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EL PAPEL DE LOS TLR EN LA ACTIVACIN DE NEUTRFILOS Los neutrfilos son importantes clulas inmunitarias efectoras innatas que son

rpidamente reclutados a los sitios de infeccin e inflamacin para proporcionar defensa temprana contra microorganismos invasivos. Esta funcin es facilitada por la expresin de los miembros de la familia de receptores Toll-like (TLR) para neutrfilos, permitiendo el reconocimiento de un amplio repertorio de patrones moleculares asociados a patgenos (pmap) y provocando as la respuesta a patgenos invasores. La activacin de los TLR conduce a importantes procesos celulares, incluyendo la generacin de especies reactivas de oxgeno, produccin de citoquinas y aumento de la supervivencia, todos los cuales pueden contribuir a la patognesis de la inflamacin crnica cuando la sealizacin se desequilibra. A su vez, la inflamacin y las lesiones de tejido resultan de la liberacin de ligandos TLR endgenos, conocidos como daos de patrones moleculares asociados (DAMPs), que son una creciente clase de estmulo potente inflamatorio. DAMPs acta en una forma autocrina, alertando al anfitrin de daos, pero tambin puede amplificar la inflamacin que conduce a ms daos en el tejido. Esta revisin destaca la literatura reciente sobre TLR de neutrfilos en la funcin y regulacin durante la enfermedad, y ofrece una visin general de la zona emergente reciente de neutrfilos a respuestas a las humedades. Introduccin La nflamacin neutroflica es un componente crucial de nuestra respuesta antimicrobiana, sin embargo, el potencial de esta respuesta inflamatoria puede conducir a dao tisular local y aun ms la inflamacin tambin est bien descrito [1]. Es producido en alrededor de 108 clulas / min y representa aproximadamente 70% de la circulacin de glbulos blancos, los neutrfilos representan nuestras 'unidades de respuesta rpida' frente a la infeccin. Una parte apical de esta respuesta es la deteccin de invasin de microbios a travs de patrones moleculares asociados a patgenos (pmap) por receptores Toll-like (TLRs), que decodifican la

amenaza (bacterias Gram-positivas o negativas, virus, hongos) y adaptan la respuesta antimicrobiana requerida. Los neutrfilos expresan la mayora de los miembros de la familia TLR, carecen de los receptores intracelulares, TLR3 y TLR7. Dado que los neutrfilos defienden principalmente de bacterias, los TLRs situados en la superficie celular que son los ms estudiados en biologa neutrfila de TLR; sin embargo, los TLRs intracelulares tambin pueden jugar papeles importantes en las respuestas del patgenos. Tambin ganando la atencin es la capacidad de TLRs para detectar molculas endgenas llamadas daos asociados patrones moleculares (DAMPS), que son producidos por clulas en respuesta a la lesin o infeccin. Esta revisin tiene como objetivo resaltar la literatura reciente (por lo tanto, en algunas circunstancias crticas ocupar el lugar de las referencias originales) en funcin TLR de neutrfilos y regulacin durante la enfermedad y proporcionar una visin general de la respuesta de los neutrfilos a los DAMPs. De los TLRs de la superficie celular los TLR2 y TLR4 son los ms estudiados de todos los receptores de neutrfilos, mediando la respuesta a Gram-positiva y bacterias Gram-negativas respectivamente. El TLR2 heterodimerizado con TLR1 es para detectar pptidos o triacilados, los TLR6 para detectar pptidos diacilados, mientras que TLR4 reconoce el componente lpido A del lipopolisacrido (LPS) [2]. Los neutrfilos tambin expresan co-receptores de TLR, incluyendo CD14 y CD11b/CD18 [3], que cooperan con TLR4 o TLR2 en la membrana plasmtica [4,5]. Finalmente, TLR5 reconoce flagelina bacteriana [6]. La ligacin de los TLRs de la superficie celular ha demostrado que tienen efectos mltiples y de gran alcance sobre los neutrfilos, Un elemento particularmente crtico de la funcin de los neutrfilo es la regulacin de la vida til del neutrfilo. Los neutrfilos son clulas de corta vida y consecutivamente mueren por apoptosis, un mecanismo antinamatorio de la eliminacin de las clulas. La inhibicin de apoptosis de neutrfilos, por ejemplo, en el sitio de la infeccin, permite que estas clulas permanezcan funcionalmente competentes; sin embargo, esto tambin puede conducir la liberacin de contenidos toxicos de las

clulas y en ltima instancia, a la inflamacin y lesin tisular. Incluso antes de su reconocimiento como un ligando TLR4, LPS fue descrito como un mediador de supervivencia de los neutrfilos [8,9]. Hemos demostrado que de hecho LPS ejerce un efecto de supervivencia temprano (4 h) pero es un factor de pobre supervivencia en momentos finales (22 h), y proporcionado evidencia que anteriores observaciones pertenecientes a LPS como factor clave de supervivencia neutrfila pueden haber sido, en parte, debido a los efectos indirectos sobre clulas monocticas presentes en cultivos de neutrfilos [3,10]. Esto puede representar un mecanismo de proteccin que impide la generacin de larga vida de poblaciones de neutrfilos altamente activados sino que tambin proporciona una funcin de monocitos / macrfagos en la regulacin de la inflamacin. Adems, hemos demostrado que TLR4 y los componentes de sealizacin MyD88 y TIR de dominio que contienen adaptador de induccin de interfern-b (TRIF) (vase seccin 'sealizacin de TLR') son necesarios para la supervivencia temprana de neutrfilos, lo que indica que la sealizacin consiste en dos ramas de la va TLR4 [11]. En apoyo de esto, bloqueo anticuerpos por TLR4 fueron eficaces en la reversin de supervivencia de neutrfilos inducida por enfermedad pulmonar obstructiva crnica (EPOC) fluido lavado bronquial (BAL) in vitro [12]. Esta sugiere que el aumento de la esperanza de vida de los neutrfilos observado en los pulmones de pacientes con EPOC puede ser en parte, mediada por agonistas de TLR4 . TLRs intracelulares Los TLRs intracelulares Los TLRs intracelulares estn relacionadas principalmente con la deteccin de ARN y ADN patgenos dentro del endolisosoma. TLR3 detecta ARN de doble cadena, TLR7 y TLR8 reconocen ARN viral monocatenario (ss) mientras que TLR9 detecta dinucletidos CpG no metilados en ADN bacteriano [2]. Los neutrfilos responden a ligandos de TLR8 y TLR9, pero no responden a los activadores de TLR3 o TLR7 [13,14,15*]. Los agonistas del ARN viral monocatenario actuando a

travs de TLR8 han demostrado inhibir la apoptosis de neutrfilos humanos [16], estimular la generacin de citocinas [17,18], inducir ROS y degranulacin [14] y principal para la biosntesis de mediador lipdico inflamatorio [13]. Los neutrfilos tambin constitutivamente expresan otros receptores de reconocimiento de patrnes antivirales intracelulares incluyendo gen-I acidinducible retinoico (RIG-I) y melanoma de diferenciacin asociados a protena 5 (MDA-5), que detectan la presencia de ARNds [15]*. El ADN bacteriano activa neutrfilos a travs de TLR9, para mejorar la funcin fagoctica, causando la regualacin de molculas de adhesin, generacin de citocinas (predominantemente interleucina (IL) -8 pero tambin IL-6 y tumor necrosis factor-a (TNFa)), y sntesis de especies (RNS) de nitrgeno reactivo y supresin de la apoptosis de neutrfilos (revisado exhaustivamente en [19]). Sealizacin de TLR Dadas las limitaciones de estudiar vas intracelulares en neutrfilos humanos primarios, las vas de sealizacin de TLR complejas han sido ampliamente estudiadas en otras clulas y son objeto de muchos elegantes comentarios (por ejemplo [2]). En resumen, la iniciacin de la sealizacin a travs de la dimerizacin de enlace/receptor ligando es seguida por reclutamiento de adaptador, que divide aproximadamente a la sealizacin de TLR en dos vas distintas. La va dependiente de MyD88 es utilizado por todos los TLRs, con la excepcin de TLR3, y conduce a la activacin de la interleucina-1 receptor cinasa asociada (IRAK) de la familia de las cinasas y posteriormente el factor receptor asociado de TNF (TRAF6) y TRAF3. La sealizacin de TLR2 y la sealizacin TLR4 adems requieren el dominio de receptor (TIR) adaptador de peaje-Interleucina-1 transitorio que contienen protenas del adaptador (TIRAP) de MyD88 (Mal) para enlazar los receptores con MyD88. La va TRIF-dependiente es utilizada por TLR3 y TLR4 a travs de la molcula de TRIF relacionados con molcula adaptadora (TRAM), y conduce directamente a la activacin de TRAF3 y TRAF6. Ambas vas son el resultado final en la translocacin nuclear de uno o ms factores de transcripcin (factor predominantemente nuclear

(NF)-kB, las cinasas de protena activada por mitgeno (MAP) y los factores reguladores de interfern). La activacin del factor de transcripcin conduce a la expresin de protenas efectoras, en particular citocinas y quimiocinas. Aunque hay mucha coincidencia entre la va de sealizacin, diferentes ligandos desencadenan mltiples vas en diferentes tipos de clulas que permiten una respuesta celular altamente personalizada. La funcin de un nmero de estos miembros de itinerario dentro de la sealizacin del neutrfilo se ha confirmado utilizando de origen natural o generado por laboratorio el gen knockouts. Por ejemplo, los principales neutrfilos humanos de individuos con un deciencia de IRAK4 autosmica recesiva han proporcionado informacin sobre el papel de esta cinasa en la generacin de ROS, la quimiotaxis y la fagocitosis [20,21!!, 22]. IRAK4 es una parte central de las bacterias para matar el programa en los sistemas humanos, jugando un papel clave en la defensa inmune contra importantes organismos piognicos, particularmente Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa [23,24]. Van Bruggen et al. mostraron que IRAK4 es requerido para todas las respuestas TLR con la excepcin deTLR9, aunque curiosamente, IRAK4 es deficiente en neutrfilos no se altera en su capacidad para matar S. aureus, P. aeruginosa o Candida albicans, lo que sugiere que el mecanismo de muerte de neutrfilos es independiente de TLRs /IRAK4 en sistemas de clulas individuales [25*, 26], aunque in vivo, la activacin de TLR directa o indirectamente, todava puede ser supocin de que contribuyen a la eficacia de las respuestas de neutrfilos a estos patgenos. Los neutrfilos tomadas de IRAK4 o TRIF de ratones deficientes muestran que IRAK4, pero no TRIF, es crucial para la exocitosis de los orgnulos secretores de neutrfilos en respuesta a LPS [27]. Ratones deficientes de MyD88 o TRIF ratones deficientes papel fundamental de los adaptadores tambin han proporcionado evidencia para el papel fundamental de estos adaptadores en matar bacterias; en modelos de infeccin, ambas cepas de ratn knockout mostraban deterioro de supervivencia y reducida remocin bacteriana, inammacin de las vas respiratorias y citocinas en mayor expresin

[28]. Anteriormente hemos descrito la importancia de redes dependientes de citocinas entre residentes de tejido y clulas mononucleares en la regulacin de reclutamiento de neutrfilos y su funcin [30,31]. As, parece factible que la falta de MyD88 en no neutrfilos (clulas epiteliales, monocitos) resultar de respuestas patgenas reducidas, la sealizacin inflamatoria y la produccin de IL-8 de estas clulas, lo que tendr consecuencias signicativo para el reclutamiento de neutrfilos. TLR de neutrfilos y la enfermedad. Se sabe mucho sobre los cambios funcionales de los neutrfilos despus de la ligadura de TLR por agonistas sintticos o componentes patgenos [3, 32/37] y la investigacin en esta rea contina describir abrumadoramente los efectos proinamatorios de los agonistas de TLR. Ms recientemente una gran cantidad de investigacines se han centrado en los efectos de la activacin de TLR por entero patgeno. Se ha descrito la regulacin directa y selectiva de la expresin de TLR neutrfilos y activacin por todas las tres clases de agentes patgenos (bacterias, hongos, virus). Por ejemplo, la bacteria gramnegativa Helicobacter pylori mejora la expresin de TLR2 y TLR4 en la superficie de los neutrfilos humanos y bloqueo de estos receptores inhibe la produccin de H. pylori inducida por IL-8 e IL-10 y las citocinas proinflamatorias y antiinamatorias respectivamente [38]. El impacto recproco de la regulacin de la expresin de TLR y la produccin posterior de citocinas sobre la infeccin por H. pylori an no ha sido descrita. El hongo Paracoccidioides brasiliensis tambin aumenta la expresin superficial de TLR2 en los neutrfilos pero bajoregula la expresin de TLR4 [39]. Curiosamente P. brasiliensis utiliza TLR4 en lugar de TLR2 para obtener acceso a los neutrfilos humanos [39], lo cual sugiere que la regulacin de la expresin de los TLR es una respuesta del husped a la infeccin en lugar de un objetivo directo del patgeno. El bloqueo de TLR, particularmente TLR4, ha demostrado inhibir parcialmente la produccin neutrfila de IL-8 e IL-10 en respuesta a la infeccin de p. brasiliensis [39]. Adems, IL-8 ha demostrado

estar involucrado en retrasar la muerte de las clulas neutrfilas despues de la infeccin por p. brasiliensis pora mediar un efecto anti-apoptticos y permitiendo que el hongo persista intracelularmente, sugiriendo que los TLRs puedan ser utilizados por el hongo para garantizar su propia multiplicacin [39]. TLR4 tambin es un bajoregulador en sangre perifrica y los neutrfilos BAL aisladas de nios con virus respiratorio sincitial (RSV) bronquiolitis se compararon con los controles [40]. TLR4 reconoce RSV mediante su protena de fusin superficial (F) [41]. Los datos presentados en forma de resumen indican que se han detectado que dentro de los neutrfilos se indica infeccin activa de estas clulas [40,42] unidas a protenas sanguineas de RSV, BAL de neutrfilos y los cidos nucleicos virales. Sin embargo, la consecuencia de la regulacin de los TLR neutrfilos durante la bronquiolitis es desconocida por RSV. Es claro que de los estudios anteriores quedan muchas preguntas sobre la importancia de la regulacin de la expresin superficial de los TLR en neutrfilos en respuesta a estmulos patgenos. Por ejemplo, se piensa que TLR4 permanece funcional incluso a niveles de expresin de superficie extremadamente bajo, por ejemplo unos cien o menos receptores por clula en clulas dendrticas inmaduras [43], por lo que la importancia funcional de los niveles de expresin del receptor estimulada o bajoregulada puede ser modesta. Otros factores a considerar son la capacidad de los agonistas de TLR para preparar o tolerar la funcin de los neutrfilos. La preparacin del neutrfilo puede mejorar su capacidad para el vivir en los tejidos, prolongar la esperanza de vida y la capacidad funcional en el sitio de la infeccin y causar un aumento dramtico en la respuesta de estas clulas a un agente alternativo de activacin [44]. Se ha reportado aumento de la expresin de marcadores asociados al preaparado en neutrfilos de la sangre perifrica durante las exacerbaciones graves de la EPOC, probablemente debido a los acontecimientos de los eventos inflamtorios locales, y disminuye la expresin de estos marcadores tras el tratamiento [45,46]. Recientemente se ha informado de que la expresin de TLR4 (pero no TLR2) es hasta regulada en la infiltracin de neutrfilos detectadas en el BAL de pacientes con EPOC [12]. Adems, el

bloqueo TLR4 aument la apoptosis de neutrfilos, sugiriendo un papel para TLR4 y potencialmente preparado, en mejorar la vida del neutrfilo durante la enfermedad [12]. Sin embargo, la exposicin previa a los ligandos TLR tambin puede causar tolerancia, un estado transitorio de refractariedad subsecuente al cambio, que por un lado puede proteger contra la hiperaactivacin , pero tambin puede procesar el anfitrin susceptible a infecciones posteriores (revisadas en [47]). Se ha reportado tolerancia neutrfila a LPS in vitro, y mientras esto se asoci con disminucin de la expresin de TLR4 en la superficie celular es importante tener en cuenta que una parlisis global de la funcin de los neutrfilo no ocurri [48]. Adems la expresin de TLR4 comparable es reportado en monocitos normales y LPS tolerante [49]. As, mientras que la expresin de TLR ha demostrado estar alterado durante una gama de enfermedades [40, 50/53], las implicaciones de esta regulacin requiere ms claricacin. DAMPs y activacin de neutrfila Los TLRs tambin pueden detectar molculas endgenas denominadas DAMPS, que se producen a partir de tejido o clulas inmunes en respuesta a la lesin o infeccin (tabla 1). Adems de iniciar respuestas protectoras, los DAMPs han sido implicados en la patogenia de las infecciones agudas como sepsis [54] y trastornos inamatorios crnicos tales como enfermedad pulmonar [55,56] y [57/59] artritis reumatoide. El primer concepto de DAMPs sali con la identication de la protena de shock trmico 60 (HSP60) como un ligando de TLR4 [60]. Ahora hay muchos DAMPs conocidos para activar TLR2 y TLR4, incluyendo otros HSP y componentes de ECM, por ejemplo el cido hialurnico (HA) y el sulfato de heparina (elegantemente revisado en [61]**), aunque no est claro en que medida la contaminacin microbiana juega un papel en algunas de estas observaciones [62]. Otros TLRs tambin se han asignado ligandos DAMP: TLR1/2 para b-defensina-3 [63] y los TLRs virales (TLR3, TLR7 y TLR8) para la deteccin de cidos nucleicos de seleccion [61]**. Este fenmeno puede ser particularmente importante para los neutrfilos, que a pesar de su papel bien definido, como las

clulas inmunes, son reclutados y se activan en la inflamacin estril y de hecho han sido demostrado Tabal 1

que TLR4 desempean un papel regulador negativo a la sealizacin de HA, donde el reclutamiento de

El efecto funcional de DAMPS en el recuento de neutrfilos. DAMP/TLR HMGB1/TLR2-4 Fuente de DAMP clulas lesionadas efecto funcional sobre las neutrfilos in vitro: la generacin de ROS, Bcl-xl regulacin positiva, pro-inflamatorias la produccin de citocinas Refs

ser activados en respuesta a DAMPS. La protena

neutrfilos y la inflamacin estn elevados en TLR4 "/" despus de la administracin intra-traqueal de AH en ratones [71,72*]. Adems, las ratas

nuclear y de alta movilidad del grupo de protenas B1 (HMGB1), un activador de TLR2 / 4 que es ya sea de forma activa o pasivamente liberada por las clulas lesionadas, conduce a NADPH a la asamblea de la oxidasa y la generacin de ROS [64], aumentando la protena anti-apopttica Bcl-xl [65] y la produccin de citocinas proinflamatorias [66]. Estudios in vivo apoyan sto mostrando funcin intraperitoneal e intratraqueal en que la entrega de HMGB1 conduce a la acumulacin de neutrfilos y un anticuerpo bloqueante de HMGB1 reduce el nmero de neutrfilos en un modelo de pulmn inducida por lesin por LPS [67-69]. De nuevo es probable que estos efectos sobre el reclutamiento de neutrfilos son al menos parcialmente indirectos y reflejan un papel en las clulas del tejido residente (clulas epiteliales, macrfagos de tejido) en la inamacin mediada por HMGB1 en este contexto. Efectos similares se observan con el activador de TLR2/4 HA, en modelos de sepsis en ratas, aunque la naturaleza del efecto depende del peso molecular de las especies HA [70]. De inters, se ha demostrado

sometidas a una lesin pulmonar por inhalacin de humo o inducido por la sepsis mostr infiltracin de neutrfilos menor en el pulmn y la mejora de la supervivencia cuando se pretrataban con HA de alto peso molecular, lo que sugiere HA puede tener un papel protector en la inflamacin [73,74]. S100A8 y S100A9 son protenas de unin a calcio que estn involucrados en un nmero de procesos celulares y se liberan en abundancia por los fagocitos durante la inflamacin. Como ligandos de TLR4 [75], S100A8/A9 han demostrado activar neutrfilos in vitro, lo que conduce a la degranulacin no slo a travs de cinasas MAP [76], sino tambin la regulacin negativa de la generacin de ROS [77]. Estudios in vivo demuestran un papel para S100A8/A9 en inammation, siendo particularmente importante para el reclutamiento de leucocitos en modelos de infeccin y lesiones [77,78]. Se piensa que mientras S100A8/A9 induce la produccin de IL-8 in vitro de monocitos y tejidos y por lo tanto tiene el potencial

para reclutar neutrfilos a travs de las clulas del tejido, tambin es posible que in vivo estas DAMPs trabajan de manera directa por los principales neutrfilos a travs de las etapas nales de migracin de fagocitos [77]. Otros DAMPs participan en inamacin mediada a travs de redes celulares. HSP72 es liberado de las clulas epiteliales bronquiales viralmente infectadas y fue detectado en aspirados traqueales de nios crticamente enfermos infectados con RSV [79]**. Adems, ambas clulas derivan y purifican HSP72 inducida por la IL-8 y TNFa va NF-kB en neutrfilos humanos primarios, pero no en los neutrfilos aislados de ratones decientes de TLR4, indicando que los efectos de HSP72 son dependientes del TLR4 [79]**. Ms recientemente, los DAMPs mitocondriales (MTDs) que incluyen pptidos formil y ADN mitocondrial han demostrado activar neutrfilos por va formil pptido receptor-1 y TLR9 respectivamente [80**], causando afluencia de Ca 2 +, activacin de p38 y cinasas MAP ERK, liberacin metaloproteinasa de matriz (MMP), generacin de IL-8 y quimiotaxis mejorada. Experimentos in vivo de este mismo estudio mostraban la lesin pulmonar signicativa e inltracin de neutrfilos en las vas respiratorias en ratas tratadas con MTD [80]**. Resumen La capacidad innata de neutrfilos para reclutar rpidamente a sitios de infeccin, mejora la depuracin de fagocitosis y reclutar otras clulas inmunes es crucial para eliminar una amenaza patgena. Sin embargo si el intrincado balance de patgeno / neutrfilo es perturbado, el costo de este proceso a menudo es la generacin de un entorno proinflamatorio y la liberacin de factores nocivos como derivado del neutrfilo proteasas y ROS, resultando en daos a los tejidos y la produccin de DAMPs del entorno. Estas seales de peligro endgeno posteriormente inducen una cascada de proinflamatoria mediante la activacin de TLR, hasta regular mediadores proinflamatorios y disparo de dao tisular, llevando a niveles crecientes de DAMPs. La creacin de este bucle autocrino proinflamatorio puede resultar en la inamsacin crnica o enfermedad autoinmune. As suprimir la capacidad de DAMPs para activar TLRs puede ser

una alternativa racional a los actuales enfoques para el tratamiento de enfermedades inamatorias, y crea una gama de nuevos objetivos potenciales. De hecho, hay evidencia creciente de estudios en animales y en humanos que el bloqueo de estos mediadores pueden mejorar la enfermedad [8184]. El establecimiento de los mecanismos de activacin de TLR y de sealizacin son nicos para DAMPS, y que son esenciales para PAMPs, es el objetivo siguiente. Esto puede permitir la identificacin y definicin de objetivos especficos o vas, para la desconexin o al menos ajustar la respuesta a seales de daos endgenos, preservando al mismo tiempo la respuesta de los neutrfilos a los patgenos. El objetivo de estos estudios ser la identicacin de nuevos objetivos de inmunomoduladores para la intervencin teraputica modular neutroflica en enfermedades y ayudar a la resolucin de inamacin.