FACULTAD DE INGENIERA CIVIL Y AMBIENTAL PRCTICA DE TOXICOLOGA TEMA: BIOENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON ALLIUM CEPA L (CEBOLLA) MEDIANTE

LA EVALU ACIN DE LA INHIBICIN DEL CRECIMIENTO PROMEDIO DE RACES. 1.- OBJETIVOS: Evaluar los efectos fitotxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el p roceso de crecimiento de las races de cebolla (allium cepa L) en un perodo de prue ba de 96 horas . 2.- TEORA: Cuando un bulbo de cebolla (Allium sp) se rehidrata, se produce una estimulacin d el crecimiento de las clulas, lo cual permite la elongacin de las races de la plant a. Sin embargo, cuando la hidratacin se lleva a cabo en presencia de sustancias tx icas, la divisin celular de los meristemas radiculares puede inhibirse, ya sea re tardando el proceso de mitosis o destruyendo las clulas. Este tipo de alteracione s generalmente impide el crecimiento normal de la raz y, por tanto, su elongacin ( Fis esj, 1985, 1993, 1997). El efecto puede determinarse en forma indirecta, mediante la comparacin de la elo ngacin de las races de cebollas expuestas al txico con las de cebollas no expuestas , luego de un periodo de 72 h de prueba. La cuantificacin del efecto se realiza e stableciendo el porcentaje de inhibicin del crecimiento de las races respecto a la longitud promedio de las races del control. 3.- MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS: Materiales 1. 1 Bistur. 2. 5 vasos de precipitacin de 100 ml. 3. 1 Pipeta de 10 ml 4. 1 Probeta de 25 ml. Equipos 1. Plancha de agitacin Reactivos 1. Solucin de dicromato de potasio 5 M. 2. Agua dura. 3. 4. Agua destilada. 72 bulbos de cebolla.

4.- PROCEDIMIENTO: 1. Seleccin de los individuos de prueba Para la elaboracin de las pruebas se deben seleccionar bulbos de Allium sp (cebol la amarilla) de 1,5 cm de dimetro, secos y sin formacin de hojas y/o raz. Pueden se r obtenidos del mercado local o adquiridos a travs de algn proveedor. Previo al montaje de la prueba, los bulbos deben limpiarse eliminando la epiderm is seca y removiendo, con un bistur o instrumento punzante, los restos de tejido y races del rea radicular (Ilustracin N1). No se deben daar las races primordiales. Co n el fin de eliminar los restos de tejidos es conveniente colocar los bulbos en agua destilada por dos horas y secar. Ilustracin 1 Esquema de los pasos a seguir para la realizacin de la prueba. 1) Lim pieza y pelado de bulbos. 2) Ubicacin de los bulbos en tubos de ensayo 3) Colocac in de tubos en soporte. 4) Colocacin de las soluciones. 5) Medicin. 2. Elaboracin del El medio de crecimiento Tabla N 1. La solucin ces con agua destilada, Medio De Crecimiento utilizado para el desarrollo del ensayo se indica en la madre preparada de acuerdo con lo indicado se diluye diez ve y el pH se ajusta a siete antes de utilizar.

Tabla 1 Medio de crecimiento para Allium. Masa de sal para disolver en un litro de agua destilada Reactivo mg Ca (NO3)24H2O 236,1 KNO3 202 MgSO47H2O 246 KH2PO4 136,1 Fe EDTA3H2O 67,6 Elementos traza Reactivo mg MnSO4 0,55(*) CuCl2 0,0645(*) NaMnO4 0,001(*) ZnSO4 0,0007(*) H3BO3 0,23(*) (*) Los componentes correspondientes a elementos traza deben ser adicionados a p artir de una solucin stoc Tambin se puede utilizar agua dura o agua de la llave como medio de crecimiento. En el caso de usar cualquiera de estas opciones el control negativo y el agua ut ilizada para preparar las diluciones de los compuestos qumicos o las muestras deb er ser la misma. 3. Almacenamiento de los bulbos de cebolla Se recomienda adquirir los bulbos en vsperas de la realizacin de pruebas o en su d efecto, almacenarlos en un lugar donde se puedan garantizar condiciones secas, y una temperatura entre 10 y 20 C. En algunas regiones, los bulbos pueden mantener se almacenados hasta por un ao, sin embargo, en zonas geogrficas donde la temperat ura y humedad son altas, el almacenamiento est limitado a unos pocos das. 4. Preparacin de diluciones Generalmente se sugiere el empleo de una serie de cinco concentraciones, dos o t res controles positivos y un control negativo. Para su preparacin se emplea el mto do de dilucin en forma secuencial aplicando un factor de 0,2 o 0,3. Cuando se va a llevar a cabo una evaluacin presuntiva puede emplearse una serie d e diluciones logartmicas, por ejemplo: 100; 10; 1; 0,1; 0,01, etctera, lo cual per mitir establecer el intervalo de concentracin conveniente para la determinacin de l a concentracin inhibitoria media (CI50). Se recomienda igualmente utilizar agua dura para el control negativo, as como par a la preparacin de las diluciones de la muestra y la preparacin del control positi vo con el txico de referencia. 5. Ensayo de toxicidad Cuando se trabaja con bulbos de dimetro pequeo, las pruebas se realizan en tubos d e ensayo de 10 cm de longitud x 1,5 cm de ancho; en el caso de bulbos de mayor d imetro pueden utilizarse tubos o recipientes de mayor volumen, dependiendo del ta mao de los mismos. Es importante destacar que la profundidad de los recipientes d ebe ser tal que, al trmino de la prueba, la elongacin mxima no alcance el fondo del recipiente. En la prueba se utilizan cinco concentraciones de la muestra, un control negativ o, y uno o dos controles positivos, cada una con doce rplicas. El ensayo se inici a con el llenado de los tubos con cada una de las diluciones y controles; este l lenado deber hacerse hasta el borde del tubo. A continuacin se colocan los bulbos limpios sobre la boca del tubo, cuidando que la zona radicular quede inmersa en el lquido. Los tubos se colocan en una gradilla, la cual se localiza sobre una mesa que no presente vibraciones y se mantienen a temperatura ambiente (20 C) por un periodo de 96 horas. Debe evitarse la iluminacin directa. Dos veces al da durante el periodo de prueba se debe restablecer el volumen perdi do por evaporacin o absorcin. Para restablecer este volumen se utiliza la muestra o dilucin correspondiente. Se recomienda inclinar el bulbo sin sacar las races del tubo, adicionando cuidadosamente el volumen con ayuda de una pipeta Pasteur. En la ilustracin N 2 se resumen las condiciones de prueba y en la tabla N 2 se obse

rvan los parmetros de realizacin del ensayo. Tabla 2. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad c on Allium cepa L. PARMETROS VALOR Tipo de ensayo Esttico Temperatura 20 C; ambiente Calidad de luz Fluorescente, blanco-frio Iluminacin Indirecta Recipientes Tubos de ensayo de 10 1,5 cm de dimetro Nmero de rplicas 12 Material biolgico Bulbos de aproximadamente 1,5 cm de dimetro Condicin de los bulbos Pelar los bulbos y la base, evitar daar el anillo radicul ar Agua de dilucin Agua de la Ilave O canilla O medio de crecimiento Nmero de concentraciones Cinco Duracin de la prueba 72 h Efecto medido Inhibicin de crecimiento de las races Control negativo Agua de la Ilave o medio de crecimiento Control positivo Agua dura Resultado final CI50 Ilustracin 2 Ensayo de toxicidad con Allium cepa L. 5.- EXPRESIN DE RESULTADOS Al trmino del periodo de exposicin se registra la longitud promedio de las races, l a cual se lleva a cabo con ayuda de una regla comn con escala en milmetros (Ilustr acin N 3). La medicin se lleva a cabo colocando la escala en el margen del tubo; se ubica el valor de longitud mnimo y mximo donde incide la mayora de las races y el p unto medio se define como el promedio. Se efecta la estimacin en cada tubo y se ob tiene el promedio matemtico de diez rplicas (los dos valores ms extremos se descart an). Ilustracin 3 Elongacin de las races de bulbos de cebolla despus de un proceso de hid ratacin. Para obtener el porcentaje de efecto de inhibicin se debe realizar la siguiente o peracin: (Longitud del controlLongitud de la muestra) x 100/longitud del control Con estos valores se construye una grfica de concentracin en funcin del porcentaje de inhibicin y se calcula la CI50 mediante cualquiera de los siguientes mtodos: Pr obit, promedios mviles o Sperman & Karber (Consultar bibliografa sobre "Mtodos esta dsticos para el anlisis de resultados de toxicidad"). 6. REFERENCIAS Fis esj, G, 1985, The Allium Test as Standard in Environmental Monitoring, Heredita s, pp.102; 99-12. Fis esj, G., 1993, "The Allium Test in Wastewater Monitoring". Env. Toxicol. Wat. Qual., pp. 8; 291-298. Fis esj, G., 1997, "Allium Test for Screening Chemicals; Evaluation of Cytologica l Parameters", in: Plants for Environmental Studies, Wancheng.