INSTITUTO DE FARMACOLOGIA E TERAPUTICA EXPERIMENTAL

FACULDADE DE MEDICINA DE COIMBRA

AULAS PRTICAS DE FARMACOLOGIA

Experimentao animal: farmacodinamia

INTRODUO

As aulas prticas de demonstrao em Farmacologia constam de exerccios em modelos biolgicos que permitem estudar funes fisiolgicas do animal e a modificao dessas funes por frmacos.

MATERIAL DE LABORATRIO A escolha do material depende muito do gosto pessoal do investigador e das disponibilidades econmicas. Utiliza-se, de um modo geral, material de laboratrio em vidro ou em plstico. Em qualquer dos casos fundamental o cuidado com o seu manejo e esmero na sua limpeza: deve utilizar-se detergente para a lavagem e depois desta estar completa dever o mesmo ser passado com gua destilada antes de secar. Em algumas aulas utiliza-se material especfico, como seringas, agulhas, instrumentos cirrgicos metlicos (tesouras, pinas de ponta fina, pinas de dente de rato, porta-agulhas, pinas hemostticas, etc). Dever observar-se cuidado com a sua conservao. Utilizam-se ainda alguns aparelhos simples como banhos de rgos, registador de vrios canais e aparelhos para estudo das modificaes do comportamento por frmacos, os quais requerem algum treino para o seu uso.

ANIMAIS DE LABORATRIO No nosso pas as normas que regulam a obteno, o cuidado e a utilizao dos animais de experimentao obedecem s regras gerais definidas pelo Conselho da Europa. Os animais que se utilizam neste Curso Prtico so adquiridos algum tempo antes de serem usados, de modo a que estejam habituados a ser manejados pelo homem e no tm tendncia a produzir qualquer dano, a no ser que sejam provocados. Durante o Curso sero usadas duas espcies: murganhos e ratos. Sempre que possvel, especialmente os ratos, devero ser manuseados no biotrio, para que os investigadores se familiarizem com eles.

Os animais referidos podem manejar-se vivos sem ajudas especiais, com luvas, como se observar ao longo do Curso. Podem ser levantados pela cauda sem os assustar, embora devam ser colocados, to rapidamente quanto possvel, sobre uma superfcie plana. Ambas as espcies devem ser seguradas pelo pescoo e pelas patas traseiras ou posteriores. No decurso de experincias os animais devero ser manipulados

cuidadosamente, no s por razes culturais ou legais, mas tambm cientficas, visto que um animal assustado ou maltratado responde de maneira anmala. Eis algumas das regras gerais a ter em conta em experimentao animal: As experincias com animais vivos devem realizar-se sob a orientao de pessoas qualificadas e com um protocolo experimental bem definido. Em caso algum devero ser sacrificados aleatoriamente; No deve ser realizada uma experincia se, para obter o resultado desejado, for razovel e possvel utilizar outro mtodo cientificamente satisfatrio que no implique a utilizao de um animal; So proibidas as experincias em sejam utilizados animais pertencentes a espcies consideradas ameaadas de extino, excepto se essas experincias respeitarem o Regulamento (CEE) n. 3626/82 e tiverem um dos seguintes objectivos: a) A preservao das espcies em questo; b) De natureza biomdica, quando se provar que a espcie em questo excepcionalmente a nica indicada para tal; Todos os animais para experincias devem ser alojados em meio ambiente adequado, com alguma liberdade de movimentos, alimentao e gua, recebendo os cuidados necessrios sua sade e bem-estar; As condies ambientais nas quais os animais so criados, conservados ou utilizados so sujeitas a controlos dirios; Um animal no pode ser utilizado mais de uma vez em experincias que envolvam dores violentas, aflio ou sofrimento; Sempre que a experincia a efectuar produza um sofrimento maior que o originado pela tcnica anestsica disponvel, o animal dever ser anestesiado; A morte do animal s dever verificar-se quando for necessria.

DISSECO Uma das experincias a realizar durante o curso prtico implica a disseco do animal que morto antes da demonstrao. No so, portanto, necessrias tcnicas de assepsia e cirurgia muito sofisticadas. No entanto um bom princpio evitar a exposio de rgos profundos, ou a leso dos rgos a utilizar, porque isso levar deteriorao do preparado.

ADMINISTRAO DE FRMACOS A ANIMAIS

Para a administrao oral de frmacos necessria a introduo de um tubo no estmago, de calibre varivel consoante o animal e, para os coelhos e gatos, necessrio muitas vezes uma anestesia ligeira que possibilite a introduo do tubo. Para qualquer injeco, a agulha deve ter dimenso e calibre adequados. Os volumes a injectar dependem das caractersticas do animal. A ttulo de exemplo, no quadro seguinte esto indicados os volumes mximos a injectar pelas diversas vias para o rato, murganho e cobaia:

IV Rato Murganho Cobaia 0,4 ml -

IP 2 ml 1 ml 2-4 ml

SC 1 ml 0,4 ml 1 ml

IM 0,4 ml 0,4 ml 0,5 ml

Oral 1 ml -

Em muitas experincias a esterilidade no constitui problema, e as seringas, ao contrrio das agulhas, podero ser usadas vrias vezes, especialmente se se trata de injectar a mesma soluo. Poder-se-o utilizar para solues diferentes, desde que sejam bem lavadas. A principal desvantagem do uso de seringas de plstico a dificuldade de fazer deslocar as bolhas de ar alojadas nos lados, sendo necessrio dar vrias pancadinhas repartidas para remov-las. sempre importante assegurarmo-nos que o ar no injectado.

As vias de administrao mais frequentemente utilizadas em animais so as vias subcutnea (SC), intraperitoneal (IP), intramuscular (IM), intravenosa (IV) e oral. Para a injeco subcutnea a pele pinada entre o polegar e o indicador, sendo a agulha espetada com firmeza, trespassando a pele com um ngulo aproximado de 45o. A ponta dever ficar livre e mover-se entre a pele e o msculo. O dorso do animal, de cada lado da coluna vertebral, representa o local mais adequado para a injeco subcutnea. Porm, se no existir um ajudante que segure o animal, a injeco poder ser dada mais na direco do pescoo pelo que um brao poder ser necessrio para segurar o animal. Na injeco intraperitoneal o processo semelhante ao da injeco subcutnea, sendo que, neste caso, a pele do abdmen que dever ser esticada. O animal dever ser imobilizado, segurando-o pelo pescoo e pelas patas traseiras. No entanto, para os ratos, prefervel colocar a mo direita volta das espduas, as patas dianteiras cruzadas firmemente sobre o torax e seguras entre os dedos do ajudante. A mo esquerda deste imobilizar as patas posteriores. A agulha espetada com firmeza atravs da parede abdominal, numa regio onde no seja possvel atingir o fgado, rim, bao ou bexiga. Para a injeco intramuscular o local escolhido dever ser uma zona muscular do organismo; em regra escolhem-se as ndegas. Para uma injeco intravenosa o processo varia de uma espcie para outra. De um modo geral, as injeces intravenosas em gatos, cobaias e ratos so feitas sob anestesia. Nos coelhos, possvel fazer injeces na veia marginal da orelha com o animal consciente. O coelho, colocado sobre uma mesa, imobilizado por um ajudante que procurar segurar as patas dianteiras ao mesmo tempo que ajeitar a orelha de modo a que o operador possa injectar. A veia distende-se se impedirmos o fluxo na base da orelha com o polegar e o indicador. conveniente dispormos de uma lmpada que ilumine o local de injeco (no dever incidir sobre o focinho do coelho) e que serve ao mesmo tempo para aquecer a orelha. Uma agulha poder ento ser facilmente inserida na veia assim distendida, aps o que o polegar e o indicador sero libertados, de modo a permitir a passagem do soluto injectado. sempre
Fig. 1. Injeco intraperitoneal

prefervel espetar a agulha longe da base da orelha de modo a permitir outras tentativas em caso de falhano. No rato, as injeces IV so feitas na veia da cauda. Requerem muito treino e devero ser tentadas apenas em ratos albinos nos quais mais fcil a visualizao das veias.

PREPARAO DE SOLUES As quantidades de frmacos habitualmente necessrias na maioria das experincias so bastante pequenas ( 10 mg). Devero ser pesados em balanas de preciso onde o erro ~ 1%. Mas se a substncia a utilizar higroscpica ou pesada num pedao de papel, ento o erro de pesagem ser superior ao referido. Quando se pretende uma soluo muito rigorosa, prefervel pesar uma quantidade maior (por exemplo 100 mg) e preparar maiores volumes de soluo, ou uma soluo mais concentrada que depois ser diluda consoante o que se pretende. As solues devero ser preparadas juntando a quantidade pesada ao volume de gua calculado e no por adio do lquido ao slido, a menos que a quantidade do slido seja muito pequena comparada com o volume do solvente. A maioria das solues de frmacos necessrios para as experincias em Farmacologia so muito diludas, sendo conveniente prepar-las por etapas ou por diluies sucessivas. Por exemplo, se pretendemos utilizar uma soluo 10-6M pesase uma quantidade de frmaco que permita preparar uma soluo 10-2M; esta diluda sucessivamente (1:10) at 10-6M. A soluo concentrada (chamada soluo "stock" ou soluo-me) pode ser preparada em gua destilada, tendo em conta que alguns compostos so muito menos solveis em solues salinas fisiolgicas do que na gua. A diluio final deve, no entanto, ser feita numa soluo fisiolgica (soluo de Tyrode, soluo de Krebs, soro fisiolgico). As concentraes dos frmacos so por vezes expressas em gramas por 100 ml, isto , em percentagem (m/v), mas com mais frequncia em gramas por litro. Os farmacologistas, porm, admitem que os frmacos actuam por um processo qumico ou fsico-qumico e que obedecem lei da Aco da Massa. Considera-se assim que a Massa Activa do frmaco presente que mais importante do que o peso actual.

Deste modo, as doses devem ser expressas em moles, e as concentraes em termos de molaridade. Uma grande vantagem de expressar as concentraes em termos de molaridade que desnecessrio especificar a natureza do sal utilizado. Se necessrio, por exemplo, uma soluo de suxametnio 10 M no tem importncia se a soluo contm cloreto,
-4 -3

brometo

ou

iodeto.

Os
-4

compostos

diferem

consideravelmente no peso molecular e as concentraes correspondentes, expressas em g/ml, so 3,97 x 10 para o cloreto (2H2O), 4,86 x 10 para o brometo (2H2O) e 5,44 x 10-4 para o iodeto. A nica complicao que advm do uso de concentraes molares quando o sal contm mais do que uma unidade de espcies activas. O sulfato de atropina, por exemplo, possui duas molculas de atropina para uma de cido sulfrico. Assim, para obter uma soluo molar de atropina, ser necessrio ter 347,5 mg/ml de sulfato de atropina e no 695 mg/ml deste sal.

IMPORTNCIA DO pH EM FARMACOLOGIA O pH tem uma importncia extraordinria em Farmacologia, podendo as suas variaes modificar a ionizao dos frmacos e, consequentemente, a sua absoro, distribuio e eliminao. A maioria dos frmacos so substncias ionizveis. Assim, as substncias cidas em meios fisiolgicos com pH baixo encontram-se na forma no ionizada e, portanto, mais facilmente absorvidas, o mesmo acontecendo para as bases em meio alcalino. O organismo procura manter o pH dentro de limites muito estreitos: uma ligeira variao do pH no meio interno ser imediatamente controlada pelos tampes orgnicos (protenas, HCO3 , HPO42-) que impedem qualquer modificao brusca. Concorrem ainda para a regulao do pH no organismo vivo a respirao, atravs da eliminao de CO2 nos pulmes e o rim atravs da secreo de H+ e da reabsoro de HCO3 e HPO42-. Nas experincias in vivo, quando se utiliza um anestsico por perodos longos de tempo, os animais desenvolvem um quadro de acidose. Esta situao deve ser corrigida pela administrao de bicarbonato de sdio. Em condies ideais dever-se-ia medir a concentrao dos bicarbonatos a intervalos regulares, mas como isto no realizvel a maior parte das vezes, aconselha-se injectar bicarbonato
-

de sdio (a soluo molar a mais utilizada) velocidade de 1,5 mM/Kg/hora. Nas experincias mais prolongadas as flutuaes provveis nas concentraes plasmticas de outros ies, tais como o potssio, devero ser tambm consideradas, em particular se se pretendem respostas reprodutveis dos tecidos excitveis. Nas experincias efectuadas in vitro tambm importante manter o pH dentro dos limites fisiolgicos. Por esse motivo, adiciona-se a todos os lquidos nutritivos um sistema tampo que tem como finalidade neutralizar os metabolitos cidos resultantes da actividade celular. Os tampes so constitudos por misturas de cidos ou bases fracas com os seus sais, por ex., fosfato monossdico/fosfato dissdico; cido actico/acetato de sdio, etc. ACIDENTES Os acidentes possveis neste tipo de experincias so as exploses e a deteriorao das roupas. Para precaver esses riscos deve usar-se sempre uma bata no laboratrio e no fumar. Evitar-se- toda a manipulao de substncias qumicas desconhecidas, pelo perigo de intoxicao e dever-se- lavar as mos antes de abandonar o Laboratrio, se se participou activamente na demonstrao realizada. As mordeduras de animais no acarretam de um modo geral problemas infecciosos graves, mas devero ser objecto de desinfeco no prprio Laboratrio onde existe material preparado para o efeito.

FARMACODINAMIA

ELABORAO DE UMA CURVA CONCENTRAO-EFEITO EM LEO DE RATO SPRAGUE-DAWLEY: DEMONSTRAO PRTICA DAS ACES DO SISTEMA NEURO-VEGETATIVO PARASSIMPTICO

1) OBJECTIVOS

O objectivo desta aula estudar a relao entre a concentrao e a resposta a um frmaco num rgo isolado, pela elaborao de uma curva concentrao-efeito, usando como preparado experimental o intestino isolado de rato. Na preparao do leo de rato vamos manipular fundamentalmente a juno neuro-efectora do Sistema Nervoso Vegetativo parassimptico. Na presente aula pretende-se registar a resposta contrctil do leo induzida pela ligao da acetilcolina (Ach, neurotransmissor libertado por fibras parassimpticas pr- e ps-ganglionares) aos receptores muscarnicos (predominantemente 3) existentes nas clulas efectoras, com o auxlio de um fisigrafo acoplado a um transdutor de fora. Pretendendo-se tambm ilustrar o antagonismo farmacolgico ou competitivo, vamos repetir a curva concentrao-efeito depois de se incubar o leo com atropina (prottipo dos antagonistas muscarnicos), que, ao antagonizar as contraes induzidas pela Ach, ir deslocar a curva concentrao-efeito do agonista.

2) INTRODUO

Os efeitos teraputicos ou txicos produzidos pela maior parte dos frmacos resulta de uma interaco com componentes macromoleculares funcionais do organismo que se designam por receptores. Desta interaco podem resultar inmeras alteraes de tipo bioqumico e/ou fisiolgico, que caracterizam a resposta de uma clula a um determinado frmaco. Os receptores determinam assim, em larga medida, a relao entre a dose ou concentrao de um frmaco e os seus efeitos farmacolgicos. Uma substncia que se liga a uma famlia de receptores, alterando a proporo de receptores que esto na forma activa e consequentemente induzindo uma resposta biolgica, designa-se por agonista. Para que um frmaco produza efeito necessrio que se forme um complexo frmaco-receptor reversvel, de acordo com a lei da aco da massa. Assim, se admitirmos que um agonista interage reversivelmente com um receptor e que o efeito resultante proporcional ao nmero de receptores pode escrever-se a seguinte equao:

K+ 1 F + R FR Efeito K 1

F designa o frmaco, R designa o receptor, k+1 designa a constante de velocidade de associao e k-1 a constante de velocidade de dissociao do complexo frmaco-receptor. A relao entre o efeito e a concentrao do frmaco livre pode ser descrito pelo seguinte modelo:
Efeito = efeito mximo * [F] EC 50 + [F ]

na qual EC50 representa a concentrao do frmaco que induz metade do efeito mximo (ver figura 1). O logaritmo negativo dessa concentrao designa-se por pD2. Utilizando a tcnica dos radioligandos para o estudo dos receptores, pode estabelecerse a relao entre a concentrao do frmaco ligado aos receptores (B) e a concentrao do frmaco livre (no ligado) (C):
B= Bmax * C C + KD

em que Bmax indica a concentrao total dos receptores e KD (coeficiente de dissociao em equilbrio; K-1/K+1) representa a concentrao de frmaco com a qual se verifica 50% da ligao mxima. Esta constante define a afinidade de um frmaco por um receptor: se o KD baixo, a afinidade alta e vice-versa. Nos casos em que um agonista total necessita de ocupar todos os receptores para causar uma resposta mxima, o KD igual ao EC50. A representao grfica entre o aumento da concentrao de um frmaco no banho (que se faz crescer por um factor constante) e o efeito observado, uma hiprbole quando a concentrao aumenta de forma aritmtica. Assim:

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Quando se representa a relao entre o efeito e o logaritmo da concentrao do frmaco no banho, a traduo grfica uma curva sigmoide que tem uma poro rectilnea entre 20 e 80% das respostas:

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Na poro rectlnia da curva verifica-se uma relao linear entre o efeito e o log da concentrao do banho. Quando a curva dose-efeito obtida num animal inteiro esse intervalo, mais ou menos extenso consoante a inclinao da recta, define o conjunto das doses que podem ser administradas com efeito til, sem manifestao de efeitos txicos. Numa determinada preparao observa-se o aumento da amplitude das respostas com o crescimento da concentrao. Todavia, uma vez ocupados todos os receptores disponveis e obtida a resposta mxima no se observa qualquer aumento e a resposta pode mesmo decrescer. Para proceder representao grfica dos efeitos observados em funo do logaritmo das doses utilizadas, avalia-se a amplitude da resposta mxima que passa a ser considerada como 100% e todos os outros valores so traduzidos em % dessa resposta obtida numa determinada preparao, obtendo-se um traado semelhante ao da figura 1.

B
% do efeito mximo

50

EC50

log[agonista]

20 %

80 %

Figura 1. Curvas dose-efeito em coordenadas semi-logartmicas. Traados sigmides.

Este tipo de traado permite a anlise de trs parmetros fundamentais: a posio da curva no eixo das abcissas, amplitude ou efeito mximo e inclinao da recta da poro rectilnea. A posio sobre o eixo das abcissas traduz a afinidade de um agonista por um receptor e, na prtica, define a potncia de um frmaco. Quanto

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mais esquerda se situar mais potente o frmaco, porque significa que pode ser obtido um efeito mximo com menor [] do frmaco. A anlise da figura 1 permite concluir que o agonista A tem maior afinidade que o agonista B. A amplitude da curva traduz a eficcia, efeito mximo ou a actividade intrnseca de um agonista. Com efeito, quando um frmaco induz uma resposta mxima, possui uma actividade intrnseca mxima, designando-se por agonista total (ex: acetilcolina). Por outro lado, se a resposta induzida por um agonista for parcial (efeito inferior a 100 %) este designa-se por agonista parcial. fcil perceber, na fig. 1, que o agonista A total e que B designa um agonista parcial. A inclinao, que deve ser determinada na parte mdia da curva por ser aquela que mais se aproxima da recta (situa-se entre 20% e 80% das respostas). Quanto mais verticalizada for a curva, mais rapidamente se passa do efeito mnimo ao mximo. Em relao a um barbitrico, por exemplo, h um intervalo pequeno entre a dose sedativa e dose que produz coma. Fala-se em antagonismo quando a aco farmacolgica de um frmaco (antagonista) diminui ou anula a aco de outro frmaco (agonista). Muitas vezes o antagonista apelidado de antdoto, o que se verifica nos casos em que o agonista uma substncia txica ou um frmaco administrado em doses ou em condies que o tornam provido de toxicidade para o indivduo e que uma substncia (antdoto) de natureza qumica distinta do txico, neutraliza quimicamente. O antagonismo pode ser 1) farmacolgico (competitivo) ou 2) fisiolgico (no competitivo). 1) Existe antagonismo competitivo ou farmacolgico quando dois frmacos com afinidade para as mesmas estruturas interferem mutuamente, produzindo efeitos contrrios. O antagonista com maior afinidade para o receptor ocupa-o, impedindo o agonista de desencadear uma resposta. Porm, quando a concentrao do agonista junto ao receptor aumenta, desloca io antagonista e origina de novo uma resposta. Deste modo, possvel representar um antagonismo farmacolgico sob a forma de curvas dose-efeito de traado sigmoide. Obtida uma primeira curva dose-efeito com um agonista (ex: Ach) num rgo isolado, por exemplo, o leo, podemos repetir a mesma curva aps lavagem do preparado e incubao do mesmo com um antagonista (atropina) que actue nos mesmos receptores que o agonista.

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Depois,

sempre

na

presena

do

antagonista,

vamos

aumentando

progressivamente a concentrao do agonista no banho. Vemos ento desenhar-se uma nova curva, paralela primeira na poro rectilnea, mas desviada para a direita no eixo das abcissas, por termos necessidade de aumentar a dose do agonista para deslocar o antagonista de todos os receptores. A resposta mxima idntica, uma vez que todos os receptores participaram nessa resposta.

% do Efeito mximo

A
Curva do agonista

B
Curva do agonista na presena de antagonista

50

Log [agonista]

A curva do agonista ser progressivamente desviada para a direita medida que aumenta a concentrao do antagonista.

Exemplos:
a) Exemplo demonstrado na aula. Actuando nos mesmos receptores que o

neurotransmissor colinrgico, a atropina vai contrariar os efeitos produzidos pela acetilcolina. Este antagonismo tem bastante interesse em toxicologia, visto que o aumento de acetilcolina no organismo, induzido pelas frequentes intoxicaes por pesticidas organofosforados (inibidores irreversveis das colinesterases), o responsvel pelos sintomas de intoxicao, utilizando-se a atropina como antagonista por ter maior afinidade para os receptores, conseguindo deslocar algum agonista.

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b)

A prazosina um potente e selectivo antagonista adrenrgico 1, que

so contrados pela noradrenalina. Este frmaco pode ser usado no tratamento da hipertenso. Os efeitos mais relevantes da prazosina resultam do bloqueio dos receptores adrenrgicos 1 existentes nas arterolas e veias, o que traduz no decrscimo da resistncia vascular perifrica e do retorno venoso ao corao.

2) Estamos perante um antagonismo funcional, fisiolgico ou no competitivo quando duas substncias qumicas produzem efeitos opostos na mesma funo fisiolgica, agindo sobre estruturas diferentes. Se actuarem nos mesmos receptores, mas o antagonista levar destruio do prprio receptor (ex: fenoxibenzamina e noradrenalina), estaremos na presena de um antagonista irreversvel. Neste caso, a representao grfica, em termos de curvas log [ ]/efeito, traduz-se por uma curva desviada para a direita, mas cujo efeito mximo vai sendo progressivamente mais baixo. Se a concentrao do antagonista for muito baixa, as curvas at parecem paralelas, mas medida que a concentrao deste aumenta, as curvas vo sendo gradualmente reduzidas.

% do Efeito mximo

50

Concentraes crescentes do antagonista

Log [agonista]

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No exemplo dado, a fenoxibenzamina inactiva os receptores e quanto maior a concentrao usada no banho menor ser o nmero daqueles que respondem estimulao pelo agonista. No animal inteiro ou no homem, a fenoxibenzamina em doses controladas, pode ser usada com fins teraputicos, uma vez que os receptores que so inactivados so substitudos por outros que so ressintetizados.

Exemplos de antagonismo funcional ou fisiolgico:

a) Antagonistas de canais de clcio (ex: Veratridina, Verapamil, etc) (que bloqueiam a entrada de Ca2+ nas clulas) relaxam as fibras musculares lisas perifricas, produzindo efeitos opostos aos da noradrenalina num vaso sanguneo. b) A teofilina, um antagonista da adenosina, inibe a broncoconstrio produzida pela histamina. c) Um outro exemplo conhecido de todos o antagonismo entre o lcool, depressor do SNC, e a cafena que um estimulante do SNC (nestes casos as duas substncias actuam em estruturas diferentes no SNC).

3) MATERIAL

Ratos Sprague-Dawley (250-300 g), Material cirrgico, Placas de Petri, Seringas de 1 ml, Soluo de Krebs (1 Litro; mM: 120 NaCl; 5 KCl; 25 NaHCO3; 1,2 KH2PO4; 1,1 MgCl2.6H2O; 2,56 CaCl2.2H2O, pH=7,4), Glicose 11 mM, ~2-3 cm de leo, Banho de orgos (10 ml), Sistema de registo (Fisigrafo acoplado a um transdutor isomtrico) e Solues de frmacos a estudar: acetilolina e atropina.

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4) MONTAGEM DA PREPARAO

Sacrifica-se o rato mediante uma pancada na nuca. Abre-se amplamente a cavidade abdominal, expondo bem as vsceras. Pinando o cego, rebate-se o intestino para o lado esquerdo com o que fica visvel todo o leo, podendo identificar-se a juno leo-cecal. Retira-se um segmento com aproximadamente 10 cm, tendo o cuidado de desprezar os 10 cm junto ao cego, por darem resultados controversos em virtude da inervao; coloca-se imediatamente numa placa de Petri com soluo de Krebs a 37C. Aps efectuar-se a limpeza do orgo, a pea montada num banho de orgos contendo Krebs aquecido a 37C e arejado: uma das extremidades fixada a um suporte de vidro mergulhado no banho de orgos enquanto que a outra ligada a um transdutor isomtrico conectado a um fisigrafo (fig. 2). Aps a montagem a preparao deve ficar em repouso durante cerca de 30 minutos antes de ser utilizada. Os frmacos a ensaiar so introduzidos na soluo Krebs que banha o orgo montado sem tocar no fio que o liga ao transdutor.

Figura 2. Plano de conjunto do aparato experimental.

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5) ELABORAO DE UMA CURVA DOSE-EFEITO CUMULATIVA

5.1- Preparar solues de Ach nas concentraes de 10-3 M; 10-4 M; 10-5 M e 10-6 M a partir de uma soluo 10-2 M Ach, por diluies sucessivas de 1:10 e uma soluo 10-6 M atropina a partir de 10-2 M atropina. 5.2- Para obter curvas dose-resposta cumulativas, aumenta-se a concentrao do agonista por um factor constante, depois da concentrao prvia ter produzido a resposta mxima e de esta se manter em patamar. Todas as respostas so expressas como uma percentagem da resposta mxima. As concentraes vo crescer segundo uma progresso geomtrica de razo 3, por exemplo, isto , a quantidade de Ach adicionada ao banho tal que a concentrao final em cada adio seja 3 vezes superior concentrao anterior.

Depois do orgo ter relaxado completamente, proceder do seguinte modo: 1 - Colocar o fisigrafo em movimento e registar a linha de base durante 60 seg; 2 - Proceder adio da Ach de acordo com a tabela seguinte, com a ajuda de uma seringa com a agulha dobrada, de modo a evitar tocar no fio que prende o rgo ao transdutor. NOTA: O volume do banho 10 ml e os volumes a adicionar no devero ultrapassar 10% do volume total.

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Concentrao inicial (M) 10-6 10-6 10-5 10-5 10-4 10-4 10-3 10-3 10-2 10-2

Volume a adicionar ao banho (ml)

Volume final adicionado ao banho (ml) 0,100 0,300 0,360 0,540 0,594 0,754 0,803 0,953 0,997 1,129

Concentrao Adicionada (M)

Concentrao final (M) 10-8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,100 0,200 0,060 0,180 0,054 0,160 0,049 0,150 0,044 0,132

2,0 x 10-8 6,0 x 10-8 1,8 x 10-7 5,4 x 10-7 1,6 x 10-6 4,9 x 10-6 1,5 x 10-5 4,4 x 10-5 1,3 x 10-4

3,0 x 10-8 9,0 x 10-8 2,7 x 10-7 8,1 x 10-7 2,4 x 10-6 7,3 x 10-6 2,2 x 10-5 6,6 x 10-5 2,0 x 10-4

3 - A curva concentrao-efeito est concluda quando no for possvel alterar o padro de resposta induzido pela concentao anterior de Ach.

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6) INCUBAO DO ORGO COM O ANTAGONISTA ATROPINA

Depois de lavar extensivamente o orgo para que possa relaxar completamente, proceder do seguinte modo: Adicionar ao banho de orgos 0,1 ml atropina 10-6 M e esperar durante 20-30 min para garantir que a atropina se ligue a todos os receptores.

7) ELABORAO DE UMA CURVA DOSE-EFEITO CUMULATIVA NA PRESENA DE ATROPINA

Sem lavar o orgo (portanto na presena da atropina), reproduzir a curva doseefeito cumulativa de Ach descrita em 5). Com esta experincia pretende-se constatar que, na presena de atropina, necessrio aumentar a concentrao de Ach para reproduzir o efeito mximo observado em 5). Ou seja, estamos na presena de antagonismo competitivo. A figura seguinte (fig. 3) ilustra curvas dose-efeito para um agonista na ausncia e na presena de concentraes crescentes de um antagonista competitivo. Da anlise desta figura consta-se que o antagonista desloca a curva dose-feito para a direita, ou seja, preciso aumentar a concentrao do agonista para produzir o mesmo efeito. Apresenta-se finalmente como se calcula o pA2 (constante com utilidade em Farmacologia para medir a afinidade de um anatagonista) (fig. 4).

20

%
100

80

contraco mxima

60

10 x

100 x

40

20

0 10
-9

10

-8

10

-7

10

-6

10

-5

10

-4

Figura 3. Curvas de dose-efeito para um agonista na ausncia e na presena de um antagonista competitivo. Se, na ausncia do antagonista, o agonista tem a curva A como sua representao grfica e se na presena da concentrao x do antagonista a curva passa para a posio B, ento 10x do antagonista deslocaro a curva para a posio C e 100x para a posio D, uma vez que, multiplicando tambm por 10 a concentrao do agonista, ele ter de provocar sempre o mesmo efeito (50% da resposta mxima) (Figura adaptada do Cap. 4, pp 60. In Teraputica Medicamentosa e Suas Bases Farmacolgicas, I VOLUME, 3 EDIO).

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Figura 4. Determinao do valor de pA2 Schild Plot: The Schild plot is a pharmacological method of receptor classification. To construct a Schild plot, the dose-effect curve for an agonist is determined in the presence of various concentrations of a competitive antagonist. From this experiment the pA2 is determined which is a measure of affinity of the antagonist for its receptor (i.e., the equilibrium dissociation constant). As such, the Schild Plot is sometimes referred to as pA2 analysis. Once the actual experiments are completed a series of dose ratios (DR) are calculated for a given effect. For example the ratio of the dose of agonist (A') to produce a specific effect (e.g., half maximal effect) in the presence of the antagonist (B) to the dose required in the absence of the antagonist (A) is calculated. This is determined for several doses of antagonist and then log ((A'/A) -1) versus the negative log B is plotted (this can also be plotted versus log B, but negative log B is more convenient). If the regression of log ((A'/A) -1) on -log B is linear with a slope of -1, then this indicates that the antagonism is competitive and by definition the agonist and antagonist act at the same recognition sites. The x-intercept of the fitted regression line is an estimate of pA2 which is the estimated equilibrium dissociation constant for the antagonist (pA2 is also the dose of antagonist that requires a 2-fold increase in agonist concentration.) The correct use of the Schild plot to estimate pA2 requires that the antagonist be a competitive antagonist. If the slope of the regression

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is not -1, then by definition the antagonist is not competitive or some other condition is in effect. This might include multiple binding sites or pharmacokinetic interactions. The Schild plot has a long history in Pharmacology and has proved to be useful for functional estimation of receptor properties. (see Arunklakshana & Schild, Br. J. Pharmacol. 65: 48-58, 1959).

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