Investigando la funcin de hormonas vegetales en los mecanismos epigenticos de regulacin gnica

Introduccin
El desarrollo vegetal y la gentica del desarrollo han quedado fuera de los programas de mejoramiento en el pasado. Pero existe una amplia cantidad de informacin que involucra a mecanismos genticos y epigenticos operando principalmente en reas reguladoras crticas del genoma para generar un cambio fenotpico adaptativo. Ejemplos como los loci VGT1 y TB1 proporcionan fuertes evidencias acerca de la existencia de elementos reguladores operando durante el desarrollo y proporcionando instrucciones de dnde, cuando y cmo diferentes herramientas genmicas sern utilizadas para transformar un genotipo a su fenotipo (Tsaftaris et al., 2008). La epigentica se define como todo cambio mittica y meiticamente heredable en la expresin gnica que no est codificado por la propia secuencia de DNA. En plantas, los fenmenos epigenticos controlan muchos procesos biolgicos tales como el desarrollo, morfognesis, imprinting genmico, variaciones somaclonales, heterosis, silenciamiento transgnico y respuestas al estrs (Gentil y Maury, 2007). Adems, los mecanismos epigenticos han sido propuestos para regular la expresin de blancos corriente abajo en las vas de sealizacin hormonal (Zu, 2009). Hasta la fecha se han descrito tres Sistemas de Informacin Epigentica (SIEs): metilacin de DNA, diversas modificaciones de Histonas y protenas asociadas y la va del RNA de interferencia (RNAi). La metilacin del DNA fue histricamente la primera y ms extensamente estudiada marca epigentica de la cromatina y las modificaciones covalentes de Histonas y protenas asociadas fueron definidas como patrones mayores que transmiten informacin por cambios de estado de la cromatina. Mientras que la metilacin

de Citosinas es la nica marca en el DNA, las modificaciones de Histonas implican metilacin, acetilacin, fosforilacin, ribosilacin y ubiquitinizacin, principalmente de la Histona 3 (H3 ), como as tambin en las Histonas H4, H2A, H2B y H1. Finalmente, el mayor avance de la biologa de los ltimos aos ha sido el descubrimiento que pequeas molculas de RNA con funciones catalticas pueden regular la expresin gnica a partir de la va del RNA de interferencia (Tsaftaris et al., 2008). Los RNAs pequeos no codificantes han estado implicados en la regulacin de genes endgenos y en el control de entidades genticas invasoras. Los RNAs pequeos derivados de RNA doble cadena que pueden o no ser codificados en el genoma se denominan RNAs cortos de interferencia (siRNA). Estos RNAs actan para silenciar cidos nucleicos invasores, va clivaje de RNA o a partir de cambios en la estructura de la cromatina. En contraste, los microRNAs (miRNAs) son codificados endogenamente, procesados a partir de precursores tallo-bucle de RNA y regulan genes de diferentes loci (Floyd y Bowman, 2005), razn por la cual son muy importantes desde el punto de vista del desarrollo. Las variaciones en el fenotipo vegetal producidas sin modificacin en la secuencia de DNA corresponden a fenmenos epigenticos (Gentil y Maury, 2007). Los patrones epigenticos forman parte de un mecanismo dirigido de algn modo para actuar como interfase entre genotipo y fenotipo durante el desarrollo, ya que dependen tanto de la secuencia como del ambiente. Por ejemplo, las islas CpG son contextos de secuencias con una mayor probabilidad de sufrir metilacin, mientras que el estrs por altas temperaturas lleva a modificaciones epigenticas en plantas de petunia transgnicas (Meyer, 1992). Existe una gran cantidad de informacin indicando que estos procesos frecuentemente podran interpretarse como resultado de la manifestacin de gradientes hormonales en

respuesta a diversas condiciones ambientales (Sokol et al., 2007; Berdasco et al., 2008; Kim et al., 2009; Fowden y Forhead, 2009; Vicent et al., 2009 Zu, 2010).

Desarrollo
Los mecanismos epigenticos forman parte de un sistema de herencia paralelo al sistema gentico (Jablonka y Lamb, 2005) y por lo tanto se observan actuando sobre genes mayores durante el desarrollo; por ejemplo, a partir de la activacin y el silenciamiento de la expresin gnica en tejidos especficos, as como en determinadas fases del desarrollo. En las etapas ms tempranas del desarrollo vegetal los Sistemas de Informacin Epigentica (SIEs) regulan genes mayores encargados de codificar Factores de Regulacin y Trascripcin esenciales para la formacin correcta de los diferentes tejidos: 1- Genes de identidad de rganos de la familia MADS-box codifican Factores Reguladores involucrados en las fases ms tempranas del desarrollo. (Heck et al., 1995). Por otro lado, Bastow et al. (2004) demostraron que la vernalizacin induce la metilacin en dominios discretos de Histonas dentro del gen MADS-box FLOWERING LOCUS C (FLC) en Arabidopsis. 2- Factores de Trascripcin pertenecientes a las familias GRAS, MIB y bHLH promueven el establecimiento de meristemos axilares (Tsaftaris et al., 2008). Los Factores TCP tambin estn involucrados con la formacin de yemas laterales: la protena TEOSINTE BRANCHED1 (TB1) suprime el desarrollo de meristemos axilares en maz. La sobreexpresin del gen tb1 de maz ha sido asociada con la diferenciacin a su antecesor silvestre teocinte, pero la cascada de activacin molecular y sus efectos sobre la expresin gnica diferencial an no son completamente entendidos (Clark et al., 2004). Iltis (1983) propuso que el maz evolucion repentinamente como respuesta a una modificacin espacial en los gradientes hormonales, mediante un mecanismo epigentico denominado transmutacin sexual por el cual las espigas masculinas de teocinte

ingresaron en la zona de induccin hormonal femenina, promoviendo la condensacin de las mismas para generar la mazorca del maz actual. En trigo hexaploide, los genes mayores Rht-D1/Rht-B1 codifican para protenas DELLA que afectan el desarrollo por disminucin de la habilidad de respuesta a la hormona Giberelina, provocando paralelamente una disminucin en la altura de la planta (Hedden et al., 2003); sin embargo, tampoco se comprende cmo funcionan los mecanismos moleculares involucrados o por qu la sobreexpresin de estos genes no afecta la arquitectura integral y, en consecuencia, al rendimiento del cultivo. Durante la denominada revolucin verde, a mediados de 1960, la introgresin de los genes de enanismo Rht dentro de variedades tropicales y subtropicales de trigo pan fue una de las causas principales que ocasionaron el extraordinario e imprevisto salto cualitativo en el rendimiento agronmico del cultivo (Hedden et al., 2003). Con respecto a tb1, Clark et al. (2006) sorprendentemente reportaron una secuencia intergnica 58-69 kb corriente arriba que tiene efectos pleiotrpicos sobre la arquitectura de la planta y la inflorescencia (una secuencia intergnica en lugar de un gen!). Adems informaron que la secuencia >41 kb corriente arriba de tb1 acta en cis para alterar la transcripcin, aunque slo en el caso del locus b1 (tambin en maz) se ha propuesto la presencia de una secuencia cis-reguladora que acta separada por una distancia semejante. Por ello, Clark concluye que deben realizarse estudios posteriores acerca de cmo el DNA denominado basura contribuye a la variacin fenotpica. Muy interesante es subrayar que la expresin del gen b1 estara relacionada al fenmeno epigentico de transmutacin, siendo conocidos tanto los alelos paramutados como paramutables que transinteraccionan para producir un cambio heredable en el fenotipo (Coe, 1966; Patterson et al., 1993). En relacin a esto, Stam y col. (2002) elucidaron a partir de mapeo por

estructura fina del locus b1 que las secuencias que fomentan la actividad enhancer y de paramutacin estn contenidas en la misma regin de DNA. Conjuntamente con loci como tb1 de maz o Rht-D1/B1 de trigo hexaploide existen otros factores que podran estar participando durante el desarrollo vegetal para generar un cambio fenotpico adaptativo. Es interesante el caso del gen MADS-box de tipo I PHERES1 de Arabidopsis, el primer gen descubierto en el desarrollo vegetal expresado por imprinting paterno (Khler y Grossniklaus, 2005). Se desconoce la funcin exacta de los genes MADS-box de tipo I, pero si se sabe que los genes MADS-box de tipo II evolucionaron a partir de un linaje de tipo I, en un ancestro comn de plantas y animales (Alvarez-Buylla, et al., 2000). Las protenas MADS de tipo II estn implicadas en aspectos crticos del desarrollo vegetal, como la regulacin de identidad de rgano floral y de meristemo, induccin de la floracin, como as tambin desarrollo de vulos, frutos, hojas y races (Ng y Yanofsky, 2001). Tanto las protenas MADS-box de plantas como protenas homeodominio de animales han sido reclutadas para la regulacin de procesos del desarrollo, por ejemplo, la especificidad de identidad de rganos. Por lo tanto, la expresin de estos interruptores maestros del desarrollo est agudamente controlada por mecanismos evolutivamente conservados (Khler et al., 2003). El alineamiento mltiple entre las protenas TB1, PHERES1 y DELLA, esta ltima codificada por los genes de enanismo Rht-B1/Rht-D1 de trigo hexaploide, evidenci homologa significativa para un motivo del dominio conservado TCP correspondiente a TB1 (Figura 1), el cual se encuentra en protenas que regulan el desarrollo y crecimiento vegetal (Cubas et al., 1999). Por otro lado, esta regin pertenece a la Familia de Factores de Transcripcin GRAS en protenas DELLA. Al igual que TCP, los Factores de Transcripcin de la Familia GRAS pueden cumplir funciones importantes en las vas del desarrollo vegetal (Schumacher et al., 1999).

Figura 1. Segmento del alineamiento mltiple entre las protenas TB1, PHERES1 y DELLA realizado con el software T-Coffe Advanced. El fragmento alineado exhibe homologa significativa (regin en rojo) en los dominios TCP y GRAS correspondientes a las protenas TB1 y DELLA, respectivamente. La protena PHERES1 no presenta ningn dominio identificado en la regin alineada.

Vas de respuesta al ambiente y regulacin mediada por DELLA El alineamiento entre las entradas de Triticum Aestivum A8QU14 (Base de Datos UniProt) perteneciente a la Familia de los Factores de Transcripcin MYB (subdivisin GAMYB, sensible a Giberelina) y la protena DELLA Q9ST59 (insensible a Giberelina) evidenci un gap -en A8QU14- para el segmento de secuencia proteica investigado; sin embargo y de modo muy interesante, la regiones adyacentes permanecieron conservadas (Figura 2). Las Familias MYC, MYB y bZIP pertenecen a Factores de Transcripcin regulados por fitohormonas tales como Acido Abssico (ABA) o Giberlico (GA) y estn involucradas en las vas de respuesta a diferentes tipos de estreses ambientales como fro, deshidratacin o aplicacin exgena de ABA (Kusano et al., 1995; Lu et al., 1996; Nakagawa et al.,1996; Abe et al., 2003). Por su parte, los Factores pertenecientes a la subdivisin GAMYB estn codificados por genes con elementos cis de respuesta a GA en sus promotores y cumplen con las ms variadas funciones del desarrollo vegetal, entre las cuales podemos citar: maduracin de la semilla, elongacin del tallo o floracin (Haseneyer et al., 2008).

Figura 2. Segmento del alineamiento entre las entradas A8QU14 y Q9ST59 de T. Aestivum utilizando el programa T-Coffe Advanced. El rectngulo azul indica la regin investigada en la secuencia proteica de DELLA (Figura 1).

La va del RNA de interferencia, conexiones entre mecanismos de regulacin y el papel central de DELLA

miR159 es un miRNA vegetal bien caracterizado cuya funcin es dirigir el clivage de mensajeros que codifican para Factores GAMYB. Achard et al. (2004) demostraron que los niveles de miR159 estn regulados por GA, de manera opuesta a la funcin de protenas DELLA; adems, sealaron que tanto la secuencia de miR159 como sus niveles de transcripto regulados por DELLA se encuentran evolutivamente conservados tanto en Arabidopsis como cebada (Hordeum vulgare).

Objetivos generales
El presente trabajo intenta comprender ms profundamente el rol de las hormonas en la configuracin de patrones epigenticos y los mecanismos moleculares que podran encontrarse asociados a diversos sucesos del desarrollo vegetal. Objetivos especficos Entender la vinculacin con el proceso de cambio general en la arquitectura de las variedades semienanas de trigo pan desarrolladas durante la revolucin verde, interpretando cuales fueron las causas que originaron el incremento en el ndice de cosecha, calculado como la proporcin en peso de granos en funcin del peso total de la planta. Esto significa que una mayor proporcin de productos de la fotosntesis se acumulan en semillas en lugar de hojas (Hedden et al., 2003). Dilucidar las claves del mecanismo de supresin de ramificaciones laterales en maz respecto a su antecesor silvestre teosinte. Comprender el mecanismo molecular por el cual la sobreexpresin del gen de maz tb1 en trigo suprime el desarrollo de macollos (Lewis et al., 2008). Determinar las causas que motivaron diferencias muy significativas entre el Desequilibrio de ligamiento (LD) esperado y observado para loci funcionalmente muy importantes y evolutivamente conservados. Con respecto a esto es emblemtico el caso de la secuencia gnica en el locus mayor de domesticacin de maz tb1, cuya regin estructural tiene un LD neutral. Se ha intentado explicar parcialmente este fenmeno a partir de la sencilla presencia de un enhancer corriente arriba del gen tb1, donde existe un LD significativo; sin embargo, la distancia que separa dicho potenciador (41-61 kb) se considera limitante (Clark et al., 2004). En relacin a estos objetivos, se plantean una serie de hiptesis:

1- Hiptesis y evidencias relacionadas al funcionamiento de hormonas en el establecimiento de mecanismos epigenticos 1- Los gradientes hormonales traducen seales ambientales por activacin de diferentes mecanismos epigenticos. En la actualidad, existe gran cantidad de trabajos bibliogrficos que relacionan fenmenos epigenticos al funcionamiento hormonal celular: a. En mamferos, las hormonas cumplen un rol importante en el establecimiento de los mecanismos epigenticos y son capaces de sealizar el tipo, severidad y duracin de las seales ambientales que controlan el desarrollo de tejidos feto-placentarios (Fowden y Forhead, 2009) b. Los Complejos Remodeladores de la cromatina actan de manera coordinada durante la activacin de Elementos de Respuesta a Hormonas (HRE) en clulas cancergenas (Vicent et al., 2009) c. Combinacin de auxinas y citoquinas conservan el estado desdiferenciado de clulas del callo en Arabidopsis por mantenimiento del status de metilacin del DNA e hipoacetilacin de Histonas en las regiones promotoras de los genes MAPK12, GSTU12 y BXL1 (Berdasco et al., 2008) d. Tambin en Arabidopsis, miR164 es un microRNA controlado

negativamente por la protena EIN2 (Insensible a Etileno 2), el componente central en la va de transduccin de seales del etileno. miR164 marca un gen crucial, ORE1, el cual es regulado positivamente por EIN2 durante la apoptosis celular (Kim et al., 2009) e. Paralelamente a condiciones de alta salinidad y estrs por fro, la aplicacin de Acido Abssico (ABA) dispara rpidamente modificaciones epigenticas

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tales como fosforilacin de la Histona 3 (H3) en la posicin Ser-10, fosfoacetilacin tambin de H3 y acetilacin de la Histona 4 (H4) en tabaco y Arabidopsis (Sokol et al., 2007). 2. Las mutaciones en genes Rht que indujeron la insensibilidad a Giberelina de protenas DELLA ocasionaron cambios muy importantes desde el punto de vista del desarrollo porque lograron que la hormona atenuara la activacin de una cascada de transcripcin que potencia el crecimiento del tallo y al mismo tiempo incrementar el rendimiento de peso en granos. Esta asimilacin energtica queda evidenciada por el extraordinario aumento en el ndice de cosecha de las variedades surgidas durante este periodo. 3. El tratamiento hormonal es capaz de modificar los patrones epigenticos. Es por ello que la auxina sinttica conocida como 2,4-D (cido diclorofenoxiactico) ha sido utilizada para evitar la incompatibilidad genmica-citoplasmtica y consecuente aborto de las espigas emasculadas durante cruzamientos intergenricos de trigo duro x mijo (Knox et al., 2000; Garca-Llamas et al., 2004), avena x trigo pan (Sidhu et al., 2006), triticale x mijo (Wedzony, 1998), etc. En el caso del triticale -un hbrido intergenrico desarrollado a partir del cruzamiento de trigo pan x centeno-, Matos (2008) observ que las Regiones Organizadoras Nucleolares (NORs) tanto de trigo pan como centeno se encontraban activas antes de la fertilizacin; sin embargo, 5 das luego de la fertilizacin, los genes de RNA ribosmicos (rRNAs) de centeno se encontraban suprimidos. Posteriormente, Matos descubri a partir de la incorporacin de 5-azacitidina (5-AC)* durante la germinacin que los NORs provenientes del cromosoma R1 de centeno eran coloreados con nitrato de plata, lo que indica que se encontraban activos durante la interfase (Neves et al., 1995) y demostrando el control

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epigentico durante el proceso de dominancia nucleolar ejercido a travs de la expresin de rRNAs de trigo.
* 5-AC es un anlogo de la citosina que no puede ser metilada porque la posicin 5 est bloqueada

2- Hiptesis y evidencias relacionadas al mecanismo de funcionamiento de la regin genmica investigada La protena vegetal PHERES1 implicada en el mecanismo epigentico de imprinting genmico y los Factores de Transcripcin DELLA y TB1 comparten un dominio comn evolutivamente conservado, tanto para Mono (Triticum Aestivum y Zea Mays) como Dicotiledneas (Arabidopsis), lo cual estara sugiriendo la existencia de una funcin ancestral compartida. A partir del mtodo de prediccin PSIPRED (Jones, 1999) se logr dilucidar que tanto la estructura secundaria de PHERES 1, DELLA como TB1 coinciden con la formacin de una hlice en el segmento de secuencia investigado; adems, el grado de confiabilidad de los residuos intervinientes para el establecimiento de una conformacin helicoidal tuvo un coeficiente de 9, el mayor valor posible. Las regiones investigadas codifican para protenas esenciales en el desarrollo vegetal porque estn implicadas en un mecanismo epigentico el cual no se encuentra caracterizado. Las secuencias genmicas examinadas poseen una serie de caractersticas compartidas que estaran directamente relacionadas con este modo de funcionamiento: a. Desde el punto de vista del desarrollo, son regiones donde se localizan genes fundamentales para las especies vegetales citadas; es decir, cada uno de los loci investigados codifican para protenas muy importantes en el desarrollo de dichos cultivos.

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b. El modo de expresin de las protenas codificadas es la sobreexpresin. En el caso del locus tb1, la bibliografa indica que 1-la regin corriente arriba posee un ndice muy bajo de diversidad nucleotdica, revelando que se encontrara sujeta a seleccin reciente, y 2-debera actuar como enhancer. Posteriormente, el mismo grupo de investigacin public recientemente (Clark, 2011) que dicha regin potenciadora mapea en un retrotransposon. Entonces, cabe preguntarse cmo funciona un retrotransposon de enhancer? En el locus b1 de maz, Stam y col. (2002) caracterizaron una secuencia potenciadora corriente arriba separada por una distancia semejante que mapea conjuntamente con la regin necesaria para el mecanismo de paramutacin. En relacin a esto es muy interesante subrayar que la caracterizacin de la secuencia corriente arriba del locus B desencadenante de la paramutacin del alelo B-I evidenci que dicho locus (B) se encontraba compuesto principalmente por retrotransposones flanqueados por unos pocos

transposones. De este modo, mi hiptesis es: la sobreexpresin se producira por medio de un mecanismo en el que participaran la protena codificada y su regin corriente arriba, proponiendo que elementos retrotransponibles, en lugar de funcionar como enhancers, deberan ser blancos que posee el genoma para un tipo de modificacin de naturaleza epigentica que induce la sobreexpresin de la protena corriente abajo. Las regiones genmicas no codificantes implicadas en el mecanismo propuesto deberan compartir un patrn, el cual podra o no estar relacionado con el nivel de homologa de secuencia. Al igual que para el mecanismo de paramutacin, este tipo de modificacin epigentica debera ser heredable de modo estable y transgeneracional. A juzgar

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por la importancia de las protenas codificadas en estas regiones, los cambios desencadenados deberan producir una reordenacin general en la expresin del genoma, con efectos muy importantes sobre el fenotipo vegetal. El origen del mecanismo propuesto obedecera al movimiento de elementos retrotransponibles cuando el ambiente induce estrs durante el desarrollo; por lo tanto estas secuencias no codificantes funcionaran como fuentes generadoras de variabilidad dentro del genoma. Los conceptos planteados se relacionan con caractersticas que exhibe el genoma, como la fluidez y plasticidad integral para expresarse en funcin de condiciones ambientales dinmicas. Por ejemplo: 1) Los siRNAs que se activan para inducir silenciamiento gnico

postranscripcional se elaboran a partir de transposones y virus, como as tambin de otras secuencias repetidas transcritas bidireccionalmente (Muoz, 2007) 2) Los islotes CpG blanco de metilacin se componen de secuencias no codificantes ricas en Citosina y Guanina; del mismo modo, sus protenas asociadas sufren diversos tipos de modificaciones epigenticas. Comprobacin experimental de las hiptesis centrales del trabajo Experimento 1: Introducir en Zea Mays fragmentos especficos de la secuencia genmica correspondiente a la regin corriente arriba del gen tb1 en dicho locus endgeno por medio de la tcnica conocida como gene targeting. Del mismo modo, se podra introducir en Triticum Aestivum segmentos de la regin corriente arriba de los genes Rht-B1/D1, respectivamente. El objetivo es observar las variantes fenotpicas producidas tanto en maz como trigo pan a partir de la introduccin de secuencias genmicas exgenas de la regin de inters. La mayora de las tcnicas

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utilizadas para la introduccin de ADN exgeno en clulas producen la integracin aleatoria en el genoma celular del ADN introducido. La tcnica de gene targeting genera una modificacin gentica dirigida, especfica y controlada, basada en la introduccin o en la eliminacin de ADN en lugares precisos del genoma, utilizando la recombinacin homloga de esas secuencias de ADN forneas con los genes autctonos. Experimento 2: Introgresar por retrocuzamiento la secuencia correspondiente al locus tb1 original en las plantas transgnicas de maz derivadas del experimento 1 y operar del mismo modo con las secuencias genmicas de los loci Rht-B1/D1 correspondientes a los organismos transgnicos de trigo pan obtenidos. El objetivo de este experimento es observar cambios fenotpicos estables aun luego de la introgresin de las secuencias genmicas correspondientes a las variedades originales utilizadas para el proceso de transgnesis. Esto comprobara el establecimiento en la memoria celular de modificaciones epigenticas transgeneracionales por un fenmeno anlogo a la paramutacin del locus b1 en maz, pero que en lugar de afectar una caracterstica cualitativa como el color del grano, influira sobre rasgos cuantitativos directamente relacionados con el rendimiento del cultivo.

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