumicay farmacologa................................................................................................................................................14 I.2.2.Papelfisiolgicodelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato.....................................................18 I.3.LaadenosinaenelSistemaNerviosoCentral.............................................................................................20 I.3.1.Receptoresdeadenosina:clasificacin,localizacin,rutasdesealizacinyfuncionesenelSNC....22 I.3.2.Papelfisiolgicodelaadenosina:fenotiposdelosratonesKnockout..............................................25 I.4.Neurodegeneracin:Procesosdemuerteneuronal..................................................................................27 I.4.1.Excitotoxicidad....................................................................................................................................28 I.4.2.Efectodeladisponibilidadbiolgicadeoxgeno................................................................................30 I.4.3.ElpptidoamiloideylaenfermedaddeAlzheimer............................................................................31 I.4.4.Efectosdelestrsoxidativo................................................................................................................35 I.4.5.Envejecimientoymuertecelular........................................................................................................37 Objetivos...............................................................................................................................................................39 MaterialesyMtodos...........................................................................................................................................43 III.1.Materiales.................................................................................................................................................45 III.2.Animales...................................................................................................................................................45 III.3.CultivocelulardelalneaC6.....................................................................................................................46 III.4.Cultivosprimariosdeneuronascorticalesdecerebroderata.................................................................47 III.5.Aislamientodemembranasplasmticas..................................................................................................48 III.6.ReaccinencadenadelaPolimerasaclsica...........................................................................................50 III.7.ReaccinencadenadelaPolimerasacuantitativa...................................................................................50 III.8.Determinacindereceptoresmetabotrpicosdeglutamatomedianteensayosdeuninde L[3H]Glutamatoenclulasintactas.................................................................................................................52

III.9.Determinacindelosreceptoresdeadenosinamedianteensayosdeuninde[3H]DPCPXo [3H]ZM241385enclulasintactas....................................................................................................................53 Ensayosdeuninde[3H]DPCPX................................................................................................................53 Ensayosdeuninde[3H]ZM241385.........................................................................................................53 III.10.Determinacindelosreceptoresdeadenosinamedianteensayosdeuninde[3H]DPCPXo [3H]ZM241385enmembranasplasmticas......................................................................................................54 Ensayosdeuninde[3H]DPCPX................................................................................................................54 Ensayosdeuninde[3H]ZM241385.........................................................................................................54 III.11.Determinacindelaactividadadenilatociclasa.....................................................................................54 III.12.Ensayodeviabilidad:testbasadoenMTT..............................................................................................55 III.13.Ensayodeactividadcaspasa3...............................................................................................................56 III.14.Electroforesisengelesdepoliacrilamidaencondicionesdesnaturalizantes:PAGESDS.......................56 III.15.Inmovilizacindeprotenas:transferenciaamembrana.Inmunodeteccindeprotenas....................56 III.16.Ensayosdeinmunofluorescencia............................................................................................................58 III.18.Evaluacindelamorfologanuclear.......................................................................................................60 III.19.Determinacindelaconcentracindeprotena....................................................................................60 III.20.Anlisisdelosparmetroscinticos.......................................................................................................60 III.21.Anlisisestadsticodelosdatos..............................................................................................................61 III.22.Dilucindelosreactivoscomerciales.....................................................................................................61 Resultados.............................................................................................................................................................63 IV.1ExpresinycaracterizacindelosreceptoresenclulasC6.....................................................................65 a) b) ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato.....................................................................................65 Receptoresdeadenosina................................................................................................................65

IV.2ExcitotoxicidadinducidaporGlutamato...................................................................................................73 IV.2.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza...................................................................................73 a) b) c) d) Efectoenlaviabilidad.....................................................................................................................74 ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato.....................................................................................75 Receptoresdeadenosina................................................................................................................82 Tablaresumen.................................................................................................................................89

IV.2.2EnclulasC6degliomaderata.........................................................................................................90 a) b) c) d) Viabilidad. .......................................................................................................................................91 . ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato.....................................................................................92 Receptoresdeadenosina................................................................................................................98 Tablaresumen...............................................................................................................................103

IV.3EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC.........................................................................................104 IV.3.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza.................................................................................104 a) b) Viabilidad. .....................................................................................................................................105 . Receptoresmetabotrpicosdeglutamato...................................................................................107

II

c) d)

Receptoresdeadenosina. ............................................................................................................117 . Tablaresumen..............................................................................................................................128

IV.3.2EnclulasC6degliomaderata.......................................................................................................130 a) b) c) d) Efectoenlaviabilidadcelular.......................................................................................................130 ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato..................................................................................131 Receptoresdeadenosina. ............................................................................................................136 . Tablaresumen..............................................................................................................................146

IV.4Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide....................................................................................147 IV.4.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza.................................................................................147 a) b) c) d) Viabilidad......................................................................................................................................147 ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato..................................................................................150 Receptoresdeadenosina. ............................................................................................................158 . Tablaresumen..............................................................................................................................164

IV.4.2EnclulasC6degliomaderata.......................................................................................................165 a) b) c) d) Efectoenlaviabilidad...................................................................................................................165 ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato..................................................................................169 Receptoresdeadenosina. ............................................................................................................174 . Tablaresumen..............................................................................................................................179

IV.5Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno. .................................179 . IV.5.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza.................................................................................179 a) b) c) d) Efectoenlaviabilidadcelular.......................................................................................................180 ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato..................................................................................181 Receptoresdeadenosina. ............................................................................................................188 . Tablaresumen..............................................................................................................................193

IV.5.2EnclulasC6degliomaderata.......................................................................................................193 a) b) c) d) Efectoenlaviabilidadcelular.......................................................................................................194 ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato..................................................................................195 Receptoresdeadenosina. ............................................................................................................199 . Tablaresumen..............................................................................................................................202

IV.6Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimientoacelerado....................203 Discusin.............................................................................................................................................................209 V.1.ExpresinycaracterizacindelosreceptoresdeadenosinaenclulasC6............................................211 V.2.ExcitotoxicidadinducidaporGlutamato.................................................................................................214 V.2.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza..................................................................................214 V.2.2EnclulasC6degliomaderata........................................................................................................218 V.3.EfectodelahipoxiasobrelasclulasdeSNC..........................................................................................222 V.3.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza..................................................................................222 V.3.2EnclulasC6degliomaderata........................................................................................................228

III

V.4.Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide....................................................................................233 V.4.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza..................................................................................233 V.4.2EnclulasC6degliomaderata........................................................................................................238 V.5.Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno...................................242 V.5.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza..................................................................................242 V.5.2EnclulasC6degliomaderata........................................................................................................245 V.6.Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimientoacelerado....................248 Conclusiones........................................................................................................................................................253 Bibliografa...........................................................................................................................................................257 NotadelAutor.....................................................................................................................................................277

IV

NDICEDEILUSTRACIONES Ilustracin1:RepresentacinesquemticadeunGPCR. .......................................................................................4 . Ilustracin2:ModelodeactivacindeunGPCR. ...................................................................................................5 . Ilustracin3:Aspectosestructuralesmsrelevantesdelas3principalesfamiliasdeGPCRs................................7 Ilustracin4:ElciclodelasprotenasG..................................................................................................................9 Ilustracin5:LosGPCRestnacopladosalafamiliadelasprotenasG...............................................................10 Ilustracin6:ModeloclsicodeinternalizacindelosGPCR...............................................................................12 Ilustracin7:LafosforilacindiferencialdelosGPCRimplicalaactivacindemecanismosefectores caractersticos............................................................................................................................................13 Ilustracin8:ActivacindelosreceptoresmGludelgrupoI................................................................................16 Ilustracin9:CascadasdesealizacininducidasporlaactivacindelosreceptoresmGlu...............................17 Ilustracin10:ModosdeactivacindelosreceptoresmGludelosgruposII/IIIpresinpticos...........................20 Ilustracin11:Representacinesquemticadelasenzimasytransportadoresqueregulanlosnivelesde adenosina...................................................................................................................................................22 Ilustracin12:ComunicacinneuronaglamediadaporlosreceptoresA1yA2A.................................................24 Ilustracin13:Rutasdescritasdesupervivenciaymuertecelular.......................................................................28 Ilustracin14:Sucesosgeneralesqueocurrenenlamuerteporexcitotoxicidad................................................29 Ilustracin15:VariossensoresdeoxgenocontrolanlaactividaddeHIF1.......................................................30 Ilustracin16:ProcesamientodelaprotenaAPPyeventosclavesenlapatognesisdelaenfermedadde Alzhemier...................................................................................................................................................34 Ilustracin17:Neurotoxicidadinducidaporelpptidoamiloide.........................................................................35 Ilustracin18:GeneracinanmaladeROS.........................................................................................................36 Ilustracin19:EnsayosdeinmunoflourescenciaenlasclulasC6.......................................................................47 Ilustracin20:Imgenesrepresentativasencontrastedefasesdeldesarrollodeuncultivoprimariode neuronasdecortezadecerebroderata....................................................................................................48 Ilustracin21:Imgenesrepresentativasdeexperimentosdeinmunofluorescenciaa16DIV(I).......................49 Ilustracin22:Imgenesrepresentativasdeexperimentosdeinmunofluorescenciaa16DIV(II)......................49 NDICEDETABLAS Tabla1:ResumendelasrutasdetransduccinprincipalesyfarmacologadelosmGluRs.................................15 Tabla2:ResumendelacoplamientoaprotenasG,farmacologayprincipalesfuncionesfisiolgicasdelos receptoresdeadenosina. ..........................................................................................................................27 . Tabla3:CebadoresutilizadosparalaPCRenlaamplificacindecadagen.........................................................51 Tabla4:Resumendelosanticuerposprimariosysecundariosascomodesuprocedenciayladilucin empleadaparalainmunodeteccindeprotenasporlatcnicadeWesternblot....................................57

Tabla5:Resumendelosanticuerposprimariosysecundariosascomodesuprocedenciayladilucin empleadaparalainmunodeteccindeprotenas. ....................................................................................59 . Tabla6:ResumendelosparmetroscinticosobtenidosenneuronascorticalesexpuestasaLGlu..................77 Tabla7:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenneuronas corticalesexpuestasaLGlu.......................................................................................................................79 Tabla8:ResumendelosresultadosobtenidosenneuronascorticalesexpuestasaLGlu...................................90 Tabla9:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenclulasC6 expuestasaLGlu........................................................................................................................................93 Tabla10:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenclulasC6 expuestasaLGlu........................................................................................................................................95 Tabla11:ResumendelosresultadosobtenidosenclulasC6expuestasaLGlu..............................................104 Tabla12:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenneuronas corticalesexpuestasahipoxiamoderda..................................................................................................108 Tabla13:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenneuronas corticalesexpuestasahipoxiamoderada................................................................................................110 Tabla14:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenneuronas corticalesexpuestasaadenosina1M. ..................................................................................................114 . Tabla15:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenneuronas corticalesexpuestasareoxigenacin.......................................................................................................116 Tabla16:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[3H]DPCPXenneuronas corticalesexpuestasahipoxiamoderda..................................................................................................118 Tabla17:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[3H]ZM241385enneuronas corticalesexpuestasahipoxiamoderda..................................................................................................119 Tabla18:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[3H]DPCPXenneuronas corticalesexpuestasaadenosina1M. ..................................................................................................124 . Tabla19:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[3H]ZM241385enneuronas corticalesexpuestasaadenosina1M. ..................................................................................................126 . Tabla20:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosparalos receptoresdeadenosinaenneuronascorticalesexpuestasareoxigenacin.........................................128 Tabla21:Resumendelosresultadosobtenidosenneuronascorticalesexpuestasahipoxia...........................129 Tabla22:Resumendelosresultadosobtenidosenneuronascorticalestratadasconadenosina.....................130 Tabla23:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenclulasC6 expuestasahipoxiamoderda. .................................................................................................................132 . Tabla24:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenclulasC6 expuestasahipoxiamoderda. .................................................................................................................135 . Tabla25:ResumendelosresultadosobtenidosenclulasC6expuestasahipoxiamoderada.........................146 Tabla26:ResumendelosresultadosobtenidosenclulasC6expuestasahipoxiamoderada.........................147

VI

Tabla27:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenneuronas corticalesexpuestasaA2535...................................................................................................................152 Tabla28:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenneuronas corticalesexpuestasaA2535...................................................................................................................155 Tabla29:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[3H]DPCPXenneuronas corticalesexpuestasaA2535...................................................................................................................159 Tabla30:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[3H]ZM241385enneuronas corticalesexpuestasaA2535...................................................................................................................160 Tabla31:ResumendelosresultadosobtenidosenneuronascorticalesexpuestasaA253525M..................164 Tabla32:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenclulasC6 expuestasaA2535...................................................................................................................................173 Tabla33:ResumendelosresultadosobtenidosenclulasC6expuestasaA253525M................................179 Tabla34:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenneuronas corticalesexpuestasaH2O2. ....................................................................................................................182 . Tabla35:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenneuronas corticalesexpuestasaH2O2. ....................................................................................................................184 . Tabla36:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[3H]DPCPXenneuronas corticalesexpuestasaH2O2. ....................................................................................................................189 . Tabla37:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[3H]ZM241385enneuronas corticalesexpuestasaH2O2. ....................................................................................................................190 . Tabla38:ResumendelosresultadosobtenidosenneuronascorticalesexpuestasaH2O2...............................193 Tabla39:ResumendelosresultadosobtenidosenclelulasC6expuestasaH2O2. ............................................203 . NDICEDEFIGURAS Figura1.DeteccindelosreceptoresdeAdenosinaenclulasC6.PanelA........................................................66 Figura2:CuantificacinporPCRatiemporealdelaexpresindereceptoresA1,A2A,A2ByA3......................67 Figura3:Uninespecficade[3H]DPCPXamembranasyaclulasintactas.........................................................68 Figura4:Uninespecficade[3H]ZM241385amembranasyaclulasintactas..................................................68 Figura5:DeteccindelasprotenasGienclulasC6...........................................................................................69 Figura6:LosreceptoresA1estnacopladosaunaprotenasensibleaPTX.........................................................70 Figura7:ActividadACenclulasC6......................................................................................................................71 Figura8:EfectodeCGS21680enlaactividadACenclulasC6intactas.............................................................71 Figura9:EfectodeNECAenlaactividadACenclulasC6intactas......................................................................72 Figura10:LosreceptoresA2estimulanlaactividadACatravsdeunaprotenaGs. ........................................73 . Figura11:LaexposicinaLGludisminuyelaviabilidadcelular...........................................................................74 Figura12:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresindecaspasa3.........................................................75 Figura13:LaexposicinaLGlumodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular........................76

VII

Figura14:LaexposicinaLGlumodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular........................77 Figura15:InmunodeteccindemGluyPLC1traslaexposicinaLGlu..............................................................78 Figura16:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresingnicademGlu1,mGlu5yPLC1...........................80 Figura17:LaexposicinaLGlunovaralaactividadPLC.....................................................................................81 Figura18:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaactividadAC...........................................................................82 Figura19:LaexposicinaLGluregulaalalzalosreceptoresA1(I)......................................................................83 Figura20:LaexposicinaLGluregulaalalzalosreceptoresA1(II).....................................................................83 Figura21:LaexposicinaLGluregulaalalzalosreceptoresA1(III)....................................................................84 Figura22:LaexposicinaLGluregulaalalzalosreceptoresA2A.........................................................................85 Figura23:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresingnicadeA1,A2AyA2B...........................................86 Figura24:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaactividadAC...........................................................................87 Figura25:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresingnicadelosfactoresdetranscripcinCREBy CREM..........................................................................................................................................................89 Figura26:LasclulasC6sonresistentesalaexposicinaLGlu100M.............................................................91 Figura27:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresindecaspasa3. ........................................................92 . Figura28:LaexposicinaLGlumodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelulardelasclulasC6. ....................................................................................................................................................................92 Figura29:InmunodeteccindemGluyPLC1......................................................................................................94 Figura30:LaexposicinaLGlumodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular........................94 Figura31:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresingnicademGlu1yPLC1.......................................96 Figura32:LaexposicinaLGlunovaralaactividadPLC.....................................................................................96 Figura33:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaactividadAC...........................................................................97 Figura34:LaexposicinaLGlumodulalosreceptoresA1enlasuperficiecelulardelasclulasC6...................98 Figura35:LaexposicinaLGlumodulalosreceptoresA2AenlasuperficiecelulardelasclulasC6.................99 Figura36:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresingnicadelosreceptoresdeadenosina..............101 Figura37:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaactividadAC.........................................................................102 Figura38:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresingnicadelosfactoresCREByCREM...................103 Figura39:Efectodelahipoxiamoderadasobrelaexpresindecaspasa3........................................................105 Figura40:Laexposicinahipoxiamoderadadisminuyelaviabilidadcelular....................................................106 Figura41:Laexposicinahipoxiamoderadadesencadenaprocesosapopticos.............................................107 Figura42:Laexposicinahipoxiamoderadamodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular..108 Figura43:InmunodeteccindemGluyPLC1traslaexposicinahipoxiamoderada.......................................109 Figura44:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaexpresingnicademGlu1,mGlu5yPLC1....111 Figura45:LaexposicinahipoxiamoderadanoafectalaactividadPLCbasal. .................................................111 . Figura46:Laexposicina5%O2noafectaalafuncionalidaddelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI..112 Figura47:Efectodelaexposicina5%O2sobrelaactividadAC.......................................................................113 Figura48:Laexposicinaadenosinamodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular..............114

VIII

Figura49:Comparativaentrelosparmetroscinticosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligando alsometerlasneuronascorticalesa5%O2oaadenosina1M.............................................................115 Figura50:Laexposicinahipoxiaproduceefectosreversiblessobrelosreceptoresmetabotrpicosde glutamato.................................................................................................................................................116 Figura51:LaexposicinahipoxiamoderadamodulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular.......................117 Figura52:LaexposicinahipoxiamoderadamodulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular.....................119 Figura53:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaexpresingnicadeA1,A2AyA2B...................120 Figura54:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaexpresingnicadelosfactoresHIF1,HIF3, CREByCREM............................................................................................................................................121 Figura55:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaactividadAC....................................................122 Figura56:LaexposicinaadenosinamodulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular. ..................................123 . Figura57:Comparativaentrelosparmetroscinticosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligando alsometerlasneuronascorticalesa5%O2obienaadenosina1M.....................................................124 Figura58:LaexposicinaadenosinamodulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular..................................125 Figura59:Comparativaentrelosparmetroscinticosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligando alsometerlasneuronascorticalesa5%O2obienaadenosina1M.....................................................126 Figura60:LaexposicinahipoxiaproduceefectosreversiblessobrelosreceptoresA1deadenosina.............127 Figura61:LaexposicinahipoxianoproduceefectosreversiblessobrelosreceptoresA2Adeadenosina......128 Figura62:LasclulasC6resistenlabajadaenladisponibilidaddeoxgeno......................................................131 Figura63:Laexposicinahipoxiamoderadamodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular.132 Figura64:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaexpresingnicademGlu1yPLC1................133 Figura65:LaexposicinahipoxiamoderadanoafectalaactividadPLCbasal..................................................133 Figura66:Laexposicina5%O2noafectaalafuncionalidaddelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI..134 Figura67:Laexposicinaadenosinamodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular..............135 Figura68:Comparativaentrelosparmetroscinticosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligando alsometerlasclulasC6a5%O2obienaadenosina1M....................................................................136 Figura69:LaexposicinahipoxiamoderadamodulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular.......................137 Figura70:EfectodelahipoxiamoderadasobrelaactividadACbasalysuinhibicinmediadaporelreceptorA1. .................................................................................................................................................................137 Figura71:MovilizacindelcalcioenclulasC6..................................................................................................139 Figura72:LaexposicinahipoxiamoderadamodulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular.....................139 Figura73:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaactividadACestimuladaporlosreceptoresA2. .................................................................................................................................................................140 Figura74:LaexposicinaadenosinamodulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular. ..................................141 . Figura75:LaexposicinaadenosinamodulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular..................................142 Figura76:Efectodelaadenosinadesaminasadurantelahipoxia. ....................................................................143 . Figura77:Lamodulacindelosreceptoresdeadenosinadurantelahipoxiamoderadaseproduceatravsde laactivacindelreceptorA1....................................................................................................................144

IX

Figura78:Efectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaexpresingnicadelosreceptoresde adenosina.................................................................................................................................................145 Figura79:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaexpresingnicadelosfactoresHIF1,HIF3, CREByCREM............................................................................................................................................145 Figura80:LaexposicinaA2535disminuyelaviabilidadcelulardeformadependientedelaconcentraciny deltiempodeexposicin.........................................................................................................................148 Figura81:LaexposicinaA142disminuyelaviabilidadcelulardeformasimilaralaexposicinaA2535.......149 Figura82:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresindecaspasa3.....................................................149 Figura83:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaactividaddecaspasa3.......................................................150 Figura84:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular....................151 Figura85:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnicademGlu1,mGlu5yPLC1.......................152 Figura86:InmunodeteccindemGluyPLC1traslaexposicinaA2535. ........................................................154 . Figura87:LaexposicinaA2535noafectalaactividadPLCbasal.....................................................................155 Figura88:LaexposicinaA2535afectaalafuncionalidaddelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI.......156 Figura89:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaactividadACbasal.............................................................157 Figura90:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaactividadACmediadaporlosreceptoresmGlu................158 Figura91:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular..........................................159 Figura92:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular.........................................160 Figura93:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnicadeA1,A2AyA2B......................................161 Figura94:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaactividadACmediadaporlosreceptoresdeadenosina...162 Figura95:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnicadelosfactoresCREByCREM. ...............163 . Figura96:LaexposicinaA2535disminuyelaviabilidadcelular(I)...................................................................166 Figura97:LaexposicinaA2535disminuyelaviabilidadcelular(II)..................................................................166 Figura98:ResumendelefectoobservadoporexposicinaA2535eneltiempo. .............................................167 . Figura99:LaexposicinaA142disminuyelaviabilidadcelulardeformasimilaraA2535...............................167 Figura100:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaactividaddecaspasa3.....................................................168 Figura101:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresindecaspasa3...................................................169 Figura102:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular..................170 Figura103:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnicademGlu1yPLC1.................................171 Figura104:InmunodeteccindemGlu1,mGlu5ymGlu2,3traslaexposicinaA2535(I)...................................172 Figura105:InmunodeteccindemGlu1,mGlu5ymGlu2,3traslaexposicinaA2535(II)..................................173 Figura106:InmunodeteccindePLC1traslaexposicinaA2535....................................................................174 Figura107:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular........................................175 Figura108:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular......................................176 Figura109:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnicadeA1,A2A,A2ByA3...............................177 Figura110:ElefectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnicadelosfactoresCREByCREMdepende deltiempodeexposicin.........................................................................................................................178

Figura111:LaexposicinaH2O2disminuyelaviabilidadcelulardeformadependientedelaconcentracinydel tiempodeexposicin...............................................................................................................................180 Figura112:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresindecaspasa3......................................................181 Figura113:LaexposicinaH2O2modulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular....................182 Figura114:InmunodeteccindemGlu1,mGlu5ymGlu2,3traslaexposicinaH2O2..........................................183 Figura115:LaexposicinaH2O2noafectalaactividadPLCbasal......................................................................184 Figura116:LaexposicinaH2O2afectaalafuncionalidaddelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI.......185 Figura117:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnicademGlu1,mGlu5yPLC1.......................186 Figura118:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaactividadACbasal..............................................................187 Figura119:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaactividadACmediadaporlosreceptoresmGlu................187 Figura120:LaexposicinaH2O2modulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular..........................................188 Figura121:LaexposicinaH2O2modulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular.........................................189 Figura122:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnicadeA1,A2AyA2B.......................................191 Figura123:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaactividadACmediadaporlosreceptoresdeadenosina....192 Figura124:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnicadelosfactoresCREByCREM.................192 Figura125:LaexposicinaH2O2disminuyelaviabilidadcelular........................................................................194 Figura126:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaactividaddecaspasa3.......................................................195 Figura127:LaexposicinaH2O2regulademanerasubtipoespecficalosreceptoresmGlu............................197 Figura128:LaexposicinaH2O2regulaalalzalaprotenaPLC1......................................................................198 Figura129:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnicademGlu1yPLC1...................................198 Figura130:LaexposicinaH2O2regulaalalzalosreceptoresdeadenosinaA1yA2A. ......................................200 . Figura131:LaexposicinaH2O2nomodulalaprotenaACI.............................................................................200 Figura132:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnicadelosreceptoresdeadenosina.............201 Figura133:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnicadelosfactoresCREByCREM.................202 Figura134:Anlisisdelaexpresingnicadelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimiento.204 Figura135:DeteccindelosreceptoresA1enratonesSAMmedianteuninderadioligandos........................205 Figura136:DeteccindelosreceptoresA1yA2AenratonesSAMmedianteWesternblot...............................206 Figura137:ElenvejecimientodisminuyelosreceptoresA1encerebroderata.................................................206 Figura138:EfectodelenvejecimientosobrelaactividadAC. ............................................................................207 .

XI

ABREVIATURAS A [3H]DPCPX Pptidoamiloide [propil3H]8ciclopentil1,3 dipropilxantina


[ H]ZM2413852[ H]4(2[7amino2{2
3

CPA CPCCOEt

N6ciclopentiladenosina Etilster7 (Hidroxiimino)ciclopropa[]cromen 1carboxilato

furil}{1,2,4}triazolo{2,3 }{1,3,5,}triazin5ilamino]etil)fenol
2ClIBMECA 2CloroN (3iodobencil)adenosina
6

CPPG

(RS)Ciclopropil4 fosfonofenilglicina

Da DAG DCGIV

Daltons Diacilglicerol (2S,2'R,3'R)2(2',3' Dicarboxiciclopropil)glicina

5Nmetiluronamida ACPD cido(1S,3R)1aminociclopentano 1,3dicarboxilico ADA ADN ADNasa ADNc Ado ADP AIDA Adenosinadesaminasa cidodesoxirribonucleico Desoxirribonucleasa cidodesoxirribonucleicocopia Adenosina Adenosina5difosfato cido(RS)1aminoindan1,5 dicarboxlico AMP AMPA Adenosina5monofosfato cidoAmino3hidroxi5 metilisoxazol4propinico AMPc APDC Adenosina3,5monofosfatocclico (2R,4R)4Aminopirrolidinea2,4 dicarboxilato APP AraC ARN ARNasa ARNm ATP Bmax BSA CGS21680 Protenaprecursoradeamiloide CytosinaDarabinofuransido cidoribonucleico Ribonucleasa ARNmensajero Adenosina5trifosfato Uninmxima Albminadesuerobovino 2[p(2carboxietil)feniletilamino]5' Netilcarboxamidoadenosina CHA CHPG N6ciclohexiladenosina (RS)2Cloro5hidroxifenilglicina

DEPC DHPG DMEM

Dietilpirocarbonato (S)3,5Dihidroxifenilglicina MedioEaglemodificadopor Dulbecco

DMSO dNTPs DPCPX DTT EDTA EGLU EGTA

Dimetilsulfxido Desoxinucletidostrifosfato 8Cyclopentil1,3dipropilxantina Ditiotreitol cidoetilendiaminotetraactico cido(2S)Etilglutmico cidoetilenglicolbis(2 aminoetileter)N,N,N',N' tetraactico

GABA GDP GPCR Gpp(NH)p GRK GSH GTP GTPS HENECA

cidoaminobutrico Guanosina5difosfato ReceptoracopladoaprotenasG Guanililimidodifosfato. QuinasaacopladaaunGPCR Glutation Guanosina5trifosfato Guanosina5'O(3tiotrifosfato) 2Hexinil5 etilcarboxamidoadenosina

HIF iGlu

Factorinducibleporhipoxia Receptoresionotrpicosde Glutamato

XIII

IP3 Kb KD kDa KO L[ H]Glu LAP4


3

Inositol1,4,5trisfosfato Kilobases Constantededisociacin Kilodaltons Knockout cidoL[3,4 H]Glutmico cidoL(+)2Amino4 fosfonobutirico


3

PKA

Protenaquinasadependientede AMPc

PKC

Protenaquinasadependientede calcio

PLC PLD PMSF PSB1115

FosfolipasaC FosfolipasaD Fenilmetilsulfonilfluoruro cido4(2,3,6,7Tetraidro2,6dioxo 1propil1Hpurin8il) bencenosulfonico

LGlu LSOP LY341495

cidoLGlutmico OfosfoLserina cido(2S)2Amino2[(1S,2S)2 carboxicicloprop1il]3(xant9 il)propanoico PSMF PTX Quis

Fluorurodefenilmetilsulfonilo Toxinapertsica cidoLQuisculico

LY367385

cido(S)(+)Amino4carboxi2 metilbencenoacetico

Ro201724 4(3Butoxi4 metoxibencil)imidazolidin2ona ROS RPIA RTPCR Especiesreactivasdeoxgeno ()N6fenilisopropiladenosina Transcripcininversayreaccinen cadenadelapolimerasa SAM SDS SEM SNC Tris VSCC ZM241385 Ratonesdesenescenciaacelerada Dodecilsulfatosdico Errorestndardelamedia Sistemanerviosocentral Trishidroximetilaminometano Canalesdecalciosensiblesavoltaje 4(2[7amino2{2 furil}{1,2,4}triazolo{2,3 }{1,3,5,}triazin5ilamino]etil)fenol

MAP4

cido(S)2Amino2metil4 fosfonobutanoico

MAP MCCG MCPG

Quinasasactivadaspormitgenos metilciclopropilglicina (RS)Metil3carboxi4 hidroxifenilglicina

MEM MeSOP mGlu

Mediomnimoesencial (R,S)metilserinaOfosfato Receptoresmetabotrpicosde Glutamato

MPEP

Hidroclorurode2Metil6 (feniletinil)piridina

MRS1220

N[9Cloro2(2furanil)[1,2,4] triazolo[1,5]quinazolin5 il]bencenoacetamida

MTT

Bromurode3[4,5dimetiltiazol2il] 2,5difeniltetrazolio

NB NECA PBS PFA PIP2

Neurobasal 5Netilcarboxamidoadenosina Tampnfosfatosalino Paraformaldehdo Inositol4,5bisfosfato

XIV

Resumen

Los receptores de adenosina (AR) y los metabotrpicos de glutamato (mGlu) estn implicados en multituddeprocesosfisiolgicosenelorganismo.EnelSistemaNerviosoCentral(SNC)laadenosina,mediante suaccinneuromoduladora,controlalaexcitabilidadneuronal,ejerciendosuefectoatravsdelosreceptores de alta afinidad A1 y A2A. Estos receptores interaccionan con receptores de neurotransmisores, de neuromoduladores y con sistemas de transporte de adenosina. Por otro lado, el glutamato, principal neurotransmisorexcitadordelSNC,estimplicadoenfenmenosfisiolgicos,comolatransmisindelimpulso nervioso,ypatolgicos,comolamuerteexcitotxica.Elglutamatoejercesuaccinatravsdelosreceptores deglutamato,tantoionotrpicos(canalesinicos)comometabotrpicos(GPCR).Sehadescritolaimplicacin de los AR y mGlu en procesos de neuroproteccin/neurodegeneracin en varios modelos, as como su modulacinenalgunasenfermedadesneurodegenerativas,porloquesuestudioserevistedeespecialinters hoy da. En esta memoria se han explorado los mecanismos de modulacin de estos receptores en clulas neuronales y de gla expuestas a diferentes estmulos relacionados con procesos de neurodegeneracin y muerte neuronal, como son la excitotoxicidad, la hipoxia, el pptido amiloide y el agua oxigenada. Por otro lado,sehaestudiadocmosemodulanencerebrolosARduranteelenvejecimientoenelmodelomurinode senescenciaacelerada(SAM).Sehanempleandodistintosabordajesexperimentalescomoensayosdeuninde radioligandos,tcnicasinmunocitoqumicas,determinacionesdeactividadesenzimticasycuantificacionesde laexpresingnica.Lasprincipalesconclusionesquesedesprendendeesteestudioson: En situaciones nocivas las clulas estudiadas responden aumentando los niveles totales de

receptores mGlu. En neuronas corticales se ha observado el aumento de, al menos, un subtipo de receptor mGludelgrupoI. EntodasestascondicionesseproduceunaumentodelosreceptoresA1,loquepodrajustificar

supapelneuroprotectorpreviamentedescrito.SehaobservadoquecuandoaumentanlosreceptoresA2Ala muertecelularesmayor. LosratonesSAMpresentandisfuncionesenlosmecanismosdemodulacindelosreceptoresde

adenosinaconlaedad.

XVII

Abstract

Adenosine Receptors (AR) and Metabotropic Glutamate Receptors (mGlu) are implicated in several physiologicalprocesses.AdenosineinCentralNervousSystem(CNS)playsaneuromodulatoryrolecontrolling neuronal excitability through high affinity receptors A1 and A2A. These AR interact with other neurotransmittersandneuromodulatorsreceptorsandwithadenosinetransportsystems.Ontheotherhand, Glutamate,themainexcitatoryneurotransmitterinCNS,isimplicatedintransmissionofnerveimpulseandit may cause excitotoxic cell death. Glutamate acts through its receptors, which include ionotropic (ionic channels) and metabotropic (GPCR) glutamate receptors. Both AR and mGlu have been implicated in neuroprotection/neurodegeneration processes in several experimental models. These receptors are also modulatedinsomeneurodegenerativediseasesmakingthemapotentialtargetfornewtreatmentstrategies. Inthisreport,themodulatorymechanismsthatcontrolARandmGluexpressionsisstudiedinneuronsandglia exposed to different noxious stimuli as excitotoxicity, hypoxia, amyloid peptide and hydrogen peroxide. In addition, a complementary study of AR modulation during ageing has been carried out in senescence accelerated mouse model (SAM). Different experimental approaches (radioligand binding assays, immunochemistrymethods,enzymaticactivitiesmeasurementandgeneexpressionquantification)havebeen usedtoreachthepreviouslyindicatedobjectives.Themainconclusionsobtainedinthisresearchare: NoxiousstimuliinneuronsandgliaincreasestotalmGluexpression.IncorticalneuronsgroupI

mGluareupregulatedineachexperimentalcondition. AdenosineA1receptorsareupregulatedineverystudiedsituation,andthiscouldberelatedto

A1mediatedneuroprotection.WhenA2Areceptorswereupregulated,celldeathwasincreased. AdenosinereceptorsmodulationduringageingisimpairedinSAMmodel.

XXI

Introduccin

I.1.ReceptoresacopladosaprotenasGodesietedominiostransmembrana.

Introduccin

Los mecanismos de comunicacin celular son imprescindibles para establecer relaciones adecuadas entreunorganismoysuentorno.Enelcasodelosorganismospluricelulares,adems,hadeocurrirquecada cluladelorganismofuncionedependiendodelasnecesidadesdelconjunto,paraellosenecesitaunsistema capazdegenerar,transmitiryrecibirsealesdedistintandole,peroademsestassealeshandeproduciruna respuestaenlacluladianademaneraqueadecuesufuncionamientoalassealesquerecibe. Por lo general, los sistemas de comunicacin se basan en la existencia de receptores capaces de reconocer con una elevada afinidad y especificidad una determinada seal, cuya naturaleza no siempre es qumica. Por otro lado, estos receptores han de ser capaces de desencadenar una serie de eventos intracelularescomoconsecuenciadeestasealextracelular.Losmecanismosporloscualessetransformaenel interiordelaclulauntipodesealextracelular(primermensajero)enotrointracelular(segundomensajero) seconocencomomecanismosdetransduccincelular. Los receptores son molculas de elevado tamao de carcter proteico las cuales normalmente atraviesan la membrana plasmtica, al menos una vez, aunque se encuentran receptores en otros rganos subcelulares (receptores intracelulares), como es el caso de los receptores de hormonas esteroideas o los receptores de IP3 del retculo. En la presente Memoria nos ocuparemos de los receptores situados en la membranaplasmticaoreceptorestransmembrana. Estos receptores, al igual que las enzimas, poseen sitios estreoselectivos para el reconocimiento de ligandosespecficos,detalformaqueelprimermensajeroejercesuefectosobrelacluladianaalunirseasu receptorespecficoformandouncomplejoligandoreceptor.Apartirdeestaprimerauninsedesencadenan una serie de procesos en la clula diana que varan en funcin de la naturaleza del primer mensajero, del receptor y del tipo celular al que llega el mensaje. Por tanto un mismo mensaje puede desencadenar respuestasdistintas,inclusoopuestas,dependiendodelacluladianaqueloreciba. Engeneral,existendostiposderespuestascelularesanteunadeterminadasealenfuncindeltipode receptorquelarecibe.Porunlado,losreceptoresmetabotrpicos,trasladeteccindelaseal,interaccionan deformacomplejaconunaseriedeprotenas,denominadasprotenasG,lascualesinteraccionanasuvezcon distintossistemasenzimticosque,enltimotrmino,producenalteracionesbioqumicasenelinteriorcelular enlosnivelesdesegundosmensajeros.Porotrolado,losreceptoresionotrpicosconstituyencanalesinicos, loscuales,comoconsecuenciadelaunindesuligando,podranvariarsuestadofuncionalpermitindosela entradaolasalidadeiones,loquevariaraelpotencialdemembrana. Desde un punto de vista evolutivo los receptores acoplados a protenas G (GPCR, del ingls G proteincoupledreceptors)hansupuestounxito,constituyendoentreel1yel2%delosgenesdemamferos (Pin y col., 2003). Esta familia de genes codifican, en el caso del genoma humano, para ms de ochocientas protenas,delascuales,msdeun90%seexpresanenSNC(Georgeycol.,2002).Sugranxitosedebeala capacidad que poseen de integrar mensajes de muy distinta ndole, as las seales capaces de activar estos receptorespuedenvariardesdehormonas,pptidosoaminocidoshastasustanciasdenaturalezafsicacomo

Introduccin losfotones.OtroniveldevariabilidadseencuentraenlainteraccinconlasprotenasG,yaquecadareceptor, enfuncindesuestructura,interaccionadeformaespecficacondeterminadasfamiliasdeprotenasG,cada unadelascualesejerceunefectocaractersticoenelinteriorcelular.LasiguienteIlustracintratadeexponer estaheterogeneidad,tantoaniveldeligandoscomoaniveldeefectosbiolgicosdesencadenados.

Ilustracin1:RepresentacinesquemticadeunGPCR.VariosligandosusanlosGPCRsparaestimulardeterminadasdianascelulares.La unindeunagonistaproduceuncambioconformacionalenelreceptor,quecatalizaelintercambiodeGDPporGTPenlasubunidadde laprotenaGcorrespondiente,lacualsedisociadelasubunidad.Lassubunidadessedividenenvariassubfamilias,lascualesmedian distintos efectos. Cada receptor interacciona de manera especfica con una o varias familias de protenas G (Modificado de Dorsam y Gutkind,2007).

Duranteaoshasidolaprioridaddelosfarmaclogosdedicadosalestudiodelosreceptoresneuronales eldiseodeligandospotentesyselectivosparacadaunodelosreceptoresdescritos.Laaproximacinclsica que se emple fue la de diferenciar los receptores en funcin de los agentes farmacolgicos que los encendan o apagaban. Estos ligandos se conocen desde un punto de vista clsico como agonistas o antagonistas,respectivamente.Enlaactualidadsehademostradoquelosreceptoressepuedenencontraren distintasconformaciones,cadaunadeellasconunaparticularactividadbiolgica,siendolamsfavorablepara lasealizacindelreceptoraquellaestabilizadaporunagonista,mientrasqueelempleodeagonistasinversos estabilizaralaconformacinmenosactivadelreceptor.Elcasodelosantagonistasesespecial,yaqueestosno

Introduccin

intervienenenelequilibrioentrelaformaactivaylainactivadelreceptory,sinembargo,tienenlacapacidad debloquearelefectotantodelosagonistascomodelosagonistasinversos. A B

Ilustracin 2: Modelo de activacin de un GPCR. Panel A. Accin de los diferentes tipos de ligandos sobre el estado de activacin del receptor.PanelB.Elempleodeantagonistasespecficosdeunreceptorbloqueaelefectoobservadosobrelaactivacindelmismoejercido porotrosligandos.Lig:ligando;A.:Agonista;A.I.:Agonistainverso(ModificadodeThestateofGPCRresearchin2004).

I.1.1.EstructuradelosGPCRs. Todos los receptores englobados en esta superfamilia presentan una arquitectura comn, su cadena polipeptdica atraviesa la membrana plasmtica 7 veces, formando un motivo tambin llamado dominio heptahlico.LasecuenciapolipeptdicacomienzaenelextremoNterminal,elcualseexponehaciaelespacio extracelular.Losdominiostransmembranaestnformadosporsecuenciasde25a35aminocidosdecarcter hidrfoboqueadquierenladisposicindehlice,lascualesseencuentranconectadaspor6bucles,3intray 3 extracelulares, de longitud variable quedando el extremo Cterminal en el interior celular. Esta disposicin permitequeunapartedelreceptorquedeexpuestaalladoexternodelamembranaplasmtica,lacualser responsable de la interaccin con el ligando, mientras que otra parte se expone hacia el lado intracelular, siendo esta responsable de la interaccin con las protenas G. En algunos receptores, los que reconocen ligandosdetamaopequeo,estaestructuraessuficienteparaelcorrectofuncionamiento,yaqueloreducido deltamaopermiteelcorrectoreconocimientoporlosbuclesextracelularesdeestaestructura.Losreceptores quereconocenligandosdemayortamaopresentanunextremoNterminalmslargoque,proyectadohacia elespacioextracelular,proporcionalossitiosdereconocimientonecesarios. LosGPCRsnoslocompartenestemotivoestructuralcomn,sinotambinunmtodointracelularde amplificacinde la seal. Este mtodo sebasa en la interaccin por parte de cada receptor conprotenas G especficas.ParaelloesnecesarioqueelextremoCterminalinteraccioneconlascavidadesformadasporlos

Introduccin bucles intracelulares 2 y 3 (para revisin ver Bourne, 1997), siendo la secuencia de estas cavidades particularmenteimportanteparaelreconocimientodeprotenasGcaractersticas. El primer receptor acoplado a protenas G cuya estructura cristalina se resolvi fue el receptor de rodopsinabovino(Palczewskiycol.,2000),desdeentoncesseharecopiladoabundanteinformacinacercade la estructura, los residuos conservados a lo largo de la evolucin y la funcionalidad en estos motivos tan conservados. No obstante, el estudio de estos receptores todava arroja sorpresas, de hecho, se ha descrito recientementelaestructuradelreceptorA2Ahumanoyenellasehaobservadoquelosbuclesextracelularesy lashlicestransmembranaformanunbolsillodeunindelligandodistintoaldetodoslosGPCRscaracterizados hastalafecha(Jaakolaycol.,2008). I.1.2.ClasificacindelosGPCRs. EnlaactualidadnoexisteunacuerdoglobalacercadecmoorganizarlaclasificacindelosGPCRs,de modo que diferentes bases de datos proporcionan informacin que en algunos casos resulta confusa, redundanteoqueenglobaagruposdereceptoresquesolapanentres.Lasclasificacionesrealizadashastala fecha han respondido bien a aspectos biolgicos, farmacolgicos o computacionales. La dificultad de su clasificacin radica en que, a pesar de que la estructura tridimensional se ha mantenido a lo largo de la evolucin, la secuencia primaria de estos receptores apenas se parece (Milligan, 2006), lo que dificulta enormementeunaclasificacinbasadaensimilitudesdesecuenciaascomolainclusindenuevosreceptores en una clasificacin de este tipo (Davies y col., 2007). La clasificacin ms ampliamente utilizada es la establecidaenlabasededatosGPCRDB(accesibleenwww.gpcr.org/7tm/),tambinllamadaclasificacinAF, quedividelosGPCRsen6familias(Hornycol.,2003).Estabasededatosbasasuclasificacinenlainformacin quehaidorecopilandodesdesuinicioen1994(Kolakowski,1994)ycontienesecuencias,mutacionesydatos deunindeligandos.Recientementehasidodesarrolladaunaherramientainformticagratuitaparaclasificar unGPCRhurfanoapartirdesusecuenciaaminoacdicaporcomparacincontodoslosdatosalmacenadosen estabasededatos(Daviesycol.,2008). Segn esta clasificacin la familia A o similares a rodopsina (rhodopsinlike) es la ms abundante, agrupandomsdel80%delosGPCRsenhumanos,enestegruposeencuentranlosreceptoresdeadenosina. La familia B son los similares a secretina (secretinlike) y la C recibe el nombre por los receptores metabotrpicos de glutamato, aunque contiene otros receptores como los de GABA (cido aminobutrico). LasfamiliasA,B,CyFseencuentranenmamferos,alcontrarioquelasfamiliasDyE,lascualessonbastante menores, estando formada la primera por los receptores de feromonas slo encontrados en hongos y la segundaporlosreceptoresdeAMPcdescritosenDictyostelium.LafamiliaFesmspequeatodavayrecibeel nombreinglsdefamiliaFrizzled/smoothened.LasiguienteFigurarepresentalascaractersticasestructurales bsicasdelastresfamiliasmsabundantesdeGPCRs.

Introduccin

Ilustracin 3: Aspectos estructurales ms relevantes de las 3 principales familias de GPCRs. En todas las Figuras se exponen losaminocidosaltamenteconservados,aunquelahomologade secuencia entre los receptores de las distintas familias es baja. PanelA.LafamiliaAestformadaporreceptoresparaligandos de pequeo tamao por lo que la regin extracelular del receptor es pequea. Las hlices transmembrana de estos receptores se orientan de forma inclinada con respecto a la membrana plasmtica. Panel B. La familia B posee un extremo Nterminal ms largo con abundantes cistenas que probablementeformanunareddepuentesdisulfuro.PanelC.La familiaCpresentagrandesregionesCyNterminales.Lazonade reconocimiento del ligando se encuentra en el Nterminal que formaunmduloquerecibeelnombreVFT(VenusFlyTrap)por suanalogaconlaplantacarnvora(ModificadodeGeorgeycol., 2002).

Noobstante,aunquestasealaclasificacinmsampliamenteaceptadaexistenotrasclasificaciones, como la GRAFS, que clasifica los GPCRs en cinco subfamilias cuyas iniciales dan lugar al nombre de la clasificacin (Frediksson y col., 2003). Dentro de cada subfamilia se establecen otras subsubfamilias, en funcindeunorigenevolutivocomn. I.1.3.LasuperfamiliadelasGTPasas.MecanismosdetransduccindelosGPCRs. Las protenas G son una familia de protenas heterotrimricas formadas por tres subunidades denominadas,y,responsablesdemuchosprocesosdetransduccindesealypartcipesenmultitudde procesosdeinterstantofisiolgicocomofisiopatolgico.Lacaractersticacomndeestafamiliadeprotenas esqueunennucletidosdeguanina,enconcretointercambianGDPporGTP,graciasalainteraccinconun receptor activado, pasando de un estado inactivo a otro activo, en el que la subunidad , unida a GTP, se disocia del dmero , permitindose as que ejerzan ambos los efectos correspondiente sobre las enzimas

Introduccin dianadandolugaralarespuestacelular(revisadoenPinycol.,2003).Lasubunidadcatalizalahidrlisisde GTPaGDP,volviendolaprotenaGasuestadoinactivo. Desdesudescubrimientosehaconsideradoaestasprotenascomounosinterruptoresmoleculares capacesdeencenderoapagarlaactividaddeotrasmolculas.Enrealidadelprocesoesmscomplicadoya que estas protenas slo ejercen su actividad cuando ellas mismas estn activadas y ese tiempo, como se comentaracontinuacin,esdeterminado.EnelestadoinactivolaprotenaGpresentaunaelevadaafinidad por el GDP, no es hasta que un receptor activado por un ligando induce un cambio conformacional en la protenaGcuandosefavorecelasalidadelGDP,dandolugaraunestadoneutrodeactivacintransitorioque terminaconlarpidaentradadeGTPenelcomplejo.AlaumentarlaafinidadporelGTPtambindisminuyela interaccinentrelasubunidadyelcomplejoestable.Deestemodotantolasubunidad,unidaaGTP, como el dmero ejercen sus efectos singulares sobre sus correspondientes dianas. Slo mientras la subunidad est activada (unida a GTP) es capaz de ejercer estos efectos, sin embargo, en este estado tambinescapazdecatalizarlahidrlisisdeGTPaGDP,siendolatasadehidrlisisdecadaprotenaGlaque determinaeltiempoqueestesistemaestactivado.Unavezquesehaproducidoestahidrlisislasubunidad unidaaGDPsufreunnuevocambioconformacionalqueaumentasuafinidadporelcomplejo,volviendoel sistema completo al estado inactivo o apagado. Este sistema permite que se amplifique la seal, obtenindoseapartirdeunnicomensajeroprimariolaliberacindemltiplesmensajerossecundariosenel citosol. La Ilustracin 4 trata de esquematizar el proceso aqu explicado. Por ltimo, otras protenas de esta familianoestnligadasaGPCRs,comop21Ras,yenellaselintercambioGDPporGTPylaposteriorhidrlisisde ste estn regulados por otras protenas denominadas GNRP (guanine release proteins) y GAP (GTPaseactivatingproteins). Estasuperfamiliadeprotenasestformadaporunoscienmiembros.EnlaIlustracin1yasemostrla heterogeneidaddelasprotenasGcon16subtipos,ademsexisten5subtiposdesubunidadesy14tiposde subunidades (revisado por Milligan y Kostenis, 2006). Dado que cada subunidad ejerce una influencia caracterstica sobre su(s) sistema(s) efector(es) y que una protena G est formada por tres subunidades, la respuestaaunadeterminadasealpodravariarenfuncindeltipodeclulaquelarecibaydelasprotenasG acopladas a ese hipottico receptor, lo que confiere al sistema, adems de una gran capacidad de amplificacin,unagranflexibilidadderespuesta. Existen multitud de molculas efectoras, entre las que encontramos ciclasas, fosfolipasas, fosfodiesterasasocanalesinicosdemembrana,porcitaralgunos.Debidoaquelosreceptoresestudiadosen lapresenteMemoria,losdeadenosinaylosmetabotrpicosdeglutamato,estnprincipalmenteacopladosal sistema de la adenilato ciclasa y al de la fosfolipasa C slo se describirn estos dos sistemas en la presente Introduccin.Noobstantehayquetenerencuentaquesetratadeunavisinsimplificada,yaqueestosdos ejemplosclsicosdecascadasdesealizacininiciadasporactivacindeGPCRsnocontemplanotrasvasde sealizacin relativamente nuevas como la activacin de las MAP quinasas (Yamauchi y col., 1997). Este fenmenodesealizacincelularpuedecomplicarsetodavamssisetieneencuentaquelosGPCRspueden actuarcomohomooheterodmeros,comosecomentarmsadelante(pararevisinverMilligan,2008).

Introduccin

Ilustracin 4: El ciclo de las protenas G. La activacin del GPCR promueve la salida del GTP (a) formndose un complejoternarioinestable(b).ElGPCRactivadocatalizala entrada de GTP en la subunidad (c), lo que deshace el complejoternarioypromueveladisociacindelaprotenaG en la subunidad y el dmero . En estas circunstancias ambossoncapacesderegularsussistemasefectores(d).La activacin de la protena G se termina por la hidrlisis de GTP en GDP (e), quedando cerrado el ciclo (Modificado de ThestateofGPCRresearchin2004).

Enprimerlugarsecomentarelefectosobrelasadenilatociclasas.Estafamiliadeenzimascatalizanla formacindeAMPcclico(AMPc),unsegundomensajeroubicuoparatodaslasclulasanimales.Lasubunidad Giinhibelaactivacindeesteenzima,mientrasquelasubunidadGsejerceelefectocontrarioestimulandola actividadenzimtica.ElpapelmsimportantedelAMPcesactivarlaprotenaquinasadependientedeAMPco PKA.Unavezactivada,estaenzimamultimricaempleaATPparafosforilarasussustratos,quepuedenvariar entre enzimas, receptores, canales inicos, histonas, factores de transcripcin, etc. Esta fosforilacin en un residuo de serina, treonina o tirosina ejerce el efecto de inhibir o activar la molcula biolgica diana. Por ltimo,ladesfosforilacinproducidaporcualquieradelasvariasfosfatasaspresentesenelcitosoldevuelvea estasprotenasasuestadoinicial. Medianteelempleodetcnicasdebiologamolecularsehademostradoqueexisten,almenos,nueve subtiposdeestaenzimadiferentesenlasclulasdemamfero,siendolaACIlamayoritariaentejidodelSNC (revisadoporHanouneyDefer,2001).Todasellaspresentanunpesomoleculardeentre120y130kDacon12 segmentos transmembrana. Sin embargo, cada una de ellas presenta unas caractersticas de activacin particulares,loqueunidoasudiferentedistribucin,hacendesteunsistemaheterogneo. UnadelasdianasdePKAeslaprotenadeuninalelementoderespuestaaAMPcoCREB(delingls cAMPresponsiveelementbindingprotein),unfactordetranscripcincrticoparamuchasfuncionesneuronales (revisadas por Josselyn y Nguyen, 2005). El factor CREB se activa por fosforilacin por PKA, dimeriza y se transloca al ncleo promoviendo la transcripcin de aquellos genes que posean elementos CRE (del ingls cAMP response elements) en sus promotores gracias a su interaccin con la protena CBP (del ingls CREBbindingprotein),uncoactivadordelamaquinariadetranscripcin.PorsuparteCREM(delinglscAMP response element modulator) es un factor de transcripcin concapacidad de unirse a los elementos CRE,de

Introduccin elevadahomologaconCREByquetambinseactivaporfosforilacinporPKA,sinembargo,sehaobservado queestefactorpuedefuncionarcomounactivadorounrepresordelaactividadtranscripcional(revisadopor Foulkes y SassoneCorsi, 1992). Una caracterstica importante de estos factores es que son un punto de convergenciaentrelasrutasAMPc/PKAylasMAPquinasas(revisadoporDeCesareycol.,1999). Por otro lado se ha observado que la subunidad Gq activa la fosfolipasa C. La activacin de este importantesistemaefectorembebidoenlamembranaplasmticaconducealaproduccindedossegundos mensajeros, el inositol trisfosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG), por conversin del fosfolpido fosfatidilinositolbisfosfato (PIP2), localizado en la cara interna de la membrana plasmtica. El IP3 es una molcula soluble en agua que difunde a travs del citosol, donde puede reaccionar con receptores en el retculo endoplsmico, desde el que se produce la liberacin de calcio, el cual tiene mltiples efectos en la bioqumica celular. Por otro lado, el DAG es hidrfobo y permanece en la membrana plasmtica, donde reacciona con la protena quinasa dependiente de calcio (PKC), la cual tambin se encuentra anclada a la membranaplasmtica,cuandolaconcentracindecalciocitoslicohaaumentado(comoconsecuenciadela liberacin de calcio del retculo antes mencionada). De este modo, la PKC est capacitada para activar protenas por fosforilacin, las cuales darn lugar a respuestas bioqumicas especficas. En neuronas se han descritovariosefectoscomoconsecuenciadelaactivacindelaPKC,quevaranentrevariacionesenlasntesis ysecrecindeneurotransmisores,alteracionesenlasensibilidaddelosreceptoresascomoalteracionesenla funcionalidaddelcitoesqueleto.
Ilustracin 5: Los GPCR estn acoplados a la familia de las protenas G. Panel A. Los receptores acoplados a protenas Gi/o inhibenlaenzimaadenilatociclasay,enalgunoscasos,activanla salidadeK oinhibenlaentradadeCa .PanelB.Losacopladosa protenas Gs estimulan la formacin de AMPc. Panel C. Otros receptoresestnacopladosaprotenasGqloqueactivalaPLC, incrementando la hidrlisis de PIP2 en IP3 y DAG con el consiguienteaumentodeCa ylaactivacindePKC(Modificado deThestateofGPCRresearchin2004).
2+ + 2+

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I.1.4.RegulacindelosGPCRs.

Introduccin

Est establecido que la mayora de los GPCRs se regulan por fosforilacin. Desde un punto de vista clsico,elfenmenodelaregulacindelosGPCRssehaasociadoconlosprocesosdedesensibilizacincomo consecuencia de la exposicin de estos receptores a su ligando, los cuales implican el desacoplamiento del receptordelasprotenasGefectoras(Hausdorffycol.,1989),lainternalizacindelreceptoracompartimentos intracelulares(revisadoporTrejo,2005)yladisminucindelnmerodereceptoresdebidoaunamenortasa desntesisascomounadisminucinensuexpresin(Pakycol.,1999).Estemecanismodedesensibilizacin protege frente a la sobreestimulacin aguda y crnica, aunque el concepto de exposicin aguda a agonista vara entre cada receptor, observndose que algunos se desensibilizan en minutos mientras que otros receptoresnecesitanhorasdeactivacinparaobservarseestaprdidaderespuesta(revisadoporTsaoycol., 2001). Lasprimerasquinasascapacesdemediarestosprocesosdefosforilacinfueronquinasasdependientes de segundo mensajero, como la PKA o la PKC (Benovic y col., 1985; revisado por Kelly y col., 2008). Sin embargo, el modelo evolucion tras el descubrimientode una nueva quinasa capaz de medir fenmenos de desensibilizacin independientede segundos mensajeros (Benovicycol., 1986). Estaquinasa se englobcon posterioridaddentrodeunafamiliadequinasasintracelularesdenominadasGRK(delingls,Gproteincoupled receptor kinase). Sin embargo, la fosforilacin del GPCR producida por estas quinasas no era condicin suficienteparaqueseprodujeraladesensibilizacin(Pitcherycol.,1992),sinoqueestafosforilacinpromueve launindeunasprotenasdenominadasarrestinas(Losheycol.,1990)quedesacoplanlosreceptoresdelas protenasGiniciandoasladesensibilizacindelarespuesta.Estasprotenas,alfuncionarcomoadaptadores moleculares,marcanalreceptoralquesehanunidoparaquesufraunprocesodeendocitosisporvesculasde clatrina.Unavezinternalizados,lamayoradelosGPCRsondesfosforiladosencompartimentosendosomalesy bien son reciclados de nuevo a la membrana plasmtica, se envan a lisosomas para su degradacin o, en algunoscasos,seretienenenendosomasparaserrecicladoslentamentealasuperficiecelular(revisadopor DhamiyFerguson,2006).Enlaactualidadsehandescritootrosmecanismosmolecularesdedesensibilizacin mscomplejosquedependendeltipodereceptorestudiado,comoporejemplolainternalizacinencaveolas, (revisadosporKellyycol.,2008).ElmecanismoclsicodedesensibilizacinseesquematizaenlaIlustracin6. Los procesos de desensibilizacin pueden ser de dos tipos en funcin de los mecanismos que los desencadenan, comprendiendo, en general, cambios adaptativos tanto a nivel del GPCR como a nivel de las protenasGydelsistemaefectoracoplado.Porunlado,existenlosprocesosdedesensibilizacinhomloga,los cualessecaracterizanporquelaprdidaderespuestadeundeterminadoGPCResproducidaporlaaccinde un agonista selectivo sobre l mismo. Por otro lado, la desensibilizacin heterloga implica la prdida simultnea de respuesta a agonista de un GPCR como sonsecuencia de la activacin crnica de otro GPCR distinto.Unavezquelaexposicinaagonistaseharestringido,larespuestadelGPCRpuede,enlamayorade los casos, ser recobrada mediante un proceso pobremente comprendido llamado resensibilizacin (revisado porFergusonycol.,1998),aunqueparalamayoradelosreceptoressereciclaypartesedegrada(Escrichey col.,2003).

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Introduccin

Ilustracin 6: Modelo clsico de internalizacin de los GPCR. Debido a la unin crnica del agonista (A) el GPCR es susceptible de ser fosforilado por una GRK en residuos del tercer giro intracelular y del carboxilo terminal, reclutando as a las arrestinas (ARR). Estas protenasreclutanalaclatrina,queconducirelprocesodeendocitosis(ModificadodePierceyLefkowitz,2001).

Por otro lado, los procesos de fosforilacin de los GPCR no slo estn relacionados con la desensibilizacindeundeterminadoreceptorconelfindeprotegerelsistemadeunasobreestimulacin,sino que,adems,lasarrestinasunidasalreceptorfuncionanamododeadaptadoresmoleculares.Deestemodo, la unin de esta familia de protenas al receptor fosforilado inicia otros procesos de sealizacin celular diferentesaloscaractersticosdelreceptoralquesehanunido(revisadoporDeWireycol.,2007),comopor ejemplo, la activacin de la va de sealizacin de las quinasas activadas por mitgenos (MAP, del ingls mitogenactivated protein kinases). De forma adicional, el fenmeno de dimerizacin que sufren los GPCR aadeotroniveldecomplejidadaestosprocesos(revisadoporTerrillonyBouvier,2004).Estosmotivoshacen quelavisinclsicadelaregulacindelosGPCRtengaqueseractualizadaconregularidad.Adems,existen evidencias de que los mecanismos estudiados para un tipo de receptor no puedan ser aplicables de modo general a otro distinto, e incluso de que varios subtipos de un mismo receptor, activados por un mismo agonista,puedanseguirmecanismosdedesensibilizacindiferentes. Porltimo,esteprocesoderegulacinvaraenfuncindeltipocelular,yaqueencadatipocelularse expresanunasdeterminadasquinasasquepresentandiferentesmecanismosdeactivacin,lascualesfosforilan a sus receptores diana en distintos lugares y con diferentes cinticas. Todo ello tiene unas consecuencias comunes,comoladesensibilizacindelreceptor,perotambinunascaractersticasnicasquedependendelas particularidadesdecadatejidoyquedanlugaraunamplioabanicodemodelosdesealizacin,loqueaadea estos receptores nuevos niveles de complejidad, diversidad y capacidad de adaptacin frente a distintos estmulos(revisadoporTobinycol.,2008).LasiguienteFiguraresumeestosnuevosnivelesdecomplejidad.

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Introduccin

Ilustracin7:LafosforilacindiferencialdelosGPCRimplicalaactivacindemecanismosefectorescaractersticos.Enelesquematres diferentes quinasas son capaces de fosforilar en distintos sitios a un determinado GPCR en funcin del tejido, dando lugar a diferentes perfilesdefosforilacin.Estosperfilesdefosforilacindirigenlasealizacincelularsubsiguiente,produciendoenlosdistintostejidos(A,B oC)losprocesosdesealizacinrequeridos(ModificadodeTobinycol.,2008).

I.2.Elglutamatoysusreceptores. La accin excitadora del glutamato en cerebro y mdula espinal de mamferos se conoca desde la dcada de los 50 del siglo pasado (Hayashi, 1952), sin embargo no fue hasta el final de la dcada de los 70 cuando se reconoci abiertamente que el glutamato era el principal neurotransmisor excitador del SNC, desempeando,portanto,unaampliavariedaddefuncionesdentrodedichosistema.Enunprincipiosecrea quelafuncindelglutamatoestabaligadasloasuaccinsobrecanalesinicosdemembranaactivadospor ligando, los receptores ionotrpicos de glutamato (revisados por Dingledine y col., 1999). Sin embargo, a mediadosdelos80aparecieronevidenciasdelaexistenciadereceptoresdeglutamatoacopladosasistemas desegundosmensajerosatravsdeprotenasG,debidoalacapacidaddelglutamatodeactivarlahidrlisisde fosfoinostidos(Sladeczecycol.,1985).Assedescubriloquehoyconocemoscomolafamiliadereceptores metabotrpicosdeglutamato,acopladosalossistemasefectoresatravsdeprotenasGheterotrimricas. Los receptores ionotrpicos de glutamato son canales inicos situados preferentemente a nivel postsinptico,aunquesupermeabilidadaNa+yCa2+varaenfuncindelacomposicinmultimricadecada receptor. Existen tres familias de estos receptores, denominadas as por sus tres principales agonistas: NmetilDaspartato (NMDA), cido amino3hidroxi5 metil4isoxazolpropinico (AMPA) y cido kanico. Estoscanalesregulanprocesosdetransportedeionesdeunladoaotrodelamembranaplasmtica.Portanto,

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Introduccin unavezactivadosporsuligando,estoscanalesseabrenformandounporoquepermiteelflujodelosiones seleccionadosatravsdeungradienteelectroqumico,producindosecambiosenelpotencialdemembrana que dan lugar en la sinapsis a los procesos de despolarizacin e hiperpolarizacin caractersticos de la transmisinnerviosa.Elcambioenelpotencialdemembranarepresentaunasealqueserprocesadaenla clulareceptora,lamagnitudyduracindeestasealdependedevariosfactoresquenoserncomentadosen lapresenteMemoria(revisadosenMadden,2002). ConrespectoalosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatoelprimerADNcclonadofueeldelmGlu1a, elcualfueclonado,alavezydemaneraindependiente,pordosgrupos(Houamedycol.,1991;Masuycol., 1991).LasecuenciacindeestegennopresentabahomologasignificativaconningunafamiliagnicadeGPCR conocidaentonces,loquesugeraqueformabapartedeunanuevafamiliadereceptores,aunque,comoseha comentado con anterioridad, esta hiptesis ya se haba propuesto a finales de la dcada de los 80. En la bsquedadenuevosmiembrosdeesafamiliadegenessehanllegadoaclonarhasta8receptoresdistintosms lascorrespondientesvariantesdeprocesamientoosplicingalternativoparaalgunosdeellos. I.2.1. Clasificacin de los receptores metabotrpicos en funcin de su estructura, bioqumica y farmacologa. Duranteelperiodode1991a1995sedescribielclonajedelafamiliadereceptoresmetabotrpicosde glutamato en mamferos, en la actualidad se conocen 8 subtipos de estos receptores, numerados del 1 al 8 segnordendesecuenciacin.Basndonosenlahomologadesecuenciaestosreceptoressepuedenclasificar asuvezentresgrupos,conaproximadamenteun70%dehomologaentrecomponentesdeunmismogrupo, pero con sloun40% entrecomponentesde los distintos grupos (Schoepp, 2001), adems esta clasificacin coincideconlosmecanismosdetransduccinprincipalesutilizadosporcadasubtipodereceptor.Delosgrupos I y III existen variantes de splicing, denominadas segn el alfabeto romano por orden de secuenciacin, observndosequelamayoradelosaminocidoscambiadosseencuentranenlasregionescarboxiloterminal, loquepodraserimportantealahoradelocalizarestosreceptoresendistintasregionescelulares(Boudiny col., 2000), siendo estas pequeas variaciones suficientes para otorgarles a los receptores resultantes funciones fisiolgicas diferentes (Mion y col., 2001). A modo de resumen se muestra la Tabla 1, donde se engloban las principales caractersticas de estos receptores (revisado por Pin y Duvoisin, 1995; Conn y Pin, 1997). El grupo I incluye los subtipos 1 y 5. En cada sistema de expresin estudiado, as como en todos los sistemasinvivo,losmGludeltipoIestimulanlafosfolipasadetipoCatravsdeunaprotenaGq/11(Sladeczeky col., 1985) y, por tanto, la hidrlisis de fosfoinostidos, dando lugar a los segundos mensajeros IP3 y diacilglicerol. Existen al menos dos tipos de canales de calcio que regulan su liberacin de reservorios intracelulares:canalessensiblesaIP3(Thornycol.,1993)ycanalessensiblesarianodina,ambossituadosen retculo endoplsmico. El IP3 interacciona con su receptor abrindolo y es usado en muchas clulas como segundo mensajero para liberar calcio. Por su parte, el canal sensible a rianodina es responsable del efecto

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Introduccin

conocido como liberacin de calcio inducida por calcio (calciuminduced calcium release, Fabiato y Fabiato, 1977). Por otro lado, la produccin de DAG y/o la liberacin de calcio son capaces de activar diferentes isoformas de la PKC (revisadas en Webb y col., 2000) las cuales fosforilarn a sus sustratos especficos, provocandoenltimaestancialaregulacindelaexpresingnica(Ilustracin8).
Grupo Subtipos Principalesrutasdetransduccin Agonsitasselectivos Antagonistas selectivos

mGlu1a mGlu1b I mGlu1c mGlu1d mGlu5a mGlu5b LQuis (S)DHPG CHPG(mGlu5) AIDA LY367385(mGlu1) CPCCOEt(mGlu1) MPEP(mGlu5)

II

mGlu2 mGlu3 mGlu4a mGlu4b mGlu6

DCGIV (2R,4R)APDC

MCCG LY341495 EGLU

III

mGlu7a mGlu7b mGlu8a mGlu8b mGlu8c

LAP4 LSOP

MeSOP MAP4 CPPG

Tabla 1: Resumen de las rutas de transduccin principales y farmacologa de los mGluRs. Adaptado de Hermans y Challiss, 2001 y Nicolettiycol.,2007.

Adems de estimular la hidrlisis de fosfoinostidos, se han estudiado casos de acoplamientos alternativos(comnmentellamadospromiscuos)conotrossistemasdesealizacin,loscualesnormalmente contribuyenalacomplejidaddelasrespuestasfisiolgicasaglutamato.Enestesentidosehandescritocasos enlosquelosreceptoresdelgrupoImodulanlosnivelesdeAMPcyconellolaactividadPKA,atravsdeun protenaestimuladoraGs,ensistemasheterlogos(AramoriyNakanishi,1992).Otrasrutasatpicasobservadas paraestegruposonlaactivacindelafosfolipasaDenhipocampo(BossyConn,1992),lacualalgunosautores sugieren que es producida por un receptor mGlu an por caracterizar (AlbaniTorregrossa y col., 1999), la activacin de la fosfolipasa A2 en neuronas estriatales, al ser estimulados junto con los receptores NMDA (Dumuis y col, 1990), y el incremento en la cantidad de GMPc en cerebelo (Okada, 1992). Por otro lado, la

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Introduccin activacindeestosreceptorestambinafectaaloscanalesinicos,assehaestablecidoquelasealizacin medianteprotenaspuedemodulardeformanegativacanalesdecalciooperadosporvoltaje(Kammermeier eIkeda,1999),mientrasqueloscanalesdepotasiopuedenserinhibidosporunmecanismodependientedela PKC(Sharonycol.,1997).


Ilustracin 8: Activacin de los receptores mGlu del grupo I. La unin del agonista sobre los receptores mGlu1 o mGlu5 produce la activacin de la enzimaPLC, lo que conduce a la formacin de IP3 y DAG. El IP3 difundehaciaelinteriorcelularactivandosusreceptores del retculo, lo que produce la liberacin de calcio al ineriorcelular.Enestascondicionesseactivalaenzima PKC(AdaptadodeCullenyLockyer,2002).

LosreceptoresdelgrupoII,queincluyelossubtipos2y3,ylosdelgrupoIII,queincluyelossubtipos4, 6,7y8,estnprincipalmenteacopladosdemanerainhibidoraalaactividadadenilatociclasa,medianteuna protenaGi/o,ascomoavariostiposdecanalesdecalcio.LadisminucinenlosnivelesdeAMPcproducidapor laactivacindeestosreceptoresimplicanecesariamenteunadisminucinenlaactividaddelaquinasaPKA.La capacidad inhibidora de estos receptores sobre los incrementos de AMPc estimulados por forskolina se ha demostradoendiferentesestudios,tantoensistemasheterlogos(Tanabeycol.,1993)comoenneuronasen cultivo(Prezeauycol.,1994).Porotrolado,estosreceptorestambinmodulanlaactividaddecanalesinicos, inhibiendolaentradadecalcioatravsdecanalesinicosoperadosporvoltaje(TrombleyyWestbrook,1992).

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Introduccin

Sinembargo,sehandescritootrasposiblesvasdeactuacindeestosreceptoresenfuncindeltejidoy delagonistautilizado.UncasoespecialeseldelmGlu6acopladoaunafosfodiesterasaquereducelosniveles deGMPcenlasclulasONdelaretina(Masuycol.,1995). La capacidad de los receptores metabotrpicos de glutamato para interaccionar con sistemas de segundos mensajeros, as como su capacidad de iniciar rutas de sealizacin de forma independiente de protenas G, hacen de este un sistema verstil a la hora de activar diferentes vas de sealizacin. Los receptores metabotrpicos de glutamato activan una de las vas mejor caracterizadas en los procesos de regulacin,lavadelasMAPquinasas,regulandodeestamaneralaexpresingnica(revisadoporWangycol., 2007).Cadagrupodereceptoresactivaestavamediantedistintosmecanismosyadistintosniveles,quevaran en funcin del sistema estudiado pero que, en general, estn relacionados con la transactivacin de receptores con actividad tirosina quinasa (Peavy y col., 2001), con la interaccin directa de los receptores metabotrpicos con la familia de protenas adaptadoras Homer (revisado por Thomas, 2002), la sealizacin independientedeprotenasGporinteraccinconlafamiliaSrc(Heussycol.,1999)obienconlaactivacinde ERK a travs de subunidades ligadas a receptores de los grupos II y III, que ligan las protenas heterotrimricas con la va de Ras (Crespo y col., 1994). En la actualidad est descrita la activacin de otras rutasdesealizacinporpartedeestosreceptorescomopuedenserlarutadeJNKyladelap38,aunqueno estn tan ampliamente descritas como la activacin de las MAP quinasas. La Ilustracin 9 esquematiza la complejidaddelosprocesosexpuestos.
Ilustracin9:CascadasdesealizacininducidasporlaactivacindelosreceptoresmGlu.Existenvariasrutasqueliganlosreceptores metabotrpicos de glutamato con las vas de ERK y JNK: la transactivacin de receptores con actividad tirosina quinasa (RTK), la ruta clsicadeaumentodecalciointracelularatravsdeunprotenaGq,poraccindelassubunidadesymedianteloscomplejosformados conlosadaptadoresdelafamiliaHomer(ModificadodeWangycol.,2007).

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Introduccin Unaparticularidaddelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatoy,engeneraldetodoslosreceptores incluidosdentrodelafamiliaCdeGPCR,esquefuncionalmentesondmeros,pudiendoencontrarseenforma de homo o heterodmeros (revisado por Pin y col., 2003). La primera evidencia de este fenmeno en los receptoresmetabotrpicosdeglutamatoseobtuvoenladcadadelos90,cuandoseobservquelamovilidad electroforticadelreceptormGlu5nosecorrespondaconelpesomolecularesperado,quedandodemostrado questereceptorsecomportabacomoundmeromediantelaformacindepuentesdisulfuro(Romanoycol., 1996).Estefenmenonosloesimportantealahoradedeterminarlosposiblesmecanismosdeactivacinde estos receptores, sino que tiene una importancia mayor al ser considerados los fenmenos de transduccin quellevanacaboestosreceptores,aumentandoaselgradodediversidadyplasticidaddelasestructurasque contienenestosreceptores,especialmenteelcerebro. I.2.2.Papelfisiolgicodelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato. A pesar de que el papel de los receptores metabotrpicos de glutamato se ha restringido tradicionalmente a su funcin moduladora de la accin del glutamato en las sinapsis excitadoras del SNC, dondeseleatribuyenfuncionesfisiolgicastalescomolaparticipacinenprocesoscognitivos,deaprendizaje orelacionadosconlamemoria,ascomoeneldesarrollodelSNC(revisadoporLujnycol.,2005).Noobstante, segnsevanampliandolosmbitosdeestudiosevanaadiendonuevosfuncionesparaestosreceptores.De hecho,estnapareciendoevidenciasqueamplanlafuncindelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatoa sistemasdiferentesdelSNC.Enestesentido,estosreceptoressehancaracterizadoenvariasclulasperifricas como osteoclastos, osteoblastos, hepatocitos, clulas pancreticas, clulas del sistema inmune y en tejidos como la piel o el corazn (Shin y col., 2008; revisado por Skerry y Genever, 2001). Por otro lado, se ha relacionado estos receptores con el control del crecimiento de tumores, no slo circunscritos al SNC, sino tumores tan diferentes a los cerebrales como los melanomas (Nicoletti y col., 2007; Shin y col., 2008). Recientemente,traseliniciodelainvestigacinconclulasmadre,sehaestablecidounarelacindirectaentre losreceptoresmetabotrpicosdeglutamatoylaproliferacin,supervivenciaydiferenciacindestasclulas madre,tantoembrionariascomoneurales(Melchorriycol.,2007),loquepermitira,mediantelamanipulacin deestosreceptores,laoptimizacindelosprotocolosdeexpansinydiferenciacincelularencaminadosala sustitucin de tejidos daados. Por todos estos antecedentes, y los que se expondrn a continuacin, se ha consideradohistricamentealosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatobuenasdianasfarmacolgicaspara abordarenfermedadesneurolgicasypsiquitricas.Enlaactualidad,ademssecreequepuedenserbuenas dianas para el tratamiento de enfermedades variadas como esquizofrenia, ansiedad, depresin, Parkinson, dolorcrnico,drogodependencias,migraas,etc(Nicolettiycol.,2008). EnelSNCelglutamatoesliberadoenlosterminalessinpticosyactaanivelpostsinpticosobrelos receptoresionotrpicosmediandotransmisionessinpticasrpidas.Sinembargo,elglutamatotambinpuede actuar sobre los receptores metabotrpicos ejerciendo una variedad de efectos moduladores a travs de la capacidaddeestosreceptoresdeactivarsistemasdesegundosmensajeros.Acontinuacinseexpondrnlas principalesfuncionesfisiolgicasdelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatoenelSNC.

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ReceptoresmetabotrpicosdeglutamatodelgrupoI.

Introduccin

LosreceptoresdelgrupoIseencuentranenlassinapsisexcitadorasglutamatrgicasprincipalmentea nivelpostsinptico(revisadoporAnwyl,1999),dondedesempeanunpapelimportanteenlaregulacindela sinapsisrpidamediadaporglutamatoyenlosprocesosdeplasticidadneuronal. Porotrolado,existenevidenciasmenosabundantesdesupresenciaanivelpresinptico,encargndose enmdulaespinaldefuncionescomoelmantenimientodelalocomocin(TakahashiyAlford,2002),aunque tambin se han descrito en corteza, donde, al igual que en la mdula, facilitan la liberacin de glutamato (Musanteycol.,2008). Los estudios de ratones KO (del ingls, knockout) para el gen codificante para el receptor mGlu1 desvelaron que este receptor est implicado directamente en el aprendizaje asociativo y motor (Aiba y col., 1994a,b),mientrasqueelKOparaelmGlu5parecanodesarrollaradiccinacocana(Chiamuleraycol.,2001). SehanencontradoreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIfuncionalesenlamembrananuclear,donde suactivacinproduceincrementosdecalcioenelinteriordelncleo(OMalleyycol.,2003;Jongycol.,2005). Sinembargo,sedesconoceenlaactualidadelmecanismodeactivacinquesiguenestosreceptoresnucleares ascomolasposiblesimplicacionesfisiolgicasquepudierantenerestosincrementosdecalcioenlaregulacin delatranscripcingnicaoinclusodelciclocelular. Porltimo,sehademostradorecientementequelapresenciademGlu1desempeaunpapelcrucialen lasupervivenciadelasneuronasduranteeldesarrollodelSNC,otorgndoleaestereceptornuevasfunciones hastalafechadesconocidas(Pshenichkinycol.,2008). ReceptoresmetabotrpicosdeglutamatodelosgruposIIyIII. Los receptores de estos grupos se sitan principalmente a nivel presinptico, donde controlan la liberacin deglutamato(revisado por Cartmell y Schoepp, 2000). La situacin en el terminal presinpticode estos receptores y la capacidad para inhibir la liberacin de glutamato tras su activacin, hacen que se considerenautoreceptores.Ensentidoestricto,losautoreceptoresseactivanporelglutamatoqueelmismo terminal nervioso est liberando, lo que produce una disminucin en la liberacin del mismo. No obstante, estosreceptorespuedenencontrarsetambinensinapsisGABArgicasvecinas,dondemodulanlaliberacin deGABA,unneurotransmisordecarcterinhibidor(ChenyBonham,2005;Renycol.,2007),regulandoasla excitabilidadneuronal en elSNC (revisadopor Schoepp,2001). La Ilustracin 10 esquematiza los fenmenos aqudescritos. Porotrolado,existenevidenciasdelapresenciadeestosreceptoresanivelperisinptico(Shigemotoy col., 1997), aunque no estn claras las condiciones fisiolgicas requeridas para su activacin ni el papel fisiolgicoquedesempean. ExistenestudiosrecientesquerelacionanlaprdidadelosreceptoresdelgrupoIIconlafisiopatologa detrastornosdepresivos(Matriscianoycol.,2008).Adems,laeliminacingnicadeestosdosreceptoresen

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Introduccin ratones permiti descubrir las funciones opuestas que estos receptores desempean en procesos de neuroproteccinneurodegeneracin en neuronas y gla, siendo la activacin de los receptores mGlu3 de astrocitosneuroprotectorafrenteaagentestxicosmientrasquelademGlu2enneuronasresultabaperjudicial (Cortiycol.,2007).
Ilustracin10: ModosdeactivacindelosreceptoresmGlu delosgrupos II/III presinpticos.Losreceptoreslocalizadosenterminales cercanos a los sitios de liberacin de glutamato pueden actuar como autoreceptores y modular la transmisin sinptica (1). Dada la particular geometra de algunas sinapsis el glutamato podra actuar sobre receptores situados extrasinpticamente (2). El glutamato excedentedelespacioextracelularpodraactuarsobrevariosreceptorespresentestantoenneuronasglutamatrgicascomoGABArgicas (3y4).(ModificadodePinheiroyMulle,2008).

El estudio realizado en ratones KO para el receptor mGlu7 propone a estos receptores como posibles dianas teraputicas a la hora del desarrollo de frmacos anticonvulsivos, pudiendo estar directamente relacionadoscontrastornospsicomotorescomolaepilepsia(Sansigycol.,2001).Porotrolado,losKOparalos receptoresmGlu4evidencianlaimplicacindestosenlafuncinmotora(Pekhletskiycol.,1996). I.3.LaadenosinaenelSistemaNerviosoCentral. Laadenosinaesunnuclesidodepurinaampliamentedistribuidoentodaslasclulasdelorganismo.Las caractersticasquedefinenlosneurotransmisoressonvarias,entreellasseincluyequedebensersintetizados por la neurona que los libera, que se almacenan en vesculas o que se requiere estimulacin a nivel presinpticoparasuliberacin.Yaquelaadenosinanoseajustaaestosrequerimientosy,portanto,nopuede ser considerada un neurotransmisor, se define su funcin como la de un neuromodulador de la transmisin

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Introduccin

nerviosa (Ribeiro, 1979), una sustancia que modula el acceso al espacio extracelular tanto de neurotransmisores como de otras sustancias y metabolitos ejerciendo importantes funciones tanto dentro como fuera del SNC. En este sentido se dice que la adenosina ha sido diseada para controlar el flujo de informacinentreneuronasmsqueparatransferirdirectamenteinformacinentreneuronas,comohacenlos neurotransmisores (revisado por Cunha, 2005). Por otro lado, tanto la adenosina como sus derivados son constituyentesesencialesdetodaclulaviva,yaquesonconstituyentesdemetabolitostanimportantescomo el ATP, de segundos mensajeros como el AMPc, de cofactores como el NADH y adems forma parte de la estructuradeloscidosnucleicos. Bajocondicionesfisiolgicasnormales,laadenosinaactacomoagentepromotordelsueoregulando el ciclo sueovigilia. De este modo, se ha comprobado que durante perodos de vigilia prolongados la adenosinaseacumulamientrasqueduranteelsueolosnivelessereducen(Beningtonycol.,1995).Adems, la adenosina participa en multitud de procesos fisiolgicos en condiciones basales, como se describir ms adelante, encontrndose tanto intra como extracelularmente. La concentracin de adenosina en ambos compartimentos se debe tanto a los enzimas que controlan su sntesis y degradacin como a los transportadores de membrana. La concentracin de adenosina intracelular se considera entre 1050 nM (revisado por Cunha, 2001), mientras que a nivel extracelular vara segn los autores, encontrndose generalmente en el rango 25250 nM (revisado por Dunwiddie y Masino, 2001). Estos niveles de adenosina estnfuertementeinfluenciadosporlacargaenergticadelaclula,demodoque,encondicionesenlasque lastasasdegastoenergticoempleadoporunaclulasonsuperioresalastasasenlasqueesaclulaobtiene nutrientesquelepermitanrealizardichogasto,seobservaunincrementodelaconcentracindeadenosina como consecuencia del metabolismo del ATP. En este sentido, una actividad neuronal alta, como ocurre de forma particular en los procesos de hipoxia o isquemia, conlleva un incremento en los niveles de este nuclesido(revisadoporNewby,1991). En general se le atribuyen dos papeles principales a la adenosina (Cunha y col., 2001a), por un lado acta como modulador homeosttico, sealizando situaciones de estrs metablico, y por otro, de mayor importanciaenSNC,controlalaliberacindeneurotransmisoresyconellolaexcitabilidadneuronal(revisado por Cunha,2008). La formacin de adenosina en el medio extracelularpuedeproducirse principalmente por dos mecanismos, bien siendo liberada por transportadores, de tipo equilibrativo, desde el interior celular o bien a partir de nucletidos de adenina extracelulares, principalmente ATP, por accin de las ectonucleotidasas.Laadenosinaintracelularpuedeserformadaporlaaccindevariasenzimasencondiciones deestrscelular,principalmente,trasunaseriedepasos,porhidrlisisdeATP(revisadoporFredholmycol., 2005b). Todos estos procesos estn altamente regulados por el balance energtico del tejido en cuestin (Deussen, 2000) y se ha observado la desregulacin de estos procesos en varias condiciones patolgicas (revisadoporLatiniyPedata,2001).LasiguienteIlustracinesquematizaesteproceso.

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Introduccin
Ilustracin11:Representacinesquemticadelasenzimas ytransportadoresqueregulanlosnivelesdeadenosina.La adenosinapuedeformarseapartirdeAMPporaccindelas las 5nucleotidasas citoslicas tipo I (2) o extracelulares (ecto 5nucleotidasas, 8), puede ser fosforilada por la adenosina quinasa (1) o transformarse por la adenosina desaminasa (5). Su transporte est regulado por los transportadores equilibrativos o concentrativos (7). Otras enzimasrelacionadasconelmetabolismodelaspurinasson laAMPdesaminasa(3),5nucleotidasadetipoII(4),purina nuclesido fosforilasa (6) y la apirasa (9). Modificado de Parkinsonycol.,2006.

Laspurinasejercensusefectosatravsdelosreceptorespurinrgicos.Laadenosinalohaceatravsde losreceptoresdeadenosina,familiaformadapor4miembrosydenominadaP1,elATPlohaceatravsdelos receptores P2, entre los que encontramos los receptores ionotrpicos P2X y los metabotrpicos P2Y (para revisinverBurnstock,2008). I.3.1.Receptoresdeadenosina:clasificacin,localizacin,rutasdesealizacinyfuncionesenelSNC. Laactivacindelosdistintostiposdereceptoresdeadenosinapuedemodificarelmetabolismocelular deacuerdoalsubtipodereceptoractivadoyalmetabolismodecadatipocelularenparticular.Lasprimeras evidenciasdelaexistenciadeestosreceptoresprovienendelao1970(SattinyRall,1970)cuandoseobserv que la acumulacin de AMPc mediada por adenosina en cerebro era antagonizada en presencia de metilxantinas. Cuando se descubri que distintos compuestos derivados de la adenosina eran capaces de incrementarodisminuirlacantidaddeAMPcintracelularsepropusoquelaadenosinainteraccionabacondos tiposdereceptores,losqueinhibanlaadenilatociclasasedenominaronA1(vanCalkerycol.,1979)ylosquela estimulabanA2(Londosycol.,1980). Posteriormente, gracias a tcnicas de biologa molecular y farmacolgicas, han sido definidos y caracterizadoscuatroclasesdereceptoresdeadenosina,todosellosacopladosaprotenasG,incluidosdentro de la familia A de GPCR. Los receptores del tipo 2 se subdividieron en receptores de alta afinidad, A2A, y receptoresdebajaafinidad,A2B (Burnsycol.,1986).En1992seclonycaracterizelltimodelosreceptores de la familia, denominado A3 (Zhou y col., 1992), el cual se observ que tambin estaba acoplado de forma inhibidoraa la adenilato ciclasa. Los receptores A1, A2A y A2Bpresentan unaelevadahomologadesecuencia entrelasdistintasespeciesenlasquehansidoclonadossinembargo,noocurrelomismoconelreceptorA3,el cualpresentadiferenciasconsiderablesentreespecies. De los cuatro receptores de adenosina, el receptor A1 es el ms abundante y el ms ampliamente distribuidoencerebro(Fastbomycol.,1987),mientrasquelosA2Aseencuentranconcentradosenlosganglios basalesaunqueestnpresentesentodoelcerebroaunadensidadmenor(revisadoenFredholmycol.,2003).

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Introduccin

ExistebastanteinformacinacercadeladistribucindelosreceptoresA1yA2Adediferentesespeciesobtenida medianteelempleoderadioligandosyanticuerposespecficos(revisadoporRibeiroycol.,2002).Engeneral,la localizacin de ambos receptores en SNC es predominantemente sinptica, siendo a nivel postsinptico ms densoslosreceptoresA1quelosA2A,aexcepcindelestriado,dondelosreceptoresA2Asonmuchomsdensos a nivel postsinptico que los A1. Adems de esta localizacin neuronal, ambos receptores tambin se encuentranenastrocitosymicrogla,losA1enoligodendrocitosylosA2Aenlosvasossanguneos.Debidoasu pocaabundanciaencerebroelpapeldelosreceptoresA2ByA3harecibidomenosatencin.Aestehechohan contribuidolafaltadeherramientasfarmacolgicaspotentesyselectivas,loquehahechoaestosreceptores mucho menos estudiados y, por tanto, comprendidos que los receptores A1 y A2A. La capacidad de los receptores de adenosina para regular las diversas funciones biolgicas en las que estn implicados est estrechamenterelacionadaconlaconcentracinextracelulardeadenosina.LosreceptoresA1ylosA2Asonlos msafinesporsuligando,mientrasquelosreceptoresA2ByA3presentanunaafinidadmenorporlaadenosina, porloqueelpapeldeestosreceptorescobraraimportanciaensituacionesdeestrsfisiolgicoopatolgicas enlasquelaconcentracindeadenosinaaumenteenormemente(revisadoporFredholm,2007yGessiycol., 2008) Losreceptoresdeadenosinafueroninicialmenteclasificadosenfuncindesucapacidadparainhibiro estimularlaactividadadenilatociclasa,comoyasehacomentadoanteriormente.Sinembargo,enlaactualidad hay autores que cuestionan esta clasificacin ya que, todos los receptores de adenosina han demostrado su capacidad para acoplarse a distintos sistemas de protenas G y a diferentes sistemas de transduccin en diferentestiposcelulares.Porello,loqueestosautoresproponenesqueestosreceptorespresentanefectos pleiotrpicos,esdecir,potencialmentepuedenacoplarseadiferentessistemasdetransduccin,ellodepende desugradodeactivacinydelalocalizacinsubcelularencuestin(revisadoporCunha,2005). TraslaactivacindelasprotenasGcorrespondientes,losreceptoresdeadenosinatambinmodulanla actividaddevarioscanalesinicos,comoesposiblepredecirenfuncindelascaractersticascomentadasde las protenas G heterotrimricas. As, el receptor A1 media la inhibicin de la adenilato ciclasa, inhibe varios canalesdepotasio(LiyHenry,1992),inhibecanalesdecalciodetipoN,PyQ,activalafosfolipasaCyactiva la va de las MAP quinasas a travs de ERK1/2, va subunidades (Dickenson y col., 1998). No obstante, el principalefectofisiolgicomediadoporestereceptor,lainhibicinpresinpticadelaliberacindeglutamato, parecenoestarrelacionadoconlacapacidaddeestereceptordemodularlosnivelesdeAMPcsinomsbien con la inhibicin de la entrada de calcio (Cunha, 2001). Por otro lado, la inhibicin de la actividad neuronal mediada por el receptor A1 tiene un componente adicional a nivel postsinptico, donde la activacin de los receptores A1 inhibe la conductancia de potasio, lo que produce la hiperpolarizacin neuronal (revisado en GreeneyHaas,1991),efectoimportantealahoradecontrolarlaactivacinneuronalaelevadasfrecuenciasde estimulacin(Thompsonycol.,1992). EstapleiotropanoescaractersticanicamentedelreceptorA1.EnelcasodelreceptorA2A,elcualse asume que est acoplado de manera estimuladora a la adenilato ciclasa a travs de una Gs (o una Golf) aumentandolosnivelesdeAMPc,variosgruposhandemostradoqueestosreceptorescontrolanlaliberacin

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Introduccin delamayoradelosneurotransmisores(glutamato,GABA,glicina,acetilcolina,noradrenalina,serotonina)de formaindependientedelosnivelesdeAMPcperodependientedelaactivacindelaPKC,alestimularcanales decalciodependientesdevoltaje(CunhayRibeiro,2000). Enresumen,enrelacinalosdosprincipalesreceptoresdeadenosinadelcerebro,laaccinfisiolgica de ambos parece ser opuesta en lo que al control de la liberacin de neurotransmisores se refiere. En particular, en sinapsis glutamatrgicas se ha observado que estos receptores colocalizan en el hipocampo (Rebolaycol.,2005b)yexisteunarelacinfuncionalentrelosmismosconefectosopuestossobrelaliberacin deglutamato(Lopesycol.,1999b).Porotrolado,dadoelhechodequelaafinidaddeambosreceptoresporla adenosina sea similar, encontrndose en el rango del nanomolar bajo, es posible asumir que deben existir diferentesmecanismosporlosquesegenereadenosinaenuntejidoquepermitanactivarunreceptoruotro, yaqueambospresentanaccionesopuestassobreliberacindeneurotransmisores(revisadoenCunha,2005). Adems de los efectos descritos sobre el control de la actividad neuronal, la adenosina ejerce otros efectos enclulas del SNC que tambinpueden influenciar la actividad neuronal. Por ejemplo, losastrocitos expresanloscuatrosubtiposdereceptoresdeadenosina(revisadoporCiccarelliycol.,2001)quecontrolansu actividadylaliberacindesustanciasquepuedaninfluenciarlaactividadneuronal(Schwaningerycol.,1997; Brodieycol.,1998).Porsupartelaadenosinatambincontrolalareactividaddelamicrogla(Wollmerycol., 2001),pudiendoestarimplicadaenelcontroldelaneuroinflamacin(Schubertycol.,1996).Portodo,ellola adenosina puede tener una influencia muy activa en la comunicacin glaneurona, como se trata de representarenlasiguienteIlustracin.
Ilustracin 12: Comunicacin

neuronagla mediada por los receptores A1 y A2A. Todos los tipos y compartimentos celulares estn dotados de receptores A1 y A2A en diferentes proporciones, indicadas por el tamao relativo de los crculos, que desempean distintospapelesenfuncindesu localizacin, comentado Abreviaturas: como en IK, el se ha texto.

conductancia

parapotasio;GLT1,transportador de glutamato; VSCC, canales de calcio sensibles a voltaje (del ingls, Voltage Sensitive Calcium Channels). Modificado de Cunha, 2005.

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Introduccin

No obstante, estos procesos pueden complicarse todava ms ya que la idea tradicional de los receptores como entes aislados y funcionando como sistemas de sealizacin independientes no se corresponde con los hallazgos realizados en el campo de la biologa molecular, en los que ha quedado demostrado que los receptores de adenosina pueden funcionar como homo (Ciruela y col., 1997) o heterodmeros,bienjuntoconotrosreceptorespurinrgicos(Yoshiokaycol.,2002)obienjuntoareceptores deotrasfamilias,comolosmetabotrpicosdeglutamato(Ciruelaycol.,2001;Nishiycol.,2003),loqueampla enormementeelposibleimpactodelaadenosinaenlafuncincerebral.Porotrolado,laactivacindeestos receptoresconlleva,comoparatodoslosGPCR,procesosdedesensibilizacincaractersticosquedanlugara lasvasdesealizacinmediadasporarrestinas(Klaasseycol.,2008). Finalmente,cabedestacarlacapacidadconocidadelosreceptoresdeadenosinadeproducircambiosen el ciclo celular. Se ha demostrado que A1, A2A, A2B y A3 pueden activar ERK1/2 (Schulte y Fredholm, 2000), aunqueenelcasodeA2Adependedeltrasfondocelular(revisadoporFredholmycol.,2007).Porsuparte,se hademostradoqueA2B,ademsdeactivarlarutadelasMAP,escapazdeactivarJNKyp38(Feoktistovycol., 1999). I.3.2. Papelfisiolgicodelaadenosina:fenotiposdelosratonesKnockout. Enelapartadoanteriorsecomentaronlasprincipalesfuncionesdelaadenosina,actuandoatravsde susreceptoresenelSNC.Noobstante,comosehacomentadolaadenosinaseencuentrapresenteentodaslas clulas del organismo, por lo que el nmero de funciones fisiolgicas en las que se encuentra implicada es mayorquelasobservadasparacualquierneuromodulador.Enesteapartadosedescribirnbrevementeotras funcionesdesempeadasporlaadenosinaobservadasapartirdelestudiodeanimalesdeficientesenalgunode susreceptores,quesecompletarnconlaTabla2,quemuestralasprincipalesfuncionesreconocidasparalos distintosreceptoresdeadenosina. DadalaabundanteexpresindelreceptorA1encerebroeradeesperarqueladeficienciaenestegen proporcionara un fenotipo bastante diferente del salvaje. En este sentido, se ha observado que los ratones deficientes para el receptor A1 (Johansson y col., 2001; GimnezLlort y col., 2002) presentan una marcada ansiedad,uncomportamientoagresivoylarespuestaahipoxiaestsustancialmentealterada,reduciendola viabilidaddelosmismosanteestosprocesos.Porotrolado,estosratonessonnormalesenlamayoradelos aspectos (viabilidad, fertilidad, peso, temperatura, reflejos motores, memoria). El estudio de estos ratones tambin permiti definir el papel analgsico de la adenosina, ya que se observ que los ratones KO para el receptorA1eranmssensiblesaldolorsinpresentarunasensibilidadanteunaestimulacinmecnicamayor. EstosresultadosdemuestranqueelpapeldelreceptorA1noesesencialeneldesarrollodelorganismopero quedesempeaunpapelimportanteencondicionespatolgicas,comolahipoxia,ypudieraestarrelacionado con otras condiciones patolgicas o con el desarrollo de analgsicos. En el caso particular de la hipoxia se observ que el efecto de la eliminacin del receptor A1 era dependiente de la edad, observndose que los animalesadultossobrevivanmenosaprocesoshipxicosenausenciadelreceptorA1,peroquelosneonatos

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Introduccin salvajes eran ms sensibles a la ausencia de oxgeno que los KO (Turner y col., 2004). No obstante, estos ratonespresentanunavidamediamscorta,debidaquizadisfuncionescardiovasculares,renalesohepticas, dondelosreceptoresA1desempeanunpapelimportante. Los ratones KO para el A2A se consiguieron en 1997 por el mismo laboratorio que clon primero los receptoresdeadenosina(Ledentycol.,1997),aunqueotrosanimalesseconstruyeronposteriormente(Cheny col., 1999). Su estudio demuestra que estos animales presentan una presin sangunea elevada y mayores nivelesdeagregacinplaquetaria,aunquesonviablesysealimentanconnormalidad.PorotroladolosA2Ason tambin importantes para los efectos estimulantes de la cafena a nivel motor, observndose que en estos animaleselefectodelacafenaeramsbienelcontrario,unadepresindelaactividadmotora(Yangycol., 2009). Por otro lado, los machos deficientes en este receptor presentaban un carcter ms agresivo que pudieraestarrelacionadoconlaansiedadeirritabilidaddescritaenhumanosporconsumocrnicodecafena (Fredholmycol.,1999).AligualquelosKOparalosreceptoresA1,losratonesdeficientesenA2Asoportaban mejor el dolor segn varios tests (Berrendero y col., 2003). Por ltimo, el estudio de estos animales se ha relacionado con procesos patolgicos. Se ha demostradoque la activacin de estos receptorescontribuyeal daocerebralproducidoenprocesosisqumicosyqueelempleodeantagonistasdeestosreceptorespuede resultarunaherramientavlidaparaeltratamientodelaenfermedaddeParkinsonascomoparaeldesarrollo deagentesantidepresivosefectivos,mientrasqueelusodeagonistaspuederesultarinteresantecomodroga antipsictica.Enelcasodelahipoxia,estosratonesmuestranefectosopuestosalosobservadosenlosKOdel receptorA1,desempeandoelreceptorA2Aunimportantepapelprotectorenlahipoxiacerebralneonatal.Un datocuriososurgidelposibleempleodeantagonistasdelreceptorA2Acomodrogastilesenlosprocesosde abstinenciaporalcohol(ElYacoubiycol.,2003),apesardequelosratonesKOconsumanmsetanolquelos salvajes(Naasilaycol.,2002). MientrasqueelpapeldelosreceptoresA1yA2Aestbastanteestablecidoencerebro,losreceptoresA2B yA3hansidorelacionadosmsfcilmenteconsusfuncionesenrganosperifricos,principalmenteporlafalta deligandosespecficosylabajadensidaddeestosreceptoresencerebro.ElKOparaelreceptorA2Bhasido construido recientemente (Yang ycol., 2006),no obstante su estudio se ha centrado en rganos perifricos, donde parece desempear funciones ms importantes que en SNC, como son la proteccin frente a la inflamacinylaexcesivaadhesincelular(Xuycol.,2008). Ratones KO para el receptor A3 presentanuna disminucin en la permeabilidad vascular (Tilley y col., 2000) y una mayor respuesta al tratamiento con adenosina en corazn y aorta (Zhao y col., 2000), aunque debido a las diferencias farmacolgicas y de distribucin entre ratones y humanos no est claro que el resultadoseaporcompletoextrapolable.Porotrolado,estosratonespresentanunamenorsensibilidadfrente aalgunostiposdedolor,unaelevadaactividadmotorasinsignosdeansiedadyunamayorneurodegeneracin enprocesosdehipoxia(Fedorovaycol.,2003).Portodoello,apesardelabajaexpresindelosreceptoresA3 en cerebro, los efectos observados en estos ratones sealan que estos receptores desempean un papel complejoenelcontroldeltemperamentoeinclusopudieranestarrelacionadosconeldesarrollodelindividuo (Bjrklundycol.,2008).

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Acoplamientoa protenasG Agonistas Selectivos Antagonistas selectivos

Introduccin

Subtipo

Principalesfuncionesfisiolgicas

Bradicardia,inhibicindelalipolisis,reduccindelafiltracin CPA Gi A1 Go RPIA CHA DPCPX glomerular,retroalimentacintuberoglomerular,antinocicepcin, reduccindelaactividadsimpticayparasimptica,inhibicin presinptica,hiperpolarizacinpostsinptica,precondicionamiento isqumico Regulacinsensomotoraengangliosbasales,inhibicindela Gs A2A Golf HENECA CGS21680 ZM241385 agregacindeplaquetasydeleucocitospolimorfonucleares, vasodilatacin,proteccinfrentealdaoisqumico,estimulacin delaactividadnerviosa Gs A2B Gq/11 Gi A3 Gq/11 Tabla 2: Resumen del acoplamiento a protenas G, farmacologa y principales funciones fisiolgicas de los receptores de adenosina. AdaptadodeFredholmycol.,2005a. 2ClIBMECA MRS1220 PSB1115 Relajacindelmsculolisoenlavasculaturaeintestino,inhibicin delafunctiondemonocitosymacrfagos,estimulacinde mastocitos(algunasespecies) Estimulacindemastocitos(algunasespecies), precondicionamiento(algunasespecies)

I.4.Neurodegeneracin:Procesosdemuerteneuronal. Lasneuronasdelosmamferosestnentrelostiposcelularesdevidamslargadelorganismo.Apesar del descubrimiento reciente de que las clulas madre neuronales pueden proliferar en el cerebro adulto (revisadoenAbrousycol.,2005),sehaaceptadocomodogmaquelamayoradeneuronasdelSNCperduran durante toda la vida del organismo. No obstante, las neuronas no son invulnerables y durante el propio desarrollo embrionario, el sistema nervioso se remodela eliminando el exceso de neuronas asegurando un correcto desarrollo. Se trata de una muerte programada imprescindible para una adecuada formacin del sistemanervioso.Ademsdeesteprocesofisiolgico,lasneuronastambinpuedenmorirdeformaprematura encualquiermomentodelavidadelindividuocuandoseproducensituacionesneurotxicasagudasocrnicas (revisadoenYuanycol.,2003). Enunestudioclsicodemuertecelularduranteeldesarrolloembrionario(SchweichelyMerker,1973) se clasificaron los tipos de muerte celular en tres categoras basadas en diferencias morfolgicas y estructurales: apoptosis (Kerr y col., 1972; revisado por Danial y Korsmeyer, 2004), autofagia y necrosis (revisado por Edinger y, Thompson, 2004). Aunque la apoptosis y la necrosis han sido contempladas normalmentecomodostiposdemuertedistintas,cadavezhaymsevidenciasdequeenrealidadrepresentan losdosextremosdeunampliorangodetiposdemuertecelularclasificadasenfuncindesuscaractersticas morfolgicasybioqumicas.Dehecho,nosiempresecumplentodoslosrequisitosquepermitencaracterizar undeterminadoprocesodemuerteeinclusounmismoestmulopuedeinduciruntipodemuerteuotroen

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Introduccin funcindesuintensidad,lasubpoblacinneuronalimplicada,laespecie,laedadoelgenotipodelorganismo en cuestin. La Ilustracin 13 expone un resumen de las rutas caracterizadas de supervivencia y muerte neuronal.
Ilustracin 13: Rutas descritas de supervivenciaymuertecelular.Unejemplode activacin de rutas de supervivencia es el descrito para la activacin de receptores para factores neurotrficos (NTF), en las cuales se activan cascadas de sealizacin y factores de transcripcin que incrementan la produccin de protenas implicadas en supervivencia o antiapoptticas (BCL2, BCLXL, etc). Las rutas de muerte celular pueden activarse por la liberacinmasivadeglutamato.Enestecaso,la sobreactivacin de receptores produce la entradamasivadecalcio,quepuedeinducirla activacin de protenas proapoptticas, como PAR4, BAD, BAX y p53, las cuales acaban liberando citocromo c quedando activada la ruta de las caspasas. Adaptado de Mattson, 2000.

En este apartado se expondrn las principales caractersticas de los agentes txicos empleados en la parteexperimentaldelapresenteMemoria. I.4.1.Excitotoxicidad. Histricamente,eldescubrimientodelacapacidadneurotxicadelglutamatodatadefinalesdelos50. Lucas y Newhouse encontraron que al inyectar Lglutamato en ratones en desarrollo se destruan las capas neuralesinternasdelaretina(LucasyNewhouse,1957).SeguidamentefueJonhOlneyelqueconfirmesta retinotoxicidady,traselestudiodelprocesoanivelcelular,acueltrminoexcitotoxicidadparadarnombre a la neurodegeneracin producida por aminocidos excitadores (Olney, 1969). Ya se ha comentado que el glutamatoejercesusefectosatravsdelosreceptoresdeglutamato,portanto,suliberacinmasivaproduce la estimulacin rpida de los receptores ionotrpicos de glutamato postsinpticos, permitiendo el flujo descontroladodeionesNa+yCa2+alinteriorcelular(revisadoenCoyleyPuttfarcken,1993).Engeneral,seha propuesto que el calcio que entra a travs de los receptores NMDA es especialmente letal, debido a la

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Introduccin

colocalizacindeestoscanalesconprotenascelularesespecialmentesensibles,porloquesehandesarrollado unnmeromselevadodetrabajosrelacionadosconlaexcitotoxicidadenestosreceptoresionotrpicosque enelresto.Noobstante,eldesarrollodefrmacosclnicosparaelinfartocerebralbasadosenelbloqueodelos receptores ionotrpicos no ha proporcionado resultados satisfactorios (Muir y Lees, 1995), a pesar de los buenosresultadosobtenidosenmodelosexperimentales. En cualquier caso, un mediador clave de este proceso de muerte celular es el in Ca2+, el cual est implicadoenmultituddeprocesoscelularescomocrecimientocelular,diferenciacinyactividadsinptica.Se encuentra regulado, tanto espacial como temporalmente, por complejas relaciones entre su entrada, salida, almacenamiento y tamponamiento. Es esta regulacin tan compleja la que permite que puedan darse diferentesprocesosmediadosporcalcioenunamismaclula.Debidoaestagrancomplejidaddelsistemade estudio los mecanismos desencadenados por la liberacin masiva de calcio no se comprenden por completo (revisadoporArundineyTymianski,2003).Acontinuacinseesquematizaesteprocesodeformaglobal.
Ilustracin 14: Sucesos generales que ocurren en la muerte por excitotoxicidad. Tras un estmulo desconocido se produce la liberacin masiva de glutamato a la hendidura sinptica. El glutamato actua sobre los receptores ionotrpicos produciendo la entrada masiva de calcio, el cual produce mltiples efectoscomodisfuncinmitocondrial,dficitenergtico y generacin de especies reactivas de oxgeno (ROS) y nitrgeno (RNS). Al final de estos procesos se encuentraneldaocelularporperoxidacnlipdica,en protenascelularesyaniveldeADN,pudindoseactivar proteasas dependientes de calcio y la va de las caspasas.ModificadodeLoycol.,2003.

Por otro lado, existen evidencias considerables sobre el papel de la excitotoxicidad en diversidad de trastornos neurodegenerativos agudos como el infarto cerebral, la epilepsia, lesiones de la mdula espinal e hipoglucemia (revisado por Choi, 1988), as como en enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson, corea de Huntington y esclerosis lateral amiotrfica (revisado por Gardoni y Di Luca, 2006 y por Coronaycol.,2007).

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Introduccin I.4.2.Efectodeladisponibilidadbiolgicadeoxgeno. Enelcerebroadulto,lamuertecelularpuedeserdebidaamultituddefactorestxicos,sinembargo,el mscomndeelloseslainterrupcinsbitadelflujosanguneooisquemia.Elelevadoaportedeoxgenoque requiereelcerebroparamantenersumetabolismohacequesteseauntejidoespecialmentesensiblealos efectosdelahipoxia.SegnlaAmericanHeartAssociationcada45segundosalguiensufreunderramecerebral ycada3minutosalguienmuereporestacausasloenEstadosUnidos.Lossupervivientesdeestaenfermedad sufrendeficienciasfsicas,emocionalesycognitivasenmuchoscasospermanentes,loquehacemsevidentela necesidad de una descripcin adecuada del dao producido en estas situaciones as como de posibles mecanismosquepuedaninfluirenestosprocesosdemuerteneuronal. A nivel molecular la hipoxia produce profundos cambios en los perfiles de expresin gnica celulares. Estosefectosestngobernadosporunafamiliadefactoresdetranscripcinaltamentereguladaconocidacomo HIF(delinglshypoxiainduciblefactor).Ademsdeestafamiliadefactoresdetranscripcin,otrosfactoresy rutascelularesseactivancomoconsecuenciadeladisminucinenlapresinparcialdeoxgeno(revisadospor KennethyRocha,2008).ElfactorHIFesundmeroformadoporunasubunidad,sensiblealadisponibilidad deoxgeno,yunasubunidad,queseexpresadeformaconstitutiva.Seconocenvariassubunidadesparael factorHIF,enmamferossedenominanHIF1,HIF2yHIF3.Laprimeraseexpresadeformaubicua,pero las otras dos subunidades presentan una distribucin ms restringida. La activacin de este factor de transcripcinesunprocesoenvariospasosquecomprendelaestabilizacindelasubunidad,latranslocacin alncleo,suheterodimerizacinylaposibleinteraccinconotrasprotenasqueregulendeformamsprecisa laactivacintranscripcionaldelosgenesactivadosporhipoxia(revisadoporBrahimiHornycol.,2005).Este procesoseesquematizaenlaIlustracinsiguiente.
Ilustracin15:VariossensoresdeoxgenocontrolanlaactividaddeHIF1.ElfactorHIFesunheterodmeroformadoporunasubunidad sensibleaoxgenoyunasubunidadinsensibleaoxgeno.Lasubunidadessusceptibledeserhidroxiladapordossensoresdeoxgeno, las prolil hidroxilasas (PHD), que inducen la unin de la protena supresora de tumores von HippelLindau (VHL) y su degradacin proteosomal, y los factores inhibidores de HIF (FIH), que impiden la unin del cofactor p300 requerido para la transcripcin de algunos genes diana. Durante la hipoxia estas hidroxilasas seencuentran inactivas, estos procesos se suprimen y se permite la formacin de un complejodetranscripcinactivo.ModificadodeDangycol.,2008.

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Introduccin

Ademsdelpapeldesempeadoporlahipoxiaenprocesosdedaocerebral,sehandescritorelaciones entre la principal familia de factores de transcripcin que controla los efectos de la hipoxia sobre el transcriptoma y procesos relacionados con la oncologa. Por un lado, se ha descrito la interaccin de los factoresHIFcononcogenes,comolafamiliaMYC.Estainteraccinpermite,bajocondicionesfisiolgicas,una adecuacin del ciclo celular frente a una situacin de baja disponibilidad de oxgeno, sin embargo, en condiciones tumorales, esta interaccin confiere a las clulas tumorales ventajas metablicas frente a las clulas no transformadas (revisado por Dang y col., 2008). Por otro lado, se ha relacionado los factores HIF como principales mediadores de la neovascularizacin, el metabolismo de la glucosa, las supervivencia y la metstasistumoral(revisadoporPouyssgurycol.,2006).Estosnuevosdescubrimientosponendemanifiesto laimportanciadelestudiodelosfenmenosrelacionadosconlahipoxiaylasealizacincelularsubyacente. I.4.3.ElpptidoamiloideylaenfermedaddeAlzheimer. La enfermedad de Alzheimer se define como una enfermedad degenerativa progresiva del cerebro caracterizadaporladesorientacinylaprdidadememoria,deatencinydelacapacidadderaciocinio.Se consideralaprimeracausadedemenciaenlavejez,abarcandohastael70%deloscasos.Teniendoencuenta el envejecimiento progresivo de la poblacin mundial el estudio de esta enfermedad est ampliamente justificado.FuedescritaporprimeravezporelneuropatlogoalemnAloisAlzheimeren1906,quepublicel casodeunamujerde51aoscuyasfacultadesintelectualeshabandesaparecidogradualmenteenunperodo de4aos(traducidoenAlzheimerycol.,1995). Losdesencadenantesdeestaenfermedadnoestnclarosenlaactualidad,aunqueexistenvariasteoras al respecto. Las hiptesis existentes se basan en los dos rasgos anatomopatolgicos caractersticos de esta enfermedad. La presencia de acumulaciones de protenas en las neuronas y fuera de ellas es el rasgo ms caracterstico y se considera un marcador de la misma, de hecho se conoce desde 1968 que existe una correlacinentreladensidaddeestasacumulacionesextracelularesylaseveridaddelademencia(Blessedy col.,1968).Sinembargo,nofuehastacasi80aosdespusdeltrabajodeAlzheimercuandoseidentificaron los componentes moleculares de estas acumulaciones de protena, por un lado el pptido amiloide, o simplementepptidoamiloide,provenientedelarupturaproteolticadeunaprotenatransmembrana,erael componentebioqumicoprincipaldelasplacasneurticasextracelulares(GlenneryWong,1984),mientrasque laprotenatauhiperfosforilada,unaprotenadeuninamicrotbulos,eraelcomponentecentraldelosovillos neurofibrilares intracelulares (GrundkeIqbal y col., 1986). No obstante, se desconoce el papel exacto que tienenestasestructurasalahoradeldesarrollodelaenfermedad,culeslacausadesuaparicin,sisoncausa oconsecuenciayporqualgunospacientesancianostienenneurofibrillasynodesarrollansntomasmientras otrospacientessquedesarrollanlaenfermedad(Shojiycol.,1992). LahiptesismsampliamenteaceptadaparaexplicareldesarrollodelaenfermedaddeAlzheimeresla denominadahiptesisamiloide(revisadaporHardyySelkoe,2002).Estahiptesisestablecequeelaumento en lacantidad depptido amiloide en elcerebro es elprimer factorpatognico que conduce al resto de las

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Introduccin caractersticashistolgicasyclnicasobservadasenestaenfermedad,entreellas,lahiperfosforilacindetau. Enlaactualidad,aunqueparececlaroqueelpptidoamiloidedesempeaunpapelcentraleneldesarrollode laenfermedad,existenevidenciasdequenosloseacumuladeformaextracelular,sinoquesehandescrito agregadosintracelularesquepodrantenerdiferentesefectospatolgicos(revisadoporLaFerlaycol.,2007), que podran ser anteriores a la acumulacin de pptido amiloide extracelular (Braak y Del Tredici, 2004) e inclusoquelaestructuratxicamspequeaestformadapordmerossolublesdelpptidoamiloide(Shankar y col., 2008). Estos nuevos descubrimientos hacen que las hiptesis de trabajo sobre la patognesis de la enfermedaddeAlzheimerestnencontinuarevisin.As,sehapropuestorecientementequedeficienciasen lospatronesdemielinizacinsonanterioresalaaparicindelasplacasylosovillosenunmodeloanimal(Desai ycol.,2009)oqueplacasyovillospodransercausadosporunantecedentecomnyambasrutasseranigual deimportanteseneldesarrollodelaenfermedad(revisadoporSmallyDuff,2008).EnlapresenteMemoriase ha aceptado la hiptesis amiloide, emplendose la exposicin al pptido amiloide como modelo experimentalinvitro. Elpptidoamiloideprovienedelaprotenaprecursoradeamiloide(APP,delingsAmyloidPrecursor Protein), la cual sufre cortes secuenciales por varias proteasas, denominadas , y secretasas. La glicoprotena APP es ubicua y se encuentra codificada en el cromosoma 21, atraviesa la membrana y su heterogeneidad proviene de procesamiento alternativo y de modificaciones post traduccionales (Kang ycol., 1987).Seconocenhastalafecha4variantesporsplicingalternativosiendolamscomndeellaslaqueda lugaraunaprotenade695aminocidosperopudiendoalcanzarhasta770(Eschycol.,1990). ElprocesamientofisiolgicodeAPPpuedeocurrirpordosvas:amiloidognicaynoamiloidognica.La rutanoamiloidognicaeslamayoritariayexcluyelaformacindelpptidoamiloide.Elprimercortedeestava laproduceunaenzimadenominadasecretasa,unametaloproteasa,quecortapormediodelfragmentoque daralugaralpptidoamiloide,liberndoseunfragmentodeaproximadamente100kDa(sAPP)yunfragmento menor que puede sufrir cortes adicionales (C83). Por otro lado, el primer corte de la ruta amiloidognica lo produce la secretasa, tambin llamada BACE1 (del ingls site APPCleaving Enzyme 1), que libera un fragmento al exterior celular (sAPP) mientras que otro fragmento de 99 aminocidos queda anclado en la membrana(C99).EsteC99serposteriormentecortado,poruncomplejodenominadosecretasa,entrelos aminocidos38y43paraasliberarelpptidoamiloide.Ellugarexactodecorteesmuyrelevanteenloquea la capacidad de agregacin del pptido resultante se refiere, siendo el corte mayoritario el que libera un fragmento de 40 aminocidos y estando las placas neurticas principalmente formadas por el pptido de 42 aminocidos. En individuos sanos, la proporcin de los fragmentos de 40 y 42 aminocidos es de 10:1 respectivamente, mientras que esta proporcin aumenta en condiciones patolgicas (revisado por LaFerla y col.,2007). Anivelmolecularlasconsecuenciasbiolgicasdelaacumulacindelpptidoamiloidesonvarias.Engeneral,se aceptaqueexisteunbalancedescompensadoentrelaproduccinylaeliminacindelpptidoamiloide,elcual presenta tendencia a agregarse formando placas insolubles, que conduce gradualmente a un deterioro sinptico con activacin glial, siendo la acumulacin de este pptido responsable del deterioro cognitivo

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Introduccin

observado(HardyySelkoe,2002).Sinembargo,losprocesosquellevandelaacumulacindelpptidoamiloide al deterioro neuronalno estn todava claros, aunque se resumen en la generacinde especies reactivas de oxgeno, alteraciones mitocondriales y la desregulacin de la homeostasia del calcio (revisado por Mattson, 2004). Por los estudios realizados en modelos experimentales se deduce que la acumulacin del pptido amiloide genera estrs oxidativo (Nunomura y col., 2001), el cual afecta al calcio neuronal, haciendo a las neuronasmssensiblesalosfenmenosdeexcitotoxicidadyaldesarrollodealteracionesenelcitoesqueleto (revisado por Bezprozvanny y Mattson, 2008). La hiperfosforilacin de la protena tau inhibe el correcto ensamblaje de los microtbulos, produciendo en ltima instancia la degeneracin de la neurona afectada (revisado por Iqbal y GrundkeIqbal, 2006). Por otro lado, la acumulacin del pptido amiloide produce la activacin glial antes descrita, que resulta en una respuesta inflamatoria descontrolada con efectos neurodegenerativos(revisadoporDhawanycol.,2008). En lo que respecta a la acumulacin del pptido amiloide, se ha demostrado que las mutaciones que conducen a un mayor procesamiento amiloidognico de la protena APP dan lugar a una forma de esta enfermedaddenominadahereditariaofamiliarquecomprendeentreel1yel5%deltotaldecasosdetectados en humanos. No obstante, a nivel de tejido los efectos de la variante espordica de la enfermedad son indistinguibles de los de la hereditaria, por lo que la mayora de los modelos empleados para el estudio de mecanismos y desarrollo de terapias estn basados en la introduccin en el animal de laboratorio de una mutacinqueconlleveelaumentodelaacumulacindelpptidoamiloide.EnlaIlustracin17seexponenlas principalesaccionesneurotxicasdescritasparaelpptidoamiloide.

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Introduccin
Ilustracin 16: Procesamiento de la protena APP y eventosclavesenlapatognesisdelaenfermedadde Alzhemier. Panel Izquierdo. La protena precursora del pptido amiloide puede sufrir un procesamiento amiloidognicoonoamiloidognico,siendoesteltimo el que da lugar a la liberacin del pptido amiloide. Modificado de LaFerla y col., 2007. Panel Inferior. El pptido amiloide formado intra y extracelularmente oligomeriza formando placas insolubles. Oligmeros solubles pueden interferir con la actividad sinptica, mientras que las placas neurticas producen disfunciones en las neuronas vecinas. Entre ellas, la hiperfosforilacin de la protena tau, que forma ovillos intracelulares. Microgla activada y astrocitos reactivos pueden participar en la respuesta inflamatoria local contribuyendo a la neurotoxicidad. Modificado de Selkoe,2004.

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Ilustracin 17: Neurotoxicidad inducida por el pptido amiloide. La interaccin del pptido amiloide con iones metlicos genera agua oxigenada. El estrs oxidativo asociado a la membrana plasmtica produce peroxidacin lipdicayoxidacindeprotenas.Algunasdelas protenas modificadas son transportadores de membrana, receptores, protenas G o canales inicos, que resultan desreguladas. Esta desregulacin produce la activacin de quinasas capaces de hiperfosforilar a la protena tau, dando lugar a los ovillos neurofibrilares. El pptido amiloide tambin produce estrs oxidativo a nivel mitocondrial, loquegeneradisfuncionesanivelmetablicoy enlaregulacindelahomeostasiadelcalcio,lo que a su vez produce ms radicales libres. AdaptadodeMattson,2004.

Introduccin

I.4.4.Efectosdelestrsoxidativo. El estrs oxidativo puede desencadenar procesos de muerte celular, generalmente apopttica, por variosmecanismos,debidosprincipalmenteaquelasespeciesreactivasdeoxgeno(ROS,delinglsReactive Oxygen Species) producen modificaciones oxidativas que afectan a protenas, ADN, lpidos de membrana y otrasmolculas.ElestudiodelosefectosdelosradicaleslibressobrelasclulasdelSNCresultainteresanteya que se ha postulado que la prdida de funciones fisiolgicas con la edad puede estar relacionada con la acumulacinprogresivadedaooxidativoque,enltimaestancia,puededeterminarelperiododevidadeun organismo. Esta teora se formul inicialmente en 1956 (Harman, 1956), aunque se ha reformulado varias veceshastadarlugaralateoramitocondrialdelenvejecimiento(revisadaporJangyRemmen,2009).Porotro lado, se ha demostrado un incremento del dao oxidativo producido con la edad en varios tejidos tanto en humanos como en varios modelos experimentales (revisado por Muller y col., 2007), lo que podra estar relacionado con el desarrollo de algunas enfermedades neurodegenerativas (revisado por Barnham y col., 2004). Laformacinderadicaleslibresconcapacidadoxidativaseproduceprincipalmenteenlamitocondria, enconcreto,loscomplejosIyIIIdelacadenarespiratoriasonlasprincipalesfuentesdelaninsuperxido(O2) (Jezek y Hlavat, 2005). Sin embargo, este orgnulo tambin posee un complejo sistema de defensa antioxidativa (Yu, 1994) formado por enzimas que rpidamente transforman los radicales libres en especies qumicasnotxicas.Sielbalanceentrelaformacinderadicaleslibresylaeliminacindelosmismosporestas enzimas antioxidantes se encuentra desplazado hacia el primer trmino la acumulacin de dao oxidativo puede desencadenar la muerte celular. Entre las enzimas encargadas de eliminar estos radicales libres se encuentranlafamiliadelassuperxidodismutasas(SOD),quetransformanelsuperxidoenH2O2,lacatalasa,

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Introduccin quetransformaelaguaoxigenadaenagua,yotrasenzimascomolaglutationreductasaohemooxigenasa1 cuyaexpresinseinduceporROS.UnfactoratenerencuentaalestudiarelbalanceentrelosROSformadosy los sistemas enzimticos de defensa antioxidante es que algunas de las enzimas de este sistema pueden cambiarsufuncinantioxidanteporoxidante,debidoprincipalmentealincrementodeionesdehierroycobre que se produce en cerebro con la edad (revisado por Barnham y col., 2004). De esta forma se produce una generacinmasivadeespeciesROSrelacionadasconlamuertecelularporestrsoxidativoy,portanto,con enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (De Leo y col., 1998) y la esclerosis lateralamiotrfica(Bergeronycol.,1994).Enlasiguienteilustracinseintentaesquematizarestasreacciones queocurrenconlaedad(revisadoporZhuycol.,2007).
Ilustracin 18: Generacin anmala de ROS. Son variaslasreaccionesporlasquese puedenformar ROS de forma anmala. La funcin normal de la SOD es convertir radicales superxido en agua oxigenadaquees,posteriormente,inactivadaporla catalasa.Debidoaincrementosdecobrey/ohierro la actividad enzimtica de la SOD se altera producindose peroxinitrito (OONO ). El exceso de cobrey/ohierrocatalizalatransformacindelagua oxigenada en radicales hidroxilo (OH ). Modificado deBarnhamycol.,2004.

Existen varios mecanismos por los que los radicales libres pueden desencadenar procesos de muerte celular. Uno de los ms comunes es que los radicales libres que se generan en la mitocondria, como consecuencia de la respiracin oxidativa, pueden inducir la entrada de calcio en la mitocondria y variar su permeabilidad, producindose la liberacin de citocromo C que inicia la cascada de apoptosis (Mattson y Kroemer, 2003). Otros procesos engloban la oxidacin del ADN, la oxidacin de lpidos de la membrana plasmtica, relacionada sta con pacientes de esclerosis lateral amiotrfica (Pedersen y col., 1998) y la activacin de esfingomielinasas con la subsiguiente liberacin de ceramida, que relaciona el estrs oxidativo conlasenfermedadesdeAlzheimer(Cutlerycol.,2004),demenciainducidaporVIH(Haugheyycol.,2004)y esclerosislateralamiotrfica(Cutlerycol.,2002).Ademssecreequeelprimereventopatolgicoqueocurre en la enfermedad de Alzheimer es la aparicin de dao oxidativo por ROS (Nunomura y col., 2001), lo que aademsvaloralestudiodeesteprocesotancomplejo.

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I.4.5.Envejecimientoymuertecelular.

Introduccin

Lasclulasdetodaslasregionesdelsistemanerviososevenafectadasporelenvejecimiento,comose apreciaporundeclivedelasfuncionessensoriales,motorasycognitivasqueseacentaconlaedad(Hofery col.,2003).Elproblemadelenvejecimientoresultadegranimportanciasisetieneencuentaqueseestimaque paraelao2050aproximadamenteel30%delapoblacinmundialseencontrarentornoalos65aosde edad (el autor de la presente Memoria cumplir 69 ese ao) y existe un incremento sustancial en la probabilidaddedesarrollarunaenfermedadneurodegenerativadurantelasexta,sptimayoctavadcadade vida,loqueacarrearunelevadocosteeconmicoysocial.Enconcreto,sehaestimadoqueexisteunaelevada probabilidad de que una persona de 85 aos sufra de Alzheimer. El Parkinson, no obstante, es ms comn desarrollarloalos70ylaprobabilidaddepadeceresclerosislateralamiotrficaaumentaalrededordelos40 aos(revisadoporMattsonyMagnus,2006). LosratonesSAM(SAM,delinglsSenescenceAcceleratedMouse)fueronoriginadosapartirderatones AKR/J con la particularidad de que no se trata de un modelo manipulado genticamente. El modelo se estableciapartirdelaobservacinempricadequealgunascamadaspresentabanrasgoscaractersticosde una edad ms avanzada de la que les corresponda. Se establecieron las 5 subcepas ms sensibles al envejecimiento(SAMP,prone)ylas3subcepasmsresistentesodeenvejecimientonormal(SAMR,resistant) (Takedaycol.,1981),aunqueenlaactualidadelmodelosehaampliadoa9subcepasSAMP(Takeda,2009).De todasestassubcepasesparticularmenteinteresanteelestudiodelosratonesSAMP8(Fujibayashiycol.,1994), los cuales desarrollan de forma espontnea un fenotipo patolgico caracterizado por un deterioro en el comportamiento relacionado con la edad, tal como dficits en el aprendizaje y memoria, desrdenes emocionales, como una reducida ansiedad y un comportamiento depresivo, y un ritmo circadiano alterado (Takeda, 2009). Se diferencian principalmente de otros modelos de envejecimiento en que estos ratones no sontransgnicos,comolosmodelosdeenvejecimientobasadosenlaeliminacindep53(Tynerycol.,2002)u otrosgenes(revisadoporBartke,2008),sinoquelasdeficienciasquesehanobservadoenellosaparecende formaespontneaconlaedad. Los ratones de envejecimiento acelerado han sido un modelo empleado para el estudio de los mecanismosfundamentalesqueconvergenenlosdficitsdememoriayaprendizajedesarrolladosconlaedad (revisadoporButterfieldyPoon,2005),aunquetambinhansidoempleadoscomoorganismomodeloparael estudiodelapatognesisdelaenfermedaddeAlzheimer(revisadoporPallsycol.,2008). Como modelo de envejecimiento, los ratones SAMP8 presentan las principales deficiencias cognitivas descritas con la edad en humanos, comopueden ser una deficiencia progresiva en la capacidad deatencin (McDowd y Craik, 1988) as como de la memoria espacial (Otha y col., 1981). Adems, las deficiencias cognitivasobservadasenestemodelosonabundantesymimetizanlosdficitsencomportamientoycognitivos observadosenpacientesdeAlzheimeryenotrosmodelostransgnicos.Porotrolado,estemodeloreproduce conlaedadyconunacronologasimilaralaqueapareceenlapatologaenhumanos(revisadoporBraaky Braak, 1998) los principales sntomas y caractersticas histopatolgicas que aparecen a lo largo de la

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Introduccin enfermedad de Alzheimer, como son el estrs oxidativo, gliosis, acumulacin del pptido amiloide e hiperfosforilacindetau(Pallsycol.,2008). Es evidente que el envejecimiento est fuertemente relacionado con determinadas enfermedades neurodegenerativas, sin embargo se plantean algunos interrogantes a los que no es posible contestar en la actualidad,como,porejemplo,elhechodequeciertaspoblacionesdeneuronasseveanmsafectadasque otras en determinadas enfermedades neurolgicas o, en un plano ms general, porqu una enfermedad neurodegenerativa causada por la edad es histopatolgicamente indistinguible de la misma enfermedad causada por causas genticas. Por otro lado, si el envejecimiento est relacionado con las enfermedades neurodegenerativas es de esperar que la ralentizacin de este proceso pudiera evitar de alguna manera el desarrollodeestasenfermedades.Todaestaseriedeinterroganteshacenquesigasiendonecesarioelestudio delosmecanismosrelacionadosconelenvejecimiento,larelacindestosconeldesarrollodeenfermedades neurodegenerativasyeldescubrimientodenuevasdianasteraputicasparaestasenfermedades.

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Objetivos

Objetivos

El objetivo principal del presente trabajo de investigacin fue el estudio de la modulacin de los receptoresmetabotrpicosdeglutamatoydeadenosinatantoencultivosprimariosdeneuronas,comoenuna lneatransformada,lalneaC6provenientedeastrocitomaderata,envariosmodelosdetoxicidadymuerte celularrelacionadosdirectamenteconpatologasneurodegenerativas.Losobjetivosbsicosquesemarcaronal comienzodeestetrabajofueronlossiguientes: 1. LacaracterizacindelosreceptoresdeadenosinaenlasclulasC6degliomaderata. 2. Efectodelatoxicidadinducidaporglutamatosobrelosreceptoresobjetodeestudio. 3. Efectodelahipoxiamoderadasobrelosreceptoresobjetodeestudio.Papeldelaadenosina. 4. Efecto de la toxicidad inducida por la exposicin al pptido amiloide sobre los receptores objeto de estudio. 5. Modulacindeestosreceptoresporestrsoxidativoinducidoporperxidodehidrgeno. 6. Estudio de la modulacin de los receptores de adenosina durante el envejecimiento en modelos animales.

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Materiales y Mtodos

III.1.Materiales.

Mtodos

Los radioligandos utilizados para los estudios de receptores de adenosina [3H]DPCPX (118 Ci/mmol) y [3H]ZM241385(27,4Ci/mmol),fueronobtenidosdeAmershamBiosciences(Buckinghamshire,ReinoUnido)y Tocris Cookson Ltd (Bristol, Reino Unido), respectivamente. Para estudiar los receptores metabotrpicos de glutamato se utiliz el radioligando L[3H]Glu (49,9 Ci/mmol) procedente de Perkin Elmer (Boston, EEUU). El [3H]AMPc(27,4Ci/mmol),seobtuvodePerkinElmer(Boston,EEUU). Fueron adquiridos de SigmaAldrich (Saint Louis, EEUU) los siguientes compuestos: pptido amiloide (142y2535),dipiridamol,CPA,CHA,AMPA,NMDA,cidokanico,teofilina,forskolina,NECA,PKA,RPIA,ATP, PFA, adenosina, Ro 201724, dipiridamol, creatina quinasa, creatina fosfato, inhibidores de proteasas, bacitracina, PSMF, toxina pertsica y el kit MTT. El ligando cido Lglutmico es de la casa comercial Tocris Cookson Ltd. (Bristol, Reino Unido), as como los ligandos (1S,3R)ACPD, (2R,4R)APDC, LAP4, CGS 21680, PSB1115yZM241385. Lassustanciasqumicas,losmediosylasplacasempleadasparalarealizacinyelmantenimientodelos cultivoscelularesseobtuvierondeGibcoBRL(Maryland,EEUU),exceptoelsuerofetalbovinoqueseobtuvode PAA(Parching,Austria). Los materiales relacionados con la electroforesis de protenas, a menos que se indique lo contrario, provienendeBioRad(California,EEUU).Laprocedenciadesustanciasrelacionadasconlainmunofluorescencia sedetallamsadelanteeneltexto. Los reactivos empleados en los experimentos de PCR, cuantitativa o clsica, fueron adquiridos de AppliedBiosystems(California,EEUU),amenosqueseindiquelocontrario. Laenzimaadenosinadesaminasa(ADA)fueadquiridadeRocheDiagnostics(Basel,Suiza). TodosloslquidosdecentelleofueronadquiridosdePerkinElmer(Massachusetts,EEUU). Elrestodelosreactivosutilizadosfuerondegradoanaltico. III.2.Animales. Durante la parte experimental se emplearon dos tipos de animales: ratas Wistar gestantes, para la realizacindecultivosprimariosdeneuronascorticales,yalgunascepasderatonesdesenescenciaacelerada (SAM),parasuestudiocomomodelodeenvejecimiento. Las ratas utilizadas para obtener los cultivos primarios de neuronas corticales fueron criadas en el animalario del Centro de Biologa Molecular "Severo Ochoa" de la Universidad Autnoma de Madrid, en condicionesestriles,conciclosdeluzoscuridadde12horas,humedadrelativadel5055%ytemperaturade 2025C. Para estos cultivos se usaron fetos a da embrionario 18 provenientes de ratas de la raza Wistar albinasde3mesesdeedad.Losanimalessealimentaronconunadietaestndardelaboratorioytuvieronlibre accesoalalimentoyalaguadebebida.

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Mtodos Con motivo de realizar el estudio de la variacin de los receptores de adenosina durante el envejecimientoseempleelmodeloderatonesdesenescenciaaceleradaSAM.Estemodeloseestablecien 1981 por seleccin fenotpica de una cepa comn de ratones AKR/J (Takeda y col., 1981), subcepas ms sensiblesalenvejecimiento(prone;SAMP)ysubcepasmsresistentes(resistant;SAMR). En los estudios aqu presentados se han empleado las subcepas SAMR1, como modelo de envejecimientofisiolgico,ySAMP8,comomodelodeenvejecimientoacelerado,amablementecedidasporel Dr. Antoni Camins, de la Universidad de Barcelona. Entre las caractersticas de los ratones SAMP8 se encuentran: deficiencias en el aprendizaje y la memoria relacionadas con la edad, disfunciones del sistema inmuney deposicin dependiente de la edad del pptido amiloide. Para estos estudios se han empleado las subcepasSAMR1ySAMP8,alasedadesde3semanasy6meses. TodoslosexperimentosrealizadosconanimalessiguieronlasnormasfijadasporlaComunidadEuropea acercadelaexperimentacinanimalascomolaregulacinespecficadelComitdeExperimentacinAnimal delaUniversidaddeCastillaLaMancha. III.3.CultivocelulardelalneaC6. Losastrocitossonlosresponsablesdelarecaptacinyelmetabolismodelamayorpartedeglutamato en el cerebro. stos, a diferencia de las neuronas, poseen una elevada actividad glutamina sintetasa, una enzima exclusiva de las clulas gliales que convierte el glutamato en glutamina a travs de una reaccin de amidacinqueconsumeenerga.Debidoalpapeldelglutamatoenmuchasenfermedadesneurodegenerativas y a la capacidad de la adenosina de modular la liberacin de ste usamos la lnea celular C6 derivada de astrocitomaderatacomomodelodeestudio. Las clulas C6 de glioma de rata (Benda y col., 1968) se obtuvieron de la American Type Culture Colection (ATCC; CCL107) y fueron crecidas en placas Nunc en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle MediumconLGlucosa4,5g/L)conteniendotampnHEPES12,6mM,NaHCO310,11mM,cidopirvico1mM, suplementado con 10% suero fetal bovino (previamente descomplementado), Lglutamina 2 mM, 1% aminocidosnoesenciales,1%antibiticoantimicticoygentamicina50g/mL.Lasclulassemantuvierona 37Cenatmsferahmedade5%CO2/95%aire.Imgenesrepresentativasdeestasclulasseexponenenla Ilustracin19. LascondicionesdehipoxiaempleadassecontrolaronenunincubadorFormaSeriesII(TermoElectron Corporation).Enestosexperimentos,lasclulassemantuvierona37Cenatmsferahmedade5%CO2/5% O2/90%N2durantelostiemposindicadosencadaexperimento.

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Mtodos

Ilustracin 19: Ensayos de inmunoflourescencia en las clulas C6. A, tincin con Hoechst. B, inmiunodeteccin de GFAP (Glial fibrillary acidicprotein).C,mezcladeAyB.Labarrarepresenta240menCy100menAyB.

III.4.Cultivosprimariosdeneuronascorticalesdecerebroderata. LoscultivosprimariosfueronobtenidosdeembrionesderatasdelacepaWistara18dasdegestacin. LoscerebrosfetalesfuerondiseccionadosycolocadosenPBS(NaCl8g/L,KCl0,2g/L,Na2HPO42H2O2,9g/Ly KH2PO4 0,2 g/L, pH 7,4) suplementado con glucosa 6 mM y BSA 1%. Despus de separar las meninges, las cortezasseccionadasseincubaroncon30U/mLdepapanadurante5minutosa37Cparaserposteriormente disgregadasmecnicamenteconayudadeunapipetaPasteur.Unavezdisgregadoeltejido,seaadieron10 mgdeDNasaylasclulasdisociadassefiltraronporgravedadatravsdeunfiltrode70mdetamaodeporo (BDFalcon).Elfiltradosecentrifuga300gdurante6minutosyelpelletobtenidoseresuspendienMEM (Minimum Essential Medium) suplementado con NaHCO3 2,2 g/L, Glutamax I 10 ml/L, HEPES 2,6 g/L, antibiticoantimictico10ml/L,B27y10%desuerodecaballo(previamentedesactivado),aunadensidadde 4105 clulas/mL. Las clulas fueron plaqueadas en placas recubiertas de poliLlisina (BD Falcon) (2,6105 clulasporpocilloenplacasde24pocillos;8104clulasporpocilloenplacasde96pocillos;8104clulaspor pocilloenplacasde10cmdedimetro)ymantenidasa37Cenatmsferahmedade5%CO2/95%aire.Al dasiguientesecambilatotalidaddelmediopormedioNeurobasal(NB)suplementadoconB27.Alos2das invitro(DIV)seaadicitosinaarabinosa(AraC)aunaconcentracinfinalde5M.Alos7y14DiVsedesech la mitad del medio y se repuso medio NB suplementado con B27. Todos los experimentos fueron realizados entrelos14ylos18DIV,loquesecorrespondeconlamadurezdelcultivo.Unresumendeesteproceso,junto conimgenesrepresentativasdealgunosdasdecultivo,seexponeenlaIlustracin20.Espordicamentese comprob la contaminacin glial del cultivo mediante inmunodeteccin de GFAP, un experimento representativoseexponeenlasIlustraciones21y22.

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Mtodos

Ilustracin20:Imgenesrepresentativasencontrastedefasesdeldesarrollodeuncultivoprimariodeneuronasdecortezadecerebro derata.Todaslasimgenesfuerontomadasconelobjetivo20X.A.Clulasa0DIV.B.PrimerDIV.C.2DIVtraseltratamientoconAraC.D. 15DIV.E.16DIV.F.17DIV,labarrarepresenta100m.Enelpanelinferiorseesquematizanloscambiosdemediorealizadosduranteun cultivocualquiera.Labarrarepresenta100m.

III.5.Aislamientodemembranasplasmticas. LasmembranasplasmticasdeclulasC6,neuronasdecultivosprimariosocerebrodeanimalfueron aisladas siguiendo el mtodo descrito previamente por este grupo de investigacin (Albasanz y col., 2002a; Len y col., 2002). Brevemente, tras eliminar el medio se lav cada placa con 2 mL aproximadamente de tampn de aislamiento (TrisHCl 50 mM, MgCl2 10 mM, pH 7.4) que contena los inhibidores de proteasas bacitracina(100g/mL)yPSMF(100M).Seguidamentelasclulasdecadaplacafueronrecogidasen3mLde tampn de aislamiento y homogeneizadas en un homogeneizador Dounce (10xA, 10xB), se centrifugaron 5 minutosa2000rpmenunacentrifugaBeckmanJA20ylossobrenadantesobtenidossevolvieronacentrifugar durante30minutosa15.000rpm.

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Mtodos

Ilustracin 21: Imgenes representativas de experimentos de inmunofluorescencia a 16 DIV (I). A y D, tincin con Hoechst. B y E, inmunodeteccindeNeuN(NeuronalNuclei)ytubulina,respectivamente.CyF,mezclasdelasimgenesanteriores.Labarrarepresenta 240menCyFy100menA,B,DyE.

Ilustracin22:Imgenesrepresentativasdeexperimentosdeinmunofluorescenciaa16DIV(II).PanelesAC,cultivossintratarconAraC. PanelesDF,cultivoscorrientes.AyD,tincinconHoechst.ByE,inmunodeteccindeGFAP.CyF,mezclasdelasimgenesanteriores.La barrarepresenta240menCyFy100menA,B,DyE.

El sedimento se resuspendi de nuevo en tampn de aislamiento y se homogeneiz en un Dounce (10xA,10xB),serepartienalcuotasquesecongelaronenN2lquidoysealmacenarona80Chastasuuso. En el caso del aislamiento de membranas plasmticas procedentes de tejido, el esquema de centrifugacinempleadofueelmismoqueparalalneacelularperosepartideunhomogenado.As,cerebros completos de los animales de estudio fueron resuspendidos en 20 volmenes del tampn de aislamiento

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Mtodos descritoyhomogeneizadosenDounce(10xA,10xB).Estehomogenadosesometialprocesodecentrifugacin diferencialdescritoanteriormente. III.6.ReaccinencadenadelaPolimerasaclsica. EnlosexperimentosrealizadosparaidentificarlosreceptoresdeadenosinaenlasclulasC6elmodode PCRempleadofuelaRTPCRclsica.ElRNAfueaisladoporextraccincontiocianatodeguanidinio/fenol/ cloroformo segn el mtodo descrito por Chomczynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi, 1987). Tras el tratamientocon10UdeDNasaI(libredeRNasas)durante30minutosa37Cseprovocladesnaturalizacin delaenzimaporcalentamientoa95Cdurante5minutos. Setomaron5gdelRNAtotalyseretrotranscribieronaADNcenTrisHCl50mMpH8,3conteniendo KCl75mM,MgCl23mM,DTT2,5mM,dNTPs1mM,pd(N)6cebadoresaleatorios(BoehringerManheim),40U deinhibidordeRNasasy200UdeMMVLtranscriptasareversa(BRL),transcurriendolareaccindurante60 minutos a 37 C. Posteriormente se llev a cabo la PCR siguiendo el mtodo descrito por Vendite y colaboradoresen1998,elADNcfueamplificadoenTrisHCl20mMpH8,3conteniendoKCl50mM,MgCl23 mM, dNTPs 0,2 mM, cebadores 5 1 M, cebadores 3 1 M y 2 U de Taq polimerasa. Los oligonucletidos iniciadores utilizados en la amplificacin de cada gen, as como el tamao esperado para los diferentes fragmentosamplificadosporPCR,seresumenenlaTabla3. Seanalizaron15LdeADNcamplificadoporelectroforesisengelesdeagarosaal2%yposteriortincin conbromurodeetidioparasuvisualizacinconluzUV. III.7.ReaccinencadenadelaPolimerasacuantitativa. ParalosexperimentosdecuantificacindelacantidaddeRNAporPCRatiemporealpresentadosenla presenteMemoria,elaislamientodeRNAfuellevadoacabo,tantoenelcasodecultivoscelularescomoenel caso de cerebros de ratn, en un equipo ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems) siguiendolosprotocolosindicadosporelfabricante. La reaccin de retrotranscripcin se llev a cabo en un equipo Prism 7500 Fast Sequence Detection System(AppliedBiosystems)empleandoelHighCapacityADNcArchiveKit(AppliedBiosystems)siguiendolas instruccionesdelfabricante.Eltermocicladorseprogram10minutosa25C,paramaximizarlauninentre loscebadoresaleatoriosyelRNA,trasloscualessedejtranscurrirlareaccindurante2horasa37C.Antes de almacenar el ADNc a 80 C se matuvo la mezcla de reaccin a 85 C durante 5 segundos con el fin de desactivarlatranscriptasainversa.

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Gen amplificado
A1

Mtodos Tamaodel fragmento


630pb

Acceso GenBank
AB001089

Secuencias
(A):5ATCCCACTGGCCATCCTTATC3 (B):5TGGCGATGTAGATCAGAATGC3

A2A

NM_017161

150pb

(A):5CCATGCTGGGCTGGAACA3 (B):5GAAGGGGCAGTAACACGAACG3

A2B

M91466

160pb

(A):5TGGCGCTGGAGCTGGTTA3 (B):5GCAAAGGGGATGGCGAAG3

A3

NM_012896

655pb

(A):5AGAGCTAGGTCCACTGGC3 (B):5GCACATGACAACCAGGGGATGA3

Gi1

M17527

1080pb

(A):5AAGGACAGCGGTGTGCAAGCCTGCTTCAAC3 (B):5AATCTGTCATTCCGTACAAGGTACTTAACA3

Gi2

M17528

530pb

(A):5AGTATGACGAGGCAGCCAGCTACATCCAGAGCAA3 (B):5GTACTCCTCCAGACATAGGCCTTGGGAAACTCTGC3

Gi3

M20713

680pb

(A):5TGCTAGGAGACGTCTAAGAGTATA3 (B):5GCTTGCTTCCCAAAGCAGTTCTGA3

Gs

NM_019132

770pb

(A):5GCAGGCTGCAAGGAGCAACAGCGA3 (B):5CCGGGTCACGCGTGGGTCCTC3

actina

NM_031144

320pb

(A):5GGTATGGAATCCTGTCGCATCCATGAAA3 (B):5GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG3

Tabla3:CebadoresutilizadosparalaPCRenlaamplificacindecadagen.ElADNccorrespondientealosdistintosgenesindicadosenla tabla se amplificmediante el uso de un oligonucletido directo (A, cebador 5) e inverso (B, cebador 3), de los cuales se especifica el cdigodeaccesodeGenBankdecadagenyeltamaodelfragmentoamplificado.

La PCR cuantitativa fue llevada a cabo en el mismo equipo que la retrotranscripcin empleando el sistema TaqMan universal PCR master mix (Applied Biosystems) para detectar los genes deseados. En cada amplificacinseemplearon10ngdeADNc.Loscebadoresylassondasestnpatentadosasquelasecuencia no est disponible. Cabe destacar que se intent amplificar el gen mGlu5 en C6 empleando dos sondas diferentesencondicionesenlasqueseobservabaamplificacinconmuestrasobtenidasdecultivosprimarios deneuronascorticalesy,enningunodelosdoscasos,seobservoamplificacinalguna. Seempleelgendelaactinacomocontrolendgeno.LassondassemarcaronconelfluorforoFAM enelextremo5yconunagenteapantallante(quencher)enelextremo3.Lafluorescenciadefondosemidi aadiendoelfluorforoROS.LassecuenciasdelassondassonpropiedaddeAppliedBiosystemsporloqueno estndisponibles.Lassondasfueronempleadassiguiendolasespecificacionesdelfabricanteytodasellasson productosvalidadosporelmismo. El termociclador se program 20 segundos a 95 C seguido de 40 ciclos de 3 segundos a 95 C y 30 segundosa60C.Losnivelesdeexpresinseanalizaronempleandoelprograma7500FastSystemSDS(versin 1.3.1)usandoelmtodocomparativoCtparacalcularelparmetroRqrepresentado(SchmittgenyLivak,2008).

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Mtodos Los resultados de expresin fueron normalizados para cada gen con los del control interno (actina) y relativizadosconrespectoauncalibrador.Matemticamentelaecuacinempleadafue: Rq=2Ct=2((CtgendianaCtactina)muestra(CtgendianaCtactina)calibrador) DondeCteselcicloumbral,estoes,elcicloenelquelafluorescenciaemitidaesdiezvecesmayorque elruido. III.8. Determinacin de receptores metabotrpicos de glutamato mediante ensayos de unin de L[3H]Glutamatoenclulasintactas. Los receptores metabotrpicos de glutamato se determinaron mediante ensayos de unin usando L[ H]Glucomoradioligando,segnelmtododescritopreviamenteenestegrupodeinvestigacin(Albasanzy col.,2002a). Los ensayos de unin a los receptores metabotrpicos se llevaban a cabo bloqueando la unin a los receptoresionotrpicos,enpresenciade10MdeAMPA,100MdeNMDAyKanico(Chaycol.,1990),yel transportedeglutamatocon10MdecidoDLtreohidroxiasprtico(McBeanyRoberts,1985;Kimelbergy col.,1989). Despusdeeliminarelmediodecultivocelularselavaronlasclulasconmediodecultivosincompletar (DMEMconLGlucosa4,5g/LconteniendotampnHepes12,6mM,NaHCO310,11mM,cidopirvico1mM), a continuacin se aadieron los agentes bloqueantes de los receptores ionotrpicos y del transporte de glutamato y Lglutamato slo en aquellos pocillos en los que se iba a medir la unin inespecfica. Para la realizacindelascurvasdesaturacinlasclulasfueronincubadasenpresenciadediferentesconcentraciones deL[3H]Glu(0,15hasta1,2M)duranteunahoraa37CusandoLglufro10mMfinalcomoligandopara determinar la unin inespecfica, en un volumen final de 250 L. El ensayo se detuvo aspirando el medio radiactivoylavandolospocillosconmediodecultivosincompletara4C. LasclulasselisaronconSDS0,1%ysellevaronavialesdecentelleoalosqueseaadieron3mLde lquidodecentelleoOptiphaseHiSafe3ysecontaronenuncontadorMicroBetaJet(PerkinElmer). Encadaensayosemidilaunintotalylainespecficaparacadaconcentracinporduplicado.
3

52

Mtodos

III.9. Determinacin de los receptores de adenosina mediante ensayos de unin de [3H]DPCPX o [3H]ZM241385enclulasintactas. Ensayosdeuninde[3H]DPCPX. LosensayosdeuninderadioligandosalreceptorA1deadenosinafueronrealizadosenclulasintactas segnelmtododescritopreviamenteporestegrupo(Ruizycol.,2000).Paraello,seemple[3H]DPCPXcomo antagonistaespecficodelosreceptoresA1. Despusdeeliminarelmediodecultivoselavaronlasclulasconmediodecultivosincompletaryse incubaron con 2 U/mL de ADA a 25 C durante 30 minutos con el fin de eliminar la adenosina endgena. A continuacin se aadi dipiridamol 1 M final en todos los pocillos, para bloquear los transportadores de adenosina, y CPA 4 mM final, para medir la unin inespecfica en aquellos pocillos que corresponda. Se incubarondurante2horasa25Ccon[3H]DPCPXalasconcentracionescorrespondientes(de1a20nMfinal,a menosqueseindiquelocontrario).Elensayosedetuvoaspirandoelmedioradiactivoylavandolospocillos conmediodecultivosincompletara4C. LasclulasselisaronconSDS0,1%ysellevaronavialesdecentelleoqueserellenaronconlquidode centelleoOptiphaseHiSafe3ysecontaronenuncontadorMicroBetaJet(PerkinElmer). Encadaensayosemidilaunintotalylainespecficaparacadaconcentracinporduplicado. Las curvas de competicin se obtuvieron siguiendo el mismo procedimiento usando una nica concentracinde[3H]DPCPX(15nM)ydistintasconcentracionesdelosligandosaensayar. Ensayosdeuninde[3H]ZM241385. LosensayosdeuninderadioligandosalreceptorA2Adeadenosinafueronrealizadosenclulasintactas usandoelantagonistaespecficotritiadoparaelreceptorA2A[3H]ZM241385. EsteensayoesigualquelauninareceptoresA1peroenestecadoseusteofilina9mMfinalcomo ligandofroparavalorarlaunininespecficaydistintasconcentracionesdelradioligando(de1a20nMfinal,a menosqueseindiquelocontrario). Las curvas de competicin se obtuvieron siguiendo el mismo procedimiento usando una nica concentracinde[3H]ZM241385(15nM)ydistintasconcentracionesdelosligandosaensayar. LasclulasselisaronconSDS0,1%ysellevaronavialesdecentelleoqueserellenaronconlquidode centelleoOptiphaseHiSafe3ysecontaronenuncontadorMicroBetaJet(PerkinElmer). Encadaensayosemidilaunintotalylainespecficaparacadaconcentracinporduplicado.

53

Mtodos III.10. Determinacin de los receptores de adenosina mediante ensayos de unin de [3H]DPCPX o [3H]ZM241385enmembranasplasmticas. Ensayosdeuninde[3H]DPCPX Los ensayos de unin de radioligandos al receptor A1 de adenosina fueron realizados en membranas plasmticassegnelmtododescritopreviamenteporestegrupodeinvestigacin(Ruizycol.,2000). Previamente a la realizacin del ensayo de unin las membranas plasmticas fueron incubadas con 2 U/mgdeadenosinadesaminasa(ADA)entampndeensayo(TrisHCl50mM,MgCl22mM,pH7,4)durante30 minutosa25C,paraeliminarlaadenosinaendgena.Acontinuacin,seaadieronlosdiferentesligandosen presencia de 75 g de protena en un volumen final de 250 L y se incubaron durante 2 horas a 25 C en agitacin. Transcurrido este tiempo se par la reaccin por filtracin usando un equipo Filtermateharvester (Perkin Elmer) y la radiactividad obtenida se cuantific en un contador MicroBeta Jet (Perkin Elmer) usando lquidodecentelleoBetaplateScint(PerkinElmer). Lascurvasdesaturacinserealizaronusandodiferentesconcentracionesdelradioligando[3H]DPCPX(1 a 20 nM) y CPA como ligando fro a una concentracin de, al menos, 104 veces la del radioligando, para determinarlaunininespecfica. Ensayosdeuninde[3H]ZM241385 ElmismomtodofueutilizadoparaladeterminacindereceptoresA2Adeadenosinaempleando75g demuestrayutilizandoteofilina3mMcomodesplazante.Denuevo,transcurridoeltiempodeincubacinse parlareaccinporfiltracinusandounequipoFiltermateharvester(PerkinElmer)ylaradiactividadobtenida secuantificenuncontadorMicroBetaJet(PerkinElmer)usandolquidodecentelleoBetaplateScint(Perkin Elmer). III.11.Determinacindelaactividadadenilatociclasa. Enclulasintactas

La actividad adenilato ciclasa se determin, en clulas intactas, siguiendo el mtodo descrito por Murphy y colaboradores (Murphy y col., 1991) con algunas modificaciones (Ruiz y col., 2000). Tras lavar las clulasdosvecesconmediodecultivosincompletar,seincubarondurante10minutosa37Cconelinhibidor defosfodiesterasasRo201724100Mycon2U/mLdeADA,enunvolumenfinaldemediode225L.Trasla incubacin se inici la reaccin con los agentes correspondientesy se dej transcurrir durante15minutos a 37CparaposteriormentedetenerlaconHCl0,1NenEtOHabsoluto.Elcontenidodecadapocillosecentrifug a 12.000 rpm durante 10 minutos en una centrfuga de mesa (Hettich) y el sobrenadante se evapor en speedvac(Heto)durante3horasparaaadirledespus150LdetampnTrisHCl50mMpH7,5conteniendo EDTA4mM.

54

Mtodos

La determinacin de los niveles de AMPc se llev a cabo segn el mtodo descrito inicialmente por NordstedtyFredholmen1990.SedeterminlacantidaddeAMPcen50Ldecadamuestrausando6,25gde protenaquinasa Acomoprotena de unin al AMPc y 0,25 pmol de [3H]AMPc como trazador.As se incub todoenmedioTrisHCl50mMpH7,5,EDTA4mMa4Cduranteunmnimode2yunmximode18horas.Al mismotiemposeconstruyunacurvapatrnsobrelaqueinterpolarlosdatosobtenidosconconcentraciones deAMPcde0,25a32pmol.LareaccinseparporfiltracinusandounFiltermateharvester(PerkinElmer)y laradiactividadobtenidasecuantificenuncontadorMicroBetaJet(PerkinElmer)usandolquidodecentelleo BetaplateScint. Enmembranasplasmticas.

Laactividadadenilatociclasaenmembranaplasmticadecerebrofuedeterminadasiguiendoelmtodo inicialmentedescritoporMalbonycolaboradores(Malbonycol.,1985).Elensayosellevoacabocon20gde membranasplasmticas,lascualeshabansidopretratadasconadenosinadesaminasa,0,2U/mg,entampn de ensayo (Tris 50 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, pH 7,4) durante 30 minutos a 37 C. Posteriormente, las membranasfueronincubadasentampndeensayodurante6minutosa30Cenunvolumenfinalde250L, conteniendo Ro 201724 100 M, sistema regenerador (albmina 1 mg/mL, creatina quinasa 1 mg/mL y creatinafosfato10mM)mslosligandoscuyapotenciasequeraprobar.Lareaccinseiniciconlaadicinde ATP 200 M y se prolong durante 10 minutos a 30 C. Finalizado este tiempo la reaccin fue detenida hirviendolasmuestrasdurante2minutosconposteriorcentrifugacina12000g.Delsobrenadanteobtenido serecogieron50LquefueronusadosparadeterminarlosnivelesdeAMPcclico(AMPc). Ladeterminacinfuellevadaacabosegnsehadescritoenelapartadoanterior. III.12.Ensayodeviabilidad:testbasadoenMTT. Laviabilidadcelularfuedeterminadaporunmtodocolorimtricoutilizandounkitdeviabilidadcelular basado en el compuesto bromuro de 3[4,5dimetiltiazol2il]2,5difeniltetrazolio (MTT), el cual es fragmentado por deshidrogenasas mitocondriales dando lugar a cristales de formazn, insolubles en medios acuosos. Estos cristales se disuelven en una disolucin cida de isopropanol y la variacin de la medida espectrofotomtrica a 570 nm se toma como una variacin de la cantidad de clulas causada por el agente txicoensayado. Brevemente,setrataronlamismacantidaddeclulasenplacasde96pocillosconlosdistintosagentes a los tiempos correspondientes ms las clulas llevadas como control, incubadas con el mismo volumen de mediocompleto.Traseltratamientoseaadieron10LdeunadisolucindeMTT(5mg/mL)acadapocilloy lasclulasseincubarona37Cdurante3horas.Aloscristalesformadosselesaadi100Ldeladisolucin desolubilizacin(TritnX10010%,HCl0,1Nenisopropanolanhidro)ysedejaronsolubilizardurantetodala noche.Alamaanasiguiente,laabsorbanciasemidia570nmyelfondoa690nm.

55

Mtodos III.13.Ensayodeactividadcaspasa3. Seemplepararealizaresteensayounkitcomercial(MolecularProbes,Barcelona,Espaa)basadoen el diseo de un sustrato fluorescente susceptible de ser cortado proteolticamente de forma especfica por caspasa 3. Brevemente, las clulas empleadas en estos ensayos provenan de placas P24, en las que se las someti o no a los correspondientes agentes cuya influencia sobre la actividad de caspasa 3 se deseaba estudiar. Las clulas se lisaron empleando 50 L del tampn de lisis incluido en el kit durante 30 minutos, transcurridosloscualesloslisadossecentrifugarondurante5minutosamximavelocidadenunacentrfuga de mesa. A los sobrenadantes obtenidos se les aadi 50 L de tampn de ensayo, conteniendo ZDEVD Rodamina110,DTT,EDTA,PIPESyCHAPS,enlasproporcionesindicadasporelfabricante.Tras30minutosde incubacin a temperatura ambiente, se midi la absorbancia de cada muestra en un lector de placas (excitacin/emisin~496/520nm).Losincrementosenlaactividadcaspasa3,sedeterminaroncomparandolos datos obtenidos para las muestras tratadas por algn agente, con aquellos obtenidos para las muestras controles. III.14.Electroforesisengelesdepoliacrilamidaencondicionesdesnaturalizantes:PAGESDS. La separacin electrofortica de las protenas presentes en las membranas plasmticas aisladas, se realizsiguiendoelmtododescritoporLaemmli(Laemmli,1970).Lasdistintasmuestrasseresuspendieronen el tampn de carga de electroforesis o tampn de Laemmli, (SDS 2%, mercaptoetanol 5%, glicerol 10%, TrisHCl 62 mM, pH 6,8 y azul de bromofenol 0,002%) y fueron posteriormente hervidas durante5 minutos, centrifugadasyenfriadas. Las muestras se sometieron a electroforesis en minigeles de poliacrilamidaSDS, con un 10% de acrilamidayungrosorde1,5mmparasepararenelmismogelprotenasdealtoybajopesomolecular.Como patronesdepesomolecular,seemplearonmarcadorespreteidos(PrecisionPlusProteinStandarddualcolors), mezcladeprotenasrecombinantesdetamaos10,15,20,25,37,50,75,100,150y250kDa,paradeterminar electroforticamenteelpesomoleculardeprotenasdeinters. Eltampnutilizadoenlaelectroforesisestabacompuestopor25mMTris,192mMglicinay0.1%SDS. Entodosloscasos,lacantidaddeprotenaporcarrilfue,amenosqueseindiquelocontrario,de30g. III.15.Inmovilizacindeprotenas:transferenciaamembrana.Inmunodeteccindeprotenas. Latransferenciadelasprotenasseparadaselectroforticamenteamembranafuellevadaacabogracias a un equipo iBlot Dry Blotting System (Invitrogen, Barcelona, Espaa), empleando membranas de nitrocelulosa(Invitrogen)aunvoltajede20Vduranteuntiemponosuperiora8minutos. Unaveztransferidaslasprotenas,launininespecficaalasmembranasdenitrocelulosafuebloqueada incubando las mismas, durante al menos 1 hora, con tampn de bloqueo, una disolucin al 5% de leche desnatadaenpolvoenmedioPBSTween20(NaCl13,7mM,KCl2,7mM,Na2HPO48.1mM,KH2PO41,7mMy

56

Mtodos

Tween 20 0,1%). Posteriormente, las membranas fueron lavadas con PBSTween 20 durante tres ciclos de 5 minutos (3x5) y, a continuacin, incubadas con los anticuerpos primarios especficos, diludos en el mismo tampn,durantetodalanochea4C.Unavezretiradoelanticuerpo,lasmembranasfueronlavadasdenuevo (3x5) e incubadas con un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rbano, durante 30 minutos a temperaturaambienteentampndebloqueo.Traslaincubacin,serepitieronloslavados(3x5)yfinalmente, paraladeteccindelosanticuerpossecundariosconjugadosconperoxidasayunidosalasprotenasdeinters, se utiliz el sistema quimioluminiscente ECL suministrado por Amersham Pharmacia Biotech (Barcelona, Espaa). Anticuerpo primario
A1

Dilucindeuso
1/1000

Casacomercial
Calbiochem SantaCruz Biotechnology Upstate SantaCruz Biotechnology Sigma

Anticuerpo secundario
GARPO

Dilucindeuso
1/5000

Casacomercial
BioRad SantaCruz Biotechnology BioRad SantaCruz Biotechnology BioRad

A2A

1/100

DAGPO

1/3000

A2A

1/500

GAMPO

1/5000

A2B

1/100

DAGPO

1/3000

A3

1/500

GARPO

1/5000

Gi12

1/1000

DupontNEN

GARPO

1/5000

BioRad

Gi3

1/1000

DupontNEN SantaCruz Biotechnology Upstate

GARPO

1/5000

BioRad

Gs

1/1000

GARPO

1/5000

BioRad

mGlu1

1/1000

GARPO

1/5000

BioRad

mGlu5

1/1000

Upstate

GARPO

1/5000

BioRad

mGlu2,3

1/1000

Tocris

GARPO

1/5000

BioRad

PLC1

1/1000

Upstate

GAMPO

1/5000

BioRad

ACI

1/1000

Abcam

GARPO

1/5000

BioRad

Tabla 4: Resumen de los anticuerpos primarios y secundarios as como de su procedencia y la dilucin empleada para la inmunodeteccindeprotenasporlatcnicadeWesternblot.

57

Mtodos Cuandofuenecesario,seeliminaronlosanticuerposunidosalasnitrocelulosasporincubacin,durante 5minutosatemperaturaambiente,coneltampndestripping(glicina0,15%,SDS0.1%,tween201%,pH2.2). Despusdeestaincubacinlasnitrocelulosasselavaron denuevo(3x5)ycomenzdenuevoelprocesode bloqueo. Lasbandasvisualizadasenlasautorradiografassecuantificaronpordensitometraenundensitmetro GS690conelprogramainformticoMultiAnalystversin1.1deBioRad. Losanticuerposprimariosutilizados,ascomosusrespectivasdilucionesdeuso,quedanrecogidosenla Tabla4. III.16.Ensayosdeinmunofluorescencia. EstosensayosserealizaronenclulasplaqueadassobrecubreobjetosrecubiertosconpoliLlisina(BD Falcon).Antesdecomenzarconelprocesodefijacinlasclulasselavaroncontresciclosde5minutos(3x5) consolucindeLocke(NaCl140mM,KCl4,7mM,KH2PO41,2mM,MgSO47H2O1,2mM,HEPES(salsdica)10 mM,glucosa5,5mM,pH7,4)paraeliminarrestosdemediodecultivo.Elprocesodefijacinfuellevadoacabo empleando paraformaldehdo (PFA) al 4% durante treinta minutos, posteriormente los restos de PFA se eliminaron mediante sucesivos lavados (3x5) con solucin de Locke. En aquellos pocillos en los que se consider necesario se permeabilizaron las clulas con tampn de Locke conteniendo triton X100 0,25 % durante10minutos,seguidodevarioslavados(3x5)consolucindeLocke,parafomentarlaexposicindelos antgenosintracelulares. Con el fin de bloquear las uniones inespecficas se emple una disolucin de suero normal de cabra (VectorLaboratories,CA,EEUU)al3%enmediodeLocke,durante,almenos,45minutos.Trasesteperiodode bloqueoseaadieronlosanticuerposprimarios,alasdilucionesresumidasenlaTabla5,enmediodebloqueo frescoysedejaronincubardurantetodalanocheconagitacinsuavea4C. Al da siguiente, tras tres lavados de cinco minutos con medio de Locke, se aadi el anticuerpo secundario correspondiente. En el caso de las clulas C6 los anticuerpos secundarios empleados estaban acoplados directamente al flourforo que posteriormente se visualizara, en este caso FITC (fluorescencia verde) o cianina3 (fluorescencia roja). Estos anticuerpos fueron obtenidos de Jackson Immunoresearch (Pennsylvania,EEUU)yseemplearonaunadilucin1:600enmedioLockedurante45minutos. En el caso de los cultivos primarios, se realiz un paso intermedio de amplificacin empleando un anticuerposecundariobiotinilado(1:200;VectorLaboratories).Trasestaprimeraincubacinde45minutosde duracin, se realizaron tres lavados de 5 minutos con medio Locke y se aadi Streptavidina acoplada a Alexa488 (fluorescencia verde) o a Alexa546 (fluorescencia roja), obtenidos de Molecular Probes, a una dilucin1:1000enmedioLockedurante45minutos.

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Anticuerpoprimario Dilucindeuso
A1 A2A A2B A3 mGlu1(extracelular) mGlu5(extracelular) mGlu2,3(extracelular) PLC1 NeuN GFAP 1/50 1/50 1/50 1/50 1/200 1/200 1/200 1/500 1/2000 1/400

Mtodos Casacomercial
Calbiochem SantaCruzBiotechnology SantaCruzBiotechnology Sigma Alomone Alomone Tocris Upstate Chemicon Sigma

Tabla 5: Resumen de los anticuerpos primarios y secundarios as como de su procedencia y la dilucin empleada para la inmunodeteccindeprotenas.

Trasambasincubacionesseeliminelexcesodelosagentesempleadoscontreslavadosde5minutos con medio de Locke y se realiz una tincin de la cromatina empleando Hoechst 33258 1 g/mL en agua (Invitrogen).Trasunaincubacindelasclulasde5minutosconestadisolucinserealizaronsucesivoslavados (3x5)conaguaconelfindeeliminarelexcesodeagente. Unavezterminadoelprocesoloscubreobjetossemontaronsobreportaobjetosempleandounagota deProLongGold(MolecularProbes)paraevitarlaprdidadefluorescencia. Microscopaycuantificacin.

La toma de imgenes fue llevada a cabo en un microscopio invertido Leica DMI6000B (Leica Microsystems,Wetzlar,Alemania),conelobjetivode20X(objetivoHCXPLFLUOTAR)acopladoaunacmara digital(LeicaDFC350FX). Cuandofuenecesarialacuantificacindelafluorescenciaobtenidaendistintasimgenes,conelfinde relacionarla con la expresin proteica en las distintas condiciones experimentales analizadas, se emple el programaLeicaAplicationSuiteLite(versin2.0,LeicaMicrosystems).Laintensidaddefluorescenciaseestim evaluando el parmetro suma de pxeles, en, al menos, 30 campos seleccionados al azar de 40,5 m de dimetro.

59

Mtodos III.18.Evaluacindelamorfologanuclear. El Hoechst o bisbenzimida es un compuesto que se une a los cidos nucleicos. Utilizando los filtros apropiados, el Hoechst se puede visualizar con luz ultravioleta emitiendo fluorescencia azul. Las clulas apoptticaspuedendistinguirseporlacaractersticacondensacindelacromatinanuclearoporlapresencia defragmentacinnuclear. III.19.Determinacindelaconcentracindeprotena. ParadeterminarlaconcentracindeprotenadelasdiferentesmuestrassesiguielmtododeLowry (Lowry,1951)usandoalbminadesuerobovinocomopatrn.

III.20.Anlisisdelosparmetroscinticos. EnlosensayoscinticoslosparmetrosKD,constantededisociacindelradioligandoenelequilibrio,y Bmax,nmeromximodesitiosdeunin,fueroncalculadosconelanlisisdeScatcharddelosdatosdeunin (representando unin especfica partido de concentracin de radioligando frente a unin especfica) y se corroboraronestosvaloresmedianteregresinnolinealutilizandoelprogramaGraphPadPrismversin5.00 paraWindows(GraphPadSoftware,California,EEUU).Laecuacinutilizadaporelprogramaparaelclculode estosparmetrosfue: dondeYeslauninespecficaparacadapunto. ParaelclculodelaIC50seemplelaecuacincorrespondienteaunasigmoidededosisrespuesta: Donde Mnimo y Mximo son los valores de unin especfica ms bajo y ms alto obtenidos en estos ensayos,respectivamente,HeselcoeficientedeHillparalapendientedelasigmoide,Xeslaconcentracinde ligando empleado y el IC50 es el valor de concentracin de ligando necesario para alcanzar el valor de Y promediodelacurva.
Y = Mnimo Mximo Mnimo 1 + 10^ (LogIC 50 X )H Y= B max [radioligando] KD + [radioligando]

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III.21.Anlisisestadsticodelosdatos.

Mtodos

Comomedidadetendenciacentralsehausadolamedia,mientrasquecomomedidadedispersinha sidoutilizadoelerrorestndardelamedia(SEM). EltesttdeStudentdedoscolashasidoutilizadocomotestestadsticoparacalcularsignificatividades porcomparacinentregrupos,considerandoquelasdiferenciaseransignificativasapartirdep<0,05(95%de niveldeconfianza). III.22.Dilucindelosreactivoscomerciales. Losreactivosempleadosenlosestudiospresentadosseprepararonenlamedidadeloposibleelmismo dadelensayo.Encasocontrariofueronrepartidosenalcuotas,conservadosa20Cyempleadossegnlas instrucciones del fabricante. En el caso de sustancias insolubles en agua, se emple la mnima cantidad de solventeorgnico,generalmenteetanoloDMSO,parasucompletadisolucin,llevndoseacaboloscontroles apropiadosparadescartarelefectodeldisolvente. ElpptidoA142sepreparenaguadestiladaysecongela80C.Semantuvodurantelas24horas previasaserempleadoa37Cparafavorecersuagregacin.

61

Resultados

Expresinycaracterizacindelosrecetoresdeadenosina IV.1ExpresinycaracterizacindelosreceptoresenclulasC6. a) ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato.

Resultados

La identificacin y caracterizacin de los receptores metabotrpicos ya ha sido llevada a cabo con anterioridadenestegrupodeinvestigacinporelDr.JosLuisAlbasanz(Albasanzycol.,1997). b) Receptoresdeadenosina. EnprimerlugarseprocedialadeteccindelosreceptoresA1,A2A,A2BandA3enclulasC6,paraellose emplearon tcnicas de inmunofluorescencia y Western blot, empleando anticuerpos especficos para dichos receptores, y RTPCR, con el uso de oligonucletidos especficos. As se muestra en la Figura 1 la presencia endgenadelos4subtiposdereceptoresdeadenosina,descritoshastalafecha,enclulasC6degliomade rata. En el panel A se observa la inmunodeteccin de los citados receptores as como el correspondiente controlsinelanticuerpoprimario.Porsuparte,elpanelBrepresentalasbandasde3640kDa,45kDa,50kDa y 4452 kDa que se corresponden con los pesos moleculares de los receptores A1, A2A, A2B y A3, respectivamente,obtenidasapartirdemembranasplasmticasdeclulasC6analizadasporWesternblot.Por ltimo,talycomosemuestraenelpanelC,serealizladeteccindelosreferidosreceptoresaniveldeARNm empleandocebadoresespecficos,loscualesseencuentranresumidosenlaTabla3.Lasbandasobtenidasse visualizaronmediantetincinconbromurodeetidio. La expresin relativa de los receptores de Adenosina en clulas C6 a nivel de ARNm fue comprobada empleando la tcnica de PCR a tiempo real. En la Figura 2 se muestra el perfil de expresin de los distintos ARNm, siendo ste A1A3>A2A>A2B. Este resultado sugiere que los principales receptores de adenosina expresadosporlasclulasC6sonlosA1yA3. Una vez detectada la presencia de los mencionados receptores se procedi a la determinacin de los parmetros cinticos. Para ello se emple la tcnica de unin de radioligando, usando [3H]DPCPX como radioligandoespecficoparaelreceptorA1y[3H]ZM241385comoradioligandoespecficoparaelreceptorA2A. ComoseobservaenlaFigura3,seempleunrangoseconcentracionesde0,5a20nMderadioligando enmembranasplasmticas(panelA)yde0,5a25nM(panelB)enclulasintactas,emplendoseCPAcomo desplazanteparadeterminarlaunininespecfica.Enamboscasos,seobservunperfildeuninsaturableque seajustabaalmodelodeunnicolugardeunin.LosresultadosobtenidosfuerondeunaKDde9,41,4nMy unaBmaxde62,78,6fmol/mgprotenaparalasmembranasydeunaKDde17,71,3nMyunaBmaxde567,1 26,5fmol/mgprotenaparalasclulasintactas.Porotrolado,sedemostrquelauninde[3H]DPCPXera especficadel receptorA1 (panel C),yaque, en las curvas de competicin ensayadascon diferentes ligandos especficos,sloRPIAyCPAfueroncapacesdedesplazarlaunindelmencionadoradioligando.

65

Resultados A

Expresinycaracterizacindelosrecetoresdeadenosina

A1
Mw Membranas 40kDa 36kDa Mw

A2A
Membranas 45kDa Mw

A2B
Membranas 50kDa Mw

A3
Membranas 52kDa 44kDa

A1
M PCR

A2A
M PCR

A2B
M PCR M

A3
PCR

1000pb 500pb 630pb 160pb

655pb

150pb


Figura1.DeteccindelosreceptoresdeAdenosinaenclulasC6.PanelA.InmunolocalizacindelosreceptoresdeAdenosinaenclulas C6, Ab significa que la inmunofluorescencia se realiz en ausencia de anticuerpo primario. Se tomaron imgenes representativas empleando el objetivo 20X. Panel B. 100 g de membranas plasmticas de clulas C6 se sometieron a electroforesis en condiciones desnaturalizantes, transferidas a nitrocelulosa e incubadas con los anticuerpos corrrespondientes. Se indica el peso molecular de los fragmentosobtenidos(Mw:marcadoresdepesomolecular).PanelC.5gdeRNAtotaldeclulasC6fueronretrotranscritosyelADNc obtenidofueamplificadoempleandooligocebadoresespecficos,losproductossesepararonelectroforticamenteengelesdeagarosaylas bandassevisualizaronportincinconbromurodeetidio.Seindicalalongituddelosfragmentosobtenidosencadacaso(M:marcadorde pesomolecular,escalerade100pb).

66

Expresinycaracterizacindelosrecetoresdeadenosina

Resultados

Los mismos experimentos se realizaron para caracterizar los receptores A2A en esta ocasin empleando[3H]ZM241385,unantagonistaselectivodeA2A,comoradioligando,enunrangode1a20nM,y teofilinacomoagentedesplazanteparamedirlaunininespecfica.Serealizaronlosensayosdeunintantoen membranascomoenclulasintactas,obtenindoseenamboscasosunauninespecficasaturableyajustable almodelodeunnicositiodeunin,talycomosemuestraenlaFigura4. A
10


A1 A2A A2B A3 -actina

B
1.5

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

1.0

Rn

0.1


0.01

0.5

** **

0.001 0

5 10 15 20 25 30 35 40

0.0
1 2A

Figura 2: Cuantificacin por PCR a tiempo real de la expresin de receptores A1, A2A, A2B y A3. a Curvas de amplificacin obtenidas usandoloscebadoresyreactivosespecficosporPCRatiemporeal.Rneslasealobtenidanormalizadafrentealaemisindereferencia pasiva (ROX) menos la lnea base establecida en los primeros ciclos de reaccin (convencionalmente del 3 al 15). b Los valores fueron normalizadosusandolaactinacomocontrolinternoyexpresadosenfuncindelaexpresinrelativadeA1.Sepresentanlasmedias SEMdetresexperimentosdiferentesenloscualesseemplearonpreparacionesdeADNcdistintas.**p<0.01significativamentediferente frentealaexpresinrelativadeA1.

Losparmetroscinticosobtenidosenestosexperimentosfueron:paralasmembranasunaKDde4,7 0,6nMyunaBmaxde74,37,9fmol/mgprotena(panelA)yparaclulasintactasseobtuvounaKDde16,5 1,3nMyunaBmaxde358,952,4fmol/mgprotena(panelB). ParaconfirmarlaselectividaddeZM241385porlosreceptoresA2Aserealizaroncurvasdecompeticin enlasqueseemplearonCGS21680(agonistadeA2A),PSB1115(antagonistadeA2B)yCPA(agonistadeA1)alas concentraciones indicadas para intentar desplazar la unin de [3H]ZM241385 que se encontraba a una concentracinde15nMenclulasC6intactas(panelC).Comosemuestra,sloelCGS21680,agonistadeA2A, fuecapazdedesplazarlaunindelradioligandoalosreceptorescelulares,obtenindoseunaIC50de4,2nM. Sinembargo,elCPAyelPSB1115,selectivosparaA1yA2Brespectivamente,fueronincapacesdedesplazarla uninde[3H]ZM241385,confirmandoaslaselectividaddeesteligandoporlosreceptoresA2AenclulasC6.

Nmero de ciclo

2B

67

Resultados A
Unin especfica [ 3H]DPCPX (fmol/mg prot)

Expresinycaracterizacindelosrecetoresdeadenosina D
Unin especfica [ 3H]ZM241385 (fmol/mg prot)
80 70 60 50 40 30 20 10 0

40

30

20


0 5 10

10

Bm ax : 62.7 8.6 (5) fmol/mg prot K D : 9.4 1.4 (5) nM


15 20 25 30

Bm ax : 74.3 7.9 (7) fmol/mg prot KD : 4.7 0.6 (7) nM


0 5 10 15 20

B
350

[ 3H]DPCPX, nM

[3H]ZM241385, nM

300 250 200 150 100 50 0 0


5 10

E
Unin especfica [ 3H]ZM241385 (fmol/mg prot)
250

Unin especfica [ 3H]DPCPX (fmol/mg prot)

200

150

100

50

Bm ax : 567.1 26.5 (10) fmol/mg prot K D : 17.7 1.3 (10) nM


15 20 25 30

Bm ax : 358.9 52.4 (6) fmol/mg prot KD : 16.5 1.3 (6) nM


0 5 10 15 20

[3H]DPCPX, nM

[ 3H]ZM241385, nM

C
100

F
110 100

Unin especfica [ 3H] ZM241385 (% del control)

Unin especfica [ 3H]DPCPX (% del control)

75

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 CGS21680 PSB 1115 CPA -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

50

25

R-PIA CHA PSB 1115 CGS21680 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

Log [Ligando], M
3

Log [Ligando], M

Figura 3: Unin especfica de [ H]DPCPX a membranas y a clulas intactas. Los ensayos fueron realizados en membranas plasmticas(A)yenclulasintactas(B).Losdatosobtenidosse muestran como media SEM (n). (C) Clulas C6 se incubaron conconcentracionescrecientes(10 a10 M)deligandosycon [ H]DPCPX15nM.Semuestralauninobtenidaconrespectoal control. Los datos representan la media SEM de 3 a 6 experimentosllevadosacaboporduplicado.
3 9 3

Figura4:Uninespecficade[ H]ZM241385amembranasya clulas intactas. Los ensayos fueron realizados en membranas plasmticas(A)yenclulasintactas(B).Losdatosobtenidosse muestran como media SEM (n). (C) Clulas C6 se incubaron conconcentracionescrecientes(10 a10 M)deligandosycon [ H]ZM241385 15 nM. Se muestra la unin obtenida con respectoalcontrol.LosdatosrepresentanlamediaSEMde3 a6experimentosllevadosacaboporduplicado.
3 9 3

68

Expresinycaracterizacindelosrecetoresdeadenosina

Resultados

EstampliamentedescritalaparticipacindeprotenasconactividadGTPasademanerainhibidora(Gi) en la ruta de transduccin de seales mediada por el receptor A1. Con el fin de estudiar los subtipos de protenasGiimplicadasenesteprocesoenlasclulasC6serealizaronensayosdeWesternblot,ascomode RTPCR con el fin de caracterizar este sistema. En la Figura 5, panel A, se muestran los resultados de los WesternblotsrealizadosempleandoanticuerposespecficosparalassubunidaddelasprotenasGi12yGi3. ComoseobservaenelpanelBdelaFigura5,sedetect,medianteRTPCR,lapresenciadelARNmquecodifica la subunidad de los subtipos 2 y 3 pero no se obtuvo el fragmento correspondiente a la amplificacin del subtipo 1, indicando que slo los subtipos 2 y 3 de protenas Gi son los responsables del acoplamiento negativodelreceptorA1alaenzimaadenilatociclasa. A B
Figura5:DeteccindelasprotenasGienclulasC6.A,lapresenciadelasprotenasGi12yGi3fuedetectadaporWestenblot.B,ensayo representativodeRTPCRporelquesedetectlapresenciadelosARNmdeGi2,Gi3,semacanlostamaosdelosfragmentosobtenidos (M:marcadordepesopolecular,escalerade100pb)

Porotrolado,medianteensayosdecompeticin,sedemostrqueelreceptorA1estabaacopladoauna protena G sensible a la toxina extrada de Bordetella pertussis (PTX). As, se presenta en la Figura 6 el desplazamientoenlaunindelradioligando[3H]DPCPXenclulasintactascuandolasclulassepreincubaban conPTXoconGpp(NH)p(Guanililimidodifosfato),unanlogonohidrolizabledelGTP,obtenindoseenambos casosundesplazamientodelacurvadecompeticinhacialaderecha,esdecir,ambostratamientosdisminuan laafinidaddelreceptorporsuligando. ComosehaexpuestoenlaIntroduccin,larutadesealizacinmejorconocidaparalosreceptoresde adenosinaessucapacidaddemodularlaactividadadenilatociclasa,siendoinhibidoresdedichaactividadlos receptores A1 y activadores los A2. Con el fin de comprobar la integridad del sistema receptor efector segundo mensajero, se realizaron medidas de la actividad de la enzima adenilato ciclasa al tiempo que se estimulabanlosmencionadosreceptoresdeadenosina.

69

Resultados

Expresinycaracterizacindelosrecetoresdeadenosina

Unin especfica [3H]DPCPX (% del control)

100 75 50 25 0


Figura6:LosreceptoresA1estnacopladosaunaprotenasensible a PTX. La incubacin de las clulas C6 con 300 ng/mL de toxina pertsica (PTX) antes del ensayo de unin de radioligando desplaz hacialaderechalacurvadecompeticindelCHA(laIC50varide4,2

+ control + Gpp(NH)p + PTX -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 Log [CHA], M

M a > 1mM) en clulas intactas. Los datos representados son la mediaSEMdetrasexperimentosrealizadosportriplicado.

EnelcasodelasclulasC6,talycomosemuestraenlaFigura7,panelA,seencontrunaactividad adenilato ciclasa estimulada por forskolina y GTP de una manera dependiente de la concentracin. Para los receptoresA1,comoseobservaenelpanelBdelamismaFigura,sedetectunefectoinhibidordelligando CHA, mediado por el receptor A1, sobre la actividad adenilato ciclasa estimulada con forskolina y GTP. Por ltimo, se demostr (panel C) que este efecto inhibidor del receptor A1 sobre la enzima AC se produca medianteunaprotenasensiblealatoxinapertsica,confirmandoaselacoplamientoA1/ACatravsdeuna protenaGi. Adems, tal y como se muestra a continuacin, se estudi la funcionalidad de la va de transduccin principalparalosreceptoresA2AyA2B,estoes,laactivacindelaenzimaadenilatociclasa.Enestecaso,los ensayos consistieron en curvas de estimulacin de la actividad AC porCGS 21680, agonista especfico de los receptoresA2A,yNECA,agonistagenricodelosreceptoresA2.ComoseobservaenlaFigura8,panelA,elCGS 21680ejercaunefectoestimuladorsobrelaactividadACyesteefectoeradependientedelaconcentracin. Por otro lado, como se muestra en el panel B, dicho efecto era bloqueado mediante el empleo del antagonistaespecficodelreceptorA2AZM241385.

70

Expresinycaracterizacindelosrecetoresdeadenosina A
7.5

Resultados C
500

B
100 Actividad AC (% de FSK+GTP) 75 50 25 0

***

***

Actividad AC (pmol/mgmin)

5.0

Actividad AC (% del basal)

400 300 200 100 0

2.5

**
M M

**

0.0

FS K

H A

FS K +C

[FSK]

[GTP]

[CHA]

- PTX

Figura 7: Actividad AC en clulas C6. A, 1020 g de membranas plasmticas fueron incubadas con las concentraciones indicadas de forskolina (FSK) y GTP. B, las membranas fueron incubadas con forskolina 10 M y GTP 5 M en ausencia y presencia de distintas concentracionesdeCHA.C,laincubacindeclulasintactascon300ng/mLdePTXeliminabalacapacidadinhibitoriadeCHA1mM.La actividad basal en clulas tratadas con PTX (1,52 0,13 pmol/mgmin) no difera de la observada en clulas controles (1,2 0,1 pmol/mgmin).Entodosloscasos,elAMPcformadosemidisiguiendolosprotocolosdelapartadoMtodos.Losdatossonlasmedias SEM de tres experimentos realizados por triplicado. ** p<0,01 y *** p<0,001, significativamente diferente de la actividad AC basal en membranas (0,42 0,10 pmol/mgmin). p<0,01, significativamente diferente del valor estimulado con foskolina y GTP. xxx p<0,001, significativamentediferentedelcorrespondientevalorestimuladoconforskolina.

A
300 250 Actividad AC (% del basal)

350

*** ***
300 Actividad AC (% del basal)

##

* *

200
150 100 50

200

100

basal

-7

-6

-5

-4

0 CGS 21680 100 nM + CGS 21680 1 M ZM241385 10 M + + + + +

log [CGS21680], M

Figura 8: Efecto de CGS 21680 en la actividad AC en clulas C6 intactas. A, las clulas se incubaron en ausencia o en presencia de concentraciones crecientes de este agonista de los receptores A2A durante el ensayo de actividad AC. B, el empleo de ZM241385, antagonistadeestosreceptores,bloqueabaelefectodeCGS21680.LosdatossonlasmediasSEMde6experimentosindependientes realizados por triplicado. * p<0,05 y *** p<0,001, significativamente diferente de la actividad AC basal. # p<0,05, ## p<0,01, significativamentediferentedelcorrespondientevalorestimuladoconCGS21680.

FS K +C
+ PTX

10 0

10

FS K +G TP

B as al

10

10

FS K

nM

nM

nM

H A

71

Resultados

Expresinycaracterizacindelosrecetoresdeadenosina

EncuantoalosexperimentosenlosqueseempleelligandoNECA,comoseexponeenlaFigura9, panel A, se obtuvieron resultados similares a los obtenidos con CGS 21680, es decir NECA era capaz de estimular la actividad AC de forma dependiente de la concentracin. Para comprobar la preferencia de este ligando, si exista, por los dos subtipos de receptores de adenosina capaces de estimular la actividad AC se emplearonlosantagonistasZM241385,especficoparaA2A,yPSB1115,especficoparaA2B.Comoseobserva en el panel B de la mencionada Figura, la estimulacin de NECA sobre la actividad AC a las concentraciones ensayadas,esdebidaalaaccindeesteligandosobreelreceptorA2B,yaquesuefectoesbloqueableporel antagonistaPSB1115peronoporZM241385. A 400
350

B
400

** * *
Actividad AC (% del basal)

##
ns

Actividad AC (% del basal)

300 250 200 150 100

300

200

100

50
0

basal

-7

-6

-5

-4

-3

NECA 100 M NECA 1 mM ZM241385 10 M PSB 1115 10 M

+ -

+ + -

+ +

+ -

+ +

log [NECA], M

Figura 9: Efecto de NECA en la actividad AC en clulas C6 intactas. A, las clulas se incubaron en ausencia o en presencia de concentraciones crecientes de este agonista de los receptores A2 durante el ensayo de actividad AC. B, el empleo de ZM241385, antagonistadeA2A,nobloqueabaelefectodeNECA,mientrasquePSB1115,antagonistadeA2B,slohaca.LosdatossonlasmediasSEM de5experimentosindependientesrealizadosportriplicado.*p<0,05,**p<0,01,significativamentediferentedelaactividadACbasal.# p<0,05,##p<0,01,significativamentediferentedelcorrespondientevalorestimuladoconNECA.ns,nosignificativo.

EnestecasotambinsecomprobquelaactivacindelaACvareceptoresA2eramediadaporuna protenaGs.EnelpanelAdelaFigura10,semuestralainmunodeteccinporWesternblotdelasdosisoformas de la protena Gs. En cuanto a lo que a la funcionalidad del sistema se refiere, se estimularon membranas plasmticas aisladas con los agonistas antes empleados en presencia o ausencia de un anticuerpo especfico paralasubunidadGs.ComosemuestraenelpanelBdelamismafigura,elefectoestimuladordelaformacin deAMPcobservadoatravsdelosreceptoresA2seproducavaprotenaGs. LosexperimentosexpuestosenesteapartadoserecogenenlapublicacinEndogenousExpressionof AdenosineA1,A2andA3ReceptorsinRatC6GliomaCells(2007)NeurochemRes32:10561070.

72

Expresinycaracterizacindelosrecetoresdeadenosina A
Actividad AC (% del basal)

Resultados

B
400

**

300

200

100

i-G s EC A N N EC A + 21 68 i-G s an t

0 C G S C G S 21 68 0 +

Figura10:LosreceptoresA2estimulanlaactividadACatravsdeunaprotenaGs.A,deteccinporWesternblotdelasdosisoformasde laprotenaGs,seindicanlospesosmolecularesdelasbandasdetectadas.B,laincubacindemembranasplasmticasconunanticuerpo antiGs (1:100) 30 minutos antes del ensayo de actividad enzimtica bloqueaba los efectos estimuladores sobre la actividad AC observadosalaplicarCGS216801MyNECA100M.LosdatossonlasmediasSEMde3experimentosindependientesrealizadospor triplicado.*p<0,05,**p<0,01,significativamentediferentedelcorrespondientevalorestimuladoconagonista.

IV.2ExcitotoxicidadinducidaporGlutamato. IV.2.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza. ElglutamatoeselprincipalneurotransmisorexcitadordelSNC.Enlaactualidadseharelacionadocon procesosfisiolgicostanimportantescomoelaprendizajeolamemoriaocomoladireccindelasconexiones nerviososduranteeldesarrollo.Noobstante,cuandoesliberadodeformaincontroladaocurrenprocesosde muertecelular como consecuencia de la activacin de los receptores NMDAy la entrada masivade calcio al interior celular. Este proceso cobra importancia desde que se ha visto relacionado con varias enfermedades neurodegenerativas, algunas de ellas estudiadas por nuestro grupo de investigacin (Rodrguez y col., 2006; Albasanzycol.,2005). Dada la capacidad de los receptores metabotrpicos de glutamato de controlar los niveles de calcio intracelular o de modular la actividad de determinados canales inicos, resultan dianas teraputicas potenciales para la curacin/atenuacin de ciertas alteraciones neuroqumicas de las mencionadas enfermedades. Porotrolado,losreceptoresdeadenosinaestntambinrelacionadosconelcontroldelaliberacinde glutamato,loquelesconviertetambinendianaspotenciales.

an t

73

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Por este motivo se estudi en el presente apartado los procesos de modulacin que sufren los receptoresmetabotrpicosdeglutamatoylosreceptoresdeadenosinaencondicionesdeexposicintxicaa glutamato. a) Efectoenlaviabilidad. Segn Attucci y colaboradores (Attucci y col., 2002), en cultivos hipocampales la concentracin de glutamatoestimadaparainducirun50%demuerteneuronalencultivosdeentre21y28DIVtras24horasde exposicineradeentre5y30M.Porestemotivo,paralarealizacindeestosexperimentosseemplearon dosconcentracionesdeLGludiferentes,1y100M,queaseguraranunatoxicidadmoderadayunatoxicidad mselevada,adostiemposdeexposicintambindiferentes.LaviabilidadsemidiporeltestbasadoenMTT ylosresultadosseexponenenlaFigura11.
100

1 M L-Glu 100 M L-Glu Reduccin MTT (% del control)

75

**
50

*
25

***

12

24

tiempo (h)

Figura11:LaexposicinaLGludisminuyelaviabilidadcelular.NeuronascorticalesseexpusieronaLGlu1Mo100Mdurante2o24 horas.TranscurridoestetiemposemidilaviabilidadcelularmedianteeltestbasadoenMTT.LosdatosexpuestossonlasmediasSEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por triplicado, expresados porcentualmente con respecto a la viabilidad de las clulascontroles.*p<0,05,**p<0,01,***p<0,001significativamentediferenterespectoalcontrol.

Como se observa, slo la exposicin a LGlu 1 M durante dos horas no produce resultados estadsticamente significativos, a pesar de observarse una disminucin promedio de un 20% en la viabilidad celular (p=0,288). Sin embargo, la exposicin a esta misma cantidad de glutamato durante un periodo ms prolongadodetiempoconllevaunadisminucinenlaviabilidaddeun46%conrespectoalasituacincontrol (p<0,01). Porotrolado,seobservaquelaexposicinaLGlu100Mesunprocesomuchomstxico,talycomo cabraesperar,dehecho,tras2horasdeaplicacinyasehabanperdidoel47%delasneuronascorticalesdel

74

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

cultivo (p<0,05), mientras que tras 24 h de exposicin slo quedaban un 16% de neuronas supervivientes (p<0,001). Estos resultados confirman el hecho experimental de que la exposicin a elevadas cantidades de glutamatoinducetoxicidadencultivoscelulares,describindoseademsunmodelodeexcitotoxicidadinvitro dependientedelaconcentracinyeltiempodeexposicinaLGlu. Por otro lado se midi por PCR a tiempo real si esta exposicin a LGlu desencadenaba la activacin gnicadelacaspasa3.ComoseexponeenlaFigura12,seapreciaunincrementoparcialdelaexpresinde caspasa3.Sinembargo,nienelcasomsextremodeexposicinaLGluempleadoenestosensayos,dondela expresin aumentaba un 24%, se consiguen valores estadsticamente significativos (p=0,225), hecho que apunta a que la muerte celular producida por la exposicin excesiva a LGlu ocurre por necrosis y no por apoptosis.
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

Figura12:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresinde caspasa 3. Neuronas corticales fueron expuestas a LGlu 1 M durante 2 o 24 horas, LGlu 100 M durante 2 horas o se mantuvieronencondicionescontrolconelfindeaislarsuARN. Los experimentos de RTPCR a tiempo real se realizaron empleandounasondaespecficaparaelgencodificanteparala caspasa 3. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado

1.5

1.0

0.5

0.0

C on tr ol

24 h

empleandodistintasmuestras.

2h

LG lu

LG lu

b) ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato. La determinacin de los parmetros cinticos de los receptores metabotrpicos de glutamato, estudiados por ensayos de unin de radioligando, tanto en neuronas corticales controles como en las expuestasatoxicidadinvitroseexponenenlaFigura13. Encuantoalnmerototaldereceptores,panelA,seapreciaqueelLGluproduceunadisminucinde losreceptoresmetabotrpicosquevaraenfuncintantodelaconcentracindelagentecomodeltiempode exposicindelmismo.EnelcasodelaexposicinaLGlu1M,seobservaquetras2horasdeexposicinse detecta una disminucin de la cantidad de receptores de un 14%. Sin embargo, esta disminucin no resulta significativasegneltestestadsticoempleado.Porotrolado,silaexposicinseprolongahastalas24horasla disminucin en el nmero de receptores alcanza el 51%, dato que s resulta estadsticamente significativo (p<0,001). EnelcasodequeseemplearaLGlua100Melnmerodereceptoresenlasuperficiecelulartambin disminuyeperolosresultadossontodavamsclaros.Comoseobserva,tras2horasdeexposicinelnmero

LG lu

10 0

2h

75

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

total de receptores ha disminuido un 40% (p<0,001), mientras que si la exposicin se prolonga hasta las 24 horas,un95%delosreceptoresmetabotrpicosdesaparecedelasuperficiecelular(p<0,001). A
Figura13:LaexposicinaLGlumodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular.NeuronascorticalesseexpusieronaLGlu 1Mo100Mdurante2o24horas.SerealizaronensayosdeuninderadioligandoempleandoL[ H]Glu.Losdatosexpuestossonlas medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticoscalculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPad Prism5.0.***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

Encuantoalaafinidaddelosreceptores,panelB,seapreciaunefectomsmarcadoqueenelnmero dereceptores,yaque,enestecaso,todoslosresultadosobtenidossonestadsticamentesignificativos(todos p<0,001),observndoseunadisminucinenlaconstantequeimplicaunaumentodelaafinidaddelreceptor por su ligando. En el caso de la concentracin ms baja se observa un efecto bifsico, a tiempos cortos de exposicin la afinidad de los receptores por su ligando aumentaba en un 68%, mientras que si el tiempo de exposicin se prolongaba el aumento de la afinidad slo llegaba hasta el 50% con respecto a la situacin control.Enelcasodelaconcentracinde100M,elperfilobservadoeselmismo,mientrasquea2horasla disminucindelaKDeradeun77%,tras24horasdeexposicinsuvalorslodescendahastael47%delvalor inicial. Porotrolado,lacomparacinestadsticadelosdatosobtenidosparacadaconcentracinmuestraque, excepto en la comparacin de las afinidades obtenidas empleando LGlu 1 M (p=0,059) los resultados obtenidosadistintostiemposdeexposicinsonestadsticamentediferentesentres(almenosp<0,005). Estos resultados indican que la exposicin a LGlu en neuronas corticales produce una regulacin a la bajadelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato,queconllevaunaumentodelaafinidaddelosmismos porsuligando. Acontinuacinseexponeunresumen(Tabla6)delosdatoscinticosobtenidosenestosexperimentos.

76

Excitotoxicidadinducidaporglutamato LGlu 1M2h 493,8 72,6 988,4 84,2 *** LGlu 1M24h 279,9 35,6 *** 1546,8 244,5 *** LGlu 100M2h 343,8 32,5 *** 704,9 152,3 ***

Resultados LGlu 100M24h 27,7 3,5 *** 1653,7 167,8 ***

Bmx
(pmol/mg)

Control 577,2 29,4 3117,968,7

KD
(nM)

Tabla 6: Resumen de los parmetros cinticos obtenidos en neuronas corticales expuestas a LGlu. *** p<0,001 significativamente diferenterespectoalcorrespondientecontrol.

El siguiente paso fue comprobar de manera ms especfica la regulacin sufrida por esta familia de receptores, para ello se emplearon los anticuerpos especficos disponibles para cada subtipo, tal y como se describe en Mtodos. La cuantificacin de la fluorescencia obtenida, as como del anlisis estadstico de los datossemuestraenlaFigura14,mientrasquealgunasmicrografasrepresentativasdelasimgenesobtenidas paracadaunodelosanticuerposempleadosporcadacondicinexperimentalseexponenenlaFigura15.
Fluorescencia (unidades arbitrarias) mGlu1 mGlu5 mGlu2,3 PLC 1

600000

400000

*** ***
200000

****** **

*** ***

*** **
0

***

Figura 14: La exposicin a LGlu modula los receptores metabotrpicos en la superficie celular. Diagrama de barras que resume los resultadosexpuestosenlaFigura14.LascuantificacionesserealizaronusandoelsoftwareLASAFempleandounmnimode30campospor condicin experimental. Se exponen las medias SEM obtenidas para cada condicin experimental. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

LG C L- lu on G 1 tro L- lu l G 1 M L- lu M 2h G 10 lu 0 24 10 h 0 M M 2h 24 h LG Co L- lu n G 1 tr L- l u M ol G 1 L- lu M 2h G 10 lu 0 24 10 h 0 M M 2h 24 h LG Co L- lu n G 1 tr L- lu M ol G 1 L- lu M 2h G 10 lu 0 24 10 h 0 M M 2h 24 h LG Co L- lu n G 1 tr L- lu M ol G 1 L- lu M 2h G 10 lu 0 24 10 h 0 M M 2h 24 h

77

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Figura15:InmunodeteccindemGluyPLC1traslaexposicinaLGlu.Micrografasrepresentativasdelosresultadosobtenidostraslos experimentos de inmunofluorescencia al emplear los anticuerpos para mGlu1, mGlu5, mGlu2,3 y PLC1 en las distintas condiciones experimentales.Labarrarepresenta62m.

Acontinuacinseexponeunresumen(Tabla7)querecogelosprincipaleshallazgosobservadosenesta seriedeexperimentos.

78

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

LGlu1M2h LGlu1M24h LGlu100M2h LGlu100M24h

mGlu1 *** *** **

mGlu5 ***

mGlu2,3 *** *** **

PLC1 *** * *** ***

Tabla7:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenneuronascorticalesexpuestasaLGlu.Se muestraelsentidodelavariacinobservadaconrespectoalcontrolmedianteflechas:aumenta;disminuye.*p<0,05,**p<0,01,*** p<0,001significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.

Como se observa, la regulacin de cada uno de los subtipos de los receptores metabotrpicos como consecuencia de la exposicin a LGlu parece ser especfica para cada subtipo y depende del tiempo y de la cantidad de LGlu a la que se expongan las neuronas corticales in vitro. En el caso del receptor mGlu1, se observaunaumentosignificativodesupresenciaenlamembranaplasmticaentodosloscasosexceptoenla exposicin a LGlu 100 M durante 24 horas. En el caso de mGlu5, la modulacin es ms discreta y slo se apreciaunaumentosignificativodelacantidaddeprotenaenmembranatras2horasdeexposicinaLGlu 100 M. Los ltimos receptores estudiados, mGlu2,3, sufren un aumento significativo de su expresin en membranaentodosloscasosexceptoenlaexposicinaLGlu1Mdurante2horas. Por otro lado, la regulacin sufruda por la enzima PLC1 es tambin compleja, observndose un aumento tras la exposicin a LGlu 1 M durante 24 horas y disminuciones en la cantidad de protena en el restodeloscasos. Estosresultadossugierenquelaregulacindelaexpresinenmembranadelosdistintossubtiposde receptores metabotrpicos de glutamato, as como de la cantidad total de la enzima PLC 1, es compleja y parecenoseguirunpatrndependientedelaconcentracindeLGluempleadonideltiempodeexposicinen neuronascorticalesinvitro. DadaslasvariacionesdetectadasenlosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatoyenlaenzimaPLC1, se decidi estudiar si los cambios observados ocurran como consecuencia de la regulacin gnica de estas protenas.Paraello,serealizaronensayosdePCRatiemporealenlosquesecuantificlacantidaddeARNm de los receptores mGlu1 y mGlu5, as como de la enzima PLC1. En estos ensayos se elimin la exposicin a LGlu 100 M durante 24 horas debido a la baja viabilidad observada. Los resultados obtenidos en estos experimentosseexponenenlaFigura16.

79

Resultados
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control) Control L-Glu 1 M 2h L-Glu 1 M 24h L-Glu 100 M 2h

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

*
4

**

0
lu lu PL C m G m G 1
1 5

Figura 16: Efecto de la exposicin a LGlu sobre la expresin gnica de mGlu1, mGlu5 y PLC1. Neuronas corticales fueron expuestas a LGlu1Mdurante2o24horas,LGlu100Mdurante2horasosemantuvieronencondicionescontrolconelfindeaislarsuARN.Los experimentosdeRTPCRatiemporealserealizaronempleandosondasespecficasparalosgenesmostrados.Losdatosexpuestossonlas medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05, ** p<0,01, significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

Comoseobserva,slocuandolasneuronascorticalesseexpusieronaLGlu100Mdurantedoshoras seobtuvierondiferenciasestadsticamentesignificativas.Enconcreto,paraelreceptormGlu1esenestepunto enelquesuexpresingnicaaumentun144%(p<0,05).EnelcasodemGlu5laexpresinaumentun290% sobrelosnivelesdetectadosencondicionescontroles(p<0,05).Porltimo,enelcasodePLC1sedetectuna disminucindeun26%sobreelcontrol. Estos resultados sugieren que la modulacin de la expresin gnica deestas protenas depende dela concentracin a la que se exponen las neuronas corticales, de tal modo que el empleo de LGlu 1 M, independientementedeltiempodeexposicin,nomodulalaexpresingnicadelasprotenasestudiadas,sin embargo, el empleo de LGlu 100 M slo durante dos horas es suficiente para observar variaciones significativasenlaexpresingnica. DadaslasvariacionesobservadasenlosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI,ascomodelaisoforma de la enzima a la que estn acoplados principalmente, se procedi a realizar un estudio del efecto de la exposicinaLGlusobrelaactividadPLC.ParaelloseeligilacondicindeexposicinaLGlu100Mdurante 2horasyaqueeraenlaquemscambiossedetectabanenloquealacantidaddereceptoresenlamembrana serefiere.

80

Excitotoxicidadinducidaporglutamato A B

Resultados

Figura17:LaexposicinaLGlunovaralaactividadPLC.NeuronascorticalesfueronexpuestasonoaLGlu100Mdurante2horasantes derealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeIP3.SeestudielefectodelaexposicinaLGlusobrelaactividadPLCbasal (panelA),ascomosuefectosobrelafuncionalidaddelsistemaestimuladoporagonistasdelgrupoIdelosreceptoresmetabotrpicosde glutamato (panel B). Los datos expuestos son las medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleandodistintoscultivos.

ComoseexponeenlaFigura17,panelA,laexposicinaLGlunoproducecambiossignificativossobre la actividad PLC basal en relacina la actividad detectada en neuronas corticalescontroles (Control: 10,91 2,69;Tratada:12,410,57pmol/mgmin).EnelpanelBsemuestraque,tantoLGlu100Mcomo(S)DHPG soncapacesdeestimularlahidrlisisdefosfatidilinositolesenclulascontroles,ascomoenlastratadas.Sin embargo, no se observan diferencias significativas al comparar los datos obtenidos en ambas situaciones. Todoslosdatosexpuestossonsignificativamentediferentes(almenosp<0,05)conrespectoalaactividadbasal de cada grupo (LGlu: Control: 139,06 9,96; Tratada: 146,16 14,70%; (S)DHPG: Control: 149,69 26,80; Tratada:152,137,87%). Estos resultados sugieren que, a pesar del aumento observado en los receptores metabotrpicos del grupo I en estas condiciones, la disminucin observada en la PLC1 es suficiente para que la actividad enzimticaPLCmedidanovareensuconjunto. Por ltimo, se comprob la capacidad de los receptores metabotrpicos de los grupos II y III para transducirlasealatravsdelsistemaenzimticoalqueestnprincipalmenteacoplados,lainhibicindela adenilatociclasa.EstosexperimentosserealizaronexponiendolasneuronascorticalesaLGlu100Mdurante 2horas,dadoqueeslacondicinalaqueseobservabanmayoresnivelesdelosreceptorespertenecientesal grupoIIenlamembranaplasmticadeestasclulas.LosresultadosobtenidosseexponenenlaFigura18. ComoseobservaenelpanelA,laexposicinaLGlu100Mdurante2horasnoafectaalaactividad basaldelaAC(Control:0,940,27;Tratada:1,000,53pmol/mgmin).EnelpanelBseexponelacapacidad de(2R,4R)APDC,agonistadelosreceptoresdelgrupoII,ydeLAP4,agonistadelosreceptoresdelgrupoIII,de inhibirlaactividadAC((2R,4R)APDC:Control:58,2410,27;Tratada:70,536,37%;LAP4:Control:50,22 3,70;Tratada:76,947,47%,p<0,05).Entodosloscasoslosdatosobtenidossonsignificativamentediferentes

81

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

delbasal(almenosp<0,05),perosloseobservarondiferenciassignificativastraselempleodelagonistadel grupo III, obtenindose una menor inhibicin de la actividad AC en clulas expuestas a LGlu que en clulas controles. Estos resultados sugieren que, en estas condiciones, los receptores metabotrpicos del grupo III podranestarreguladosalabaja,yaqueelprincipalsistemadetransduccindesealesalqueestnacoplados resultaalteradocomoconsecuenciadelaexcitotoxicidadinvitro,mientrasqueenelcasodelgrupoIInose observandiferencias. A
Figura18:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaactividadAC.NeuronascorticalesfueronexpuestasonoaLGlu100Mdurante2antes derealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeAMPc.SeestudielefectodelaexposicinaLGlutamatosobrelaactividadAC basal (panel A), as como su efecto sobre la funcionalidad del sistema inhibido por un agonista del grupo II de los receptores metabotrpicosdeglutamato,(2R,4R)APDC,yporunagonistadelgrupoIII,LAP4(panelB).LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde, almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintoscultivos.*p<0,05significativamentediferentede sucorrespondientecontrol.

c) Receptoresdeadenosina.

ComosehamencionadoenlaIntroduccin,estdescritoconanterioridadenlabibliografa,inclusopor estemismoGrupodeinvestigacin,laexistenciadetransmodulacinentrelosreceptoresmetabotrpicosde glutamatoylosreceptoresdeAdenosina.Porestemotivoseextendielestudiodelosprocesosdesarrollados a nivel molecular tras una exposicin a glutamato al sistema de los receptores de Adenosina en neuronas corticalesencultivo. Con el fin de cuantificar la densidad de los receptores a nivel de la superficie celular se recurri al ensayo de unin de radioligando, empleando, de nuevo, [3H]DPCPX como antagonista especfico para el receptorA1.ComoseobservaenlaFigura19eltratamientoconLGlu100Mdurante2horasprcticamente duplicaba el nmero de receptores en la superficie celular desplazando adems la KD hacia valores ms elevados de radioligando. Como se puede observar, tanto el aumento en el nmero de receptores (85% de incrementoconrespectoalcontrol)comoelaumentoenlaKD(msdecuatrovecesconrespectoalcontrol) resultaban significativos cuando se sometan al test estadstico de Student. Estos resultados sugieren que la

82

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

exposicindelasneuronascorticalesaglutamatoenestascondicionesmodulalosreceptoresA1deadenosina incrementandosupresenciaenlamembranacelularydisminuyendolaafinidaddelosmismosporsuligando.
Unin especfica [3H]DPCPX (pmol/mg prot)

0.3

Control L-Glu 100 M 2 h


Figura19:LaexposicinaLGluregulaalalzalosreceptores A1(I).NeuronascorticalesfueronexpuestasonoaLGlu100

0.2

M durante 2 horas antes de realizar los ensayos de unin de radioligando empleando el antagonista especfico del receptorA1[ H]DPCPX.LosdatossonlasmediasSEMde,al
3

0.1

menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos cultivos. Los parmetros

0.0

cinticoscalculados,BmaxyKD,seobtuvieronapartirdelos
0 5
3

10

15

20

resultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPad Prism 5.0. * p<0,05, *** p<0,001 significativamente diferenteconrespectoalcontrol.

[ H]DPCPX (nM)
Bmax (pmol/mg prot) Control L-Glu 100 M 2 h 0,149 0,006 0,278 0,022 *** KD (nM ) 1,16 0,16 5,00 1,38 *


A1R -Actina
Control L-Glu 100 M 2h

37 kDa 45 kDa

Figura20:LaexposicinaLGluregulaalalzalosreceptores A1 (II). Neuronas corticales fueron expuestas o no a LGlu 100 M durante 2 horas antes de realizar aislamientos de membranasplasmticasporcentrifugacindiferencial,taly comosedescribeenMtodos.Seemplearon30gdecada

Densidad A1R/ -Actina (unidades arbitrairas)

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

muestra en la separacin electrofortica. Tras la inmovilizacinseemplearonanticuerposespecficosparael receptor A1 y para la protena actina como control de carga. Se expone en el panel superior una imagen representativa,lospesosmolecularesindicadosrepresentan laalturadelasbandasdensitometradas.Enelpanelinferior se muestra el anlisis densitomtrico de las bandas obtenidas. Los datos expuestos son las medias SEM de 2 experimentos muestras. independientes empleando distintas

C on tr ol

EstosresultadosfueroncorroboradosmedianteelempleodelatcnicadeWesternblot(Figura20).As, la fraccin de membrana plasmtica de cultivos primarios de neuronas corticales, fue separada electroforticamenteencondicionesdesnaturalizantesytransferidaaunsoporteslido,talycomosedescribe en Mtodos. El anlisis densitomtrico de las bandas obtenidas tras el proceso de inmunodeteccin con los

LG

lu

10

2h

83

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

anticuerposespecficosparaelreceptorA1yparaelcontrolinternodelaactina,revelabanunaumentodeun 82%enlacantidaddereceptorA1presenteenlamembranaplasmticadelasclulasexpuestasaglutamato conrespectoalacantidaddelmismoreceptorpresenteenlasmembranasplasmticasdelasclulascontroles. Sinembargo,elaumentodescritoporestemtodonoresultsignificativo(p=0,14),debidoprobablementeala menorsensibilidaddeestemtodoconrespectodelensayodeuninderadioligandos.


Figura21:LaexposicinaLGluregulaalalzalosreceptoresA1(III). Neuronas corticales fueron expuestas o no a LGlu 1 o 100 M durante 2 o 24 horas antes de realizar los ensayos de inmunofluerescencia empleando un anticuerpo especfico para el receptor A1 en las condiciones descritas en el texto. En el panel izquierdo se exponen micrografas representativas de los resultados obtenidos tras los experimentos de inmunofluorescencia en las distintas condiciones experimentales. La barra representa 62 m. El diagrama de barras que se expone en el panel derecho resume los datosobtenidosenlascuantificacionesrealizadasusandoelsoftware LAS AF empleando un mnimo de 30 campos por condicin experimental. Se exponen las medias SEM obtenidas para cada condicin experimental. *** p<0,001 significativamente diferente conrespectoalcontrol.

Fluorescencia (unidades arbitrarias)

300000

***
200000

100000

0
C on tr ol 1 M LG 2h lu 1 M L24 G lu h 10 0 LM G lu 2h 10 0 M 24 h LG lu

ConelfindeampliaresteestudioadistintascondicionesdeexposicinaLGluserecurrialatcnicade inmunocitoqumica como herramienta sencilla que permita estudiar el comportamiento del receptor A1 en distintassituacionesascomocuantificarsuvariacin.Deestamanera,elmismoanticuerpocontraelreceptor A1empleadoenWesternblotfueempleadoparalasinmunofluorescencias.Dadoqueeleptopocontraelque

84

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

est dirigido este anticuerpo se encuentra situado en la parte del receptor expuesta hacia el exterior de la membrana (aminocidos 309326), la fijacin con paraformaldehdo, tras los correspondientes tratamientos, sin posterior permeabilizacin nos permiti cuantificar la cantidad de receptor presente en la membrana celulardespusdehaberterminadolainmunocitoqumica.LosresultadosobtenidossemuestranenlaFigura 21,enelpanelizquierdosemuestranimgenesrepresentativasdecadaunadelascondicionesdeexposicina LGluensayadas,ascomodelacondicincontrol.Porsuparteenelpanelderechoseobservanlosresultados obtenidostraslascuantificacionesrealizadasconelsoftwareLASAFLite,talycomosedescribeenMtodos. Comoseobserva,laexposicinaLGluproduce,engeneral,unaumentodelafluorescenciaobservada,estoes unaumentodelacantidaddereceptorA1presenteenlamembranacelular.Sinembargo,esteaumentoslo essignificativoparalaexposicinaLGlu1Mdurante24horas(p<0,001,segnANOVAdedosvasseguido deBonferroni),enlaqueelaumentodelaintensidaddefluorescenciapromedioesde3veces,siendode1,8 vecesparaLGlu100M2hyde1,1vecesparaLGlu100M24h,mientrasqueparaLGlu1Mdurante2 horasprcticamentenohayaumento.Estosresultadossugierenque,engeneral,laexposicinaLGluproduce unaumentodelosreceptoresA1aniveldelamembranaplasmtica,corroborandoaslosresultadosobtenidos conanterioridad. ComoseexponeenelpanelsuperiordelaFigura22,laexposicindeneuronascorticalesencultivoa LGlu100Mdurante2horasproduceunaumentodelnmerototaldereceptoresA2Aenlasuperficiecelular. El anlisis estadstico de los datos obtenidos en estos ensayos se muestra en el panel inferior de la misma Figura. Como se expone, el aumento observado resulta significativo y se corresponde con un aumento del nmero de receptores de un 82% con respecto a las clulas controles. Por otro lado, aunque se observa un ligero aumento de la KD de estos receptores, lo que conlleva una disminucin en la afinidad de los mismos, este aumento no es significativo. Estos resultados sugieren que la exposicin a LGlu en estas condiciones produce un aumento del nmero de receptores A2A en la membrana plasmtica de neuronas corticales en cultivo,sinqueelloafectealaafinidaddelreceptorporsuligando.
Unin especfica [3H]ZM241385 (pmol/mg prot) Control L-Glu 100 M 2 h
0.6

Figura22:LaexposicinaLGluregulaalalzalosreceptores A2A.NeuronascorticalesfueronexpuestasonoaLGlu100 M durante 2 horas antes de realizar los ensayos de unin

0.4

de radioligando empleando el antagonista especfico del receptorA2A[ H]ZM241385.Losdatosexpuestosenelpanel superiorsonlasmediasSEMde,almenos,3experimentos


3

0.2

independientes realizados por duplicado empleando distintoscultivos.Losparmetroscinticoscalculados,Bmaxy

0.0 0 5
3

KD, se obtuvieron a partir de los resultados experimentales


10 15 20

empleando el software GraphPad Prism 5.0 y se exponene en el panel inferior. ** p<0,01, significativamente diferente conrespectoalcontrol.

[ H]ZM241385 (nM)
Bmax (pmol/mg prot) Control L-Glu 100 M 2 h 0,656 0,051 1,198 0,035 ** KD (nM ) 14,79 0,89 21,37 3,40

85

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

UnavezrealizadoelestudiodelosreceptoresA1yA2Adeadenosinaaniveldelasuperficiecelularse procedialestudiodelaregulacindelaexpresingnicadelosmismostraslaexposicindelasneuronas corticales en cultivo a distintas cantidades de LGlu, con el fin de comprobar si los cambios detectados eran consecuenciadeprocesosderegulacindelaexpresingnicainducidosporesteagente.Paraelloserecurri a la tcnica de RTPCR en tiempo real empleando sondas especficas para los genes correspondientes a los receptoresA1,A2AyA2B.ApesardequesedisponadeunasondaparaelgencorrespondientealreceptorA3de adenosina,sedescartsuanlisisporPCRdebidoalabajaexpresindeestegenenneuronascorticales. Conestefin,lasneuronascorticalesseexpusieronaLGlu1Mdurante2y24horasyaLGlu100M durantedoshoras,despusdelostratamientosseprocediaextraerelARNtotaldecadacondicin.Aunque paraelestudiodelreceptorA1porinmunocitoqumicaseempletambinlacondicinLGlu100Mdurante 24 horas, esta condicin fue descartada para los estudios de PCR debido a la baja viabilidad celular tras la exposicin,loquedisminuaconsiderablementeelrendimientodeobtencindeRNA. LosresultadosobtenidosparaestosexperimentosseexponenenlaFigura23.Comoseobservaenla Figura,paraelgencodificanteparaelreceptorA1ocurrequeeltratamientoconLGluaumentalaexpresinde dichogendeformadependientedelaconcentracinydeltiempodeexposicin.Sinembargo,estatendencia esslosignificativaenelcasodeltratamientoconLGlu100M2h(p<0,05).
2.0

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

1.5

A1 A2A A2B

Figura 23: Efecto de la exposicin a

LGlusobrelaexpresingnicadeA1, A2A y A2B. Neuronas corticales fueron expuestasaLGlu1Mdurante2o24 horas,LGlu100Mdurante2horaso semantuvieronencondicionescontrol

1.0

con el fin de aislar su ARN. Los experimentosdeRTPCRatiemporeal

0.5

se realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos realizados por

0.0
2h C on tr ol 24 2h h M M M

independientes duplicado

empleando

distintas

muestras.*p<0,05,significativamente diferenteconrespectoalcontrol.

LG lu

lu

LG

EnloqueserefierealgenquecodificaparaelreceptorA2A,comoseobservaenlaFigura23,tambinse produceunaumentodelaexpresindelmismocomoconsecuenciadelaexposicinaLGlu.Sinembargo,este aumentosloseapreciacuandolasneuronascorticalesseexponenaLGlu1M24horasyaLGlu100M durante2horas,siendosteltimoelnicocasoenelquedichoaumentoessignificativo(p<0,05). Por ltimo, en el caso del gen que codifica para el receptor A2B, la regulacin de la expresin gnica ocurreensentidocontrario,talycomoseapreciaenlaFigura23,esdecir,laexposicinaLGluproduceuna

86

L-

lu

10 0

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

disminucinenlaexpresindedichogen,apreciabledesdelaexposicinaLGlu1Mdurante2horasysiendo significativaparaLGlu1M24horasyLGlu100M2horas(p<0,05enamboscasos). Estos resultados, tomados en conjunto, sugieren que la exposicin de neuronas corticales a LGlu modulalaexpresingnicadelosreceptoresdeadenosina,siendoincrementadalaexpresincorrespondiente a los genes que codifican para los receptores A1 y A2A y disminuida la expresin correspondiente al gen que codificaparaelreceptorA2B,aunqueestasvariacionesslosonestadsticamentesignificativosenelcasodela exposicinaLGlu100Mdurante2h. Paracompletarelestudiorelativoalosreceptoresdeadenosina,secomprobcmoseveaafectadala va de transduccin de seales mediada por tales receptores tras la exposicin de las neuronas corticales a LGlu.Paraello,serecurrialadeterminacindelacantidaddeAMPcquecontenanlasneuronascorticales despusdehabersidoestimuladoslosreceptoresdeadenosinaenglobadosennuestrosistemadeestudio.As, dadoqueelreceptorA1estacopladodemanerainhibidoraalaenzimaACseempleforskolina,unditerpeno capaz de estimular directamente la AC, y CHA, un agonista especfico del receptor A1, mientras que para el receptor A2A, acoplado de manera estimuladora a la AC, se emple el agonista CGS 21680. En este caso se emplearonlascondicionesenlasquesehabandetectadomayoresvariacionesenlaexpresindereceptores A1yA2A,tantoaniveldeARNmcomoaniveldeprotena,estoes,laexposicinaLGlu100Mdurante2h. A
Inhibicin mediada por CHA (% de la actividad con Forsk)

B
Actividad AC estimulada por CGS 21680 (% del basal)

60

250 200 150 100 50 0

40

20

C on tr ol

ol

C on tr

lu

LG

Figura24:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaactividadAC.NeuronascorticalesfueronexpuestasonoaLGlu100Mdurante2antes derealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeAMPc.SeestudielefectodelaexposicinaLGlutamatosobrelainhibicinde la actividad AC por el receptor A1 (panel A), empleando el agonista especfico CHA a 100 M para inhibir la actividad estimulada por forskolina 5 M (Forsk). Tambin se comprob el efecto de la excitotoxicidad en la estimulacin de la actividad AC promovida por el receptorA2A(panelB),paralocualseempleelagonistaespecficoCGS21680a1M.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde,al menos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintoscultivos.*p<0,05significativamentediferentedesu correspondientecontrol.ActividadbasalAC:Control:0,940,27;Tratada:1,000,53pmol/mgmin.

LosresultadosobtenidossemuestranenlaFigura24.LaexposicinaLGlunoproducaningnefecto sobre la actividad basal de la enzima (Control: 1,21 0,35; LGlu 100M 2h: 1,24 0,67 pmol/mgmin). Sin

LG

lu

10 0

10

87

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

embargo,comosepuedeobservarenelpanelA,elefectoinhibidordeCHAsobrelaenzimaACatravsdel receptorA1,eramayor,esdecirseobservabaunamayorinhibicindelaenzimaAC,previamenteestimulada conforskolina,enlasclulasexpuestasaLGlu,siendoademsesteaumentodeun42%enlacapacidadde inhibicinestadsticamentesignificativo(Control:33,892,93%;LGlu100M2h:48,315,54%,p<0,05). Por otro lado, la estimulacin de la AC va receptor A2A tambin produca cambios significativos, tal y como se expone en elpanel Bde la misma Figura. Como se observa, la estimulacin del receptorA2A con el agonistaespecficoCGS21680eraun66%mselevada,esdecirsedetectabaunamayorproduccindeAMPc, enlasneuronascorticalesexpuestasaLGlu100Mdurante2hqueenlasclulascontroles(Control:140,43 7,18%;LGlu100M2h:233,4731,29%,p<0,05). EstosresultadossugierenquelavaprincipaldetransduccindesealesmediadaporlosreceptoresA1 y A2A de adenosina en neuronas corticales de cerebro de rata se ven potenciadas como consecuencia de la exposicin a LGlu, observndose cambios tanto a nivel del nmero de receptores, como cambios en la expresin gnica de los mismos que justifican la potenciacin de su actividad, entendida sta como la capacidaddealterarlaconcentracindesegundosmensajerosintracelulares. Una vez confirmada la modulacin de la va de transduccin de la AC mediada por los receptores de adenosinacomoconsecuenciadelaexposicinaLGluenneuronascorticales,seprocediaestudiarsiesta exposicinafectabaalaexpresindelfactordetranscripcinCREByasumoduladorCREM,yaqueCREBactiva la transcripcin de genes implicados en la supervivencia celular. Para ello se realizaron ensayos de RTPCR a tiemporealempleandosondasespecficasparaambosgenes.LosresultadosobtenidosseexponenenlaFigura 25.Comoseobserva,laexposicinaLGluproduceunadisminucindelaexpresindeambosgenes,siendo ademsestadisminucinsignificativaentodosloscasos.Deestemodo,paraelgenquecodificaparaCREBse detect una disminucin con respecto alcontrol de un20% tras la exposicin a LGlu 1M durante 2horas (p<0,05), de un 29% si la exposicin se prolongaba durante 24 horas (p<0,01) y de un 37% si lo que se empleabaeraLGlu100Mdurante2horas(p<0,001).EnelcasodelgencodificanteparalaprotenaCREMsu disminucinconrespectoalcontrolfuedeun29%paraLGlu1Mdurante2horas(p<0,05),deun46%parala exposicin durante 24 horas (p<0,001) y de un 34% en caso de emplearse LGlu 100 M durante 2 horas (p<0,01). EstosresultadosapuntanaquelaexpresingnicadelosfactoresdetranscripcinCREByCREMest disminuida en neuronas corticales como consecuencia de la exposicin a LGlu, lo que podra influenciar la supervivenciacelular.

88

Excitotoxicidadinducidaporglutamato
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control) CREB CREM

Resultados

1.0

1.0

** ***

*** **
0.5

0.5

0.0

0.0

ro l

2h

on t

24 h

lu

LG lu

LG

Figura25:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresingnicadelosfactoresdetranscripcinCREByCREM.Neuronascorticales fueronexpuestasaLGlu1Mdurante2o24horas,LGlu100Mdurante2horasosemantuvieronencondicionescontrolconelfinde aislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiemporealserealizaronempleandosondasespecficasparalosgenescodificantesparalos factores de transcripcin CREB y CREM. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 significativamente diferente con respecto al control correspondiente.

d) Tablaresumen. En la siguiente tabla se expone un resumen de los resultados obtenidos tras la exposicin de cultivos primarios de neuronas corticales a glutamato. Todos ellos han sido comentados anteriormente, por lo que ahorasloseexponeelexperimentorealizado,sisehaencontradovariacinonoyenqusentido.

LG lu

10 0

2h

89

Resultados LGlu 1M 2h
Viabildad ARNmcaspasa 3 Bmaxunin L[ H]Glu KDunin L[ H]Glu Protena mGlu1 ARNmmGlu1 Protena mGlu5 ARNmmGlu5 Protena mGlu2,3 ProtenaPLC1 ARNmPLC1 ActividadPLC basal ActividadPLC grupoI ActividadAC basal ActividadAC grupoII ActividadAC grupoIII
3 3

Excitotoxicidadinducidaporglutamato LGlu 1M 24h LGlu 100M 2h LGlu 100M 24h


Bmax unin [ H]DPCPX KD unin L[ H]DPCPX ProtenaA1 Bmax unin [ H]ZM241385 KD unin [ H]ZM241385 ARNmA1 ARNmA2A ARNmA2B Actividad A1/AC Actividad A2A/AC ARNmCREB ARNmCREM
3 3 3 3

LGlu 1M 2h

LGlu 1M 24h

LGlu 100M 2h

LGlu 100M 24h

Tabla 8: Resumen de los resultados obtenidos en neuronas corticales expuestas a LGlu. En esta tabla se exponen grficamente los resultadosnumricosdescritosenestecaptulo.,nohayvariacinestadstica,,seobservaunaumentorespectoalasituacincontrol, ,seobservaunadisminucinrespectoalasituacincontrol.

IV.2.2EnclulasC6degliomaderata. LasclulasC6constituyenunmodeloampliamenteusadoparaelestudiodelaspropiedadesglialesin vitro. En este apartado se completarn estudios realizados por este grupo de investigacin en los que se demostr que la exposicin a LGlu en C6 produca la internalizacin del receptor por medio de vesculas cubiertas (Albasanz y col, 2002). Esta ampliacin consisti en prolongar el tiempo de exposicin a esta

90

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

sustancia con el fin de determinar la modulacin sufrida por los receptores de glutamato y, de forma especfica,algunosdesussubtipos. Por otro lado, el estudio de la exposicin a LGlu se ampli a la modulacin de los receptores de adenosina, recientemente caracterizados en esta lnea celular (Castillo y col, 2007). Estudios previos de este grupo de investigacin demostraban la existencia de transmodulacin entre estos receptores y los de glutamatoencerebroderata(Lenycol,2008),loqueavalabalaampliacindeestosestudiosalosreceptores deadenosinaenclulasC6. a) Viabilidad. El efecto de la exposicin a LGlu 100 M a distintos tiempos sobre la viabilidad celular se midi empleando el reactivo MTT. Los resultados obtenidos exponiendo las clulas C6 a LGlu durante 6, 24 y 48 horassemuestranenlaFigura26.Comoseobserva,laexposicinprolongadadeestasclulasacondiciones queenneuronascorticalesresultarontxicas,noproducealteracionessignificativasenlosvaloresobtenidos delaviabilidadcelularacadatiempoensayado(LGlu100M:6h:95,603,55;24h:102,206,07;48h:95,69 3,13%).
Reduccin MTT (% del control)
120

Figura26:LasclulasC6sonresistentesalaexposicinaLGlu100M.

110

LasclulasC6fueronexpuestasaLGlu100Mdurante6,24o48horas, trascurridas las cuales se midi la viabilidad celular por el mtodo del

100

MTT. Los datos expuestos son las medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por triplicado, expresados

90

porcentualmenteconrespectoalaviabilidaddelasclulascontroles.

80

0 6 24 48

tiempo (h)

EstosresultadosdemuestranquelasclulasC6sonresistentesaexposicionesaglutamatoque,enotros modeloscelulares,resultanenormementetxicas. No obstante, se comprob por PCR a tiempo real si existan variaciones en la expresin gnica de la caspasa3.ComoseexponeenlaFigura27,noseaprecianvariacionesenlaexpresindelacaspasa3,como eradeesperartrascomprobarlaviabilidad.

91

Resultados
Figura27:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresinde caspasa 3. Las clulas C6 fueron expuestas a LGlu 100 M durante 6, 24 o 48 horas o se mantuvieron en condiciones controlconelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRa tiempo real se realizaron empleando una sonda especfica para elgencodificanteparalacaspasa3.Losdatosexpuestossonlas mediasSEMde3experimentosindependientesrealizadospor duplicadoempleandodistintasmuestras.

Excitotoxicidadinducidaporglutamato
1.5

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

1.0

0.5

0.0

tr o

24

b) ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato. Lacuantificacindelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatoserealizmedianteensayosdeunin deradioligando,comosedescribeenMtodos.LosresultadosobtenidosenclulasC6expuestasaLGlu100 Mdurante6,24y48horasseexponenenlaFigura28. A


Bm ax (pmol/mgprot)
400

on

***
Kd (nM)

4000

***

***

300

3000

*** **

200
0 Control 6h 24 h 48 h 100

2000

1000

Control

6h

24 h

48 h

Figura 28: La exposicin a LGlu modula los receptores metabotrpicos en la superficie celular de las clulas C6. Las clulas C6 se expusieron a LGlu 100 M durante 6, 24 o 48 horas. Se realizaron ensayos de unin de radioligando empleando L[ H]Glu. Los datos expuestossonlasmediasSEMde,almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentespases.Los parmetros cinticos calculados, Bmax (panel A) y KD (panel B), se obtuvieron a partir de los resultados experimentales empleando el softwareGraphPadPrism5.0.**p<0,01,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

Comoseaprecia,lamodulacinobservadaenlasclulasC6enfuncindeltiempodeexposicinaLGlu es distinta. En el caso del nmero total de receptores (panel A) a tiempos cortos de exposicin a LGlu se observaundescensosignificativodeun28%(p<0,05).Sinembargo,sieltiempodeexposicinseprolonga,se aprecia que el nmero de receptores aumenta considerablemente, de hecho tras 24 horas de exposicin el nmerodereceptorestotalesaumentaun180%(p<0,001).Silaexposicinseprolongahastalas48horasel

92

48

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

nmerodereceptoressiguesiendomayorqueenlacondicincontrolenun60%(p<0,001)peromenorqueel datoobtenidoalas24horas. Sinosfijamosenlaafinidaddeestosreceptoresporsuligando(panelB)denuevoseapreciaeseefecto bifsico.Mientrasquetras6horasdeexposicinlaafinidaddelosreceptoresporsuligandonovariaba,tras24 y 48 horas de exposicin la afinidad de estos receptores disminua alrededor a 4,5 veces sobre la afinidad detectadaencondicionescontroles(p<0,001enamboscasos). Lacomparacinestadsticadelosdatosobtenidosentrelosdistintostiemposdeexposicinrevelaque, enelcasodelasBmax,todoslosgruposdedatossonestadsticamentediferentesentres(p<0,001entodos), mientrasqueenelcasodelasKD,slolasvariacionesobservadasentrelaafinidaddeestosreceptorestras6y 24ytras24y48horassonestadsticamentediferentes(p<0,001entodos). EstosresultadossugierenquelaexposicinaLGlumodulanotablementelaexpresinproteicadelos receptoresmetabotrpicosdeglutamatoascomolaafinidaddelosmismosdeformadependientedeltiempo deexposicin.Acontinuacinseexponeunresumen(Tabla9)conlosparmetroscinticosobtenidosenestos experimentos. Bmx
(pmol/mg)

Control 133,759,54 707,5944,45

LGlu100M6h 96,824,66** 643,9661,59

LGlu100M24h 374,5015,26*** 3171,99345,03***

LGlu100M48h 214,542,76*** 3592,50268,08***

KD
(nM)

Tabla9:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenclulasC6expuestasaLGlu.Enesta tablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.**p<0,01,***p<0,001significativamente diferenterespectoalcorrespondientecontrol.

El estudio de la regulacin de los receptores metabotrpicos de glutamato como consecuencia de la exposicindelalneaC6aLGluseamplirealizandoensayosdeinmunocitoqumica,enlosque,medianteel empleodeanticuerposespecficosseestudilamodulacindelossubtiposmGlu1,mGlu5ymGlu2,3,anivelde la membrana plasmtica, as como la de la protena PLC1. Micrografas representativas de las imgenes obtenidasseexponenenlaFigura29.Porotrolado,enlaFigura30semuestranlosvaloresobtenidosparala cuantificacindelafluorescenciadelasseriesdeimgenes,ascomodelanlisisestadsticorealizado.

93

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Figura 29: Inmunodeteccin de mGlu y PLC1. Micrografas representativas de los resultados obtenidos tras los experimentos de inmunofluorescenciaalemplearlosanticuerposparamGlu1,mGlu5,mGlu2,3yPLC1enlasdistintascondicionesexperimentales.Labarra representa62m.
500000

Fluorescencia (unidades arbitrarias)

400000

mGlu1 mGlu5 mGlu2,3 PLC 1

Figura 30: La exposicin a LGlu modula los receptores

metabotrpicos en la superficie celular. Diagrama de barras que

300000

*** *** *** *** *** ***


h h C on tr ol h C on tr ol h h C on tr ol h h h h h

resume los resultados expuestos en la Figura se 29. Las

cuantificaciones
200000

realizaron

usando el software LAS AF empleando un mnimo de 30 camposporcondicin.Seexponen las medias SEM obtenidas para cada condicin experimental. *** p<0,001estdsticamentediferente

100000

0
h C on tr ol 6 h 6 6 24 48 24 48 24 48 6 24 48

con respecto al correspondiente control.

94

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

Acontinuacinseexponeunatablaresumenconlasvariacionesobservadasenestosexperimentos. LGlu100M6h LGlu100M24h LGlu100M48h


Tabla10:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenclulasC6expuestasaLGlu.Semuestra elsentidodelavariacinobservadaconrespectoalcontrolmedianteflechas:aumenta;disminuye.***p<0,001significativamente diferenteconrespectoasucorrespondientecontrol.

mGlu1 *** *** ***

mGlu5

mGlu2,3

PLC1 *** *** ***

Comoseobserva,lamodulacindelosreceptoresdeglutamatocomoconsecuenciadelaexposicina su agonista endgeno es especfica de cada subtipo. As, mientras que el subtipo mGlu1 disminuye significativamente sus niveles en la membrana plasmtica en todas las condiciones empleadas, los subtipos mGlu5 y mGlu2,3 no resultan modulados en estas condiciones. Por otro lado la cantidad de la PLC1 tambin disminuyedeformasignificativaentodaslascondicionesensayadas. Estos resultados sugieren que la exposicin a LGlu modula a la baja selectivamente, al menos, el subtipo mGlu1 de los receptores metabotrpicos de glutamato, modulacin que va acompaada de una anlogaenlacantidaddePLC1. Conelfindedeterminarsiloscambiosobservadoseranproducidosporunamodulacindelaexpresin gnicainducidaporlaexposicinaLGluenlasclulasC6,secuantificlacantidaddeARNmcorrespondientea lasprotenasmGlu1yPLC1porPCRatiemporealenlasdistintascondicionesexperimentalesensayadas. ComoseexponeenlaFigura31,laexposicinaLGlunoproducecambiossignificativosenlaexpresin gnicademGlu1,enningunadelassituacionesestudiadas.Sinembargo,paralaexpresingnicadePLC1se apreciaunadisminucinsignificativadelosnivelesdeARNmencomparacinconlasituacincontroltras24 (p<0,05)y48horasdeexposicin(p<0,01).Estasdisminucionessecorrespondenconun8%,un10%yun18% menosenlaexpresingnicapromediodePLC1tras6,24y48horas,respectivamente,deexposicinaLGlu.

95

Resultados
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)
1.5

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

1.0

mGlu1 PLC 1

Figura 31: Efecto de la exposicin a LGlu sobre la expresin gnica de mGlu1 y PLC1. Clulas C6 fueron expuestas a LGlu 100 M durante 6, 24 o 48 horas o se mantuvieron en condicionescontrolconelfindeaislarsuARN.Losexperimentos de RTPCR a tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son

* **

0.5

las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05, ** p<0,01,significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

0.0
C on tr ol h C on tr ol h h h 6 24 48 6 24 h 48 h

Debido a las variaciones en la cantidaddeprotena detectadas por inmunofluorescencia se realiz un estudio ms exhaustivo de la funcionalidad del sistema formado por los receptores metabotrpicos de glutamato del grupo I y la actividad enzimtica principal a la que estn acoplados. Para ello se realizaron ensayosenzimticosdelaactividadPLC.LosresultadosobtenidosseexponenenlaFigura32. EnelpanelAdelamencionadafiguraseobservanlasvariacionesdetectadasenlaactividadbasaldela enzimaPLC.Comoseaprecia,apesardeladisminucindetectadaenlaisoforma1,porinmunofluorescenciay PCR,noseobservanvariacionessignificativasenlaactividadbasaldeestaenzimatraslaexposicindelalnea celular C6 a LGlu (Control: 7,39 0,35; LGlu 100 M: 6h: 6,47 0,36; 24h: 6,57 0,24; 48h: 9,53 1,41 pmol/mgmin). A
Actividad PLC basal (pmol/mgmin) Actividad PLC (% del basal)

B
L-Glu 100 M 160 DHPG 100 M

10

140

120

0
l h h h tr o 24 48 6 on

100
l h l h h h tr o tr o 6 24 48 6 24 C on C on 48 h h

Figura32:LaexposicinaLGlunovaralaactividadPLC.ClulasC6fueronexpuestasonoaLGlu100Mdurante6,24y48horasantes derealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeIP3.SeestudielefectodelaexposicinaLGlutamatosobrelaactividadPLC basal (panel A), as como su efecto sobre la funcionalidad del sistema estimulado por LGlu o DHPG 100 M de los receptores metabotrpicosdeglutamato(panelB).LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde,almenos,3experimentosindependientesrealizados por duplicado empleando distintos pases. Todas las estimulaciones con LGlu o DHPG resultaron estadsticamente significativas con respectoalbasal(almenos,p<0,05).

96

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

En el panel B se expone la capacidad del propio LGlu y del (S)DHPG de estimular la hidrlisis de fosfatidilinositoles.Comoseobserva,noseapreciandiferenciassignificativasenlacapacidaddecadaunode ellosdeestimularlaactividadPLCatravsdelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIcomoconsecuenciade laexposicindelasclulasC6aLGlu100M(LGlu%basal:Control:130,595,72;LGlu100M:6h:28,32 5,74;24h:128,67 5,54; 48h: 122,56 5,88%;(S)DHPG % basal: Control: 134,95 6,57; LGlu100 M: 6h: 133,01 2,44; 24h: 144,27 12,84; 48h: 136,84 5,64%). Cabe destacar que todos los datos obtenidos son estadsticamentediferentesdelcorrespondientevalorbasal(almenosp<0,05). Estos resultados apuntan a que, a pesar de las variaciones observadas en el receptor mGlu1 en membranaplasmticayenlacantidadtotaldelaisoformaPLC1,lacapacidaddeestimulacindelaactividad PLCempleandoligandosdelgrupoInoresultaalteradaenestascondiciones,esdecir,ladisminucinenmGlu1 y PLC1 no es suficiente para disminuir la funcionalidad del sistema, lo que implica que la presencia del receptormGlu5debeserdeterminanteparasta. Por ltimo, se examin la influencia de la exposicin a LGlu sobre la actividad adenilato ciclasa dependientedelosreceptoresmetabotrpicosdelosgruposIIyIII.ComoseexponeenlaFigura33,panelA,la actividadbasaldeestaenzimanoresultamoduladacomoconsecuenciadelaexposicinaLGlu(Control:1,18 0,05;LGlu100M:6h:1,160,23;24h:0,760,25;48h:1,010,08pmol/mgmin). A
Actividad AC basal (pmol/mgmin)
1.5 100 1.0

B
125 (2R,4R)-APDC 100 M L-AP4 100 M

Actividad AC (% del basal)


on tr ol h h h

75 50 25

0.5

0.0

on tr ol

on tr ol

48

24

24

48

24

Figura33:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaactividadAC.ClulasC6fueronexpuestasonoaLGlu100Mdurante6,24y48horas antes de realizar los ensayos enzimticos para la acumulacin de AMPc. Se estudi el efecto de la exposicin a LGlutamato sobre la actividadACbasal(panelA),ascomosuefectosobrelafuncionalidaddelsistemainhibidoporunagonistadelgrupoIIdelosreceptores metabotrpicosdeglutamato,(2R,4R)APDC,yporunagonistadelgrupoIII,LAP4(panelB).LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde, almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintospases.

EnelpanelB,seaprecialacapacidaddeinhibirlaactividadACbasalde(2R,4R)APDC,agonistadelos receptores del grupo II, y LAP4, agonista de los receptores del grupo III. En el caso de los receptores metabotrpicos del grupo II se observa que el promedio de inhibicin de la AC es similar en todas las

48

97

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

situacionesestudiadas(%basal:Control:59,8330,63;LGlu100M:6h:57,8613,78;24h:49,0615,11; 48h:56,2112,49%).Sinembargo,enlosdatosobtenidosempleandoLAP4,seobservaunaciertatendencia, nosignificativa,enlaqueaparentementeseapreciaunainhibicinmayordeestaenzimasegnseprolongael tratamientoeneltiempo(%basal:Control:67,633,91;LGlu100M:6h:59,302,57;24h:44,9417,22; 48h:48,596,65%). Enresumen,laactividadACbasalnoresultamoduladadeformasignificativaporlaexposicinaLGlu, sin embargo se aprecia una cierta tendencia de los receptores del grupo III de clulas expuestas a LGlu a inhibirenmayormedidaestaactividadenzimtica. c) Receptoresdeadenosina.

Aligualqueenneuronascorticales,losprocesosdetransmodulacinqueejercalaexposicinaLGlu encultivosobrelosreceptoresdeadenosinaseestudiaroncondetalleenlasclulasC6degliomaderata. ParaestudiarelefectodedichaexposicinsobrelosreceptoresA1deadenosinaaniveldelamembrana plasmtica en esta lnea celular se emple la tcnica de unin de radioligando, usando [3H]DPCPX como antagonistaespecficodelreceptorA1yCPAfroparacalcularlaunininespecfica.Losresultadossemuestran enlaFigura34. A 1.5
Bm ax (pmol/mg prot)

B
25

KD (nM)

1.0

***

***

20 15 10 5 0

0.5 0.0
l 6h 48 h 24 h tr o M C on 0

6h

24 h

10

10 0

C on

10 0

10 0

lu

G lu

LG lu

LG lu

Figura34:LaexposicinaLGlumodulalosreceptoresA1enlasuperficiecelulardelasclulasC6.LasclulasC6seexpusieronaLGlu 100 M durante 6, 24 o 48 horas. Se realizaron ensayos de unin de radioligando empleando [ H]DPCPX. Los datos expuestos son las medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes pases. Los parmetros cinticoscalculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPad Prism5.0.*p<0,05,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol;xxp<0,01significativamentediferenteconrespectoa las6horasdeexposicin;p<0,05significativamentediferenteconrespectoalas24horasdeexposicin.
3

98

LG lu

LG lu

L-

L-

10 0

10 0

48 h

tr o

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

Como se observa en la mencionada figura, panel A, la exposicin a LGlu 100 M a distintos tiempos tambin ejerce un efecto sobre el nmero de receptores A1 existentes en la superficie de estas clulas. En concreto,dichaexposicinaumentasignificativamenteelnmerodereceptoresA1enlamembranaplasmtica delasclulasC6degliomaderata,observndosealas6horasdeexposicinunaumentodel34%,alas24 horasunaumentodel53%yalas48horasdeexposicinunaumentodel76%conrespectoalcontrol(Control: 0,5580,030;LGlu100M6h:0,7500,059,p<0,05;LGlu100M24h:0,8540,032,p<0,001;LGlu100 M48h:0,9860,045pmol/mg,p<0,001).Losresultadosobtenidosdemuestranque,adems,esteaumento delnmerodereceptoresesprogresivo,esdecir,cuantomsprolongadoeseltiempodetratamientomayor eselefectoqueejerceelLGlusobrelosreceptoresA1,siendosignificativaslasdiferenciasentreelefectodela exposicinaLGlu100Mdurante6horasy48horas(p<0,01)ydurante24horasy48horas(p<0,05). Los resultados obtenidos para el anlisis de la afinidad se exponen en el panel B de la misma Figura. ComosepuedeobservarlaexposicinaLGlunoproducavariacionessignificativasenlaafinidadobtenidaen estosexperimentosconrespectoalacontrol(Control:17,751,15;LGlu100M6h:20,321,53;LGlu100 M24h:21,684,31;LGlu100M48h:22,111,69nM). Posteriormente se estudi si la exposicin prolongada a LGlu tambin modulaba la expresin de los receptoresA2Adeadenosina,paraelloseempleelensayodeuninderadioligandos,usandoelantagonista especficodeA2A[3H]ZM241385comoligandotritiado.LosresultadossemuestranenlaFigura35. A
Bm ax (pmol / mgprot)
0.4

*** ***
KD (nM)

20

0.3 0.2
0.1

***

15

10

6h

C on tr ol

C on tr ol

6h

24

48

24

10

10

10

10

lu

lu

lu

lu

lu

LG

Figura35:LaexposicinaLGlumodulalosreceptoresA2AenlasuperficiecelulardelasclulasC6.LasclulasC6seexpusieronaLGlu 100Mdurante6,24o48horas.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]ZM241385.Losdatosexpuestossonlas medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes pases. Los parmetros cinticoscalculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPad Prism 5.0. *** p<0,001 significativamente diferente con respecto al control; xx p<0,01 significativamente diferente con respecto a las 6 horasdeexposicin.
3

LG

LG

LG

LG

LG

lu

10

10

48

0.0

99

Resultados

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Como se observa en la Figura 35, panel A, la exposicin a LGlu ejerca sobre el nmero total de receptoresA2AelefectocontrarioqueeldescritoparaelreceptorA1,esdecir,enestecasoelLGludisminuala densidad de los receptores A2A en la superficie celular, siendo esta disminucin de un 33% a las 6 horas de exposicin,un52%alas24horasyun49%alas48horasconrespectoalnmerodereceptoresenlasituacin control(Control:0,3860,012;LGlu100M6h:0,2570,011,p<0,001;LGlu100M24h:0,1860,005, p<0,001;LGlu100M48h:0,1980,021pmol/mg,p<0,001).Demanerasimilaraloqueocurraenelcasodel receptorA1,paraelreceptorA2AelefectodelaexposicinaLGlutambinesgradualhastalas24horasde exposicin,siendosignificativaslasdiferenciasentrelosdatosobtenidosalas6horasdeexposicinyalas24 horas (p<0,01) aunque estando la diferencia entre los datos obtenidos a las 6 y a las 48 horas cercana a la significatividad(p=0,068).Porotroladonoseobservandiferenciassignificativasentrelosresultadosobtenidos a24ya48horasdeexposicinaLGlu. En el panel B se pueden comprobar los resultados obtenidos para el anlisis de la afinidad en estos mismosexperimentos.Comoseobserva,laexposicinaLGlunoejercacambiossignificativosenlaafinidad deestosreceptoresA2Aporsuligando,sinembargoseobservaunaciertatendenciahaciavaloresmsbajosde KDsegnseprolongalaexposicinaesteagente(Control:18,012,99;LGlu100M6h:17,020,97;LGlu 100M24h:13,752,69;LGlu100M48h:13,411,61nM). Todosestosresultados,tomadosenconjunto,apuntanaquelaexposicinaLGlu100MenclulasC6 degliomaderata,yaseaatiemposcortosolargos,produceefectosantagnicossobrelosreceptoresA1yA2A deadenosina.Sobrelosprimeros,elLGluinduceunaumentogradualdelosmismossinvariarlaafinidadde estosporsuligando,mientrasquesobrelossegundosinduceunadisminucinmuymarcadadelosmismossin afectartampocoasuafinidad.Sinembargoestaexposicintienesuefectomximoalas24horasysuefecto sobre los receptores A2A, al contrario de lo que ocurra con los receptores A1, no aumenta si se prolonga el tiempodeexposicinaLGluhastalas48horas. UnavezanalizadoelefectodelaexposicinaLGluenlasclulasC6aniveldelamembranaplasmtica, se procedi a comprobar si exista algn efecto sobre la expresin de los genes que codifican para los receptoresdeadenosina.ParaelloserealizaronensayosdePCRatiemporealempleandosondasespecficas paralos4receptoresdeadenosinadescritoshastalafechayelgendelaactinacomocontrolinterno. ComoseobservaenlaFigura36,panelA,laexposicinaLGluenestasclulasnoproducevariaciones significativasenlaexpresindelosgenesquecodificanparalosreceptoresA1yA2B.Sinembargo,talycomose muestraenelpanelB,paralosgenescorrespondientesalosreceptoresA2AyA3sseobservabanvariaciones significativasatodoslostiemposdeexposicinaLGlu.Deestemodo,paraelgenquecodificaparaelreceptor A2Aseobservunadisminucindrsticadelaexpresindelmismopero,alcontrariodeloqueocurraenel ensayo de unin de radioligando, esta disminucin no estaba relacionada con el tiempo de exposicin al aminocido(Control:1,000,11;LGlu100M6h:0,430,14,p<0,05;LGlu100M24h:0,520,05,p<0,05; LGlu100M48h:0,340,07,p<0,01).EnelcasodelgenquecodificaparaelreceptorA3,elefectoproducido porlaexposicinaLGlu100Merasimilaralobservadoenelcasoanteriorperoladisminucinenestecaso

100

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

esmenosdrsticaaunqueigualmentesignificativa(Control:1,000,03;LGlu100M6h:0,780,03,p<0,01; LGlu100M24h:0,610,07,p<0,05;LGlu100M48h:0,640,06,p<0,01). A
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

B
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)
1.00

1.0

**
0.75

* ** * * **

0.50

0.5

0.25

0.0

24 48

24 48

0.00

24 48

24 48

A1R

A2BR

A2AR

A3R

Horas de exposicin a L-Glu 100 M

Horas de exposicin a L-Glu 100 M

Figura36:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresingnicadelosreceptoresdeadenosina.ClulasC6fueronexpuestasaLGlu 100 M durante 6, 24 o 48 horas o se mantuvieron en condiciones control con el fin de aislar su ARN. Los experimentos de RTPCR a tiemporealserealizaronempleandosondasespecficasparalosgenesmostrados.LaexposicinaLGlunoafectaalaexpresindeA1yA2B (panel A), aunque disminuye la de A2A y A3 (panel B). Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizadosporduplicadoempleandodistintasmuestras.*p<0,05,**p<0,01,significativamentediferenteconrespectoasucontrol.

Estosresultadosindicanquemientrasqueelglutamatoejerceunefectoaniveldelaregulacindela expresingnicaparaelreceptorA2A,observndosedisminucionesenlaexpresindeestegenaligualquese observaronenelensayodeuninderadioligando,enelcasodelreceptorA1losaumentosaniveldeprotena descritos con anterioridad no se deben a variaciones de la expresin del correspondiente gen, sino a mecanismosposttranscripcionales. Adems, se comprob el efecto que ejerca la exposicin prolongada a LGlu 100 M sobre las vas principalesdetransduccindesealesdelosreceptoresestudiados,estoes,lainhibicindelaactividadACpor partedelreceptorA1ylaactivacindelamismaactividadenzimticaporpartedelreceptorA2A.Paraellose midilacantidaddeAMPcformadocuandoestasclulas,previamenteexpuestasonoaLGlu100Mdurante losdistintostiempos,seenfrentabanalosagonistasespecficosdelosreceptoresA1yA2A. Como se observa en la Figura 37, panel A, la capacidad del ligando CHA de inhibir la actividad AC previamenteestimuladaconforskolinaaumentabadeformasignificativaenlasclulasC6traslaexposicinde lasmismasaLGludurante24y48horas,correspondindosestaconun13%yun31%deincrementoenla capacidadinhibidoraconrespectoalasituacincontrol.Sinembargo,laexposicinaLGlu100Mdurante6 horasnoproducaefectoalgunoenlacapacidadinhibidoradelCHAsobreelsistemadescrito(Control:47,58 0,99;LGlu100M6h:38,424,62;LGlu100M24h:53,740,83,p<0,05;LGlu100M48h:62,242,12%, p<0,05).

101

Resultados A
Actividad AC inhibida por CHA (% de Forsk)
75

Excitotoxicidadinducidaporglutamato B
Actividad AC estimulada por CGS 21680 (% del basal)

* *
50

200

150

**

**

100

25

50

ol

ol

tr

24

48

on

C on

24

10 0

10 0

10 0

10 0

G lu

LG lu

G lu

G lu

10 0

L-

L-

G lu

Figura37:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaactividadAC.ClulasC6fueronexpuestasonoaLGlu100Mdurante6,24o48horas antes de realizar los ensayos enzimticos para la acumulacin de AMPc. Se estudi el efecto de la exposicin a LGlutamato sobre la inhibicin de la actividad AC por el receptor A1 (panel A), empleando el agonista especfico CHA a 100 M para inhibir la actividad estimuladaporforskolina5M.TambinsecomprobelefectoenlaestimulacindelaactividadACpromovidaporelreceptorA2A(panel B),paralocualseempleelagonistaespecficoCGS21680a1M.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde,almenos,3experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos cultivos. * p<0,05, ** p<0,01 significativamente diferente con su correspondiente control. Actividad AC Basal: Control: 7,39 0,35; L Glu 100 M: 6h: 6,47 0,36; 24h: 6,57 0,24; 48h: 9,53 1,41 pmol/mgmin.

Porltimo,comoseobservaenelpanelBdelamismaFigura,laexposicinaLGlu,yaseaatiempos cortosoprolongados,disminuyelacapacidaddelCGS21680paraestimularelsistemaACenun32%,un28%y un36%enlasexposicionesaLGlua6,24y48horasdeexposicin,respectivamente(Control:196,334,53; LGlu100M6h:132,923,47,p<0,01;LGlu100M24h:142,119,05,p<0,05;LGlu100M48h:125,96 2,30%,p<0,01). Estosresultadosindicanqueelprincipalsistemadetransduccinalqueestnacopladoslosreceptores A1yA2AenclulasC6resultaafectadocomoconsecuenciadelaexposicindeestasclulasaLGlu100M, observndoseunapotenciacindelavainhibidoramediadaporelreceptorA1yunadesensibilizacindelava estimuladoramediadaporA2A. De forma adicional se estudi el efecto que ejerca la exposicin a LGlu sobre dos factores de transcripcin constitutivos relacionados con el AMPc, los factores CREB y CREM. As, se estudi por PCR a tiemporealsilaexpresingnicadeestosfactoresresultabamoduladaenestosexperimentos.Losresultados obtenidosseexponenenlaFigura38 Comoseobserva,slotras48horasdeexposicinaLGlu100Msemodulabalaexpresindeestos factoresdetranscripcindeformasignificativa.Enamboscasossedetectunadisminucindelacantidadde ARNm con respecto a la situacin control. En el caso de CREB se cuantific una disminucin de la expresin

102

L-

L-

G lu

L-

10 0

48

tr

Excitotoxicidadinducidaporglutamato

Resultados

gnicadeun10%(p<0,05),enelcasodeCREMestadisminucinfuemsacusadayllegabahastael20%con respectoasuexpresinbasal(p<0,05). Dado que la expresin de ambos factores es constitutiva y su eliminacin produce un fenotipo embrionarioletal,podramospostularque,apesardequelasclulasC6sonresistentesaldaoexcitotxico inducidoporglutamato,siseprolongaralosuficienteeltiempodeexposicinaestamismaconcentracinde glutamatopodramosllegaradesencadenarprocesosdemuerteneuronal.
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control) CREB CREM
1.00
Figura38:EfectodelaexposicinaLGlusobrelaexpresingnica de los factores CREB y CREM. Clulas C6 fueron expuestas a LGlu

* *

1.00 100 M durante 6, 24 o 48 horas o se mantuvieron en condiciones


control con el fin de aislar su ARN. Los experimentos de RTPCR a tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los genes codificantes para los factores de transcripcin CREB y CREM.

0.75

0.75 Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos


independientes realizados por duplicado empleando distintas

0.5 0.0
C on L- tro G l L- lu 6 G lu h L- 24 G lu h 48 h C on L- tro G l L- lu 6 G lu h L- 24 G lu h 48 h

0.5 0.0

muestras. * p<0,05 significativamente diferente con respecto al control.

d) Tablaresumen. Un resumen de los datos obtenidos en los experimentos descritos en este captulo se expone en la siguiente tabla (Tabla 11). En la misma, slo se muestra si se han observado variaciones en los parmetros medidos con respecto a la situacin control y en qu sentido se producen las mismas, ya que los datos numricoshansidoaportadosconanterioridad.

103

Resultados LGlu 100M 6h


Viabildad ARNm caspasa3 Bmaxunin L[ H]Glu KDunin L[ H]Glu Protena mGlu1 ARNmmGlu1 Protena mGlu5 Protena mGlu2,3 Protena PLC1 ARNmPLC1 ActividadPLC basal ActividadPLC grupoI ActividadAC basal ActividadAC grupoII ActividadAC grupoIII
3 3

Excitotoxicidadinducidaporglutamato LGlu 100M 24h LGlu 100M 48h


Bmax unin [ H]DPCPX KD unin [ H]DPCPX Bmax unin [ H]ZM241385 KD unin [ H]ZM241385 ARNmA1 ARNmA2A ARNmA2B
3 3 3 3

LGlu 100M 6h

LGlu 100M 24h

LGlu 100M 48h

ARNmA3

ActividadA1/AC Actividad A2A/AC ARNmCREB ARNmCREM

Tabla 11: Resumen de los resultados obtenidos en clulas C6 expuestas a LGlu. En esta tabla se exponen grficamente los resultados numricosdescritosenestecaptulo.,nohayvariacinestadstica,,seobservaunaumentoconrespectoalasituacincontrol,,se observaunadisminucinconrespectoalasituacincontrol.

IV.3EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC. IV.3.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza. Dadalapropuestadealgunosautoresdequeeldaocelularocurridoanteunabajadadeoxgenose podraproducircomoconsecuenciadelaliberacindeglutamatoysuaumentoanivelesexcitotxicos,resulta

104

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Resultados

interesanteconocerculesseranlosefectosdelahipoxiaantesdequeestoocurra,conelfindepoderdefinir conclaridadunmodelodedaocelularporhipoxiaqueluegopodraservirdecampodepruebasdeligandos destinadosaatenuaresedao.Estoresultatambinpatenteenelsistemadelosreceptoresmetabotrpicos de glutamato, en el que los experimentos realizados hasta la fecha no arrojan luz sobre el posible papel neuroprotectoronoquepuedandesarrollarestafamiliadereceptoresacopladosaprotenasG,especialmente losincluidosenelgrupoI. Para ello se estableci unas condiciones de hipoxia moderada, consistentes en la disminucin de la presinparcialdeoxgenohastaunvalordeun5%,valorenelque,segnlosdatosbibliogrficosdisponibles, empiezanaapreciarselosefectosdelahipoxiaproducidosporelprincipalfactordetranscripcinencargadode mediar sus efectos: el factor inducible por hipoxia 1 (HIF1). En estas condiciones se realizaron, sobre cultivosprimariosdeneuronascorticalesdecerebroderata,ensayosdeuninderadioligandos,ensayosde viabilidad,PCRatiemporeal,inmunofluorescenciayensayosdeactividadenzimticaconelfindecaracterizar lomejorposibleloscambiosquetuvieranlugarenestascondiciones. a) Viabilidad. Elprimerpasoconsistiencomprobarelefectoejercidoporlaexposicindeneuronascorticalesala hipoxiamoderadaenlamodulacindelaexpresindelgendelacaspasa3,protenadondeconvergenlasvas apoptticasdemuertecelular. ComosemuestraenlaFigura39,losensayosdePCRatiemporealrealizadosmuestranqueseproduce un incremento de la expresin gnica de caspasa 3 a los distintos tiempos ensayados. Este incremento, no obstante,sloresultaestadsticamentesignificativotras24horasdeexposicinahipoxiamoderada(p<0,05), momentoenelquelaexpresinaumentaun29%sobrelaexpresinbasal.Porotrolado,esdestacablequeel incremento de expresin observado tras 6 horas de exposicin, de un 26%, estuvo cerca de resultar estadsticamentesignificativo(p=0,051).
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)
1.5
Figura 39: Efecto de la hipoxia moderada sobre la expresin de

caspasa3.Neuronascorticalesfueronexpuestasahipoxiamoderada durante 2, 6 o 24 horas o se mantuvieron en condiciones control

1.0

(normoxia)conelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRa tiemporealserealizaronempleandounasondaespecficaparaelgen codificante para la caspasa 3. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado

0.5

empleandodistintasmuestras.*p<0,05significativamentediferente conrespectoalcontrol.

0.0
2

C on tr ol

5%

5%

5%

24 h

2h

6h

105

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Unavezcomprobadoelincrementodelaexpresingnicadecaspasa3,seprocediaestudiarsieste aumento se reflejaba en la viabilidad del cultivo primario sometido a bajas presiones parciales de oxgeno durante24horas.ParaelloseempleelensayobasadoenMTTylosresultadosobtenidosseexponenenla Figura40.
100

Viabilidad (% respecto al control)

80 60 40 20 0

**

Figura 40: La exposicin a hipoxia moderada disminuye la viabilidad celular. Neuronas corticales se expusieron a 5% O2 durante24horas.Transcurridoestetiemposemidilaviabilidad celularmedianteeltestbasadoenMTT.Losdatosexpuestosson lasmediasSEMde,almenos,3experimentosindependientes realizados por triplicado, expresados porcentualmente con respecto a la viabilidad de las clulas controles. ** p<0,01 significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

24 h

tr ol

on

ComoseobservaenlamencionadaFigura,tras24horasdeexposicinahipoxiamoderadaseaprecian procesosdemuertecelularenlasneuronascorticalesinvitro.Estadisminucinenlaviabilidadcelularesdeun 18%, comparada con neuronas corticales mantenidas en normoxia, y resulta estadsticamente significativa (p<0,01). Porltimo,paracomprobarsilamuertecelularocurrapormecanismosapoptticos,comosugerael aumentodelaexpresingnicadelacaspasa3,seprocediaevaluarlamorfologacelulardelasneuronas corticalessometidasabajaspresionesparcialesdeoxgenoyneuronascorticalesmantenidasencondiciones normxicas. Los resultados obtenidos se exponen en la Figura 41, en la que se muestra que la exposicin a hipoxiamoderadadurante24horasfomentalaaparicindecuerposapoptticos,marcadorcaractersticode clulas apoptticas (% clulas apoptticas: Control: 10,50 1,22; 5% O2 24h: 31,53 3,52%, p<0,001). Si se calcula la disminucin real en la viabilidad en este experimento, entendiendo que todas las clulas que no presentancuerposapoptticossonviables,seobtieneporestemtodounadisminucinenlaviabilidaddeun 24% con respecto a la situacin control, lo que se encuentra en el rango de los resultados obtenidos empleando el test basado en MTT. En la parte superior de la misma figura se muestran dos imgenes en aumentodencleosnormales(izquierda)ycuerposapoptticos(derecha).

106

5%

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC
Figura 41: La exposicin a hipoxia moderada desencadena procesosapopticos.Neuronascorticalesseexpusierona5%O2 durante 24 horas o se crecieron en condiciones normxicas. Transcurrido este tiempo las clulas se fijaron y se realiz una tincindelacromatinaconHoechst.Losdatosexpuestossonlas medias SEM de 2 experimentos independientes en los que se contaron una media de 10 campos (20X) por condicin, expresados porcentualmente con respecto a la cantidad de clulas apoptticas observadas por campo. *** p<0,001 significativamentediferenteconrespectoalcontrol.Enelpanel superior se exponen dos muestras de ncleos normales (izquierda)yncleosapoptticos(derecha).

Resultados
100

% clulas apoptticas/campo

80

60

40

***

20

0
C on tr ol
2

Tomados en conjunto, estos resultados apuntan a que las neuronas corticales son sensibles a la disminucin,aunqueseamoderada,enlapresinparcialdeoxgeno,desencadenndoseprocesosdemuerte celularporapoptosis. b) Receptoresmetabotrpicosdeglutamato. La variacin del nmero total de receptores metabotrpicos de glutamato se midi empleando L[ H]Glu, tal y como se describe en Mtodos. Los resultados obtenidos en neuronas corticales sometidas a hipoxiamoderadasemuestranenlaFigura42yunresumenseexponeacontinuacinenlaTabla12. Como se observa en la Figura 42, panel A, la exposicin de neuronas corticales a hipoxia moderada produce un incremento gradual del nmero de receptores metabotrpicos de glutamato en la superficie celular.As,seencontraronaumentosenelnmerodereceptoresdeun34%tras2horas,95%tras6horasy deun154%despusde24horasdeexposicinahipoxiamoderada.Deestasvariacionesslolasencontradasa las 6 horas (p<0,001) y a las 24 horas (p<0,05) resultaron ser significativas con respecto a las niveles de receptoresdetectadosenlasituacincontrol,mientrasquetras2horasdeexposicinnolofueron(p=0,180). Por otro lado, al comparar los valores obtenidos a cada uno de los tiempos de exposicin entre s se determinquelasdiferenciasentreelnmerodereceptorescuantificadostras2y6horasdeexposicineran estadsticamentesignificativos(p<0,05)yquelosgruposdedatosobtenidostras2y24horasestabancercade serlo(p=0,133). Estos resultados sugieren que el efecto de la hipoxia moderada sobre el nmero de receptores metabotrpicos de glutamato es gradual y depende del tiempo que se sometan las neuronas corticales a la bajapresinparcialdeoxgeno,cumplindosedentrodelrangodetiemposestudiadosque,amayortiempode exposicinmayorincrementoenelnmerototaldereceptoresmetabotrpicos.
3

5%

24 h

107

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

En lo que se refiere a la afinidad de los receptores, presentada en el panel B de la misma figura, se observaquelahipoxiamoderadanoafectaalaafinidaddelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatoporsu ligando. A
Bm ax (pmol/mgprot)

2000

B
4000

1500

***

3000

1000

KD (nM)

2000

500

1000

ol

24 h

6h

ol

on

on

5%

Figura 42: La exposicin a hipoxia moderada modula los receptores metabotrpicos en la superficie celular. Neuronas corticales se expusieronahipoxiamoderadadurante2,6o24horas.SerealizaronensayosdeuninderadioligandoempleandoL[ H]Glu.Losdatos expuestossonlasmediasSEMde,almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentescultivos.Los parmetros cinticos calculados, Bmax (panel A) y KD (panel B), se obtuvieron a partir de los resultados experimentales empleando el software GraphPad Prism 5.0. * p<0,05, *** p<0,001 significativamente diferente con respecto al control; p<0,05 significativamente diferenteconrespectoalas2horasdeexposicin.
3

Bmx(pmol/mg) KD(nM)
Tabla 12: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de radioligandos en neuronas corticales expuestas a hipoxiamoderda.Enestatablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.*p<0,05,*** p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcorrespondiente control; p<0,05 significativamentediferenteconrespectoalas2 horasdeexposicin.
a

Control 577,2329,41 3117,9768,73

5%O22h 776,21132,03 2672,46649,11

5%O26h 1128,2446,89***a 2767,07821,50

1464,06360,88* 2744,71558,96

Conelfindecomprobarsilaregulacindelosreceptoresmetabotrpicosafectabaenmayoromenor medida a los distintos subtipos del receptor, se emplearon los anticuerpos especficos disponibles contra los receptores mGlu1, mGlu5 y mGlu2,3 en ensayos inmunocitoqumicos, como se ha expuesto en Mtodos. Adems, se analiz tambin el efecto de la hipoxia moderada sobre la cantidad de protena PLC1, primera enzima de la ruta de transduccin de seales activada por el grupo I de receptores metabotrpicos de

108

5%

5%

5%

5%

5%

5%O224h

24 h

2h

tr

tr

2h

6h

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Resultados

glutamato.Dadoquelamayordiferenciaobservadaenelnmerodereceptoresseencontrabatras24horas deexposicinahipoxia,seeligiestetiempopararealizarlosensayosdeinmunofluorescencia.Losresultados obtenidosseexponenenlaFigura43. A B


Fluorescencia (unidades arbitrarias)
500000

400000

mGlu1 mGlu5 mGlu2,3 PLC 1

* ***

300000

200000

***

**

100000

C on tr ol 5% O 2 2 4h

Figura 43: Inmunodeteccin de mGlu y PLC1 tras la exposicin a hipoxia moderada. Panel A. Micrografas representativas de los resultadosobtenidostraslosexperimentosdeinmunofluorescenciaalemplearlosanticuerposparamGlu1,mGlu5,mGlu2,3yPLC1enlas distintascondicionesexperimentales.Labarrarepresenta62m.PanelB.Diagramadebarrasqueresumelosresultadosexpuestosenel panelA.LascuantificacionesserealizaronusandoelsoftwareLASAFempleandounmnimode30camposporcondicinexperimental.Se exponenlasmediasSEMobtenidasparacadacondicinexperimental.*p<0,05,**p<0,01,***p<0,001significativamentediferentecon respectoalcontrol.

C on tr ol 5% O 2 2 4h

C on tr ol 5% O 2 2 4h

C on tr ol 5% O 2 2 4h

109

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Unresumendelosresultadosobtenidostraslacuantificacinyelanlisisestadsticodelasimgenes obtenidasseexponeenlatablasiguiente. 5%O224h


Tabla13:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenneuronascorticalesexpuestasahipoxia moderada.Semuestraelsentidodelavariacinobservadaconrespectoalcontrolmedianteflechas:aumenta;disminuye.*p<0,05, **p<0,01,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

mGlu1 ***

mGlu5 **

mGlu2,3 ***

PLC1 *

ComoseapreciaenlaTabla13,engeneral,ladisminucinenlapresinparcialdeoxgenoproduceun aumentosignificativodecadaunodelossubtiposdereceptormetabotrpicosestudiados.Porelcontrario,el estudio de la cantidad total de protena PLC1 demuestra que durante la exposicin a hipoxia ocurre una disminucinenlacantidadtotaldeprotena. Conelfindeobservarsilasdiferenciasobservadaseranproductodevariacionesenlaexpresingnica como consecuencia de la exposicin a bajas presiones parciales de oxgeno, se realizaron ensayos de PCR a tiempo real empleando sondas especficas para los genes codificantes para mGlu1, mGlu5 y PLC1. Los resultados obtenidos en estos ensayos, que se exponen en la Figura 44, demuestran que, de los genes estudiados, el nico regulado como consecuencia de la exposicin a hipoxia moderada es el gen codificante paramGlu1que,adems,varaensentidocontrarioacomolohacenlosnivelesdeprotena.Deestemodo,se detectarondisminucionesdeun56%trasdoshorasdeexposicin,deun64%tras6horasydeun50%tras24 horas,todasellasestadsticamentesignificativas(p<0,001). Estos resultados demuestran que la hipoxia moderada modula de manera especfica la expresin del genmGlu1,sinafectaralosnivelesdeARNmdemGlu5nidePLC1. Debidoalasdiferenciasobservadasenlosexperimentosdeinmunocitoqumicayalarelacinexistente entrelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIylaactividadPLC,serealizaronensayosenzimticosdedicha actividadencondicionesdeprivacinparcialdeoxgeno.EnlaFigura45semuestralainfluenciadelahipoxia moderada sobre la actividad PLC basal en neuronas corticales, observndose que no existen diferencias significativas entre las condiciones comparadas (p=0,295) (Control: 26,81 7,27; 5% O2 24h: 36,32 3,10 pmol/mgmin).

110

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control) mGluR1 mGluR5 PLC 1
1.0

Resultados

0.5

***

*** ***

0.0

C on tr 5% ol O 2 5% 2h O 5% 2 6h O 2 2 4h

C on tr 5% ol O 2 2 h 5% O 5% 2 6h O 2 2 4h

Figura44:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaexpresingnicademGlu1,mGlu5yPLC1.Neuronascorticalesfueron expuestasa5%O2durante2,6o24horasosemantuvieronencondicionescontrolconelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCR a tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. *** p<0,001, significativamente diferente con respectoalcontrol.


Figura45:Laexposicinahipoxiamoderadanoafectalaactividad PLC basal. Neuronas corticales fueron expuestas o no a 5% O2 durante 24 horas antes de realizar los ensayos enzimticos para la acumulacindeIP3basal.LosdatosexpuestossonlasmediasSEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicadoempleandodistintoscultivos.

50

Actividad PLC basal (pmol/mgmin)

40

30

20

10

0
C on tr ol O 5%
2

Por otro lado,se estudi tambin lacapacidad de los receptores delgrupo Ide estimular la actividad PLC,empleando(S)DHPGcomoagonistaespecficodeestegrupo.ComoseapreciaenlaFigura46,enambas situaciones(S)DHPGescapazdeestimularlaactividadPLCdeformasignificativaporencimadelvalorbasal(al menosp<0,01),aunquenoexistendiferenciassignificativasenlaestimulacinobservadaentreambosgrupos (Control:138,421,26;5%O224h:132,753,97%delbasal). EnlamismafiguraseapreciaelefectobloqueantedelosantagonistasespecficosdelossubtiposmGlu1 ymGlu5.TantoenelcasodelJNJ16259685(antagonistamGlu1)comoeneldelMPEP(antagonistamGlu5)se

24 h

C on tr 5% ol O 2 2 h 5% O 5% 2 6h O 2 2 4h

111

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

observa una reduccin considerable sobre las estimulaciones por (S)DHPG, sin embargo no se aprecian variacionessignificativasencuantoalacapacidaddecadaunodeellosdeactuarsobresuscorrespondientes dianas. Los resultados aqu expuestos no permiten afirmar que en neuronas corticales de cerebro de rata el sistemadelaPLCseencuentrealteradocomoconsecuenciadelaexposicinapresionesparcialesdeoxgeno bajas,apesardehaberdetectadocambiosaniveldelacantidaddeprotenadealgunosdesuscomponentes.
140 160

***

Control 5% O2 24h

**

Actividad PLC (% del basal)

120

100

80

DHPG 30 M

DHPG + JNJ 0,5 M

DHPG + MPEP 1 M

Figura46:Laexposicina5%O2noafectaalafuncionalidaddelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI.Neuronascorticalesfueron expuestasonoa5%O2durante24horasantesderealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeIP3.Seestudielefectodela hipoxia moderada sobre la funcionalidad del sistema estimulado por DHPG, agonista del grupo I de los receptores metabotrpicos de glutamato, as como el papel de los subtipos mGlu1, inhibido por JNJ, y mGlu5, inhibido por MPEP, en dicha funcionalidad. Los datos expuestossonlasmediasSEMde,almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintoscultivos.** p<0,01,***p<0,001,significativamentediferenteconrespectoasubasal.

Porotrolado,tambinseestudielcomportamientodelsistemaenzimticodelaadenilatociclasa,en condicionescontrolehipxicas,debidoasuacoplamientoalosreceptoresmetabotrpicosdelosgruposIIyIII. LaactividadbasaldelaenzimaACenhipoxianoresultabaalterada,comoseexponeenlaFigura47,panelA (Control:2,910,60;5%O224h:2,640,85pmol/mgmin). Como se expone en elpanel A, encondiciones basales, la actividad basal de la enzima no vara entre grupos.EnelcasodellosreceptoresdelgrupoII,comoseapreciaenelpanelB,lavadetransduccinmediada porlosreceptoresdelgrupoIIseencuentrapotenciadaenhipoxia(%inhibicin:Control:42,765,60;5%O2 24h:64,583,84%,p<0,05).EnloquerespectaalosreceptoresdelgrupoIII,panelC,seobservtambinel mismoefectoqueenlosdelgrupoII,aldetectarsemayorcapacidaddeinhibicindelaactividadACenhipoxia (%inhibicin:Control:26,533,29;5%O224h:46,875,79%,p<0,05).

112

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC A
Actividad AC basal (pmol/mgmin)
4

Resultados
Inhibicin mediada por L-AP4 (% de la actividad con Forsk)
60

Inhibicin mediada por (2R,4R)-APDC (% de la actividad con Forsk)

B
80

*
60

40

40

20

20

24 h on tr ol 5%

24 h

5%

Figura47:Efectodelaexposicina5%O2sobrelaactividadAC.Neuronascorticalesfueronexpuestasonoahipoxiamoderadadurante 24antesderealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeAMPc.Seestudielefectodelaexposicinhipoxiasobrelaactividad AC basal (panel A), as como su efecto sobre la funcionalidad del sistema inhibido por un agonista del grupo II de los receptores metabotrpicos de glutamato, (2R,4R)APDC 100 M (panel B), y por un agonista del grupo III, LAP4 100 M (panel C).En B y C los resultadosseexpresancomoeltantoporcientodelainhibicinobservadasobrelaestimulacindeforskolina100nM(Forsk).Losdatos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos cultivos. * p<0,05 significativamente diferente de su correspondiente control. En los ensayos de inhibicin ambos grupos resultaron significativamente diferentesconrespectoasucondicinbasal.

De esta manera, se puede concluir que la exposicin de neuronas corticales a hipoxia moderada potencialaprincipalvadetransduccinmediadaporlosreceptoresmetabotrpicosdelosgruposIIyIII,sin queelloafectealaactividadbasaldelapropiaAC. Debido a la cantidad de citas bibliogrficas que mencionan que la bajada de oxgeno desencadena procesosdeliberacindeadenosinaalmedioextracelular,seintentcomprobarsilaadicindeadenosinaal medio de cultivo mimetizaba de alguna manera los efectos observados como consecuencia de la hipoxia moderada.Paraello,seemplelaconcentracinfinaldeadenosina1M,lacualinhibadeformaeficientela transmisinsinpticadurantelaisquemiaenelreaCA1(Pearsonycol.,2006),durante2,6y24horasyse realizaron ensayos de unin de L[3H]Glu, ya que fue en estos ensayos en los que la accin de la hipoxia moderadaresultmspatente. Los resultados obtenidos se exponen en la Figura 48. Como se observa, la exposicin a adenosina durantelosmismostiemposquelahipoxiamoderadainducecambiossimilares,aunquenoidnticos,sobrelos receptores metabotrpicos de glutamato. En cuanto al nmero total de receptores en la superficie celular, panel A, se observa un incremento significativo (al menos p<0,01) en todos los tiempos estudiados de alrededordeun200%sobrelaexpresinbasaldeestosreceptores.Enelcasodelasafinidades,panelB,loque seobservaesunadisminucinalamitadenelparmetroKD(almenosp<0,01),unaumentoportantodela afinidad del receptor por su ligando, con respecto a los datos obtenidos en neuronas corticales controles. A continuacin de esta figura se expone una tabla resumen (Tabla 14) con los datos obtenidos as como su anlisisestadstico.

5%

on tr ol

on tr ol

24 h

113

Resultados A
Bm ax (pmol/mgprot)

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC B

2000

***

4000

**

**
3000

1500

KD (nM)

1000

2000

***

**

***

500

1000

0
ol h C on tr M M

0
ol h h
h h

on

tr

24

D O

A D

A D

Figura48:Laexposicinaadenosinamodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular.Neuronascorticalesseexpusierona adenosina1Mdurante2,6o24horas.SerealizaronensayosdeuninderadioligandoempleandoL[ H]Glu.Losdatosexpuestossonlas medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticoscalculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPad Prism5.0.**p<0,01,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

Bmx(pmol/mg) KD(nM)
Tabla 14: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de radioligandos en neuronas corticales expuestas a adenosina1M.Enestatablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.**p<0,01,*** p<0,001significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.

Control 577,2329,41 3117,9768,73

Adenosina1M2h 1735,73101,53*** 1661,01248,53***

Adenosina1M6h 1502,90255,87** 1685,84326,53**

Adenosina1M24h 1538,56248,86** 1533,48192,01***

La comparacin de los datos obtenidos durante la hipoxia moderada y durante la exposicin de las neuronascorticalesaadenosinaseexponeenlaFigura49.Comoseobserva,enelcasodelasBmx,losdatos obtenidossevanhaciendomsparecidossegnavanzaeltiempoenambosgruposdeexperimentos,siendo incluso estadsticamente diferentes (p<0,01) en el caso de la comparacin a 2 horas. Para las afinidades, a pesar de que los datos obtenidos son distintos en la hipoxia moderada y en la exposicin a adenosina, la comparacinestadsticadelosmismosnoreveladiferenciassignificativasentreambos. SiobservamoslasdiferenciasentrelasBmaxobtenidasenambosgruposdeexperimentossededuceque durante la hipoxia moderada ocurre una liberacin gradual de adenosina, que aparentemente alcanza su liberacin mxima a las 24 horas, momento en el que los datos obtenidos en ambos experimentos prcticamente convergen. En lo que se refiere a las afinidades detectadas, se observa que en ambas

114

24

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Resultados

situacionesexperimentalesnohayvariacionesdelosvaloresobtenidosparalasKDconrespectoaltiempo,lo quesugierequeseactivandistintasvasderegulacindelaafinidad. A
Bm ax (pmol/mg prot)
2000

4000

1500

3000

1000

KD (nM)

2000

500

**
h h

1000

5% O2 ADO 1 M
h
0

5% O2 ADO 1 M
h h 2 6 24 h

0
2 6

Figura49:Comparativaentrelosparmetroscinticosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandoalsometerlasneuronas corticalesa5%O2oaadenosina1M.LosdatosexpuestosprovienendelasTablas12y14.ComparativadelosvaloresdeBmax(panelA)y comparativadelosvaloresdeKD(panelB).**p<0,01valoresentregrupossignificativamentediferentes.

Unproblemaquesurgecuandoseestudianprocesosdehipoxiaesloquesehallamadolaparadojadel oxgeno. sta consiste en que cuando clulas o tejidos que han estado sometidos a procesos de hipoxia se reoxigenan se desencadenan procesos de muerte celular adicionales, exacerbndose as el dao celular observadodurantelahipoxia,problemaqueresultaespecialmentecrticosobretodoanivelclnicoalahorade tratarepisodiosdeisquemiacerebral. Porestemotivosecomprobelefectoquepudieratenerlareoxigenacindeloscultivosdeneuronas corticalessobrelosnivelesdelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato.Dadoelproblemaquesequera afrontarseestableciunsistemadereoxigenacinconsistenteenque,tras6horasdehipoxiamoderada,las clulaserandevueltasalincubadorencondicionesdenormoxiaunahoraantesderealizarlosexperimentos. As, se podran observar los cambios que ocurran en periodos cortos de reoxigenacin sobre los receptores metabotrpicosdeglutamato. Los resultados obtenidos en estos experimentos se exponen en la Figura 50. Como se observa en el panel A, la reoxigenacin durante 1 hora induce una disminucin significativa de los niveles totales de receptoresmetabotrpicosdeglutamatoconrespectoalosdetectadostras6horasdehipoxia.Enconcreto,el valordeBmxdetectadoesun52%mselevadoqueelbasal(p<0,001)yun22%msbajoqueelobservadotras las6horasdeexposicinahipoxia(p<0,05). Enloqueserefierealosvaloresobtenidosparalaafinidaddeestosreceptoresporsuligando,panelB, seobservaquetras1horadereoxigenacinelvalordeKDdisminuaun74%,conloquelaafinidadresultaba aumentadadeformasignificativaconrespectoalasituacincontrol(p<0,001).Sinembargo,lacomparacin de valores con los datosobtenidos tras lahipoxia no revelaban variaciones significativas entre s,a pesarde

24

115

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

detectarseunasdisminucionespromediodeun71%entreambosgruposdedatos,aunqueestnmuycercade serlo(p=0,063),elloseaprobablementedebidoalaelevadavariabilidaddelasKDenestosexperimentos A
1500

B
4000

***
KD (nM)

Bm ax (pmol/mgprot)

3000

1000

***

2000

500
0
6h ol R eo x tr on
2

1000

***

0
6h ol on O C C 5% 5% O R eo x tr
2

Figura50:Laexposicinahipoxiaproduceefectosreversiblessobrelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato.Neuronascorticalesse expusieron a hipoxia moderada 6 horas (5% O2 6h), transcurridas las cuales se mantuvieron una hora ms en condiciones normxicas (Reox).TranscurridoestetiemposerealizaronensayosdeuninderadioligandoempleandoL[ H]Glu.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticos calculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism 5.0.***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol;p<0,05valoresentregrupossignificativamentediferentes.
3

EnlaTabla15semuestraunresumendelosdatosobtenidosenestosexperimentosparaelestudiodel efectodelareoxigenacinenlosnivelesdereceptoresmetabotrpicosdeglutamato. 5%O26h+Reox1h


Tabla 15: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de radioligandos en neuronas corticales expuestas a reoxigenacin. En esta tabla se exponen los resultados numricos obtenidos para el clculo de los parmetros cinticos. *** p<0,001 significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol;p<0,05significativamentediferenterespectoa5%O26horas.

Bmx(pmol/mg) 876,0142,28***

KD(nM) 808,0265,19***

Estos resultados sugieren que, durante los procesos de reoxigenacin estudiados ocurren fenmenos rpidosensentidocontrarioalosdescritosdurantelahipoxia,yaque,elnmerototaldereceptoresseacerca aunvalormsparecidoalobtenidoenneuronascorticalescontroles.Porotrolado,elaumentodeafinidad descrito tras la reoxigenacin podra ser resultado de una respuesta compensatoria a la disminucin del nmerototaldereceptores.

116

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC c) Receptoresdeadenosina.

Resultados

Est firmemente establecido en la bibliografa que durante los procesos de hipoxia/isquemia cerebral aumenta la concentracin de adenosina extracelular. Esta adenosina ejerce, en principio, un efecto neuroprotectoralactivarlosreceptoresA1einhibirlaliberacindeglutamato.Sinembargo,losprocesosde modulacin que sufren los receptores de adenosina en estos modelos experimentales estn pobremente caracterizados. Por este motivo se emple la exposicina hipoxia moderada descrita con anterioridadcomo modeloparaestudiarlosprocesosdemodulacinqueocurrenenlosreceptoresdeadenosina,ascomoenla vadetransduccinmediadaporelsegundomensajeroAMPc,comoconsecuenciadeladisminucinparcialde oxgeno. LadeterminacindelosreceptoresA1,segnsedescribiconanterioridadenMtodos,sellevacabo a los mismos tiempos que se realizaron los ensayos del apartado anterior. Los resultados se exponen en la Figura51. A
Bm ax (pmol/mg prot)
0.8

20

0.6

***

***

***
KD (nM)

15

**

*** ***

0.4

10

0.2

6h

2h

24

2h

6h

ol

ol

C on tr

C on tr

5%

5%

5%

5%

5%

Figura51:LaexposicinahipoxiamoderadamodulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular.Neuronascorticalesseexpusierona5%O2 durante2,6o24horas.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]DPCPX.LosdatosexpuestossonlasmediasSEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticos calculados, Bmax (panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism5.0.**p<0,01,*** p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

ComoseobservaenelpanelA,lahipoxiamoderadaproduceunaumentosignificativo(p<0,001)delos receptoresA1enlasuperficiecelular,cuantificndoseincrementosdel301%tras2horas,263%tras6horasy 238%tras24horasdetratamiento.Porotrolado,lacomparacinestadsticaentregruposnorevelresultados significativos. En cuanto a la afinidad de los receptores A1 (panel B) se observa en todos los casos un aumento significativodelparmetroKDde,aproximadamente,nuevevecessobrelaafinidadenlasituacincontrol(al

5%

24

0.0

117

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

menosp<0,01),loquellevaaparejadaunaprdidadelaafinidaddeestosreceptoresporsuligando.Denuevo, elanlisisestadsticodelosdatosentregruposnorevelvariacionessignificativas. Acontinuacinseexponeunatablaresumen(Tabla16)conlosdatosnumricosobtenidosparacada unodelosparmetroscalculadosenlasdistintassituacionesdeensayo. Bmx(pmol/mg) KD(nM)


Tabla16:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[ H]DPCPXenneuronascorticalesexpuestasahipoxia moderda.Enestatablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.**p<0,01,***p<0,001 significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.
3

Control 0,1490,006 1,160,16

5%O22h 0,5970,035*** 10,931,98**

5%O26h 0,5410,058*** 10,360,44***

5%O224h 0,5040,071*** 12,951,77***

EstosresultadossugierenquelosreceptoresA1deadenosinasonextremadamentesensiblesalabajada deoxgenoinclusoencondicionestansuavescomolasqueenglobannuestromodelodeensayo. Porotrolado,seestudielcomportamientodelosreceptoresA2Aenlasmismassituacionesporensayo de unin de radioligando, empleando [3H]ZM241385 como antagonista especfico de los receptores A2A. Los resultados obtenidos en estos experimentos se muestran en laFigura 52. Como seobserva en el panel A, la exposicin de neuronas corticales a hipoxia moderada produce una disminucin significativa del nmero de receptoresenlasuperficiecelular,as,alas2horasdeexposicinelnmerodereceptoressehabareducido un34%(p<0,05),alas6horasun39%(p<0,01)ydespusde24horassloquedabael59%delosreceptores iniciales(p<0,01). Sinoscentramosenelestudiodelaafinidad(panelB)seobservaquelaexposicinahipoxiamoderada noejerceefectosnotablessobrelaafinidaddelosreceptoresA2Aporsuligando. A continuacin se expone una tabla resumen (Tabla 17) con los resultados obtenidos en estos experimentosparaelreceptorA2Aenneuronascorticalessometidasacondicionesdehipoxiamoderada.

118

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC A
Bm x (pmol/mgprot)

Resultados

0.8

20

0.6

15

0.4

KD (nM)

**

**

10

0.2

0.0
2h 6h 24 h C on tr ol
2 2

0
2h C on tr ol
2

5%

5%

5%

5%

5%

Figura52:LaexposicinahipoxiamoderadamodulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular.Neuronascorticalesseexpusierona5%O2 durante2,6o24horas.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]ZM241385.Losdatosexpuestossonlasmedias SEMde3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentescultivos.Losparmetroscinticoscalculados,Bmax (panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism5.0.*p<0,05,** p<0,01significativamentediferenteconrespectoalcontrol.


3

Bmx(pmol/mg) KD(nM)
Tabla 17: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de [ H]ZM241385 en neuronas corticales expuestas a hipoxiamoderda.Enestatablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.*p<0,05,** p<0,01significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.
3

Control 0,6560,051 13,250,26

5%O22h 0,4320,035* 11,382,65

5%O26h 0,3980,033** 13,772,10

5%

0,3890,016** 10,241,94

Estos resultados sugieren que, al igual que ocurra con el receptor A1, los receptores A2A son muy sensiblesalasvariacionesenlapresinparcialdeoxgeno.Noobstante,esnecesariodestacarquelosprocesos deregulacinquesufrenA1yA2Asonopuestos,mientrasquelosreceptoresA1aumentansuBmaxyKDcomo consecuenciadelaexposicinahipoxiamoderada,losreceptoresA2Aslosevenalteradosensunmero,que disminuyeenestosprocesos,resultandoinalteradasuafinidad. Acontinuacinsecomprob,mediantePCRatiemporeal,siloscambiosobservadosenambostiposde receptoreseranconsecuenciademodulacionessufridasaniveldelaexpresingnica,comoconsecuenciade la exposicin de las neuronas corticales a hipoxia moderada. De forma adicional seestudi la regulacin del gencodificanteparaelreceptorA2Bdeadenosina.

5%O224h

24 h

6h

119

Resultados
20

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC
A1 A2A A2B

***

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

15

10

***
5

Figura53:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaexpresingnicadeA1,A2AyA2B.Neuronascorticalesfueronexpuestasa 5%O2durante2,6o24horasosemantuvieronencondicionescontrolconelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiempo realserealizaronempleandosondasespecficasparalosgenesmostrados.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde3experimentos independientesrealizadosporduplicadoempleandodistintasmuestras.***p<0,001,significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

ComoseapreciaenlaFigura53,noseobtuvoparalosgenescodificantesparalosreceptoresA1yA2A, en ninguna de las condiciones ensayadas, una variacin de la expresin gnica tal que resultara estadsticamente significativa, lo cual sugiere que es a nivel posttranscripcional donde ocurren los procesos responsablesdelamodulacindeestosreceptoresaniveldelamembranaplasmtica.Enelcasodelreceptor A2B se aprecia, a partir de las 6 horas de exposicin, un aumento significativo en la expresin gnica de 5,8 vecestras6horas(p<0,001)yde21,6vecestras24horasdeexposicin(p<0,001). EsteestudioporPCRatiemporealseampliadosfamiliasdegenesrelacionadasconlosreceptoresde adenosinayconlahipoxia,comosonlosfactoresdetranscripcinconstitutivosCREByCREMylafamiliadelos factoresdetranscripcininduciblesporhipoxia(HIF).LosresultadosobtenidosseexponenenlaFigura54. En cuanto a los factores de transcripcin CREB y CREM, se aprecia que su nivel de ARNm est sensiblementedisminuidoapartirdelas6horasdeexposicinahipoxiamoderada.As,enelcasodeCREBse apreciandisminucionesdealrededordeun25%enlaexpresingnicadeestefactor(p<0,001),mientrasque enelcasodeCREMlasdisminucionessonmsacusadasysuperanalas6y24horasel40%dedisminucinen laexpresingnicadeestefactor(almenosp<0,05).

120

C on tr 5% ol O 2 2 h 5% O 5% 2 6h O 2 2 4h

C on tr 5% ol O 2 2 h 5% O 5% 2 6h O 2 2 4h

C on tr 5% ol O 2 5% 2h O 5% 2 6h O 2 2 4h

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC
2.5

Resultados

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

2.0

CREB CREM HIF-1 HIF-3

**

1.5

1.0

******

** *

0.5

0.0

C on 5% tro O l 5% 2 2 h 5% O2 6h O 2 2 4h

Figura54:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaexpresingnicadelosfactoresHIF1,HIF3,CREByCREM.Neuronas corticales fueron expuestas a 5% O2 durante 2, 6 o 24 horas o se mantuvieron en condiciones control con el fin de aislar su ARN. Los experimentos de RTPCR a tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los genes codificantes para los factores de transcripcin mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleandodistintasmuestras.*p<0,05,**p<0,01,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

EnelcasodelafamiliadelosHIF,seapreciaque,enestascondiciones,noseestimulalatranscripcin gnicadelfactordetranscripcinHIF1,quedeberaser,enprincipio,elprincipalresponsabledemediarlas accionesdelabajadadeoxgeno.AdemsseobservaunaumentoenlatranscripcingnicadeHIF3,cuyo principal cometido parece ser reprimir la activacin gnica promovida por causa de la hipoxia. El aumento comentadosuponeunosincrementosdeun43%tras2horasdeexposicin(p=0,053),deun42%despusde6 horas(p<0,05)ydeun103%tras24horasdeexposicin(p<0,01). Estosresultadossugierenquelaexpresingnicadelafamiliadefactoresdetranscripcinrelacionados con el AMPc, CREB y CREM, se encuentra disminuida como consecuencia de la exposicin de las neuronas corticalesahipoxiamoderada.Porotrolado,afaltadeconfirmacinaniveldeexpresinproteica,pareceque noesHIF1elresponsabledelosefectosobservadosenestemodelodehipoxiamoderada,pordosmotivos: por un lado, su expresin gnica no aumenta al disminuir la presin parcial de oxgeno y, por otro lado, la expresin gnica del principal represor de HIF1, HIF3, s que aumenta como consecuencia de la disminucinenlapresinparcialdeoxgenoenlasneuronascorticalesencultivo. UnavezconfirmadasexperimentalmentelasvariacionesenladensidaddereceptoresdeadenosinaA1y A2A a nivel de la membrana plasmtica y el estado alterado de los niveles de ARNm de los factores de transcripcinCREByCREM,elsiguientepasodebasercomprobarlacapacidaddelosreceptoresA1yA2Apara transducir una seal a travs del sistema enzimtico al que estn acoplados principalmente. Dado que los

C on 5% tro O l 5% 2 2 h 5% O2 6h O 2 2 4h C on 5% tro O l 5% 2 2 h 5% O2 6h O 2 2 4h C on 5% tro O l 5% 2 2 h 5% O2 6h O 2 2 4h

121

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

efectosmspatentesdelahipoxiamoderadaseobservabantras24horasdeexposicindeestasclulas,se eligiestetiempodeexposicinpararealizarlossiguientesensayosenzimticos. A
Actividad AC inhibida por CHA (% de Forsk)
60

B
Actividad AC estimulada por CGS 21680 (% del basal)
200 175 150 125 100

*
40

20

0
C on tr ol 24 h O
2

0
C on tr ol O 5%
2

Figura55:EfectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaactividadAC.Neuronascorticalesfueronexpuestasonoa5%O2durante 24horasantesderealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeAMPc.Seestudielefectodelaexposicinahipoxiamoderada sobrelainhibicindelaactividadACporelreceptorA1(panelA),empleandoelagonistaespecficoCHAa1Mparainhibirlaactividad estimuladaporforskolina100nM.TambinsecomprobelefectodelaexcitotoxicidadenlaestimulacindelaactividadACpromovida porelreceptorA2A(panelB),paralocualseempleelagonistaespecficoCGS21680a1M.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde, almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintoscultivos.*p<0,05significativamentediferentede sucorrespondientecontrol.Actividadbasal:Control:2,910,60;5%O224h:2,640,85pmol/mgmin.

As,comoseexponeenelpanelAdelaFigura55,enelcasodelreceptorA1,comoconsecuenciadela hipoxia, se observa una mayor capacidad de ste para inhibir la enzima adenilato ciclasa previamente estimulada. Este aumento funcional del receptor A1 resultaba, adems, significativo estadsticamente (% inhibicin:Control:24,952,89;5%O224h:40,173,19,p<0,05). EnelcasodelreceptorA2AlosresultadosobtenidosseexponenenelpanelBdelamismaFigura.Como se aprecia, en este caso existe una menor capacidad de los receptores A2A para estimular el sistema de la adenilatociclasacomparadoconlaactividadobservadaenneuronascorticalescontroles,dato,porotrolado, estadsticamentesignificativo(%estimulacin:Control:174,333,64;5%O224h:127,3813,33,p<0,05). DeestamaneraquedademostradoquelafuncionalidaddelosreceptoresdeadenosinaA1yA2Aresulta modulada como consecuencia de la exposicin de las neuronas corticales a hipoxia moderada, resultando la funcionalidaddelreceptorA1aumentadayladelA2Adisminuida,comoenprincipiocabraesperardebidoalas variacionesdescritasenladensidaddeambosreceptoresenlamembranaplasmticadeestasclulas. Al igual que en el apartado anterior, se comprob el efecto de la exposicin a adenosina 1 M en neuronascorticales,debidoalarelacinentrelahipoxia/isquemiaylaadenosinadescritaconanterioridad.En laFigura56semuestranlosresultadosobtenidosparalosensayosdeuninderadioligandoparaelreceptor A1.Comoseobserva,laexposicinaadenosinaaumentalosdosparmetroscinticosestudiados,laBmaxyla KD.

122

5%

24 h

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC A
Bm ax (pmol/mg prot)
2.0

Resultados

2.5

***
KD (nM)

30 25 20

**

*** ***

1.5

1.0

*** ***

15 10 5 0

0.5

0.0
h h ol h 2 6 C on tr 24 M M M

ol

C on tr

A D O

A D O

A D O

A D O

Figura56:LaexposicinaadenosinamodulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular.Neuronascorticalesseexpusieronaadenosina1 Mdurante2,6o24horas.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]DPCPX.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticos calculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism 5.0.**p<0,01,***p<0,001significativamentediferentecon respecto alcontrol;p<0,05,p<0,01significativamentediferenteentre grupos.
3

ComoseobservaenelpanelA,laexposicinaadenosinainduceatiemposcortosunaumentomximo enelnmerodereceptoresA1enlasuperficiecelularde10,7vecesconrespectoalcontrol(p<0,001),pasadas 6 horas de exposicin el aumento es slo de 6,3 veces con respecto al control (p<0,001) y tras 24 horas de exposicin el aumento es de 4,1 veces con respecto al control (p<0,001), es decir, un mayor tiempo de tratamiento con adenosina no aumentaba proporcionalmente el nmero de receptores. Por otro lado, la comparacinestadsticadelosdatosobtenidosentregrupos,indicaquesloexistendiferenciassignificativas entrelosdatosobtenidosa2y24horas(p<0,05).Encuantoalrestodelosgrupos,lacomparacinestcercana aserestadsticamentesignificativa(p=0,083entre2y6horas;p=0,070entre6y24horas). En el caso de las afinidades (panel B) la exposicin de neuronas corticales a adenosina produce una disminucin significativa de la afinidad en todos los casos. Como se observa, tras 2 horas de exposicin la disminucin de la afinidad fue de 18 veces con respecto al control (p<0,01), tras 6 horas fue de 14 veces (p<0,001)y tras 24 horas fue de8 veces(p<0,001). Porotro lado, lacomparacin entre datos indicaque las variacionesobservadasentrelasexposicionesa6y24horassonsignificativasentres(p<0,01).

A D O

A D O

24

123

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Acontinuacinseexponeunatablaresumen(Tabla18)conlosdatosobtenidosenestosexperimentos. Bmx(pmol/mg) KD(nM)


Tabla 18: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de [ H]DPCPX en neuronas corticales expuestas a adenosina1M.Enestatablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.**p<0,01,*** p<0,001significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.
3

Control 0,1490,0066 1,1650,16

Adenosina1M2h 1,5940,275*** 21,124,69**

Adenosina1M6h 0,9320,134*** 16,521,85***

Adenosina1M24h 0,6070,044*** 9,5381,61***

Posteriormente se compararon estadsticamente los resultados obtenidos tras la exposicin a hipoxia moderadayaadenosina1M.LosresultadosobtenidosenestacomparativasemuestranenlaFigura57. A
Bm a x (pmol/mg prot)

2.0

5% O2 ADO 1 M

30

5% O2 ADO 1 M

1.5
20

1.0

KD (nM)
10

0.5

*
h

*
0

0.0

Figura57:Comparativaentrelosparmetroscinticosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandoalsometerlasneuronas corticalesa5%O2obienaadenosina1M.LosdatosexpuestosprovienendelasTablas16y18.ComparativadelosvaloresdeBmax(panel A)ycomparativadelosvaloresdeKD(panelB).*p<0,05valoresentregrupossignificativamentediferentes.

ComoseobservaenelpanelA,elefectosobreelnmerodereceptoresconvergeenambosmodelos experimentales a las 24 horas, sin embargo, a tiempos ms cortos de exposicin, la adenosina induce un incremento del nmero de receptores mayor que la hipoxia moderada, tanto a 2 como a 6 horas, siendo, adems,esteincrementoestadsticamentesignificativo(p<0,05). En lo que respecta a la afinidad de los mismos (panel B), la comparacin de los valores obtenidos desprendelasmismasconclusionesqueenelcasodelnmerodereceptores,conlaexcepcindeque,eneste caso, las variaciones en la afinidad obtenidas para ambos grupos a las 2 horas no revelan resultados significativos(p=0,116).

124

24

24

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Resultados

Estosresultadossugierenquelaexposicinaadenosinaproduceresultadossimilaresalosproducidos por la hipoxia moderada a tiempos largos de exposicin, lo que indica que en neuronas corticales la hipoxia moderadainduceunaumentogradualdeadenosinaenelmedioextracelular. EnelcasodelreceptorA2A,laexposicinaadenosina1Mdurantelostiemposindicadosproduceuna disminucindel nmero deestos receptores sobre la superficie celular, como se expone en el panel A de la Figura 58. A todos los tiempos ensayados se observaron disminuciones significativas (al menos p<0,05) superioresal30%enelnmerodereceptoresconrespectoalasituacincontrol.Porotrolado,lacomparacin estadsticadeestosresultadosentrelosdistintosgruposnoreveldiferencias. A
Bm x (pmol/mgprot)

0.8

B
20

0.6

15

0.4

KD (nM)

**

10

0.2

0.0
ol 2h 24 h h 6 on tr M M C M

0
ol on tr M M C M A D O 1 24 h 2h 6 O A D 1 h

Figura58:LaexposicinaadenosinamodulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular.Neuronascorticalesseexpusieronaadenosina1 Mdurante2,6o24horas.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]ZM241385.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticos calculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism 5.0.*p<0,05,**p<0,01significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

Delestudiodelasafinidadestraslaexposicindeestasclulasaadenosina(panelB)sedesprendeque la afinidad de los receptores A2A en neuronas corticales no resulta afectada como consecuencia de dicha exposicin. A continuacin se expone una tabla resumen (Tabla 19) con los datos cinticos obtenidos en estos experimentos.

125

Resultados Bmx(pmol/mg) KD(nM) Control 0,6560,051 13,250,26

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC Adenosina1M2h 0,4470,045* 12,440,90 Adenosina1M6h 0,4030,026** 10,782,03 Adenosina1M24h 0,4080,066* 12,022,50

Tabla 19: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de [ H]ZM241385 en neuronas corticales expuestas a adenosina1M.Enestatablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.*p<0,05,** p<0,01significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.

La comparacin de los datos cinticos obtenidos en estos experimentos para el receptor A2A con los obtenidostraslaexposicinahipoxiamoderadaseexponeenlaFigura59.ComoseobservaenestaFigurano existendiferenciasapreciablesentreelresultadoobservadotrassometeralasneuronascorticalesaunauotra situacin. A
0.6

5% O2 ADO 1 M

B
20

5% O2 ADO 1 M

Bm x (pmol/mgprot)

15
0.4

KD (nM)

10

0.2

0.0
24

0
h h h

Figura59:Comparativaentrelosparmetroscinticosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandoalsometerlasneuronas corticalesa5%O2obienaadenosina1M.LosdatosexpuestosdevienendelasTablas17y19.ComparativadelosvaloresdeBmax(panel A)ydelosvaloresdeKD(panelB).

EstosresultadossugierenquelosreceptoresA2Asecomportanigualbajolainfluenciadelaadenosina1 Mquebajolainfluenciadelahipoxiamoderada.Sicomparamosestosresultadosconlosobtenidosparael receptor A1 se observa que ste es ms susceptible de ser regulado por pequeas variaciones en la concentracindeadenosina,mientrasqueelreceptorA2Apareceresponderigualantecualquierestmuloque suponga liberacin de adenosina, lo que hace al receptor A1 candidato a orquestar las respuestas celulares frenteavariacionesenlaconcentracindeadenosina. Aligualqueenelapartadoanterior,seestudisilosefectosobservadosenlosparmetroscinticosde los receptores A1 y A2A como consecuencia de la exposicin a hipoxia eran reversibles o no. Para ello, las neuronas corticales se sometieron a hipoxia moderada durante dos horas, tiempo suficiente para observar

126

24

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Resultados

modulacinenlosparmetroscinticosdeambosreceptores,ydespussemantuvieronduranteunahoraen condicionesnormxicasantesderealizarlosensayosdeuninderadioligandos. LosresultadosobtenidosparaelreceptorA1seexponenenlaFigura60.EnelpanelAseobservaqueel aumentode receptoresA1 observado durante la hipoxia disminuye tras la reoxigenacin. De esta manera se apreciaunadisminucinsignificativaenelnmerodereceptorestotalesconrespectoalosdetectadosdurante la hipoxia moderada de un 34% (p<0,05), aunque este nmero sigue siendo 2,6 veces superior a la Bmax detectadaenneuronascorticalescontroles(p<0,01). En el caso de la afinidad del receptor A1 (panel B), se aprecia el mismo efecto que el descrito anteriormente,elparmetroKDtraslareoxigenacinsiguesiendomselevadoqueelcontrol,enconcreto3,7 veces (p<0,05), pero es a la vez estadsticamente menor, un 60%, que el descrito para la hipoxia moderada (p<0,05). A
Bm ax (pmol/mg prot)

0.8

B
15

*** **
KD (nM)

**

0.6

10

0.4

5
0.2

0.0
l on t R eo x ro 2h
2

2h

on tr ol

Figura60:LaexposicinahipoxiaproduceefectosreversiblessobrelosreceptoresA1deadenosina.Neuronascorticalesseexpusierona hipoxia moderada 2 horas (5% O2 2h), transcurridas las cuales se mantuvieron una hora ms en condiciones normxicas (Reox). Transcurridoestetiemposerealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]DPCPX.LosdatosexpuestossonlasmediasSEM de,almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentescultivos.Losparmetroscinticoscalculados, Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism5.0.*p<0,05, **p<0,01,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol;p<0,05valoresentregrupossignificativamentediferentes.
3

EnelcasodelreceptorA2A,losresultadosseexponenenlaFigura61.Comoseaprecia,yalcontrariode lo que ocurra para el estudio del receptor A1, una hora de reoxigenacin no es suficiente para observar variaciones en los parmetros cinticos estudiados: nmero total de receptores (panel A) y afinidad de los mismos(panelB). EstosresultadosapoyanlahiptesisdequeelreceptorA1seamssusceptibledeserreguladoporlas concentracionesdeadenosinay,dealgunamanera,puedacontrolarelcomportamientodelreceptorA2A.

5%

5%

eo x

127

Resultados A
Bm x (pmol/mgprot)
0.6

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC B
15

0.8

0.4

KD (nM)
5 0
ol

10

0.2

0.0
C on tr ol R eo x 2h
2

C on tr

Figura 61: La exposicin a hipoxia no produce efectos reversibles sobre los receptores A2A de adenosina. Neuronas corticales se expusieron a hipoxia moderada 2 horas (5% O2 2h), transcurridas las cuales se mantuvieron una hora ms en condiciones normxicas (Reox). Transcurrido este tiempo se realizaron ensayos de unin de radioligando empleando [ H]DPCPX. Los datos expuestos son las medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticoscalculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPad Prism5.0.***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol;p<0,05valoresentregrupossignificativamentediferentes.
3

Acontinuacinseexponeunatablaconlosparmetroscinticosobtenidosparaambosreceptoresen estosexperimentos,ascomoelanlisisestadsticodelosmismos. 5%O22h+Reox1h A1 A2A


Tabla 20: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de radioligandos para los receptores de adenosina en neuronas corticales expuestas a reoxigenacin. En esta tabla se exponen los resultados numricos obtenidos para el clculo de los parmetros cinticos. * p<0,05, ** p<0,01 significativamente diferente respecto al correspondiente control. p<0,05 significativamente diferenteconrespectoa5%O22horas.

Bmx(pmol/mg) 0,3940,069 ** 0,4360,022*

5%

5%

4,281,06 * 11,231,63

d) Tablaresumen. Acontinuacinseexponendostablasamododeresumenconlasprincipalesvariacionesobservadasen los experimentos descritos en este apartado. La primera (Tabla 21) recoge las variaciones observadas en los experimentosempleando5%O2,enlasegunda(Tabla22)enlosqueseempleadenosina.

128

KD(nM)

R eo x

2h

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC 5%O2 2h 5%O2 6h 5%O2 24h


3

Resultados 5%O2 2h 5%O2 6h 5%O2 24h

Bmax unin [ H]DPCPX KD unin [ H]DPCPX Bmax unin [ H]ZM241385 KD unin [ H]ZM241385 ARNmA1 ARNmA2A ARNmA2B ARNmHIF1 ARNmHIF3 ARNmCREB ARNmCREM ActividadA1/AC ActividadA2A/AC Bmax[ H]DPCPX (1hReox) KD [ H]DPCPX (1hReox) Bmax 3 [ H]ZM241385 (1hReox)
3 3 3 3 3

Viabildad Muerte apopttica ARNm caspasa3 Bmaxunin L[ H]Glu KDunin L[ H]Glu ProtenamGlu1 ARNmmGlu1 ProtenamGlu5 ARNmmGlu5 ProtenamGlu2,3 ProtenaPLC1 ARNmPLC1 ActividadPLC basal ActividadPLC grupoI ActividadAC basal ActividadAC grupoII ActividadAC grupoIII BmaxL[ H]Glu (1hReox) KDL[ H]Glu (1hReox)
3 3 3 3

KD [ H]ZM241385 (1hReox)

Tabla21:Resumendelosresultadosobtenidosenneuronascorticalesexpuestasahipoxia.Enestatablaseexponengrficamentelos resultados numricos descritos en este captulo. , no hay variacin estadstica, , se observa un aumento con respecto a la situacin control,,seobservaunadisminucinconrespectoalasituacincontrol.

129

Resultados
BmaxuninL[ H]Glu KDuninL[ H]Glu Bmaxunin[ H]DPCPX KDunin[ H]DPCPX Bmaxunin[ H]ZM241385 KDunin[ H]ZM241385
3 3 3 3 3 3

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC Ado1M2h Ado1M6h Ado1M24h

Tabla22:Resumendelosresultadosobtenidosenneuronascorticalestratadasconadenosina.Enestatablaseexponengrficamentelos resultados numricos descritos en este captulo. , no hay variacin estadstica, , se observa un aumento con respecto a la situacin control,,seobservaunadisminucinconrespectoalasituacincontrol.

IV.3.2EnclulasC6degliomaderata. Enlaactualidadexistenalgunasreferenciasbibliogrficasquerelacionanlosreceptoresmetabotrpicos deglutamatocomoposiblesmediadoresdelaneuroproteccin/neurodegeneracinenmodelosdehipoxiae isquemia.Sinembargo,ningunodeestosestudioscomprendelademostracindelosprocesosderegulacin que sufren estos receptores como consecuencia de la disminucin de la presin parcial de oxgeno. En este apartadosedesarrollarunaprimeraaproximacinalosprocesosderegulacinquesufrenestosreceptores traslaexposicinahipoxiamoderadaenclulasC6.Paraelloseeligielmismomodelodehipoxiamoderada empleadoenneuronas,consistenteenladisminucinenlapresinparcialdeoxgenohastaun5%durante2,6 o24horas.Despusserealizaranensayosdeuninderadioligando,experimentosdeRTPCRatiemporealy ensayosdeactividadenzimticaconelfindeintentardilucidarlosmecanismosderegulacinquesufrenestos receptoresantelaexposicinahipoxiamoderadaenclulasgliales. a) Efectoenlaviabilidadcelular. Los primeros experimentos se encaminaron a observar los efectos que ejerca esta hipoxia moderada sobrelaviabilidadcelularenclulasC6,paraelloserecurrialtestdeviabilidadbasadoenelMTT.Comose observaenlaFigura62,laexposicindelasclulasC6aunadisminucinmoderadaenlapresinparcialde oxgeno,noafectaalaviabilidadcelularaningunodelostiemposensayados(%viabilidad:Control:100,00 0,95;5%O22h:100,015,48;5%O26h:96,555,66;5%O224h:98,0011,88).

130

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC 140
Viabilidad (% respecto al control)
120 100 80 60 40

Resultados

Figura62:LasclulasC6resistenlabajadaenladisponibilidad deoxgeno.ClulasC6seexpusierona5%O2durante2,6y24 horas. Transcurrido este tiempo se midi la viabilidad celular mediante el test basado en MTT. Los datos expuestos son las medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por triplicado, expresados porcentualmente con respectoalaviabilidaddelasclulascontroles.

20 0
ro l 2h 6h on t
2

5%

5%

b) ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato. Acontinuacinserealizunestudiocompletodelamodulacindelosreceptoresmetabotrpicosde glutamatocomoconsecuenciadeladisminucinenlapresinparcialdeO2.ComoseobservaenlaFigura63,la disminucindelapresinparcialdeoxgeno,inclusodurantetiempostancortoscomodoshoras,modulala expresin de los receptores metabotrpicos de glutamato en la superficie celular de la lnea C6, afectando tantoalacantidaddereceptorescomoalaafinidaddelosmismosporsuligando.As,seapreciaunaumento significativodelnmerototaldereceptoresmetabotrpicos(panelA),elcualesdeun138%trasdoshorasde hipoxiamoderada,deun132%despusde6horasydeun123%traslas24horas,conrespectoalnmerode receptoresmedidosensituacincontrol. Losresultadosobtenidosdemostrabanquelaafinidaddelosreceptoresmetabotrpicosporsuligando disminuadeformasignificativacomoconsecuenciadelahipoxia(panelB).As,sehandescritoaumentosenla KDde2,9,3y2,4vecestras2horas,6y24horasdehipoxiamoderada,respectivamente,encomparacincon lasituacincontrol.LosdatosobtenidosparalosensayosdeunindeL[3H]Glu,ascomoelanlisisestadstico delosmismos,seexponeenlatabla23. Elanlisisestadsticodelosdatosobtenidosenlasexposicionesahipoxiamoderadaadistintostiempos, revelquenoexistandiferenciassignificativasentreellos,esdecir,loscambiosdetectadosaniveldenmero dereceptoresydesuafinidaddetectadosalasdoshorasdeexposicinsemantenaneneltiempoalolargode todoelestudio.

5%

24 h

131

Resultados A
Bm ax (pmol/mg prot)
300

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC B
2500 2000

***

***

***
KD (nM)

***

* ***

200

1500 1000

100 500 0 0

2h

6h

2h

6h

on tr ol

on tr ol

24

5%

5%

5%

5%

5%

Figura63:Laexposicinahipoxiamoderadamodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular.ClulasC6seexpusierona hipoxiadurante2,6o24horas.SerealizaronensayosdeuninderadioligandoempleandoL[ H]Glu.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando clulas de diferentes pases. Los parmetros cinticoscalculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPad Prism5.0.*p<0,05,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

Bmx(pmol/mg) KD(nM)
Tabla 23: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de radioligandos en clulas C6 expuestas a hipoxia moderda.Enestatablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.*p<0,05,***p<0,001 significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.

Control 133,759,54 707,5944,45

5%O22h 317,6619,26*** 2058,41169,39***

5%O26h 310,2833,41*** 2103,56384,82*

298,3324,37*** 1687,13219,70***

ConelfindeestudiarmsafondoelsistemadetransduccinmediadoporlosreceptoresdelgrupoI,se estudiporPCRatiemporeallosefectosqueejercalahipoxiamoderadaalosdistintostiemposdeexposicin en clulas C6 sobre los genes codificantes para el receptor mGlu1 y para la enzima PLC1. Los resultados obtenidostrasestosexperimentosseexponenenlaFigura64. Comoseobserva,apesardenohabersedetectadodiferenciasenlamodulacindelnmerototalde receptores entre los distintos tiempos de hipoxia, en el caso del gen codificante para mGlu1 se aprecia un aumentoprogresivodesuexpresinconeltiempodeexposicinalahipoxiamoderada,aunquesloresultan significativosdesdeunpuntodevistaestadsticotras24horasdetratamiento(p<0,05).Porcentualmenteestos aumentos se traducen en incrementos del 7%, 32% y 108%, tras 2, 6 y 24 horas de exposicin, respectivamente.Porotrolado,lacomparacinestadsticadelasvariacionesenlaexpresingnicaobservadas entrelosdistintostratamientosreveladiferenciassignificativasentrelosdatosobtenidosa2ya24horasde

132

5%

5%O224h

24

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Resultados

hipoxiamoderada(p<0,05)yproporcionaunvalordep=0,144alacomparacindelosdatosobtenidostras6y 24horasdeexposicin.Portodoellosepuedeafirmarquelahipoxiamoderadaproduceunaumentogradual delaexpresindelgencodificanteparaelreceptormGlu1. Sinembargo,lahipoxiamoderadanoproduceningunavariacinsignificativaenlaexpresingnicade una enzima relacionada directamente con el receptor mGlu1 y con la transduccin de la seal mediada por ste,comoeslaPLC1,comoseobservaenlaFigura64.
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
C o 5% ntr o O l 5% 2 2 h 5% O2 6h O 2 2 4h

mGluR1 PLC 1

Figura 64: Efecto de la exposicin a hipoxia moderada sobre la expresingnicademGlu1yPLC1.ClulasC6fueronexpuestasa5% O2durante2,6o24horasosemantuvieronencondicionescontrol conelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiemporeal se realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05, significativamente diferente con respectoalcontrol.

Dado el aumento observado en la expresin gnica de mGlu1, a pesar de no observar cambios significativos en la expresin de PLC1 que sugirieran que el sistema de transduccin mediado por los receptores del grupo I pudiera estar alterado, se realizaron ensayos enzimticos de actividad PLC en clulas controlesyexpuestasahipoxiamoderada. Como se observa en la Figura 65, la hipoxia moderada no produjo ningn efecto considerable en la actividadPLCbasal(Control:9,850,75;5%O22h:9,540,28;5%O26h:10,900,82;5%O224h:8,770,18 pmol/mgmin).
Figura65:Laexposicinahipoxiamoderadanoafectalaactividad PLCbasal.ClulasC6fueronexpuestasonoa5%O2durante2,6o24 horasantesderealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacin deIP3basal.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde,almenos, 3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleando distintospases.

C o 5% ntr o O l 5% 2 2 h 5% O2 6h O 2 2 4h

15

Actividad PLC basal (pmol/mgmin)

10

ro l h h h 5% O
2

on t

5%

5%

24

133

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

ApesardeellosecomprobsilacapacidaddelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatodelgrupoI de activar la enzima PLC se vea alterada en estas condiciones. As, como se expone en la Figura 66, no se aprecian diferencias significativas en la capacidad de Lglutamato, agonista de todos los mGlu, ni en la de (1S,3R)ACPD, agonista de los grupos I y II, de estimular el sistema de la PLC en clulas controles y en las sometidas a la hipoxia moderada. En todos los casos expuestos, la estimulacin de la PLC observada era estadsticamentesignificativaconrespectoasuvalorbasalmedido(almenos,p<0,05). Estosresultadosindicanque,apesardeloscambiosobservadosaniveldelnmerototaldereceptores en la superficie celular y de los detectados en la expresin gnica del receptor mGlu1, no se observan diferenciassignificativasenlacapacidaddelsistemadelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIdetransducir laseal,entendindosestacomounaumentodelahidrlisisdelfosfatidilinositoles.
140

Figura66:Laexposicina5%O2noafectaalafuncionalidadde

Actividad PLC (% del basal)

los receptores metabotrpicos del grupo I. Clulas C6 fueron


120

expuestas o no a 5% O2 durante 24 horas antes de realizar los ensayos enzimticos para la acumulacin de IP3. Se estudi el efectodelahipoxiamoderadasobrelafuncionalidaddelsistema

100

estimulado por LGlu 100 M, agonista endgeno de los receptores metabotrpicos, as como por (1S,3R)ACPD 1 mM, agonistadelosgruposIyIIdelosreceptoresmetabotrpicosde

80

glutamato. Los datos expuestos son las medias SEM de, al


C on 5% tro O l 5% 2 2h 5% O2 6 O h 2 2 4h

C on 5% tro O l 5% 2 2 h 5% O2 6h O 2 2 4h

menos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicado empleandodistintospases.

L-Glu 100 M

(1S,3R)-ACPD 1 mM

Como se ha comentado con anterioridad existen mltiples referencias bibliogrficas al aumento en la cantidad de adenosina en el medio extracelular como consecuencia de los procesos de hipoxia, por ello se intent comprobar si el efecto observado de la hipoxia moderada sobre el nmero total de receptores metabotrpicos de glutamato era debidoa un aumento en la cantidad de adenosina del medio extracelular. Del mismo modo que en los cultivos primarios de neuronas se aadi adenosina 1 M a las clulas C6 en condicionesnormxicasdurante2,6y24horas.LosdatosobtenidosenlosensayosdeunindeL[3H]Gluse exponenenlaFigura67. Losresultadosobtenidostraslostratamientosconadenosinaencondicionesnormxicasproporcionan valoressimilaresalosobservadosencondicionesdehipoxiamoderada.Enconcreto,seapreciaunaumento significativo del nmero total de receptores a nivel de la membrana plasmtica que se concreta en un incrementodeun116%tras2horas,un109%tras6horasydeun106%traslas24horasdetratamiento.Por otro lado, la afinidad de los receptores sobre su ligando tambin se ve alterada como consecuencia del tratamientodelasclulasC6conadenosina,asseobservaqueelparmetroKDaumentadeformasignificativa 3,3vecestras2horasdetratamiento,3,2vecestras6horasy3vecestraslas24horassobreelvalordetectado

134

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Resultados

encondicionesbasales.LacomparacinestadsticadelosvaloresobtenidosparaelparmetroBmxyKDenlos distintostratamientosconadenosinarevelaquenoexistendiferenciassignificativasentreellos. A
Bm ax (pmol/mg prot)

300

***

**

*
KD (nM)

**
2500 2000

**

200

1500 1000

100 500 0
2h 6h h C on tr ol 24 M M M

0
2h 6h C on tr ol M M M A do 1 24 h

A do

Figura67:Laexposicinaadenosinamodulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular.ClulasC6seexpusieronaadenosina 1Mdurante2,6o24horas.SerealizaronensayosdeuninderadioligandoempleandoL[ H]Glu.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes pases. Los parmetros cinticos calculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism 5.0.**p<0,01,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

Acontinuacinseexponeunatablaresumendelosresultadosobtenidos. Bmx(pmol/mg) KD(nM)


Tabla 24: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de radioligandos en clulas C6 expuestas a hipoxia moderda.Enestatablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.*p<0,05,**p<0,01, ***p<0,001significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.

Control 133,759,54 707,5944,45

A do

Adenosina1M2h 288,4730,22*** 2344,71368,49**

Adenosina1M6h 279,7331,72** 2231,58459,50*

A do

A do

A do

Adenosina1M24h 276,1155,50* 2126,69398,12**

EstosresultadossugierenqueenclulasC6ocurrenprocesosdetransmodulacinentrelosreceptores deadenosina,principalesresponsablesdemediarlasrespuestascelularescomoconsecuenciadelaexposicin aesteneuromodulador,ylosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato. Porotrolado,lacomparacinentrelosdatosobtenidosenlosensayosdeuninderadioligandoenlos experimentos de hipoxia moderada y los obtenidos en los tratamientos con adenosina revela que no hay diferencias significativas entre ellos, indicando que los cambios observados como consecuencia de la

135

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

exposicin celular a una presin parcial de oxgeno menor eran causados por un aumento de lacantidad de adenosinaenelmedioextracelular.Unagrficaresumendelacomparacindeestosvaloresseexponeenla Figura 68. En el panel A se expone una comparacin en los valores obtenidos para el nmero total de receptores,enelpanelB,paralaafinidaddelosmismos. A
Bm ax (pmol/mg prot)
350

5% O2

B
5% O2 ADO 1 M
2500

ADO 1 M

300

KD (nM)
h h

2000

250

1500

200

1000

24

Figura68:ComparativaentrelosparmetroscinticosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandoalsometerlasclulasC6 a5%O2obienaadenosina1M.LosdatosexpuestosprovienendelasTablas23y24.ComparativadelosvaloresdeBmax(panelA)yde losvaloresdeKD(panelB).

c) Receptoresdeadenosina.

ComosehaexpuestoenMtodos,lacuantificacindelosreceptoresdeadenosinaserealizmediante latcnicadeuninderadioligando,talycomosehaexpuestoanteriormente. Se determin para los receptores A1 de adenosina que la hipoxia moderada, durante 2, 6 y 24 horas, producaasuvezunadisminucindeladensidaddereceptoresdeestetipoenlasuperficiecelular(Figura69, panel A). Dicha disminucin, se corresponda con la prdida de un 60% de los receptores A1 (panel B) e iba asociadaconunaumentoenlaafinidaddelosmismos(panelC).Porotrolado,noseobservarondiferencias significativas al analizar el efectode lahipoxia moderada sobre los receptoresA1 entre los distintos tiempos ensayados. Una vez observado el efecto de la hipoxia a nivel de la superficie celular se procedi a analizar la funcionalidad de los receptores. Como se ha descrito en la Introduccin, la principal va de transduccin de sealesmediadaporelreceptorA1eslainhibicindelaenzimaadenilatociclasaatravsdeunaprotenaGi/o, porestemotivoseestudielefectodelahipoxiamoderadasobrelacapacidaddetransduccindelreceptor A1. Como se observa en la Figura 70, panel A, la hipoxia produca una disminucin del nivel basal de AMPc similarentodoslostiemposdeestudio(Control:1,120,11;5%O2:2h:0,50,08,p<0,001;6h:0,470,09, p<0,001; 24h: 0,55 0,2 pmol/mg prot min, p<0,01). Por otro lado, el empleo de forskolina para estimular directamentelaenzimanomostrabadiferenciassignificativasentrelasituacincontrolylahipoxiamoderada.

136

24

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC A
0.4 Unin especfica [3H]DPCPX (pmol/mg prot)
Control 2h 6 h hipoxia 24 h

Resultados

Figura 69: La exposicin a hipoxia moderada modula los receptores A1 en la superficie celular. Clulas C6 se expusieron a 5% O2 durante 2, 6 o 24 horas. Se realizaron ensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]DPCPX.Los
3

0.3

0.2

datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando

0.1

diferentes cultivos (panel A). Los parmetros cinticos calculados, Bmax (panel B) y KD (panel C), se obtuvieron a

0.0

10

15
3

20

25

30

35

40

45

partir de los resultados experimentales empleando el software GraphPad Prism 5.0. *** p<0,001

[ H]DPCPX, nM

significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

600

C
20

Bm a x (fmol/mg prot)
500

KD (nM)

400 300 200

15

*** *** ***

10

*** ***

***

100

0 A
Basal Fors Actividad AC basal (pmol/mgmin)
4

Control

2h

6h

24 h

Control

2h

6h

24 h

5% O2

5% O2

Actividad AC inhibida por CHA (% de Forsk)

B
70 60 50 40 30 20 10 0

Actividad AC inhibida por CHA (% de Forsk)


100

C
###

++

75

50

*** *** **
0

25

on tr ol

0h

2h

6h 24 h

0h

2h

6h 24 h

Forsk

Forsk +CHA

5% O2

5% O2

5% O2

Forsk +CHA +DPCPX

Figura70:EfectodelahipoxiamoderadasobrelaactividadACbasalysuinhibicinmediadaporelreceptorA1.Laacumulacinbasalde AMPcascomolaestimuladaporforskolina5M(Fors)fueestudiadaenclulasC6expuestasahipoxiamoderadadurante2,6y24horas yclulasC6controles(panelA).SeestuditambinelefectodelahipoxiamoderadasobrelainhibicindelaactividadACporelreceptor A1 (panel B), empleando el agonista especfico CHA a 1 mM para inhibir la actividad estimulada por forskolina 5 M. Por ltimo, se comprobqueel efectoobservado seproducaatravsdelreceptorA1,paraelloseempleDPCPX100M,antagonistaespecficodel receptorA1,durantelos5minutospreviosysemantuvoduranteelensayodeacumulacin(panelC).Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos pases. ** p<0,01, *** p<0,001 significativamentediferentedelvalorennormoxia;++p<0,01y###p<0,001,valorentregrupossignificativamentediferente.

24

137

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

EnloquerespectaalacapacidaddelreceptorA1parainhibirestavadetransduccin,comoseobserva enelpanelBdelamismafigura,noseveaalteradaporelefectodelahipoxiamoderada(Control:441,9;5% O2: 2h: 45 4,6; 6h: 50 4,2; 24h: 48,5 11,4%), a pesar de la disminucin en el nmero de receptores observada.Porotrolado,secomprob(panelC)queelefectoinhibidordelligandoCHAsobrelaactividadAC eramediadoporelreceptorA1,yaqueelempleodelantagonistaespecficoparaA1DPCPXbloqueabadicho efecto. En la Introduccin se apunt que otra va secundaria de transduccin de seales mediada por el receptorA1eralaactivacindelafosfolipasaCconelconsiguienteaumentodelcalciointracelular.Dadoquea pesardeladisminucintannotabledereceptoresA1porcausadelahipoxianoseobservabanalteracionesen el sistema de transduccin receptor A1 protena Gi/o AC, comprobamos la capacidad de transduccin a travsdelsistemaPLCencondicionesnormxicas.ParaelloseempleFluo4,unasondasensiblealcalciolibre intracelular. Como se observa en la Figura 71, panel A, en condiciones normxicas slo cuando se aada (S)DHPG, agonista especfico del subgrupo I de los receptores metabotrpicos de glutamato, acoplados principalmente al sistema PLC, se observaba un aumento del calcio intracelular, mientras que el agonista especfico del receptor A1, CHA, no era capaz de estimular el sistema PLC a las distintas concentraciones ensayadas.Porotrolado,enelpanelBdelamismaFigura,semuestralabateradeconcentracionesensayadas delosagonistasespecficosdelreceptorA1,CHAyCPA,ytambinelcontrolpositivodel(S)DHPG,queasegura la validez del ensayo. Estos resultados sugieren que la va de transduccin principal de los receptores A1 en clulasC6eslainhibicindelaadenilatociclasaynoelaumentodecalciointracelularatravsdePLC. ConelfindecomprobarelefectodelahipoxiamoderadasobrelosreceptoresA2Aseuslatcnicade unin de radioligandos, empleando en este caso [3H]ZM241385 como ligando marcado y teofilina fra para medir la unin inespecfica. Como se muestra en la Figura 72, panel A, la hipoxia moderada produce un aumentodelosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular.ComoseobservaenelpanelB,elaumentodescritoes, aligualqueenelcasodelosreceptoresA1,independientedeltiempodetratamientoyempiezaaobservarsea tiempos tan cortos como 2 horas. Dicho aumento se corresponde aproximadamente con un incremento del 60%delnmerototaldereceptoresenlasuperficiecelular(Control:399,016,6;5%O2:2h:655,045,5;6h: 657,029,9,p<0,001;24h:679,042,4fmol/mgprot,p<0,001). Sin embargo, en esta ocasin el aumento del nmero de receptores no se corresponde en todos los casosconunavariacindelaafinidaddelosmismos,comoseexponeenelpanelCdelamismaFigura.Tras2 horasdehipoxiamoderadaseobservaronvariacionessignificativasenelnmerototaldereceptoresperono en la afinidad de los mismos. Sin embargo, a tiempos ms prolongados de tratamiento s se observaban cambiosenlaafinidad.Enestecasoelaumentoenelnmerototaldereceptoresvenaacompaadoporuna disminucinenlaafinidaddelosmismosporsuligando(p<0,05enamboscasos).

138

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC
80 A

Resultados B

Fluorescencia (unidades arbitrarias)

70 60 50 40 30 20 10 0 0

Fluorescencia (unidades arbitrarias)

100 M DHPG 1 M CHA 10 M CHA 1 mM CHA

50 DHPG 40 CHA CPA 30


10 20 30 40 50

20

10

-8

-7

-6

-5

-4

-3

tiempo despus de la aplicacin, (s)

[ligando], M

Figura 71: Movilizacin del calcio en clulas C6. Clulas C6 mantenidas en condiciones normxicas se incubaron con diferentes concentraciones de DHPG, agonista del grupo I de los receptores mGlu, CPA y CHA, agonistas del receptor A1. Panel A. Cambios en la fluorescenciamedidoseneltiempodesdeelmomentodeaplicacindelligando.LosresultadossonlamediaSEMdelseguimientode40 clulas.PanelB.Respuestadelamovilizacindecalciomedidacomoelincrementomximodelasealfluorescenteconeltiempo.Los datosrepresentanlamediaSEMdetresexperimentosenlosqueseemplearondistintospases.

A
control

Figura 72: La exposicin a hipoxia moderada modula los receptores A2A en la superficie celular. Clulas C6 se expusieron o no a 5% O2 durante 2, 6 o 24 horas. Se realizaron ensayos de unin de radioligando empleando [ H]ZM241385.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde
3

Unin especfica [3H]ZM241385 (pmol/mg prot)

2h

0.4

6h 24 h

hipoxia

0.3

0.2

3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes pases (panel A). Los parmetros

0.1

cinticos calculados, Bmax (panel B) y KD (panel C), se obtuvieron a partir de los resultados experimentales
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0.0

empleando el software GraphPad Prism 5.0. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 significativamente diferente con respectoalcontrol.

[3H]ZM241385, nM

B
Bm ax (fmol/mg prot)

800

700
600 500 400 300

***

***

***
KD (nM)

35 30 25 20 15 10 5 0

200
100

ol

ol

24

on

5% O2

on

5% O2

24

tr

tr

139

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

TambinsecomproblafuncionalidaddelsistemadetransduccinmediadoporelreceptorA2A,esto es, la activacin de la enzima adenilato ciclasa a travs de una protena Gs. Para ello, se emplearon los siguientesligandos:CGS21680,agonistaespecficodeA2A,cuyaselectividadporlossitiosA2Ayahaquedado demostradaenapartadosanterioresdelapresenteMemoria,yNECA,unagonistageneraldelosreceptoresA2 que,empleadoa100M,sedemostrconanterioridadquetenapreferenciaporlossitiosA2BenclulasC6 (Castillo y col., 2007). Como se muestra en la Figura 73, la hipoxia moderada produce un aumento de la capacidadestimuladoradeambosligandossobrelaenzimaACconrespectoalascondicionesnormxicas.As, paraCGS21680elincrementoporcentualdelaestimulacinfuedeun15212%encondicionesnormxicasy pasalossiguientesvalorestraslaexposicinahipoxiamoderada:2h,29157%,p<0,05;6h,27434%, p<0,01;24h,33993%,p<0,05.Porotrolado,losvaloresobtenidosparalaestimulacinproducidaporNECA incrementarondeun1243%alossiguientesvalores:2h,22423%,p<0,01;6h,35299%,p<0,05;24h, 36040%,p<0,01.
Figura 73: Efecto de la exposicin a hipoxia moderada sobre la actividad AC estimulada por los receptores A2. Clulas C6 fueron expuestasonoa5%O2durante2,6o24horasantesderealizarlos
Actividad AC (% del basal)
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

* * ** **

* **

ensayos enzimticos para la acumulacin de AMPc. Se estudi el efectodelaexposicinahipoxiamoderadasobrelaestimulacinde laactividadACpromovidaporelreceptorA2A,paraloqueseemple el agonista especfico CGS 21680 a 1 M, as como la capacidad estimuladoradeNECAa100M.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos pases, expresados porcentualmente con respecto a la actividad AC basal. * p<0,05, ** p<0,01 significativamentediferentedesucorrespondientecontrol.

24

24

CGS 21680

NECA

Aligualqueenapartadosanterioresseempleadenosina,aunaconcentracinfinalde1M,conelfin decomprobarsilaregulacindelosreceptoreseradebidaalaumentodelosnivelesdeadenosina. EnelcasodelreceptorA1,lamedidadeladensidaddereceptoresensuperficie,ascomodesuafinidad, proporcion,traslostratamientosconadenosina,valoressimilaresdeBmaxyKDalosobtenidostrassometera las clulas a hipoxia moderada durante los mismos tiempos. Como se muestra en la Figura 74, panel A, el tratamiento con adenosina produce una disminucin del nmero de receptores A1 en la superficie celular, tanto a2,6y24horas de tratamiento.Enel panel B se representan los datos obtenidos para la Bmax de los receptoresA1traslostratamientosconadenosina(Control:539,937,8;adenosina:2h:272,049,4,p<0,001; 6h:225,040,1,p<0,001;24h:191,04,3fmol/mgprot,p<0,001).Porsuparte,elanlisisdelosdatosdela afinidadreflejaqueexisteunaumentosignificativodelaafinidaddelosreceptoresA1(Control:18,41,5nM; adenosina: 2h: 9,7 1,6 nM, p<0,01; 6h: 7,9 1,8 nM, p<0,01; 24h: 5,7 0,4 nM, p<0,001), siendo esta variacin,aligualquelaobservadaenlaBmax,independientedeltiempodetratamiento.

140

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC A
Unin especfica [3H]DPCPX (pmol/mg prot)

Resultados

0.3

Control 2h 1 M Ado 6h 24 h

Figura74:Laexposicinaadenosinamodulalosreceptores A1 en la superficie celular. Clulas C6 se expusieron a adenosina1Mdurante2,6o24horas.Posteriormentese

0.2

realizaron ensayos de unin de radioligando empleando [ H]DPCPX. Los datos expuestos son las medias SEM de 3
3

0.1

experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes pases (panel A). Los parmetros cinticos calculados, Bmax (panel B) y KD (panel C), se

0.0

10
3

15

20

obtuvieron a partir de los resultados experimentales empleandoelsoftwareGraphPadPrism5.0.**p<0,01,*** p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

[ H]DPCPX, nM

B
600

C
20

Bm ax (fmol/mg prot)

500 400 300 200

***

KD (nM)

15

***

**
10 5

***

** ***

100 0

h h h C on tr ol 2 6 24

C on tr ol

1 M adenosina

1 M adenosina

Aunque no estaba descrita la regulacin al alza de los receptores A2A como consecuencia de un tratamientoconagonista,alaluzdelosdatosobtenidosparaelreceptorA1enC6sedecidiinvestigarqu efecto tena el tratamiento con adenosina en estos receptores. As, como muestra la Figura 75, panel A, el tratamientoconadenosinaproduca,aligualquelaexposicinahipoxiamoderada,unincrementodelnmero total de receptores en la superficie celular a todos los tiempos ensayados. Los datos que se desprenden del anlisis estadstico de los valores de Bmax obtenidos, panel B, (Control: 399,0 16,6; adenosina: 2h: 589,0 66,0, p<0,05; 6h: 618,0 46,3, p<0,01; 24h: 760,0 39,9 fmol/mg prot, p<0,001) indican que adems este aumento es similar al observado tras las exposiciones a hipoxia moderada e independiente del tiempo de exposicinaadenosina.Sinembargo,enelcasodelaafinidaddelreceptorA2Aporsuligando,panelC,nose observ ningn efecto significativo (Control: 18,0 3,0; adenosina: 2h: 17,4 1,6, p>0,05; 6h: 14,4 2,7, p>0,05;24h:16,80,7nM,p>0,05)

24

141

Resultados A
0.4
Unin especfica [3H]ZM241385 (pmol/mg prot)
Control 2h 1 M Ado 6h 24 h

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Figura75:Laexposicinaadenosinamodulalosreceptores A2A en la superficie celular. Clulas C6 se expusieron a adenosina1Mdurante2,6o24horas.Posteriormentese realizaron ensayos de unin de radioligando empleando
3

0.3

0.2

[ H]ZM241385.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde 3 experimentos independientes realizados por duplicado

0.1

empleando diferentes cultivos(panel A). Los parmetros cinticos calculados, Bmax (panel B) y KD (panel C), se

0.0

10
3

15

20

25

obtuvieron a partir de los resultados experimentales empleando el software GraphPad Prism 5.0. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 significativamente diferente con respectoalcontrol.

[ H]ZM241385, nM

800

C
20

*** * **
KD (nM)
h
15

Bm ax (fmol/mg prot)

700 600 500 400

10

300 200 100 0 5

h C on tr ol 2 6 h

C on tr ol

1 M adenosina

24

1 M adenosina

Estosresultadossugeranqueelincrementodeadenosinaenelmedioextracelulareselresponsablede la modulacin en sentido inverso de los receptores A1 y A2A de adenosina. Con el fin de confirmar esta hiptesis,seemplelaenzimaadenosinadesaminasa(EC3.5.4.4,ADA),enzimadelavadelarecuperacinde laspurinasquecatalizaladesaminacinirreversibledelaadenosinaparaformarinosinayqueeliminara,por tanto,laadenosinadelmediodecultivo.Serealizaronensayospuntualesdeuninderadioligandoenlosque seestudisilaadicindeADA(2U/mL)durantelosperiodosdehipoxiamoderadaerasuficienteonopara revertirelefectodelahipoxiasobreladensidaddelosreceptores. Dadoqueelefectodelahipoxiasobreladensidaddereceptoresnoeradependientedeltiempo,estos experimentos slo fueron llevados a cabo a dos horas de exposicin. Como se muestra en el panel A de la mencionada figura, en el caso de los receptores A1, la exposicin a la enzima mientras se mantenan a las clulas en hipoxia devolva los niveles de receptores A1 a valores similares a los obtenidos en la situacin control, observndose, adems, que en condiciones normxicas la incubacin con ADA no produca efecto algunosobrelacantidaddereceptoresA1enlasuperficiecelular(Normoxia:0,340,02;Normoxia+ADA:0,33 0,03;Hipoxia:0,150,02;Hipoxia+ADA:0,380,03fmol/mgprot).

142

24

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC A
Unin especfica [ 3H]DPCPX (pmol/mg prot)

Resultados

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

++

B
Unin especfica [ 3H]ZM241385 (pmol/mg prot)
0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
ia

**

**

ox ia

2h

A D

+A D

A D

2h

N or m

N or

ox ia

ox ia

2h

5%

5%

N or m

N or m

5%

Figura 76: Efecto de la adenosina desaminasa durante la hipoxia. Clulas C6 se mantuvieron en condiciones normxicas o hipxicas durante2horasenpresenciaoausenciade 2 U/mL deADA.Posteriormenteserealizaronensayospuntualesdeuninderadioligando, siguiendoelprocedimientodescritoenMtodos,empleando[ H]DPCPXa20nM,paramedirlamodulacindelosreceptoresA1(panelA), y [ H]ZM241385 a 20 nM, para medir la modulacin de los receptores A2A (panel B). Los datos representan la media SEM de tres experimentosenlosqueseemplearondisintospases.**p<0,01significativamentediferentedelvalorobservadoennormoxia;+p<0,05, ++p<0,01significativamentediferentedelvalorobservadoenhipoxiamoderadasinADA.
3 3

ElestudiodelosreceptoresA2Aenlasmismascondicionesarrojresultadossimilaresalosobtenidos para el receptor A1, como se expone en el panel B de la misma Figura. De nuevo, el tratamiento con ADA durantelahipoxiadevolvalosnivelesdelreceptorA2Aalosobservadosdurantelanormoxia,mientrasquela enzimaADAporssolanoejercaningnefectoreguladorsobreestetipodereceptoresenlasituacincontrol (Normoxia:0,210,01;Normoxia+ADA:0,210,04;Hipoxia:0,300,02;Hipoxia+ADA:0,170,03fmol/mg prot). Conelfindeahondaranmsenelmecanismoresponsabledelaregulacindeestosreceptores,dado quehaquedadodemostradoquelaliberacindeadenosinadurantelahipoxiaestimplicadaenlamodulacin delosdossubtiposdereceptoresestudiadosypuestoque,adems,estosreceptoresdebenserlosprincipales sensores de dicho nuclesido en el medio, se recurri al empleo de antagonistas especficos de ambos receptoresparaverificarsilaadenosinaejercasuefectodirectosobrealgunodeellos. Aligualqueenlosexperimentosdescritosconanterioridad,estosensayossloserealizaronconclulas sometidas a 2 horas de hipoxia moderada, ya que la variacin de la densidad de receptores no era significativamentediferenteentresteylosotrostiemposdeexperimentacin.ComoseexponeenlaFigura 77, panel A, la presencia de DPCPX, antagonista especfico de los receptores A1, de ZM241385, antagonista especficodelosreceptoresA2A,odeambos,noproducaningnefectosobreelensayopuntualdeuninde uninde[3H]DPCPXtrasdoshorasdeincubacinennormoxia.Sinembargo,lapresenciadeDPCPXcuandose sometan las clulas a hipoxia, ya fuera slo (Hipoxia + DPCPX: 0,33 0,05 fmol/mg prot) o en presencia de ZM241385(Hypoxia+DPCPX+ZM241385:0,320,05fmol/mgprot),mantenalosvaloresparalaunindel

5%

2h

A D

ox

143

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

radioligandoenvaloressimilaresalosobtenidosencondicionesdenormoxia(Normoxia:0,340,02fmol/mg prot).Porsuparte,elligandoZM241385noejercaningnefectoporssoloenlamodulacindelosreceptores porlahipoxiamoderada. A


Unin especfica [ 3H]DPCPX (pmol/mg prot)

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

B
Unin especfica [ 3H]ZM241385 (pmol/mg prot)
0.5

**

*
+ +

**
0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

*
++ +

DPCPX 10 M ZM241385 10 M

+ -

+ +

+ -

+ +

DPCPX 10 M ZM241385 10 M

+ -

+ +

+ -

+ +

Normoxia

5% O2

Normoxia

5% O2

Figura77:Lamodulacindelosreceptoresdeadenosinadurantelahipoxiamoderadaseproduceatravsdelaactivacindelreceptor A1. Clulas C6 se mantuvieron en condiciones normxicas o hipxicas durante 2 horas en presencia o ausencia de DPCPX a 10 M, antagonistaespecficodelreceptorA1,deZM241385a10M,antagonistaespecficodelreceptorA2A,odeunacombinacindeambos ligandos. Posteriormente se realizaron ensayos puntuales de unin de radioligando, siguiendo el procedimiento descrito en Mtodos, empleando [ H]DPCPX a 20 nM, para medir la modulacin de los receptores A1 (panel A), y [ H]ZM241385 a 20 nM, para medir la modulacindelosreceptoresA2A(panelB).LosdatosrepresentanlamediaSEMdetresexperimentosenlosqueseemplearondisintos pases.*p<0,05,**p<0,01significativamentediferentedelvalorobservadoennormoxia;+p<0,05,++p<0,01significativamentediferente delvalorobservadoenhipoxiamoderada.
3 3

Por otro lado, cuando se realizaron estos mismos experimentos empleando [3H]ZM241385 como radioligando,losresultadosobtenidosfueronsimilarestrasdoshorasdetratamiento,comosemuestraenel panel B. Por un lado, el empleo de los antagonistas descritos no ejerca ningn efecto sobre el nmero de receptores A2A en condiciones normxicas. Sin embargo, la presencia de antagonistas durante la hipoxia indicabaqueelbloqueodelosreceptoresA1duranteesteprocesobloqueabaasuvezelefectodelahipoxia sobre los receptores A2A, ya fuera slo (Hipoxia + DPCPX: 0,17 0,05; Hipoxia: 0,30 0,02 fmol/mg prot; p<0,05)ocombinadoconZM24135(Hipoxia+DPCPX+ZM241385:0,190,02fmol/mgprot),mientrasque,de nuevo,elempleodeZM241385noinducasobrelasclulascambiosdiferentesalosyaobservadosdurantela hipoxia(Hipoxia+ZM241385:0,310,03fmol/mgprot). EstosresultadosestudiadosenconjuntoindicanquelahipoxiamoderadamodulalosreceptoresA1yA2A deadenosinaatravsdelaactivacindelreceptorA1. Porltimo,secomprobmediantePCRatiemporealelefectoqueejercalahipoxiamoderadasobrela expresingnicadelosreceptoresdeadenosina,ascomoenlaexpresindealgunosfactoresdetranscripcin

144

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

Resultados

relacionados con la hipoxia o el AMPc. Como se observa en la Figura 78, la hipoxia moderada no modula la expresindeningunodelosgenesquecodificanparalosreceptoresdeadenosina.
Figura78:Efectodelaexposicina hipoxia moderada sobre la

Mean fold change in gene expression

2.5

expresin gnica de los receptores de adenosina. Clulas C6 fueron expuestasa5%O2durante2,6o24 horas o se mantuvieron en

2.0

1.5

condicionescontrol(0h)conelfinde aislar su ARN. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes

1.0

0.5

realizadosporduplicadoempleando distintasmuestras.

0.0

0 2 6 24 A1

0 2 6 24 A2A

0 2 6 24 A2B

0 2 6 24 A3

Porotrolado,enloquealaexpresingnicadefactoresdetranscripcinserefiere,losresultadosse resumenenlaFigura79.ComoseobservaenlacitadaFigura,noexistenvariacionessignificativasenHIF1,el principalmoduladordelosefectosdelabajadadeoxgeno,loqueconcuerdaconloobservadoporWestern blot(datosnomostrados),mientrasqueparaHIF3,unreguladornegativodeHIF1,loqueseobservaes una disminucin aparente, aunque no significativa, de su expresin gnica. En lo que a los factores relacionadosconelAMPcserefiere,losfactoresdetranscripcinconstitutivosCREByCREM,loqueseobserva esunadisminucinsignificativadelaexpresingnicadeambosatodaslashorasestudiadas.
Figura79:Efectodelaexposicin

1.5

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

HIF-1 HIF-3 CREB CREM

a hipoxia moderada sobre la expresin gnica de los factores HIF1, HIF3, CREB y CREM. Clulas C6 fueron expuestas a 5% O2 durante 2, 6 o 24 horas o se mantuvieron en condiciones

1.0

* * *
0.5

control(0h) con elfindeaislarsu

* **

ARN. Los datos expuestos son las

**

medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05, ** p<0,01

0.0

significativamente diferente con respecto al correspondiente

0h

2h

6h 24 h

0h

2h

6h 24 h

0h

2h

6h 24 h

0h

2h

6h 24 h

control.

145

Resultados

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC

LamodulacindelosreceptoresA1yA2AdeadenosinaenelmodelodeC6fuepublicadaconelttulo ModulationofadenosineA1andA2AreceptorsinC6gliomacellsduringhypoxia:involvementofendogenous adenosineenlarevistaJournalofNeurochemistry(2008)105:23152329. d) Tablaresumen. Acontinuacinseexponendostablasamododeresumenconlasprincipalesvariacionesobservadasen los experimentos descritos en este apartado. La primera (Tabla 25) recoge las variaciones observadas en los experimentosempleando5%O2,enlasegunda(Tabla26)enlosqueseempleadenosina.
Viabildad Bmaxunin L[ H]Glu KDunin L[ H]Glu ARNmmGlu1 ARNmPLC1 ActividadPLC basal ActividadPLC grupoI Bmaxunin [ H]DPCPX KDunin L[ H]DPCPX Bmaxunin [ H]ZM241385 KDunin [ H]ZM241385
3 3 3 3 3 3

5%O2 2h

5%O2 6h

5%O2 24h

ARNmA1 ARNmA2A

5%O2 2h

5%O2 6h

5%O2 24h

ARNmA2B ARNmA3 ActividadACbasal ActividadA1/AC ActividadA2A/AC

ARNmHIF1

ARNmHIF3

ARNmCREB

ARNmCREM

Tabla25:ResumendelosresultadosobtenidosenclulasC6expuestasahipoxiamoderada.Enestatablaseexponengrficamentelos resultados numricos descritos en este captulo. , no hay variacin estadstica, , se observa un aumento con respecto a la situacin control,,seobservaunadisminucinconrespectoalasituacincontrol.

146

EfectodelahipoxiasobrelasclulasdelSNC
BmaxuninL[ H]Glu KDuninL[ H]Glu Bmaxunin[ H]DPCPX KDunin[ H]DPCPX Bmaxunin[ H]ZM241385 KDunin[ H]ZM241385
3 3 3 3 3 3

Resultados ADO1M6h ADO1M24h

ADO1M2h

Tabla26:ResumendelosresultadosobtenidosenclulasC6expuestasahipoxiamoderada.Enestatablaseexponengrficamentelos resultados numricos descritos en este captulo. , no hay variacin estadstica, , se observa un aumento con respecto a la situacin control,,seobservaunadisminucinconrespectoalasituacincontrol.

IV.4Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide. IV.4.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza. En 2005 fue publicado por este grupo de investigacin, en colaboracin con el grupo del Dr. Isidre Ferrer, un trabajo en el que se relacionaba la cantidad total de receptores metabotrpicos de glutamato en membrana plasmtica de homogenados de corteza frontal de cerebro humano con la progresin de la enfermedaddeAlzheimer,enconcretoseobservabaquesegnavanzabalaenfermedadmenoreralacantidad de receptores metabotrpicos de glutamato detectada (Albasanz y col., 2005). El objetivo de los trabajos expuestosenelsiguienteapartadofueconfirmarestosresultadosempleandouncultivoprimariodeneuronas decortezadecerebroderata,conelfindeestudiar,enlamedidaenlaquefueraposible,cuntoscambiosde losdescritoseranatribuiblesalasneuronascorticales,almenosinvitro. a) Viabilidad. El primer paso consisti en describir el modelo de toxicidad in vitro a emplear. En todos estos experimentos no se emple el pptido amiloide completo, cuyas acumulaciones son caractersticas en la enfermedad de Alzheimer, sino que se emple slo la fraccin del pptido que contena el efecto txico del pptidocompleto(Yanknerycol.,1990).stacomprendalosaminocidosquevandel25al35(A2535)delos cuarentaydosqueconstituyenelpptidoamiloideencontradoendichasacumulaciones. Se comprob con un gradiente de concentraciones la toxicidad que ejerca la exposicin a A2535 en cultivotras24horasdeincubacin.ParaelloserecurrialtestdeviabilidadbasadoenlacolorimetradelMTT ylosresultadosobtenidosparaestascondicionesseexponenenelpanelAdelaFigura80.Comosemuestra,la

147

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

exposicinaA2535producaunadisminucindelaviabilidaddependientedelaconcentracin,aunquesloel empleo de las dos concentraciones ms altas proporcionaba resultados estadsticamente significativos. As, cuandoseempleabalaconcentracinde25Mladisminucinenlaviabilidaderadeun32%,mientrasque paralaconcentracinde50Mlaviabilidaddisminuaun35%(Control:100,006,85;A2535:1M:89,27 4,99;10M:78,376,97;25M:67,803,20,p<0,01;50M:65,154,02,p<0,01). Apartirdeestosresultadossedecidiquelaconcentracinptimaparaobservarunefectotxicocomo consecuenciadelaexposicindeneuronascorticalesaA2535invitroeralade25M.Dadoqueeltrabajode investigacin antes comentado observaba diferencias entre los grados de avance de la enfermedad de Alzheimeryelniveldereceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular,seintentemularelprogresodela enfermedad in vitro mediante exposicin prolongada al fragmento txico. Se establecieron por tanto dos tiempos de incubacin sobre los que se realizaran los experimentos posteriores: un tiempo de exposicin medio,24horas,yuntiempodeexposicinprolongado,48horas. A
Viabilidad (% respecto al control)

110

B
100

*** ***

Viabilidad (% respecto al control)

100 90 80 70 60

80 60 40 20 0

**

**

0
ol M M M M C on tr 10 1 25 50

ol

C on tr

24

-3 5

25 -3

25 -3

25 -3

25

-3 5

24 horas
Figura80:LaexposicinaA2535disminuyelaviabilidadcelulardeformadependientedelaconcentracinydeltiempodeexposicin. NeuronascorticalesseexpusieronadistintasconcentracionesdeA2535durante24horas(panelA)yaA253525Mdurante24y48horas (panelB).TranscurridoestetiemposemidilaviabilidadcelularmedianteeltestbasadoenMTT.Losdatosexpuestossonlasmedias SEMde3experimentosindependientesrealizadosportriplicado,expresadosporcentualmenteconrespectoalaviabilidaddelasclulas controles.**p<0,01,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol;p<0,05diferenciassignificativasentregrupos.

Los experimentos de viabilidad realizados empleando estos dos tiempos de exposicin y la concentracin final de 25 M para el fragmento txico se exponen en el panel B de la Figura 80. Como se observaenlacitadaFiguraexistendiferenciassignificativasenlaviabilidadobservadacuandoseprolongabael tiempodeexposicinaA2535de24(%viabilidad:A253525M24h:64,753,83,p<0,001)a48horas(A2535 25 M 48h: 50,39 3,23%, p<0,001), siendo adems estos valores significativamente diferentes entre s (p<0,05).

148

25

25

-3 5

25

25

48

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

El ltimo paso para corroborar la validez del modelo de toxicidad descrito fue emplear el pptido amiloide completo a la misma concentracin a la que se emple el fragmento 2535 en los experimentos anterioresyalmismotiempoenensayosdeviabilidadsobreneuronascorticales.Losresultadosobtenidosse exponen en la Figura 81. Como se observa, la incubacin de neuronas corticales con A2535 produce una disminucinsignificativaenlaviabilidaddelasmismasdeun32%(%viabilidad:Control:100,002,81;A142 25M24h:63,587,70%,p<0,001).
Viabilidad (% respecto al control)
110 100 90 80 70 60

Figura 81: La exposicin a A142 disminuye la viabilidad celular de forma similar a la exposicin a A2535. Neuronas corticales se expusieronaA14225Mdurante24horas.Transcurridoestetiempo semidilaviabilidadcelularmedianteeltestbasadoenMTT.Losdatos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por triplicado, expresados porcentualmente con respecto a la viabilidad de las clulas controles. ** p<0,01 significativamente diferenteconrespectoalcontrol.

**

0
ol C on M 24 h tr

Esteltimoresultadoesprcticamenteidnticoalobtenidocuandoseempleelfragmento2535,lo quecorroboralahiptesisdequelatoxicidaddelpptidoamiloideseencuentraenesos10aminocidos. De forma adicional se comprob si este efecto txico detectado ocurra como consecuencia de la activacindelarutadelascaspasas.SeestudielefectoqueejercalaexposicinaA2535sobrelacaspasa3, protenaencuyaactivacinconvergenlasvasdemuertecelularapopttica.Paraelloserealizarondostipos deestudios,elprimerodeellosaniveldelaexpresingnicayelsegundoaniveldelaactividadproteolticade lapropiaenzima.
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

Figura82:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresinde caspasa3.NeuronascorticalesfueronexpuestasaA253525M durante24o48horasosemantuvieronencondicionescontrol conelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiempo real se realizaron empleando una sonda especfica para el gen codificanteparalacaspasa3.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05

142

25

significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

0
h C on tr ol 24 M M A 25 48 h

25

149

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

LosresultadosobtenidosparalosensayosdeRTPCRatiemporealempleandosondasespecficaspara elgenquecodificaparalacaspasa3,seexponenenlaFigura82.Comoseobserva,laexposicindeneuronas corticales a A2535 in vitro induce un aumento en la expresin gnica de la caspasa 3, aumento que se corresponde con incrementos del 160% tras 24 horas y del 161% tras 48 horas de exposicin al fragmento txico.Ambosresultadosfueronsignificativosestadsticamentecuandosecompararonconlasituacinbasal (p<0,05paraambos)peronocuandosecomparanentres. 2.0
Ratio de activacin Caspasa-3

1.5

*
Figura 83: Efecto de la exposicin a A2535 sobre la actividad de caspasa 3. Neuronas corticales fueron expuestas a A2535 25 M

1.0

durante 24 o 48 horas o se mantuvieron en condiciones control Posteriormente se realizaron ensayos de actividad enzimtica

0.5

especficos de caspasa 3 empleando el kit comercial descrito en Mtodos. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando

0.0
h on tr o 24 M M 48 h l

distintospases.*p<0,05significativamentediferenteconrespectoa laactividadbasal.

Por otro lado, la activacin de la capacidad proteoltica de caspasa 3 como consecuencia de la exposicinaA2535seexponeenlaFigura83.Paraesteestudio,seempleunensayocomercialbasadoenla emisin de fluorescencia al producirse el corte proteoltico especfico de la caspasa 3 sobre un pptido marcadoconunfluorforo,talycomosedescribeenMtodos.Comoseobserva,seapreciaunincremento significativodelaactividadproteolticadelacaspasa3tantoa24comoa48horasdetratamiento(p<0,05para ambos), incrementos que se correspondan con un aumento de actividad de un 55 y de un 59%, respectivamente,respectoalcontrol. Estosexperimentos,tomadosenconjunto,apuntanaquelaexposicinaA2535deneuronascorticales invitroinduceunaumentodelaexpresingnicaascomodelaactividaddelacaspasa3,talycomoerade esperar segn los antecedentes bibliogrficos, lo que valida definitivamente el diseo experimental de toxicidadporA2535empleado. b) ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato. UnavezdemostradalatoxicidadinvitroqueejercalaexposicinaA2535sobrelasneuronascorticales, se procedi a comprobar el efecto de esta misma exposicin sobre los niveles de los receptores metabotrpicos de glutamato en la superficie celular. Para ello, se realizaron ensayos de unin de radioligandosempleandoL[3H]Glu.LosresultadosobtenidosenestosensayosseexponenenlaFigura84.

150

25

25

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

ComosemuestraenlaFigura84,laexposicinaA2535producaunaumentosignificativodelnmero totaldereceptoresmetabotrpicossobrelosnivelesexpresadosensituacinbasal.Estasvariacionesdescritas setraducenenunincrementodel65%tras24horasdeexposicinyunincrementodel104%traslas48horas sobrelosvaloresdetectadosencondicionesbasales.Sinembargo,apesardequetras48horasdeexposicin seapreciabaunaumentoenelnmerototaldereceptoresdeun24%conrespectoalacantidadcuantificadaa las 24 horas, la comparacin estadstica de estos resultados determin que los valores no eran lo suficientementedistintoscomoparaserconsideradosestadsticamentediferentes,noobstante,estabanmuy cercadeserlo(p=0,059). Porotrolado,laexposicinaA2535tambinmodulabalaafinidaddeestosreceptoresporsuligando (panelB),enconcretoelparmetroKDdisminua,esdecir,laafinidadaumentaba,hastavalorescercanosala mitaddelobservadoencondicionesbasalestantoa24comoa48horasdeexposicin.Comoseexponeenla tablaresumen(Tabla27),estadisminucinerasignificativadesdeelpuntodevistaestadstico. Estos resultados demuestran que la exposicin a A2535 modula tanto la cantidad de los receptores metabotrpicoscomolaafinidaddeestosporsuligandoenlasuperficiecelulardeneuronascorticales. A
Bm x (pmol/mg prot)

1500

B
4000

*** ***
KD (nM)
3000

1000
0

2000

**

***

500 1000

0
h h h C on tr ol C on tr ol 24 24 M 48 M M M A 25
3

25

25

Figura 84: La exposicin a A2535 modula los receptores metabotrpicos en la superficie celular. Neuronas corticales se expusieron a A253525Mdurante24o48horas.Se realizaronensayosdeuninderadioligandoempleandoL[ H]Glu. Losdatos expuestossonlas medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticoscalculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPad Prism5.0.**p<0,01,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

25

48

151

Resultados Bmx(pmol/mg) KD(nM) Control

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide A253525M24h 952,388,74*** 1607,27423,00** A253525M48h 1178,2292,53*** 1522,25162,64***

577,2329,41 3117,9768,74

Tabla 27: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de radioligandos en neuronas corticales expuestas a A2535.Enestatablaseexponenlosresultadosnumricosobtenidosparaelclculodelosparmetroscinticos.**p<0,01,***p<0,001 significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.

Adems se estudi si la exposicin a A2535 induca cambios en la expresin gnica de los genes que codifican para los receptores metabotrpicos del grupo I y la PLC1. Los resultados obtenidos tras estos estudiosdePCRatiemporealseexponenenlaFigura85.
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)
2.5

2.0

mGlu1 mGlu5 PLC 1

2.5

2.0

1.5

* ** ***

1.5

1.0

1.0

0.5

0.5

0.0

0.0

on tr ol

on tr ol

ro l

48

24

24

48

24

h M A 25 M

25

25

25

on t

Figura85:EfectodelaexposicinaA2535 sobrelaexpresingnicademGlu1,mGlu5yPLC1.Neuronascorticalesfueronexpuestasa A253525Mdurante24o48horasosemantuvieronencondicionescontrolconelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRa tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintasmuestras.*p<0,05,**p<0,01,***p<0,001significativamente diferenteconrespectoalcontrol;p<0,01significativamentediferenteentregrupos.

Como se observa, la exposicin a A2535 produce cambios diferentes dependiendo de la parte del sistemaqueestudiemos.As,paraelgenquecodificaparaelreceptormetabotrpicodeglutamatomGlu1se apreciaunpatrnsimilaralquesedescribienelensayodeuninderadioligando:unincrementosignificativo delaexpresintras24horasdeexposicin,quesecorrespondeconunaumentodel32%sobrelaexpresin basal(p<0,05),y,trasprolongarlaexposicinhastaalcanzarlas48horas,esteaumentoalcanzabaelvalordel 99%sobrelaexpresinbasal(p<0,05).Lacomparacinestadsticadeestosdosgruposdedatosrevelabaque

152

25

25

48

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

entre la expresin detectada para mGlu1 tras 24 horas y la detectada tras 48 horas de exposicin existan diferenciassignificativas(p<0,01),locualnoresultasorprendentepuestoquelosdatosobtenidosa48horas suponen un incremento de la expresin de mGlu1 de un 50% con respecto a los obtenidos tras 24 horas de exposicin. Porotrolado,enelcasodelgencodificanteparamGlu5seapreciaquelaexposicinaA2535noinduce cambiosensuexpresingnicaenneuronascorticales,niamedionialargoplazo. Porltimo,enloqueserefierealaexpresindelaPLC1,seapreciaunadisminucindelamismacomo consecuencia de la exposicin a ste agente txico. As, 24 horas de exposicin suponen una disminucin significativadeun28%conrespectoalaexpresinbasal(p<0,01),mientrasqueatiemposmsprolongadosde exposicinsedetectaunadisminucindeun33%(p<0,001)conrespectoalbasal. Estos resultados indican que la exposicin a A2535 en neuronas corticales modula, en sentidos opuestos,laexpresingnicademGlu1yPLC1.EnelcasodelreceptormGlu1,lamodulacindesuexpresin gnicasigueelmismopatnqueeldescritoenlosensayosdeuninderadioligandos,loquesugierequeel receptormGlu1podraserunodelosresponsablesdelamodulacinenelnmerototaldereceptoresanivel delamembranaplasmticadescritaconanterioridad. Con el fin de ahondar ms en la regulacin sufrida por los receptores metabotrpicos de glutamato comoconsecuenciadelaexposicinaA2535,serecurrialempleodeanticuerposespecficosdirigidoscontra eptoposextracelularesdelosreceptoresmGlu1,mGlu5ymGlu2,3,ytambinseestudielcomportamientode la protena PLC1, segn los procedimientos descritos en Mtodos. Los resultados obtenidos en estos experimentos tras la exposicin de neuronas corticales a A2535 durante 24 horas, en comparacin con la situacincontrol,ascomoelanlisisestadsticodelosmismosseexponenenlaFigura86.EnelpanelA,se exponen micrografas representativas de las imgenes obtenidas en estos experimentos, en el panel B, se muestranlosresultadosobtenidosalcuantificarlafluorescenciadeestasimgenes.Acontinuacinsemuestra unatablaresumenconlasprincipalesobservaciones(Tabla28). ComosesepuedeobservarenlaTabla28,laexposicinaA2535moduladeformadistintalaexpresin delasdistintasprotenasestudiadas.As,enelcasodelosreceptoresdelgrupoI,mGlu1ymGlu5,acoplados principalmente a la hidrlisis de fosfatidilinositoles, se observa un aumento significativo en la densidad de ambosenlasuperficiecelular,loquecontrastaconelmarcadodescensoobservadoenlacantidadtotaldela enzima PLC1. Por otro lado, el caso de los receptores metabotrpicos del grupo II, mGlu2,3, se observa un marcadodescensodeladensidaddelosmismosenlasuperficiecelular,comoconsecuenciadelaexposicina A2535. Enresumen,losexperimentosdeinmunofluorescenciademuestranqueelaumentoenlacantidadtotal dereceptoresmetabotrpicosdeglutamatodetectadoporunindeL[3H]Gluesdebido,almenosenparte,al aumento en el nmero de receptores mGlu1 y mGlu5, y se encuentra contrarrestado por, al menos, la disminucindelosreceptoresquecomponenelgrupoII,mGlu2,3.Porotrolado,laprincipalenzimaalaque estnacopladoslosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI,laPLC1,seencuentradisminuida,loquesugiere

153

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

quelasealizacinmediadaporlosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIenestascondicionespodraestar alterada. A B
500000


Fluorescencia (unidades arbitrarias)
400000

mGlu1 mGlu5 mGlu2,3 PLC 1

300000

*** **

***

200000

100000

*
0
C on tr ol 25 M 24 h C on tr ol 25 M 24 h C on tr ol 25 M 24 h C on tr ol 25 M 24 h A

Figura86:InmunodeteccindemGluyPLC1traslaexposicinaA2535.PanelA.Micrografasrepresentativasdelosresultadosobtenidos tras los experimentos de inmunofluorescencia al emplear los anticuerpos para mGlu1, mGlu5, mGlu2,3 y PLC1 en neuronas corticales controlesyexpuestasaA253525Mdurante24horas.Labarrarepresenta62m.PanelB.Diagramadebarrasqueresumelosresultados expuestosenelpanelA.LascuantificacionesserealizaronusandoelsoftwareLASAFempleandounmnimode30camposporcondicin experimental. Se exponen las medias SEM obtenidas para cada condicin experimental. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

154

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

A253525M24h

mGlu1 ***

mGlu5 **

mGlu2,3 *

PLC1 ***

Tabla28:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenneuronascorticalesexpuestasaA2535. Semuestraelsentidodelavariacinobservadaconrespectoalcontrolmedianteflechas:aumenta;disminuye.*p<0,05,**p<0,01, ***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

Dado que el efecto txico del pptido amiloide puede ser debido a un aumento excesivo del calcio intracelular,seestudielacoplamientodelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatodelgrupoIylaPLC, realizndoseensayosenzimticosdeactividadenclulascontrolesyenclulasexpuestasaA2535durante24 horas. As, el primer paso fue comprobar el efecto sobre la actividad basal de esta enzima. Los resultados obtenidosenestosexperimentosseexponenenlaFigura87.Comoseobserva,elnivelbasaldeactivacinde laenzimaPLCestligeramentedisminuidaconrespectoalasituacincontrol(Control:26,817,27;A2535: 17,614,85pmol/mgmin),aunquedeformanosignificativa(p=0,35).
Actividad PLC basal (pmol/mgmin)
40

Figura 87: La exposicin a A2535 no afecta la actividad PLC basal. Neuronas corticales fueron expuestas o no a A2535 25 M durante 24 horas antes de realizar los ensayos enzimticos para la acumulacindeIP3basal.LosdatosexpuestossonlasmediasSEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicadoempleandodistintoscultivos.

30

20

10

0
ol on tr C M A
25 -3 5

AcontinuacinseestudilacapacidaddelagonistaespecficodelgrupoI,(S)DHPG,paraestimularla actividadPLCtantoenneuronascorticalescontrolescomoenlassometidasalaexposicinaA2535,ascomo de los antagonistas especficos JNJ 16259685,para mGlu1,y MPEP,para mGlu5, deinhibir esta estimulacin. LosresultadosobtenidosenestosexperimentosseexponenenlaFigura88. ComoseobservaenlamencionadaFigura,existendiferenciasenlacapacidaddelligando(S)DHPGpara estimularelsistemadelaPLCenlasdossituacionesestudiadas.Porunlado,enambosgruposdeexperimentos (S)DHPGestimuladeformasignificativalahidrlisisdePIP2encadaunadelassituacionescomparadaconla actividad basal (Control: 138,42 1,26, p<0,001; A2535: 120,27 3,65%, p<0,05). Sin embargo, cuando comparamoslacapacidadestimuladoradel(S)DHPGenambassituaciones,seobservaqueexistendiferencias

25

24 h

155

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

significativasentreunayotra,quesetraducenenunadisminucindeun13%enlaestimulacindelaPLCen neuronascorticalesexpuestasaA2535conrespectoalgrupodeneuronascorticalescontrol(p<0,01). Porotrolado,elempleodeantagonistasespecficosparainhibirlaestimulacindelaPLCmediadapor (S)DHPG no proporcion resultados reveladores acerca de si alguno de los dos subtipos, mGlu1 o mGlu5, predominabaenlaactivacindelaPLCsobreelotroosiexistancambiosenlapreferenciadealgunoporesta va de transduccin tras la exposicin al fragmento txico ((S)DHPG + JNJ: Control: 105,98 5,33; A2535: 101,813,35%.(S)DHPG+MPEP:Control:111,444,30;A2535:103,7513,87%).
140 160

*** *

Control A25-35 25 M 24h

Actividad PLC (% del basal)

120

100

80

0, 5

30

D H

JN J

PG

Figura 88: La exposicin a A2535 afecta a la funcionalidad de los receptores metabotrpicos del grupo I. Neuronas corticales fueron expuestasonoaA253525Mdurante24horasantesderealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeIP3.Seestudielefecto delaexposicinaA2535sobrelafuncionalidaddelsistemaestimuladoporDHPG,agonistadelgrupoIdelosreceptoresmetabotrpicos deglutamato,ascomoelpapelde lossubtiposmGlu1,inhibidopor JNJ,y mGlu5,inhibidoporMPEP,endichafuncionalidad.Losdatos expuestos son las medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos cultivos. * p<0,05,***p<0,001,significativamentediferenteconrespectoasubasal;p<0,01grupossignificativamentediferentes.

Estosresultadosapuntanaqueexisteuncambioenlacapacidaddelosreceptoresmetabotrpicosde glutamato del grupo I de estimular la hidrlisis de fosfatidilinositoles, en concreto se observa que esta capacidaddisminuyeenneuronascorticalesexpuestasaA2535,apesardelaumentoconstatadoenlacantidad de los receptores del grupo I en la superficie celular. Sin embargo, no se han detectado diferencias entre la capacidad de los 2 subtipos de receptores metabotrpicos del grupo I a la hora de modular esta seal en presenciadelosantagonistasdescritos. Dado que se haba encontrado en los experimentos de inmunofluorescencia una disminucin en la cantidaddelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatodelgrupoIIenlamembranaplasmticadeneuronas corticalesexpuestasaA2535,seestudisilaprincipalvadetransduccinalaqueestnacopladoslossubtipos

156

D H PG

M PE P

PG

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

mGlu2ymGlu3resultabatambinmoduladacomoconsecuenciadelaexposicinalfragmentotxico.Comose dispona de las herramientas farmacolgicas necesarias para extender este estudio a los receptores metabotrpicos del grupo III, se plante si la exposicin a A2535 afectaba a la capacidad de estos para transmitirlasealalaenzimaadenilatociclasa. ElprimerpasoconsistiencomprobarsilameraexposicindeneuronascorticalesaA2535afectabaa los niveles basales de activacin de la enzima AC. As, como se expone en la Figura 89, se aprecia que no existen diferencias significativas entre los valores basales de actividad obtenidos en ambas condiciones experimentales (p=0,499), aunque, a simple vista, se aprecia una disminucin en la actividad basal en las neuronasexpuestasalfragmentotxico.Estadisminucinesdeun20%conrespectoalvalormediodetectado encondicionescontroles.
Figura89:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaactividadAC

Actividad AC basal (pmol/mgmin)

basal.NeuronascorticalesfueronexpuestasonoaA253525M durante24horasantesderealizarlosensayosenzimticospara laacumulacindeAMPc.Seestudielefectodelaexposicina

A2535 sobre la actividad AC basal. Los datos expuestos son las mediasSEMde3experimentosindependientesrealizadospor duplicadoempleandodistintoscultivos.

0
on

ElestudiodelainhibicindelaactividadACcomoconsecuenciadelaactivacindelosreceptoresdelos gruposIIyIII,sepresentaenlaFigura90.ElempleodelagonistadelgrupoII(2R,4R)APDC(panelA)demuestra quenoexistenvariacionessignificativasalestimularestesistemaenneuronascontrolesyenlasexpuestasa toxicidad in vitro, a pesar de la disminucin en el nmero de receptores del grupo II detectada por inmunofluorescencia(%inhibicin:Control:42,765,60;A2535:21,6511,41%). En cuanto al empleo de LAP4 en los mismos experimentos (panel B) se observa que, en neuronas expuestasalfragmentotxico,esteligandotieneunamayorcapacidaddeinhibirlaactividaddelaenzimaAC de forma significativa (% inhibicin: Control: 26,53 3,29; A2535: 44,77 2,83%; p<0,05). El aumento en la capacidadinhibidoradeestosreceptorespodraapuntaraquelosreceptoresdelgrupoIIIaumentanenestas condiciones,contribuyendoalaumentodereceptoresmetabotrpicosdetectadosporuninderadioligandos. Estosdatosapuntanaque,aunquelosresultadosobtenidosenestosexperimentosparalosreceptores delgrupoIInohayanresultadosignificativos,laexposicinaA2535enneuronascorticalesinvitromodulalos sistemasformadosporlosgruposIIyIIIdelosreceptoresmetabotrpicosylaenzimaAC,almenos,enloque respectaalacapacidaddestosdeinhibirlaactividadACpreviamenteestimulada,sugiriendoqueestemodelo

25 -3 5

25

24 h

tr ol

157

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

txicotambinafectaalatransduccinmediadaporelsegundomensajeroAMPcaunquelohaceensentidos opuestosencadagrupo. A
Inhibicin mediada por (2R,4R)-APDC (% de la actividad Forsk)

60

B
Inhibicin mediada por L-AP4 (% de la actividad Forsk)
60

*
40

40

20

20

on tr ol

24 h

ol

on tr

25

25 -3 5

Figura90:EfectodelaexposicinaA2535 sobrelaactividadACmediadaporlosreceptoresmGlu.Neuronascorticalesfueronexpuestas onoaA253525Mdurante24horasantesderealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeAMPc.Seestudielefectodela exposicinaA2535sobrelafuncionalidaddelsistemainhibidoporunagonistadelgrupoIIdelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato, (2R,4R)APDC 100 M (panel A), y por un agonista del grupo III, LAP4 100 M (panel B). Los resultados se expresan como el tanto por ciento de la inhibicin observada sobre la estimulacin de forskolina 100 nM (Forsk). Los datos expuestos son las medias SEM de, al menos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintoscultivos.*p<0,05significativamentediferentedesu correspondientecontrol.

c) Receptoresdeadenosina.

Existenenlaactualidadvariasreferenciasbibliogrficasquerelacionanlosreceptoresdeadenosinacon un posible papel neuroprotector en ciertas enfermedades neurodegenerativas. No obstante, este papel neuroprotector no est todava claro. Por otro lado, ha sido recientemente descrito por este grupo de investigacin el incremento del nmero total de receptores A1 y A2A en la corteza frontal de cerebros de pacientesdiagnosticadosconlaenfermedaddeAlzheimer(Albasanzycol.,2007). En este apartado se estudiar el efecto que ejerce in vitro la exposicin de neuronas corticales de cerebroderataaA2535sobrelacantidaddereceptoresA1yA2Aenlasuperficiecelular.Estosresultadosse completarn con estudios de PCR a tiempo real y ensayos de actividad AC. Dado que en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer se describen varios estadios (Braak y Braak, 1998), se ha planteado el modelo de toxicidadinvitroendosetapas:exposicinaA253525Mdurante24horasydurante48horas. Para determinar el nmero total de receptores en la superficie celular se us la tcnica de unin de radioligandos, empleando [3H]DPCPX, y [3H]ZM241385, para cuantificar los receptores A1 y A2A, respectivamente. Los resultados obtenidos en estos experimentos para determinar la densidad de receptores A1 en la superficie de neuronas corticales se exponen en la Figura 91. En la siguiente tabla resumen se muestran los valoresobtenidosparalosparmetroscinticosdeterminadosenestosexperimentos.

158

25 -3 5

25

24 h

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide A
Bm a x (pmol/mg prot)
0.6

Resultados
15

0.8

**
KD (nM)

**
0.4

10

* *

5 0.2

tr ol

tr ol

48

24

C on

C on

24

Figura 91: La exposicin a A2535 modula los receptores A1 en la superficie celular. Neuronas corticales se expusieron a A2535 25 M durante24o48horas.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]DPCPX.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde 3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentescultivos.Losparmetroscinticoscalculados,Bmax(panelA) yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentales empleandoelsoftwareGraphPadPrism5.0.*p<0,05,**p<0,01 significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

Bmx(pmol/mg) KD(nM)
Tabla29:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[ H]DPCPXenneuronascorticalesexpuestasaA2535. En esta tabla se exponen los resultados numricos obtenidos para el clculo de los parmetros cinticos. * p<0,05, ** p<0,01 significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.
3

Control 0,1490,006 1,160,16

A253525M24h 0,5450,101** 7,512,35*

25

25

25

25

A253525M48h 0,4230,066** 5,511,33*

Comoseobserva,laexposicininvitroaA2535produceunaumentodelnmerototaldereceptoresen lasuperficiecelularquesecorrespondeconunaumentodeun266%tras24horasdeexposicinydeun184% tras 48 horas de exposicin. Estos resultados son estadsticamente diferentes con respecto a los datos obtenidos en la situacin control (p<0,01 en ambos casos) y, sin embargo, no son estadsticamente significativoscuandosoncomparadosentres(p=0,35). El anlisis de los datos obtenidos para la afinidad de los receptores A1 indica que la exposicin continuada a A2535 disminuye la afinidad de estos receptores por su ligando, de modo estadsticamente significativo(p<0,05paraambos).EnconcretosedetectanincrementosenelparmetroKDde6,4vecestras24 horasdeexposicinyde4,7vecesalas48horasconrespectoalasituacincontrol.Denuevo,alcomparar estadsticamenteestosdatosentresnoseobtuvieronresultadossignificativos(p=0,49).

48

0.0
h h

0
h h

159

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

En el caso del receptor A2A los resultados obtenidos para los ensayos de unin de radioligando se exponenenlaFigura92.Acontinuacinsemuestranresumidoslosparmetroscuantificadosenestosensayos Tabla30). Los resultados obtenidos demuestran que, en el caso del receptor A2A, se necesita una exposicin prolongada a A2535 para observase efectos en su regulacin a nivel de la densidad de receptor en la membrana plasmtica. En concreto a las 48 horas se produce un aumento significativo de la cantidad de receptor A2A de un 80% sobre la situacin control (p<0,001). Esta variacin tambin es significativa con respectoalosvaloresobtenidosalas24horas(p<0,001). Porotrolado,elanlisisdelosdatosobtenidosparalasafinidadesdelreceptorA2Aporsuligandorevela quenoexistenvariacionessignificativasentrelosdatosobtenidos. A
Bm x (pmol/mgprot)

1.50
1.25 1.00 0.75 0.50

20

***
15

KD (nM)
h h

10

5 0.25 0.00 0

tr ol

24

48

tr ol

on

on

25

25

25

Figura92:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular.NeuronascorticalesseexpusieronaA253525M durante24o48horas.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]ZM241385.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticos calculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism 5.0.***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

Bmx(pmol/mg) KD(nM)
Tabla 30: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de unin de [ H]ZM241385 en neuronas corticales expuestas a A2535. En esta tabla se exponen los resultados numricos obtenidos para el clculo de los parmetros cinticos. *** p<0,001 significativamentediferenterespectoalcorrespondientecontrol.p<0,001,estadsticamentediferenteconrespectoalas24horasde tratamiento.
3

Control 0,6560,051 13,260,26

A253525M24h 0,5570,056 10,331,22

1,1780,043*** 13,964,69

160

A253525M48h

25

48

24

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

Estos resultados, en conjunto, indican que existe una regulacin diferencial de los receptores de adenosinaA1yA2AcomoconsecuenciadelaexposicininvitroaA2535aniveltantodelnmerodereceptores como de la afinidad de los mismos por su ligando y que, en el caso del receptor A2A, depende adems del tiempodeexposicin. Acontinuacinseestudielcomportamientoqueseguanlosgenesquecodificanparalosreceptores de adenosina A1, A2A y A2B tras la exposicin a medio y largo plazo a A2535. Para ello se recurri, como en apartadosanterioresaensayosdeRTPCRatiemporeal. Como se expone en la Figura 93, en todos los casos estudiados, la exposicin a A2535 induce la transcripcindeestosgenes,tantoamediocomoalargoplazo.As,paraelgencodificanteparaelreceptorA1, se detectaron aumentos de un 53 y de un 65% tras 24 y 48 horas de exposicin a A2535, respectivamente, datos que, adems, eran estadsticamente significativos con respecto a la situacin control (p<0,01 para ambos).
3

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

A1 A2A A2B

** *** **

**
1

**

**

0
ol ol 24 h ol 24 h 48 h 24 h M A 25 48 h C on tr C on tr C on tr M M M M M 48 h

25

25

25

25

Figura93:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnicadeA1,A2AyA2B.NeuronascorticalesfueronexpuestasaA253525M durante24o48horasosemantuvieronencondicionescontrolconelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiemporealse realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientesrealizadosporduplicadoempleandodistintasmuestras.**p<0,01,***p<0,001,significativamentediferenteconrespecto alcontrol;p<0,05grupossignificativamentediferentes.

EnelcasodelgencodificanteparaelreceptorA2B,lasdiferenciasobservadasfueronanmayoresentre laexpresingnicaencondicionescontrolytraslaexposicinaA2535.Assecuantificaronincrementosdeun 88yun89%tras24y48horasdeexposicin,respectivamente,conrespectoalaexpresinbasal,resultados ademsestadsticamentesignificativos(p<0,001tras24horasyp<0,05tras48horas). Sinembargo,paraelcasodelreceptorA2Alaregulacindelaexpresingnicaobservadafuediferente. Enestecaso,aligualqueseobservaniveldeladensidaddeprotenadelreceptorenlasuperficiecelular,

25

161

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

existendiferenciasentrelosefectosejercidosporelfragmentotxicodependiendodeltiempodeexposicinal mismo.As,tras24horasdeexposicinseobservunaumentoenlaexpresingnicadelreceptorA2Adeun 71%(p<0,01).Sinembargo,cuandolaexposicinaA2535seprolongabahastalas48horasinvitrosedetect unincrementotodavamayor,enconcreto,de162%(p<0,01). Adems,enelcasodelgenquecodificaparaelreceptorA2Aseencontrarondiferenciassignificativasal analizar los datos obtenidos a uno y a otro tiempo de exposicin (p<0,05), observndose a las 48 horas un aumentoenlaexpresindeun53%conrespectoalvalorcuantificadoalas24horas. Estos resultados demuestran que la exposicin a A2535 aumenta la expresin gnica de todos los receptoresdeadenosinaestudiadosperolohaceconunaparticularidad,enelcasodelgencodificanteparael receptor A2A el incremento observado depende del tiempo de exposicin, siendo mximo tras 48 horas. Por otrolado,losincrementosenladensidaddelreceptorA1yA2Aaniveldemembranaplasmticatras48horas deexposicinaA2535,ascomodeA1tras24horas,puedenentendersecomoresultadodeunincrementoen su expresingnica. Sin embargo, los resultados observados para el receptorA2A a nivel de protena tras 24 horaspodranserresultadodeundesfaseexistenteentrelatranscripcingnicaylatraduccinproteica. Con el fin de cuantificar el efecto que ejerca este modelo de toxicidad in vitro sobre los niveles del segundo mensajero AMPc, se estudi la capacidad de los receptores de adenosina para transducir una determinadasealalinteriorcelular.LosresultadosobtenidosparalacuantificacindelosnivelesdeAMPcen neuronascorticalescontrolesysometidasalatoxicidadinvitrodeA2535seexponeenlaFigura94.
Actividad AC estimulada por CGS 21680 (% of basal)

A
Actividad AC inhibida por CHA (% de Forsk)
60

B
200 175 150 125 100

40

**

20

0
on tr ol h M 24 C

0
on tr ol C M A
25 -3 5

Figura94:EfectodelaexposicinaA2535 sobrelaactividadACmediadaporlosreceptoresdeadenosina.Neuronascorticalesfueron expuestaso noa A253525 Mdurante24horasantesderealizarlos ensayosenzimticosparalaacumulacinde AMPc.Seestudi el efectodelaexposicinaA2535sobrelainhibicindelaactividadACporelreceptorA1(panelA),empleandoelagonistaespecficoCHAa1 Mparainhibirlaactividadestimuladaporforskolina100nM.Tambinsecomprobelefectoejercidoenlaestimulacindelaactividad ACpromovidaporelreceptorA2A(panelB),paralocualseempleelagonistaespecficoCGS21680a1M.Losdatosexpuestossonlas medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos cultivos. ** p<0,01 significativamentediferentedesucorrespondientecontrol.Actividadbasal:Control:2.910.60;Tratadas:2.330.51pmol/mgmin.

162

25 -3 5

25

25

24

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

Como se observa en el panel A, la capacidad del CHA, agonista especfico del receptor A1, de inhibir aumentosenlacantidaddeAMPcporinhibicindelsistemadelaACresultaumentadacomoconsecuencia delaexposicindelasneuronascorticalesalfragmentotxicodurante24horas(%inhibicin:Control:24,95 2,89;A253525M24h:39,022,00,p<0,01).EnelcasodelreceptorA2A,lacapacidaddesteparamodular lacantidaddeAMPctraslaexposicindeneuronascorticalesaA2535resultsersimilaralaobservadaparael mismosistemaencondicionesbasales(%estimulacin:Control:174,333,64;A253525M24h:172,86 8,45). Dado que no se han detectado variaciones en la actividad AC basal tras la exposicin a A2535, estos resultadossecorrelacionanconlosobservadosmedianteensayosdeuninderadioligando. Por ltimo, se comprob si estas condiciones afectaban a la transcripcin de los factores de transcripcin CREB y CREM. Para ello, se realizaron ensayos de RTPCR a tiempo real empleando sondas especficasparaambosenmuestrasaisladastras24y48horasdeexposicinaA2535ysecompararonconlos nivelesdetranscripcinbasalesdeambosfactores.Enamboscasosseobservunamodulacinsimilar,quese exponeenlaFigura95.Enconcreto,enestemodelodetoxicidad,tantoatiemposmediosdeexposicincomo a tiempos largos, se observaba una disminucin de la cantidad de ARNm transcrito para ambos factores de transcripcin. La cuantificacin de estos experimentos revel que en el caso de CREB las disminuciones que ocurran eran de un 39% tras 24 horas de exposicin y de un 40% tras las 48 horas de exposicin, ambos resultadosestadsticamentesignificativoscuandosecompararonconlasituacincontrol(p<0,05). EnloquerespectaaCREM,seobservunadisminucindelaexpresintodavamsacusadaqueenel caso anterior. As, tras 24 horas de exposicin la disminucin era de un 60%, mientras que tras 48 horas se detectunadisminucindeun62%conrespectoalosnivelesdeARNmcuantificadosenlasituacincontrol. Estosresultados,denuevo,resultaronsignificativosdesdeunpuntodevistaestadstico(p<0,05).
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control) CREB CREM
Figura95:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnica delosfactoresCREByCREM.Neuronascorticalesfueronexpuestasa

1.0

A253525Mdurante24o48horasosemantuvieronencondiciones control con el fin de aislar su ARN. Los experimentos de RTPCR a

* *
0.5

tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los

* *

genescodificantesparalosfactoresdetranscripcinmostrados.Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05 significativamente diferente con respecto al

0.0

control.

24 M h 48 h

25

25

25 A

25

24 M h 48 h

ro l

on t

on t

ro l

163

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

En resumen, dado que tanto CREB como CREM son factores de transcripcin constitutivos que promueven la expresin de genes relacionados con la supervivencia celular, es razonable suponer que esta disminucin en los niveles de ARNm de CREB y CREM afecta a la cantidad de factor en forma de protena disponibleyellopodrainfluirenlatoxicidadejercidaporelfragmento2535delpptidoamiloideinvitro,sin descartarquehayaotrosmotivosporlosqueestepptidoresultetxicoanivelcelular. d) Tablaresumen. Acontinuacinseexponeunatablaamododeresumenconlasprincipalesvariacionesobservadas.
Viabildad ARNm caspasa3 Actividad caspasa3 Bmaxunin L[ H]Glu KDunin L[ H]Glu ProtenamGlu1
3 3

A2535 24h

A253548h
ActividadACbasal ActividadAC GrupoII ActividadAC GrupoIII Bmax unin [ H]DPCPX KD unin L[ H]DPCPX Bmax unin [ H]ZM241385 KD unin [ H]ZM241385 ARNmA1 ARNmA2A ARNmA2B
3 3 3 3

A2535 24h

A253548h

ARNmmGlu1 Protena mGlu5 ARNmmGlu5 Protena mGlu2,3 Protena PLC1 ARNmPLC1 ActividadPLCbasal ActividadPLC GrupoI

ActividadA1/AC ActividadA2A/AC ARNmCREB

ARNmCREM

Tabla31:ResumendelosresultadosobtenidosenneuronascorticalesexpuestasaA253525M.Enestatablaseexponengrficamente losresultadosnumricosdescritosenestecaptulo.,nohayvariacinestadstica:seobservaunaumentoounadisminucincon respectoalasituacincontrol.

164

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide IV.4.2EnclulasC6degliomaderata.

Resultados

Como se ha expuesto en la Introduccin, la presencia del pptido amiloide produce varios efectos nocivos sobre las clulas presentes en el SNC. En concreto, la gla que rodea los depsitos del pptido amiloide se activa volvindose reactiva y daando al tejido que la rodea. Dado que los receptores metabotrpicosdeglutamatoseencuentranalteradosenvariasenfermedadesneurodegenerativasyadems influyenenelprocesamientonoamiloidognicodelaprotenaAPPresultainteresantecomprobarelestadoen elqueseencuentrantrassometeralmodelodeC6aunaexposicinprolongadaalpptidoamiloide. a) Efectoenlaviabilidad. Paraestosexperimentosseempleelfragmento2535delpptidoamiloide,dadoslosmotivosquese hancomentadoenapartadosanterioresdelapresenteMemoria.Elprimerpasofuecomprobarsielfragmento 2535ejerca,talycomoseproponeenlosantecedentesbibliogrficos,unefectotxicosobrelasclulasC6 afectandoalaviabilidaddelasmismas. Paraello,serecurrialtestdeviabilidadbasadoenelMTTy,comoseexponeenlaFigura96,panelA, delrangodeconcentracionesempleadodurantelas6horasdeexposicinaestefragmentotxico,slotres proporcionaron una disminucin de la viabilidad estadsticamente significativa con respecto a la situacin control,estasfueron10,25y50M,aunquetodaslasconcentracionesempleadasprodujerondisminuciones nelaviabilidad(A25356h:Control:100,003,65;2,5M:88,033,16;5M:79,857,05;10M:70,95 5,25, p<0,05; 25 M: 68,93 7,68, p<0,05; 50 M: 63,68 5,61%, p<0,01). El anlisis estadstico de las diferencias entre el efecto en la viabilidad de estas tres concentraciones no proporcion diferencias significativas. Por tanto se determin que, en estos estudios se empleara la concentracin de 25 M del fragmento 2535 del pptido amiloide, ya que, por un lado, produca una disminucin significativa de la viabilidad en clulas C6 y, por otro, esta concentracin ya haba sido empleada con anterioridad en la bibliografadisponible. AdemsseestudieltiempodeexposicindelasclulasC6aA2535paraquecomenzaraaapreciarse sutoxicidadinvitro.LarespuestaaestapreguntaseencuentraenelpanelBdelamismafigura,enlaquese aprecia que no se observan diferencias significativas hasta pasadas, al menos 4 horas de exposicin a ste pptido,aunqueatiemposcortossetambinseobservabaunefectotxicoaunquedemodonosignificativo (A253525M:Control:100,004,25;1h:85,063,47;3h:73,1910,06;4h:72,367,56,p<0,05;6h:69,57 7,42%,p<0,05).

165

Resultados A
Viabilidad (% respecto al control)

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide B
Viabilidad (% respecto al control)

110 100 90 80 70 60

110 100 90 80 70 60

**

tr ol

tr ol

C on

A25-35 6 h

C on

2, 5

10

25

50

A25-35 25 M

Figura96:LaexposicinaA2535disminuyelaviabilidadcelular(I).ClulasC6seexpusieronadistintasconcentracionesdeA2535durante 6horas(panelA)yaA253525Mdurante1,3,4y6horas(panelB).Transcurridoestetiemposemidilaviabilidadcelularmedianteel testbasadoenMTT.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde3experimentosindependientesrealizadosportriplicado,expresados porcentualmente con respecto a la viabilidad de las clulas controles. * p<0,05, ** p<0,01 significativamente diferente con respecto al control.

UnavezcomprobadoeltiempomnimodeexposicincelularaA2535paraobservarvariacionesenla viabilidad,seestudilatoxicidadalmismoalprolongabareltiempodeexposicin.Seefectuaronensayosde viabilidada24ya48horas,incorporandocomocontrolpositivodetoxicidadlaexposicinalfragmentotxico durante6horas.LosresultadosobtenidosenestascondicionesseexponenenlaFigura97,y,comoseobserva, revelanqueelefectotxicodeA2535sobrelasclulasC6invitronodependedeltiempodeexposicin,una vez superado el umbral mnimo, sino que no se alcanzan disminuciones en la viabilidad mayores a las ya descritas,astras24horasy48horasdeexposicinseobservunadisminucinenlaviabilidaddeun31%con respectoalcontrol,similaraladescritaalas6horas(A253525M:Control:100,003,30;6h:73,041,86, p<0,001;24h:68,774,39,p<0,001;48h:69,043,93%,p<0,001).
Figura97:LaexposicinaA2535disminuyelaviabilidadcelular (II). Clulas C6 se expusieron a distintas concentraciones de A2535durante24horas(panelA)yaA253525Mdurante24y 48 horas (panel B). Transcurrido este tiempo se midi la viabilidad celular mediante el test basado en MTT. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por triplicado, expresados

110 100

Viabilidad (% respecto al control)

90 80 70 60

***

***

***

porcentualmente con respecto a la viabilidad de las clulas controles.***p<0,001significativamentediferenteconrespecto alcontrol.

0
on tr ol h h 6 24 C 48 h

A25-35 25 M

166

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

UnresumendelosresultadosobtenidosenestosexperimentosdeviabilidadempleandoA2535enlas clulasC6seexponeenlaFigura98,enlaquesemuestracmounavezqueelfragmentoalcanzasuefecto txicomximo,esteefectosemantieneentodoslostiemposposterioresensayados. El ltimo ensayo necesario para demostrar la validez de este modelo de toxicidad in vitro era incorponrar el empleo del pptido amiloide completo a estos experimentos. Los experimentos de viabilidad realizadosconelpptidoamiloidecompletoseexponenenlaFigura99.Comoseesperaba,laexposicindelas clulas C6 a A142 disminuye su viabilidad en un 28% con respecto a la situacin control (Control: 100,00 0,88;A14225M24h:73,041,27%,p<0,001).Cuandosecompararonestadsticamentelasdisminuciones observadastras24horasdeexposicinaA142yaA2535noseobtuvierondiferenciassignificativas. Estos resultados apuntan a que el empleo de A2535 induca muerte celular sobre las clulas C6 en la mismamagnitudqueelfragmentocompleto,locualvalidabaelmodelodeestudioempleado,talycomoera deesperarsegnlosantecedentesbibliogrficos.
0 01 34 6 24 48 105 100 95

Viabilidad (% respecto al control)

90 85 80 75 70 65 60

Tiempo de exposicin (h)

Figura 98: Resumen del efecto observado por exposicin a A2535 en el tiempo. Esta Figura recoge las medias expuestas a distintos tiemposenlasFiguras96y97.

110 100
Figura99:LaexposicinaA142disminuyelaviabilidadcelular de forma similar a A2535. Clulas C6 se expusieron a A142 durante24horas.Transcurridoestetiemposemidilaviabilidad

Viabilidad (% respecto al control)

90 80 70 60

***

celularmedianteeltestbasadoenMTT.Losdatosexpuestosson las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por triplicado, expresados porcentualmente con respecto a la viabilidad de las clulas controles. *** p<0,001

significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

0
on tr C M A
142

25

24 h

ol

167

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Segn los datos bibliogrficos disponibles, la muerte celular producida por la exposicin al pptido amiloideesconsecuencia,enparte,delaactivacindelavadelascaspasas.Porestemotivo,elsiguientepaso fuecomprobarelefectoqueejercalaexposicinaA2535sobrelaactivacindeestava.Comoseobservaen la Figura 100, la exposicin de las clulas C6 a A2535 induce la activacin de la va de las caspasas tanto a tiemposcortos(6horasdeexposicin)comoatiemposmsprolongados(24y48horas).Estosresultadoseran adems todos estadsticamente significativos cuando se comparaban con la situacin control (Ratio de activacin:6h:1,760,18,p<0,01;24h:2,140,43,p<0,05;48h:2,010,37,p<0,05).
Figura 100: Efecto de la exposicin a A2535 sobre la actividaddecaspasa3.ClulasC6fueronexpuestasaA2535 25 M durante 6, 24 o 48 horas o se mantuvieron en condiciones control. Posteriormente se realizaron ensayos deactividadenzimticaespecficosdecaspasa3empleando el kit comercial descrito en Mtodos. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos pases. * p<0,05,**p<0,01significativamentediferenteconrespecto alaactividadcontrol.

Ratio de activacin Caspasa-3

*
2

**

C on tr ol

24

25

25

Conelobjetivodevalidarporcompletoelmodeloseestudilarepercusinquetenalaexposicinde lasclulasC6aA2535sobrelaexpresingnicadelacaspasa3.ParaelloserealizaronensayosdeRTPCRa tiempo real empleando sondas especficas para el gen correspondiente. As, los resultados obtenidos, expuestosenlaFigura101,revelanquelaexposicinaA2535produceunaactivacindelatranscripcindel gen correspondiente a la caspasa 3, siendo esta activacin dependiente del tiempo de exposicin. As, se observa a las 6 horas un aumento de 2,9 veces en la expresin de este ARNm sobre la situacin control, resultado que, por otro lado, est cercano a ser estadsticamente significativo (p=0,066). Sin embargo, si se prolongaeltiempodeexposicinalfragmentotxicoseobservaunaumentomoderadoi,quesecorresponde con un incremento de 1,9 veces a las 24 horas y de 1,4 veces a las 48 horas. Estos resultados son, adems, estadsticamente diferentes con respecto al control (p<0,01 y p<0,05, respectivamente). El hecho de que la modulacin de la expresin gnica del gen codificante para la caspasa 3 sea dependiente del tiempo lo corrobora la comparacin estadstica de los datos obtenidos a 24 y a 48 horas, la cual arroja diferencias estadsticamentesignificativasentreunoyotrogrupodeexperimentos(p<0,001).

168

25

48

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide
4
expresin de caspasa 3. Clulas C6 fueron expuestas a A253525Mdurante6,24o48horasosemantuvieronen condiciones control con el fin de aislar su ARN. Los experimentos de RTPCR a tiempo real se realizaron empleandounasondaespecficaparaelgencodificantepara lacaspasa3.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05, ** p<0,01 significativamente diferente con respecto al control; p<0,001valoressignificativamentediferentes. Figura 101: Efecto de la exposicin a A2535 sobre la

Resultados

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

** *

24 h

on

b) ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato. Una vez comprobada la validez del modelo de estudio se procedi a estudiar el efecto que ejerca el fragmento2535delpptidoamiloidesobreelsistemadelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato.Para ello, lo primero fue comprobar si la exposicin a dicho fragmento afectaba a la presencia de los receptores metabotrpicos en la superficie celular empleando de nuevo el ensayo de unin de radioligando usando L[3H]Glu.LosresultadosobtenidosseexponenenlaFigura102.ComoseobservaenelpanelA,laexposicina A2535 produce un aumento gradual de la presencia de los receptores metabotrpicos en la membrana plasmticacelular. Elnmero totalde receptores metabotrpicos se ve aumentadoun27%a las6 horas de exposicin,un54%alas24horasyun66%alas48horas,siendoademsestosresultadossignificativamente diferentesdelosobtenidosparalasituacincontrol(Control:133,75 9,54;A253525M:6h,170,1611,54, p<0,05;24h,205,6826,39,p<0,05;48h,222,5715,85pmol/mgprot,p<0,001).Porotrolado,sedetectaron diferenciassignificativasentreladensidaddereceptoresmetabotrpicosalas6horasdeexposicinytras48 horasdeexposicin(p<0,05)lascualessecorrespondanconunaumentodeun31%enlacantidadtotalde receptoresenlasuperficiecelular. Encuantoalanlisisdelosdatosobtenidosparalaafinidaddelosreceptoreslosresultadosseexponen en el panel B de la misma figura. La exposicin a A2535 tiene efectos variados sobre la afinidad de los receptoresmetabotrpicosporsuligando,yaque,aunquesiempreproduceelmismoefecto,unaumentodela KD o lo que es lo mismo una disminucin de la afinidad,este efecto no es gradualyvara entre los distintos tiempos de exposicin estudiados. Como se observa, a las 6 horas de exposicin el efecto sobre la KD es mximo y los receptores metabotrpicos alcanzan su menor afinidad por su ligando, aumentando la KD 3,7 vecesconrespectoalcontrol(Control:707,5944,45;A253525M6h:2646,20254,49nM,p<0,001).Sin embargo,alas24horasdeexposicinlasdiferenciasobservadasdejandesersignificativasconrespectoala situacincontrolyelvalordelaKDdisminuyeconrespectoaloobservadoalas6horas,observndosevalores de afinidad similares al control (A2535 25 M 24h: 807,30 84,93nM). Si se prolongan ms los tiempos de

48 h

tr

6h

ol

169

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

exposicin a A2535 se observa que a las 48 horas de exposicin la afinidad detectada para los receptores metabotrpicosdeglutamatovuelveadisminuir,aumentandoelvalordelaKDen1,7vecesconrespectoala situacincontrol(A253525M48h:1233,97207,77nM,p<0,05).Porotroladoalgunasdeestasvariaciones descritasenlaKDsonsignificativasentres,asladiferenciaobservadaentrelaexposicinalfragmentotxico empleado durante 6 horas y 24 horas se traduce en una disminucin en la KD de un 67% entre uno y otro tiempo (p<0,001) y la diferencia observada entre la exposicin durante 6 y 48 horas al fragmento txico empleado supone una disminucin en la KD de un 53% (p<0,01). Cabe destacar, adems, que la diferencia descrita entrela afinidad detectada tras las 24 y 48 horas de exposicin no llega a ser significativa (p=0,13). Estosresultados,tomadosenconjunto,apuntanaquelaexposicinaA2535producediferentesefectosenel nmerodereceptoresyenlaafinidaddelosmismos. A
300

B
3500

* ***
KD (nM)

Bm x (pmol/mgprot)

3000 2500 2000 1500 1000 500

*** *

200

100

6h

24 h

6h

24 h

48 h

on

on

25

25

25

25

Figura102:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular.ClulasC6seexpusieronaA253525M durante6,24o48horas.SerealizaronensayosdeuninderadioligandoempleandoL[ H]Glu.LosdatosexpuestossonlasmediasSEM de,almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentespases.Losparmetroscinticoscalculados, Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism5.0.*p<0,05, ***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol;p<0,05,p<0,01,p<0,001diferenciassignificativasConrespectoa las6horas.


3

AcontinuacinseprocediacomprobarelefectoqueejercalaexposicinaA2535sobrelaexpresin gnicadelreceptormetabotrpicodeglutamatodeltipo1ydelaisoforma1delaPLC.Paraelloserecurria la tcnica de PCR en tiempo real empleando sondas especficas para cada gen. Los resultados obtenidos se exponenenlaFigura103.Comosemuestra,laexposicindelasclulasC6aA2535,yaseaatiemposcortoso ms prolongados, no ejerce influencia alguna sobre la expresin gnica del receptor metabotrpico de glutamatodeltipo1ascomodelafosfolipasaC1.

170

25

25

48 h

tr ol

tr ol

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide
Figura 103: Efecto de la exposicin a A2535 sobre la expresin gnicademGlu1yPLC1.ClulasC6fueronexpuestasaA253525M durante 6, 24 o 48 horas o se mantuvieron en condiciones control conelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiemporeal se realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintasmuestras.

Resultados
2.0

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

mGlu1 PLC 1

1.5

1.0

0.5

0.0
C on tr o A l A 6h 2 A 4h 48 h C on tr o A l A 6h 2 A 4h 48 h

Conelfindeprofundizarmsenlamodulacindescritaaniveldeprotenamedianteensayodeunin de radioligando se emplearon tcnicas inmunocitoqumicas. Para ello, se usaron anticuerpos dirigidos contra elementos extracelulares de determinados receptores metabotrpicos, de tal manera que la fijacin sin permeabilizacinnospermitiquelosanticuerposempleadosseunieransloalosreceptoresexpuestosenla superficiecelular,dndonosunaideaacercadelamodulacinquesufrancomoconsecuenciadelaexposicin a A2535. Se emplearon anticuerpos especficos de los receptores metabotrpicos de glutamato del grupo I (subtipos1y5)ydelgrupoII(subtipos2y3). ImgenesrepresentativasdelosexperimentosrealizadosenestascondicionessemuestranenlaFigura 104. Un diagrama de barras que representa la cuantificacin de la fluorescencia obtenida se expone en la Figura 105. Por ltimo, un resumen de los datos obtenidos as como del anlisis estadstico se expone a continuacinenlaTabla32. Como se observa en la Tabla 32, slo el subtipo 1 de los receptores metabotrpicos de glutamato experimentaunavariacinsignificativacomoconsecuenciadelaexposicindelasclulasC6aA2535.Adems estavariacinessignificativa(p<0,001)independientementedesielperiododeexposicinalfragmentotxico delpptidoamiloideescortooesmsprolongado. Los resultados obtenidos por inmunofluorescencia indican que el aumento observado en la unin de L[ H]GlunopuedeserproducidocomoconsecuenciadelaumentodelnmerodereceptoresdelosgruposIy II, ya que, segn los experimentos de inmunocitoqumica, ninguno de los receptores de los grupos I y II aumentansupresenciaenmembranacomoconsecuenciadelaexposicinalpptido,esmslapresenciade los del subtipo 1 disminuye significativamente, por lo que experimentos adicionales deben realizarse para confirmarelpapeldelgrupoIIIenesteaumento.
3

171

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Figura 104: Inmunodeteccin de mGlu1, mGlu5 y mGlu2,3 tras la exposicin a A2535 (I). Micrografas representativas de los resultados obtenidostraslosexperimentosdeinmunofluorescenciaalemplearlosanticuerposparamGlu1,mGlu5ymGlu2,3enclulasC6controlesy expuestasaA253525Mdurante6,24y48horas.Labarrarepresenta62m.

172

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide
Fluorescencia (unidades arbitrarias)
200000

Resultados
mGlu1 mGlu5 mGlu2,3

150000

100000

50000

***

***

***

C on tr ol A 6h A 24 h A 48 h

C on tr ol A 6h A 24 h A 48 h

Figura105:InmunodeteccindemGlu1,mGlu5ymGlu2,3traslaexposicinaA2535(II). Diagramadebarrasqueresumelosresultados expuestos en la Figura 104. Las cuantificaciones se realizaron usando el software LAS AF empleando un mnimo de 30 campos por condicin experimental. Se exponen las medias SEM obtenidas para cada condicin experimental. *** p<0,001 significativamente diferenteconrespectoalcontrol.

mGlu1 mGlu5 mGlu2,3


Tabla 32: Resumen de los resultados obtenidos en los experimentos de inmunofluorescencia en clulas C6 expuestas a A2535. Se muestraelsentidodelavariacinobservadaconrespectoalcorrespondientecontrolmedianteflechas:aumenta;disminuye.*** p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

A253525M6h *** ns ns

A253525M24h *** ns ns

C on tr ol A 6h A 24 h A 48 h

A253525M48h *** ns ns

PorltimosecomprobsilaexposicinaA2535ejercaalgnefectosobrelaenzimaqueparticipaenla principalvadetransduccinacopladaalgrupoIdelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato,yaque,segn sepostulaenlabibliografa,puedeserunaumentoexcesivodelcalciointracelularelcausantedelefectotxico inducidoporA2535.Paraello,serecurridenuevoatcnicasinmunocitoqumicasclsicasempleandoestavez elanticuerpoespecficoparalaisoforma1delaenzimaPLCascomounprocesodepermeabilizacintrasla fijacinconelfindeexponeralanticuerpolosantgenosintracelulares. Los resultados obtenidos se exponen en la Figura 106. En el panel A se muestran imgenes representativas de algunos campos fotografiados tras la inmunofluorescencia mientras que en el panel B se muestra una grfica con el resumen de los datos obtenidos tras la cuantificacin, as como el anlisis

173

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

estadstico realizado. Como se observa, la nica variacin significativa detectada ante la exposicin de las clulas C6 a A2535 en estas condiciones es una disminucin significativa (p<0,05) de la seal fluorescente obtenidaparaPLC1alas24horasdeexposicin. A
Figura 106: Inmunodeteccin de PLC1 tras la exposicin a A2535. Panel A. Micrografas representativas de los resultados obtenidos tras los experimentos de inmunofluorescencia al emplear el anticuerpoparaPLC1enclulasC6controlesyexpuestasaA253525 M durante 6, 24 y 48 horas. La barra representa 62 m. Panel B. Diagramadebarrasqueresumelosresultadosexpuestosenelpanel A. Las cuantificaciones se realizaron usando el software LAS AF empleandounmnimode30camposporcondicinexperimental.Se exponen las medias SEM obtenidas para cada condicin experimental. * p<0,05 significativamente diferente con respecto al control.

B
Fluorescencia (unidades arbitrarias)
400000

300000

*
200000

100000

C on tr ol

24 h

6h

c) Receptoresdeadenosina.

Comoyasehacomentado,seestnrelacionandolosreceptoresdeadenosinaconciertasenfermedades neurodegenerativas, incluso en el caso de la enfermedad de Alzheimer se postula que el empleo de antagonistas del receptor A2A puede producir mejoras frente al dao celular que ocasiona la exposicin a A2535(Dalllgnaycol.,2003).PorestemotivoseestudisilaexposicindelasclulasC6aA2535modulaba losreceptoresdeadenosina.

174

48 h

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

Con este fin se emple la tcnica de unin de radioligandos. Para estudiar el receptor A1 se emple [ H]DPCPX.ComoseobservaenlaFigura107,panelA,laexposicinaA2535produceunaumentosignificativo delnmerodereceptoresA1queseencuentranenlasuperficiecelular(Control:0,5670,026;A253525M: 6h: 1,266 0,123, p<0,001; 24h: 1,585 0,058, p<0,001; 48h: 1,547 0,244 pmol/mg prot, p<0,01). Este aumentosecorrespondeconunincrementoporcentualdeun123,179y173%paralostiemposdeexposicin 6,24y48horas,respectivamente. Elanlisisestadsticodelosdatosobtenidosalosdistintostiemposdesvelaquenoexistendiferencias significativasentreelefectoobservadotraslaexposicinaA2535durantetiemposcortosyduranteperiodos ms prolongados, aunque se observa una cierta tendencia. En el panel B de la misma figura se observan los efectosqueejercelaexposicinaA2535sobrelaafinidaddelreceptorA1porsuligando.Comoseexpone,no seaprecianvariacionesaparentesenlaKD. A
Bm a x (pmol/mg prot)
3

2.0

30

***
1.5

**
20

***
KD (nM)

1.0

10 0.5

0.0
ol h h h 48 6 C on tr 24 M M M

0
ol h h C on tr M M 24 M A 25 48 6 h

25

25

25

25

Figura107:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresA1enlasuperficiecelular.ClulasC6seexpusieronaA253525Mdurante6,24 o 48 horas. Se realizaron ensayos de unin de radioligando empleando [ H]DPCPX. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentespases.Losparmetroscinticoscalculados,Bmax(panelA)y KD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism5.0.**p<0,01,***p<0,001 significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

En lo que al estudio del receptor A2A se refiere se emple [3H]ZM241385 en el ensayo de unin de radioligando.LosresultadosobtenidosenestosexperimentostraslaexposicindelasclulasC6aA2535se resumenacontinuacinenlaFigura108. SeapreciaqueestefragmentotxicoproduceunaumentosignificativodelnmerodereceptoresA2A sobrelasuperficiecelularatodoslostiemposensayados(Control:0,4320,011;A253525M:6h:1,300 0,074,p<0,001;24h:1,1100,088,p<0,001;48h:0,8500,079pmol/mgprot,p<0,01).Sinembargo,elefecto delaexposicinaA2535descritosobrelosreceptoresA2Atieneunaparticularidad;esmximoalas6horasde exposicin(201%deincrementosobreelcontrol)y,segnseprolongaeltiempodeexposicin,elefectova

25

175

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

disminuyendo(157%deincrementotras24horasyslo97%tras48horasdeexposicin).Estaatenuacindel efectoresultaademssignificativadesdeelpuntodevistaestadstico(p<0,01entrelosdatosa6y48horas). Por otro lado, como se expone en el panel B de la misma Figura, la exposicin a A2535 no produce ningnefectosignificativosobrelaafinidaddeestosreceptoressobresuligando. A
Bm a x (pmol/mg prot)

B
25

1.5

***

20

***
KD (nM)

1.0

**

15

10

0.5 5

0.0
on tr 24 48

0
h ol h h ol h h on tr 6 6 M M M M M 24 M A 25 C C 48 h

25

25

25

25

Figura108:LaexposicinaA2535modulalosreceptoresA2Aenlasuperficiecelular.ClulasC6seexpusieronaA253525Mdurante6, 24o48horas.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]ZM241385.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde3 experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentespases.Losparmetroscinticoscalculados,Bmax(panelA)y KD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism5.0.**p<0,01,***p<0,001 significativamentediferenteconrespectoalcontrol;p<0,01variacinentregrupossignificativamentediferente.


3

DelosresultadosobtenidosseextraequelaexposicinaA2535modulaladensidaddelosreceptores A1yA2AenlamembranaplasmticadelasclulasC6,aumentandoenamboscasossupresenciasinafectarasu afinidad,peroconlaparticularidaddequemientrasqueelefectosobreelreceptorA1nodependedeforma claradeltiempodeexposicin,elefectosobreelreceptorA2Aesdependientedeltiempoysecumpleque,para lostiemposensayados,esmayorcuantomenoreseltiempodeexposicin. AcontinuacinseprocediaestudiarsilaexposicinaA2535enC6modulabalaexpresingnicade los receptores de adenosina. Para ello se recurri a la tcnica de la RTPCR en su variante a tiempo real empleando sondas especficas para los receptores de adenosina. Los resultados obtenidos se exponen en la Figura 109, en la que se aprecia que, en general, la exposicin al mencionado agente txico aumenta la expresindelosreceptoresdeadenosinaA1yA2BynomodulaladeA2AyA3. As, para el gen codificante para el receptor A1 se observa un aumento de la expresin gnica como consecuenciadelaexposicindelasclulasC6aA2535,observndoseaumentosdeun74%alas6yalas24 horasydeun58%alas48horasdeexposicin.Sinembargo,esteaumentofuesignificativoslotras6y24 horasdeexposicin(p<0,05ambas).

176

25

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Resultados

EnelcasodeA2Belefectoobservadofuesimilar,laexposicinaA2535incrementabalaexpresinun 82, 92 y 44% a las 6, 24 y 48 horas de exposicin, respectivamente, siendo todas estas variaciones estadsticamentesignificativas(p<0,05tras6y48horasdeexposicinyp<0,01tras24horasdeexposicin). CabedestacarqueparalosgenescorrespondientesalosreceptoresA2AyA3nosedetectmodulacin delaexpresingnicacomoconsecuenciadelaexposicinaA2535enclulasC6.
Figura109:EfectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnicadeA1,A2A,A2ByA3.ClulasC6fueronexpuestasaA253525M durante6,24o48horasosemantuvieronencondicionescontrolconelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiemporealse realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientesrealizadosporduplicadoempleandodistintasmuestras.*p<0,05,**p<0,01,significativamentediferenteconrespectoal control.
0.0
A Co nt A 25 rol M 25 A M 6h 25 2 M 4h 48 h A Co nt 2 r A 5 ol 25 M A M 6h 25 2 M 4h 48 h A Co nt 2 r A 5 ol 25 M A M 6h 25 2 M 4h 48 h A Co nt 2 r A 5 ol 25 M A M 6h 25 2 M 4h 48 h

2.5

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

2.0

* *

* ** *

A1 A2A A2B A3

1.5

1.0

0.5

Por tanto, se podra decir que la exposicin a A2535 en clulas C6 modula la expresin de los genes correspondientesalosreceptoresdeadenosinadeformadiferente,yaqueaumentalaexpresindeA1yA2B peronoladeA2AyA3.Porotrolado,enelcasodelreceptorA1,loscambiosobservadosaniveldelaexpresin gnicapodranexplicarlosaumentosenlacantidaddeprotenaquesedescribieronenapartadosanteriores. Sin embargo, en el caso del receptor A2A, estas variaciones en la cantidad de protena slo podran ser resultadodemodificacionesposttranscripcionales,yaquelosnivelesdeARNmdelgenquecodificaparaeste receptornosevenmoduladosenestemodelodetoxicidad. ParaterminarlosexperimentosconA2535enclulasC6serealizaronensayosdeRTPCRatiemporeal conobjetodecuantificarlasdiferenciasenlaexpresingnicadelosfactoresdetranscripcinCREByCREM, ambosrelacionadosconlavadelAMPcyconprocesosdeneurodegeneracin(Mantamadiotisycol.,2002).

177

Resultados

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide

Como se expone en la Figura 110, paneles A y B, la modulacin de la expresin gnica de estos dos factoresescompleja,aunquelaexposicinaA2535losmoduladelamismamanera.As,atiemposcortosde exposicinalfragmento2535seproduceunadisminucindeambosfactores,enconcretosuponeunaprdida del12%delARNmdetectadodeCREB(p<0,05)ydeun24%paraelARNmdeCREM(p<0,05).Sinembargo,sise prolonga el tiempo de exposicin se observa el efecto contrario, el ARNm codificante para ambos factores aumenta,un26%enelcasodeCREB(p<0,001)yun21%enelcasodelfactorCREM(p<0,05).Siseprolongala exposicinhastaelltimotiempoestudiadoseapreciaque,a48horasdeexposicin,losnivelesdeARNmde ambosfactoresdetranscripcinsonsimilaresaloscuantificadosenlasituacincontrol. A
1.4

B
1.4

Cambio en la expresin gnica de CREB (n veces sobre el control)

Cambio en la expresin gnica de CREM (n veces sobre el control)

***
1.2

*
1.2

1.0

1.0

*
0.8

0.8

0.6
6h 24 h 48 h tr ol A C on A A

0.6
6h on A A A 48 h 24 h tr ol C

Figura110:ElefectodelaexposicinaA2535sobrelaexpresingnicadelosfactoresCREByCREMdependedeltiempodeexposicin. ClulasC6fueronexpuestasaA253525Mdurante6,24o48horasosemantuvieronencondicionescontrolconelfindeaislarsuARN. Los experimentos de RTPCR a tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los genes codificantes para los factores de transcripcinCREB(panelA)yCREM(panelB).LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde3experimentosindependientesrealizadospor duplicadoempleandodistintasmuestras.*p<0,05,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

EstosresultadosindicanquelamodulacindelosfactoresdetranscripcinCREByCREMescomplejaen clulas C6 expuestas a A2535 y depende del tiempo de exposicin, lo que sugiere que el papel que estos factoresdetranscripcinjueganenlamodulacindelaexpresingnicatiene,almenostresfases:atiempos cortosdeexposicinalfragmentotxico(6h)laexpresindeCREByCREMdisminuye,conloque,apriori,se transcriben en menor cantidad genes implicados en proliferacin y supervivencia y podra estar relacionado conladisminucinenlaviabilidaddescrita.Sinembargo,tras24horasdeexposicin,ambosfactoresaumentan su expresin, lo que podra estar relacionado con el hecho demostrado de que la viabilidad no aumente al prolongareltiempodeexposicin.Porltimo,tras48horasdeexposicinlosnivelesdeexpresindeCREBy CREMyasehannormalizado,loquepodrasugerirque,enestascondiciones,lasclulasC6norequierenuna mayorexpresindeCREByCREMparasobreviviraA2535,pudiendoversecompensadosuefectotxico,por ejemplo,conajustesenenciclocelular

178

Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide d) Tablaresumen.

Resultados

Acontinuacinseexponenunatablaamododeresumenconlasprincipalesvariacionesobservadasen losexperimentosdescritosenesteapartado. A2535 6h A2535 24h A2535 48h


3

Bmax unin [ H]DPCPX KD unin [ H]DPCPX Bmax unin [ H]ZM241385 KD unin [ H]ZM241385 ARNmA1
3 3 3

A2535 6h

A2535 24h

A2535 48h

Viabildad ARNm caspasa3 Actividad caspasa3 Bmaxunin L[ H]Glu KDunin L[ H]Glu Protena mGlu1 ARNmmGlu1 Protena mGlu5 Protena mGlu2,3 Protena PLC1 ARNmPLC1
3 3

ARNmA2A ARNmA2B ARNmA3

ARNmCREB

ARNmCREM

Tabla 33: Resumen de los resultados obtenidos en clulas C6 expuestas a A2535 25 M. En esta tabla se exponen grficamente los resultados numricos descritos en este captulo. , no hay variacin estadstica, , se observa un aumento con respecto a la situacin control,,seobservaunadisminucinconrespectoalasituacincontrol.

IV.5Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno. IV.5.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza. Eltejidocerebralesparticularmentesensiblealdaooxidativo,elloesposiblementedebidoalelevado consumodeoxgenoporpartedeestetejido,loqueconllevaunaelevadaformacindeespeciesreactivasde oxgenoduranteelprocesodefosforilacinoxidativa(Castagneycol.,1999).Porestemotivoseus,duranteel

179

Resultados

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

desarrollodelapresenteMemoria,elperxidodehidrgenocomoagentecausantedeestrsoxidativoanivel molecular,yaquesehademostradosucapacidadoxidativasobreprotenas,lpidosyDNA. a) Efectoenlaviabilidadcelular. El primer paso consisti en comprobar el efecto que ejerca la exposicin a H2O2 sobre la viabilidad celulardeneuronascorticalesdecerebroderatainvitro.ComoseobservaenelpanelAdelaFigura111,se emple H2O2 en un rango de concentraciones variable (desde 50 hasta 500 M) durante 30 minutos de exposicin. As se determin que, en estas condiciones, la exposicin a H2O2 produca muerte celular de las neuronasencultivodeformadependientedelaconcentracin,llegandoenelcasomsextremoasuponeruna prdidaenlaviabilidaddeun30%conrespectoalasituacincontrol,siendoademsestecasoylaexposicin aH2O2250Mestadsticamentediferentesconrespectoalcontrol(50M:89,515,23;100M:87,666,89; 250M:75,495,33,p<0,05;500M:70,194,98%,p<0,05). A
Viabilidad (% respecto al control)

120 110 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100

120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Viabilidad (% respecto al control)

** *** ***

tr ol

m in

on

10 0

25 0

50 0

50

on

m in

m in

2O 2

2O 2

2O 2

30 min

2O 2

H2O2 500 M

Figura111:LaexposicinaH2O2disminuyelaviabilidadcelulardeformadependientedelaconcentracinydeltiempodeexposicin. NeuronascorticalesseexpusieronadistintasconcentracionesdeH2O2durante30minutos(panelA)yaH2O2500Mdurante15,30,45, 60y120minutos(panelB).TranscurridoestetiemposemidilaviabilidadcelularmedianteeltestbasadoenMTT.Losdatosexpuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por triplicado, expresados porcentualmente con respecto a la viabilidaddelasclulascontroles.*p<0,05,**p<0,01,***p<0,001significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

Dadoqueslosenecesitaban30minutosdeexposicinparaobservarunadisminucinenlaviabilidad de un 30% se ampli la exposicin a H2O2 a lo largo del tiempo con el fin de estudiar si el efecto que se producaalolargodeltiempoeratandramticocomoelobservadoenlosprimeros30minutos.Losresultados obtenidos para estos experimentos se exponen en el panel B de la misma Figura. Como se aprecia, la exposicin prolongada de neuronas corticales a estrs oxidativo, en estas condiciones, disminuye gradualmente la viabilidad celular conforme se prolonga el tiempo de exposicin al agente txico. As se aprecia,en elcaso de exposicin mxima estudiado, unadisminucinde un 74% en la viabilidad celular con

180

12 0

45

15

30

60

m in

m in

tr ol

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

Resultados

respecto a la situacin control. Por otro lado, a partir de los 30 minutos de exposicin todos los resultados obtenidossonsignificativamentediferentesconrespectoalasituacincontrol(15min:80,613,92;30min: 70,19 4,99, p<0,01; 45 min: 56,45 8,13, p<0,01; 60 min: 40,79 6,67, p<0,001; 120 min: 26,46 3,99%, p<0,001). EstosresultadosdemuestranquelaexposicindeneuronascorticalesaH2O2,emulandounasituacin de dao oxidativo, produce una disminucin gradual de la viabilidad celular dependiente tanto del tiempo como de la concentracin de agente txico empleada, indicando la vulnerabilidad de estas clulas al estrs oxidativo. DeformaadicionalserealizaronexperimentosdeRTPCRatiemporealconRNAaisladoencondiciones control y tras la exposicin a H2O2 500 M durante 30 minutos, tiempo y concentracin que producan una disminucindelaviabilidadapreciableperonodramtica,consondasespecficasparaelgenquecodificapara la caspasa 3, proteasa en la que, como se ha expuesto anteriormente, convergen las rutas de muerte apopttica. Como se aprecia en la Figura 112, no hay diferencias apreciables entre la expresin de este gen entre ambas condiciones, lo que sugiere que la muerte acontecida como consecuencia del dao oxidativo infringidoalasneuronascorticalespodraocurrirvanecrosisynovaapoptosis.
Figura112:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresinde caspasa3.NeuronascorticalesfueronexpuestasaH2O2500M durante30minutososemantuvieronencondicionescontrolcon elfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiemporeal se realizaron empleando una sonda especfica para el gen codificanteparalacaspasa3.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicadoempleandodistintasmuestras.

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

1.0

0.5

0.0

ro l

on t

b) ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato. Dada la relacin existente entre los receptores metabotrpicos de glutamato y ciertas enfermedades con elevada incidencia sobre la poblacin en las que se encuentra dao oxidativo a nivel celular, como por ejemplo la enfermedad de Alzheimer (Albasanz y col., 2005), se procedi a estudiar el papel que ejerca el estrs oxidativo sobre los receptores metabotrpicos de glutamato in vitro. Para ello, y en vista de los resultadospreviosdeviabilidad,sedecidiemplearenlosucesivoeltratamientodeH2O2500Mdurante30 minutos.

2O 2

181

Resultados

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

SeemplelatcnicadeuninderadioligandosusandoL[3H]Glucomoradioligando,agentequeseune a todos los receptores metabotrpicos presentes en la superficie celular. Los resultados obtenidos en estos experimentos en lo que al nmero de receptores y a la afinidad de los mismos se refiere, se exponen en la Figura 113. A continuacin de sta, Tabla 34, se muestran los parmetros cinticos obtenidos en cada condicin. A
Bm ax (pmol/mgprot)

2000

4000

1500

**
KD (nM)

3000

**
2000

1000

500

1000

0
l
2O 2

0
C on tr ol
C on H

Figura113:LaexposicinaH2O2modulalosreceptoresmetabotrpicosenlasuperficiecelular.NeuronascorticalesseexpusieronaH2O2 500Mdurante30minutos.SerealizaronensayosdeuninderadioligandoempleandoL[ H]Glu.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando diferentes cultivos. Los parmetros cinticos calculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism 5.0.**p<0,01significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

Bmx(pmol/mg) KD(nM)
Tabla34:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninderadioligandosenneuronascorticalesexpuestasaH2O2. En esta tabla se exponen los resultados numricos obtenidos para el clculo de los parmetros cinticos. ** p<0,01 significativamente diferenterespectoalcorrespondientecontrol.

Control 577,2329,41 3117,9768,73

H2O2500M30min 1284,80165,58** 1749,58344,59**

Comoseexponeenlatablaanterior,losdatosobtenidos,tantoaniveldelnmerodereceptorescomo en lo que a la afinidad de los mismos por su ligando se refiere, muestran variaciones significativas entre la neuronascorticalesenlasituacincontrolytraslaexposicindelasmismasaH2O2.Enconcreto,elnmero total de receptores metabotrpicos de glutamato aumenta en un 123% mientras que la KD de los mismos disminuyeun44%. Estos resultados sugieren que la exposicin de neuronas corticales a estrs oxidativo modula la expresindelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatotantoencantidadcomoenafinidad.

182

2O 2

tr o

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

Resultados

Unestudiomsdetalladodelavariacindelosreceptoresmetabotrpicossellevacaboempleando anticuerpos extracelulares especficos para los subtipos mGlu1, mGlu5 y para los receptores incluidos en el grupoII(mGlu2,3),detalformaquelafijacindelasclulassinpermeabilizacinposteriornospermitirealizar unseguimientodelaexpresindecadaunodelossubtiposantesmencionadosporinmunofluorescenciatras laexposicindelasneuronascorticalesaH2O2. En la Figura 114, panel A, se exponen micrografas representativas de las inmunofluorescencias realizadasensituacincontrolytraslaexposicinaH2O2paralosanticuerposmGlu1,mGlu5ymGlu2,3.Enel panelB,semuestralosvaloresobtenidosenlacuantificacindelafluorescenciadelasimgenesobtenidasen cadacondicin.LaTabla35resumelasvariacionesobservadas. A
Fluorescencia (unidades arbitrarias)

150000

mGlu1 mGlu5 mGlu2,3

Figura 114: Inmunodeteccin de mGlu1, mGlu5 y mGlu2,3

tras la exposicin a H2O2. Panel A. Micrografas representativas de los resultados obtenidos tras los experimentos de inmunofluorescencia al emplear los anticuerpos para mGlu1, mGlu5 y mGlu2,3 en neuronas

100000

50000

**

corticales controles y expuestas a H2O2 500 M durante 30 minutos. La barra representa 62 m. Panel B. Diagrama de barras que resume los resultados expuestos en el panel A. LascuantificacionesserealizaronusandoelsoftwareLASAF

0
C on tr ol H 2O C on tr ol H 2O ol
2 2

empleando un mnimo de 30 campos por condicin experimental.SeexponenlasmediasSEMobtenidaspara


2O 2

C on tr

cada condicin experimental. * p<0,05, ** p<0,01 significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

183

Resultados

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno mGlu1 ** mGlu5 mGlu2,3 *

H2O2500M30min

Tabla35:ResumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeinmunofluorescenciaenneuronascorticalesexpuestasaH2O2.Se muestra el sentido de la variacin observada con respecto al correspondiente control mediante flechas: aumenta; disminuye. * p<0,05,**p<0,01significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

Como se aprecia en la tabla anterior la exposicin a H2O2 modula de manera subtipoespecfica los receptores metabotrpicos de glutamato. Se observa que los subtipos del grupo I son diferencialmente modulados, mientras que el subtipo mGlu1 sufre un aumento porcentual de un 51% sobre su presencia en membranaenlasituacincontrol,elsubtipomGlu5noseveregulado.Porotrolado,seobservaqueparalos subtipos del grupo II tambin ocurre un aumento de su presencia en membrana de un 174% como consecuenciadelaexposicinaH2O2. Existen referentes bibliogrficos acerca de la relacin existente entre el estrs oxidativo, la muerte celularylaliberacindecalciointracelular.DadoquesehademostradoelincrementodemGlu1aniveldela membrana plasmtica y que este subtipo est acoplado a la enzima PLC, capaz de controlar la liberacin de calciodelretculoendoplsmico,elsiguientepasofuecomprobarsielsistemadelaPLCseencontrabaalterado como consecuencia de la exposicin de las neuronas corticales a H2O2. Para ello se realizaron medidas de la actividadenzimticaPLCtalycomosedescribeenMtodos. As,comoseexponeenlaFigura115,sedetectquelaactividadbasaldeestaenzimaseencontraba ligeramentealterada,enconcretolosvaloresbasalesresultabanserun46%mselevadosdurantelasituacin deestrsoxidativoqueenlasituacincontrol.
Actividad PLC basal (pmol/mgmin)
50

40
Figura115:LaexposicinaH2O2noafectalaactividadPLC basal.NeuronascorticalesfueronexpuestasonoaH2O2500 M durante 30 minutos antes de realizar los ensayos

30

20

enzimticos para la acumulacin de IP3 basal. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos

10

independientes realizados por duplicado empleando distintoscultivos.

0
C on tr ol H
2O 2

184

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

Resultados

AcontinuacinserecurrialusodeagonistasyantagonistasespecficosdelossubtiposmGlu1ymGlu5 conelfindeestudiarsuefectosobreelsistemadelaPLC,enconcretoseemple(S)DHPG,agonistaespecfico delosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI,yJNJ16259685yMPEP,antagonistasespecficosdelossubtipos mGlu1ymGlu5,respectivamente.


140 180

160

Control H2O2

** ***

Actividad PLC (% del basal)

120

100

80

DHPG 30 M

DHPG + JNJ 0,5 M

DHPG + MPEP 1 M

Figura 116: La exposicin a H2O2 afecta a la funcionalidad de los receptores metabotrpicos del grupo I. Neuronas corticales fueron expuestas o no a H2O2 500 M durante 30 minutos antes de realizar los ensayos enzimticos para la acumulacin de IP3. Se estudi el efecto de la exposicin a H2O2 sobre la funcionalidad del sistema estimulado por DHPG, agonista del grupo I de los receptores metabotrpicos de glutamato, as como el papel de los subtipos mGlu1, inhibido por JNJ, y mGlu5, inhibido por MPEP, en dicha funcionalidad. Los datos expuestos son las medias SEM de, al menos, 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos cultivos. ** p<0,01, *** p<0,001, significativamente diferente con respecto a su basal; p<0,05 grupos significativamentediferentes.

Los resultados obtenidos en estos experimentos se exponen en la Figura 116. Como se observa, la estimulacin de los receptores del grupo I produce un aumento en la cantidad de IP3 formado en ambas situaciones, este hecho es, adems, significativo estadsticamente con respecto a cada situacin basal ((S)DHPG: Control: 138,42 1,26, p<0,001; H2O2: 149,58 3,76%, p<0,01). Estos datos, adems, revelan diferenciassignificativascuandosecomparanentres(p<0,05). CuandoseemplearonlosantagonistasdelossubtiposmGlu1ymGlu5seobserventodosloscasosuna disminucin en la cantidad de IP3 formado. Sin embargo estos resultados no presentaban diferencias significativasentres((S)DHPG+JNJ:Control:105,985,33;H2O2:114,336,28%.(S)DHPG+MPEP:Control: 111,444,30;H2O2:114,899,28%). Deestosexperimentossededucequeaparentementelaactividadbasalesmayorenneuronascorticales expuestasaH2O2,aunquelasdiferenciasnosonestadsticamentesignificativas,yquelacapacidaddelgrupoI de receptores metabotrpicos de estimular el sistema de la PLC es, en estas condiciones, tambin mayor, presumiblementeporcausadelincrementoenlacantidaddemGlu1enlamembranaplasmtica.Sinembargo, losexperimentosdeinhibicindelaestimulacinPLCporempleodeantagonistasespecficosdelossubtipos

185

Resultados

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

mGlu1 y mGlu5 no arrojaron luz sobre el papel de cada subtipo en la estimulacin de la PLC en ambas condiciones. UnavezcomprobadoelefectodelaexposicinaH2O2sobrelacantidaddereceptoresenlasuperficie celularysucapacidaddeestimulacindelsistemadelaPLC,seprocediacomprobarsiloscomponentesdel sistemaestudiadosufrancambiosaniveldelaexpresingnica.ParaelloserealizaronensayosdeRTPCRa tiemporealenlosqueseemplearonsondasespecficasparalosgenesquecodificanparalasprotenasmGlu1, mGlu5yPLC1.ComoseexponeenlaFigura117,laexposicinaH2O2produceunadisminucinsignificativaen el caso de los genes codificantes para mGlu1 y PLC1. En concreto se cuantific una disminucin de un 37% (p<0,05)ydeun26%(p<0,05),respectivamente.SinembargolaexpresingnicademGlu5noseveaalterada comoconsecuenciadelaexposicindeneuronascorticalesaH2O2. EstosresultadosapuntanaquelasvariacionesobservadasaniveldelacantidaddeprotenademGlu1 delaactividadPLCtraslasexposicionesaH2O2,nopuedenserexplicadasporcambiosenlaexpresingnica demGlu1nidePLC1.
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)
1.0

mGlu1 mGlu5 PLC 1


1.0

*
0.5

0.5

0.0

0.0

C on tr ol

C on tr ol

C on tr

Figura117:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnicademGlu1,mGlu5yPLC1.Neuronascorticalesfueronexpuestasa H2O2 500 M durante 30 minutos o se mantuvieron en condiciones control con el fin de aislar su ARN. Los experimentos de RTPCR a tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintasmuestras.*p<0,05significativamentediferenteconrespecto alcontrol.

ConelfindecompletaresestudiodelefectoqueejercalaexposicindeneuronascorticalesaH2O2in vitrosobrelosreceptoresmetabotrpicos,seanalizlavaprincipalalaqueestnacopladoslosgruposIIyIII deestosreceptores,lainhibicindelaadenilatociclasa,controlando,deestamanera,losnivelesdelsegundo mensajeroAMPc.ElestudiodelaactividadbasaldelaAC,expuestoenlaFigura118,desvelaquelaexposicin aH2O2noproducecambiossignificativosdichaactividad.

186

ol

2O 2

2O 2

2O 2

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno
Actividad AC basal (pmol/mgmin)
Figura 118: Efecto de la exposicin a H2O2 sobre la actividad AC basal. Neuronas corticales fueron expuestas o no a H2O2 500 M durante30minutosantesderealizarlosensayosenzimticosparala acumulacin de AMPc basal. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleandodistintoscultivos.

Resultados


0
C on tr ol H
H
2O 2

En la Figura 119 se estudi el efecto que ejercan agonistas especficos de los grupos II y III de los receptoresmetabotrpicosdeglutamatosobrelaactividadACestimuladadirectamenteconForskolina.Para ello,seemplearonlosligandos(2R,4R)APDC,agonistadelgrupoII,yLAP4,agonistadelgrupoIII.Comose observaenelpanelAdelamencionadaFigura,elempleode(2R,4R)APDCenneuronasexpuestasaestrs oxidativo proporciona una inhibicin mayor de la actividad AC previamente estimulada con forskolina (% inhibicin: Control: 42,76 5,60; H2O2: 67,63 4,34), la cual resultaba significativa desde un punto de vista estadstico(p<0,05).
Inhibicin mediada por (2R,4R)-APDC (% de la actividad Forsk)

100

B
Inhibicin mediada por L-AP4 (% de la actividad Forsk)
60

80

60

40

40

20

20

0
ro l on t
2O 2

Figura119:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaactividadACmediadaporlosreceptoresmGlu.Neuronascorticalesfueronexpuestaso noaH2O2500Mdurante30minutosantesderealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeAMPc.Seestudielefectodela exposicinaH2O2sobrelafuncionalidaddelsistemainhibidoporunagonistadelgrupoIIdelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato, (2R,4R)APDC 100 M (panel A), y por un agonista del grupo III, LAP4 100 M (panel B). Los resultados se expresan como el tanto por ciento de la inhibicin observada sobre la estimulacin de forskolina 100 nM (Forsk). Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos cultivos. * p<0,05 significativamente diferente de su correspondientecontrol.

on

tr o

2O 2

187

Resultados

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

Porotrolado,enelpanelBdelamencionadafiguraseexponenlosresultadosobtenidosalactivarlos receptoresdelgrupoIIIempleandoelligandoLAP4.Comoseobserva,losdatosdelainhibicinobtenidaen ambos grupos experimentales sobre la actividad AC previamente estimulada, demuestran que no existen diferenciassignificativasenlacapacidaddeLAP4deinhibirlaAC(%inhibicin:Control:26,533,29;H2O2: 33,921,84). Por tanto, tomando estos resultados en su conjunto se puede afirmar que la va de la AC resulta afectada en la situacin de estrs oxidativo slo en el caso de los receptores metabotrpicos del grupo II, observndoseunapotenciacindeestavadeinhibicin. c) Receptoresdeadenosina.

Al igual que los receptores metabotrpicos de glutamato, los receptores de adenosina se han visto relacionadosrecientementecondeterminadasenfermedadesneurodegenerativas.Porestemotivoelestudio del efecto del estrs oxidativo in vitro se ampli a los receptores de adenosina y su va de transduccin principal,laenzimaadenilatociclasa. El primer paso fue cuantificar si exista variacin entre los receptores de adenosina a nivel de la superficie celular como consecuencia de la exposicin de neuronas corticales a H2O2, para ello se emple la tcnicadeuninderadioligandos.EnelcasodelreceptorA1seempleelantagonistatritiado[3H]DPCPX,los resultadosobtenidossemuestranenlaFigura120.UnresumendeestosexperimentossemuestraenlaTabla 36. A
Bm a x (pmol/mg prot)

0.5

0.4

***
KD (nM)

10.0

***

0.3

7.5

0.2

5.0

0.1

2.5

0.0
2O 2

0.0

on tr ol

on tr

Figura 120: La exposicin a H2O2 modula los receptores A1 en la superficie celular. Neuronas corticales se expusieron a H2O2 500 M durante30minutos.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]DPCPX.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde3 experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentescultivos.Losparmetroscinticoscalculados,Bmax(panelA)y KD (panel B), se obtuvieron a partir de los resultados experimentales empleando el software GraphPad Prism 5.0. *** p<0,001 significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

188

2O 2

ol

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno Bmx(pmol/mg) KD(nM) Control 0,1490,007 1,160,16

Resultados

H2O2500M30min 0,3800,027*** 9,210,50***

Tabla36:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[ H]DPCPXenneuronascorticalesexpuestasaH2O2.En esta tabla se exponen los resultados numricos obtenidos para el clculo de los parmetros cinticos. *** p<0,001 significativamente diferenterespectoalcorrespondientecontrol.

ComoseexponeenlaTabla36,laexposicindeneuronascorticalesaH2O2modulabatantolacantidad comolaafinidaddelosreceptoresA1enlasuperficiecelular.SeapreciaqueelnmerototaldereceptoresA1 en condiciones de estrs oxidativo aumenta en un 155% (p<0,001). Adems, en estas condiciones los receptoressufranunadisminucinmuymarcadaenlaafinidadquedemuestranporsuligando,enconcretoel valordeKDobservadotraslaexposicinaH2O2 es7,9vecesmayorqueelobservadoencondicionescontroles (p<0,001). Por otro lado, para el estudio de los receptores A2A de adenosina se emple el antagonista [ H]ZM241385 en los ensayos de unin de radioligandos, como se expone en la Figura 121. Los resultados obtenidosenestosexperimentosseresumenenlaTabla37. A
Bm x (pmol/mgprot)
3

0.8

20

0.6

15

KD (nM)

**
0.4

10

0.2

0.0
on tr ol
2O 2

0
C on tr ol
C H

Figura 121: La exposicin a H2O2 modula los receptores A2A en la superficie celular. Neuronas corticales se expusieron a H2O2 500 M durante30minutos.Serealizaronensayosdeuninderadioligandoempleando[ H]ZM241385.LosdatosexpuestossonlasmediasSEM de,almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodiferentescultivos.Losparmetroscinticoscalculados, Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirdelosresultadosexperimentalesempleandoelsoftwareGraphPadPrism5.0.**p<0,01 significativamentediferenteconrespectoalcontrol.
3

2O 2

189

Resultados

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno Control 0,6560,051 13,260,26 H2O2500M30min 0,4360,033** 11,661,76

Bmx(pmol/mg) KD(nM)

Tabla37:Resumendelosresultadosobtenidosenlosexperimentosdeuninde[ H]ZM241385enneuronascorticalesexpuestasaH2O2. En esta tabla se exponen los resultados numricos obtenidos para el clculo de los parmetros cinticos. ** p<0,01 significativamente diferenterespectoalcorrespondientecontrol.

ComosehaexpuestoenlaTabla37,denuevo,laexposicinaH2O2enneuronascorticalesmodulaun receptor acoplado a protena G a nivel de membrana plasmtica, en este caso el receptor A2A disminuye su presenciaenlamembranaplasmticaenun34%comoconsecuenciadelestrsoxidativo(p<0,01)sinqueello afectealaafinidadporsuligando. Estos resultados, tomados en conjunto, indican que la exposicin a H2O2 modula la presencia de los receptores de adenosina a nivel de la membrana celular aumentando, en el caso del receptor A1, o disminuyendo,enelcasodeA2A.Ademsdecomprobarqueelestrsoxidativomoduladeformaopuestalos receptoresdeadenosinaA1yA2Asehademostradoqueestaregulacinnoocurresloaniveldelacantidadde receptor,sinoquetambinesespecficaparalaafinidaddelosmismosporsuligando,aslaafinidaddelos receptoresA1porsuligandodisminuyemientrasqueladelosA2Anoresultaafectadaenesteproceso. Unavezcuantificadosloscambiosenlacantidaddeprotena,seprocediacomprobarsilaexposicin de neuronas corticales a H2O2 modulaba la expresin gnica de los receptores de adenosina. Para ello, se realizaronensayosdeRTPCRconsondasespecficasparalosgenesquecodificanparalosreceptoresA1,A2Ay A2B(Figura122). Comoseobserva,tantoparalosgenesquecodificanparalosreceptoresA1comoA2Anoseobservan variacionesenlacantidaddeARNmdetectado,aunqueseobservaunaciertatandenciaascendente.Porotro lado, cuando se estudi el receptor A2B se detect un aumento muy relevante de la cantidad de ARNm correspondienteaestereceptortraslaexposicinaH2O2,enconcretolacantidaddeARNmaumentabaen3,2 vecesconrespectoalcontrol(p<0,05). Portanto,estosresultadosapuntanaqueexistemodulacindelaexpresingnicadelreceptorA2B,el cualaumentasuexpresincomoconsecuenciadelaexposicindeneuronascorticalesaH2O2.Sinembargo,en elcasodelosreceptoresA1yA2Anopareceexistirmodulacindesuexpresingnica.

190

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno
0
C on tr ol C on tr ol C on tr ol
2O 2 2O 2

Resultados

A1 A2A A2B

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

Figura122:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnicadeA1,A2AyA2B.NeuronascorticalesfueronexpuestasaH2O2500M durante 30 minutos o se mantuvieron en condiciones control con el fin de aislar su ARN. Los experimentos de RTPCR a tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientesrealizadosporduplicadoempleandodistintasmuestras.*p<0,05significativamentediferenteconrespectoalcontrol.

Ademsseplanteelestudiodelaprincipalvadetransduccinalaqueestnacopladoslosreceptores deadenosina,lamodulacindelaactividadAC.Unavezms,secuantificlacantidaddeAMPcenneuronas corticales expuestas o no a estrs oxidativo, como se expone en la Figura 123. Se observ (panel A) que la capacidad del ligando CHA de inhibir la actividad AC previamente estimulada con forskolina aumentaba en neuronascorticalessometidasaestrsoxidativo,esdeciraumentabalacapacidaddelsistemadetransduccin delreceptorA1(%inhibicin:Control:24,952,89;H2O2:40,111,84,p<0,01). Sin embargo, en el caso del receptor A2A, panel B, lo que se observaba era que los receptores A2A presentaban una menor capacidadde transduccin de la seal, ya que al ser estimulados con CGS21680 se observaba una cantidad significativamente menor de AMPc formado con respecto a la situacin control (% estimulacin:Control:174,333,64;H2O2:143,641,06,p<0,01). Estosresultadosrevelanque,comoconsecuenciadelestrsoxidativoalquesesometialasneuronas corticales de cerebro de rata in vitro, la va de transduccin de seales mediada por los receptores de adenosinaresultalterada,modificndoselacapacidaddelosreceptoresA1yA2Aparacontrolarlasvariaciones enlosnivelesdelsegundomensajeroAMPcenelmismosentidoenquevarandichosreceptores.

2O 2

191

Resultados A
Actividad AC inhibida por CHA (% de Forsk)
60

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno B

Actividad AC estimulada por CGS 21680 (% del basal)

200 175 150 125 100

40

**

**

20

0
l
2O 2

0
on tr ol C H
2O 2

on t

ro

Figura123:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaactividadACmediadaporlosreceptoresdeadenosina.Neuronascorticalesfueron expuestasonoaH2O2500Mdurante30minutosantesderealizarlosensayosenzimticosparalaacumulacindeAMPc.Seestudiel efectodelaexposicinaH2O2sobrelainhibicindelaactividadACporelreceptorA1(panelA),empleandoelagonistaespecficoCHAa1 Mparainhibirlaactividadestimuladaporforskolina100nM(Forsk).TambinsecomproblaestimulacindelaactividadACpromovida porelreceptorA2A(panelB),paralocualseempleelagonistaespecficoCGS21680a1M.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde, almenos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintoscultivos.**p<0,01significativamentediferentede sucorrespondientecontrol.Actividadbasal:Control:2.910.60;Tratada:3.300.87pmol/mgmin.

El ltimo apartado de este estudio comprendi el anlisis por RTPCR a tiempo real de las posibles variaciones que surgieran en los factores de transcripcin CREB y CREM, relacionados ambos con la va del AMPc.ComoseexponeenlaFigura124,seproduceunadisminucindelaexpresingnicadeambosfactores detranscripcinconstitutivos.EnelcasodelgenquecodificaparaCREBsedetectunadisminucindeun26% enlacantidaddeARNmdetectado,mientrasquefuedeun36%enelcasodesumoduladorCREM.Enambos casoslosresultadosobtenidosfueronestadsticamentesignificativos(p<0,01yp<0,05,respectivamente).
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control) CREB
1.0

CREM

Figura124:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnica delosfactoresCREByCREM.Neuronascorticalesfueronexpuestasa

**
0.5

H2O2 500 M durante 30 minutos o se mantuvieron en condiciones

control con el fin de aislar su ARN. Los experimentos de RTPCR a tiempo real se realizaron empleando sondas especficas para los genescodificantesparalosfactoresdetranscripcinmostrados.Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05, ** p<0,01 significativamente diferente con respectoalcontrol.

0.0

ro l

2O 2

ro l on t C

on t

Estos resultados, tomados en conjunto, sugieren que los procesos de transduccin de seales que se producencomoconsecuenciadeunaumentoenlacantidaddelsegundomensajeroAMPcocurrenenmenor

192

2O 2

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

Resultados

medidaencondicionesdeestrsoxidativoenneuronascorticalespordosmotivos,laenzimaACpresentauna capacidad de ser estimulada menor y una capacidad de ser inhibida mayor y, por otro lado, factores de transcripcinmoduladoporAMPc(CREByCREM)disminuyensuexpresinenestascondiciones. d) Tablaresumen. Acontinuacinseexponenunatablaamododeresumenconlasprincipalesvariacionesobservadasen losexperimentosdescritosenesteapartado.
Viabildad ARNmcaspasa3 BmaxuninL[ H]Glu KDuninL[ H]Glu ProtenamGlu1 ARNmmGlu1 ProtenamGlu5 ARNmmGlu5 ProtenamGlu2,3 ARNmPLC1 ActividadPLCbasal ActividadPLCGrupoI
3 3

H2O2500M0,5h
ActividadACbasal ActividadACGrupoII ActividadACGrupoIII Bmax unin [ H]DPCPX KDunin[ H]DPCPX Bmaxunin[ H]ZM241385 KDunin[ H]ZM241385 ARNmA1 ARNmA2A ARNmA2B ActividadA1/AC ActividadA2A/AC ARNmCREB ARNmCREM
3 3 3 3

H2O2500M0,5h

Tabla 38: Resumen de los resultados obtenidos en neuronas corticales expuestas a H2O2. En esta tabla se exponen grficamente los resultados numricos descritos en este captulo. , no hay variacin estadstica, , se observa un aumento con respecto a la situacin control,,seobservaunadisminucinconrespectoalasituacincontrol.

IV.5.2EnclulasC6degliomaderata. Comosehacomentadoenapartadosanterioreseltejidocerebralesparticularmentesensiblealdao oxidativoinducidoporlasespeciesreactivasdeoxgeno.Porello,seamplielestudiodeldaoinducidoporla exposicin a H2O2 al modelo celular de clulas C6 de glioma de rata, modelo que, dependiendo de factores comolascondicionesdecultivo,poseepropiedadesoligodendrocticas,astrocticasoneuronales(Parkerycol., 1980).

193

Resultados

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

a) Efectoenlaviabilidadcelular. ElprimerpasodeesteestudiofuecomprobarsielefectotxicodelaexposicinaH2O2descritoenlas neuronas corticales se reproduca en el modelo de C6. Los resultados obtenidos para estos experimentos se exponenenlaFigura125.EnelpanelAsemuestraelefectoqueejercasobrelaviabilidadcelularlaexposicin adistintasconcentracionesdeH2O2durante30minutos.Comoseobserva,slolaexposicinaH2O2500M produjounadisminucindelaviabilidadcelularsignificativadeun16%conrespectoalcontrol,comoocurra enneuronascorticales(Control:100,005,54;H2O2500M30:84,271,64%,p<0,05). A
110

B
110

Viabilidad (% respecto al control)

Viabilidad (% respecto al control)

100 90 80 70 60

100 90 80 70 60

0
ro l
M M M

0
10 0 25 0 50 0 C on 50 12 0' 15 ' 30 ' 45 '
M

on t

tr ol

H2O2 30 min

H2O2 500M

Figura125:LaexposicinaH2O2disminuyelaviabilidadcelular.ClulasC6seexpusieronadistintasconcentracionesdeH2O2durante30 minutos(panelA)yaH2O2500Mdurante15,30,45,60y120minutos(panelB).Transcurridoestetiemposemidilaviabilidadcelular medianteeltestbasadoenMTT.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde3experimentosindependientesrealizadosportriplicado, expresados porcentualmente con respecto a la viabilidad de las clulas controles. * p<0,05, ** p<0,01 significativamente diferente con respectoalcontrol;nsnosignificativo.

UnestudiodeldaoproducidoporlaexposicinaH2O2alolargodeltiemposepresentaenelpanelB. Paraelloseemplelaconcentracinde500M,lacualsehademostradoqueproducamuertecelularalos30 minutos de exposicin. Como se observa en dicho panel, el dao producido sobre las clulas C6 como consecuencia de la exposicin a H2O2 comienza a ser significativo a partir de los 30 minutos de exposicin, aunquealos15minutosyaseobservaunadisminucindelaviabilidad.Sinembargostenoaumentasise prolonga el tiempo de exposicin hasta los 120 minutos, es decir, el efecto txico de la exposicin a H2O2 ocurreenlos30minutosprimerosdeexposicin(Control:99,625,54;15:86,511,56;30:84,271,64, p<0,05;45:81,432,04,p<0,05;60: 80,98 2,55, p<0,05; 120: 81,30 3,28%, p<0,05). El anlisis

estadsticodelosdatosobtenidosalolargodelostiemposdeexposicindemuestranquenoexistevariacin significativa entre la disminucin de la viabilidad descrita a 30 minutos de exposicin a H2O2 500 M y las observadasa45,60y120minutosdeexposicin.

194

60 '

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

Resultados

Estos resultados indican que la exposicin a H2O2 produce una disminucin de la viabilidad a una concentracinde500M,conlaparticularidaddequeeldaoproducidosobrelasclulasC6noaumentasise prolongaeltiempodeexposicinaesteagentetxicodesdelos30minutosdeexposicinhastaunmximode doshoras. Dado que existen antecedentes bibliogrficos que proponen que el dao oxidativo en clulas C6 producemuertecelularmediadaporlavadelascaspasas(Marangoloycol.,2001)yconelfindevalidarel modeloexperimentaldedaooxidativoempleado(laexposicindeC6aH2O2500Mdurante30minutos)se comprob si la exposicin de estas clulas a H2O2 produca un aumento de la expresin gnica del gen que codifica para la caspasa 3. Para ello, se aisl RNA total de clulas C6, en condiciones controles y tras la exposicin de estas clulas a H2O2, y se emple en experimentos de RTPCR a tiempo real. Los resultados obtenidosseexponenenlaFigura126.Comoseobserva,laexposicinaH2O2enestascondicionesproduceun aumento en la expresin gnica de la caspasa 3, este aumento porcentualmente se corresponde con un incremento de un 119% en la expresinde suARNm con respecto a lasituacin control. Por otro lado, este aumentoresultasignificativosegneltestestadsticoempleado(p<0,05).
Figura126:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaactividad de caspasa 3. Clulas C6 fueron expuestas a H2O2 500 M durante 30 minutos o se mantuvieron en condiciones control Posteriormente se realizaron ensayos de actividad enzimtica especficos de caspasa 3 empleando el kit comercialdescritoenMtodos.Losdatosexpuestossonlas mediasSEMde3experimentosindependientesrealizados por duplicado empleando distintos pases. * p<0,05 significativamente diferente con respecto a la actividad control.

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

*
2

C on tr ol

Estosresultadossugierenqueelmodelodedaooxidativoempleadoesvlidopuestoqueseajustaa dos hechos bsicos recogidos en la bibliografa para el dao producido por H2O2: la exposicin a H2O2 disminuyelaviabilidadcelularylohaceactivandolavadelascaspasas. b) ReceptoresmetabotrpicosdeGlutamato. Debido a la variacin de los receptores metabotrpicos de glutamato en algunas enfermedades neurodegenerativasquecursanconaumentodelasespeciesreactivasdeoxgeno,seestudisilaexposicina H2O2enclulasC6degliomaderataejercaalgnefectosobrelacantidaddeestosreceptoresenlamembrana plasmtica.Paraello,seaislaronmembranasplasmticasdelasclulasC6encondicionesnormalesytrasser expuestas durante 30 minutos a la presencia de H2O2 500 M. Estas membranas fueron separadas

2O 2

195

Resultados

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

electroforticamenteparaserdespusinmovilizadasenmembranasdenitrocelulosa,lascualesseincubaron con anticuerpos especficos para los subtipos 1 y 5 y con anticuerpos especficos para los receptores metabotrpicos delgrupo II(subtipos 2y3).As en laFigura 127 se muestran los resultados obtenidos para estosexperimentosdeWesternblot. ComoseobservaenelpanelA,paraelreceptormGlu1seobservaunaumentodeun32%enlacantidad total de protena en membrana (p<0,05). Para mGlu5 el anlisis densitomtrico demuestra que ocurre una disminucinsignificativadeun32%enlacantidaddeestaprotenapresenteenlamembranaplasmticatrasla exposicinaesteagentetxico(p<0,01).Porltimo,enelpanelCseexponenlosdatosobtenidosparaelcaso delosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoII,paraloscualesseempleunanticuerpocapazdedetectartanto elsubtipo2comoelsubtipo3dedichosreceptores.Talycomoseexpone,seobservaunaumentodeun22% deestegrupodereceptorestraslaexposicinaH2O2.Sinembargo,esteaumentonoresultasersignificativo cuandoessometidoaunanlisisestadstico(p=0,104). Estos resultados indican que la exposicin a H2O2 500 M durante 30 minutos es suficiente para modularlapresenciadealgunosdelosreceptoresmetabotrpicossiendoestamodulacinademsespecfica para cada subtipo. As, para los subtipos incluidos dentro del grupo I la exposicin a H2O2 produce efectos antagnicos,mientrasqueaumentalapresenciaenmembranaplasmticadelsubtipomGlu1,disminuyeladel subtipo mGlu5. Sin embargo, debido a que el anticuerpo empleado en el caso del grupo II es sensible a las formasmGlu2ymGlu3,noesposibleespecificarsilasvariacionesqueocurrendentrodeestegrupo,aunno siendosignificativasensuconjunto,sonespecficasdecadasubtipodelreceptor.Debidoalasvariacionestan especficas que se describieron para los subtipos del grupo I, el siguiente paso fue comprobar si el principal sistemaalqueestacopladoelgrupoIdereceptoresmetabotrpicosdeglutamatoseveatambinalterado comoconsecuenciadelaexposicinaH2O2enclulasC6degliomaderata.Paraellosesiguiempleandola tcnicadeWesternblotusandoanticuerposespecficoscontralaisoforma1delaprotenaPLC. Los resultados obtenidos en estos experimentos se exponen en la Figura 128. En el panel superior se muestranimgenesdeblotsrepresentativosdelosobtenidos,mientrasqueenlaparteinferiorsemuestrael anlisis densitomtrico de los resultados obtenidos as como el anlisis estadstico de los mismos. Como se observa,laexposicinaH2O2produceunaumentosignificativoenlacantidadtotaldeprotenaPLC1decasi tresvecesconrespectoalasituacincontrol(p<0,05). Estosresultadossugierenquelaprincipalvadetransduccinalaqueestnacopladoslosreceptores metabotrpicosdelgrupoIsevealteradacomoconsecuenciadeexposicinaH2O2.

196

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno A mGlu1
-Actina

Resultados

140 kDa 45 kDa

B
mGlu5 -Actina Control H2O2
0.4

130 kDa 45 kDa + + + + -

Control
Densidad mGlu 1/ -Actina (unidades arbitrarias) H2O2

+ -

+ -

1.5

1.0

Densidad mGlu 5/ -Actina (unidades arbitrarias)

0.3

**

0.2

0.5

0.1

0.0

0.0

on tr ol

2O 2

ol

on tr

C
Figura127:LaexposicinaH2O2regulademanerasubtipo

mGlu2,3 -Actina Control H2O2


1.5

100 kDa 45 kDa + + + + -

especficalosreceptoresmGlu.ClulasC6fueronexpuestas o no a H2O2 500 M durante 30 minutos antes de realizar aislamientos de membranas plasmticas por centrifugacin diferencial, tal y como se describe en Mtodos. Se emplearon 30 g de cada muestra en la separacin electrofortica. Tras la inmovilizacin se emplearon anticuerposespecficosparalosreceptoresmGlu1(panelA), mGlu5 (panelB),mGlu2,3(panelC)yparalaprotenaactina comocontrolde carga.Seexponeenelpanelsuperioruna

Densidad mGlu 2,3 / -Actina (unidades arbitrarias)

1.0

imagen representativa, los pesos moleculares indicados representan la altura aproximada de las bandas densitometradas. En el panel inferior se muestran los

0.5

resltados del anlisis densitomtrico de las bandas obtenidas. Los datos expuestos son las medias SEM de 2 experimentos independientes empleando distintas

muestras. * p<0,05, ** p<0,01 significativamente diferente

0.0

delcorrespondientecontrol.

on t

2O 2

ro

2O 2

197

Resultados
PLC 1
-Actina

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno
150 kDa 45 kDa + + + + Figura 128: La exposicin a H2O2 regula al alza la protena PLC1. Clulas C6 fueron expuestas o no a H2O2 500 M durante 30 minutos antes de realizar aislamientos de

Control H2O2
1.5

membranasplasmticasporcentrifugacindiferencial,taly comosedescribeenMtodos.Seemplearon30gdecada muestra en la separacin electrofortica. Tras la inmovilizacin se emplearon anticuerpos especficos para

Densidad PLC 1/ -Actina (unidades arbitrarias)

*
1.0

PLC1yparalaprotenaactinacomocontroldecarga.Se exponeenelpanelsuperiorunaimagenrepresentativa,los pesos moleculares indicados representan la altura aproximada de las bandas densitometradas. En el panel

0.5

inferiorsemuestranlosresltadosdelanlisisdensitomtrico delasbandasobtenidas.Losdatosexpuestossonlasmedias SEM de 2 experimentos independientes empleando

0.0

distintasmuestras.*p<0,05significativamentediferentedel correspondientecontrol.
C on tr ol
2O 2

Porltimo,secomprobsilasdiferenciasobservadasenloscomponentesdelsistemadeestudioanivel delacantidaddeprotenaenlamembranaplasmticaprocedandelaregulacindelaexpresingnicadelos genes correspondientes como consecuencia de la presencia del H2O2 en el medio. Para ello se realizaron ensayos de PCR a tiempo real empleando sondas especficas para los genes que codifican para el receptor mGlu1yparalaenzimaPLC1.
2.5

Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)

2.0

mGlu1 PLC 1

**

Figura129:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnica de mGlu1 y PLC1. Clulas C6 fueron expuestas a H2O2 500 M durante30minutososemantuvieronencondicionescontrolconel fin de aislar su ARN. Los experimentos de RTPCR a tiempo real se

1.5

1.0

realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos

0.5

independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. ** p<0,01, significativamente diferente con respecto al

0.0
on tr ol
2O 2

control.

on t

Los resultados obtenidos para estos experimentos se exponen en la Figura 129. Como se observa, la exposicinaH2O2noproducevariacionesenlacantidaddeARNmdetectadoparaelreceptormGlu1.Porotro lado,enelcasodelaenzimaPLC1seobservaunaumentoensuexpresingnicadeun70%(p<0,01). Estos resultados apuntan a que mientras que el aumento detectado en la enzima PLC1 a nivel de protena puede ser consecuencia del aumento detectado a nivel de ARNm, en el caso del receptor mGlu1 el

198

2O 2

ro l

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

Resultados

aumentoobservadoaniveldeprotenapuedenoserdebidoalaumentoenlaexpresingnicasinoquepodra seratribuidoamecanismosposttranscripcionalesadicionalesquefomentaranelaumentodelreceptormGlu1 aniveldeprotenaenlamembranaplasmtica. c) Receptoresdeadenosina.

En la actualidad todava es controvertido el papel que juegan los receptores de adenosina en determinadasenfermedadesneurodegenerativas.Essabidoque,lapatognesisdealgunasdeellascursacon un aumento de la produccin de radicales libres. Por este motivo se procedi a estudiar la modulacin que sufran esta familia de receptores como consecuencia de la exposicin de las clulas C6 de glioma de rata a H2O2,enlascondicionesexperimentalesyaexpuestasenapartadosanteriores.Paraelloseemplelatcnica deWesternblot,porloqueseaislporcentrifugacindiferenciallafraccincorrespondientealaprotenade membranaplasmticadeclulasC6encondicionescontrolytraslaexposicinaH2O2durante30minutos. Estas fracciones se emplearon en experimentos de Western blot, tal y como se expuso en Mtodos, usando los anticuerpos especficos disponibles para los receptores de adenosina A1 y A2A. Los resultados obtenidos en estos experimentos se exponen en la Figura 130. En la parte superior de los paneles A y B se muestran imgenes representativas, adjuntando el correspondiente control interno de la actina para cada uno.Enlaparteinferiordeambospanelessemuestraelanlisisdensitomtricoefectuado. ComoseobservaenelpanelA,paraelcasodelreceptorA1sedetectunaumentodeun22%(p<0,05) enlacantidaddereceptoraniveldelamembranaplasmticatraslaexposicindelasclulasC6aH2O2.Por otrolado,enelpanelBsemuestranlosdatosobtenidosparaelreceptorA2A,elcualsufreunaumentoenla cantidadtotaldereceptoraniveldelamembranaplasmticadeun27%(p<0,05). Estos resultados, tomados en conjunto, indican que la exposicin de las clulas C6 a H2O2 induce un aumentoenlacantidadtotaldelosreceptoresdeadenosinaA1yA2Aaniveldelamembranaplasmticade dichasclulas. A continuacin se ampli el estudio al principal sistema de transduccin al que estn acoplados los receptoresdeadenosina,estoeslasvariacionesenlosnivelesdelsegundomensajeroAMPc.Asseestudiel efecto que ejerca la exposicin a H2O2 en clulas C6 sobre la cantidad de enzima adenilato ciclasa que se encontraba presente a nivel de la membrana plasmtica. De tal forma que las fracciones de membrana plasmtica empleadas en los experimentos anteriores fueron tambin utilizadas para dilucidar si existan diferenciasapreciablesaniveldeestaenzima.Paraelloseempleunanticuerpoespecficoparaelsubtipode ACmsabundanteenelSNC,laACtipoI(Xiaycol.,1993).LosresultadosobtenidosseexponenenlaFigura 131.Enestecaso,elanlisisrevelaquelaexposicinaH2O2novaralosnivelesdeestaenzimapresentesenla membranaplasmtica.

199

Resultados A
A1R -Actina

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno
37 kDa 45 kDa

B
A2AR -Actina Control H2 O 2
0.8

45 kDa 45 kDa + + + + -

Control

+ -

+ -

H2 O 2

0.6

Densidad A 2AR/ -Actina (unidades arbitrarias)

Densidad A 1R/ -Actina (unidades arbitrarias)

0.4

0.6

0.4

0.2 0.0
on tr ol
2O 2

0.2

0.0

tr ol

Figura130:LaexposicinaH2O2regulaalalzalosreceptores deadenosinaA1yA2A.ClulasC6fueronexpuestasonoaH2O2500M durante 30 minutos antes de realizar aislamientos de membranas plasmticas por centrifugacin diferencial, tal y como se describe en Mtodos. Se emplearon 30 g de cada muestra en la separacin electrofortica. Tras la inmovilizacin se emplearon anticuerpos especficos para los receptores A1 y A2A as como para la protena actina como control de carga. Se expone en el panel superior una imagen representativa, los pesos moleculares indicados representan la altura aproximada de las bandas densitometradas. En el panel inferior se muestra el anlisis densitomtrico de las bandas obtenidas. Los datos expuestos son las medias SEM de 2 experimentos independientesempleandodistintasmuestras.*p<0,05significativamentediferentedelcorrespondientecontrol.


Figura 131: La exposicin a H2O2 no modula la protena AC I. Clulas C6 fueron expuestas o no a H2O2 500 M durante 30 minutos antes de realizar aislamientos de membranas plasmticasporcentrifugacindiferencial,talycomosedescribe en Mtodos. Se emplearon 30 g de cada muestra en la

AC I -Actina Control H2O 2


0.6

C on

2O 2

124 kDa 45 kDa + + + + -

anticuerpos especficos para la protena AC I as como para la protenaactinacomocontroldecarga.Seexponeenelpanel superior una imagen representativa, los pesos moleculares indicados representan la altura aproximada de las bandas densitometradas. En el panel inferior se muestra el anlisis densitomtricodelasbandasobtenidas.Losdatosexpuestosson lasmediasSEMde2experimentosindependientesempleando distintasmuestras.

Densidad AC 1/ -Actina (unidades arbitrarias)

separacin electrofortica. Tras la inmovilizacin se emplearon

0.4

0.2

0.0

l C on H
2O 2

200

tr o

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

Resultados

Estos resultados muestran que la exposicin de las clulas C6 a H2O2 no produce ningn efecto en la cantidaddeprotenadelaenzimaACtipoI,locualnoimplicanecesariamentequelavadetransduccindel AMPcnoseveaalteradaenestascondiciones,yaqueunamayorcantidaddereceptoresdeadenosinadelos tiposA1yA2ApodratenerunamayorinfluenciasobreelsistemadelaAC. Porltimo,seprocediacomprobarsilaexposicinaH2O2enclulasC6modulabalaexpresingnica delosgenesquecodificanparalosreceptoresdeadenosina.Porello,serealizaronensayosdePCRatiempo real con sondas especficas para los receptores de adenosina descritos hasta la fecha: A1, A2A, A2B y A3. Los resultadosobtenidosparaestosexperimentosseexponenenlaFigura132. Comoseobserva,enelcasodelosreceptoresdeadenosinaA1,A2AyA2BlaexposicinaH2O2produce unaumentoenlaexpresindesusgenesdeun73,un37yun143%,respectivamente.Sinembargo,sloenel casodelosgenesquecodificanparalosreceptoresA1yA2Bresultabaestadsticamentesignificativo(p<0,05y p<0,001,respectivamente). Porotrolado,enelcasodelgencodificanteparaelreceptorA3,losresultadosobtenidosindicanquela exposicin a H2O2 produce una disminucin aparente en la expresin del mismo de un 27%, sin embargo el anlisisestadsticodelosdatosnorevelabadiferenciassignificativasentrelosmismos(p=0,143).
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)
3

*** *
2

A1 A2A A2B A3

C on tr ol

C on tr ol

C on tr ol

2O 2

2O 2

2O 2

ol C on tr

Figura132:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnicadelosreceptoresdeadenosina.ClulasC6fueronexpuestasaH2O2 500Mdurante30minutososemantuvieronencondicionescontrolconelfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiemporeal se realizaron empleando sondas especficas para los genes mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientesrealizadosporduplicadoempleandodistintasmuestras.*p<0,05,***p<0,001significativamentediferentesconrespectoa sucontrol.

Estosresultados,tomadosenconjunto,indicanquelaexposicindelasclulasC6degliomaderataa H2O2 modulaba la expresin gnica de los receptores de adenosina, aumentando, en algn caso slo

2O 2

201

Resultados

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno

ligeramente, la expresin de los genes que codifican para A1, A2A y A2B y disminuyendo aparentemente la expresindeldeA3. De forma adicional se estudi la posible modulacin de la expresin gnica de los factores de transcripcinCREByCREM,ambosrelacionadosconlavadelAMPc,comoconsecuenciadelaexposicinde las clulas C6 de glioma de rata a H2O2. Los resultados obtenidos se exponen en la Figura 133, en la cual se observa que existe un aumento del ARNm tanto de CREB como de CREM, que se corresponde con un incrementoporcentualdeun63yun60%,respectivamente.Sinembargo,esteaumentonoessignificativoen ningunodelosdoscasos(p=0,104yp=0,093,respectivamente).
Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)
3

CREB CREM
Figura133:EfectodelaexposicinaH2O2sobrelaexpresingnica

delosfactoresCREByCREM.ClulasC6fueronexpuestasaH2O2500 Mdurante30minutososemantuvieronencondicionescontrolcon elfindeaislarsuARN.LosexperimentosdeRTPCRatiemporealse realizaronempleandosondasespecficasparalosgenescodificantes

para los factores de transcripcin mostrados. Los datos expuestos son las medias SEM de 3 experimentos independientes realizados porduplicadoempleandodistintasmuestras.

0
C on tr ol C on tr ol
2O 2

Estos ltimos resultados sugieren que la exposicin de las clulas C6de glioma de rata a H2O2podra afectaralaexpresindelosgenescontroladosporlosfactoresdetranscripcinCREBysumoduladorCREM. Sinembargo,serannecesariosmsexperimentosparaconfirmarestadsticamenteestahiptesis. d) Tablaresumen. Acontinuacinseexponenunatablaamododeresumenconlasprincipalesvariacionesobservadasen losexperimentosdescritosenesteapartado.

202

2O 2

Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno
Viabildad ARNmcaspasa3 ProtenamGlu1 ARNmmGlu1 ProtenamGlu5 ProtenamGlu2,3 ProtenaPLC1 ARNmPLC1

Resultados H2O2500M30min

H2O2500M30min

ProtenaA1 ARNmA1 ProtenaA2A ARNmA2A ARNmA2B ARNmA3 ProtenaACI ARNmCREB ARNmCREM

Tabla39:Resumen delosresultadosobtenidosenclelulasC6expuestasaH2O2. Enestatablaseexponengrficamentelos resultados numricosdescritosenestecaptulo.,nohayvariacinestadstica,,seobservaunaumentoconrespectoalasituacincontrol,,se observaunadisminucinconrespectoalasituacincontrol.

IV.6Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimientoacelerado.

El modelo de senescencia acelerada en ratones (SAM) es uno de los ms apropiados a la hora de estudiarfenmenosdeenvejecimientoyenfermedadesrelacionadasconlaedad.Enlosestudiospresentados sehanempleadolassubcepasSAMR1,comomodelodeenvejecimientofisiolgico,ySAMP8,comomodelode envejecimiento acelerado. Entre las caractersticas de los ratones SAMP8 se encuentran: deficiencias en el aprendizajeylamemoriarelacionadasconlaedad,vidamediamscorta,disfuncionesdelsistemainmuney deposicindependientedelaedaddelpptidoamiloide.Elobjetodelpresentetrabajoeraestudiarelestado de los receptores de adenosina en este modelo de envejecimiento acelerado (SAMP8) y compararlos con ratonesdeenvejecimientonormal(SAMR1).Paraelloseeligierondosedadesalasquerealizarelestudio,por unlado,seemplearonratonesjvenes,de3semanasdevida(21das),y,porotro,ratonesdemedianaedad, quefueronsacrificadosalos6mesesdevida(180das).Paralaeleccindeestasedadessetuvoencuentaque lavidamediadelosratonesSAMResde16,3mesesmientrasqueladelosSAMPesde,tansolo,9,7meses, frente a los 28 meses promedio que vive un ratn de laboratorio normal. Adems, estos resultados se completaron con estudios realizados en ratas de la cepa Wistar, en las que se compar el estado de estos receptoresentrelos3ylos24mesesdevida. Conelfindedeterminarloscambiosrelacionadosconlaedadenlaexpresingnicadelosreceptores deadenosina,serealizaronensayosdePCRatiemporealempleandosondasespecficasparacadaunodelos4

203

Resultados

Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimiento

genesquecodificanparaestosreceptores.Losresultados,expuestosenlaFigura134,muestranquelosniveles deexpresindelreceptorA1aumentandemanerafisiolgicaconlaedad(p<0,01),sinembargo,losratones SAMP8nomostrabanestasvariacionesrelacionadasconlaedadsinoquelosnivelesdetrncritodetectados eransimilaresalosdelosSAMR1jvenes.Resultadossimilaresseobtuvieronenelcasodelaexpresingnica delreceptorA2B.EnloqueserefierealosreceptoresA2Anoseobservaroncambiosrelacionadosconlaedad, aunquealcompararambassubcepasseobservunadisminucinsignificativadelaexpresingnicadeestos receptoresenlosratonesSAMP8.EnelcasodelreceptorA3seobservunaumentodelaexpresingnicade estosreceptoresconlaedad,sinembargonoseapreciarondiferenciassignificativascuandoseestudiaronlas variacionesentrelasdossubcepas.


Cambio en la expresin gnica (n veces sobre el control)
3.0

2.5

A1 A2A A2B A3

3.0

**

2.5

2.0

**

2.0

1.5

1.5

1.0

1.0

0.5

**

0.5

0.0
P8 d 2 P8 1 d 18 0 d R 1 2 R 1d 1 18 0 P8 d 21 P8 d 18 0 d R 1 2 R 1d 1 18 0 P8 d 21 P8 d 18 0 d R 1 2 R 1d 1 18 0 P8 d 21 P8 d 18 0 d d 21 1 18 0

0.0

Figura 134: Anlisis de la expresin gnica de los receptores de adenosina en un modelo de envejecimiento. Se aisl ARN total de homogenadosdecerebroderatonesSAMR1(R1)ySAMP8(P8)sacrificadosalas3semanas(21d)oalos6mesesdeedad(180d).Los experimentosdeRTPCRatiemporealserealizaronempleandosondasespecficasparalosgenesmostrados.Losdatosexpuestossonlas medias SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintas muestras. * p<0,05, ** p<0,01 significativamentediferentesconrespectoaR121d;p<0,05variacinentregrupossignificativa.

SeestudiaronlosparmetroscinticosdelosreceptoresA1porensayosdeuninderadioligandosen las subcepas SAMR1 y SAMP8, empleando [3H]DPCPX como radioligando. Como se expone en la Figura 135, panelA,seobservunadisminucindeun38%enelnmerodereceptoresA1enratonesSAMR1demediana edad con respecto a la misma cepa joven (p<0,001), lo que sugiere una disminucin en el nmero de receptoresA1conlaedad.EnelcasodelosratonesSAMP8seobservquetantolosratonesjvenescomolos de mediana edad presentaban niveles del receptor A1 similares entre s y disminuidos con respecto a los SAMR1jvenes(alrededordeun50%),loquesugierequeenestemodelodeenvejecimientolosreceptoresA1 estnafectadosenetapastempranasdeldesarrolloyqueestaafectacinsemantienealolargodelavidadel animal, ya que no se encontraron diferencias entre los niveles de receptor A1 en ratones SAMP8 a distintas edades.ComoseexponeenelpanelB,noseobservarondiferenciassignificativasenlavariacindelaafinidad deestosreceptoresconlaedad,nientrelosdistintosgrupos.

204

Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimiento A
Bm x (pmol/mg prot)

Resultados

0.4

0.3

***
KD (nM)
d

0.2

0.1

0.0
d d 18 0 21 21 d 18 0 P8 1 1 P8 R

0
d d d 18 0 21 21 P8 1 1 P8 R 18 0 d

Figura 135: Deteccin de los receptores A1 en ratones SAM mediante unin de radioligandos. Se aislaron membranas plasmticas de cerebroderatonesSAMR1(R1)ySAMP8(P8)sacrificadosalas3semanas(21d)oalos6mesesdeedad(180d).Serealizaronensayosde uninderadioligandoempleando[ H]DPCPX.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde4experimentosindependientesrealizadospor duplicadoempleandodiferentesaislamientos.Losparmetroscinticoscalculados,Bmax(panelA)yKD(panelB),seobtuvieronapartirde los resultados experimentales empleando el software GraphPad Prism 5.0. *** p<0,001 significativamente diferente con respecto a los valoresobtenidosenlosratonesSAMR1de21das;p<0,05variacinsignificativaentregrupos.
3

Paraconfirmarlosresultadosobtenidosporensayosdeuninderadioligandosyconelfindeampliarel estudioalosreceptoresA2A,serealizaronensayosdeWesternblotenlasmembranasplasmticasaisladasde loscerebrosderatonesSAMR1ySAMP8alostiemposantesindicados.ComoseexponeenlaFigura136,panel A,losresultadosobtenidosmedianteestatcnicasonconsistentesconlosobservadosmedianteelensayode uninderadioligando,esdecir,denuevoseapreciaenlosratonesSAMR1unadisminucindelosreceptores A1conlaedad(p<0,05)mientrasquelosnivelesdereceptordetectadosenlosratonesSAMP8sonsimilares,en ambos casos, a los detectados en los SAMR1 de mediana edad y significativamente menores que los detectadosenlosSAMR1jvenes(almenos,p<0,05). En el panel B de la misma Figura se exponen los resultados obtenidos al emplear un anticuerpo especficoparaelreceptorA2Aenlasmismasmuestras.EnelcasodelosratonesSAMR1seapreciaunaumento de los receptores A2A con la edad de estos animales (p<0,01), mientras que en los ratones SAMP8 no se aprecian variaciones en estos receptores con la edad. Por otro lado, aunque los niveles de receptores A2A encontradosenlosratonesSAMP8eranalgomselevadosquelosencontradosenratonesSAMR1jvenes,no loeranlosuficientecomoparaqueestadiferenciaresultaraestadsticamentesignificativa. Porunlado,estosresultadoscorroboranlosobtenidosmediantelatcnicadeuninderadioligandosen el caso del receptor A1, por otro lado, para el receptor A2A, sugieren que estos receptores se encuentran afectados en ratones SAMR1 de mediana edad (6 meses) a causa del envejecimiento. Sin embargo, estos procesosderegulacindelreceptorA2AnoseobservanenlacepaSAMP8.

205

Resultados A
A1R

Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimiento
37 kDa 45 kDa

R121

R1180

P821

P8180

B
A2AR -Actina
0.8

R121

R1180

P821

P8180 45 kDa 45 kDa

-Actina
0.4

Densidad A2AR/ -Actina (unidades arbitrarias)

**

Densidad A 1R/ -Actina (unidades arbitrairas)

0.3
0.2 0.1 0.0

* ***

0.6

0.4

0.2

0.0
d d d d d d 21 d 18 0 P8 21 0 0 21 21 0 d

18

18

18 R 1

R 1

Figura136:DeteccindelosreceptoresA1yA2AenratonesSAMmedianteWesternblot.Seaislaronmembranasplasmticasdecerebro deratonesSAMR1(R1)ySAMP8(P8)sacrificadosalas3semanas(21d)oalos6mesesdeedad(180d).Seemplearon30gdecada muestraenlaseparacinelectrofortica.TraslainmovilizacinseemplearonanticuerposespecficosparalosreceptoresA1yA2Aascomo para la protena actina como control de carga. Se exponen en el panel superior imgenes representativas. Los pesos moleculares indicados representan la altura de las bandas densitometradas. En el panel inferior se muestra el anlisis densitomtrico de las bandas obtenidas.LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde2experimentosindependientesempleandodistintasmuestrasprovenientesde distintosanimales.*p<0,05,**p<0,01,***p<0,001significativamentediferentedeR121d.

250

Unin especfica [ 3H]DPCPX (fmol/mg prot)

jvenes viejas

R 1

P8

Figura 137: El envejecimiento disminuye los receptores A1 en cerebro de rata. Se aislaron membranas plasmticas de cerebroderatonesSAMR1(R1)ySAMP8(P8)sacrificadosa las3semanas(21d)oalos6mesesdeedad(180d)conlas que se realizaron los ensayos de unin de radioligando empleando el antagonista especfico del receptor A1 [ H]DPCPX. Los datos son las medias SEM de 3
3

200

150

100

50

experimentos independientes realizados por duplicado empleando distintos aislamientos de diferentes animales.

Losparmetroscinticoscalculados,BmaxyKD,seobtuvieron
0 5 10 15 20

a partir de los resultados experimentales empleando el software GraphPad Prism 5.0 y se exponen en el panel inferior. * p<0,05 significativamente diferente con respecto

[3H]DPCPX (nM)
Bmax (fmol/mg prot) jvenes viejas 204,79 26,22 101,09 10,10 * KD (nM ) 4,42 0,72 4,51 1,25

alvalorobtenidoenratasjvenes.

206

R 1

P8

P8

Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimiento

Resultados

ElestudiodelosreceptoresdeadenosinaconelenvejecimientoseextendiacerebrosderatasWistar. En este caso se emplearon dos grupos de ratas que denominaremos jvenes (sacrificadas a los 3 meses) o viejas (sacrificadas a los 24 meses). En todos los casos se emplearon membranas plasmticas extradas de cerebros de ratas macho en las que se realizaron ensayos de unin de radioligandos as como ensayos de actividad enzimtica, con el fin de determinar la funcionalidad del sistema de transduccin mediado por el receptorA1. Los resultados obtenidos para los ensayos de unin de radioligandos empleando [3H]DPCPX como antagonista especfico de los receptores A1 se exponen en la Figura 137. Se detect una disminucin significativaenladensidaddelosreceptoresA1conlaedadligeramentesuperioral50%(p<0,05)sinvariacin aparentedelaafinidaddelosmismos. LaevaluacindelafuncionalidaddelsistemaseexponeenlaFigura138.ComoseobservaenelpanelA, tantolaactividadbasaldelaenzimaACcomolaestimuladaseencuentransignificativamentedisminuidasen ratasviejasconrespectoalasratasjvenes(p<0,05).Porotrolado,comoseexponeenelpanelBdelamisma Figura,lacapacidaddeCHAenratasviejas,agonistaselectivodelreceptorA1,deinhibirlaactividadenzimtica previamente estimulada tambin se encontraba disminuida con respecto a las ratas jvenes (p<0,05). En conjunto,estosresultadossugierenqueconlaedadseproduceunadesensibilizacindelarespuestamediada porlosreceptoresA1asociadaalaprdidadereceptoresenlamembranaplasmtica. A
Actividad AC (pmol/mgmin)
200

300

jvenes viejas

B
Actividad AC inhibida por CHA (% de Forsk+GTPS) jvenes viejas . .

30 25 20 15 10 5 0

.
100

* *

0
B as al Fo rs

Figura138:EfectodelenvejecimientosobrelaactividadAC.1020g demembranasplasmticas,previamenteincubados conADA,se . emplearonenladeterminacindelosnivelesbasalesdeAMPcascomodelosobservadosalestimularconforskolina10M(Forsk)(panel A).LainhibicindelaactividadACmediadaporelreceptorA1semidicomolacapacidaddeCHA1mM,agonistaespecficodelreceptor A1,deinhibirlaactividadACestimuladaconforskolina10MmsGTPS5M(panelB).LosdatosexpuestossonlasmediasSEMde,al menos,3experimentosindependientesrealizadosporduplicadoempleandodistintosaislamientos.*p<0,05significativamentediferente conrespectoalvalorobtenidoenratasjvenes.

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Expresinycaracterizacindelosreceptoresdeadenosina V.1.ExpresinycaracterizacindelosreceptoresdeadenosinaenclulasC6.

Discusin

En este trabajo se han mostrado evidencias bioqumicas, farmacolgicas y moleculares de que las clulas C6 del glioma de rata expresan de manera endgena los cuatro tipos de receptores de adenosina. Adems de la identificacin y la caracterizacin completa de los receptores A1 y A2A, se ha demostrado que estnfuncionalmenteligadosdemanerainhibidoraoestimuladoraalaactividadadenilatociclasaatravsde unaprotenaGsodeunaprotenaGisensibleaPTX,respectivamente. LosensayosdeRTPCRylaposteriordeteccindelabandacorrespondientedelfragmentoamplificado delARNmdelreceptorA1,sugierenlapresenciadeestetipodereceptorenlasclulasC6.ElARNmdeeste receptor se ha encontrado en diferentes tejidos de rata (Dixon y col., 1996) y en cultivos de astrocitos de diferentesregionescerebrales(Biberycol.,1997).Estosmismosensayospermitierondetectarlapresenciadel ARNmdelosreceptoresA2A,A2ByA3.Adems,porPCRcuantitativasedeterminqueelniveldeexpresinde A1 y A3 en clulas C6 era similar y significativamente ms alto que el de A2A y A2B. Todos estos tipos de receptoressedetectaronporWesternbloteinmunocitoqumicausandoanticuerposespecficos.Elanticuerpo deA2Areconociunabandanicaconunpesomolecularde45kDa,correspondientealaprotenaA2Acomo previamentesedescribienotrasclulasastrogliales(Trincavelliycol.,2004).ElanticuerpodeA3reconoci dosbandasconpesosmolecularesde44y52kDacomopreviamentesedescribienotrostejidos(Christofiy col.,2001). ElligandoDPCPXseempleparacuantificarlosreceptoresA1.Laselectividaddeesteantagonistapara determinarlosreceptoresA1fuevalidadamediantecurvasdecompeticincondiferentesligandosespecficos. RPIA mostr la potencia ms alta para desplazar la unin de DPCPX, seguido de CHA. Sin embargo ni CGS 21680 ni PSB 1115 causaron desplazamiento alguno. El anlisis de las curvas de saturacin mostr un nico sitio de unin de DPCPX a las membranas plasmticas de las clulas C6, cuyos parmetros de unin concordaban con aquellos previamente descritos en membranas celulares de clulas 28A (Spielman y col., 1992),envasosdeferentesderata(Smithycol.,1997)yenmiocardiodeatriohumano(Bohmycol.,1989).Por otrolado,aunquelosvaloresdeKDsecorrelacionanbienconotrosmedidosenmamferos(Falcnycol.,1997), membranasdemsculorugoso(Peacheyycol.,1994)ycerebrodecobaya(Klotzycol.,1989),sinembargo,son ms altos que los usualmente descritos en membranas de corazn y cerebro bovino, cerebro de rata y adipocitos (Lohse y col., 1987), indicando una afinidad ms baja de estos receptores en clulas C6. Por otra parteelnmerototaldereceptoresconcuerdaconlosvaloresdescritosenclulasgranulares(HettingerSmith y col., 1996) y membranas de astrocitos en cultivo (Biber y col., 1997). Aunque contrasta con los valores descritosencoraznycerebrobovino,cerebroderatayadipocitos(Lohseycol.,1987). LosensayosdeuninrealizadosenclulasintactasempleandoDPCPXmostrarontambinunapoblacin nicadereceptores,aunquelosparmetrosdeuninfueronmsaltosqueenlasmembranasplasmticas.El descensoenelnmerototaldereceptoresdetectadosenlaspreparacionesdemembranaconrespectoalas clulasintactasyahasidodescritoparaCCPAyCGS21680enneuronasencultivoypodraexplicarseporla alteracinsufridaporlosreceptorescomoconsecuenciadelprocesodehomogenizacin(Nicolasycol.,1994). ResultadossimilaressehandescritoparaelreceptorA1encultivosprimariosdeclulasgranulares(Sanzycol.,

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Expresinycaracterizacindelosreceptoresdeadenosina

1996)ydeneuronas(Ruizycol.,2000).Comotodoslosensayosserealizaronenpresenciadedipiridamol,un potenteinhibidordelacapturadeadenosina,losincrementosdetectadosenelnmerototaldereceptoresen clulasintactasnopuedenserdebidosalaunindelradioligandoauntransportador(Nicolasycol.,1994). Para caracterizar los receptores A2A se empleo ZM241385 como radioligando selectivo (Palmer y col., 1995; Alexander y Millns, 2001). En membranas de C6 este radioligando mostr una unin saturable con un valordeafinidadsimilaralobtenidoenmembranasdelasclulasNG10815(Willetsycol.,1999).Porotrolado laKDeramsaltaqueladescritapreviamenteenotrasespeciesytejidoscomoestriadobovino(Palmerycol., 1995)oestriadoderata(AllexanderyMillns,2001).Sinembargo,elgrandesplazamientoobtenidodelaunin deZM241385abajasconcentracionesdeCGS21680,agonistaselectivodeA2A,ylaincapacidaddePSB1115de desplazar la unin confirman la selectividad de este ligando. Nuestros resultados sobre la deteccin de A2A contrastan con otros descritos previamente (Palmer y Stiles, 1999; Sands y col., 2004). En estos trabajos se emplearonclulasC6paraexpresarelreceptorA2AcaninosinhaberdetectadoanteselreceptorA2Aendgeno, probablemente por los diferentes procedimientos de aislamiento de las muestras estudiadas empleados. Mientrasqueestosautoresemplearonhomogenadoscelulares,enloscualeslapresenciadelreceptordebera serproporcionalmentemsbaja,ennuestrotrabajoseemplearonmembranasplasmticasyclulasintactas. De hecho se detectan valores de Bmx ms bajos en membranas que en clulas intactas como se coment anteriormente. Medianteelempleodetcnicasdeclonajemolecularypurificacindirectahansidodetectadashastala fechatressubtiposdeprotenasinhibidorasGi,denominadasGi1,Gi2yGi3(JonesyReed,1987).Porensayos deWesternblotsedetectunabandaconlosanticuerposAS/7yEC/2quereconocenlassubunidadesGi12y Gi3,respectivamente.LaclavedefinitivaparadilucidarqusubtiposdelasprotenasGiseencontrabanenlas clulasC6laproporcionaronlosensayosdeRTPCR,dondesloseobtuvolabandacorrespondienteparaGi2y Gi3,comoseobserventrabajosanteriores(Kimycol.,1988;Yanycol.,1996;ElJamaliycol.,1998).Comose describipreviamente,Gi2eselsustratomsabundantedelatoxinaBordetellapertussisenclulasC6(Brabet ycol.,1988).Ensistemasreconstituidos,elreceptorA1humanoybovinopareceinteractuarpreferentemente conprotenasrecombinantesGiantesqueconGo(Figlerycol.,1997).LafaltadeGi1ylaelevadaribosilacin deGi2(mayorqueladeGi3),hacenqueGi2seaunbuencandidatoparamediarlasrespuestasdelreceptorA1 enclulasC6. La ruta de sealizacin celular principal de los receptores A1 es la inhibicin de la actividad adenilato ciclasa,causandounadisminucindellosnivelesdelsegundomensajeroAMPc(vanCalkerycol.,1979;Londos ycol.,1980).ElempleodeGTPyforskolinaprodujounaumentodelaestimulacindelaactividadACenC6 dependiente de la concentracin, confirmando el estatus funcional de dicha actividad enzimtica (Insel y Ostrom,2003).EnmembranasdeclulasC6,elligandoCHAprodujounainhibicindependientedesudosisde la actividad AC previamente estimulada con forskolina y GTP, observndose su efecto mximo a 100 nM. ResultadossimilaresseobservaronenclulasNIH3T3transfectadasenloqueserefierealainhibicinporCPA de la acumulacin de AMPc estimulada por forskolina (Reppert y col., 1991) y tambin en membranas de cortezafrontalderata(Lorenzenycol.,1997).Adems,estosdatosseasemejanalosdescritosencultivosde

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Expresinycaracterizacindelosreceptoresdeadenosina

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astrocitos, en los que CPA 100 nM mostr la mxima inhibicin efectiva de la actividad AC (Murphy y col., 1991).Pianetycolaboradores(Pianetycol.,1989)demostraronque,enclulasC6,laadenosinaestimulabala actividadACbasalylaactivadaporisoproterenol,sugiriendolapresenciadeunreceptordetipoA2acoplado deformaestimuladoraalaACenestasclulas.SehademostradoelestatusfuncionaldelosreceptoresA2Ay A2B en estas clulas, dado que CGS21680 y NECA fueron capaces de estimular la acumulacin de AMPc. La estimulacin de CGS21680 fue bloqueada en presencia del antagonista especfico de A2A ZM241385, confirmandoelpapeldelosreceptoresA2A.LaaparentefaltadeefectodeZM241385yelefectobloqueantede PSB 1115, antagonista especfico de A2B, en la estimulacin de la AC mediada por NECA sugiere que los receptores A2B estn tambin implicados en la respuesta de la AC. Corrobora este hecho la observacin en cultivosprimariosdeastrocitosderatadeestimulacindelaACporNECAvaA2B(PeakmanyHill,1994). Las diferencias observadas en la acividad AC basal entre membranas (0,42 0,10 pmol/mgmin1) y clulas intactas (1,2 0,1 pmol/mgmin1) concuerda con la observacin efectuada por Daly (Dally, 1984) de quelaforskolinaestimulamenoslaformacindeAMPcenensayosempleandoclulasdisgregadasqueenlos queseutilizabanclulasintactas.LosestudiosrealizadossobrelaestimulacindelaACmediadaporforskolina en clulas intactas revelan una contribucin de agonistas endgenos que actan directa o indirectamente sobrelosGPCRsyqueseliberancomoconsecuenciadelaexposicinaforskolina(InselyOstrom,2003). Los resultados mostrados demuestran que los cuatro tipos descritos de receptores de adenosina se encuentranpresentesdemaneraendgenaenlasclulasC6.Noestclaroelpapelfuncionalquedesempean los receptores de adenosina en clulas tumorales. Algunos autores sugieren que la adenosina extracelular podra interaccionar con receptores especficos de membrana influenciando el crecimiento celular y la diferenciacin en cultivos de clulas tumorales. Su efecto dependera de su concentracin extracelular as como de la expresin de los diferentes receptores de adenosina, adems de los distintos mecanismos de transduccin de seales que podran activarse (Merighi y col., 2003). En clulas HT29 de adenocarcinoma humano,laenzimaadenosinadesaminasayantagonistasdelreceptorA1causanunainhibicindelcrecimiento celular, sugiriendo que la presencia de los receptores A1 en estas lneas tumorales podra promover el crecimiento celular (Lelievre y col., 1998). Adems, en la lnea A375 de melanoma humano, la adenosina desencadenasealesdesupervivenciaatravsdelreceptorA3ydemuertecelularatravsdelreceptorA2A (Merighi y col., 2002). Existen adems evidencias contrastadas de un papel activo del receptor A2A en el crecimiento tumoral y se est planteando la idea de que el receptor A2B tambin pudiera participar en el crecimiento tumoral as como en procesos de neovascularizacin, dada su habilidad para promover crecimiento endotelial (Merighi y col., 2003), all donde los niveles de adenosina fueran lo suficientemente elevadoscomoparaactivarestereceptordebajaafinidad(Melaniycol.,2003). Por otro lado, la expresin del receptor A3 parece ser baja en tejidos sanos y elevada en clulas tumorales,inclusosehasugeridoquelasobreexpresindelreceptorA3podraserunbuencandidatocomo marcadortumoral(Merighiycol.,2003).Adems,comoyasehacomentado,enlalneademelanomaA375la adenosinapromueveelcrecimientocelularvaA3ylamuertecelularvaA2A(Merighiycol.,2002).

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Expresinycaracterizacindelosreceptoresdeadenosina

Comosehaexpuesto,lapresenciadelosreceptoresdeadenosinaentiposcelularestumorales,sugiere elpotencialmoduladordelaadenosinaenprocesosdecrecimientotumoral(Ohanaycol.,2001;Merighiycol., 2003).Porestemotivo,lapresenciadeloscuatrosubtiposdereceptoresdeadenosinadescritoshastalafecha, as como de sus respectivas vas de sealizacin, en clulas C6 permite proponer a esta lnea celular como candidataparaelestudiodelaregulaciny/oposiblesprocesosdetransmodulacindeestosreceptoresas comodesuimplicacinenenfermedadestumorales. V.2.ExcitotoxicidadinducidaporGlutamato. V.2.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza. ElglutamatoeselneurotransmisorexcitadormsabundantedelSNC,actuandoatravsdereceptores especficos participa en funciones tan importantes como el aprendizaje o la memoria. Sin embargo, la sobreexcitacindelsistemaglutamatrgicoproduceexcitotoxicidadyestimplicadaenlapatologadealgunas enfermedades neurodegenerativas. Como se ha expuesto en Resultados, ha quedado demostrado el efecto txicodelaexposicinaLGluenneuronascorticales.Adems,sehandescritolosprocesosderegulacinque sufren los receptores metabotrpicos de glutamato frente a este fenmeno txico. La importancia de estos receptores como diana farmacolgica ante la neurotoxicidad se basa, entre otros factores, en su capacidad para modular la actividad de determinados canales inicos, controlando as la excitabilidad neuronal. Esta importanciasehavistoincrementadadebidoalfallodelosensayosclnicosrealizadosconantagonistasdelos receptoresionotrpicos(Birmingham,2002),loscualeshabandemostradosusefectosneuroprotectorestanto invitrocomoenmodelosanimalesdederramecerebral,traumatismocerebralydaoenespinadorsal(Leey col.,1999). LaviabilidadcelularseestudiusandoelmtododelMTT,elcualsebasaenlacapacidaddelasclulas vivas de transformar este compuesto. Este mtodo ha resultado ser uno de los ms eficaces a la hora de cuantificar la toxicidad de una determinada molcula (Puttonen y col., 2008). Aunque, dependiendo del mtodo de cuantificacin empleado, existen variaciones acerca de la concentracin de glutamato en el sobrenadante de las neuronas corticales in vitro, la mayora de los autores proporcionan datos que se encuentranpordebajodelrangodemicromolar.As,enneuronascorticalesderataa8DIVseestimporHPLC quelacantidaddeLGluenelsobrenadantecelularseencontrabaalrededorde100nM(Antonelliycol.,2004). Encualquiercaso,lasneuronascorticalesresultaronseveramenteafectadasporlaexposicinaLGluinclusoa tiempos y concentraciones bajas (1 M durante 2 horas), lo cual concuerda con los fenmenos de exitotoxicidadampliamentedescritosenlaliteratura.Resultadossimilaressehanobservadorecientementeen losquelaexposicinaLGluproducemuertecelulardeformadosisdependienteenneuronascorticales(Wang ycol.,2008). La regulacin observada en los receptores metabotrpicos de glutamato tras la exposicin de las neuronascorticalesaLGlusecorrespondeconelcomportamientoesperabledeunGPCRalenfrentarseasu

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Excitotoxicidadinducidaporglutamato

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agonista endgeno, este fenmeno de regulacin homloga se conoce como regulacin a la baja o, ms comnmente,poreltrminoinglsdownregulation.Losmecanismosporlosquesedisminuyenlosnivelesde receptorenlasuperficiecelularestnmediadosporunaseriedequinasasintracelularescapacesdefosforilar deformaespecficaalosGPCRactivados(revisadoporPenelaycol.,2003).Pormediodeestafosforilacinen el extremo C terminal se reclutan una familia de protenas llamadas arrestinas, las cuales funcionan como adaptadores moleculares y conectan el receptor activado con la maquinaria de endocitosis (Shenoy y Lefkowitz,2005).Unavezquesehainternalizadoelreceptorenunavesculadeclatrina,dependiendodelas condicionescelulares,lavesculapuededirigirseallisosomaparasudegradacinobienpuederecircularseala membrana plasmtica si las condiciones de exposicin al agonista han terminado (revisado por: Marchese y col., 2008; Hanyaloglu y von Zastrow, 2008). Por otro lado, adems de los mecanismos clsicos, existe otro mecanismo, demostrado para el mGlu1, por el que los GPCRs pueden ser internalizados, este mecanismo dependedelasGRKsperonodesuactividadquinasa(DhamiyFerguson,2006). La excitotoxicidad en neuronas ha sido estudiada ampliamente desde la primera descripcin de este fenmeno (Olney y col., 1973). La teora de la excitotoxicidad se basa en el hecho de que el glutamato, actuando a travs de los receptores NMDA, mata a las neuronas inmediatamente despus de una lesin cerebraldebidoalaentradamasivadecalcio(revisadoporVillmannyBecker,2007).Sinembargo,estateora ignoraelhechodequeelglutamatoesunfactorquedesencadenalatranscripcindefactoresdesupervivencia comoCREB(Hardinghamycol.,2002).Elpapeldelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatocomoagentes neurotxicosoneuroprotectoresfrentealdaoexcitotxicohasidoestudiadoenvariosmodeloscelularesy existen evidencias experimentales de la participacin de los receptores mGlu en ambos procesos. Los resultados expuestos en la presente Memoria sugieren que, en general, tras la exposicinde las neuronas a LGlu, los receptores metabotrpicos del grupo I y del grupo II aumentan su presencia en la membrana plasmticamientrasquelosdelgrupoIIIladisminuyen. La mayora de las referencias que relacionan la activacin de los receptores del grupo I con neurodegeneracinsebasanenquesuactivacinpuedepotenciareldaoproducidoporlosreceptoresNMDA (Skeberdisycol.,2001;Pisaniycol.,2001).Sinembargo,existegrancantidaddereferenciasqueapuntanenel otro sentido. La activacin de los receptores del grupo I frente al dao excitotxico implica el desencadenamiento de fenmenos de endocitosis, as como de inhibicin de la inflamacin, de la adhesin celular y de la muerte celular (revisado por Baskys y col., 2005). Segn estos autores la activacin de los receptoresdelgrupoIfavorecelaendocitosisdelosreceptoresNMDA,loquereduciraeldaoexcitotxico. De entre dichas referencias destaca el trabajo de Bruno y colaboradores, que demuestra que, en neuronas corticales,dosaplicacionesconsecutivasdeDHPGresultabanneuroprotectorasfrentealdaoproducidopor NMDAdebidoaqueseproducauncambioenlafuncionalidadenestosreceptorestraslasegundaaplicacin delagonista(Brunoycol.,2001).Estaobservacinnoeranuevaparalosreceptoresmetabotrpicosdelgrupo I, con anterioridad se haba demostrado que la liberacin de glutamato controlada por los mGlu del grupo I dependa de la actividad previa de estos receptores (Herrero y col., 1998). Sin embargo, en clulas de hipocampo,sloeranecesariaunaaplicacindeDHPGparaobservarlosefectosneuroprotectores,indicando

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Excitotoxicidadinducidaporglutamato

queelsistemaneuroproteccinneurodegeneracindependientedelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI depende del tipo celular (Bruno y col., 2001). Otra prueba del papel neuroprotector de los receptores metabotrpicos del grupo I es que la activacin de los receptores NMDA en neuronas corticales in vitro produceelcorteproteolticoporcalpanadelreceptormGlu1,elcualtraslaprotelisisesincapazdeactivarla cascadaneuroprotectoradelaPI3KAkt(Xuycol.,2007a).Unacomplicacinadicionalesquesehademostrado que la funcin del agonista depende del momento de la aplicacin. As, la activacin de los receptores del grupoIantesdelaexposicinaNMDAeraneuroprotectora(Blaabjergycol.,2003),mientrasquesiprimerose empleaba el NMDA y despus el agonista de los mGlu del grupo I se apreciaba un aumento de la toxicidad (Brunoycol.,1995a). En elcasode los receptoresde los gruposII y III los resultados obtenidos parecen contradictorios,ya queambosreceptoresdesempeanfuncionessimilaresy,sinembargo,seregulandemaneraopuestafrentea laexposicinaLGlu.LaactivacindelosreceptoresdelgrupoIIyIIIresultaraneuroprotectoradebidoaque, actuandoanivelpresinptico,disminuiranlaliberacindeglutamato,loqueasuvezdisminuiralosaumentos deCa2+intracelularqueesteglutamatoproduciranivelpostsinptico.Aunquealgunosautoresafirmanque cuandolosagonistasdeestosreceptoresfuncionancomoneuroprotectores,elefectoobservadonosiemprees debidoaladisminucinenlaliberacindeglutamato,sinoqueaccionesmoduladorasadicionalespodranser lasresponsablesdelaneuroproteccinobservada(Calabresiycol.,2000).Dehecho,algunosautoresproponen queladisminucindelosreceptoresdelgrupoIIobservadaenmodelosdeepilepsiaestararelacionadaconla susceptibilidaddeestasclulasfrenteafenmenosexcitotxicos(PachecoOtaloraycol.,2006).Sinembargo, aligualqueconlosreceptoresdelgrupoI,existecontroversiaacercadesiestosreceptorespuedenresultar neuroprotectores (LafonCazal y col., 1999a; Bruno y col., 2000a) o, por el contrario, agravan el dao excitotxico (Behrens y col., 1999; LafonCazal y col., 1999b). Son, por tanto, necesarios experimentos adicionalesqueconfirmenelpapeldeestosreceptoresenlascondicionesensayadas. ComosehaexpuestoenResultados,laenzimaPLC1sufreunamodulacindependientedeltiempode exposicinperoindependientedelaconcentracinenelrangoqueseempledeLGlu.Asseobservque,a tiempos cortos, la cantidad de enzima disponible disminua con respecto al control, mientras que si el tratamiento se prolongaba se observaba que la cantidad de enzima disponible aumentaba. Estos resultados podran encajar con los argumentos expuestos anteriormente. Por un lado, la accin inicial del glutamato, a travsdelosreceptoresNMDA,esaumentarelcalciointracelular,loqueproducelamuertecelulary,dadoque laenzimaPLC1eselprincipalsistemaenzimticoalqueestnacopladoslosreceptoresmetabotrpicosdel grupoI,ladisminucindelacantidaddeestaenzimadisminuiralaliberacindecalciodelretculoporaccin delIP3,loque,enprincipio,podramitigareldaoexcitotxico.Sinembargo,atiemposmslargospodramos encontrarque, despus de toda la muerte neuronal observada, el principal efecto mediadopor elcalcio sea neurognico.Esta hiptesis concuerda con los aumentos de la cantidad de PLC1 observados a tiempos ms prolongados de exposicin, que contribuira a la movilizacin de calcio del retculo, favoreciendo los efectos neurognicoscomentadosconanterioridad.Estaregulacin,aparentementecontradictoria,concuerdaconlos motivosesgrimidospordeterminadosautoresalahoradeexplicarelfallodelosantagonistasdelosreceptores

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de NMDA en los ensayos clnicos para derrame cerebral, traumatismo crneoenceflico y demencia (IkonomidouyTurski,2002;HardinghamyBading,2003;revisadoporMuir,2006). Existen en la literatura multitud de referencias acerca del empleo de ligandos de los receptores de adenosina en diversos modelos de toxicidad tanto in vivo como in vitro. En general, la falta de potentes ligandos para los receptores A2B y A3 ha limitado el estudio de los receptores de adenosina en condiciones patolgicas a los receptores A1 y A2A. En la presente Memoria se ha descrito que en neuronas corticales sometidasaprocesosexcitotxicosseproduceunaregulacinalalza,oupregulation,delosreceptoresA1y A2A,tantoaniveldeprotenacomodeARNm,quesecorrespondeconvariacionesenlafuncionalidaddelos mismos, medidas a travs del sistema enzimtico al que estn principalmente acoplados, la inhibicin o activacin,respectivamente,delaadenilatociclasa. ElpapelneuroprotectordelosreceptoresA1deadenosinahasidoampliamenteestudiadoendiversos modelos de toxicidad (para revisin ver de Mendona y col., 2000) principalmente por dos motivos: por un lado, estos receptores presentanunagran capacidad inhibidora de la excitabilidadneuronal y la transmisin sinptica, por otro, son los ms abundantes en SNC (para revisin ver Cunha, 2005). Tras diversos estudios realizados en diferentes componentes del SNC frente a diferentes estmulos nocivos se ha llegado a la conclusin de que la activacin de los receptores A1 desempea un papel neuroprotector. As se ha demostrado, por ejemplo, en modelos de excitotoxicidad inducido por kainato y cido quinolnico en hipocampo(MacGregorycol.,1993;MacGregorycol.,1997).Porotrolado,laneuroproteccinporactivacin de los receptores A1 ha sido comprobada en modelos in vivo de diversas enfermedades relacionadas con la excitotoxicidad(SheldonyRobinson,2007;GilyRego,2008).Porejemplo,enunmodelodelaenfermedadde HuntingtonlainyeccinsubcutneadeagonistasdelreceptorA1reducaeldaocerebral(Blumycol.,2002). Deigualforma,enunmodelodeesclerosismltipleseobservquetantolaregulacinalalzadelreceptorA1 como su activacin atenuaban la neuroinflamacin y la desmielinizacin observada (Tsutsui y col., 2004). La neuroproteccin demostrada por los agonistas de los receptores A1 se produce a varios niveles. A nivel presinptico la activacin de los receptores A1 inhibe la liberacin de neurotransmisores excitadores, entre ellos el glutamato, lo que disminuye los procesos neurotxicos causados por estos agentes. A nivel postsinptico los receptores A1 producen la activacin de canales rectificadores de K+, que producen hiperpolarizacinneuronal(DunwiddieyMasino,2001).Porltimo,laactivacindelosreceptoresA1inhibela accin de los receptores NMDA, reduciendo por tanto la entrada masiva de calcio y los fenmenos excitotxicos(deMendonaycol.,1995).Elresultadoconjuntodetodosestosmecanismosesquelaactivacin delosreceptoresA1reducelaexcitabilidadneuronal. Enresumen,losresultadosexpuestosjuntoconlasreferenciascitadassonconsistentesconlaideade que el aumento en la expresin de los receptores A1 sea consecuencia de un intento de minimizar el dao excitotxico producido por la exposicin a LGlu. Sin embargo, no es posible aplicar el mismo razonamiento paraelaumentodetectadoenlaexpresinyfuncionalidaddelosreceptoresA2A,yaque,enestecaso,apenas existenreferenciasbibliogrficasquejustifiquenestaafirmacinenneuronascorticales.Porotrolado,enlos pocos trabajos en los que los agonistas de los receptores A2A resultan neuroprotectores, como por ejemplo

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frente a modelos excitotxicos en ratas (Jones y col., 1998) o en modelos de hemorragia cerebral in vivo (Mayneycol.,2001),noestclarosisuaccinseproducedirectamentesobrelasneuronasomsbienocurrea travsdemecanismosperifricoscomo,porejemplo,laalteracindelflujosanguneoodelafuncininmune (revisadoporStone,2002).Adems,sehaobservadoqueenciertascondicionespatolgicasseproduceuna regulacinalalzadelosreceptoresA2Adeadenosina.Estehechohasidocomprobadoenmodelosdeepilepsia (Rebolaycol.,2005a),enmodelosdeParkinson(Pinnaycol.,2002)ascomoencerebrosdepacientesdeesta enfermedad(Calonycol.,2004).Porpartedelgrupodeinvestigacinenelquesehadesarolladolapresente Memoria,encolaboracinconelgrupodelDr.Ferrer,tambinsehadetectadounaumentoenlacantidadde receptor A2A en pacientes de demencia de Pick (Albasanz y col., 2006). Existe por tanto una tendencia en situacionespatolgicasrelacionadasconelfenmenoexcitotxicoalaregulacinalalzadelosreceptoresA2A deadenosina,apesardequelosmecanismosporlosqueseproduceestaregulacinnosecomprendenensu totalidad hoy en da, este proceso explica por qu, en general, los antagonistas de los receptores A2A proporcionanunarobustaproteccinfrenteaestmulosnocivos(revisadoporCunha,2005). Porltimo,sehamostradoqueenneuronascorticalesexpuestasaLGluseproduceunadisminucinde latranscripcindelelementoCREB.Engeneral,estefactordetranscripcinpromuevelaexpresindegenes relacionados con la supervivencia neuronal, como se ha demostrado tanto por los modelos de animales deficientesenCREB(Mantamadiotisycol.,2002)comoenensayosdeexcitotoxicidadenneuronascorticales (Leeycol.,2005).Noobstante,laidentidaddelosgenesreguladosporCREBpareceserdependientedeltipo celularydelestmulo.Loquessehadeterminadoesqueunadelasvasporlasqueestefactorseactivaesa travs de la activacin del receptor NMDA a concentraciones no excitotxicas (Hardingham y col., 2002), promoviendosealesdesupervivencia.Portanto,segnlostrabajosprevios,pareceexistirunarelacinentre ladisminucinenlaviabilidadobservadayladisminucinenlatranscripcindeestefactor. V.2.2EnclulasC6degliomaderata. LasclulasC6mostraronunaelevadaresistenciaalaexposicinaLGlutantoatiemposcortoscomoen exposiciones ms prolongadas. Resultados similares se observaron en el estudio realizado por Puttonen y colaboradores,dondelasclulasC6eranmsresistentesquelasclulasSHSY5Y,derivadasdeneuroblastoma humano,alosagentestxicos6hidroxidopaminayAraC(Puttonenycol.,2008).Adems,yahasidodescrito queenclulasC6senecesitanexposicionesacantidadeselevadasdeLGluparaobservarseefectosnocivosen la viabilidad celular (Sribnick y col., 2006), lo que confirma la elevada resistencia de estas clulas al dao excitotxico. Por otro lado, esta mayor resistencia frente a agentes txicos podra ser debida al papel neuroprotector que la gla desempea en el SNC. En este sentido se ha demostrado que la accin de la glia resulta neuroprotectora en cultivos deneuronas granulares (PrezCapote y col.,2004), de motoneuronas in vitro(Maragakisycol.,2005)odeneuronasdelaespinadorsal(Duycol.,2007). La disminucin de los receptores metabotrpicos de glutamato tras 6 horas de exposicin a LGlu confirma resultados obtenidos por este grupo de investigacin (Albasanz y col., 2002a). En este trabajo se

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demostrqueenC6,tras6horasdeexposicinaLGlu,seproducalainternalizacindelosreceptoresmGlu mediadaporvesculasdeclatrina.Algunosautoresproponenqueestaregulacinocurreenperiodosdetiempo cortostraslaexposicinaagonistas(Dohertyycol.,1999).Porotrolado,estefenmenohasidocomprobadoa tiempos ms cortos de exposicin a agonista por otros grupos de investigacin (Liu y Kirchgessner, 2000; Mundellycol.,2001;Iacovelliycol.,2004;Pelkeyycol.,2007).Existenreferenciasbibliogrficasqueavalanuna habilidadmuchomenosconocidadelosGPCR,sucapacidaddeserreguladosalalzaporexposicincrnicaasu agonista. Este fenmeno ha sido descrito para los receptores 3adrenrgicos (Thomas y col., 1992), los receptoresdelahormonaliberadoradegonadotropina(LoumayeyCatt,1983),losdelahormonaliberadora de tirotrofina (Cook y Hinckle, 2004), los nicotnicos de acetilcolina (Gentry y Lukas, 2002) y los de somatostatinadetipo1(Ramrezycol.,2005).Adems,sehadescritoquediferentessubtiposdelreceptorde somatostatinahumanopuedenserreguladosdemaneradiferentecuandoseexponenalmismoagonista,as los subtipos 2, 3, 4 y 5 se internalizan a tiempos cortos de exposicin mientras que los subtipos 1, 2 y 4 se regulan al alza despus de una prolongada exposicin a su agonista (Hukovic y col., 1996). No obstante, los mecanismos moleculares que controlan esta habilidad de algunos GPCRs no se conocen en la actualidad, aunquealgunosautoressugierenqueesteaumentodereceptordependientedeagonistasebasabienenel reclutamiento de los reservorios de receptor existentes en la membrana plasmtica (Hukovic y col., 1996) o bien en procesos posttranscripcionales (Gentry y Lukas, 2002). La regulacin al alza de los receptores mGlu observadatras24y48horaspodraserdebidaalasumadelosprocesosdereciclajedelosreceptoresantes internalizadoscomoconsecuenciadelaexposicinalagonistaduranteunlargoperiododetiempo(revisado por: Marchese y col., 2008; Hanyaloglu y von Zastrow, 2008) ms el resultado de un proceso de sntesis de novo,aunqueserannecesariosexperimentosadicionalesquecorroboraranestahiptesis. Como se coment en el apartado anterior existe controversia acerca del papel desempeado por los receptoresmetabotrpicosdelgrupoIensituacionespatolgicas.Sehademostradoqueanivelfisiolgicolos receptoresmGlu1activan,atravsdelaPKC,loscanalesdecalciodependientesdevoltaje(Endoh,2004),lo que, en principio, facilitara los procesos neurotxicos (Gee y Lacaille, 2004). Los primeros datos que proporcionaronevidenciasdequelaactivacindelosreceptoresdelgrupoIaumentabaeldaoproducidopor el NMDA datan de 1995. En estos experimentos, el empleo de DHPG exacerbaba el dao producido por la exposicin de cultivos mixtos de neuronas y astrocitos a NMDA (Bruno y col., 1995a). Desde entonces la eficaciadelosantagonistasdelgrupoIhasidodemostradatantoenmodelosinvitrocomoenmodelosinvivo. Entreotrosestudios,enmodelosinvitrosehaobservadoquelosantagonistasdelosreceptoresdelgrupoI eranneuroprotectoresenmodelosdeenvejecimientodehipocampo(Attucciycol.,2002)yquelosagonistas aumentabanlatoxicidaddelaexposicinahomocistenaenneuronasgranulares(Zieminskaycol.,2003).Por otro lado, los antagonistas de los receptores del grupo I resultaron neuroprotectores en modelos in vivo de Parkinsonenratas(Vernonycol.,2005)yratones(Aguirreycol.,2001).Sinembargo,parecequeserequiere unestudiodecadasituacinpatolgicaparapoderestablecerlafuncindecadatipodereceptor,dehecho,en cerebros de pacientes con esclerosis lateral amiotrfica se encontr que los grupos de motoneuronas vulnerables expresaban ms mGlu1 y menos mGlu5 que los grupos de motoneuronas resistentes (Ma y col.,

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2006),loquellevalosautoresaconcluirqueestaexpresindiferencialdelosreceptoresdelgrupoIeralo quepodrahaceraestasneuronasmssusceptiblesdedegenerar. La concentracin extracelular de glutamato es controlada fundamentalmente por las clulas gliales, principalmente astrocitos, las cuales, a travs de los transportadores de glutamato, son las encargadas de mantenerlosnivelesextracelularesdeglutamatoenconcentracionespordebajodelaneurotoxicidad(Frizzoy col., 2001). Se han descrito hasta la fecha en mamferos 5 subtipos de transportadores de glutamato, denominadosenhumanosdeEAAT1aEAAT5(ExcitatoryAminoAcidTransporters)yenroedoresGLAST,GLT1, EAAC1,EAAT4yEAAT5(revisadoporShigeriycol.,2004),deloscualeslasC6sloexpresanEAAC1(Yaoycol., 2005),aunquelosprincipalesenastrocitosseanGLASTyGLT1(AndersonySwanson,2000).Enclulasglialesel glutamatoestransportadoalinteriorcelularporestosEAATs,dondesetransformaenglutaminaysealmacena en vesculas. Estas vesculas se liberan y la glutaminaalcanza el terminal presinptico, donde escapturada y transformadaenglutamato,elcualsealmacenadadenuevoenvesculas.Todosestosprocesosconstituyenel ciclo glutamatoglutamina en el cerebro (revisado por McKenna, 2007). Alteraciones en cualquiera de los mecanismosdetransportedescritosascomodelasenzimasimplicadasenestosprocesospuedendarlugara una incorrecta homeostasia del glutamato que desencadene procesos patolgicos. Por ejemplo, se ha demostrado que en cortes de hipocampo sometidos a hipoxia severa los transportadores funcionaban liberandoglutamatoalmedio,envezderetirndolo,loqueproducalamuerteneuronal(Rossiycol.,2000). Por otro lado, los receptores metabotrpicos de los grupos II y III han sido relacionados con fenmenos de neuroproteccin en C6 frente a MPP+, una sustancia empleada para inducir parkinsonismo en primates, quedandodemostradoquesuactivacinaumentabalacapturadeglutamatoenestasclulas(Yaoycol.,2005). En el trabajo de Yao y colaboraboradores se detect un aumento de los receptores del grupo III tras prolongadasexposicionesaLGlu.ElpapelneuroprotectordelaactivacindelosreceptoresdelgrupoIIIyaha sido demostrado previamente en microgla, donde la activacin de estos receptores protega a las neuronas granulares frente a la toxicidad inducida por el LPS (Taylor y col., 2003). Sin embargo, no est claro el mecanismoporelcuallaactivacindeestosreceptoresenclulasglialespuedeserneuroprotectora,aunque se postulan varios mecanismos. As, se ha demostrado que inhiben la liberacin de quimiocinas proinflamatorias(Besongycol.,2002)yqueinducenlaliberacindeTGF(transforminggrowthfactor)en clulasgliales(Brunoycol.,1998),atravsdelasMAPquinasasylaPI3K(D'Onofrioycol.,2001).Sinembargo, sonnecesariosexperimentosadicionalesqueconfirmenlahiptesisdequelosreceptoresmetabotrpicosdel grupo III son neuroprotectores frente a la accin del glutamato en C6 y por qu va o vas ocurre esa proteccin. LosreceptoresdeadenosinaA1yA2AseregulanensentidoopuestoenlasclulasC6encondicionesde excitotoxicidad.ComosehaexpuestoenlapresenteMemoria,sehaapreciadounaumentodelreceptorA1a nivel de protena y de funcin, por el contrario, los niveles as como la funcionalidad de los receptores A2A resultaban disminuidos. Teniendo en cuenta que las clulas C6 han demostrado ser resistentes al dao excitotxico, es razonable plantear la hiptesis de que las variaciones anteriormente descritas en los receptores de adenosina estn encaminadas a preservar la viabilidad celular. Esta hiptesis se ajusta a las

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funcionescomnmenteaceptadasparalosreceptoresdeadenosina,esdecir,laactivacindelavainhibitoria delreceptorA1esneuroprotectoraascomotambinloeselbloqueodelavaestimuladoradelreceptorA2A. Las caractersticas neuroprotectoras de la activacin delreceptor A1 en diversos modelos celulares ya hansidoexpuestasenelapartadoanterior,porloqueaqusloseexpondrnalgunasparticularidadesdelas clulas gliales. Por un lado, los receptores de adenosina controlan la liberacin de diversas sustancias que puedeninfluenciarlaactividadneuronal,ascomosuviabilidad.Porejemplo,sehadescritoquelaactivacin del receptor A1 promueve la liberacin de NGF (nerve growth factor) en cultivos primarios de astrocitos (Ciccarelli y col., 1999) o de interleucinas, como la IL6 que presenta propiedades neuroprotectoras (Schwaninger y col., 1997). Por otro lado, los receptores de adenosina, al igual que en neuronas, pueden modular la funcin de otros sistemas de receptores, como ocurre con la otra familia de receptores que es objetodeestudiodeestaMemoria,losreceptoresmetabotrpicos(Cormierycol.,2001),ascomomodularel metabolismo celular. Existen, por tanto, bastantes vas por las que la activacin de los receptores A1 puede desencadenarfenmenosprotectoresenclulasC6. Existen en la bibliografa evidencias robustas de que el bloqueo de los receptores A2A resulta neuroprotector. Aunque los primeros trabajos empleando antagonistas de los receptores A2A como agentes neuroprotectores datan de principios de los 90, no fue hasta unos aos ms tarde cuando se acept definitivamentelaimplicacindelainactivacin,genticaofarmacolgica,delosreceptoresA2Aenprocesos neuroprotectoresenmodelosdeisquemiainvivo(Monopoliycol.,1998;Chenycol.,1999).Adems,tambin se ha demostrado la capacidad neuroprotectora de los antagonistas de los receptores A2A en modelos de excitotoxicidadinducidosporkainato(Leeycol.,2004b)oporlaadministracindecidoquinolnico(Popoliy col.,2002).Delarevisindeestostrabajossedesprendequelaneuroproteccinobservadaenmodelosinvivo por el bloqueo de los receptores A2A es ms robusta en regiones corticales que en ganglios basales, donde tradicionalmentesehacredoqueestosreceptoreseranmsabundantes.Estaobservacinconcuerdaconlos resultados obtenidos en la presente Memoria, donde se observa que la expresin de los receptores A2A en neuronasdecortezayclulasglialesC6essimilaralaobservadaparalosreceptoresA1,aunquecontrastacon loobservadopreviamenteempleando[3H]CGS21680comoradioligando(Lopesycol.,2004). A pesarde los efectos tanclaros que sehan observadopor el bloqueo de los receptores A2A frente a diferentes estmulos nocivos no se conocen con exactitud los mecanismos que conducen a esta proteccin celular.Enelcasodelasclulasgliales,estehechoseveincrementadoporlaescasezdetrabajosinvitroque avalenlaeficaciadelosantagonistasdelosreceptoresA2Afrenteafenmenostxicosyquefacilitenelestudio de las funciones que desempean en estos procesos. Se ha establecido que los receptores de adenosina controlanenclulasglialeslaastrogliosismediantelaactivacindelosreceptoresA2A(Brambillaycol.,2003), as como que la activacin de estos receptores produce una disminucin en el transporte de glutamato al interiordelosastrocitos(Pintorycol.,2004)yconunincrementoenlaliberacindelmismo(Nishizakiycol., 2002). Sin embargo, se desconoce con exactitud la contribucin de estos fenmenos a la neuroproteccin demostradaporlosantagonistasdelosreceptoresA2A.

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En lo que respecta a la transcripcin del factor CREB, dadas las razones esgrimidas en el apartado anterior,eslgicosuponerqueladisminucinenlatranscripcindeCREBpuedeconstituirelpasoprevioala muertecelular,que,enteorapodramosobservarsiseprolongaselaexposicinaLGlu.Atiemposmscortos, sepodraresponsibilizaralosnivelesbasalesdeexpresindeestefactordelasupervivenciacelularobservada, adiferenciadeloobservadoenneuronas.Noobstante,experimentosadicionales,comolacomprobacinde losnivelesdeCREBfosforilado,serequeriranparacorroborarodesmentirestashiptesis. V.3.EfectodelahipoxiasobrelasclulasdeSNC. V.3.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza. Con los experimentos desarrollados en este captulo se ha demostrado la modulacin sufrida por los receptoresmetabotrpicosdeglutamato,losreceptoresdeadenosinaylasvasdetransduccinprincipalesa lasqueestosreceptoresseencuentranacoplados,cuandolasneuronascorticalesfueronexpuestasahipoxia moderada. Estemodeloseplanteapartirdeestudiosdescritosenlabibliografaqueproponanquelafamiliade factoresHIFseactivabainvitrocuandolacantidaddeoxgenodisminuyedel5%(40mmdeHg)(Pouyssgury col., 2006), siendo esta activacin, adems, progresiva segn decrece la cantidad de oxgeno disponible (BrahimiHorn y Pouyssgur, 2006). Dado que existen en la bibliografa multitud de estudios realizados en diversoscomponentesdelSNCabajaspresionesparcialesdeoxgeno,generalmentepordebajodel2%,yque elcerebrohumanoesespecialmentesensiblealaprivacindeoxgeno(Leeycol.,2000a),sedecidirealizar esteestudioanivelesdehipoxiamsmoderados(5%O2). Lascondicionesdehipoxiamoderadainducenprocesosdemuertecelularsobrelasneuronascorticales de cerebro de rata in vitro, como se ha demostrado en el test de viabilidad empleado. La evaluacin de la morfologa celular, as como el incremento en la cantidad de ARNm del gen codificante para caspasa 3, permitenafirmarquelamuertecelulardetectadaesdetipoapopttico. La viabilidadcelular se estudi mediante un kitcomercial disponible basado en elcompuestoMTT, el cualrelacionalatoxicidaddeunadeterminadasustanciaconelefectoquestaejercesobrelafuncionalidad celular, incluida la actividad mitocondrial. Segn se ha expuesto, la hipoxia moderada reduca la viabilidad celulartras24horasdeexposicindelasneuronascorticalesinvitro.Esteresultadoeselesperadoparaclulas delSNC(Leeycol,2000),aunqueotrostiposcelulares,comolosfibroblastosencultivo,interrumpensuciclo celularfrentealahipoxiaperopermanecenviables(Schmaltzycol.,1998)yenelcasomsextremo,descrito paralalneaC6degliomaderata,laproliferacincontinaynoocurremuertecelular(Castilloycol.,2008). Est descrito en la literatura que la disminucin en la disponibilidad de oxgeno induce procesos apotticos en tumores humanos que podran ejercer incluso una presin selectiva sobre las clulas cancergenasmsresistentes(Weinmannycol.,2004).Estefenmenotambinseobservainvitroencultivos

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primariosdecortezadecerebroderatasometidosahipoxiasevera(Hejmadiycol.,2003)oinclusoenotros tipos celulares como son los cardiomiocitos (Ren y col, 2008) o las clulas endoteliales (Hung y col., 2007), confirmando los resultados obtenidos en nuestos cultivos. Es destacable que en todos ellos se emplearon condiciones de privacin de oxgeno ms severas que las empleadas en estos estudios, lo que valida la hiptesisdequeesapresionesparcialesdeoxgenomenoresal5%cuandoseempiezanahacerpatenteslos efectosdelahipoxia. Sinembargo,enunmodelosimilardeneuronascorticalesdecerebroderata(DelgadoEstebanycol., 2002)laexposicininvitrodeestasneuronasacondicionescercanasalaanoxiaduranteunahoranoprodujo diferenciasenlaviabilidadcelular.Estaaparentecontroversiapuedeserdebidaatresmotivos.Elprimerode ellosesqueeltiempodeexposicinempleado(1h)noseasuficientecomoparaobservarlosefectosnocivosde lahipoxia.Elsegundosebasaenelhechodequeelmtodoempleadoparacuantificarlamuertecelularen este trabajo, tinciones de la cromatina con Hoechst o ioduro de propidio, es mucho menos sensible que el mtodobasadoenMTTempleadoenlapresenteMemoriaparadetectarvariacionesenlaviabilidadcelular. Por ltimo, los experimentos se realizaron en neuronas corticales a 9 DIV, frente al rango de 14 a 18 DIV empleados en este trabajo, lo que podra suponer una menor vulnerabilidad del cultivo primario al dao producidoporlaprivacindeoxgeno. Esconocidodesdehacealgunosaosquelahipoxiay/olaisquemiainducenlaliberacindeadenosina con fines neuroprotectores (Fredholm, 1997), sin embargo, junto con este neuromodulador se liberan otros neurotransmisores, incluyendo los aminocidos excitadores glutamato y aspartato (Phillis y col., 1991), el inhibidor GABA (Phillis y col., 1991), noradrenalina (Globus y col., 1989) y acetilcolina (Kumagae y Matsui, 1991),siendo,enprincipio,losaminocidosexcitadoreslosresponsablesdeldaoneuronalqueocurrecomo consecuencia de los episodios hipxicos/isqumicos (Lipton y Rosenberg, 1994). En este trabajo se ha demostrado que la exposicin de neuronas corticales de cerebro de rata al modelo descrito de hipoxia moderada produce un aumento del nmero total de los receptores metabotrpicos de glutamato en la superficiecelularsinqueelloafecteasuafinidad.Elestudiomsespecficodecadasubtipodereceptorindic que los subtipos mGlu1, mGlu5 y mGlu2,3 son responsables, si no totalmente, al menos, parcialmente del aumento observado. Sin embargo, este patrn no se observaba a nivel del ARNm de los subtipos mGlu1 y mGlu5,siendolaexpresindelprimerodisminuidaconlahipoxiamoderadamientrasqueladelsegundonose veaalteradaalolargodeestosprocesos.Interesantemente,laenzimaPLC1,principalisoformalaPLCenSNC, secomportabaensentidocontrarioalobservadoparalosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIalosqueest acoplada, describindose en este caso una disminucin de la cantidad de esta enzima no justificable por variacionesensuexpresingnica.Sinembargo,losensayosenzimticosrealizadosdemostraronquelavade transduccin de seales que implicaba a los receptores metabotrpicos del grupo I y a la enzima PLC no resultaba alterada como consecuencia de la hipoxia moderada en neuronas corticales de cerebro de rata, podemossuponerqueelloesdebidoamecanismosdecompensacin. La isoforma 1 de la enzima PLC juega un papel importante en la transduccin celular de seales de supervivenciaysehaobservadoquesusobreexpresinprotegalosfibroblastosNIN3T3deldaooxidativoin

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vitro(Leeycol.,2000b).Deformaanloga,encultivosprimariosdeneuronascorticalessehaobservadoqueel estrs qumico del retculo endoplsmico produca, de forma dosis dependiente, una disminucin en la viabilidadqueibaacompaadadeunadiminucinsimilarenlaexpresindelaisoforma1delaPLC(Yasuday col.,2008).OtroestudioquerelacionalaPLC1conlosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIeselrealizado por Nagasaka y colaboradores, en el que demostraron que la tena, un componente del t verde, ejerca un efecto neuroprotector en cultivos primarios de neuronas corticales frente a la exposicin a glutamato como consecuencia de la activacin de los receptores metabotrpicos del grupo I, los cuales aumentaban la expresin de la protena PLC1, evitando as la muerte neuronal (Nagasaka y col., 2004). Estos resultados concuerdanconlospresentadosenestaseccindelapresenteMemoria,enlaqueelaumentoenlaexpresin delosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIsepuedeexplicarcomounintentodepaliarlasdeficienciasenla va de sealizacin a la que estn principalmente acoplados, sta es, el aumento del calcio intracelular, deficiencias producidas por la disminucin en los niveles de la enzima PLC1. De hecho, se observa que el efecto final de la exposicin a agonistas de los mGlu del grupo I en este modelo propuesto de hipoxia moderadanosediferenciadelobservadoenneuronascorticalesmantenidasencondicionesdenormoxia. Estahiptesisseapoyaenelhechoobservadoexperimentalmenteporotrosgruposdeinvestigacinde que, en general, el empleo de agonistas de los receptores metabotrpicos del grupo I en modelos de dao cerebral por hipoxia/isquemia resulta neuroprotector. Este modelo de neuroproteccin se ha descrito en neuronas hipocampales sometidas a anoxia (Maiese y col., 1996), en cortes de hipocampo durante la hipoxia/hipoglicemia(Schrderycol.,1999),encultivosprimariosdeneuronasgranulares(KaldayZharkovsky, 1999;Kaldaycol.,2000)yencerebroneonatalderata(Camboineycol.,2000).Segnparece,laclavedela neuroproteccin ejercidapor los receptores metabotrpicos delgrupo I se basa en la capacidad de estos de activarlaPKC(Schrderycol.,1999;Maieseycol.,1996),cuyaaccinneuroprotectorayahasidodemostrada enotrosmodelosinvitrodedaocerebral(CordeyyPike,2006). AunqueelaumentodelosreceptoresdelgrupoIyladisminucindelaencimaPLC1puedanparecer accionescontradictorias,recientemente,sehadescritoporestegrupodeinvestigacin,encolaboracinconel delDr.Ferrer,resultadossimilaresenelestudiodelacortezacerebraldepacientescondemenciaconcuerpos deLewyensuformapura(Dalfycol.,2004). Sin embargo, existen algunos autores que postulan que la activacin de los mGlu del grupo I podra incrementareldaocelularenlosprocesospostisqumicos,yaque,segndemostraronMeliycolaboradores (Meli y col., 2005) en clulas BHK (Baby hamster kidney) transfectadas con mGlu1 y mGlu5, la activacin de estos receptores estimulaba la actividad de la poli(ADPribosa) polimerasa (PARP), enzima relacionada con procesosdereparacindelADNycuyahiperactividadserelacionaconmecanismosdemuertecelular,locual hacequelafuncinexactadeestaenzimaseatodavacontrovertida(NicolettiyStella,2003). SegnobservaronCasoliniycolaboradores(Casoliniycol.,2005)enunmodelodehipoxiapostnatal,los nivelesdeARNmdelosreceptoresmGludelgrupoIdisminuanenhipocampoycortezacomoconsecuenciade lahipoxiaalaqueeransometidoslosneonatos.Estosresultadosconcuerdanparcialmenteconlospresentados enlapresenteMemoria.Sinembargo,debidoalacantidadyvariedaddeprocesosintermediosqueocurren

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desde que se sintetiza el ARNm hasta que se obtiene la protena funcional existe todava, en la actualidad, ciertacontroversiaacercadelarelacinexistenteentrelosnivelesdeARNmydeprotenaenloscasosenlos quenoseobservanvariacionesenelmismosentido.Algunosautoresatribuyenestasvariacionesadefectosen la maquinaria celular que ocurren en ciertas patologas (MartnRuiz y col., 2004), sin embargo no hay evidenciasexperimentalesquecorroborenningunahiptesis. LaregulacindelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIIhasidoestudiadamsafondoalolargode estos ltimos aos dado que, debido a sus funciones conocidas es ms fcil explicar su posible papel neuroprotector.Deestemodo,sepostulaquelosreceptoresmGludelgrupoII,anivelpostsinpticoreduciran la excitabilidad neuronal como resultado de la disminucin en la formacin de AMPc o la modulacin de determinadoscanalesinicos(pararevisinverTamaruycol.,2001).Porotroladosellevacaboen2003un estudio exhaustivo de la expresin de mGlu2,3 en especies tolerantes a anoxia (Poli y col., 2003), del que se dedujo que, en el cerebro de estas especies, la expresin de los receptores mGlu del grupo II era significativamente ms elevada, resultando adems sus agonistas neuroprotectores en este modelo. No obstante,otrostrabajosencerebroderata(Caiycol.,1999),enclulasgranulares(KaldayZharkovsky,1999)o en retina (Beraudi y col., 2007), apoyan este efecto neuroprotector descrito principalmente en Carassius auratus por Poli y colaboradores (Poli y col., 2003). Estos trabajos confirman los resultados obtenidos en la presenteMemoria,enlosqueseobservaunincrementodelaexpresindelosreceptoresmGludelgrupoIIen lasuperficiecelulardelasneuronascorticalescomoconsecuenciadelaexposicinabajaspresionesparciales deoxgeno.Esteaumentovaademsacompaadodeunapotenciacinenlavadesealizacinmediadapor estosreceptores,loquecorroboraraelpapelneuroprotectordelosagonistasdelosreceptoresdelgrupoII comoagentescapacesdedisminuirlacantidaddeAMPcintracelular. Por ltimo, en lo que se refiere a los mGlu pertenecientes al grupo III, la potenciacin de su va de sealizacinenelmodelodescritodehipoxiamoderadaconcuerdaconlostrabajosdescritosenlaliteratura, enlosquelaactivacindelosmGludelgrupoIIIresultaneuroprotectorapormotivossimilaresalosesgrimidos en el caso de los agonistas de los receptores del grupo II. En este sentido, se ha descrito el efecto neuroprotectordeagonistasdelgrupoIIIenmodelosdehipoxia/isquemiaenneuronashipocampalesinvitro (Maieseycol.,1996)yencortesdehipocampo(Sabelhausycol.,2000).Eltrabajoaqupresentadoconstituye el primer estudio realizado hasta la fecha sobre la expresin proteica de los receptores metabotrpicos durantelosprocesosdehipoxiamoderadaenneuronascorticales. En la presente Memoria se ha descrito que las neuronas corticales de cerebro de rata sometidas al modelodescritodehipoxiamoderadasufrenunamodulacindelosreceptoresdeadenosinapresentesenla membranacelular.Enconcreto,seobservaqueladensidaddelosreceptoresA1aumentamientrasquelade los A2A disminuye significativamente en la membrana plasmtica de estas clulas, sin que sea modulada la expresingnicadeambosreceptores.Porotrolado,seobserv,enlosensayosenzimticosrealizados,una potenciacindelavadesealizacinprincipalmediadaporestosreceptores. Sinembargo,estarespuestadescritaeslacontrariaqueseesperarateniendoencuentalaliberacinde adenosina que ocurre durante la hipoxia, de hecho se ha descrito anteriormente que ocurren procesos de

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desensibilizacineinternalizacindelosreceptoresA1enhipocampoderatadurantelaanoxia(Coelhoycol., 2006),ascomoprocesosdedisminucinenlauninderadioligandosenvariaszonascerebralesenunmodelo de oclusin de la arteria cerebral media (Nagasawa y col., 1994) y en un modelo de isquemia cerebral transitoria (Onodera y col., 1987), aunque ste no es un comportamiento general para los receptores A1 en todas las reas cerebrales (Lee y col., 1986). Por otro lado, el efecto contrario, es decir, un aumento de los nivelesdelreceptorA2A,sehaobservadoenclulasPC12sometidasa5%deO2durante12horas(Kobayashiy Millhorn,1999). Son conocidas las propiedades neuroprotectoras de los agonistas del receptor A1 en modelos de hipoxia/isquemia (revisado por de Mendoa y col., 2000), aunque no est tan claro la funcin de los antagonistas de los receptores A2A en estas situaciones (revisado por Cunha, 2005). Por este motivo es razonablesuponerqueelsignificadofisiolgicodelosefectosobservadosenneuronascorticalessometidasa hipoxiamoderadasobreestosreceptoresesunintentocelulardeminimizareldaocuandolascondicionesde disponibilidad de oxgeno no son favorables, mientras que la disminucin de los niveles del receptor A1 y el aumento de los del receptor A2A en condiciones de anoxia podra entenderse como una disfuncin en la regulacindeestosreceptorescomoresultadodeunprocesopatolgico.Estahiptesissesustenta,adems, en el hecho demostrado de que los ratones deficientes en el receptor A1, a pesar de ser viables, al ser sometidos a hipoxia presentaban una muerte embrionaria elevada y un profundo retraso en el crecimiento acompaado de diversas malformaciones, lo que demuestra el papel neuroprotector de los receptores A1 durantelahipoxiaprenatal(Wendlerycol.,2007). Las clulas neuronales responden a la disminucin de oxgeno incrementando la liberacin del neuromodulador adenosina, tanto en sistemas in vivo (Van Wylen y col., 1986; Phillis y col., 1987) como en sistemas in vitro (Fredholm y col., 1994; Frenguelli y col., 2003), el cual parece actuar como un agente neuroprotector endgeno (de Mendona y col., 2000; Fredholm y col., 2005a). En esta Memoria se ha demostradoquelaexposicindelasneuronascorticalesaadenosinaproduceunefectosimilaralobservadoen estas clulas cuando la presin parcial de oxgeno disminua, aunque con algunas ligeras diferencias. En general,sepodradecirquelaadenosinamimetizaelefectodelahipoxiaalargostiemposdeexposicin,sin embargo, a tiempos cortos de exposicin el comportamiento de los receptores estudiados es diferente. El receptorA1,elmssensiblealapresenciadeadenosinayelquejuegaelpapelprincipalenlaneuroproteccin mediadaporesteagente(Sebastioycol.,2001),eselquemayoresdiferenciaspresentaentrelaaplicacinde adenosina y la bajada de oxgeno. De hecho, los resultados sobre los niveles del receptor A1 producidos por ambos tratamientos slo se igualan en los experimentos a tiempos ms prolongados (24 horas). Estas diferenciaspodranserdebidasalaevolucinconeltiempodelosnivelesdeadenosinadurantelahipoxia.A pesardehaberseintentado,nosehanpodidocalcularlasconcentracionesdeadenosinaalosdistintostiempos ensayados pero, a la vista de los resultados obtenidos, es razonable suponer que se produce un aumento gradual hasta alcanzar valores cercanos a 1 M en el medio de cultivo. Sin embargo, el receptor A2A no se comportademaneradiferenteanteestasdossituaciones,observndoseatodoslostiemposensayadosuna regulacinsimilarenambosbloquesdeexperimentos.Estoshechosexperimentalesconcuerdanconlamayor

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afinidaddel receptorA1 porla adenosinacon respecto al A2A y,por otro lado, apoyan la hiptesis de que el aumentodelreceptorA1seaneuroprotector,yaqueesafacilidadquedemuestraparasermoduladoporlos estmulosensayadospermitiraquelaclulaseadaptararpidamentealnuevoentorno. Se ha descrito con anterioridad por este grupo de investigacin los procesos de transmodulacin existentes entre los receptores de adenosina y los receptores metabotrpicos de glutamato en cerebro (Albasanzycol.,2002b;Lenycol.,2008)yencoraznderata(Iglesiasycol.,2006).EnlapresenteMemoriase ha demostrado que las variaciones detectadas en los receptores metabotrpicos de glutamato durante la disminucindeladisponibilidaddeoxgenosecorrespondenconlasprovocadasporaumentosenlacantidad de adenosina en el medio de cultivo y son, por tanto, mediados por los receptores de adenosina. Estas variaciones detectadas ocurren en el mismo sentido que las observadas en cerebro de rata tras inyecciones subcutneas de RPIA (Albasanz y col., 2002b), aunque seran necesarios experimentos adicionales que desvelaranelmecanismodecontroldelosreceptoresdeadenosinasobrelosdeglutamatoenestemodelo. Durantelareoxigenacinposterioralahipoxia/isquemiaocurrenfenmenosdemuertecelulardevital importancia clnica. Los resultados descritos demuestran que durante la reoxigenacin tambin ocurren procesosdemodulacindelacantidadylaafinidaddelosreceptoresestudiadosenlapresenteMemoria.Para los receptores de adenosina se observa que 1 hora de reoxigenacin produce en el receptor A1 una disminucin de los parmetros cinticos observados, mientras que para el receptor A2A no supone cambios destacables. Este resultado est de acuerdo con los argumentos expuestos anteriormente, por un lado los receptoresA1sonmssusceptiblesdeserreguladosporlaaccindelaadenosinay,portanto,tambinloson a situaciones fisiolgicas que producen variaciones en los niveles de este neuromodulador. Segn esta hiptesis,seraelreceptorA1elprincipalmediadordelosefectosdelaadenosinaanivelcelular,siendopor tanto responsable de orquestar los cambios detectados a nivel del receptor A2A. Para los receptores metabotrpicos la reoxigenacin supone una variacin adicional no observada durante los fenmenos de hipoxiamoderada.Enestecaso,lavariacinenelnmerodereceptoresvieneacompaadadeaumentosenla afinidaddelosmismos,sepodrapostularcomoelresultadodeunmecanismodecompensacindestinadoa paliar la disminucin en la excitabilidad neuronal que conlleva la prdida de receptores metabotrpicos. Aunque poco se conoce de los mecanismos que gobiernan los procesos de reoxigenacin, parece que la activacin de los factores de transcripcin cfos y cjun por las MAP quinasas controla la expresin gnica durantelareoxigenacin(Mizukamiycol.,2000). Encondicionesfisiolgicas,lafamiliadefactoresdetranscripcinCREBpromuevelaexpresindegenes quecontribuyenalasupervivencianeuronal(DawsonyGinty,2002),dehechosudeficienciaestdirectamente relacionadacondegeneracinneuronal(Mantamadiotisycol.,2002).Portanto,ladisminucinenlaviabilidad observadaenestebloquedeexperimentospodraserdebidaaladisminucindelatranscripcindeCREBy CREMquedaralugaranivelesmenoresdeprotena.Estaafirmacinsecorrelacionaconlaobservacindeque en diferentes poblaciones neuronales la resistencia a procesos de hipoxia se produca por la fosforilacin mantenidaeneltiempodelfactorCREB,mientrasqueenlasneuronasnoresistentesslosefosforilabaCREB deformatransitoria(revisadoporWaltonyDragunow,2000).

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Los mayores reguladores de la homeostasia del oxgeno son los factores inducibles por hipoxia (Semenza, 2001), que se subdividen en tres familias: HIF1, HIF2 y HIF3. Mientras que HIF1 y HIF2 funcionancomofactoresdetranscripcinenscondiferentesfuncionesesencialesparaeldesarrollo(Benizriy col., 2008), HIF3 parece ser un modulador negativo de los genes expresados en hipoxia, aunque sus funcionesnoestnbiendefinidashastalafecha.LaausenciadevariacinenlaexpresindeHIF1,ascomo elaumentoenlaexpresindeHIF3,hacerazonablesuponerqueelefectodelahipoxiamoderadaenestas clulaspuedaserdebidoaotrosfactoresdetranscripcindistintos.Sinembargo,dadoquelamayoradelos mecanismosderegulacindelosfactoresdelafamiliaHIFconocidossonposttranscripcionales(Benizriycol., 2008),laimplicacindeHIF1yHIF3enlamodulacindelaexpresingnicaenestosprocesosnodebeser descartada. V.3.2EnclulasC6degliomaderata. AlolargodeestecaptulosehademostradoqueenlasclulasC6degliomaderataexpuestasauna presinparcialdeoxgenodeun5%ocurrenfenmenosdemodulacindelosreceptoresmetabotrpicosde glutamato,observndoseaumentosenlosparmetroscinticosdeestosreceptoresquehansidoestudiados, queslosecorrelacionabanconaumentosenlaexpresingnicademGlu1tras24horasdeexposicin.Los cambiosenlaexpresindelosmGlunosereflejanenlaactividadPLCensayada.Encuantoalosreceptoresde adenosina los receptores A1 disminuyen y los A2A aumentan, al contrario de lo que suceda en cultivos neuronales,variandolasrespectivasconstantesKDenelmismosentido.Estoscambiosnoseobservaronanivel del ARNm de estos receptores pero s en los ensayos de la actividad AC en el caso del receptor A2A. Se detectaronademsvariacionesenlaexpresingnicadelosfactoresdetranscripcinCREByCREM,loscuales disminuandurantelahipoxiamoderada.Porltimosedemostrquelaadenosinamimetizabalosefectosdela hipoxia y que la regulacin observada en el caso de los receptores de adenosina estaba orquestada por el receptorA1. Al contrario de lo observado para neuronas corticales, en clulas C6 la hipoxia moderada no produce disminucin alguna en la viabilidad celular, aunque estas clulas son sensibles a condiciones estrictas de privacin de oxgeno y glucosa (Wang y Tang, 2007). Este fenmeno ha sido observado con anterioridad en clulas A549,derivadas de epiteliales de hgado, las cuales resistan 1,5% deO2durante 24 horas (Santorey col.,2002)yparecequesesustentaenlaactivacindelaquinasaAkt,lacualinhibelaprotenaproapopttica BadyfavorecelaaccindelfactorNFB(Dattaycol.,1997;Ozesycol.,1999).Ademssehadescritoque,en algunoscasos,lahipoxiafavorecefenmenosderesistenciaaapoptosisatravsdelfactorIAP2(Dongycol., 2003). En clulas PC12 se observ que la hipoxia induca cambios en enzimas claves del metabolismo del glutamato que producan una disminucindel glutamatoextracelular, lo cualpodraprotegera estas clulas durantelahipoxia(KobayashiyMillhorn,2001). ExistenenlaliteraturaestudiosacercadelpotencialteraputicodelosreceptoresmGlu,dehecho,se hademostradoqueeldaoporanoxiasereduceenclulasendotelialesalemplearagonistasdelostresgrupos

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dereceptoresmGlu(LinyMaiese,2001)oqueelempleodeagonistasdelgrupoIreducelamuertecelularen clulas granulares de cerebelo privadas de oxgeno y glucosa (Kalda y col, 2000). Recientemente se ha observadoque,encortesdehipocamposometidosaprivacindeglucosayoxgenolaactivacindelosmGlu del grupo I, y su accin a travs de PI3K y Akt, resultaba neuroprotectora (Scartabelli y col., 2008). En este mismosentido,secomentenelapartadoanteriorelpotencialneuroprotectordelosagonistasdelosgrupos II y III de los mGlu. Con estos antecedentes bibliogrficos se puede suponer que el aumento de los mGlu observadoenclulasC6sometidasahipoxiamoderadapuedeserdebidoaunintentofisiolgicodedisminuir eldaocelularproducidoporlosprocesosdeprivacindeoxgeno,locual,porotrolado,explicaralaaparente insensibilidad de estas clulas, en lo que a su viabilidad se refiere, frente a la disminucin de un factor vital comoeslapresinparcialdeoxgeno. Dado el aumento descrito en la expresin gnica del gen codificante para el receptor mGlu1, es razonablesuponerquelosnivelesdeprotenadeestereceptordebenestaraumentadosenestosprocesos.Sin embargo, los aumentos descritos en los niveles de los receptores mGlu, no pueden entenderse nicamente como un aumento del receptor mGlu1, ya que la expresin gnica no resulta modulada hasta tiempos prolongadosdeexposicinahipoxiamoderada(24horas).Porlotanto,otrosmecanismosderegulacindeben estarimplicadosenelaumentodetectadodelosreceptoresmGlu. Otrohechoexperimentalquecorroboraestahiptesiseslavariacindetectadaenlaafinidaddeestos receptores.Lasdisminucionesenlaafinidaddetectadaspodranserdebidas,almenos,a2sucesos:porunlado que el aumento detectado de los receptores mGlu conlleve una variacin en la presencia de los distintos subtipos en la membrana plasmtica, como cada subtipo tiene su propia constante de afinidad, seran variacionesenlascantidadesloquepodranexplicarlavariacindelaafinidadglobal;porotrolado,pueden darseenlosreceptoresmetabotrpicosprocesosdedimerizacin,entreellosmismosoconotrosreceptores demembrana,comoconsecuenciadelascondicionesdehipoxia,quealterenlaafinidaddelosmismosporsu ligandoaltiempoquetambinmodificansufuncionalidad. La isoforma 1 de la enzima PLC juega un papel importante en la transduccin celular de seales de supervivencia (Lee y col., 2000b). Ha quedado demostrado que ni la actividad basal de la enzima PLC ni la capacidad de agonistas del grupo I de los receptores mGlu de estimularla varan en los experimentos desarrollados, a pesar del aumento observado en los receptores mGlu. Hay varias hiptesis que podran explicar estos hechos. La primera de ellas es que las clulas C6 se comportaran de manera similar a las neuronascorticalesdurantelahipoxiamoderada.Estahiptesisfuediscutidaenelapartadoanteriorynose repetiraqu,sinembargosesnecesarioapuntarqueelestudiorealizadoenclulasC6fuemenosexhaustivo que en neuronas corticales, por lo que hay menos datos experimentales que sustenten esta hiptesis. Otra posibilidadesqueelsistemadelosreceptoresmGludelgrupoIylaPLCnovaren,onovarenlosuficiente, como para observarse diferencias significativas en la funcionalidad del sistema o bien existan variaciones a niveldelasprotenasGencargadasdeconectarambossistemasquemodifiquenlafuncionalidaddelsistema ensuconjunto.Porltimo,podraocurrirquenoseobservendiferenciasdebidoalabajaactividaddelaPLC en este tipo celular (tres veces menor que en neuronas corticales), lo que dificultara su cuantificacin.

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Cualquiera de las hiptesis mencionadas anteriormente requerira experimentos adicionales que la corroboraran. EnelestudiodescritosehaobservadounaprdidadereceptoresA1atodoslostiemposdeexposicin ensayados.LosreceptoresA1normalmentesedesensibilizandeformamslentaqueotrosGPCRdebidoasu larga vida media (Hettinger y col., 1998). En este sentido, existen algunos trabajos que sugieren que la desensibilizacinneuronaldelosreceptoresA1ocurretrasexposicionesaagonistaatiemposlargos,inclusode das (Abbracchio y col., 1992; Fernndez y col., 1996). Resultados similares se obtuvieron en tejido cerebral (Ruizycol.,2005),yclulasgranulares(Venditeycol.,1998)despusdeuntratamientocrnicoconagonista. Adems,laliberacindeadenosinaqueocurredurantelagestacindisminuyelosnivelesdeA1encerebrode rata(Lenycol.,2004),inclusoenratastratadasconcafenayteofilinademaneracrnicadurantelagestacin (Lenycol.,2002).Estadisminucinsehadescritotambinenotrostejidos,comocardiomiocitossometidosa hipoxia hipobrica durante largos periodos (Kacimi y col., 1995). Recientemente Coelho y colaboradores (Coelho y col., 2006) han demostrado que 90 minutos de hipoxia son suficientes para observar la desensibilizacineinternalizacindelosreceptoresA1enhipocampoderata,sinvariacinsignificativaenla afinidaddelosmismos. Lasclulasneuronalesrespondenalahipoxialiberandoadenosinatantoinvivo(VanWylenycol.,1986; Phillisycol.,1987)comoinvitro(Fredholmycol.,1994;Frenguelliycol.,2003).Porestemotivoseconsidera que la adenosina acta como un importante agente neuroprotector endgeno (de Mendona y col., 2000; Fredholmycol.,2005).Recientementesehareconocidoalaadenosinacomounnuevogliotransmisor,elcual se libera directamente por los astrocitos en situaciones patolgicas (Martn y col., 2007). En general, la adenosinaylosagonistasdelreceptorA1suelenserneuroprotectorescontraagentestxicos(Fredholmycol., 2005a), sin embargo,esteefectoparecesaturarse a elevados niveles extracelulares de adenosina durante la privacindeglucosayoxgeno(Lobner,2002).LaprdidadereceptoresA1descritaaqusemimetizmediante laexposicindeestasclulasaadenosinaencondicionesnormxicasdurantelosmismosperiodosdetiempo, lo que sugiere que este agonista es responsable, al menos, en parte, de la disminucin de los niveles del receptorA1.ElmismorazonamientosepuedeemplearparalamodulacindelosreceptoresA2A.Adems,se comprob que en presencia de adenosina desaminasa durante la hipoxia moderada no se observaban variacionessignificativasdelosreceptoresA1yA2A. Los valores de afinidad obtenidos en clulas normxicas fueron ligeramente ms elevados que los descritos por otros autores. Esta variacin podra ser debida a diferencias entre los sistemas estudiados. Ligandos que funcionan bien en determinados sistemas pueden ser menos potentes, o incluso inactivos, cuandoseempleanensistemasdistintosparalosquefuerondesarrollados.Unposiblemotivoqueexplicara este hecho son mutaciones puntuales en los sitios de reconocimiento del receptor que impidan el correcto reconocimientodelligando(DaSettimoycol.,2004).Deacuerdoconesto,seobservarondiferenciasdehasta tres rdenes de magnitud entre la afinidad obtenida para DPCPX y la obtenida para CHA en clulas CHO transfectadasconelreceptorA1humano(BakeryHill,2007a).Enestemismoestudio,semostrabaunvalorde KD para CPA en el rango de micromolar, lo que ilustra el amplio rango de valores de afinidad que se puede

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encontrar cuando se estudian estos receptores. Adems, los receptores de adenosina exhiben diferentes valores de EC50 en diferentes sistemas dependiendo del efecto medido. Por ejemplo, el efecto de NECA en clulas CHO transfectadas es mucho ms potente a la hora de estimular la fosforilacin de ERK1/2 (EC50=19 nM)quealahoradeformarAMPc(EC50=1,4M)atravsdelosreceptoresA2B(SchulteyFredholm,2000). Nuestros resultados muestran un incremento en la afinidad del receptor A1, lo cual podra implicar modificacionesenlosnivelesdeprotenasGy/oenlaasociacindestasconlosreceptoresdurantelahipoxia moderada. Aunque la afinidad de un receptor se ha considerado histricamente constante, dado que la composicinqumicadelreceptornovara,hayevidenciasdequelosreceptorespodrantenermltiplessitios de unin e incluso de que un mismo receptor podra mostrar diferentes afinidades dependiendo de las condicionesexperimentales(BakeryHill,2007b;NelsonyChalliss,2007).Estasdiferenciasentrelasmedidas delasafinidadesdelosantagonistashansidodescritasentodoslosreceptoresadrenrgicoshumanos(Baker yHill,2007a,b).AunqueparecenoseresteelcasodelosreceptoresA1transfectadosenclulasCHO(Bakery Hill,2007a),cambiosenlaafinidadpodranocurrirenlosreceptoresdeadenosinaexpresadosendgenamente enlasclulasC6(NelsonyChalliss,2007). Lahipoxiacausacambiosenlaactividaddediferentesquinasasyfosfatasasquedeterminanlaafinidad de los receptores de adenosina (Kitakaze y col., 1996). La hipoxia causa adems cambios en los lpidos de membrana,comolocidosgrasosinsaturadosencisquepodrandeterminarlascaractersticasdeunindelos receptoresA1yA2A(Cunhaycol.,2001b).Estoscambiosenelreceptor,laprotenaG,elacoplamientoalaACy los lpidos de los alrededores (Becher y McIlhinney, 2005) podran ser responsables de la ausencia de variaciones en la capacidad del CHA de inhibir la actividad AC estimulada por forskolina a pesar de la disminucindelosreceptoresA1.Adems,sobreestafaltadeefectotambinpodrainfluirelincrementoenla afinidad de estos receptores durante la hipoxia. La actividad AC parece ser la va principal de transduccin mediadaporlosreceptoresA1enestasclulas,yaqueniCPAniCHAfueroncapacesdeestimularlaactividad PLC.TeniendoencuentalosvaloresdeKDobtenidosenC6seempleunaconcentracindeCHAelevadaque asegurara el efecto mximo posible a la hora de testar la funcionalidad del receptor A1. Concentraciones similaresdeligandoseemplearonporCordeuxycolaboradores(Cordeuxycol.,2004),loscualesusaronCPA 100 M para inhibir la actividad AC en clulas CHO transfectadas con el receptor A1. Adems, diferentes investigadores han empleado un amplio rango de concentraciones de los ligandos de los receptores de adenosina en diferentes sistemas (de Mendona y col., 2000), lo que sugiere que cada ensayo ha de ser optimizado en cada sistema celular (Nelson y Challiss, 2007). Con respecto a los antagonistas, aunque las concentracionesusadaspuedanparecerelevadas,sonsimilaresalasempleadasencultivosgliales,enlosque ZM241385seempleenelrangodemicromolarparabloquearlaestimulacindeCGS21680(Kstycol.,1999; Sauraycol.,2005). Hay algunos trabajos que demuestran que la expresin gnica de receptores de superficie, como los receptoresyadrenrgicos,esreguladaporefectodelahipoxia(Liycol.,1995,1996).Unadelasprimeras evidenciasdelaumentodelosnivelesdelreceptorA2A,aniveldeprotenaydeARNm,durantelahipoxiala proporcionaron Kobayashi y Millhorn (Kobayashi y Millhorn, 1999) en clulas PC12. En estas clulas la

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activacindelosreceptoresA2Adisminuyelaexcitabilidaddelamembrana,alaumentarlasalidadeK+einhibir laentradadeCa2+(Kobayashiycol.,1998).LosnivelesdehipoxiaempleadosporKobayashisonindicativosde quelaregulacindelreceptorA2Apodraestarimplicadanosloenprocesosdehipoxiaseveraoisquemiasino tambinenprocesosfisiolgicoscomolaadaptacinalaaltitud.Porotrolado,elanlisisdelasecuenciadel promotordelreceptorA2Bdemostrqueexistaunareginfuncionalderespuestaahipoxiaqueincluaunsitio deuninparaelfactorHIF(Kongycol.,2006).Sinembargo,losdatosquesehanmostradoaquindicanquela hipoxiamoderadanoafectaalaexpresingnicadelosreceptoresdeadenosinaqueseexpresandemanera endgenaenlasclulasC6(Castilloycol.,2007).Portanto,laregulacinobservadaparalosreceptoresA1yA2A debeestarrelacionadaconfenmenosdetrficointracelular(Ruizycol.,1996;Escricheycol.,2003;Bechery McIlhinney,2005). El factor de transcripcin CREB desempea un papel importante en la transcripcin basal del gen A2A (Chiangycol.,2005).LaexpresingnicadelosfactoresdetranscripcinCREByCREMestsignificativamente disminuida durante la hipoxia en clulas C6, y podra estar implicada en la modulacin de los receptores observadaoladeotrosgenesdianaenestasclulas. La expresin gnica durante la hipoxia est controlada por la familia de factores de transcripcin conocidacomo factores inducibles porhipoxia (HIF) (Semenza,2001). HIF1 est altamente regulado por la presinparcialdeoxgeno(Wangycol.,1995),sinembargo,HIF3serelacionaconladisminucindelaseal desatadaporlahipoxiaalconsiderarseuninhibidordeHIF1(Makinoycol,2002).Laausenciadeefectodela hipoxia en HIF1 en C6 podra justificar en parte la falta de alteracin de la viabilidad celular observada durantelahipoxia.AunqueHIF1parecenoestaralterado,ladisminucinaparentedelaexpresindeHIF3 podrasuponerunamenorinhibicindelaactividaddeHIF1durantelahipoxiamoderadaenclulasC6. LosgliomassonlostumoresmscomunesenelSNC.Contienenmltiplesregionessensiblesalahipoxia que exhiben una elevada actividad del factor HIF, que tiene como resultado el aumento en la expresin de muchasdianasdeHIFycontribuyealcrecimientoyalaelevadavascularizacindeestostumores(Kaurycol., 2005).Enlamayoradeloscnceres,laexpresindeHIF1pareceestarasociadaconelprogresodeltumory su desarrollo. Adems, parece que HIF1 media la resistencia a radioterapia (Aebersold y col., 2001) y quimioterapia (Unruh y col., 2003) de las clulas concergenas en hipoxia. En modelos experimentales la eliminacindeHIF1impideelcrecimientodeltumorylosfenmenosangiognicos(RyanyJohnson,1998)y suinhibicinmejoralarespuestaalaquimioterapiayalaradioterapia(Quinteroycol.,2004).Porotrolado,los receptores de adenosina aumentan los niveles de factores angiognicos no slo en condiciones normxicas, sino tambin bajo los efectos de la hipoxia. Se ha descrito que la adenosina coopera con la hipoxia para estimular la secrecin de VEGF (vascular endothelial growth factor) e induce la secrecin de factores angiognicosadicionalescomo,porejemplo,lainterleuquina8(IL8),quenoseestimulannicamenteporla hipoxia.Estosfactores,secretadosenrespuestaaambosestmulospodranpromoverlaneovascularizaciny, en ltima estancia, la adecuada oxigenacin del tejido (Ryzhov y col., 2007). Cuando las clulas C6 se implantaronencerebrosderata,laexpresindelreceptorA1enlostumoresgeneradoseradependientedel volumen del tumor e independiente del tiempo de desarrollo del mismo (Dehnhardt y col., 2007). El hecho

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experimentaldequeenesteestudiolaexpresindeHIF1noaumentaraenclulasC6sometidasahipoxia, mientrasquelosreceptoresdeadenosinaeranreguladosdeformaespecficaporefectodelaadenosinaabre la puerta al empleo de ligandos con efecto sobre los receptores de adenosina como agentes teraputicos durantelahipoxiay,talvez,paraenfermedadestumorales. V.4.Muertecelularinducidaporelpptidoamiloide. V.4.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza. LosresultadosexpuestosenlapresenteMemoriademuestranlosefectosnocivosdelaexposicinde neuronas corticales al fragmento 2535 del pptido amiloide (A2535). Este fragmento ha sido ampliamente utilizadoennumerosostrabajosdeinvestigacin,enlosque,aligualqueenestaMemoria,secomprobaron quelosefectosejercidosporestepptidoeransimilaresalosobservadostraselempleodeA142(Pikeycol., 1993; Iversen y col., 1995). Entre los efectos observados destacan una marcada disminucin de la viabilidad celular, que depende tanto del tiempo de exposicin como de la cantidad de A2535 que se emple en los ensayos, y una activacin de la caspasa 3, tanto a nivel de la expresin gnica como a nivel de su actividad enzimtica. Estos resultados sugieren que la muerte celular observada se produce a travs de mecanismos apoptticos,loscualesconvergenenlaactivacindelacaspasa3,unacaspasaefectoraque,unavezactivada, procesarotrossustratosquemediarnenlamuertecelularporapoptosis,yqueserelacionacon,almenos, parte de la muerte neuronal observada durante el progreso de la enfermedad de Alzheimer (revisado por Wellington y Hayden, 2000). La toxicidad del fragmento 2535 ya haba sido demostrada previamente en neuronas corticales in vitro por el mtodo del MTT (Ueda y col., 1997), as como tambin se conoca que la activacindelacaspasa3eraresponsabledepartedelamuertecelularobservadainvitrocomoconsecuencia de la exposicin de neuronas corticales a A2535 (Harada y Sugimoto, 1999). Sin embargo, se ha observado tambin que el efecto txico del pptido amiloide depende de la concentracin a la que se emplee. Se ha establecidoqueaelevadasconcentraciones,comolasempleadasenlapresenteMemoria,elpptidoamiloide ejerce un efecto txico, mientras que a concentraciones ms bajas, que podran considerarse fisiolgicas, algunosautoreshanobservadoefectostrficos,antioxidantes,antiapotticosoneuroprotectores(Schaeffery col.,2008;revisadoporAtwoodycol.,2003). Enlaactualidadseestconsiderandoelpapelquepuedendesarrollarlosreceptoresmetabotrpicosde glutamato en la patognesis de ciertas enfermedades neurodegenerativas. En el caso de la enfermedad de Alzheimer los receptores metabotrpicos de glutamato podran contribuir a la patognesis de algunas deficienciasneurolgicasy,adems,serancapacesderegularlavulnerabilidadneuronalfrenteaestrstxico. LosresultadosaqumostradosdemuestranquelaexposicinaA2535produceunincrementodelnmerode receptoresmetabotrpicosdeglutamatoenlasuperficiecelularacompaadodeunincrementoenlaafinidad delosmismosporsuligando.Ademssehacomprobadoporinmunocitoqumicaquesonresponsablesdeeste aumento, al menos, los receptores mGlu1 y mGlu5, los cuales aumentan su expresin tras la exposicin a

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A2535, mientras que los subtipos mGlu2,3 disminuyen, observndose, por tanto, procesos de regulacin diferencial de los distintos subtipos de los receptores metabotrpicos de glutamato. Por otro lado, se ha comprobadolafuncionalidaddelsistemamedianteensayosdeactividadenzimtica,ysehaobservadoquela capacidaddelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIdeestimularlaactividadPLCresultadisminuidatrasla exposicinaA2535,mientrasqueladelosdelgrupoIIIyIIparainhibirlaactividadACresultaaumentadae inalterada,respectivamente. ElefectodeagonistasyantagonistasdelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatodelgrupoIsobre laneurotoxicidadejercidaporelpptidoamiloideharesultado,hastalafecha,controvertido.Elprimertrabajo disponibleenlabibliografaacercadelempleodeligandosparalosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatoen presencia del pptido A2535 afirmaba que la activacin de los receptores metabotrpicos de glutamato, empleandoligandospocoespecficos,protegaalasneuronascorticalesdeldaoproducidoporlaexposicin alpptidoamiloide,aunquealrealizarlosmismosexperimentosenneuronasgranularessloseobservefecto neuroprotectorporactivacindelosreceptoresdelgrupoIII(Copaniycol.,1995).Sinembargo,estemismo grupopublicaosdespusqueenneuronascorticaleselbloqueodelsubtipo5resultabaneuroprotectoren lasmismascondiciones(Brunoycol.,2000b).Lacontroversiaacercadelefectodeestosligandosseextiendea otrostrabajos,porejemploAllenycolaboradorespropusieronqueelempleodeantagonistasdelosreceptores metabotrpicosdelgrupoIexacerbabaeldaoproducidoporlaexposicinalpptidoamiloideenneuronas granulares(Allenycol.,1999),mientrasquePizziycolaboradoresdemostraronqueenneuronascorticalesyen clulas de neuroblastoma SKNSH la activacin del subtipo 5, en contra de lo que proponan Bruno y colaboradores, resultaba neuroprotectora frente al dao producido por el pptido amiloide mediante la activacindelfactorNFB(Pizziycol.,2005).Estosautoressostienenque,apesardequelaactivacindelos receptores del grupo I es excitadora, existen indicios que apoyan la idea de que la activacin tnica mismos induceladesensibilizacindesuactividadfacilitadoradelaactividadneuronaltransformndolaenunaaccin inhibidora de la actividad y, por tanto, neuroprotectora (Herrero y col., 1998; Bruno y col., 2001). Debido a estos precedentes bibliogrficos no es fcil predecir, sin la realizacin de experimentos adicionales, si los procesos de regulacin observados en los receptores metabotrpicos de glutamato son resultado de una respuesta a favor de la supervivencia celular o bien es el resultado de una situacin txica. En principio, los resultadosobservadosenhumanosporestemismogrupodeinvestigacinapoyanlaprimerahiptesis,yaque, encortezadepacientesdeAlzheimerseobservunadisminucinglobaldelosreceptoresmetabotrpicosde glutamato,quedandodemostradoqueelsubtipo1era,enparte,responsabledeesadisminucinobservada (Albasanz y col., 2005). No obstante, existen otros indicios no relacionados con el empleo de agonistas y antagonistas en modelos de neuroproteccin sino, ms bien, con la fisiopatologa de la enfermedad de Alzheimer,estostrabajosseexpondrnacontinuacinyaclararnelpapelneuroprotectordelosreceptores metabotrpicosdelgrupoIenestemodelo. Los receptores metabotrpicos de glutamato se han relacionado con los dos principales rasgos anatomopatolgicos caractersticos de la enfermedad de Alzheimer: los ovillos neurofibrilares, formados por agregadosdeprotenatauhiperfosforilada,ylasplacasneurticas,acmulosdelpptidoA142.Enprimerlugar

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se ha demostrado que en neuronas NT2N la activacin de los receptores metabotrpicos del grupo I bloqueaba el aumento de los niveles de protena tau observado en estas clulas tras un pulso con NMDA (Paterliniycol.,1998),resultandosuactivacin,portanto,neuroprotectora.Porotrolado,laactivacindelos receptoresmetabotrpicosdeglutamatotambinhasidorelacionadaconelprocesamientodelaprotenaAPP a formas no amiloidognicas. As, se demostr que en neuronas hipocampales y astrocitos corticales empleando ACPD, agonista de los grupos I y II, se favoreca el procesamiento de APP en formas no amiloidognicas (sAPP) (Lee y col., 1996). Lo mismo se demostr en neuronas NT2N empleando agonistas especficosdelgrupoI(JollyTornettaycol.,1998)yencortesdehipocampoycortezadecerebroderataal activarlosgruposIyII(UlusyWurtman,1997).Estasreferenciasbibliogrficasapoyanlahiptesisdequeel aumento observado en los receptores metabotrpicos del grupo I como consecuencia de la exposicin al pptido amiloide pudieran ser resultado de una respuesta celular cuyo objeto fuera disminuir la toxicidad producida por dicho pptido. En este sentido, se ha descrito por el grupo de investigacin en el que se desarrollestaMemoriaqueencerebrosdepacientesdeAlzheimerocurreunaprdidagradualdereceptores mGlu(Albasanzycol.,2005). Se ha descrito en la Demencia con cuerpos de Lewy que existe una disminucin de los niveles de protenaPLC1comoconsecuenciadesuasociacinconlasinuclena(Dalfycol.,2004),sinembargo,estas variacionesnoseobservaronalanalizarlosnivelesdePLC1encerebrosdepacientesdeAlzheimer(Albasanzy col.,2005).Noobstante,losefectosdescritosenlapresenteMemoria,demuestranquelacantidaddePLC1 disponible en neuronas corticales es menor tras la exposicin de las mismas al pptido amiloide, lo que producira,asuvez,unadisminucindelafuncionalidaddelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatodel grupo I en este sistema, a pesar de su aumento en nmero. Este resultado es distinto al observado anteriormente por este grupo (Albasanz y col., 2005), sin embargo, en ambos casos, el resultado sera una disminucindelafuncionalidaddelsistemamGluI/PLC1yserarazonablesuponerqueladisminucindela protena PLC1 descrita en esta Memoria podra ser resultado de un mecanismo de proteccin celular destinado a disminuir los niveles de Ca2+ intracelular, aumentados como consecuencia de la exposicin al pptido amiloide (revisado por Mattson y Chan, 2003). Por otro lado, aumentos en los niveles de Ca2+ intracelularsehanrelacionadoconunaumentodelageneracindepptidoamiloide(Querfurthycol.,1997) ascomodelahiperfosforilacindelaprotenatau(Mattsonycol.,1991).Unfenmenoquecorroboraesta hiptesisesquesehademostradoenclulasdeneuroblastomaSHSY5Yquelasmutacionesfamiliaresenla presenilina 1 favorecen el aumento de calcio intracelular al aumentar la activacin basal de PLC, lo que, en definitiva,sensibilizaalaclulafrenteaestmulosapoptticos(CedazoMinguezycol.,2002). El papel de los receptores metabotrpicos del grupo II en la enfermedad de Alzheimer es todava controvertido.Sehapropuestoqueduranteeldesarrollodeestaenfermedadseproducendisfuncionesenel transporteylaliberacindeglutamatoquedesembocanenunaumentodelaconcentracinextracelulardel mismo. Por un lado, se han detectado disfunciones en los transportadores de glutamato (Scott y col., 2002; Jacob y col., 2007; Duerson y col., 2008), as como una disminucin en la captura del mismo por parte de astrocitosexpuestosalpptidoamiloide(Matosycol.,2008).Porotrolado,sehademostradolacapacidaddel

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pptido amiloide para estimular la liberacin de glutamato (Kabogo y col., 2008). Por tanto, es razonable suponerquelaactivacindelosreceptoresdelgrupoIIydelgrupoIII,queinhibendemanerapresinpticala liberacin de glutamato, resulte neuroprotectora, como ya se haba propuesto previamente en la literatura (Brunoycol.,1995b).Sinembargo,sehaobservadodemaneraespecficaenneuronashipocampalesquese produce un aumento de los receptores mGlu2 durante la enfermedad de Alzheimer que podra suponer un mecanismodeproteccinparainhibirlaliberacindeglutamatoyqueestdirectamenterelacionadoconla hiperfosforilacindetauporlaquinasaERK(Leeycol.,2004a).Sinembargo,estosmismosautoresproponen quesereviseelhechodequelafosforilacindetauparaformarfilamentosseanocivo(Cashycol.,2003),ya quehanobservadoquelaactivacindeERKatravsdemGlu2esneuroprotectorafrentealestrsoxidativo (Leeycol.,2009).Portanto,resultadifcilpredecirelpapelquepuededesempearestaregulacinalabajade los receptores metabotrpicos del grupo II en la superficie neuronal y para hacerlo con precisin se necesitaran experimentos adicionales que arrojen luz sobre el papel de estos receptores en neuronas corticales expuestas a A2535, si bien es cierto que su funcionalidad no resulta alterada en este modelo experimental. EnloqueserefierealosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIIIlamayorinhibicindelaACdetectada poragonistasselectivossugiereunaumentodeestosreceptorescomoconsecuenciadelaexposicinaA2535, loqueconcuerdaconlareduccindelaliberacindeglutamatoexpuestaenelprrafoanterior.Adems,yase demostr que los agonistas de los receptores metabotrpicos de los grupos II y III ejercan un efecto neuroprotectorfrentealdaocelularinvitrooriginadoporlaexposicinaA2535debidoasucapacidadpara disminuirlaconductanciadelamembranaaCa2+(Copaniycol.,1995).Msrecientementehasidodemostrada laaccinneuroprotectoradeagonistasdelsubtipomGlu4frentealdaoproducidoporAencultivosmixtos deneuronasdecortezaderatn(Majycol.,2003).Porltimo,sehasugeridoqueelpptidoamiloidepodra sercapazdeactivarlaPKA,lacualllegaraaactivarlarutadelascaspasas(MartnezVelzquezycol.,2007).Un corolario de esta hiptesis es que los agonistas de los grupos II y III, que disminuyen la cantidad de AMPc, deberanejercerefectosbeneficiosossobrelaviabilidadcelular.Estohasidodemostradorecientementeenel casodelosagonistasdelgrupoIII,cuyousoenneuronascorticaleslasprotegafrentealdaocelularproducido por la exposicin al pptido amiloide mediante el bloqueo de las vas de las caspasas (Zhao y col., 2008). Debidoatodosestosantecedentesesposiblesuponerqueunaumentoenlosreceptoresmetabotrpicosde glutamato del grupo III en neuronas corticales expuestas a A2535 tendra como objetivo fomentar la supervivenciacelularfrenteaunagentetxico. En cuanto a los receptores de adenosina, se ha expuesto en la presente Memoria que en neuronas corticalesexpuestasaA2535seobservaunaumentodelosreceptoresA1yA2Aconrespectoalasneuronas controles, este aumento se observ a nivel de protena en la membrana plasmtica y a nivel de ARNm. En ensayos funcionales se observ una sensibilizacin de la va de sealizacin principal del receptor A1 tras 24 horas de exposicin, sin variacin de la funcionalidad del receptor A2A. La diferencia observada entre ambos receptores en estas condiciones radica en que, si bien se produce un aumento de ambos, el primero en producirseeseldelreceptorA1,tras24horasdeexposicin,mientrasquesenecesitaron24horasadicionales

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deexposicinparadetectarelaumentoenlosnivelesdereceptorA2A.Dadoquetras24horasdeexposicin los niveles de ARNm de los correspondientes genes ya estaban aumentados, mecanismos de regulacin posttranscripcionalespuedenserlosresponsablesdelosfenmenosobservados.Noobstante,losaumentos observados en el receptor A2A tras las 48 horas de exposicin pueden ser debidos al incremento en su expresingnica,dadoquestaaumentademanerasignificativaconrespectoalosvaloresobservadosalas 24horas.Laregulacindelosreceptoresdeadenosinaconeltiempodeexposicinalpptidoamiloidepuede estarrelacionadaconlafuncindeestosreceptoresencondicionespatolgicas,comoseintentardiscutira continuacin. ElpapelneuroprotectordelosagonistasdelosreceptoresA1yahasidoexpuestoconanterioridadenla presenteMemoria,basado,porlogeneral,enlacapacidaddelreceptorA1debloquearlaentradadecalcio, inhibiendo as la liberacin de glutamatoyevitando la sobreexcitacinpostsinptica. Previamente se haba observadoqueseproduceunaumentodelosreceptoresA1encerebrosdepacientesdeAlzheimer(Anguloy col., 2003; Albasanz y col., 2008), aunque estos resultados contradecan trabajos previos realizados con tcnicas menos sensibles (Ulas y col., 1993; Deckert y col., 1998). Por otro lado, en ratones transgnicos portadores de la mutacin sueca de la protena APP se observaron niveles elevados de los receptores A1 en corteza acompaados por un descenso en los niveles de adenosina (Arendash y col., 2006). En este caso particular,losbajosnivelesdeadenosinapodranexplicarlosniveleselevadosdelreceptorA1comopartede un modelo de regulacin clsica de los GPCR. Adems, Angulo y colaboradores demostraron que, en clulas SHSY5Ydeneuroblastoma,elempleodeagonistasdelreceptorA1desencadenabanprocesosencaminadosa aminorar los efectos producidos por los dos rasgos anatomopatolgicos caractersticos de la enfermedad de Alzheimer(Anguloycol.,2003).Porunlado,laactivacindelosreceptoresA1fomentabalatransformacinno amiloidognica del pptido APP, por otro, facilitaba la translocacin de la protena tau fosforilada al citoesqueleto,dondeesmenosprobablequeformeestructurasneurodegenerativas(Mandelkowycol.,1996). Estos precedentes convergen en el hecho de que la presencia de un nmero elevado de receptores A1 en neuronas en proceso de degeneracin como consecuencia de la exposicin al pptido amiloide debe ser neuroprotectoradebidoalosefectosanteriormentediscutidos. ElcasodelosreceptoresA2Aesmscomplejo.Porunladoexistecontroversiaacercadelalocalizacin deestosreceptoresenotrasregionesapartedelestriadoy,sinembargo,estereceptorhasidodetectadocon xito en hipocampo y corteza de rata (Cunha y col., 1996), clulas gliales de rata (Castillo y col., 2007) y, mediante distintas tcnicas, en varias regiones cerebrales del cerebro humano incluida la corteza (Svenningssonycol.,1997;Ishiwataycol.,2005;Albasanzycol.,2008).Porotrolado,noexistenindiciosde que en este modelo de neurodegeneracin la activacin de los receptores A2A pudiera resultar neuroprotectora,msbienalcontrario,dadoquesuactivacinproducelaliberacindeglutamatofacilitando la excitabilidad neuronal, lo ms probable es que sea el bloqueo de estos receptores lo que resulte neuroprotector.Enestesentidoexistenvariostrabajosqueapoyanestahiptesis.Porunlado,elempleode antagonistasespecficosdelreceptorA2Aprotegedelaneurotoxicidadinducidaporlaexposicinalfragmento 2535delpptidoamiloideenneuronasgranulares(Dall'Ignaycol.,2003).Porotrolado,sehadescritoquela

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cafenayantagonistasdelreceptorA2Abloqueabanlosdficitscognitivosobservadosenratasalasqueseles administraba A2535 de forma intracerebroventricular (Dall'Igna y col., 2007). Experimentos adicionales demostraranqueelbloqueodeestosreceptoresnoafectaalasalteracionesgeneralesdelamemoria(como lasobservadasporejemplomedianteelempleodebloqueantesdelsistemacolinrgicocomolaescopolamina) sino que su accin se restringe a condiciones neurodegenerativas en las que se produce deterioro de la memoria(Cunhaycol.,2008).Encuantoalosnivelesdereceptor,sehadescritoqueenlacortezacerebralde enfermosdeAlzheimerseproduceunaumentodelosnivelesdeA2Aacompaadodeunasensibilizacindesu principalvadesealizacin(Albasanzycol.,2008).Tambinsehaobservadounaumentodeladensidaddel receptor A2A en hipocampo de ratones transgnicos de la protena APP (Arendash y col., 2006) as en hipocampodepacientesdeAlzheimer(Anguloycol.,2003).Siunimoslosaumentosobservadosenlosniveles del receptor A2A con las propiedades neuroprotectoras de los antagonistas de estos receptores se puede concluir que el aumento del receptor A2A observado en neuronas corticales como consecuencia de una exposicin prolongada al pptido amiloide es un rasgo patolgico originado por unas condiciones de neurotoxicidad elevadas aunque, como se ha expuesto, la respuesta celular desencadenada a tiempos ms cortosseaelaumentodelreceptorA1,cuyocarcterneuroprotectoryahasidodiscutidoconanterioridad. YasehacomentadoenlapresenteMemorialarelacinentrelosfactoresdetranscripcinCREByCREM y la supervivencia celular. En los resultados presentados se observa una disminucin en la transcripcin de estosfactorestraslaexposicinalpptidoamiloide.Segnestudiosprevios,existeunafosforilacinreducida de CREB en cerebros de pacientes de Alzheimer (YamamotoSasaki y col., 1999) as como en ratones transgnicosqueexpresabanAPPhumano(Dineleyycol.,2001),lacualeraproducidapordeficienciasenla activacindelaquinasaERKcomoconsecuenciadelaoligomerizacindelpptidoamiloide(Maycol.,2007). De hecho, se ha planteado que la recuperacin de la fosforilacin de CREB pueda ser una seal de que la aplicacindeundeterminadocompuestoseaneuroprotectorfrentealaaccintxicadelpptidoamiloide(Xu ycol.,2007b).Debidoaestasevidencias,sehapropuestoquecompuestoscapacesdeaumentarlosnivelesde AMPc podran tener resultados cognitivos positivos en la enfermedad de Alzheimer as como en otras enfermedadesneurolgicas(revisadoporDeFeliceycol.,2007).Estosantecedentesbibliogrficoscorroboran de forma indirecta los resultados aqu presentados ya que, aunque no existen datos previos acerca de los nivelesdeARNmdeestosfactores,esrazonablesuponerqueunnivelinferiordeexpresindeestosfactores supondrunaactivacinmenordelosmismosalestardisponiblemenoscantidaddeprotena. V.4.2EnclulasC6degliomaderata. EnestaseccinsediscutiracercadelosresultadosobtenidosalexponerlasclulasC6degliomade rataalfragmento2535delpptidoamiloide.ComosehamostradoenResultados,lasclulasC6expuestasa A2535 sufren procesos de muerte celular apopttica dependientes de la concentracin y del tiempo de exposicin. No obstante, se observa que, por encima de las 6 horas de exposicin, el dao producido por A2535 no aumenta sino que se mantiene. Se ha demostrado que los astrocitos son capaces de unir e internalizarelpptidoA142,siendoestacapacidadmayorenastrocitosjvenesqueenadultos(Nielsenycol.,

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2008), lo que podra explicar esta parcial invulnerabilidad de algunas clulas gliales frente a la exposicin al pptido amiloide (Takadera y col., 1993). Las clulas gliales mantienen la plasticidad neuronal y fomentan la recuperacinfuncionaldelcerebrofrenteaenfermedadesoagentestxicos,porestosmotivosesimportante el estudio de las clulas gliales expuestas al pptido amiloide, ya que disfunciones de estas clulas pueden promover procesos de neurodegeneracin que daran lugar a los dficits cognitivos observados en la enfermedaddeAlzheimer. Ha quedado demostrado que se produceuna regulacin diferencial de los receptores metabotrpicos deglutamatoenlasclulasC6degliomaderataexpuestasalpptidoamiloide.Enconcreto,sehaobservado, mediante ensayos de unin de radioligandos, un aumento global de los receptores metabotrpicos, el cual podraatribuirsealaumentoenladensidaddelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIII,yaque,mediante inmunofluorescencia,sehaobservadounadisminucindelsubtipomGlu1sinvariacindelosreceptoresmGlu5 y mGlu2,3. Ha sido comentado con anterioridad la controversia existente acerca del empleo de agonistas o antagonistas de los receptores metabotrpicos del grupo I en modelos de neuroproteccin frente a la exposicindelpptidoamiloideinvitro.Sisuponemosquelosefectosobservadosaniveldelaexpresindelos receptores metabotrpicos de glutamato son consecuencia de una respuesta celular destinada a atenuar la toxicidadproducidaporlaexposicinalpptidoamiloide,esposiblesuponerqueladisminucinenlosniveles demGlu1ascomounposibleaumentoenlosnivelesdelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIIIresulten neuroprotectoresfrenteaA2535. Sisecumpleestahiptesiselempleodeantagonistasdelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamato delsubtipo1deberaresultarneuroprotector.Secomentenelapartadoanteriorelcarcterneuroprotector queencontrabanalgunosautoresenelempleodeantagonistasdelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoI en varios modelos de toxicidad neuronal por exposicin al pptido amiloide. A la luz de estos trabajos sera posibletambinespecularqueladisminucinobservadaenlosreceptoresmGlu1podraconsiderarsecomoun movimiento defensivo ante una posible sobreestimulacin del sistema de liberacin de calcio del retculo endoplsmico mediado por estos receptores. Para corroborar esa hiptesis deberan comprobarse los mecanismosporloscualesdisminuyelaexpresindelosreceptoresmGlu1enlamembranaplasmticapero resultainalteradaladelosmGlu5.Sinembargo,sehadescritotambinquelaestimulacindelosreceptores metabotrpicos del grupo I, o la estimulacin de cualquier receptor metabotrpico (Lee y Wurtman, 1997), fomentaelprocesamientonoamiloidognicodelaprotenaAPP,dandolugarasuformasoluble,APPs(Leey col.,1995),lacual,asuvez,aumentaeltransportedeglutamatoalinteriordelastrocito(Masliahycol.,1998). PorotroladonoesposibledescartarquelosefectosobservadossobreelreceptormGlu1seandebidosa un proceso de regulacin a la bajade unGPCR comoconsecuenciade una exposicin excesiva a su ligando. Elevadosnivelesdeglutamatopodranalcanzarsedevariasmaneras.Porunlado,porlasdisfuncionesenlos transportadoresdeglutamatoqueaparecencomoconsecuenciadelaexposicinalpptidoamiloide.Eneste sentido, se ha comentado con anterioridad las disfunciones observadas en el transportador EAAC1, transportadordeglutamatopresenteenlasclulasC6,enpacientesdeAlzheimer(Duersonycol.,2008).Por otrolado,sehademostradoqueestetransportadorseinhibeporlapresenciadelpptidoamiloide(Guycol.,

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2004) y que neuronas deficientes en presenilina 1 presentan una capacidad disminuida de recapturar glutamato,acompaadaporunadisminucindelapresenciaenmembranaplasmticadeestetransportador (Yang y col., 2004). Estos antecedentes permiten sugerir que en estas condiciones en las clulas C6 podran encontrarseelevadosnivelesdeglutamato,loscualespodranserlosresponsablesdelaregulacinalabajadel receptormGlu1porunmecanismoclsicodeinternalizacinenvesculasdeclatrina,comopreviamenteyase hasugeridoporestegrupodeinvestigacin(Albasanzycol.,2002a).Noobstante,aligualqueenlahiptesis anterior,quedaraabiertalapreguntadequmecanismosdisminuyenlapresenciaenmembranadelreceptor mGlu1peronodelmGlu5nidelmGlu2,3.Estahiptesissesostieneademssobrelosresultadosobservadosen clulasC6expuestasaLGlu,dondeseobservabaunadisminucindeladensidaddelosreceptoresmGlu1en membranaperonodelmGlu5. Al igual que en el apartado anterior, en clulas C6 el aumento detectado en los niveles de todos los receptores metabotrpicos podra ser atribuible a un aumento en los receptores del grupo III en membrana plasmtica.Sisuponemosqueeseaumentoesconsecuenciadeunarespuestacelulardestinadaaaminorarla toxicidadsufridacomoconsecuenciadelaexposicinalpptidoamiloideesrazonablesuponerqueelempleo deagonistasdeestosreceptorespuederesultarbeneficiosoparalasupervivenciacelularenestascondiciones. Ya fueron comentados en el apartado anterior algunos trabajos que exponan los efectos neuroprotectores observados en distintos sistemas al emplear agonistas de estos receptores. Adems de esos trabajos, se ha descritoquelaactivacindelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIIIreducalaliberacindeneurotoxinas porpartedelamicroglaactivadacomoconsecuenciadelaexposicinaA2535uotrosagentes(Taylorycol., 2003),loque,endefinitiva,disminualatoxicidadgeneradaporlaglaactivada(Wuycol.,2000).Noobstante, tambinesposibleencontrartrabajoscontradictoriosenestecampo.As,algunosautoresproponenquelos efectosneuroprotectoresdelaactivacindelosreceptoresmetabotrpicosdelgrupoIIInorequierendeun componenteglial,basndoseenlaincapacidaddeLAP4dedisminuirlatoxicidadporNMDAencultivosmixtos alseraplicadoelagonista10minutosantesqueelagentetxico,aunque,comolospropiosautoresreconocen, ello dependa de las condiciones de aplicacin (Bruno y col., 1997). Adems, estos mismos autores han publicadoqueencultivosmixtoslaactivacindemGlu4,incluidoenelgrupoIII,reducalatoxicidadobservada porA2535yNMDA,aligualquelohacaelbloqueodelreceptormGlu1(Majycol.,2003).Portantopareceque existenlossuficientesantecedentesbibliogrficosparasuponerquesielempleodeagonistasdelosreceptores metabotrpicos del grupo III resulta neuroprotector en varios modelos de neurotoxicidad, el aumento de la presenciadeestosreceptoresenlamembranaplasmticapuedeserigualmenteneuroprotector. Los resultados obtenidos en los estudios de los receptores de adenosina en clulas C6 expuestas al pptidoamiloidesonsimilaresalosobservadosydiscutidospreviamenteenneuronas.Denuevoseobservaun aumentodelosreceptoresA1yA2Adeadenosinatantoaniveldelaexpresingnicacomoaniveldeprotena enlamembranaplasmtica.AumentostambindetectadosenlaenfermedaddeAlzheimer,comosecoment con anterioridad (Albasanz y col., 2008). En estas clulas encontramos adems una particularidad, los incrementosobservadosenlacantidaddereceptorA2Aenestemodelodeneurotoxicidadvandisminuyendo segnaumentaeltiempodeexposicinalpptidoamiloide.Comoyasepropusoenelapartadoanterior,los

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antecedentesbibliogrficosdisponiblesadjudicanunpapelneuroprotectoralaactivacindelreceptorA1yal bloqueodelA2A.Enesteapartadoseaportarundatoadicional,unestudioquerelacionadeformadirectalos nivelesdeAMPcylatranscripcindeAPPenastrocitos(Leeycol.,1997).Segnestetrabajo,laestimulacin delaACparaincrementarlosnivelesdeAMPctenacomoconsecuenciaelaumentodelacantidadcelularde protenaAPPqueserelacionabaconunaumentodesuexpresingnica.Dadalarelacinexistenteentrela protenaAPP,elpptidoamiloideylaenfermedaddeAlzheimer,losautoressugeranqueestasobreexpresin de APP podra incidir en el desarrollo de la enfermedad. Enfocado a los resultados aqu presentados, esta investigacinseajustaconlahiptesisdequelaactivacindelosreceptoresA1,acopladosdeformainhibidora alaAC,yelbloqueodelosA2A,acopladosdeformaestimuladoraadichaenzima,resultenbeneficiososparala supervivenciacelularenestemodelodeneurotoxicidad.Porotrolado,sisuponemosqueelaumentodelos receptoresA2A,comoconsecuenciadelaexposicinaA2535,esfrutodeunprocesoanmaloopatolgico,se observa que justo cuando los niveles de este receptor son ms elevados es cuando las clulas C6 son ms vulnerables a la toxicidad por A2535, mientras que, segn desciende la densidad del receptor A2A en la superficiecelular,elefectotxicodelpptidonoaumentasinoquepareceestabilizarse,loquecorroborarael papel nocivo de la activacin del receptor A2A. An as, la teora aqu expuesta slo demuestra que los receptoresdeadenosinaestnrelacionadosconlaproduccindelprecursordelpptidoamiloideenastrocitos pero, dado que las clulas C6 tambin producen esta protena y son capaces de procesarla hasta llegar al pptidoamiloide(MoratoyMayor,1993),esposiblequeexistaunarelacinmsdirectaentrelosreceptores estudiadosenlapresenteMemoriayelprocesamientodelpptidoamiloideenclulasC6. En cuanto a los efectos observados sobre la transcripcin de los factores CREB y CREM en clulas C6 expuestas al pptido amiloide, stos dependen del tiempo de exposicin a A2535, observndose a tiempos cortos una disminucin de su expresin, la cual aumenta con el tiempo para volver a la situacin basal de expresinalas48horas.ExisteunestudioprevioenclulasC6quedemuestraquelaactividaddelfactorCREB aumenta como consecuencia de la exposicin a A2535 durante 18 horas (Ayasolla y col., 2004). Aunque el tiempo de ensayo no coincide con los empleados aqu, corrobora parcialmente los resultados presentados. Dadalarelacinentrelafuncindeestosfactoresdetranscripcinylaviabilidadcelularesposibleestablecer una correlacin hipottica entre la actividad transcripcional de los mismos y la muerte neuronal observada como consecuencia de la exposicin al pptido amiloide, siempre que sea vlida la suposicin de que una menor transcripcin gnica conlleva una menor actividad, lo cual suele cumplirse para los factores de transcripcin.EstahiptesissebasaenqueunamenorcantidaddefactoresCREByCREMhacenalaclulams vulnerablefrentealatoxicidadporexposicinaA2535.Segnestahiptesisesposibleexplicarlosresultados obtenidosenlosexperimentosdeviabilidadconlosnivelesdetranscripcindeestosfactores,as,atiempos cortosdeexposicinseobservaunadisminucindelatranscripcinloqueproduceunimpactonegativosobre laviabilidadcelular,sinembargo,alprolongarlaexposicinalpptidoamiloideseobservaqueelefectonocivo no aumenta, sino que se mantiene, lo cual est acompaado por un aumento de la expresin de ambos factores.Enelltimotiempodeestudioseobservaquelosnivelesdeexpresindeestosfactoressonsimilares al control, mientras que el efecto nocivo del pptido amiloide tampoco aumenta. Existen otros hechos experimentalesquerespaldanestahiptesis,porejemplo,sehademostradorecientementequeenclulasC6

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Muertecelularinducidaporelpptido amiloide

un aumento en la fosforilacin de CREB supone una mayor produccin de GDNF (glial cell linederived neurotrophic factor) (Hisaoka y col., 2008), una molcula implicada en el desarrollo, funcionalidad y regeneracin del sistema nervioso (revisado por Paratcha y Ledda, 2008). Adems, en otros sistemas la activacin de CREB produce la proliferacin de clulas progenitoras (Peltier y col., 2007). En cualquier caso, dadoquelalistadegenescontroladosporelfactorCREBsuperalos100(revisadoporMayryMontminy,2001) sern necesarios experimentos adicionales que den cuenta del mecanismo sobre el que se sustentara esta hiptesis. V.5.Daocelularproducidoporestrsoxidativo:efectodelperxidodehidrgeno. V.5.1Encultivosprimariosdeneuronasdecorteza. En este captulo se ha descrito el efecto que ejerce un potente agente oxidante sobre las neuronas corticales in vitro. Adems de la disminucin en la viabilidad celular, dependiente de la concentracin y del tiempodeexposicin,sehacomprobadoelefectodeldaooxidativoenlamodulacindelosreceptoresde glutamato y los de adenosina, as como en las vas principales de transduccin en las que estos receptores estnimplicados. Elusodeperxidodehidrgeno(H2O2)comomodelocelulardeldaooxidativosepropusoinicialmente en1995porWhittemoreycolaboradores,loscualesproponansuempleocomoagentecausantedeespecies reactivas de oxgeno, las cuales emularan la liberacin de radicales libres observadas en determinadas enfermedades neurodegenerativas (Whittemore y col., 1995). Adems, se ha comprobado que el estrs oxidativoesunacaractersticacomnenciertasenfermedadesneurodegenerativas(CoyleyPuttfarcken,1993; Olanow,1993).EneltrabajodeWhittemoresedescribique,encultivosprimariosdeneuronascorticales,tras 23DIVlaexposicinaH2O2producamuerteneuronalapoptticaaconcentracionestanbajascomo10M. Poco despus se propuso que exista una relacin directa entre estrs oxidativo y apoptosis en neurodegeneracin(Gormanycol.,1996).Losexperimentosdescritoseranreproduciblescuandoserealizaban encultivosprimariosentrelosdas5y6decultivo(Williamsycol.,2004),describindoseademslaactivacin delaquinasaJNK(cjunNterminalkinase),cuyaactivacinestrelacionadaconapoptosisneuronalinducida porestrsoxidativo(Crossthwaiteycol.,2002).Resultadossimilaresseobtuvieronenexperimentosrealizados en cultivos de 78 DIV (Yu y col., 2008), donde se observ que la muerte celular era dependiente de la concentracin de H2O2 empleada. Segn los experimentos realizados por Nakamichi y colaboradores (Nakamichi y col., 2005), en neuronas corticales a 3 y a 9 DIV, la muerte celular producida por el H2O2 era apoptticaydependadelaconcentracinperonodeltiempodeexposicin.Estadiferenciaconlosresultados mostrados en la presente Memoria se debe a que los experimentos de Najamichi se realizaron a tiempos superioresalas6horasdeexposicin,quedandofueradesusistemadeestudiolostiemposinferioresalas2 horas,quesonlosaquestudiados.Portanto,apesardenoobservarseunaactivacingnicadelacaspasa3

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nosepuededescartarquelamuerteobservadaenestasclulas,enestascondiciones,seadetipoapopttica, comoparecenconfirmarlasreferenciasbibliogrficasaquexpuestas. Ya se ha comentado con anterioridad el papel que desempea la familia de factores de transcripcin CREByCREMenelmantenimientodelasupervivenciacelular.Adems,elfactorCREBresultaactivadoalser fosforiladoporlaquinasaAkt,cuyasealizacintambinseconsideraneuroprotectora(WaltonyDragunow, 2000). Sehapropuestoqueun factor importante en lapatognesis de enfermedades prinicaspuede ser el estrs oxidativo (Freixes y col., 2006). Adems, en pacientes de la enfermedad de CreutzfeldtJakob se han detectado niveles disminuidos tanto de CREB como de su forma activada (Rodrguez y Ferrer, 2007). Estos antecedentes,juntoconladisminucinobservadaenlatranscipcindelosfactoresCREByCREMpresentada aqu,permitensuponerquelafuncionalidaddeestosfactorespodratambinestaralteradaenestemodelode estrsoxidativo. EnlosresultadosexpuestosenlapresenteMemoria,sehaconstatadoquelaexposicindeneuronas corticalesaH2O2produceunaumentoenlacantidaddelosreceptoresmetabotrpicosdeglutamatopresentes enlasuperficiecelular,lacualvaacompaadadeunaumentoenlaafinidaddelosmismosporsuligando.Esto parece indicar una mayor avidez celular por la seal mediada por los receptores metabotrpicos de glutamato. Existen varios estudios que afirman que la neuroproteccin mediada por estos receptores se produceprincipalmenteenaquellassituacionesenlasqueelagentetxicoproducemuertecelularapopttica. Enellosseproponequeestaneuroproteccinsebasaenlaactivacin,pordiferentesvas,delaPI3Kylaruta desealizacindelasMAPquinasas,producindose,endefinitiva,unadisminucinenlaconcentracindelas especies reactivas de oxgeno y,con ello,una disminucin del estrsoxidativo celular y de la muerte celular programada (Spillson y Russell, 2003). Por otro lado, tambin se ha descrito en la presente Memoria que el aumentoenlacantidaddereceptoresmetabotrpicosesdebido,almenosenparte,alaumentodelnmero de receptores mGlu1 y mGlu2,3, pero no al subtipo mGlu5, demostrando, una vez ms, la gran variedad de eventos reguladores que modulan la expresin de los distintos subtipos de receptores metabotrpicos de manera especfica, ya que, receptores con funciones similares, como es el caso de los receptores mGlu1 y mGlu5,resultanmoduladosdeformadiferenteanteunmismoestmulo. EstefenmenoderegulacindiferencialdelosreceptoresmGlu1ymGlu5fueobservadoenunmodelo de estrs oxidativo inducido por la eliminacin de cistina del medio en cultivos primarios de neuronas corticales(SagaraySchubert,1998),enelcualseobservabaquelascondicionesdeestrsoxidativoensayadas aumentaban la expresin del receptor mGlu1 en membrana plasmtica sin variar la de mGlu5. Estos autores proponenqueelmecanismodeproteccincontroladoporlosreceptoresdelgrupoIpuedeestarrelacionado conaumentosenlosnivelesdeIP3ydeCa2+intracelulares.Deacuerdoconestosresultados,sehaobservado que,encultivosprimariosdecortezaderata,elempleode(S)DHPG,agonistadelgrupoIdelosreceptores metabotrpicosdeglutamato,puedemitigareldaocelularocasionadocomoconsecuenciadelaexposicina H2O2 (Zhu y col., 2004). Por otro lado, en otros tejidos como hipocampo de ratn, se ha demostrado que el empleodeagonistasdelgrupoIyIImejoran,aunquesloparcialmente,eldaoproducidoporlaexposicina H2O2(SaransaariyOja,2004).EstosautoreshanpropuestorecientementequeelneurotransmisorGABAtiene

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unpapelneuroprotectorensituacionesdeestrsoxidativoas,enhipocampoderatnenpresenciadeH2O2,el empleodeagonistasdelgrupoIyIIaumentabalaliberacindeGABA,mientrasquelosagonistasdelgrupoIII ladisminua,resultandoportantolosprimerosbeneficiososylossegundosperjudicialesparalaviabilidadde lasclulasdelhipocampo(SaransaariyOja,2008).Sinembargo,elpapeldelosreceptoresdelgrupoIIparece dependerdeltipocelularascomodelaespecieestudiada,yaque,segnunestudiorealizadoporMoldrichy colaboradores, los agonistas del grupo II no eran capaces de mitigar el dao producido por varios agentes txicos,entreellosH2O2,enclulasdecorteza,deestriadoygranularesderatn(Moldrichycol.,2001). ElaumentodelossubtiposmGlu1ymGlu2,3,cuyopotencialneuroprotectoryahasidocomentado,se traduce adems en una potenciacin de sus vas de sealizacin principales, las enzimas PLC y AC, respectivamente,loquesugierequeelefectoneuroprotectordeambosreceptorespodraestarrelacionado consusefectossobrelosnivelesdeIP3yAMPc.Laspropiedadesneuroprotectoresdelaactivacindelaenzima PLC1yasehancomentadoconanterioridadenlapresenteMemoria(Leeycol.,2000b;Nagasacaycol.,2004; Yasudaycol.,2008).Elmecanismodeproteccinqueimplicalaactivacindelosreceptoresmetabotrpicos delgrupoIenmodelosdeestrsoxidativopareceestarrelacionadoconlacapacidaddeestosreceptoresde aumentarlosnivelesdelantioxidanteglutation(GSH)(SagaraySchubert,1998).EsteaumentodeGSHpodra sersuficienteparainhibirtodosloseventosposterioresqueconduciranalamuertecelular(Tanycol.,1998). Sinembargo,aunqueelmecanismoestanpordefinir,SagaraySchubertpropusieronquelaactivacindelos mGlu del grupo I podra afectar a la expresin o actividad de protenas requeridas para mantener la homeostasiacelularencondicionesdeestrs.Elmismopapelantioxidantehasidoadjudicadoalosreceptores metabotrpicosdelgrupoII(pararevisinver:Anjaneyuluycol.,2008).Dadoelelevadonmerodeprocesos de sealizacin con los que estn relacionados los receptores metabotrpicos de glutamato como, por ejemplo, procesos de fosforilacin/desfosforilacin, interacciones protenaprotena o transactivacin de genes (para revisin ver Conn y Pin, 1997; Michaelis, 1998), seran necesarios experimentos adicionales que confirmaran cul deestas diversas funciones es la encargada de la neuroproteccinen situaciones de estrs oxidativo. Segnlosresultadospresentados,enclulascorticalesinvitrosehaobservadoqueelestrsoxidativo produce un aumento de los receptores A1 en membrana y una disminucin de los A2A, sin observarse, en ninguno de los dos casos, variaciones en la expresin de los correspondientes genes. Por otro lado, el incremento del receptor A1 viene acompaado de una potenciacin en su va de transduccin principal, mientrasqueeldescensodeA2Atambinsuponeunadisminucinenlafuncionalidaddeestereceptor. Laadenosina,actuandoatravsdesusreceptores,escapazdemodulareldaoenlostejidosascomo participar en la reparacin de los mismos (para revisin ver Fredholm, 2007). Se ha comentado con anterioridadelefectoneuroprotectorqueejercenlosagonistasdelreceptorA1,ascomolosantagonistasdel receptor A2A, en otros modelos de toxicidad celular. Ya en 1995 se determin que la adenosina liberada durantelahipoxiabloqueabalosefectosmecnicosymetablicosqueinducalaexposicinaH2O2encorazn derataylohaca,almenosenparte,atravsdelosreceptoresA1(HarayAbiko,1995).Adems,laactivacin de los receptores A1 ha resultado citoprotectora en otros modelos de estrs oxidativo, como el inducido

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mediante el empleo de cisplatinio, un agente quimioteraputico que produce neurotoxicidad como efecto secundario.LaadministracindecisplatinioproducaenccleaunaumentodelosreceptoresA1,elcual,segn Ford y colaboradores, podra representar un mecanismo de compensacin destinado a contrarrestar los efectos txicos del cisplatinio (Ford y col., 1997). Con posterioridad, se demostr que esta hiptesis era acertadapuestoqueelempleodeagonistasdelreceptorA1enlaccleaprotegadeldaoocasionadoporel cisplatinio(Whitworthycol.,2004).Adems,enestemismotrabajo,elempleodeagonistasdelreceptorA2A incrementabalos efectosdel cisplatinio. La propia adenosina ha demostrado su potencial neuroprotector en lesiones inducidas como consecuencia de un aumento de la cantidad de radicales libres en cortes de hipocampo (Almeida y col., 2003). Ms recientemente, ha sido demostrado que, en clulas granulares, el empleo de agonistas del receptor A1 y de antagonistas del receptor A2A disminua el dao oxidativo desencadenadoporH2O2(Fatokumycol.,2007).Porotrolado,elempleodeligandosdelreceptorA2Aresulta msprometedoralahoradedesarrollarterapiasneuroprotectorasyaque,laeficaciadelaactivacindelos receptores A1 podra resultar disminuida debido a una activacin concomitante de los receptores NMDA (Stone,2005).SehademostradoquelosmetabolitosdelacafenaproducenlainhibicindelaenzimaPARP1 (poli(ADPribosa) polimerasa 1) (Geraets y col., 2006), cuya activacin se relaciona con la fisiopatologa de variasenfermedades.Dadoque,encondicionesfisiolgicas,laaccinprincipaldelacafenaeselbloqueode los receptores A2A (Fredholm y col., 2007), es razonable suponer que una de las vas por las que los antagonistas de los receptores A2A resultan neuroprotectores es la inhibicin de PARP1 en condiciones patolgicas.Noobstante,nodebendescartarseotrasposiblesvasdeneuroproteccinreguladasporefectos antioxidantesdeestosreceptores(Fatokumycol.,2007). Porotrolado,laactivacindelosreceptoresA2Aharesultadoserprotectoraenotrosestudiosporvarios mecanismos(ArslanyFredholm,2000;LeeyChao,2001;CunhaReisycol.,2008),loquesugiereque,aunque engeneralsubloqueoresulteneuroprotector,nohayunanormageneralqueregulelaaccinprotectorade estosreceptores. V.5.2EnclulasC6degliomaderata. LaexposicinaH2O2empleadaa500Mdurante30minutosproducamuertecelular.A30minutosde exposicinsedetectunincrementodelaexpresindelgencodificanteparalacaspasa3.Estasclulashan sidoempleadasconanterioridadporotrosgruposdeinvestigacinenlosltimosaoscomomodeloparael estudio del dao oxidativo producido por la exposicin a H2O2. As, se determin que la muerte celular observada era apopttica debido a la activacin de la caspasa 3, producindose, adems, la activacin del factorNF,delaquinasaJNKydelaprotenap38(Marangoloycol.,2001).Posteriormente,seobservque durantelaexposicindelasC6aH2O2tambinseproducanaumentosenlaconcentracindeCa2+intracelular, del ratio Bax/BCL2 y de la actividad de la proteasa calpana (Sur y col., 2003). Ms recientemente se ha demostradoqueestosprocesosdisminuyenlosnivelesdeGRK2debidoalaaccindelacalpanaydelaciclina cdk1(Cobelensycol.,2007).

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Deformasimilaralodescritoenelcasodeneuronascorticales,laexposicindelasclulasC6aH2O2 produce una regulacin diferencial de la expresin de los receptores metabotrpicos de glutamato. En este caso, la regulacin observada resulta ms llamativa debido al hecho de que los principales subtipos que se modulan como consecuencia del estrs oxidativo se encuentran englobados dentro del mismo grupo de receptores metabotrpicos, siendo por tanto sus funciones similares, y, sin embargo, su modulacin se produceensentidosdiferentes,resultandoaumentadalaexpresindemGlu1ydisminuidalademGlu5.Esta regulacin selectiva de los receptores ya se ha observado con anterioridad en otros trabajos, adems de los comentados en el apartado anterior, y sin embargo esta es, hasta la fecha, la primera descripcin de un comportamiento aparentemente antagnico de dos receptores metabotrpicos del mismo grupo estudiados en el mismo sistema. Este hecho representa un nuevo ejemplo de la versatilidad de los receptores metabotrpicosdeglutamatoparadesencadenarprocesosdeneuroproteccinmediantelaregulacindesu expresin de forma diferente, en funcindel estmulo txico, as como del tipo celular del estudio. Por otro lado, una familia de protenas implicada en la funcin y expresin de los receptores metabotrpicos de glutamato,lasGRK,enconcretolasdelsubtipo2,resultandisminuidasenclulasC6comoconsecuenciadela activacin de calpana tras la exposicin a H2O2 (Cobelens y col., 2007). Las GRK2 presentan capacidad de regularlaexpresinyfuncindelosreceptoresmGlu1sinnecesidaddefosforilarlos(DhamiyFerguson,2006) ascomoderegularelsubtipomGlu5graciasasuactividadquinasa(SorensenyConn,2003).Ladisminucinen elsubtipoGRK2,ascomomodulacionesenotrossubtiposdeGRKsovariacionesenlaactividadquinasadelas mismas no estudiadas hasta la fecha, podran explicar las diferencias observadas en la expresin de los subtiposdereceptoresdelgrupoIenestemodelo. Fenmenosderegulacinsimilaressehanobservadoenotrossistemas.As,enclulasHT22,unalnea inmortalizada de hipocampo, las condiciones de estrs oxidativo producen un aumento de la expresin del receptormGlu5peronodelmGlu1nidemGlu2,3(SagaraySchubert,1998).Porotrolado,encultivosprimarios deoligodendricitosdecerebroderataseobservquelaactivacindelosreceptoresdelgrupoIdisminuael efectotxicodelascondicionesdeestrsatravsdemecanismosantioxidantes(Dengycol.,2004).Enestos experimentos se demostr que los receptores del grupo I mantenan los niveles de glutation constantes en estas condiciones ypara ello era necesaria la activacin de la PKC.Otros autores proponen que cuando en enfermedades neurodegenerativas se observan regulaciones al alza de los receptores metabotrpicos en clulas gliales, estas regulaciones conllevan, generalmente, un aumento en la capacidad de estas clulas de liberar al medio factores trficos (Aronica y col., 2000), los cuales seran responsables del efecto neuroprotectorobservadoalactivarestosreceptores(pararevisinverSpillsonyRussell,2003).Porotrolado, tambinsehademostradoqueelantagonismodeestosreceptores,principalmentedelsubtipomGlu5,resulta neuroprotectorenmodelosinvivofrentealaadministracinde6hidroxidopamina(Vernonycol.,2007).En resumen, se podra citar un trabajo de Bruno y colaboradores que propone que esta variabilidad en la respuestadelosreceptoresmetabotrpicosfrenteaagonistasyantagonistasseadebidaaquelafuncinde estos receptores depende de su actividad previa, de tal forma que en funcin de la historia previa del receptorsuactivacinpuedederivarhacialaneuroproteccinohacialaneurotoxicidad(Brunoycol.,2001).De

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acuerdoconestahiptesisunrecientetrabajoafirmaquelosreceptoresmGlu1puedenserneuroprotectoreso neurotxicosenfuncindelascondicionestrficasdelmedio(Pshenichkinycol.,2008). Apesardequehistricamentelosaumentosenlosnivelesdecalciointracelularessehayanrelacionado con procesos neurotxicos durante la excitotoxicidad, sin embargo es bien conocida la funcin esencial del calcioenlafisiologacelular.Enestesentido,niveleselevadosdecalciopuedenactivardeterminadasquinasas, como calmodulina quinasa, PKC, PKA o las MAP quinasas, y fosfatasas (para revisin ver Finkbeiner y Greenberg., 1998), claves para la funcin celular e implicadas adems en procesos de neuroproteccin. De hecho, se conoce que la accin neuroprotectora de los estrgenos se debe al incremento de los niveles de calcio intracelular (Sarkar y col., 2008). Como ya se ha apuntado anteriormente, se ha observado que la neuroproteccinenelmodelodeC6dependedelaactivacindePKC,protenaincluidaenlasubfamiliaPKC clsica o convencional que requiere de la presencia de calcio, entre otros factores, para su activacin (para revisin ver MartinyBaron y Fabbro, 2007). Otros trabajos tambin apoyan la hiptesis de que en estas condiciones el aumento de calcio puede resultar neuroprotector o, al menos, no es la causa de la muerte celular observada en clulas C6. As, al transfectar varias conexinas en clulas C6, entre cuyas funciones se incluyeladeestabilizarlahomeostasiadelcalciodisminuyendoaslavulnerabilidadcelularalestrsoxidativo (Blancycol.,1998;AndradeRozentalycol.,2000),sededujoquenoeranecesarialacapacidaddelasmismas deformargapjunctionsparareducirlatoxicidaddelH2O2(Linycol.,2003),sinoqueelefectoprotectorera debidoamecanismosdesealizacinintracelular(Giardinaycol.,2007),esdecir,noeranecesariodisminuir losaumentosobservadosenlosnivelesdecalcioparaobservarunamejoraenlaviabilidadcelular. LascaractersticasneuroprotectorasdelaactivacindelosreceptoresA1ascomodelbloqueodelos receptoresA2AhansidodiscutidasampliamenteenlapresenteMemoria.Sinembargo,enclulasC6expuestas alaaccintxicadelperxidodehidrgenosehaobservadoqueelestrsoxidativoproduceunincrementode la expresin de los receptores A1 y A2A, cuyas acciones transcurren, en principio, de manera antagnica. Por otroladoseharealizadoelestudiodelosnivelesdelaenzimaACI.Estaenzimaseeligidebidoasurelacin conlosreceptoresdeadenosina,porserlaisoformadelaACespecficadetejidoneuronal(Xiaycol.,1993)y por haber estado implicada en varios modelos de aprendizaje y adaptacin celular (revisado por Mons y Cooper,1995).ElposiblecarcterneuroprotectordelaactivacindelosreceptoresA2Ayaseadelantenel apartadoanterior.EnrelacinconelefectotxicodelH2O2,seobservquelaactivacindelosreceptoresA1y A2A en osteoblastos inmortalizados contrarrestaba dicho efecto (Fatokum y col., 2006). La activacin del receptorA2Ayahabamostradopreviamenteunefectomitognicoenclulasendotelialesvenosasdecordn umbilical,atravsdelaactivacindelasMAPquinasas(Sexlycol.,1997).EnclulasHK2detbuloproximal humano se propuso que la proteccin frente a H2O2 por la activacin de los receptores A1 se produca por activacindelaPKCatravsdeunaprotenaGi/omientrasquelaproteccinobservadaporlaactivacindelos receptores A2A se produca por la ruta de sealizacin dependiente de AMPc y activacin de la PKA (Lee y Emala, 2002). Adems, estos autores demuestran que la activacin de A2A produce una recuperacin de la funcin de CREB y proponen que esta recuperacin se traduce en una mejora en la viabilidad celular. Por ltimo, en clulas ms cercanas al SNC, como son las PC12, se demostr de nuevo que la activacin de los

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receptoresA2Aprotegadeldaooriginadoporlaprivacindesuero,loque,asuvez,aumentabalasROSen PC12 (Satoh y col., 1996), mediante la activacin de PKA (Huang, 2003). En este caso se propone que la activacindelosreceptoresA2AenclulasPC12tieneunefectoantioxidante,aligualqueocurreenneutrfilos (Walkerycol.,1997),detalformaquelasvasdetransduccinqueseactivanatravsdelaPKAconfluyenen intentar mantener las cantidades de agentes antioxidantes como el glutation. Los precedentes bibliogrficos citadosenlapresenteDiscusin,unidosaloshechosexperimentalesexpuestos,representanunejemplodela versatilidaddelasfuncionesdelosdistintosreceptoresdeadenosinaendistintostiposcelularesdestinadasa preservarlaintegridaddeundeterminadotejido. Por ltimo, dada la relacin de los factores CREB y CREM con la viabilidad celular comentada en apartadosanteriores,esposibleque,enestasclulas,elquenovarenlosnivelesdetranscripcindeCREBy CREM,einclusotenganunatendencianosignificativaaaumentarsuexpresin,influyaenlaviabilidadcelular, frentealoobservadoencultivosdeneuronas. V.6.Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimientoacelerado. Este estudio es el primero en examinar la expresin de los ARNm de los diferentes receptores de adenosinayencuantificardelosreceptoresA1yA2AencerebroderatonesSAMR1ySAMP8.Losresultados expuestosenlapresenteMemoriademuestranqueenlosratonesSAMR1ocurreunaprdidadereceptoresA1 relacionada con la edad, asociada a un incremento en la en la expresin gnica del mismo, lo que podra considerarseunmecanismocompensatorioparaevitarlaprdidadereceptoraniveldemembranaplasmtica, mientrasqueenratonesSAMP8jvenesyaseobservannivelesdereceptorsimilaresalosdetectadosenlos ratonesSAMR1demsedady,adems,estosnivelesnovariabanconlaedad.Porelcontrario,enelcasodel receptorA2AloscambiosrelacionadosconlaedadsuponenunincrementoenlacantidaddereceptoresA2Aen losratonesSAMR1,mientrasquenoseobservvariacinenlosratonesSAMP8,dondelosnivelesdetectados eransimilaresalosobservadosenratonesSAMR1jvenes.Sinembargo,elresultadomsnovedosodeeste estudio es que los receptores A1deadenosina,cuya activacin se consideraneuroprotectora,seencuentran muy disminuidos en ratones SAMP8 lo que sugiere una gran afectacin de estos receptores en este modelo experimental.El anlisis de los cambios relacionados con la edad en elreceptor A1 se complet medianteel estudiodeestosreceptoresencerebrosderatasWistarde3y24meses,dondesecorroboraronlosresultados obtenidosenratonesSAM. En funcin de la especie, la cepa y la edad estudiada han sido descritos cambios morfolgicos en el cerebrodurante el procesode envejecimiento. Loscambios en los receptores A1 yA2A de adenosina y en su funcin tambin han sido demostrados previamente, observndose una disminucin del receptor A1 y un aumentodelreceptorA2A(Rodriguesycol.,2008;pararevisinverCunha,2005).Loscambiosobservadoscon laedadenlosreceptoresA1encerebrosderatonesSAMR1,deenvejecimientofisiolgico,sonconsistentescon losdatospublicadospreviamente.As,encerebroderatnsedescribieronvariacionesenelensayodeunin

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deCHA,observndoseencorteza,hipocampoycerebeloderatonesde28mesesdeedaddisminucionesdeun 44,50y12%,respectivamente,conrespectoalosdatosobtenidosenlasmismasreasderatonesde3meses de edad (Pagonopoulou y Argelatou, 1992). Ms recientemente, ha sido confirmado, tambin en ratn, la prdida de receptores A1 en varias estructuras corticales y subcorticales implicadas en el papel neuromoduladordelaadenosina.DadoquestadisminuyelaactividadelctricalaprdidadereceptoresA1 estararelacionadaconelaumentodelaexcitabilidadneuronalduranteelenvejecimiento(Ekonomouycol., 2000).Porotrolado,existenvariosprecedentesqueconfirmanqueconlaedadseproducenvariacionesdelos nivelesdereceptorA2Aenvariossistemas,comosehamencionadopreviamente.Porejemplo,encortezade cerebroderatasedeterminunaumentodeldobleenelnmerodereceptoresA2Aenratasde24mesesde edad con respecto a las de 6 semanas, sin embargo, se observaba una tendencia decreciente en estriado (Cunha y col., 1995). Esta tendencia a la disminucin de receptores A2A se confirm posteriormente en el estriadoderatasadultas(Fredholmycol.,1998).Sinembargo,enestemismalocalizacinnoseencontraron diferenciasenlacapacidaddelosreceptoresA2Adeestimularlaliberacindeglutamatoentreratasjvenesy adultas(Cosiycol.,1999).Estasdiferenciasentreestriadoycorteza,enloqueaexpresinyfuncionalidadde los receptores A2A se refiere, fueron estudiadas detalladamente por Lopes y colaboradores corroborando los resultados anteriores (Lopes y col., 1999a). Estos estudios sugieren que, con la edad y, por lo menos, en la corteza cerebral, el balance entre la accin inhibidora de los receptores A1 y la accin estimuladora de los receptoresA2Asedesplazahastaestosltimos. Los resultados expuestos en ratas Wistar se correlacionan bien con los publicados previamente por Cunhaycolaboradores,segnloscualesladensidaddereceptoresA1enratasde24mesesdisminuaun33% enhipocampoyun60%encortezacuandosecomparabaconratasde6semanas,sincambiosaparentesenla KD (Cunha y col., 1995). Por otro lado, tambin se observ una disminucin en la unin de DPCPX tritiado a membranashipocampalesenratasviejasconrespectoalasjvenes(Sperlghycol.,1997).Unestudiodela disminucin de los receptores A1 con el tiempo de envejecimiento fue llevado a cabo por Cheng y colaboradoresencortezaderatasWistar(Chengycol.,2000).Enestetrabajosedemostr,medianteWestern blot,queencomparacinconanimalesde2mesesdeedad,losanimalesde6mesesyapresentabanmenos cantidaddereceptoresA1,lacualseguadisminuyendoconlaedad.Porltimo,elpatrndeunindeDPCPX disminuaconlaedadenmembranasdecerebrocompletoderatasWistarmacho,sinobservarsecambiosen losvaloresdeafinidadentrelosgruposdeedadestudiados(Cunhaycol.,2001b). LaprdidadereceptoresA1aniveldelamembranaplasmticahasidofrecuentementeasociadaauna regulacinalabajadelreceptorA1comoconsecuenciadeunasobreexposicinasuligando.Enmodelosinvivo estegrupodeinvestigacinhasugeridoquelaprdidaydesensibilizacindelosreceptoresA1esproducida porelevadosnivelesdeadenosina(Lenycol.,2002;2004y2005).Aestahiptesisseaadeelhechodeque, encondicionesnocivaseinclusoconlaedad,elpapelmoduladordelaadenosinaenelcerebroestalterado debidoaloselevadosnivelesdeadenosina,loscuales,asuvez,modulanladensidaddesusreceptores(Lopes y col., 1999b; revisado por Cunha, 2005). Estudios previos han demostrado que los niveles extracelulares de adenosinaendgenaenpreparacioneshipocampalesderatasviejassonmselevadosquelosdetectadosen

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Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimiento

las preparaciones de ratas jvenes (Sperlgh y col., 1997; Cunha y col., 2001a). Adems, los niveles extracelulares de adenosina en cerebro basal son ms elevados en animales viejos que en jvenes (MurilloRodriguezycol.,2004),loquepodradeberseaunincrementoenlaactividadde5nucleotidasascon la edad (Cunha y col., 2001a; Mackiewicz y col., 2006). Tambin en el hipocampo aumenta el nivel de adenosinaenellquidoextracelular,asociadoconunaregulacinalabajayunadisminucindelarespuestade losreceptoresA1presinpticos(Spelghycol.,1997).Porotrolado,sehapropuestoqueestosniveleselevados de adenosina podran producir una activacin tnica de los receptores A1 que aminorara la prdida de funcionalidad de estos receptores detectada con la edad (Sebastio y col., 2000). Debido a todos estos antecedentes,esrazonablepostularqueelevadosnivelesdeadenosinapuedenserresponsablesdelaprdida conlaedaddereceptoresA1enratonesSAMR1. Al contrario de los resultados obtenidos a nivel de ARNm en la presente Memoria, se describi previamente una disminucin en los niveles de ARNm del receptor A1 en corteza de ratas macho viejas con respectoalasjvenes,empleandolatcnicadeNorthernblot(Chengycol.,2000).Estetrabajocontrastacon losresultadosmostradosempleandolatcnicadePCRatiemporealconhomogenadosdecerebro,dondese detectabaunincrementodelacantidaddelARNmcodificanteparaelreceptorA1conlaedadenlosratones SAMR1,loquepodraentendersecomounmecanismodecompensacinfrentealaprdidadereceptorA1a niveldelamembranaplasmticaposiblementeinducidaporelevadosnivelesdeadenosina.Encualquiercaso, estos mecanismos no se detectan en los ratones SAMP8, donde un nivel ms bajo de receptor A1 no se relaciona con un incremento en su transcripcin, probablemente como consecuencia de algn mecanismo defectuoso en estos ratones al no observarse regulacin de estos receptores por elenvejecimiento, como s ocurreconlosSAMR1. LosratonesSAMP8hansidoempleadoscomomodeloanimaldelaenfermedaddeAlzheimerdebidoa que producen un exceso de protena APP en el hipocampo y, en las ltimas etapas de su vida, desarrollan placasamiloides(Morleyycol.,2000).Porltimo,sehadescritoquelosnivelesdeAPPypptidoamiloideen ratonesSAMP8de12mesesdeedaderanmselevados,entornoaldoble,quelosencontradosenratones SAMP8 de 4 meses de edad, los cuales se traducan en severos dficits de aprendizaje y memoria. Estos problemas de aprendizaje y memoria podan revertirse mediante terapia con anticuerpos o oligonucletidos antisentido contra amiloide (Kumar y col., 2000; Morley y col., 2000). Por este motivo, la cepa SAMP8 representa un modelo de deterioro cognitivo dependiente de la deposicin del pptido amiloide con el envejecimiento(pararevisinverPallsycol.,2008). La prdida de receptores A1 descrita en estos animales podra estar relacionada con los niveles anormalmenteelevadosdepptidoamiloidedescritosenestemodelodeenvejecimiento,loscuales,porotro lado, son caractersticos de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, por un lado, no existen referencias bibliogrficasqueaportendatosacercadelosnivelesdepptidoamiloideenanimalesdetansolo3semanas deedad,enloscualesyaseapreciabaunaprdidasignificativadereceptoresA1conrespectoalosSAMR1de la misma edad y, por otro lado, esta hiptesis contrasta con los resultados obtenidos por este grupo de investigacinennecropsiasdecerebrosdepacientesdeAlzheimer,enlosqueseobservabaunaumentode

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Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimiento

Discusin

receptores A1 ya en las primeras etapas de la enfermedad que se mantena con el progreso de la misma (Albasanz y col., 2008). Adems, la regulacin al alza de los receptores A1 ha sido descrita en cerebros de pacientesdeotrasdemenciascomolaenfermedaddePickolademenciacongranosargirfilos,enlascuales nohayacumulacindepptidoamiloide(Albasanzycol.,2007;PerezBuiraycol.,2007).Porestosmotivosla variacinenlosreceptoresdeadenosinanopareceestarrelacionadaconlaacumulacindelpptidoamiloide, sinoque,comosepostulanteriormente,parecemsprobablementerelacionadaconunincrementoenlos nivelesdeadenosinaendgena.Deacuerdoconestahiptesisseencuentraelhechodequeenpacientesde Alzheimer se han encontrado niveles de adenosina endgena menores que podran explicar el incremento detectado en la cantidad de receptores A1 en cerebros de estos pacientes (Selley, 2004). Adems, la propia adenosina, y agentes farmacolgicos que aumenten sus niveles extracelulares han sido propuestos como posibles refuerzos en el tratamiento con inhibidores de la colinesterasa en la enfermedad de Alzheimer (Ferroniycol.,2002;Schubertycol.,2001). A pesar de que no existan datos en la bibliografa acerca de la cantidad de adenosina extracelular en estosanimales,ssehandescritovariacionesenotrossistemasdeneurotransmisoresenratonesSAM.Asse handescritodisminucionesenlosnivelesdeserotoninayacetilcolinaeincrementosenlosdeGABAenratones SAMP8(Morley,2002).Porotrolado,enhipocampoyencortezacerebraldelosratonesSAMP8elcontenido deglutamatoyglutaminaencontradofuemselevadoqueenratonesSAMR1entre2y14meses,mientras que el contenido de aspartato y alanina fue ms bajo (Nomura y Okuma., 1999; Kitamura y col., 1992). De acuerdo con esto, el valor de unin mxima de la unin de [3H]dizocilpina, un inhibidor de los receptores NMDA,enmembranascorticalesseencontrabadisminuidoconlaedadenlosratonesSAMP8peronoenlos SAMR1(Kitamuraycol.,1992).Adems,launinde[3H]MK801enhipocampoalosreceptoresNMDAtambin seencontrabadisminuidaenratonesSAMP8conrespectoalosSAMR1,loqueindicabaquelasfuncionesde losreceptoresNMDApodranserdeficientesenestemodelodeenvejecimientoacelerado,loquepodra,asu vez, estar relacionado con el envejecimiento acelerado y los dficits de aprendizaje y memoria de estos animales(Kitamuraycol.,1992;Nomuraycol.,1997).EstadisminucinenlosreceptoresNMDAenlosratones SAMP8conlaedad,queyahabasidopreviamentedescrita(ZhaoyNomura,1990),esimportantedebidoala implicacin de la acumulacin local de aminocidos excitadores en fenmenos excitotxicos (revisado por Olney,1990).Nivelesdeglutamatoelevadoshansidoencontradosenvariasreascerebralesenlaenfermedad deAlzheimer(Procterycol.,1988),producido,almenosenparte,comoresultadodelfalloenlaeliminacin delglutamatodelasinapsisneuronal(GreenamyreyYoung,1989).Deacuerdoconestosdatosseencuentra un trabajo de este grupo de investigacin en el que se describi la disminucin de los receptores metabotrpicos de glutamato en la corteza cerebral de pacientes de la enfermedad de Lewy en su forma comn y de Alzheimer (Albasanz y col., 2005). Por otro lado, la adenosina acta como una sustancia neuroprotectora principalmente a travs de los receptores A1. La activacin de los receptores A1 inhibe la liberacindeglutamatoreduciendoaslaexcitabilidadneuronal,porestemotivo,laprdidadereceptoresA1 podraserlacausadeloselevadosnivelesdeglutamatoenestemodelodeenvejecimiento.

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Discusin

Modulacindelosreceptoresdeadenosinaenunmodelodeenvejecimiento

Enresumen,enlosratonesSAMR1seobservaronlosmismoscambiosrelacionadosconlaedadenel estudio de los receptores A1 que los observados en ratas, aunque, en los ratones, el descenso descrito se produca a edades ms tempranas. Adems, en cerebros de ratones SAMP8 jvenes ya se encontraba una prdida significativa de los receptores A1, los cuales se encontraban a niveles incluso menores que los detectados en ratones SAMR1 de ms edad. Existen estudios in vivo en humanos, realizados mediante tomografadeemisindepositrones(PET),enlosquesedetectaunprdidadereceptoresA1dependientede laedad,quepodraresultarimportanteenvariasenfermedadesneurolgicasrelacionadasconlaedad(Meyer ycol.,2006).Porestemotivo,losratonesSAMrepresentanunimportantemodeloparaestudiarlaalteracin dereceptoresdeneurotransmisoresrelacionadosconenfermedadesneurodegenerativas.

252

Conclusiones

1.

Conclusiones

LoscuatroreceptoresdeadenosinadescritoshastalafechaseexpresanenclulasC6degliomaderata. Se ha demostrado para dos de ellos, los receptores A1 y A2A, que estn funcionalmente acoplados de manerainhibidorayestimuladora,respectivamente,alaenzimaadenilatociclasa.LosreceptoresA1lo hacenatravsdeunaprotenaGisensibleaPTXylosA2AatravsdeunaprotenaGs.

2.

Laexposicinaglutamatoresultatxicaenneuronascorticalesinvitro,observndoseunaregulacinal alzadelosreceptoresmGlu1ymGlu5,quepodraestarrelacionadaconunafuncinneuroprotectorade estosreceptores,aunquenoseencuentrarelacionadaconlacapacidaddelosmismosdemodularlos niveles de calcio intracelulares. Los receptores A1 y A2A tambin se regulan al alza en las condiciones ensayadas, potencindose sus vas de sealizacin, pudiendo estar relacionados con fenmenos de neuroproteccinlosprimerosydeneurodegeneracinlossegundos.

3.

LasclulasC6sonresistentesalaexposicinaelevadasconcentracionesdeglutamatoduranteperiodos prolongados de tiempo. Durante el proceso de exposicin a glutamato se observa un aumento en el nmero de receptores metabotrpicos totales, una disminucin de los receptores mGlu1 y, probablemente, un aumento de los receptores metabotrpicos del grupo III, pudiendo estar ambos efectos relacionados con la elevada resistencia de estas clulas frente a la excitotoxicidad. En estas condiciones,seobservaunaregulacinopuestadelosreceptoresdeadenosina,alalzalosA1yalabaja los A2A, as como de sus vas de sealizacin, lo que se podra corresponder con las funciones antagnicasdeestosreceptores.

4.

Lahipoxiamoderadaproducemuertecelularapoptticaenneuronascorticales.Comoconsecuenciade la disminucin de oxgeno los receptores metabotrpicos mGlu1, mGlu5 y mGlu2,3 y los receptores A1 aumentan su expresin en membrana plasmtica, debido probablemente a su papel neuroprotector ante este estmulo. Por otro lado, los receptores A2A disminuyen su presencia durante estos procesos debidoprobableaquesuactivacinpuedadesempearunpapelnocivo.

5.

En clulas C6, la hipoxia moderada no ejerce efectos txicos. Esta ausencia de toxicidad puede ser debidaalosprocesosderegulacinobservados.Porunlado,elaumentodelosreceptoresmGluydel receptorA1deadenosina,porotro,ladisminucindelreceptorA2A.Sehademostradoquelaactivacin tnicadelreceptorA1orquestaloscambiosobservadosenelreceptorA2A.

6.

La adenosina mimetiza el efecto de la hipoxia moderada sobre la regulacin de los receptores estudiados.

7.

La exposicin de neuronas corticales al pptido amiloide resulta txica, desencadenando procesos de apoptosis. En este modelo se detectan niveles de receptores mGlu del grupo I aumentados y los del grupo II disminuidos. Al ser estas modulaciones contrarias a las observadas en cerebros humanos es posiblequeseancausaoconsecuenciademecanismosdedefensafrentealatoxicidadmostradaporel pptidoamiloide.LosreceptoresA1yA2Aaumentanenestascondiciones,aunquelohacenenfuncin deltiempodeexposicin,loquesugiereunadistintafuncionalidaddeestosreceptoresenestemodelo experimental.

8.

EnclulasC6elpptidoamiloideproducemuertecelularapopttica,observndoseunaumentodelos receptores mGlu, aunque se observa una disminucin de los receptores mGlu1 que podran ser

255

Conclusiones producidospordesregulacionesenlahomeostasiadelglutamato.LosreceptoresA1yA2Aaumentanen estemodelopotencindosesusvasdesealizacin. 9. El agua oxigenada produce muerte celular en neuronas regulando los receptores estudiados. Los receptoresmGlu1ymGlu2,3aumentanenestemodelo,potencindosesusvasdesealizacin,mientras que los receptores de adenosina A1 y A2A se regulan en sentidos opuestos, siendo los primeros aumentadosylossegundosdisminuidos,observndoseelmismoefectoenlafuncionalidaddeambos sistemas. 10. EnclulasC6laexposicinaaguaoxigenadaresultatxica,detectndoseaumentosenlascantidadesde mGlu1,A1,A2AyPLC1ydisminucionesenlademGlu5. 11. ElreceptorA1ysufuncionalidaddisminuyenconlaedadencerebroderataWistar.LosratonesSAMR1 se comportan como las ratas Wistar, observndose una prdida de A1 con la edad. Sin embargo, los SAMP8presentanreceptoresA1disminuidosaedadmuytemprana,equiparndosealosSAMR1viejos, sin observarse la progresin con la edad mencionada. Por otro lado, los ratones SAMP8 tampoco presentan la regulacin de los receptoresA2A esperada con la edad, con valores similares a los de los SAMR1jvenes,loscualesaumentanenlosSAMR1viejos. En esta Memoria se ha pretendido estudiar la implicacin de los receptores metabotrpicos de glutamato y de adenosina en los mecanismos de muerte celular relacionada con enfermedades neurodegenerativastomandocomomodeloscelularesunoneuronalyotrodegla.Dichaimplicacinhasido demostrada puesto que tales receptores se modulan por estmulos txicos. Aunque el sentido de la modulacinparecedependerdeltipodeestmulotxicoydeltipocelularestudiado,engeneralseobservaun incremento de los receptores A1 de adenosina y de algunos subtipos de receptores mGlu en los modelos empleados, lo que justificara su papel neuroprotector. Por su parte, la alteracin del receptor A2A parece contribuiralefectoexcitotxicooneurotxicodelosmodelosensayados.Encualquiercaso,lasmodulaciones observadaspodrancontribuiraldiseodenuevasestrategiasdiagnsticasyteraputicasquetenganadichos receptorescomodianas.

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Nota del Autor


araloscuriosos:s,estossonlosagradecimientos.

Lo primero es lo primero, una disculpa para todos aquellos a los que me dejo en el tintero, ahora convertidoenteclado.Estarabuenoquecupieratodalagentequemeheayudadoalolargodeestoscuatro ltimosaosdecaminoenunpardefolios,noobstante,sinoaparecisenestosagradecimientosycreisque debaisestar,laculpaessloma,demimalamemoriaodemiingratitud,aunqueyoselaatribuiraalgn errorinformtico,queporlovistoestndemodaltimamente.Adems,pidodisculpasalosquesaparecen pero por causa de mi torpeza empleando la lengua de Cervantes no he sabido plasmar en palabras mis sentimientos, es que se me ha quedado metido en la cabeza lo de que el glutamato es el principal neurotransmisorexcitadorenelSNCyyanomesaleotracosa. Unavezdichoesto,unagradecimientoespecialalospadresdelacriatura,lacientficamerefiero,los otrosvendrnmsadelante.MairenayJosLuisoshabisportadoestupendamenteconmigoyhasidoparam unautnticoplacerhaberestadoviniendoatrabajarduranteestoscuatroaosallaboratorio.Realmenteme habis facilitado bastante las cosas hacindome sentir muy cmodo en un negocio en el que,pordesgracia, que tus jefes te traten como a un colega es ms raro que acertar una quiniela con 15. Adems del trato personal,quisieraagradeceroslaconfianzaquemostrasteisenmicuandonosembarcamosenestaaventura cientficasinconocernosdenada.DentrodeesteagradecimientoquisieraincluiraFlixJaln,quenospusoen contactopermitindomevolveraCiudadReal. A mis compaeros de laboratorio, menuda suerte he tenido con vosotros! A todos en general os agradezco la paciencia que tenis conmigo, porque aguantarme as tan de seguido, fcil, lo que es fcil, no tienequeser,no.AlosveteranosDavid,MngelesyMacu,graciasporensearmeesospequeostrucossin los que la ciencia no tendra sentido, principalmente porque no saldra ningn experimento, y, sobre todo, graciasporvuestraamistadyapoyo.AlosnuevosInma,Antonio,Dvide,Goffredo,MaryCandelas,graciaspor vuestracompaatantoenlosmomentosbuenoscomoenlosmalosporquetrabajarenellaboratorionoest reido con pasrselo bien en el laboratorio. A Sergio y a su paciencia infinita para aguantarnos a todos nosotros,tsquetieneselcieloganadoamigo.UnamencinespecialenesteapartadomerecenMngeles, quemehaenseadotodoloquesacercadelaobtencindecultivosprimarios,eInma,quemehaenseado el lado oscuro de la fuerza en lo que a cuestiones de microscopa se refiere, no s si me explico. Independientementedeloquehayapodidoaprenderdecadaunodevosotrosmesientomuyafortunadode haberosconocidoyhaberpodidocompartirunaetapaimportantedemividaconvosotros,lafuerzasiempre estarconvosotros(dios,quganastenadeescribirlo). Tambin quiero mencionar a todas las personas que han pasado por el laboratorio estos aos, independientementedelgrupoenelquehayantrabajado,porquelaverdadseadicha,nosqutendreste laboratorio que atrae a la buena gente. A Charo y a Ral Tamarillas os agradezco especialmente vuestra amistadylaoportunidadquemebrindasteisdecambiarelmundodelacienciaporelmundodeltoreo(enqu

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estarayopensandoparanoaprovecharla)yosdeseolomejorsiempre.AAgnes,Aurora,AlejandroyCristina osagradezcolosbuenosmomentoscompartidosylobuenoscompaerosquehabissidoconmigo.Dentrode esteapartadoquisieraaadiraldoGomaespuma,quemehaacompaadoenlarealizacindeunoscuantos cultivos primarios aunque, segn creo, ellos ni se lo imaginaban, y a Forges, que me ha prestado su ingenio para la contraportada alternativa y siempre que puede nos echa una mano a los becarios. Por ltimo, un agradecimientoespecialatodalagentenorelacionadadirectamenteconellaboratorioquehacequelascosas funcionen como es debido, sobre todo para Teresa, Mara y Mamen, personas excelentes a quienes adems aprecioenormemente. AmiscompaerosdecarreraqumicaAmparo,MJess,Bea,Puri,Isabel,JosRamnyMarisaquisiera agradeceros los buenos momentos compartidos y el poder seguir contando con vuestra amistad. A Antonio ManuelyAbelnotengopalabrasparaagradeceroslobienquemelohacaispasarenlabiblioteca,conamigos como vosotros ya podran durar las carreras 15 aos que no se iban a hacer largas. Por cierto Antonio ah queda eso: Cascoporro, la pelota est ahora en tu tejado, t ya me entiendes. De mi aventura madrilea merecetodamigratitudPaulalasHeras,odelasHeras,ocmosea,tmeayudasteenmomentosdondeslo habaoscuridadamialrededoryatuconstanteapoyoledebohoyserlicenciadoenBioqumica,realmenteno temerecesmsquelomejor. AdemsdeunaplacahonorficaenlaUniversidad,portodoeldineroquesehangastadoenmatrculas, semerecenunamencinespecialmisamigosToms,Toni,Pedro,JosAntonio,HelenayRubn,vosotrosle daissentidoalapalabraamistadtalycomoyolaentiendo,aunqueestisunpocoobsesionadosconlaideade tener que cerrar todos los bares a los que vamos (que conste que Helena no entra en el comentario de las matrculas,ahora,enlodelosbaresquenadiepiensequesequedaatrs).AToms,quenosconocimospor cuestionesalfabticasperoaquienyoconsideropartedemipropiafamilia,leagradezcoespecialmenteesta amistadysuapoyoincondicionalenmomentosmuydifcilesparami,aunquecreoquelaamistadnosepuede agradecer,perotampocomevoyaponerafilosofaraqu,esperoquesitmenecesitasalgndapuedaestara tualtura. Cmo no agradecer a las personas que convivieron conmigo el primer ao que me march de casa Pedro, Rober, Chorr y Feli y empezaron a hacer de Ciudad Real, ms que el sitio donde pasaba la semana estudiando, mi segundo hogar. Tambin a mi compaero de piso en Madrid, Baldomero, le debo haber conservadomicorduratotalmenteintacta. Deentretodoslosprofesoresquemehanidoenseandoalolargodeestosaos(cuidado,hayotrosde losqueesmejornihablar)quisieradestacarlalabordealgunosdeellosquerecuerdoconespecialcariocomo son D. Jos Luis Malagn, que me tena mucho cario, y Da. Puri, que tambin me lo tena pero no lo demostraba,aunqueahoraslohace.ACarmenGarroteyaDavidAronalesagradezcoquemeensearanque serbuenonoessuficiente,lodifcilesalcanzarlaperfeccin,nopensisquesemehaolvidado,esunprecepto quemeaplicoadiario.APilarPrietoletengoqueagradecerelamorquetransmiteporlaqumica,avecestan

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ridaydesagradecida,ademsdequeeresunaprofesoracomolacopadeunpino,desdeluegolamejorque yohetenidoenlaFacultad,eresmejorpersonatodavayhasidoparamunplacersertualumno. Le he estado dando algunas vueltas al hecho de desquitarme aqu con algunas personas, los que me conocenyasabenloaficionadoquesoyalaslistasnegrasytodoelrolloese.Elcasoesque,llegadosaeste punto,nossiesquemeestoyvolviendoblandoconlaedad,meparecequetambindeberaenciertomodo, desdeluegoagradecerno,perosmencionaraaquellaspersonasquealgunavezmehanclavadounpualpor laespalda,entreelcuartoyelquintoespaciointercostal,porquehanhechodemiunapersonamsfuertey me han obligado a sobreponerme a la adversidad. Qu tal Alberto? Pues nada, aqu sangrando, como me acabas de acuchillar y eso. Slo hay una excepcin a esta afirmacin, llammosle I, contigo s que no paso pginaamigo,esms,mereservoelderechodeescribirenunfuturounanovelanegrayahtevasaenterarde loqueesbueno. Slomequedaagradeceramifamiliatodoelcarioyelapoyoquemehandado(porfinescriboapoyo sinquesalteelcorrectorortogrfico),aunquesetratedeunamencincolectivaquisieramencionardeforma especficaaalgunaspersonas.Muyespecialmenteamispadres,aPolo,quemeenseahacerlascosascon ternuraperocon(lodeconternuranomeloenseastet,peronotepreocupesquelasegundapartelasigo arajatabla),yalaLola,quesimehubieraohubiesehechoyonquideprofesinnomehabradadoungramo menosdecario.Avosotrosdososdebotodoloquesoyydifcilmenteoslopuedoagradecerconpalabras, estoesslounmalintento.AmihermanaMara,aquienquieromuchomsdeloquesdemostrarleaunque megustarasaberhacerlo,ledeseotodolomejor,yoestoyconvencidodequepuedesconseguirtodoloque quieras,perotetienesquedarcuentat,hastaquelohagas(queparecequevaallevaruntiempo)metienes para lo que quieras. A mis abuelos Numancia, Juliana, Juan y Vicenta, que a estos s que les toc vivir en tiemposdifcilesytodavatuvierontiempoyfuerzaparaformarsuspropiasfamiliasysacarlasadelantey,todo ello,sinrenunciarasusidealesloque,losquevinimosdetrsnosabemosagradecerlosuficiente.Megustara haceresteagradecimientomspatenteenelcasodeJuanyVicenta,quemecriaroncomosucuartohijoyas mesiguierontratandoelrestodemivida.Alresto,muchasgraciasatodos. Porltimo,slomequedaagradecerelapoyoyayudademipequeafamilieja.AKimi,quemehavisto escribirestetochazocasisinparpadear,principalmenteporquesetirabael90%deltiemporoncandocomoun oso,ymehadadomscarioensuaodevidaquemuchoshumanosenloquellevodelama.YaGema,por tantasytantascosasquetendraqueescribirotras281pginasmsparapoderagradecrtelotodo,quenoes pornoescribirlas,quesabesquesihayqueescribirlasseescriben,perovendranadecirquemehacemuyfeliz quecompartastuvidaconmigoymeapoyesentodo,sobretodoenelrolloestedelaCiencia,queyoentiendo queparalosajenosalnegocioestaspasionessondifcilesdeentender.

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