Estudio del papel que desempea la insulina en la homeostasis de la glucemia en ratones con diabetes experimental.

Sussane Ayed Carmona Universidad de Valencia (UV)

Resumen

La insulina, hormona segregada por las clulas beta pancreticas, presenta un papel crucial en el metabolismo de la glucosa. Una insuficiencia de ella o incluso la ausencia total en un vertebrado provoca la diabetes de tipo I o de tipo II. En el presente estudio se valora el papel de sta en ratones a los cuales se les ha inducido la diabetes mediante aloxana. Las variables estudiadas han sido tanto la glucemia basal como la tolerancia a la glucosa y la evolucin del peso durante el estudio. Mediante procedimientos estadsticos se han analizado los resultados de stas, concluyendo que el tratamiento no ha tenido efectos significativos sobre las variables. Ello quizs haya sido debido a errores en el diseo experimental, pudiendo ser que la dosis de aloxana no era suficiente para la induccin de la diabetes en los ratones.

Palabras clave: insulina, aloxana, hiperglucemia, diabetes experimental.

INTRODUCCIN El pncreas tiene un papel principal en el control endocrino del metabolismo de la glucosa en sangre, tiene relacin con la movilizacin de los sustratos metablicos de los depsitos de almacenamiento celular de nutrientes que se realizan tras la comida. Es un rgano glandular ubicado en los sistemas digestivo y endocrino de los vertebrados. El pncreas produce ciertas hormonas endocrinas importantes, incluyendo insulina y glucagn (principales hormonas implicadas en el metabolismo de los carbohidratos) y somatostatina; tambin acta como glndula exocrina (segrega jugo pancretico que contiene enzimas digestivas que pasan al intestino delgado). Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nuclicos en el quimo. La unidad funcional del pncreas endocrino son los islotes de Langerhans, donde sintetizan la insulina (clulas beta), el glucagn (alfa) y la somatostatina (delta). Los islotes tienen una fina red vascular y estn dotados de un sistema venoso tipo portal orientado desde las clulas beta, hacia las alfa y delta. Estn inervados por el sistema nervioso autnomo y existen comunicaciones intercelulares. La insulina y el glucagn estn implicados en la movilizacin y almacenamiento de grasas en el tejido adiposo, en el tejido muscular y en el hgado [3] La insulina es la hormona "anablica" por excelencia; es decir, permite disponer a las clulas del aporte necesario de glucosa para los procesos de sntesis con gasto de energa, actuando por tanto en la mayora de las clulas del organismo. Cuando sta hormona se produce a bajos niveles (DM tipo 2) incluso no hay produccin de ella (DM tipo 1) las clulas no pueden captar la glucosa y sta se concentra en la sangre, apareciendo la llamada hiperglucemia (Fig.1) [1] El objetivo de este experimento es estudiar el efecto de la insulina sobre el control de los niveles sanguneos en glucosa, para ello realizaremos una pancretomia

qumica parcial a ratones macho de la especie Mus musculus (ratones de laboratorio que pesan entre 12 y 40 g, y cuya normoglucemia es alrededor de 6 mM) [2] inyectndoles intraperitonealmente un compuesto diabetgeno llamado aloxana. La aloxana es un compuesto txico que produce la necrosis de los islotes con desaparicin de las clulas beta, productoras de insulina. Es un producto de la oxidacin del cido rico; su frmula qumica es CNHO-COCOCNHO (Fig.2A), desdoblndose, a su vez, por hidrlisis, en urea y cido mesoxlico [4]. Los fenmenos consecutivos a la inyeccin intravenosa de la aloxana pasan por tres fases y se traducen por oscilaciones en el perfil glucmico (Fig.2B). Inicialmente se produce un aumento de la glucemia que es seguido por un descenso progresivo y prolongado de la misma hasta finalmente manifiestar los signos de la diabetes: hiperglucemia, glucosuria y cetosis los cuales se completan, en general, despus de las 48 horas de la inyeccin de aloxana [6]. La caracterstica ms notable de este txico es que destruye nicamente las clulas beta, respetando las clulas alfa y delta. Eso se debe a que la accin citotxica de la aloxana es mediada por especies reactivas de oxgeno, que junto a un aumento de la concentracin de calcio citoslica provocan la rpida destruccin de las clulas beta [5].

MATERIAL Y MTODOS Grupos experimentales Para llevar a cabo el estudio se obtuvieron al azar 19 ratones macho adultos de la especie Mus musculus. Diez de ellos se destinaron al grupo experimental control y el resto fueron tratados. Al grupo tratado se les inyect (mediante una aguja hipodrmica) una dosis intraperitonial de 75mg/kg de peso del ratn del compuesto aloxana (25mg/ml) en los das uno y ocho del experimento. El da quince de estudio se procede a valorar el

contenido de glucosa basal de los 16 ratones ayunados desde la noche anterior, mediante un mtodo automtico. ste grupo tratamiento es el que nos permite observar el efecto de la ausencia de insulina en el control de los niveles sanguneos de glucosa y la relacin con el peso corporal. En el caso del grupo control se sigui el mismo diseo experimental, excepto que en vez de aloxana se le inyect una dosis de 75mg/Kg de peso del ratn de solucin salina al 0.9% intraperitonialmente. Como otro de los objetivos de estudio es ver la variacin del peso de los ratones en ambos grupos, tanto el primer dia como el da ocho y quince de estudio se pesaron cada uno de los ratones en un balanza. Se requera conocer el peso, no slo para estudiar su evolucin, sino tambin para ajustar las dosis correctas de aloxana de forma individual. Por ltimo, con tal de estudiar el efecto del tratamiento sobre las clulas pancreticas trasncurridos los quince das de tratamiento, propusimos valorar la tolerancia a la glucosa. Para ello inyectamos, a cada ratn, intraperitonialmente 2g/kg de peso del ratn de una solucin de glucosa al 30%, y transcurridos 45 minutos,

valoramos su glucemia con el Kit de medicin de glucosa automtico. Decir que los ratones fueron manipulados de modo que sufrieran el mnimo estrs posible, aunque algunos de los sujetos llegaron a recibir ms de una inyeccin sin llegar a introducir el compuesto o incluso en dos casos particulares se les adicion una nueva dosis de tratamiento debido a que la primera no se complet por problemas con la jeringa. Adems cabe destacar que cuatro de los ocho ratones del grupo control proceden de otro estudio de comportamiento sexual.

Valoracin de la glucemia: El kit automtico de medicin de glucosa se us conforme marca el fabricante, la sangre del ratn se extrajo mediante puncin con una lanceta heparinizada en la pata del ratn, hasta conseguir una gota, suficiente para la cuantificacin automtica con las tiras reactivas. ste kit de medicin se usa tanto para la valoracin de la glucemia basal como en la glucemia tras sobrecarga.

Anlisis estadstico Teniendo en cuenta que las dos variables dependientes a estudiar son la glucemia, tanto basal como la observada tras una sobrecarga de glucosa, y la variacin de peso en el transcurso del experimento; consideramos adecuado un anlisis dirigido a comparar las medias obtenidas de cada una de la variables entre los dos grupos experimentales, con tal de ver si hay diferencias de glucemia y/o de peso, atribuibles al tratamiento con aloxana. Por ello, vemos conveniente el anlisis de las varianzas (ANOVA) de un modelo de efectos fijos como es el nuestro, es decir, estamos interesados en las diferencias entre los grupos definidos (control y aloxana). Para aplicar ANOVA se deben cumplir sus condiciones de normalidad, homocedasticidad e independencia de muestras en cada grupo. stas condiciones sern comprobadas en cada caso. Consideramos las diferencias como significativas a un p-valor<0.05. Todo el anlisis estadstico y presentacin de resultados han sido generados por el programa informtico SPSS 15 para Windows .

RESULTADOS Los niveles de glucosa basal observadas en nuestros dos grupos experimentales parecen presentar diferencias (Fig.3), se observan valores superiores en los ratones tratados con aloxana, valores que se encuentran alrededor de
140,77

mg/dL de glucosa en sangre;

aunque en el primer caso analizado se encuentra la excepcin, ste posee unos niveles de glucosa comparables a los ratones no tratados. En cuanto al grupo control, los valores se mantienen menos variables, con una media de
137,20

mg/dL, de glucosa en sangre. El test

estadstico de anlisis de varianzas nos indica que stas diferencias no son lo suficientemente significativas para un grado de confianza del 95% como para decir que la aloxana ha tenido algn tipo de efecto sobre los niveles de glucemia basal de las unidades experimentales. En el caso de la glucemia tras una sobrecarga de glucosa, obtenemos resultados en ambos grupos con elevada variabilidad es decir, no todos los ratones del grupo han reaccionado del mismo modo dentro del mismo grupo experimental. Aunque si se observa que los valores medios de ambos grupos se encuentran alrededor de
222,31

mg/dL de

glucosa en sangre (Tabla 3). Dada la elevada variabilidad es imprescindible usar el test estadstico ANOVA, que resulta indicar, para un nivel de confianza del 95%, y obtenemos que no hay diferencias esdadisticas entre el control y la aloxana. Lo cual indica que tampoco en ste caso tenemos evidencias que nos indiquen que la aloxana haya producido algn cambio en la tolerancia a la glucosa entre los dos grupos experimentales. Por ltimo, en cuanto a la evolucin del peso de los ratones tratados y control, vemos en el grfico de resultados de pesos medios (Fig.5 y Fig.6) que durante los ocho primeros das hay un aumento medio de los pesos en los ratones tratados con aloxana y un descenso medio de los ratones control. Sin embargo, a partir del octavo da y hasta el final del estudio ambos grupos sufren un descenso medio del peso, comparable.

El test estadstico ANOVA nos indica que en el primer da los pesos medios de ambos grupos experimentales no presentan diferencias significativas

DISCUSIN DE RESULTADOS Los resultados obtenidos en el estudio apuntan a que el tratamiento no ha funcionado correctamente, es decir, no hemos conseguido inducir la diabetes a los ratones mediante la aloxana. Y es as ya que se considera hiperglucemia cuando la concentracin de glucosa en sangre es igual o superior a 16 mM [6], en ninguno de los casos hemos obtenido valores tan elevados. Adems considerar que las diferencias ante la tolerancia a la glucosa no son significativas, lo que indica que quizs no se haya producido dao en las clulas y puedan an producir la insulina. Aunque s cabe destacar que los valores ms elevados de glucemia se encuentran en el grupo que se supona tratado y los ms bajos en los ratones control, ello nos lleva a pensar en varios errores que hayamos podido cometer en el diseo experimental: dosis de aloxana insuficiente, perodo de estudio insuficiente o incluso una combinacin de ambos. Dosis de aloxana insuficiente: La dosis de aloxana requerida para inducir diabetes depende de la especie animal, de la ruta de administracin y del estado nutricional [5]. Gruppuso et al.(1990) en su estudio muestran que la dosis intravenosa ms frecuente para inducir la diabetes en ratones es de 65mg/Kg, sin embargo, Boylan et al.(1992) muestran que cuando la dosis es intraperitonial subcutnea debe ser de 2 a 3 veces mayor. Katsumata et al.(1992) concluyen diciendo que las dosis intraperitoniales inferiores a 150 mg/kg quizs sean insuficientes para inducir la diabetes en ratones.

Adems, ste ltimo autor y sus colaboradores aaden que los animales ayunados son ms susceptibles a la aloxana porque parece ser que los aumentos de glucosa en sangre confieren cierta proteccin. Por lo tanto, considerando stos estudios vemos que una de las razones por las que quizs no hayamos inducido la diabetes a nuestros ratones sea la dosis de aloxana. Teniendo en cuenta que nosotros en el estudio administramos una dosis de 75mg/Kg a ratones que no se encuentran ayunados, y por lo tanto poseen cierta proteccin a la aloxana. En posteriores estudios de ste tipo, conviene entonces aumentar la dosis de aloxana (2 veces mayor) y mantener los ratones en ayunas antes de la administracin de la droga. Tiempo de estudio insuficiente: No creemos que los resultados se deban a un perodo de estudio corto, ya que como muestra Lenzen en su estudio [4] son suficientes de 12 a 48 horas para ver aumentos de glucemia significativos, e incluso antes de las 72 horas se ha inducido ya la diabetes (glucosa en sangre aproximadamente 17mM). (Fig.2B) En conclusin, el diseo experimental presenta errores que se han reflejado en los resultados obtenidos, siendo stos incongruentes. Parece ser que la dosis de aloxana administrada no ha actuado induciendo la diabetes a los ratones tratados, por lo tanto stos seguan produciendo insulina y seguan manteniendo la homeostasis de glucosa en sangre. Ello se refleja tambin en la evolucin del peso, el cual no ha variado significativamente porque la insulina est presente. Por ello, creemos que en posteriores estudios habra que reconsiderar la dosis de aloxana a administrar, as como tener en cuenta el estado nutricional del ratn cuando se le administra.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

[1] D. Randall, K. French; W. Burggren; Eckert. Fisiologa Animal: Mecanismos Y Adaptaciones; Ed.McGraw Hill 4Ed.(1998) pp. 522-553. [2] E.A.Newsholme y C.Start, Regulation in metabolism, Ed.John Wiley and Sons (1973). [3] M.Anderson, A.Gordon Wyse, W.Hill Richard; Fisiologia Animal: Control neurolgico y endocrino, sistema nervioso y relojes biolgicos; Editorial Mdica Panamericana S.A. (2006) pp 459-526. [4] S.Lenzen, The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin induced diabetes, Diabetologia. 51 (2008) 216-226. [5] T.Szkudelski, The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pancreas. Physiol.Res. 50 (2001) 536-546. [6] X.Fuentes Arderiu, M.J.Castieiras Lacambra, J.M.Queralto Compao, Bioqumica Clnica y Patologa Molecular, Vol 2, 2Ed., Editorial Revert (1998) pp.71-72.

TABLAS Y FIGURAS

Fig.1 La baja o nula secrecin de insulina por el pncreas impide la entrada de glucosa circulante en las clulas, ello desencadena la hiperglucemia. Los individuos como consecuencia presentan tres sintomatologas propias de la diabetes mellitus: Polifagia, poliuria y polidipsia [6]

TABLAS Y FIGURAS

Fig.2A Fmula qumica de la aloxana (2,4,5,6-Tetraoxypirimidina). Derivado oxigenado de la pirimidina, muy hidroflico y anlogo de la glucosa txico en las clulas beta pancreticas. Se trata de un compuesto inestable y de vida media corta, puede ser reducido a cido dialrico no txico para las clulas beta, en presencia de GSH y otros tioles.[4]

Fig.2B Fases de glucosa en sangre en respuesta a una dosis del diabetgeno alloxana (tetrafsico I-IV) [4]

TABLAS Y FIGURAS

250

200 Valores de glucemia basal (mg/dL)

150

Control Aloxana Lineal (Control)

100

Lineal (Aloxana)

50

Fig.4 Representacin grfica de los resultados obtenidos para la glucemia basal de los 19 ratones de estudio.

TABLAS Y FIGURAS

600

Valores de glucemia basal sobrecarga (mg/dL)

500

400 Control 300 Aloxana Lineal (Control) Lineal (Aloxana) 200

100

Fig.4 Representacin grfica de los resultados obtenidos para la glucemia basal sobrecarga de los 19 ratones de estudio.

TABLAS Y FIGURAS

Evolucion del peso en el grupo experimental control

50

40

30 Ttulo del eje

Peso Tratamiento 1 Peso Tratamiento 2

20

Peso tratamineto 3 Lineal (Peso Tratamiento 1) Lineal (Peso Tratamiento 2)

10

Lineal (Peso tratamineto 3)

-10 Fig.5 Representacin grfica de la evolucin del peso en ratones tratados con aloxana.

Evolucion del peso en el grupo experimental tratado con aloxana

60

50

Peso Tratamiento 1 Peso Tratamiento 2 Peso tratamineto 3 Lineal (Peso Tratamiento 1) Lineal (Peso Tratamiento 2) Lineal (Peso tratamineto 3)

40 Ttulo del eje

30

20

10

-10

Fig.6 Representacin grfica de la evolucin del peso en ratones del grupo experimental control.

Tabla 1.Comparacin si existen diferencias entre aloxana y control. Glucemia basal Descriptivos GluBasal Intervalo de confianza para la media al 95% N 1,000 2,000 Total 10 9 19 Media 137,20000 140,77778 138,89474 Desviacin tpica 40,916718 53,950852 46,196314 Error tpico 12,939002 17,983617 10,598161 Lmite inferior 107,92994 99,30748 116,62883 Lmite superior 166,47006 182,24807 161,16065 Mnimo 89,000 72,000 72,000 Mximo 207,000 229,000 229,000

Prueba de homogeneidad de varianzas GluBasal Estadstico de Levene 1,740 gl1 1 gl2 17 ANOVA GluBasal Suma de cuadrados Inter-grupos Intra-grupos Total 60,634 38353,156 38413,789 gl 1 17 18 Media cuadrtica 60,634 2256,068 F ,027 Sig. ,872 Sig. ,205

Tabla 2. Comparacin si existen diferencias entre aloxana y control. Peso Descriptivos Peso Intervalo de confianza para la media al 95% N 1,000 2,000 Total 10 9 19 Media 42,88800 42,30556 42,61211 Desviacin tpica 5,625537 5,020486 5,207202 Error tpico 1,778951 1,673495 1,194614 Lmite inferior 38,86373 38,44647 40,10231 Lmite superior 46,91227 46,16464 45,12190 Mnimo 38,100 35,500 35,500 Mximo 52,700 51,000 52,700

Prueba de homogeneidad de varianzas Peso Estadstico de Levene ,300 gl1 1 gl2 17 Sig. ,591

ANOVA Peso Suma de cuadrados Inter-grupos Intra-grupos Total 1,607 486,462 488,069 gl 1 17 18 Media cuadrtica 1,607 28,615 F ,056 Sig. ,816

Tabla 3. Comparacin si existen diferencias entre aloxana y control. Glucemia 45min

Descriptivos Glu_45min Intervalo de confianza para la media al 95% N 1,000 2,000 Total 10 9 19 Media 209,30000 236,77778 222,31579 Desviacin tpica 63,338684 110,643321 87,438266 Error tpico 20,029451 36,881107 20,059714 Lmite inferior 163,99023 151,72979 180,17189 Lmite superior 254,60977 321,82576 264,45968 Mnimo 135,000 129,000 129,000 Mximo 332,000 505,000 505,000

Prueba de homogeneidad de varianzas Glu_45min Estadstico de Levene ,312 gl1 1 gl2 17 Sig. ,584

ANOVA Glu_45min Suma de cuadrados Inter-grupos Intra-grupos Total 3576,450 134041,656 137618,105 gl 1 17 18 Media cuadrtica 3576,450 7884,803 F ,454 Sig. ,510

Fig 6. Comparacin si existen diferencias entre aloxana y control. Glucemia basal

141,000

140,000

Media de GluBasal

139,000

138,000

137,000

1,000

2,000

Tratamineto

1= control

2=aloxana

Fig. 7 Comparacin si existen diferencias entre aloxana y control. Peso

42,900

42,800

42,700

Media de Peso

42,600

42,500

42,400

42,300

1,000

2,000

tratamiento

__ 1= control 2=aloxana

Figura 8. Comparacin si existen diferencias entre aloxana y control. Glucemia 45min

240,000

230,000

Media de Glu_45min

220,000

210,000

1,000

2,000

tratamiento

1= control

2=aloxana