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RiornoAéculas y métodos bioquímicos

Este capitulo tiene cinca objetivos. El primero se refiere a la camposici6n del cuerpo y a las princi-

pales clases de moléculas que se encuentran en 61. El

estudio de estas mol&culasconfonnagrnn parte de este

texto.

La ctluIa es la principal unidad estructural y

funcional de la biología. La mayor parte de las reac-

ciones químicas dentro del cuerpo tienen lugar en las

c6lulas. Por tanta, el segundo objetivo es dar una

descripci6n concisa de los componentes de las c&lulas

y de la forma en que pueden aislarse; los detalles de

las funciones de estos componentes constituyen gran

parte de la estructura del libro.

El tercer objetivo concierne al hecho de que la biquimica es una ciencia experimental. Es importante comprender y apreciar el enfoque experimental y los mbtodos usados en bioquimica, para permitir que su estudio se convierta en un ejercicio rutinario del aprendizaje. Más aún, la bioquímica no es un cuerpo inmutable de conocimiento, sino un campo en evolución constante. Los adelantos, como en otras lireas de la bioquímica, dependen de la innovación en el enfoque experimental y tecnológico. El cuarto objetivo consiste en resumir de manera breve los principales logros obtenidos en bio- química. La visibn concisa de la ciencia, que se pre- sentad aquí, ayudará a impartir en el lector un sentido de la direccibn global del resto del texto. El quinto objetiva se dirige a destacar lo poco que conocemos en ciertas Areas, por ejemplo, sobre el desarrollo, la di ferenciacidn y funcibn cerebral, el cáncer y muchas otras enfermedades humanas. Quizá esto sirva de estimulo a algunos lectores para contribuir a la investigacibn de estas Areas.

EL CUERPO HUMANO SE COMPONE DE UNOS CUANTOS ELEMENTOS

QUE COMBINADOS FORMAN UNA EXTENSA VARIEDAD DE MOLÉCULAS

Los principales elementos san carbono,

hidrágeno, oxígeno y nitrógeno

Se ha determinado la composición elemental del cuerpo

humano y en el cuadro 2-1 se muestran los principales

resultados. El carbono, oxígeno, hidrbgeno y ni-

trógeno son los constituyentes principales de casi

todas las biomol&culas. El fosfato es un componente

de los Iicidos nucleicos as1 como de otras moléculas y

tambikn se distribuye ampliamente en su forma ioni- zada en el cuerpo humana. Por su parte el calcio tiene una funci6n importante en innumerables procesos biolbgicos y sobre él esta enfocada buena parte de la investigacibn. Los elementos enumerados en la ter- cera columna desempefían diversas funciones. Muchos de ellos se manejan casi diariamente en la prhctica mkdica al atender a pacientes con desequili-

brios electroliticos (K', Na', C1- y Mg2+},anemia por

deficiencia

de hierro (Fe2+) y enfermedades de la

tiroides (1-1.

Las cinco principales biomolécufas complejas son DNA, RNA, proteínas, polisacaráridos y Iípidos complejos

Como se muestra en el cuadro 2-2, las principales biomol~culascomplejas encontradas en las células y tejidos de los animales superiores (incluyendo al ser humano) son DNA, RNA, proteínas, polisacfiridos

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Cuadro 2-1. Composición ekemental aproximada del cuerpo humano (con base en peso seco)*

-

Carbono

50

Ovigeno

 

Azufre

I

lidrógeno

 

N

itrógcno

alcio

F.c

jsforo

ques estructurales de los Iipidos, aunque éstos no son

polimeros de acidos grasos. Al DNA, RNA, proteinas

y polisacaridos se les conoce como hiopolimeros debido a que esthn compuestos de unidades repetidas de sus bloques estructurales (los mon6meros). Las

rnol~culasantes mencionadas constituyen esencial- mente el "ingrediente vital" de este texto; la rnayor parte se ocupa de describir sus características bio-

químicas y las de sus bloques estructurales. Por lo

general se encuentran las mismas moleculas comple-

----

  • 0.00005 jas en los organismos inferiores, pero pueden diferir de los que se muestran en el cuadro 2-2. Por ejemplo, las bacterias no contienen giucogeno o triaci!- gliceroles, pero poseen otros polisacaridos y Iípidos.

* Reproducido con autorizacibn de West ES. lodd WR. T?xzbook

ofRiochcmist~.3rd ed. Macmillan, 1961.

y lipidos. Lac moiéculac complejas se construyen a partir de biomoMculas simples, tainbien enumeradas. Los bloques estructurales del DNA y el RNA (Ila- rnados colectivamente ácidos nucleicoc) son los

desoxinucleótidos y los ribonucle6tidos, respccti-

vamente. Por su parte, las bases estructurales de las protehas con los arninoitcidos, mientras que los po- lisacaridos estan constituidos por carbohidratos sim-

ples; en el caso del glucógeno (polisacárido principal

de los tejidos humanos), el carbohidrato es la glucosa.

Los ácidos grasos pueden considerarse como los blo-

Cuadro 2-2. Biomol&culas orghnicas comptejas

principales de células y tejidos. Los &cidos nucleicos,

proteinas y plisadridos son biopolimems, constrriidm

a partir de las bases estructurales mostradas. Por lo general, tos lipidos no son biopolimaros y no todos tienen ácidos grasos como bases estructurates

-.

.

.

- ..

-

-

-.

Proteínas, I ípidos, carbohid ratos, y minerales son los principales

agua

componentes del cuerpo humano

Ya se mencionb cual es la composici6n elemental del cuerpo humano. Su composición quimica se muestra en el cuadro 2-3; proteina, grasa, carbohidrato, agua y

minerales son los elementos principales. E1 agua coris-

tituye la proporción mayor, aunque su cantidad varia

ampliamente en los difcrentes tejidos. Su naturaleza

polar y su propiedad de formar puentes de hidrogeno

hacen al agua idealmente adecuada para su función

como solvente en el cuerpo. En el capítulo 3 se pre-

sentan con mayor detalle las propiedades del agua.

LA CÉLULA ES LA UNIDAD BÁSICA DE LA BIOLOG~A

1

ases

la=-[ estructurales

1

~uncioni

principales

La célula fue reconocida como la unidad fundamental

-

D

-"

de la actividad biológica por Schleidcn y Schwann y

-, --

" .-

por otros pioneros como Virchow en el sigloXIX. Sin embargo, en los aRos posteriores a la Segunda Guerra

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( Riboni

nolde par

rrotelnica

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PI~~~~~~~

AminoAcidos

Numerosas: por lo gene-

ral son las moEculas que

Cuadro 2-3. Composici6n química normal

. ---

---

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-

Sn que pesa 65 kg"

! - "qP0rce-D" -

.

-.

"

..

.A"

.-

--

--

Proteínas

1

11

17.0

(elucóeeno)

---

  • L ipidos

    • 1 branas y almaccnaje por tiempo prolongado dc

energía como triacil-
1

aliccroles

Grasas

9

13.8

Carbohidrato

I

15

Agua?

Milierales

,

-

.-

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4

i

51

iII

.

--

* Reproducido con autor17 ación de D:

avidson SD, Parsmore R,

Hrock JF: Iiuman ,l'uiri

rion and Di

ererrcs, 5th ed. Churchill

Livingstone, 1973.

El valor para el agua pucdc variar ampliamente entre los riirc-

rentes tejidos, siendo tan bajo como 22 5% para el hueso sin

mtdula Además, el porcentaje dcf agua tiende a disminuir

confunnc alimenta 13 grasa curpura)

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Mundial, tres sucesos ayudaron al inicio de un periodo de actividad sin paralelo en la bioquimica y la biologia celular. Fueron: 1 ) la disponibilidad creciente del mi- croscopio electrónico; 2) la introducci~nde rnktodos que permiten separar las células bajo condiciones relativamente poco agresivas de modo que se preserve su función: 3) el desarrollo y disponibilidad de una ultracentrifuga refrigerada de alta velocidad, capaz de generar fuerzas centrífugas suficientes para aislar los constituyentes de las celuias separadas sin sobre- calentarlos y, por tanto, sin desnaturali7arlos. El uso del microscopio electrónico reve16 muchos de los componentes ce!ularec que hasta entonces eran desconocidos o deficientemente observados, en tanto que la rotura de las células y la ultracentrifugación permitió su aislamiento y anhlisis in vitro.

El hepatocito de rata muestra características comunes a muchas

células eucariotas

En la figura 2-1 se muestra un diagrama de la estruc- mra de una ckIuEa hepatica (hepatocito) de rata; es

probabEe que ésta sea la célula m8s estudiada desde el

punto de vista bioquímico, en parte por su disponibili-

dad en cantidades relativamente grandes, por su faci-

lidad para fraccionarse y por la diversidad de siis

funciones. El hepatocito contiene todos los organelos

principales que se encuentran en [as células eucariotas

(cuadro 24); es decir, niicleo, mitocondrias. retículo

endoplásmico, ribosomas libres, aparato de Golgi,

lisosomas, peroxisornas, membrana plasrnatica y ciertos

elementos citotsque2eticos.

Para disgregar células y aislar moléculas intracelulares y organelos

subcelulares se usan técnicas físicas

Para estudiar con profundidad la funcidn de cualquier organelo, es necesario primero aislarlo en forma rela- tivamente pura, sin contaminacion importante de otros organelos. El proceso habitual para conseguirlo se llama fraccionamiento subcelular y, por lo general, comprende tres procedimientos: extraccibn, homo- geneización y centrifugaci6n. Gran parte de los traba- jos iniciales en esta irea utilizaron higado de rata.

A. Extracción

Como primer paso hacia el aislamiento de un organelo (o molécula) especifico, es necesario extraerlo de las cAulas en que se localiza. La rnayoria de los organelos y muchas ~iomoleculasson bastante Ihbiles y propen- sos a perder sus actividades biolbgicas. De acuerdo a ello, deben extraerse en condiciones poco agresivas

Retículo

endopllrsmico

h

Citoesqueleto

Membrana

plasmalica

Peruxisoma

citoso1

Lisosoma

Figura 2-1.

Representacibn esquematica de una dlula

hep8tica de rata, con sus organefos principales

(es decir, usando soiuciones acuosas y evitando si- tiiaciones extremas de pH, presibn osmótica y tempera- turas altas). En realidad, muchos de los psocedimien- tos para aislar organelos se efectria aproximadamente entre 0 y 40 "C (por ejemplo, en un cuarto frlo o utilizando materiales conservados en hielo). A la temperatura ambiente puede haber pérdida significativa de la ac- tividad, en parte por la acción de varias enzima5 digestivas (proteasas, nucleasas, etcktera), liberadas cuando se rompen las cdlulas. Una solución comun para la ex- traccion de organelos consiste en sacarosa 0.25 moVL (Esosmótica), ajustada a un pH de 7.4 con un amor- tiguador de hcido cIorhidrico-TRIS (tris [hidmimetil] am jnomewno), 0.05 moW, que contiene iones K' y Mg2' a concentraciones casi fisiol~gicas;a esta solución se le conoce con las siglas STKM (del ingles, Sucrosu,

Tris, Kulium y Magnesiurn). No todos los solventes

usados para la extraccibn son tan suaves como el STKM ; por ejemplo, para extraer lipidos y ácidos nucleicos se emplean solventes orghnicos.

imdro 24

poriancia

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t fraccibn*

Marc:ador

Funcio'nes princi

A

 

- - - . A - - A

 

DNA

los cromo!

iornas

 

Lugar donde

se desarrvl

la la sintesi

dirigida pc

 

.

,

-

Mitoconorion

 

biut&nico d~hidrog~n~a

lo cA(trrg

osforilaci b n oxidativa-A-

 

-~ibosoma*

Alta contenido de RNA

Sitio de la síni

tesis protteí!

icibn del mRNA a pro-

 

! teina)

 

:f ículo endc

Glucosa.

Lo

S rihosomas unidos a la mernbrama son un

 
 

tan

ite de síntesis proteinica

 

itesis de varios Iípidas

Sir

-

Ox

idación de nume~osos~en~i6ticos

(citocmmo_i~4~o~

Li:

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e

-

 

ATPEI~

insporte dc

molCculm

dentro y ti uera dc las

 

Mi

herencxa y comunicacibn interce

 

Aparato de Golgi

 

Di:

jtribucion intracelular

de protein

1

 

Re

acciones de glucosilac :i6n

Re

acciones de sulfatació

n

Pe

-

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iducción y

crofilamen

ie ciertos á

cidos gracos y amino

degtadrtcíi

-

in.- de - peroxido de hd!

tos, microti

Úbulos, filamentos intl

 

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-

'OS'

Citosol*

ieshidroge

-

entidad suba

nasa

-

* Un organelo se puedc dcfinir como una

:eEulwquue e

1 En:

zlmas-ae

".

!a gtuco~isis, síntesis de :- hcidos

--

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oormembranav se aislar

ior ccntxifup

aci6n a altas

De acuerdo a Ia definicihn, los ribma5, ei crioesqueieto y ei citosoi no son organclos. Sin embargo, aqui se les considera junto con

.

.

.

.

ellos dehido a que, por lo general. también se aislan pr centrifugacibn F 'ueden ctasii

iicarse comc

b entidades c

i fracciones subcelulares

Un organelo al sisl arse p

ic ccetrifug

aci6n difere

ncial rara vi

2s: es puro; 1

Jara obtener

una fraccib

n pura, habi

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S

necesario pnr lo menos, c

Laq fracciones de citoesq

or un ciclo i ierto numerc

i de ciclos.

ueleto se pi ieden recont

xer por mii

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por análisis

oforesis de

 

S

carxteristicñs que contiei

1P"

 
  • B. Homogeneización

Para extraer un organela (o biomolkcu1a) de las c&lu- las, primero es necesario romperlas bajo condiciones suaves. Los 6rganos (hígado, rifion, cerebro) y las

células que contienen se pueden

separar de manera con-

veniente mediante el proceso de homogeneizacibn; éste consiste en girar manualmente o por medio de un motor, un agitador dentro de un tubo de vidrio de dimensiones adecuadas que contiene los fragmentos desmenuzados del &gano en estudio con un medio hornogeneizante apropiado como STKM. La rotacibn controlada del agitador ejerce una fuerza mechica en las dtulas y las rompe lihdo sus constituyentes en la sacarosa. Resulta una suspensión que contiene muchos organelos intactos, la cual se conoce como

homogenado.

  • C. Centn'fugacidn

El subfraccionamiento del contenido de un homo-

genada por centrifugación diferencial ha sido una tkc- nica de importancia capital en bioquimica. El mttodo

clásico utiliza una serie de tres pasos de centrifugación diferencial, con velocidades sucesivamente mayores

(figura 2-2) y cada uno produce un sedimento y un

sobrenadante. El sobrenadante de cada paso es centri- fugado en el siguiente. Este prmedimiento proporciona tres sedimentos, que son las fracciones nuclear, rnito- condrial y rnicrosbmica. Ninguna de las fracciones está compuestade organelos absolutamente puros. Sin embargo, se ha establecido con precisión por el uso del microscopio electrbnico y por mediciones de enzi- mas "marcadoras" adecuadas y de componentes químicos (por ejemplo, DNA y RNA) que los consti- tuyentes principales de cada 1 de las 3 fracciones son nucleos, mitocondrias y microsomas, respecti- vamente. Una enzima o un compuesto químico "mar- cador" es aquel que esta casi exclusivamente confmado a un organelo particular, corno la fosfatasa

hcida en los lisosomas y el DNA en el núcleo (cuadro

24). Por tanto, sirve para indicar la presencia o ausen- cia, en una fracción determinada, del organelo en el que esth contenido. La fraccibn microsbmica (mi-

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Sobrenadante (1)

-

'

Sobrenadante (3)

15 o00 g

  • x 5 min

P

Fraccibn

Fraccibn

nuclear

microsbmica

Figura 2-2. Esquema de separacibn de fracciones cubceluTares por centrifugaeibn diferencial. f l tejido hornogeneuado (por ejemplo, hepfitico) se sujeta primero a centrifugacibn a bala velocidad para obtener la fraccidn nuclear (que contiene tanto núcleo como dlulas enteras) y el sobrenadante (1). Este ultimo se decanta y sujeta a centrifugacion a veloadad intermedia para producir la fraccibn mitocondr~af(que contiene rnitocondrias, lisosomas y peroxisomas) y el sobrenadante (2) este se decanta y sujeta a centrifugacibn a alta velocidad para obtener la fracción microsórnica (que contiene una mezcla de ribosomas libres y reticuio endoplAsmico liso y rugoso) y una soiucibn final clara, el sobrenadante (3). Este último corresponde aproximadamente al citocol o savia celular. Modificando de varias maneras el mktodo, por lo general, es posible aislar mda

organelo en forma casi pura

crosomas) contiene principalmente una mezcla de

reticulo endoplásrnico liso, retículo endopliismico ru-

goso (es decir, que tiene adheridos ribosomas) y rE-

bosornas libres. E! contenido del irltimo sobrenadante

corresponde a la savia celular (citosol). Las modifi- caciones a este proceso bácico, que utilizan medios diferentes de homogeneizacibn o protocolos distintos de centrifugacion (por ejemplo, el uso de gradientes, continuos o discontinuos, de sacarosa), han pem itido el aislamiento, en fonna más o menos pura, de todos los organelos ilustrados en la figura 2-1 y enumerados el cuadro 24. El esquema descrito anteriormente es aplicable en tkrminos generales a la mayoría de los 6rganos y las dlulas; sin embargo, los fraccionamien- tos celulares de este tipo deben ser valorados con mediciones de enzimas o de compuestos químicos marcadores y por el rnjcroscopio electrónico, hasta que el procedimiento global pueda considerarse estan- darizado. La importancia de los estudios de frac- cionamiento subcelular en el desarrollo de la bio- química y la biologia celular, no se exagera por su enfoque experimental y amplio uso, constituye una parte fundamental en el estudio de las funciones de los organelos celulares. La infomaci6n de estas funcio- nes, resumida en el cuadro 24, representa uno de los mayores logros de la investigac i 6n bioquimica

en

(vkase despubs).

El enfoque experimental tiene

tres componentes

Los componentes principaEes del enfoque experimen- tal son tres: 1) el aislamiento de biomoldculas y or- ganelos (vdase Centrifugación, antes) contenidos en las células; 2) la deteminacibn de la estructura de las biomoléculas, y 3) el aniilisis, utiIizando diversas preparaciones, de la funcion y el metabolismo (es decir, sintesis y degradacibn) de las biornoltculas.

El enfoque experimental requiere del aislamiento

de biomoléculas

Como en el caso de los organelos, conocer la funci6n de cualquier biomoidcula requiere que primero se le aisle en fonna pura. En el cuadro 2-5 se resumen los mktodos principales empleados para separar y purifi- car biomolkculas. Aquí no se detall&, pero algunos se explicarán de modo breve en otras partes del libro. Para purificar una biomol&culase necesita casi siem- pre una cornbinaci6n de mitodos hasta lograr la ho- mogeneidad (la forma pura sin contarninacibn por cualquier otra biomolécula). Es importante apreciar que los adelantos en bio- quimica dependen del desarrolIo de ttscnicas nuevas

Cuadro 2 -5. Prin cipales n mbtodas r isados p ara C Yuadro 2- 6. Princip
Cuadro 2
-5.
Prin
cipales n
mbtodas r
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C
Yuadro 2-
6.
Princip iales meto
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separar y
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Espectroscopia ultrnvioleta, visil
sle, infrarr o,ja y de reso-
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uimicos.
El uso en secuencia I de varias de
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Uso de hidrólisis ácida o alcalina para degras dar la hiomo-
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Cromatogt
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Cristalografi
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X
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En papel
Por intercambio ibnrco (intercan
Por afinidad
En capa fina
Gas-l1qu1
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En fase li
quida a alt
Filtración i
tn gel
Electroforr
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En papel
Con alto vvltaje
biornoléculas. El lector con algunos conocimientos de
química orghnica los encontrara familiares. Ciertas
enzimas cuya especificidad se conoce, son medios
muy poderosos para revelar estas caracteristicas
estructurales. El perfeccionamiento en la resolución
En agarosa
respaldado por los adelantos tebricos y tecnolbgicos,
En acetato de cclulosa
está convirtiendo cada vez más a la espectrometria
En gel de almidiin
de masa y a la de resonancia magnetita nuclear
En poliacrilamida
Poliacrilamida y dot
I sódico (S1
(RMN), en los métodos de elección rutinarios para
I!ltracentrifugacibn
estos
analisic. Las estructuras de las cadenas extre-
--
-
madamente complejas de los carbohidratos conteni-
dos en ciertas biomoléculas, como las glucoproteinas,
se pueden ahora aclarar por la elevada resolucibn de
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de anliIisis, purificacibn y determinación de estmc- turas. Por ejemplo, el campo de la bioquimica de los Iípidos avanzó con rapidez gracias a la introduccibn

de la crornatografia en capa fina y

gas-liquido. El

anklisís de la membrana y de muchas proteínas era

extremadamente dificil hasta la introducción de la

electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsul-

fato sódico (EGPASDS); el detergente dodecilsul- fonato sódico permiti6 la "solubilización" para la electroforesis de muchas proteinas que antes no habían logrado disolverse. Asimismo, el desarrollo de métodos para la secuenciacihn y clonacion del DNA ha tenido un efecto revolucionario en el estudio de los ácidos nucleicos y de la biología en general.

El enfoque experimental requiere la determinación de la estructura de biomole~ulas

Una vez que una biornoIecula ha sido purificada es necesario determinar su estnictura. De este modo puede hacerse una correlacion entre estnictura y fun- ción. En el cuadro 24 se enumeran los metodos principales en uso para analizar la estructura de las

la espectrometría RMN. Una infomacion m8s deta- llada se logra con la difraccibn de los rayos X y la cristalografia. Su uso fue decisivo para revelar las

estructuras dctalIadas de varias proteínas, enzimas y la naturaleza de la doble hélice de DNA.

El enfoque experimental requiere análisis de la función y metabolismo de biomoléculas, utilizando varias preparaciones

La investigacihn bioquímica inicial en el ser humano y los animales se hizo con el anima1 intacto. Son

ejemplos los estudios de

la respiracibn y el destino de

las sustancias ingeridas. Pronto se descubri6 que el animal íntegro erademasiado complejo para permitir dar respuestas definitivas a numerosas interrogantes. En concordancia, se hicieron preparaciones más sencillas in vitro, que eliminaron muchas de las complicaciones experimentadas con el animal intacto. El cuadro 2-7 resume los diversos tipos de preparaciones de que se dispone ahora para estudiar los procesos bioquimicos; la mayosia de tos conocimientos presentados en este texto se han obtenido gracias a su uso. El enlistado se

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-

,a 2-7. Je

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.......

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Comentar

35 procesi

Esruaios a ni

vcl del

animal int;

rueaen sc.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Bxtirpaci6n de un 6rgano (por ejemplo. hepatectomia)

Alteraciones en la alimentación (por qjemplo, ayuno-posprandial)

AdministraciOn de un fármaco (por ejemplo. fenobarbital)

Administracihn de una toxina (por qemplo, tetracloruro dc carbono)

uso

de iin anirr

ial cori una

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id especific

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nplo, diabc :tes sacarin

a)

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p.

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-

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.--p.

, -

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.' . - - - .-.-

Los Cstiid~ubachrc n~vcisur1 a rricnriuu iibiuiugicoh, pcru uueucri xr uiliciics CYCirricruretar debido

a la intcracción orgánich mediada por la circulacion

-.

. --p.

.-.- .-

ia nervioso

1 central

--

-

En particular higado, ~oraz6ny rifiiin son adecuado:

Este método permite el estudio de un organo aislado de la influencia dc otros o dcl sistema nervioso

--

-

..

Especfaln

nente se ha

n usado cortes de tejido hephtict

)

Aislíi los 8

cortes tisu1

ares de otras influencias. pero lar

; preparacii

mes tiende

de alguna

p---

1s heras, cn parte debido al suministro inadecuado ac nutrientcs

.

.

L-

...

-2AAA-L

....

"A-A

...........

o

i

. Aplicable en particular a lm células sanguínea, que pueden ser purificad

7.

En mucha breas de la biología son indispensah

les los culi ivos de teji

--

-

. -.

.- - .

--

OrganeIos cetulares

aislados

-. A ""

--

Subfracciona miento de

organelos

t. Asegura una prcparacibn qiie no contiene cklul;

Ls

2.

Pueden agregarse o removerse comnuestos esneciiiuis rnor eiemniri. nur ui~hisisiv ehrudiar sus

TI-.

..

d

..

...

:

...

.,.

...

efectos

.

.

3.

Pucdc ser subfr accionado por centrif ugacibn

-

.- --

-

pa-

.ra pproducii

r orgnnelos

: celulares i

Ampliamente usados s, para estu

di~la func

~bnde mitr icondrias, r

*eticuIoenc

loplásmico

ente usado S, por ejemplo, en cstudios de la funcibn mitocondrial

-

.....-..

s.-.---A""

....-

Aislamiento

aci=.

ri~acióndi

: metabuli-

t=pai rc v irni uLi aiiálisis de cualquier reacciiin o vía quirnica

tos y emir

"

nas

".

-

-

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Clonacidn de genes qu~ tl aislamiento del gen clonado es esencial para cstudtar los detalles de su estructura y rcgulaclbn:

codifican r

t ambitn iuede revel ar b secuencia de am

It la enzimi a o proteinl a n la que 1

presenta en orden decreciente de complejidad. Igual

que el uso de animal integro tiene desventajas, las

demás preparaciones tambiéin tienen sus limitaciones.

De los procesos usados in vitro pueden derivar resul-

tados erroneos (artefactos); por ejemplo, Ea homo-

geneizacién de las células puede liberar enzimas que

digieran parcialmente a las moléculas celulares.

LAS ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE REACCIONES

BIOQU~M~CASSON COMPLEJAS Y EN MÚLTIPLES NIVELES

Gran parte de esta obra se dedica a los procesos

bioquimicos complejos (por ejemplo, slntesis de pro-

teinas y contracción muscular), incluyendo las vías

rnetabólicas. Una vía metabhlica es una serie de

reacciones responsables de la síntesis de un com-

puesto complejo a partir de uno o miis compuestos

simples o de la degradación de una sustancia hasta su

producto final. La existencia de un proceso bio-

quimico complejo o de cienas vias metabhiicas puede

inferirse de las observaciones a nivel del animal in-

tacto. Por ejemplo, observaciones directas de nuestros

congeneres indican que los músculos se contraen.

Sabemos que la glucosa sirve como fuente de energia

para el ser humano y otros animales; por tanto, pode-

mos deducir que debe ser degradada (metabolizada)

en el cuerpo para producir energia. Sin embargo, la

comprensi6n total de la forma en que la glucosa se

metaboliza en las cklulac humanas -su conocimiento

está aún lejos de ser completo- se requieren anhlisis

a diferentes niveles. Lafiqura2-3 muestravarios tipos

de observaciones y anhlisis utilizados en un intento

por comprender los procesos bioquimicos, como la

degradación inicial de la glucosa para producir ener-

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gia (proceso conocido como glucblisis). El esquema de la figura 2-3 se aplica en un nivel general a todos los procesos bioquimicos principales por lo cual re- presenta una estrategia global para diIucidarlos; cada uno de los procesos (glucblisis, oxidación de los Aci- dos grasos, etcétera) debcdn tenerse en mente al estudiar el texto, aunque no siempre encontrarán lugar todos los puntos mencionados. Algunos puntos importantes del cuadro 2-7 y de

la figura 2-3

ameritan discusión. 1) A pesar de la

posibilidad de artefactos, es absohtamente necesario aislar e identificar cada uno de los componentes de un proceso bioquimico en forma pura para comprenderlo a nivel molecular. Más adelante se encontrarán nu- merosos ejemplos de esto. 2) También es importante

~oderreconstituir in vitro el vroceso en estudio. me- diante el ensamblaje sistemático de sus componentes individuales. Si el proceso no se realiza al ser reen-

sambladas sus partes, una explicacibn puede ser que algun componente critico ha escapado a la identifica- ci6n y, por tanto, no se ha afiadido. 3) Los adelantos tecnologicos recientes (por ejemplo, en espectros- copia RMN y en tomografia por emisión de positro- nes [TEP]) han permitido la detección de ciertas

biomoléculas a nivel del &gano intacto y la vigilancia

de Eos cambios en sus cantidades con e1 tiempo. Estos

desarrollos indican que se esti haciendo posible efec-

tuar anhlisis sofisticados de muchos procesos bio-

químicos in vivo. 4) Cuando los resultados obtenidos

con el uso de varios planteamientos a diferentes

niveles son congruentes, entonces se justifica concluir

que se ha logrado un progreso real en la comprensión

del proceso bioquímico en estudio. Si utilizando di- versos enfoques, se obtienen incongruencias imporian- tes, en toncesdekn inrestigme sus causas hastaobtener explicaciones racionales. 5) Las preparaciones y niveles de anhlisis delineados pueden utilizarse para estudiar alteraciones bioquimicas en animales con estados metabólicos alterados (como ayuno o inges- tión de alimentos) o enfermedades especificas (por ejemplo, diabetes sacarina, o cincer). 6) Muchos de los mktodos y enfoques indicados pueden aplicarse a estudios de ctlulas o tejidos humanos normales o enfermos. Sin embargo, debe tenerse cuidado de ob- tener material fresco y prestar atención particular a las consideraciones tticas que se aplican a la experimen- taci6n en el ser humano.

Los Esótopos radiactivos pesados

han contribuido de manera importante en el ecclarecimienta de procesos bioquímicos

La introduccibn del uso de isbtopos en la bioquimica en el decenio de 1930 tuvo un impacto notable; en consecuencia, su uso merece discusibn especial. Antes de su empleo, era muy dificil "marcar" las biomo-

Deduccibn de la existencia del proceso bioquímico de la vla metabólica por las observaciones hechas a nivel del animal intacto

&

Anhlisis de sus mecanismos de control in vrtro

J

Anhlisis de sus mecanismos de mntrol in vivo

.1

AnBltsis de bc efectos de enfermedades específicas sobre di (por epmpio. errores cong8nitos del metahlismo. cáncer)

&

SU locallzaubn en uno o mas brganoc

1

Su localizacibn en celulares

uno o mAs organelos celulares o fracciones sub-

3.

Determinación del número de reacciones que intervienen en 81

4

Purificación de sus susb-atos. productos, enzimas y uifactores indi- viduales u otros componentes

&

Establecimiento de los mecanismos de control utilizados en él

.1

Su reconstruccibn

L

Estudios del proceso o vla a nivel genbnm por los mktodos de la

tecnología del DNA recombinante

Figura 23. Esquema de la estrategia general utilizada para

analizar un proceso bioqulmim o una vía metabblica. Los

planteamientos enumerados no necesrtan efectuarse obli-

gadarnente en la secuencia precisa indicada aquí Sin em-

bargo, por lo general mediante su uso se han dilucidado los

detalles de los procesos o vías bioquimicos Por tanto, &te

es el esquema que se aplica de modo común a Mas las vias

rnetabblicas principales explicadas en los capítulos siguientes

Itculas de modo que sus destinos metabblicos pu- dieran vigilarse de modo conveniente. Los estudios iniciales, en particular los de Schoenheimer y sus colaboradores, se aplicaron a la utilización de ciertos isótopos estables (por ejemplo, D2 y NI5) combinados con su identificación por espectrometría de masa, para dilucidar muchos problemas bioquimicos. Por ejemplo, pudieron sintetizarse varios arninoAcidos, azúcares y iicidos gsasos que contenian un isótopo estable adecuado y, entonces, administrarse a un animal o agregarse a una preparacibn in vitro para trazar su destino metabólico (por ejemplo, vidas medias y con- versi611 a otras biomoltculas). Los compuestos mar- cados con is6topos estables se utilizaron para investigar muchos aspectos del metabolismo de pro- teinas, carbohidratos y lipidos. De estos estudios, se dedujo que el metabolismo es un proceso muy activo, en donde Ea mayoría de los compuestos en una cdlula se estan sintetizando y degradando de manera con- tinua, aunque a velocidades que difieren amplia-

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mente. Schoenheimer llam6 a estos hallazgos "la

naturaleza dinhica del metabolismo".

La introducción subsiguiente de los is6topos ra-

diactivos y de instrumentos capaces de medirlos también

fue muy importante. En el cuadro 24 se muestran los

isdtopos principales, estables y radiactivos, usados en

los sistemas biológicos. El uso de los dos tipos de

isótopas es decisivo para el desarrollo de cada irea de Ia

bioquimica. La investigación de las biomoléculas

complejas y simples, in vivo o ipi vim, se apoya fwefte-

mente en su empleo. El gran avance logrado en la

secuenciacib de los hcidos nucleicos y en la rnedici~n

de cantidades extremadamente pequeflas de com-

puestos que se encuentran en los sistemas biolbgims

se debe a la radioinmunovaloración que también

utiliza isotopos.

LOGROS IMPORTANTES

CARACTERIZAN LAS

CONTRIBUCIONES DE LA BIOQU~MICAA LA CITOLOG~A

Y A LA MEDICINA

Los siguientes piirrafos resumen los descubrimientos

principales en el campo de la bioquimica, en particular

en relacibn con la bioquimica humana. Gran parte de

este texto desarrolla los temas que aquI se enumeran.

1) Se ha determinado la composición quimica global

de c&lulas,tejidos y 6rganos; los compuestos prin-

cipales se han aislado y sus estructuras se han

establecido.

2) Se comprenden, por la menos a un nivel general,

las funciones de muchas biomoléculas simples, las

cuales se describirhn en los capitulas subsiguien-

tes. Tambitn se han establecido las funciones de

biomol&culas complejas. Es de capital interks el

conocimiento actual de que el DNA es el material

gendtico que transmite su información a un tipo de

RNA (RNA mensajero, o mRNA) y este RNA a su

vez dicta la secuencia lineal de los aminoácidos en

  • g. Isatopo ,S princip

investiga

ici6n bioc

--

-.

. m.

. J esra mies

-

r

-.

1s oropos rac

liictivnr

I):

41:

Y'

las proteínas. E! flujo de 3a información del DNA

puede ser representado convenientemente como

DNA + RNA -+ proteina. Sin embargo, se conocen

excepciones importantes de algunos de los enun-

ciados anteriores. El RNA es el material gendtico

de ciertos virus. Además, en algunas circunstancias

la información contenida en el RNA puede trans-

crjbirse al DNA; este proceso se conoce como

transcripción inversa y es usado, por ejemplo, por

el virus HIV-1 (virus de inrnunodeficiencia hu-

mana-1), causa posible del SIDA.

3) El desarrollo de la tecnología del DNA recornbi-

nante constituye un logro fundamental. Esta tec-

nologla revolucion6 el estudio de la estructura y

funcibn de los genes y también tuvo un impacto

revolucionario en todos los campos de la biologia,

incluyendo la medicina.

4) Se han aislado

los principales organelos de las células

animales y establecido sus funciones principales.

5) Se sabe que casi todas las reacciones que tienen

lugar en las células son catalizadas por enzimas;

muchas de estas han sido purificadas y estudiadas

y se han descubierto las caracteristicas generales

de sus mecanismos de acción. Aunque la mayoría de

las

enzirnas son proteinas, en la actualidad se ha

establecido de manera firme que ciertas moldculas

de RNA tambidn tienen actividad biocatalitica.

6) Se han delineado las vías membólicas que intervienen

en la síntesis y degradacibn de numerosas bio-

molCculas simples y complejas. En general, se sabe

que 1a vía de sintesis de un compuesto es distinta

de

su via de degradacion.

7) Se han esclarecida algunos aspectos de la regu-

lacidn del metabolismo,

8) Se han reconocido las características generales de

la forma en que las cClulas conservan y utiIizan la

energia.

9) Se comprenden muchos aspectos de la esmctura y

funcion de las diversas membranas encontradas en

la ctlula; sus componentes principales son pro-

teínas y lfpidos.

1(3 Se dispone

de información importante a nivel ge-

neral sobre el modo de accibn de las hormonas.

11) Se han descubierto las bases bioqufmicas para un

número considerable de enfermedades.

QUEDA MUCHO POR APRENDER

Aunque es importante saber que es mucha la informa-

ción que se ha acumulado, tiene igual relevancia apreciar

lo escaso del

conocimiento en numerosas areas. Pro-

bablemente los dos problemas principales por resolver

respecto al establecimiento de sus bases bioquirnicas

son el desarrollo, la diferenciacibn y la función cere-

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bral. Si bien está perfectamente asentada la naturaleza quimica del material genético, casi nada se sabe acerca de los mecanismos que activan y desactivan a los genes eucariotas durante el desarrollo. Comprender la regulación génica es tarnbitn un &ea clave en el aprendizaje de la forma en que las células se diferencian y toman cancerosas. El conocimiento de la división y el crecimiento celular -tanto normal como maligno- y su regulaci6n es muy primitivo. Virtualmente nada se sabe can respecto a las bases bioquimicac de fenómenos neurolbgicos complejos como la concien- cia y la memoria. Sólo se riene informacibn muy limitada de los mecanismos de la secrecion celular. A perar de cierto progreso, se desconocen los fundamen- tos moleculmes de la mayoria de las enfermedades genéticas principales, pero las tentativas propor- cionadas por la tecnología del DNA recombinante

sugieren que en los próximos

afios se logrará un

progreso notable en esta hrea. Es posible que en el año 2005 o antes se logre conocer la secuencia del genoma humano; la informacihn disponible gracias a este es- fuerzo masivo tendrh un impacto tremendo sobre la

biologia humana y la medicina.

RESUMEN

El carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrbgeno son los

constituyentes principales de gran parte de las bio-

moléculas. Ademls el calcio, fbsforo, potasio, sodio,

cloro, rnagnesio, hierro, manganeso, yodo y otros

elementos tienen gran importancia biol6gica y

medica. El agua, DNA, RNA, proteínas, poli- sacaridos y lipidos son las moléculas principales de

células y tejidos.

Las células son las unidades biolbgicas hnda- mentales. Contienen veos organelos que desempeiian numerosas funciones especializadas. Estos organelos

pueden separarse por fraccionamiento subcelular y, de este modo, estudiar sus fiinciones en detalle.

El avance de la bioquímica ha dependido del aislamiento de biomolkculas celulares. de la dcter- minación de sus estructuras así como del an8lisis de su funcibn y metabolismo. Para investigar la estruc- tura, funci6n y metabolismos de las biomoléculas se han utilizado diferentes planteamientos, desde el ani- ma! íntegro al gen aislado. En particular, el uso de isotopos. tanto estables como radiactivos, ha tenido tremenda importancia en el adelanto del conocimiento hjoquímico. La representacihn:

DNA -

Transcripcibn

Traslación

RNA-Proteina

resume la fuerza propulsara de gran parte del esfuerzo

contemporáneo en bíoquímica. No obstante, se han

hecho muchos otros avances en el conocimiento de la

bioquimica, como la apreciacibn de la ~omposicibn

corporal y la comprensibn parcial de estructuras y

funciones de enzimac, hormonas y membranas. Se han

descubierto las bases bioquímicas y genéticas de nu-

merosas enfermedades y la aplicación reciente de la

tecnología del DNA recombinante ha acelerado enor-

memente el progreso en esta área. Sin embargo, aún es mucho lo que se desconoce; los retos principales para el futuro incluyen definir ("mapear") el genorna hu- mano y proporcionar explicaciones moleculares de los mecanismos que intervienen en el desarrollo orghnico, la diferenciacibn celular y !a función cerebral. M

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