CAPITULO 1 MARCADORES GENTICOS Ripoli, Mara Vernica1, 2 y Villegas Castagnasso, Egle Etel1, 2

Centro de Investigaciones en Gentica Bsica y Aplicada (CIGEBA), Facultad de Ciencias Veterinarias,

Universidad Nacional de La Plata. Calle 60 y 118 s/n CC 296, B900AVW La Plata, Argentina. mvripoli@fcv.unlp.edu.ar
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Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tecnolgicas (CONICET).

1.1. Introduccin. 1.2. Polimorfismos bioqumicos. 1.3. Polimorfismos a nivel del ADN. 1.3.1 Enzimas de restriccin. 1.3.2 Southern blot. 1.3.3 Secuenciacin del ADN. 1.3.4 Huellas digitales del ADN o fingerprint. 1.3.5 Metodologas de deteccin de polimorfismos basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). 1.3.6 Polimorfismos de nucletido simple (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs). 1.3.6.1. Reacciones de hibridacin alelo especfica (ASO). 1.3.6.2. Polimerizacin a partir de un cebador (Primer extensin). 1.3.6.3. Ligado de oligonucletidos (Oligonucleotide ligation assay, OLA). 1.3.6.4. Corte invasivo (Invasive cleveage). 1.3.7 Cromatografa lquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC). 1.3.8 ADN mitocondrial y polimorfismos del cromosoma Y. 1.4. Conclusiones.
1.5. Referencias Bibliograficas.

1.1. Introduccin. A principios del siglo pasado las diferencias entre los individuos se expresaban sealando detalles de su aspecto externo. Para este fin se empleaban descripciones fenotpicas de la cabeza y de ambos flancos del animal, en las que se destacaban caractersticas distintivas como ser el color de capa, la presencia de remolinos, manchas, marcas, tatuajes o alguna otra particularidad. La mayor parte de estos mtodos de identificacin individual constituan una fuente de errores involuntarios, ya que estas descripciones subjetivas eran tomadas con criterios ambiguos, por lo cual resultaban ser escasamente informativas. El primer estudio sobre polimorfismos genticos fue llevado a cabo en el ao 1901 por Landsteinner, quien describi la variabilidad presente en los grupos sanguneos humanos mediante el empleo de tcnicas serolgicas. As, por primera vez, los individuos se podan agrupar en base a un criterio objetivo, y se acu el trmino marcador gentico, definido sencillamente como caracteres heredables con mltiples estados (alelos) en cada carcter (locus). Las definiciones propuestas acerca del concepto de polimorfismo han sido muy variadas y entre ellas se destaca la de Ford (1965): "polimorfismo es la presencia simultnea de dos o ms formas discontnuas en una especie, de manera tal que la menos frecuente de ellas no puede ser mantenida nicamente por mutacin". Para Cavalli-Sforza y Bodmer (1981), "el polimorfismo bioqumico - gentico es la existencia en una misma poblacin de dos o ms alelos en un locus, cada uno con una frecuencia apreciable". Segn Lucotte (1977), se puede considerar un determinado locus como polimrfico cuando la frecuencia del alelo ms comn es igual o inferior a 0,99. Sin embargo, esta definicin es arbitraria ya que este valor puede variar dependiendo de los valores muestrales (1%, 5%, etc.). En trminos prcticos se deben descartar aquellos alelos que aparezcan una nica vez y que por lo tanto puedan considerarse mutaciones espontneas. De este modo el criterio a tener en cuenta para considerar polimrfico a un locus sera que en la muestra haya al menos dos individuos heterocigotas portadores. A pesar que los trabajos sobre polimorfismos genticos comenzaron a principios del siglo XX, fue recin en la dcada de 1960 que los estudios basados en marcadores genticos se hicieron sistemticos. Smithies (1955), Lewontin y Hubby (1966), y Harris (1966) desarrollaron el mtodo de electroforesis en almidn, lo que permiti estudiar las distintas formas (electromorfos) que presenta una protena dada. Esta simple tcnica revolucion el estudio de la sistemtica, la sociobiologa, la evolucin y la gentica de poblaciones entre otras. El creciente desarrollo de las diferentes tcnicas para la identificacin del polimorfismo en distintos sistemas, hizo que se ampliara el concepto de marcador gentico, ya no slo aplicado para los caracteres

fenotpicos y los grupos sanguneos, sino que tambin se incorporaban los polimorfismos a nivel proteico o bioqumico.

1.2. Polimorfismos bioqumicos En el ao 1977, Lucotte distingui tres tipos de polimorfismos bioqumicos: (i) los grupos sanguneos, revelados mediante tcnicas serolgicas; (ii) los sistemas de histocompatibilidad, puestos de manifiesto por reacciones inmunolgicas; (iii) los polimorfismos bioqumicos propiamente dichos, identificados mediante electroforesis en geles de almidn o acrilamida. Durante la dcada de 1970 comenz la caracterizacin del genoma bovino por mtodos bioqumicos (Tabel et al., 1990; Andersson - Eklund et al., 1991; Irvin et al., 1992) o inmunogenticos (Bensaid et al., 1989). De esta manera, se comenzaron a analizar los grupos sanguneos y los polimorfismos bioqumicos a nivel de diversos rganos, tejidos y lquidos orgnicos como leche, plasma seminal y principalmente sangre. Esta ltima constituye el fluido orgnico analizado con mayor frecuencia, debido principalmente a su accesibilidad y al elevado nivel de polimorfismos detectados en las enzimas y otras protenas sanguneas. En bovinos, por ejemplo, este tipo de estudios permitieron detectar las diferencias y similitudes entre las razas y analizar la variacin gentica dentro y entre poblaciones. Dichos anlisis se llevaron a cabo en gran escala, analizando poblaciones de diferentes regiones del mundo (Braend, 1972; Baker y Manwell, 1980; Manwell y Baker, 1980; Medjugorac et al., 1994). Asimismo, se realizaron estudios a nivel regional utilizando poblaciones estrechamente relacionadas (Kidd y Pirchner, 1971; Kidd y Cavalli-Sforza, 1974; Kidd et al., 1980; Astolfi et al., 1983; Arranz Santos, 1994; Arranz Santos et. al., 1996). Una de las principales conclusiones, producto de estos estudios, consisti en la demostracin de que las razas Bos taurus y Bos indicus divergan a nivel proteico (Braend, 1972; Manwell y Baker, 1980). Por otra parte, estos datos permitieron construir rboles filogenticos y superponerlos con mapas geogrficos para de esta manera desarrollar teoras biogeogrficas sobre el origen de las razas bovinas. En cuanto al estudio de los polimorfismos proteicos en equinos, ya en el ao 1964 Braend y Stormont describieron el polimorfismo del sistema A1b glicoprotena (A1B Xk). Si bien la Sociedad Internacional de Gentica Animal, (International Society of Animal Genetics, ISAG) reconoce 16 sistemas proteicos en equinos, no todos son utilizados ya que presentan diferentes requerimientos tcnicos. Dentro de los polimorfismos bioqumicos analizados se encuentran la albmina, prealbmina, A1b glicoprotena, carboxilesterasa, hemoglobina y transferrina (Braend

y Stormont, 1964; Kingsbury y Masters, 1972; Gahne et al. 1977). En equinos de la raza Criolla Argentina, el empleo de estos marcadores permiti realizar la primer caracterizacin racial, y poner en evidencia un alto grado de variabilidad presente en la raza, as como tambin posibilit establecer relaciones filogenticas con razas ancestrales (Peral Garca, 1994; Kienast, 2004). Con respecto al anlisis de los polimorfismos bioqumicos en caninos estos se iniciaron, al igual que en bovinos y equinos, en la dcada de 1970 pudindose citar entre otros los trabajos realizados por Tanabe et al. (1974, 1977, 1978), Simonsen (1976, 1979), Sugiura et al. (1977), Juneja et al. (1981a y b), Hashimoto et al. (1984), Ejima et.al (1986), Kobayashi et al. (1987) y Jordana et al. (1991a y b). Si bien, a diferencia de las otras especies domsticas, los trabajos realizados en perros resultan escasos, estos fueron de gran utilidad para analizar niveles de variabilidad gentica y constitucin allica de distintas poblaciones.

1.3. Polimorfismos a nivel del ADN. En 1953, James Watson y Francis Crick propusieron el modelo de doble hlice del cido desoxirribonucleico (ADN). Este descubrimiento fue seguido por otros no menos importantes como ser el modelo de replicacin semiconservativa de Messelson y Sthal en 1958, o el aislamiento de la ADN polimerasa por Kornberg en 1960 (Kornberg, 1989). Esta lnea de descubrimientos marc la tendencia hacia estudios cada vez ms pormenorizados del material gentico y por ende de los polimorfismos. La primera tcnica para estimar diferencias a nivel de ADN se desarroll en la dcada de 1960 (Britten y Kohne, 1968) y se aplic en estudios sistemticos y de evolucin molecular (Sibley y Ahlquist, 1990). Esta metodologa conocida como hibridacin ADN-ADN se basa en las propiedades termodinmicas de reasociacin de las cadenas simples de ADN. A continuacin describiremos en forma breve las principales metodologas utilizadas en el estudio de los polimorfismos a nivel de ADN:

1.3.1 Enzimas de restriccin. En la dcada de 1960 se descubrieron las enzimas de restriccin, protenas bacterianas que digieren al ADN de doble cadena al reconocer un determinado motivo o diana de restriccin (Meselson y Yuan, 1968). Estas secuencias especficas se caracterizan por ser palindrmicas (inversamente repetidas) y tener una longitud de 4 a 10 pares de bases. Las bacterias utilizan estas enzimas para protegerse de la infeccin causada por bacterifagos, ya que las mismas hidrolizan al ADN forneo. Para preservarse de la hidrlisis de

su propio material gentico, las bacterias poseen enzimas de modificacin que metilan su propio ADN en las regiones especficas reconocidas por las endonucleasas. Las enzimas de restriccin se nombran de acuerdo a la bacteria de la cual se han aislado, as por ejemplo HaeIII fue aislada de Haemophilus aegyptius, EcoRI se obtuvo a partir de la cepa RY13 de Escherichia coli. Este tipo de endonucleasas pueden efectuar dos tipos de cortes en la cadena de ADN, cuando el corte se realiza por la mitad de la secuencia de reconocimiento genera extremos romos, y cuando es desigual con respecto al eje de simetra de la secuencia se obtienen extremos pegajosos (Figura 1.1). El descubrimiento de las enzimas de restriccin revolucion a la biologa molecular, ya que representaban una nueva herramienta para el estudio de los polimorfismos a nivel del ADN. El anlisis del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin obtenidos a travs del uso de endonucleasas se denomina RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism) y consiste en comparar los patrones de bandas generados a partir de molculas de ADN de diferentes individuos que han sido sometidas a digestin con las mismas enzimas de restriccin. Las diversas mutaciones que presentan las diferentes molculas de ADN son las responsables de la aparicin de los fragmentos de longitud variable. Estas diferencias pueden apreciarse mediante la realizacin de una corrida electrofortica en un gel de agarosa o de poliacrilamida y su posterior tincin (Figura 1.2). Por otra parte, estas enzimas permitieron realizar los mapas de restriccin que indican la ubicacin de los fragmentos de ADN a lo largo de un determinado cromosoma.

1.3.2 Southern blot. Los estudios de los polimorfismos a nivel del ADN se popularizaron en la dcada de 1980. Inicialmente, estos trabajos se basaron en la combinacin de la tcnica de RFLP y la de Southern blot, cuyo fundamento es la deteccin de sitios de restriccin (presencia o ausencia) mediante la utilizacin de una sonda. Definimos como sonda a una secuencia corta de nucletidos (ADN o ARN) marcada y complementaria a la regin del ADN en estudio en la cual se busca un determinado sitio de restriccin (ej.: Botstein et al., 1980; Haberfeld et al., 1993; Trommelen et al., 1993). La presencia o ausencia de los sitios de restriccin se debe a cambios moleculares como deleciones, inversiones, cambios de bases, o reordenamientos. Cualquiera de estos eventos puede crear, eliminar o translocar los sitios de reconocimiento de las enzimas de restriccin. La metodologa de Southern blot consiste en digerir el ADN con enzimas de restriccin y someter a los productos de la digestin a una electroforesis en un gel de agarosa. De esta manera se pueden separar los distintos fragmentos obtenidos a partir de la digestin. Luego, los

fragmentos de ADN se transfieren a membranas de nylon o de nitrocelulosa para poder realizar la hibridacin con la sonda adecuada que permitir identificar a los fragmentos especficos ya que ser posteriormente revelada mediante autorradiografa o a travs de algn mtodo de deteccin alternativo (por ejemplo quimioluminiscencia). Este procedimiento de transferencia es lo que se denomina transferencia de Southern, ya que fue descripto por primera vez por E. M. Southern (1975) (Figura 1.3). Por lo tanto, con la sonda adecuada pueden detectarse las diferentes variantes en base a la longitud y al nmero de fragmentos de restriccin (Theilmann et al., 1989; Damiani et al., 1990; Ferreti et al., 1990; Miller y Koopman., 1990; Barendse et al., 1991; Siguroardottir et al., 1990, Siguroardottir, 1991). Estos cambios pueden suceder tanto en zonas que se transcriben como en zonas que no se transcriben, por lo que aportan un mayor grado de informacin y amplan los lmites de los estudios.

1.3.3 Secuenciacin del ADN. Otro hito importante en la historia de la biologa molecular fue el desarrollo, durante la dcada de 1970, de dos mtodos para poder determinar la secuencia de un fragmento de ADN, uno fue desarrollado por Maxam y Gilbert, (1977) y el otro por Sanger et. al., (1977). Los dos mtodos difieren muy poco entre s, pero dado que el ms comnmente utilizado es el mtodo enzimtico de Sanger es el que vamos a describir a continuacin. Este procedimiento se basa en la extensin especfica de la cadena de ADN a partir de un cebador, por la accin de la ADN polimerasa, y en la incorporacin de dideoxinucletidos (ddNTPs) trifosfato en la cadena en formacin. Los ddNTPs carecen de un residuo -OH en la posicin 3 de la desoxirribosa. Estos nucletidos se incorporan a la cadena en crecimiento por medio del trifosfato presente en posicin 5, pero al carecer del hidroxilo en la posicin 3 no pueden formar enlaces fosfodister con nucletidos sucesivos y la cadena queda interrumpida (Sanger et al., 1977). La tcnica original consiste en realizar cuatro reacciones de polimerizacin diferentes, en las cuales debe incluirse el fragmento de ADN que se desea secuenciar, dNTPs convencionales que si llevan el residuo -OH en posicin 3 y los ddNTPs. La diferencia entre las cuatro reacciones es que una lleva ddATPs, otra ddTTPs, la tercera ddCTPs y la cuarta ddGTPs. De este modo los dNTPs y los ddNTPs compiten entre ellos generando poblaciones de oligonucletidos terminados en A, C, G o T (Sambrook et al., 1989). Los fragmentos obtenidos, que difieren en la ltima base, se separan mediante electroforesis. Posteriormente se identifica la ltima base de cada oligonucletido leyendo el gel de abajo hacia arriba. De esta manera se logra conocer la secuencia del fragmento original (Figura 1.4). Actualmente, la secuenciacin se realiza en equipos automatizados que utilizan los mismos principios bsicos establecidos por Sanger et al. (1977), pero empleando los cuatro

ddNTPs en una misma reaccin, los cuales se diferencian con cuatro fluorocromos distintos que son ledos por un lser. De esta manera los secuenciadores automticos analizan los electroferogramas resultantes y generan un cromatograma de cuatro colores en el cual cada pico representa a cada una de las cuatro bases del ADN.

1.3.4 Huellas digitales del ADN o fingerprint. Hasta el descubrimiento de los marcadores genticos ubicados en regiones no codificantes del genoma, el trmino polimorfismo slo se aplicaba a las regiones codificantes y a sus manifestaciones fenotpicas (Lewin, 1997). En la dcada de 1980 surgen tambin las tcnicas de anlisis de secuencias codificantes como no codificantes. Las secuencias no codificantes comprenden entre el 90 al 95% del ADN total, siendo las regiones ms variables del genoma. Dichas secuencias estn compuestas por ADN de copia nica, ADN repetido heterodisperso y ADN repetido en secuencias iguales una seguida de la otra (tandem). Las secuencias repetidas en tandem a su vez se clasifican en: ADN satlite, ADN telomrico, microsatlites y minisatlites. El descubrimiento de la existencia de secuencias repetidas heterodispersas en el genoma (Gerbi, 1975; Richardson et al., 1986; Gerard et al., 1990; Lenstra et al., 1993) permiti el desarrollo de sondas capaces de hibridar con secuencias altamente repetidas del ADN denominadas minisatlites. Dichas secuencias se caracterizan por estar constituidas por un ncleo o core (secuencia determinada de bases) que posee un tamao de entre 9 y 24 pares de bases (pb) y que se repite un nmero variable de veces, presentando una longitud de 0,1 a 2 Kb. El uso de sondas correspondientes a secuencias repetidas de este tipo posibilit el desarrollo de la tcnica de huellas digitales del ADN o fingerprint, que permite estudiar simultneamente distintos sectores del genoma (Jeffreys et al., 1985a, 1985b, 1991; Kirby, 1990). Para el desarrollo de est tcnica se realiza primero la digestin del ADN con una enzima de restriccin, se separan los fragmentos mediante una corrida electrofortica y se realiza la transferencia de Southern. Posteriormente, se realiza la hibridacin con una sonda especfica para un ncleo o core determinado, para luego realizar el revelado de la misma. El nmero y grado de representatividad con respecto al genoma total depende de la sonda elegida y de la distribucin de esta secuencia en el mismo. Dado que se trata de una tcnica muy laboriosa y que en muchos casos presenta baja repetibilidad, son escasos los trabajos poblacionales y de asociacin con caracteres de produccin realizados en animales domsticos (ej.: Botstein et al., 1980; Beckmann et al., 1986; Cowan et al., 1989; Haberfeld et al., 1993; Trommelen et al., 1993).

1.3.5 Metodologas de deteccin de polimorfismos basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Desde 1985, el desarrollo del mtodo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ha simplificado y revolucionado los estudios genticos poblacionales debido a que puede analizarse un gran nmero de individuos en forma fcil y econmica (Mullis, 1987; Erlich, 1989; Innis et al., 1990). Esta tcnica se basa en la amplificacin o replicacin in vitro de una secuencia determinada del ADN, limitada por un par de cebadores u oligonucletidos especficos mediante la utilizacin de una polimerasa termoestable (Taq polimerasa). Como resultado de 25 ciclos de amplificacin se obtienen aproximadamente 106 copias del fragmento deseado. La tcnica de PCR es una herramienta til para el estudio de la variacin gentica en poblaciones naturales o domsticas. Dado que dicha metodologa puede realizarse a partir de poca cantidad de ADN y que es poco exigente en cuanto a la calidad de la muestra, puede aplicarse tanto a muestras frescas como a colecciones de museo (Herrmann y Hummel, 1994). Esto ltimo permite realizar estudios cronolgicos de las variantes allicas y de esta manera evaluar los cambios de la diversidad gentica de las poblaciones a lo largo del tiempo (Kirby, 1990; MacHugh et al., 1999; Westemeier et al., 1998). La gran versatilidad de la tcnica de PCR permiti el desarrollo de diferentes variantes de esta metodologa, las que permiten resolver distintas situaciones. Entre estas metodologas podemos mencionar: PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism): este mtodo se basa en la deteccin de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin en una secuencia de ADN determinada, amplificada mediante PCR, y sometida luego a la accin de una o varias enzimas de restriccin (Damiani et al., 1990; Denicourt et al., 1990; Pinder et al., 1991) (Figura 1.2). Sin embargo, no todos los fragmentos de ADN incluyen sitios de restriccin polimrficos, por lo que stos pueden ser creados a travs del mtodo PCR-ACRS descripto por Park et al. (1995). PCR-ACRS (Amplification Created Restriction Site): esta tcnica permite identificar las variantes allicas de un locus ya que crea un sitio de restriccin artificial utilizando un cebador que posee en el extremo 3 una base no complementaria al ADN molde, que se ubica junto a la base polimrfica. AS-PCR (Allele Specific-PCR): Esta metodologa se basa en la utilizacin de dos cebadores, cada uno especfico para un alelo determinado y un cebador comn (David y Deuhtch, 1992). Se realizan dos reacciones simultneas en las que se incluyen el mismo ADN

molde, pero mientras en un tubo se agrega uno de los cebadores especficos mas el cebador comn, en el otro tubo se aade el cebador complementario al otro alelo y adems el oligonuclotido comn. Los productos de PCR se someten a electroforesis y se determina el genotipo del individuo en estudio de acuerdo a la presencia o ausencia de las bandas correspondientes a cada reaccin. ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide): esta tcnica permite la discriminacin de las variantes mediante la hibridacin del fragmento amplificado con sondas especficas para la deteccin de los distintos alelos de un marcador (Jadot et al., 1992). PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism): permite detectar variaciones puntuales en un fragmento amplificado de ADN. Para el desarrollo de esta tcnica se desnaturaliza el producto de la PCR y se somete a una electroforesis en condiciones no desnaturalizantes, de modo tal que las molculas de cadena simple no se reasocian entre si pero si forman estructuras secundarias. La aparicin de estas estructuras se debe a los apareamientos intracatenarios que se producen entre las bases de una misma cadena y dependen de la secuencia de la misma. Las diferencias de estructura secundaria hacen que las cadenas de ADN migren de modo diferente en el gel y es esta caracterstica la que permite realizar la discriminacin de los alelos. RAPDs (Random Amplification Polymorphisms DNA): esta tcnica consiste en la amplificacin al azar de secuencias de ADN y fue descripta por Williams et al. (1990). Se basa en la amplificacin al azar de secuencias desconocidas del genoma utilizando pequeos cebadores de aproximadamente 10 pares de bases. De este modo no se busca ningn fragmento de ADN especfico ya que los cebadores se unen a secuencias complementarias desconocidas del ADN molde. Los fragmentos as generados se separan mediante electroforesis. Este mtodo genera polimorfismos de tipo dominancia-recesividad, es decir que solo se evala la presencia o ausencia de una banda. Si bien se trata de una tcnica sencilla y que permite amplificar varios loci simultneamente, suele ser criticada por la falta de repetibilidad entre los distintos laboratorios (Hedrick, 1992). Sin embargo, es una tcnica de mucha utilidad en la evaluacin de poblaciones naturales de animales y vegetales, donde no se cuenta con los datos de secuencias de ADN necesarios para el diseo de cebadores especficos para una determinada secuencia. STRs (Short Tandem Repeat): El uso de la tcnica de la PCR no slo se limit al anlisis de genes estructurales, sino que tambin permiti la amplificacin de secuencias repetidas del tipo microsatlites (Litt y Lutty, 1989; Tautz, 1989; Weber y May, 1989). Estas secuencias consisten en repeticiones en serie de dos, tres o cuatro nucletidos, que se encuentran ampliamente distribuidos por todo el genoma. En el caso de estos loci, la diferencia entre los alelos est dada por variaciones en el nmero de repeticiones (Georges et al., 1991; Kemp et al.,

1991; Brezinsky et al., 1992, 1993a, 1993b; Swarbrick et al., 1990; Vaiman et al., 1994; Avraham et al., 1993; Ciampolini et al., 1993, 1995; Ellegren, 1993; Goudarzi et al., 1993; Steffen et al., 1993; Sun et al., 1993a, 1993b, 1994a, 1994b; Sunden et al., 1993). El elevado polimorfismo presente en los microsatlites sera consecuencia de la alta tasa de recombinaciones o crossing-over desiguales ocurridos durante la meiosis, lo que aumenta o disminuye el nmero de repeticiones. La tcnica de PCR-STR se basa en la amplificacin de las mencionadas secuencias repetidas mediante la utilizacin de cebadores adyacentes a dicha secuencia. Los productos de la PCR se someten a electroforesis en geles de poliacrilamida y las diferentes bandas se visualizan mediante tincin con nitrato de plata, o bien pueden detectarse las distintas variantes mediante la utilizacin de secuenciadores automticos. En este caso deben utilizarse cebadores marcados con fluorescencia. Gradualmente, los marcadores tradicionales (polimorfismos bioqumicos y grupos sanguneos) han sido reemplazados por marcadores de ADN, principalmente del tipo microsatlites. En el caso de las razas bovinas, en los ltimos veinte aos se han publicado numerosos trabajos sobre caracterizacin gentica y sobre anlisis de estructura poblacional utilizando microsatlites (MacHugh et al., 1994, 1997, 1998; Moazami-Goudarzi et al., 1994, 1997; Peelman et al., 1998). AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): Tambin denominada polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados, esta metodologa es una combinacin de las tecnologas de RFLP y de PCR. Se basa en la amplificacin selectiva de los fragmentos de restriccin mediante la PCR. Es un mtodo muy sensible para caracterizar ADN, cualquiera sea su origen y su complejidad (Zabeau y Vos, 1993). El ADN analizado es digerido con dos enzimas de restriccin diferentes, una de las cuales hace cortes frecuentes y la otra hace cortes poco frecuentes. Luego se ligan en los extremos de los fragmentos obtenidos unos adaptadores sintticos, especficos de cada sitio de restriccin y se realiza una primera PCR (preselectiva), usando cebadores complementarios al adaptador y a los sitios de restriccin. A cada cebador se le aade un nucletido para seleccionar un solo subconjunto de fragmentos. Los productos de la amplificacin preselectiva se someten a otra PCR, y nuevamente se selecciona un subconjunto de fragmentos ya que se agregan dos nucletidos ms a los cebadores. La separacin de los fragmentos de la reaccin se realiza mediante electroforesis en geles de poliacrilamida de tipo desnaturalizante revelados mediante tincin con plata o bien puede realizarse con un secuenciador automtico. La tcnica AFLP detecta polimorfismos generados por cambios en los sitios de restriccin o en los adyacentes a stos. La mayora de los marcadores de AFLP son de tipo mono-allico, lo que significa que slo se detecta un alelo de los dos posibles. Los AFLP

permiten una exploracin rpida de los polimorfismos del genoma entero y generan cantidades enormes de informacin, por lo que se requiere un anlisis automatizado de los datos y, por consiguiente una adecuada tecnologa de computacin. ESTs (Expressed Sequence Tags): los ESTs, tambin llamados marcadores de secuencia expresada, son secuencias cortas de ADN (200 a 500 nucletidos de largo) generadas a partir de la secuenciacin de uno o ambos extremos del ADN copia de un gen determinado, que pueden ser utilizadas para identificar genes desconocidos, y para mapear su posicin en el genoma. Estas secuencias son porciones de genes que se expresan en ciertas clulas, tejidos y rganos de diferentes organismos y que utilizadas como sondas permiten detectar genes en los cromosomas o en secuencias genmicas por apareamiento de bases complementarias. Los ESTs representan herramientas muy poderosas y rpidas para el descubrimiento de nuevos genes, para obtener informacin acerca de su expresin y regulacin, y para construir mapas genmicos.

1.3.6 Polimorfismos de nucletido simple (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs). Dentro de las metodologas que se estn utilizando actualmente, deben mencionarse las tcnicas de anlisis de polimorfismos de nucletido simple (SNPs). Este tipo de polimorfismo consiste en el cambio de un nucletido por otro (transicin o transversin) dentro de una secuencia determinada de ADN, es decir que cada SNP posee usualmente dos nucletidos alternativos en una posicin determinada. Dado que solo el cinco por ciento del genoma codifica para la produccin de protenas, la mayora de los SNPs se hallan fuera de las zonas codificantes. Sin embargo, los SNPs que se encuentran dentro de las regiones codificantes son de mucha importancia ya que probablemente puedan alterar la funcin biolgica de una protena. Un caso particular de polimorfismo son las deleciones o inserciones de pocos pares de bases denominadas INDELs. Si bien an es difcil estimar el nmero de SNPs presentes en el genoma humano, han sido reportados, tanto por entidades pblicas como privadas, mas de cinco millones de SNPs y cerca de cuatro millones han sido validados, es decir que han mostrado ser polimrficos en uno o varios de los principales grupos raciales (Sobrino, et. al, 2005). A pesar de su simplicidad y del polimorfismo limitado, el creciente inters por el anlisis de los SNPs en el campo de la medicina, est basado principalmente en su abundancia, dado que pueden ser usados como marcadores para la identificacin de genes responsables de enfermedades complejas y para estudiar el potencial de la frmacogenmica en el anlisis de la respuesta variable a las drogas. Otra caracterstica de inters de los SNPs es su baja tasa mutacional, lo que los hace marcadores ideales para estudios de paternidad. Sin embargo, los SNPs tienen tambin

limitaciones, por ejemplo el nmero de SNPs que se necesitan para realizar un estudio es alrededor de cuatro veces el nmero de STRs que seran necesarios (Sobrino, et. al, 2005). En animales domsticos an no se han llevado a cabo estudios tan extensivos como en humanos, sin embargo, los datos disponibles indican que existira una alta densidad de SNPs en las regiones que han sido estudiadas. Los estudios realizados en animales domsticos para la deteccin de SNPs se enfocan principalmente hacia el anlisis de marcadores genticos potencialmente asociados a caracteres de produccin (genes candidatos). De esta forma la informacin que se obtenga a partir de estos polimorfismos podr ser aplicada en un futuro cercano en programas de seleccin, as como tambin en identificacin gentica (trazabilidad, abigeato, etc.) y en frmacogentica. El hecho que los SNPs se encuentren distribuidos a lo largo de todo el genoma, sean marcadores biallicos de herencia codominante y tiendan a ser relativamente estables, los hace marcadores biolgicos de excelentes caractersticas. No existe un mtodo ideal para la tipificacin de los SNPs por lo tanto la seleccin de una tcnica apropiada depende de los requerimientos del investigador. Para comprender las tcnicas de tipificacin de SNPs se debe tener en cuenta que existen distintas reacciones para discriminar alelos, diversos mtodos de deteccin de los alelos discriminados y diferentes formatos de ensayo. La mayora de las reacciones de discriminacin de alelos pueden asignarse a uno de cuatro grupos principales de tcnicas basadas en mecanismos moleculares: hibridacin alelo especfica (ASO), extensin de cebadores (primer extension), ligado de oligonucletidos (oligonucleotide ligation assay, OLA) y corte invasivo (invasive cleveage). Los mtodos de deteccin de los alelos discriminados pueden incluir fluorescencia, luminiscencia, medicin de la masa, etc. Dentro de los formatos de ensayo, estos pueden realizarse en reacciones homogneas que son las que ocurren en medio lquido, y reacciones en soporte slido como ser lminas delgadas de vidrio, chips, etc.

1.3.6.1. Reacciones de hibridacin alelo especfica (ASO). Para poder realizar este tipo de reacciones es necesario disear dos sondas, cada una especfica para un alelo determinado. Generalmente la base polimrfica se ubica en el centro de cada sonda. De esta manera se pueden diferenciar dos ADN blanco que difieran en la base polimrfica. En condiciones ptimas de hibridacin los hbridos ADN - sonda complementaria sern estables, mientras que los hbridos que difieren en una base sern inestables (Figura 1.5). Los genotipos pueden inferirse a partir de las seales de hibridacin. El principio empleado en este tipo de reacciones es el de transferencia de energa (FRET, fluorescence

resonance energy transfer) segn el cual la fluorescencia se emite como resultado de un cambio en la distancia fsica entre un colorante fluorescente (reporter) y una molcula atenuadora (quencher) de la fluorescencia. Para poder tipificar SNPs utilizando este tipo de reacciones existen dos tipos de tcnicas: (i) Deteccin de actividad exonuclesica (Taqman): Esta tcnica se basa en el principio FRET y en la actividad exonuclesica 5 de la Taq polimerasa. En este caso el colorante fluorescente y el atenuador se encuentran en los extremos de una sonda complementaria al fragmento de ADN amplificado. Cuando la distancia entre las dos molculas se hace mayor, el atenuador deja de actuar y permite que el colorante emita fluorescencia. La metodologa consiste en permitir que se unan al fragmento amplificado un cebador y la sonda complementaria con el colorante fluorescente, con un espacio entre ambos de manera que pueda actuar la polimerasa. Se realiza entonces una PCR y a medida que avanza la polimerizacin a partir del cebador hacia la sonda, la Taq polimerasa tambin realiza una actividad exonuclesica 5 3 que degrada a la sonda, de forma tal que el colorante fluorescente se separa de la molcula atenuadora y comienza a emitir fluorescencia. La emisin de fluorescencia solo ocurre si la sonda es especfica para uno de los alelos, de no ser as no se detecta ningn tipo de emisin. Esta reaccin puede realizarse en forma alelo especfica utilizando dos sondas internas con diferentes colorantes. (ii) Guas moleculares (Molecular beacons): En este caso se utilizan sondas que poseen, a ambos lados de la regin complementaria al ADN en estudio, secuencias complementarias que llevan un marcador fluorescente en el extremo 5 (reporter) y un atenuador (quencher) en el 3. Debido a la presencia de esas secuencias en los extremos, la sonda adquiere una configuracin de bucle cuando no hibrida con el ADN blanco, entonces la molcula fluorescente est inhibida por el atenuador y no se produce emisin de fluorescencia. Cuando la sonda se aparea correctamente con el ADN analizado, el marcador y el atenuador se separan producindose la emisin de fluorescencia. Para la tipificacin de los SNPs deben utilizarse dos sondas, una especfica para cada alelo, marcadas con dos colorantes fluorescentes diferentes. Si bien el concepto de hibridacin es muy simple, este tipo de tcnicas presentan una alta tasa de error y adems las sondas y los protocolos deben ser diseados de forma muy especfica.

1.3.6.2. Polimerizacin a partir de un cebador (Primer extension). Esta tcnica se basa en la capacidad que posee la ADN polimerasa para incorporar a partir del extremo 3 de un cebador los desoxirribonucletidos complementarios a la secuencia de un ADN molde. Por lo tanto para el desarrollo de esta metodologa se utilizan oligonucletidos que se unen al ADN y se extienden debido a la accin de una polimerasa.

Existen tres variaciones de esta tcnica, y en todas se parte de un amplificado originado a partir de la PCR: (i) Extensin alelo-especfica: esta tcnica utiliza dos cebadores diferentes, cada uno de los cuales es complementario a uno de los alelos del SNP analizado, de modo tal que solo puede producirse la extensin de los fragmentos de ADN solo si los cebadores son perfectamente complementarios al fragmento de ADN. El producto de este tipo de reaccin puede ser detectado sobre un microarray utilizando nucletidos marcados con colorantes fluorescentes (Figura 1.6). (ii) Minisecuenciacin: esta metodologa implica la utilizacin de un cebador que solo se extiende una base (single base extensin, SBE primer) y cuyo extremo 3 se ubica junto a la base que precede al SNP. Para lograr la extensin se agrega una ADN polimerasa y ddNTPs marcados con cuatro colorantes fluorescentes. Luego, para poder analizar los resultados puede utilizarse cualquier mtodo que permita separar los oligonucletidos marcados de los ddNTPs marcados no incorporados. Las metodologas mas ampliamente utilizadas son la electroforesis y deteccin de fluorescencia, espectrometra de masas (MALDI-TOF MS) y microarrays (Figura 1.7). La metodologa denominada MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) est basada en la espectrometra de masas. Permite diferenciar los diferentes genotipos, dado que compara las masas de los fragmentos de ADN despus de una reaccin de extensin. La masa precisa del producto de la reaccin vara de acuerdo al tipo de ddNTP incorporado. En este caso no es necesario marcar los nucletidos, pero si es preciso disponer de equipos automatizados y adems debe asegurarse la pureza de la muestra sometida al ensayo. Cuando se utilizan microarrays los cebadores se fijan a un chip y son extendidos por una ADN polimerasa con ddNTPs marcados. Luego el microarray es escaneado para poder medir la fluorescencia. (iii) Pirosecuenciacin: Esta nueva tecnologa se basa en la ocurrencia de una cascada de reacciones enzimticas que producen la emisin de luz cada vez que se incorpora un nucletido correcto al ADN molde. Se parte de una estructura de ADN molde cebador y se van incorporando nucletidos mediante la actividad de una polimerasa. Cada vez que se incorpora un nucletido complementario a la cadena molde por accin de la polimerasa se libera un pirofosfato (PPi) que se transforma en ATP por accin de una ATP sulfurilasa. El ATP es entonces utilizado por la enzima luciferasa para producir un pico de luz que es captado por una lente. Los nucletidos no incorporados son degradados por una enzima apirasa. La sucesin de incorporaciones correctas se registran en un pirograma en el cual se puede leer la secuencia del ADN molde. La gran ventaja de este mtodo es que se puede detectar

cualquier nuevo polimorfismo y analizar un gran nmero de individuos simultneamente, y la desventaja es que se requiere de un equipamiento automatizado especfico.

1.3.6.3. Ligado de oligonucletidos (Oligonucleotide ligation assay, OLA). Esta metodologa se basa en la capacidad de la ligasa de unir covalentemente dos oligonucletidos adyacentes cuando hibridan, uno junto al otro, con un ADN molde. En este caso se disean dos oligonucletidos especficos para cada alelo y un cebador comn. Este ltimo se une al templado de ADN inmediatamente ro abajo del SNP, mientras que los cebadores especficos son complementarios a la base polimrfica, y se unen en forma adyacente al cebador comn. La unin entre los fragmentos es mediada por una ligasa y solo ocurre si la complementariedad con la base polimrfica es perfecta. La deteccin de los alelos se realiza mediante mtodos colormtricos (Figura 1.8).

1.3.6.4. Corte invasivo (Invasive cleveage). Esta tcnica se basa en la capacidad de reconocimiento y corte sobre estructuras tridimensionales que tiene la endonucleasa Flap. Estas estructuras se originan cuando dos oligonucletidos hibridan perfectamente con un ADN molde y se superponen. Los oligonucletidos se denominan oligonuclotido invasor y sonda, y ambos son complementarios a una misma regin del ADN. La longitud del solapamiento de ambos oligonucletidos es de solo una base. El invasor es complementario a la secuencia que flanquea el extremo 3 del SNP, mientras que la sonda presenta dos regiones, una complementaria al polimorfismo del SNP y al extremo 5 del mismo y un brazo 5 no complementario. Cuando la correspondencia entre la sonda y el alelo del SNP es perfecta, esta se superpone con el extremo 3 del invasor formndose una estructura que es reconocida por la endonucleasa Flap que acta cortando y liberando el brazo 5 no complementario de la sonda. En el caso que la sonda no fuera complementaria al alelo del SNP la endonucleasa no reconoce a la estructura formada y no acta (Figura 1.9). Este mtodo no necesita un paso de amplificacin previo, pero si se requiere una gran cantidad de ADN. Sin embargo, puede realizarse una PCR para aumentar la sensibilidad del ensayo, en este caso la tcnica se denomina PCR-ensayo invasor. Para conocer el resultado de este ensayo se pueden utilizar distintos mtodos de deteccin, entre ellos el que se basa en el principio FRET. En este caso la marca fluorescente se ubica en el brazo 5de la sonda y el atenuador en la regin complementaria de la misma. Cuando la complementariedad es perfecta y acta la endonucleasa, el colorante se separa del atenuador y se produce la emisin de fluorescencia.

1.3.7 Cromatografa lquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC). Otra tcnica muy utilizada en la actualidad para la deteccin de polimorfismos es la DHPLC, que es un mtodo de cromatografa lquida desnaturalizante de alto rendimiento, en el cual se separan los fragmentos de ADN segn su tamao, o de acuerdo a la elucin diferencial de homoduplex (cadenas de ADN idnticas reasociadas) y heteroduplex (cadenas de ADN no idnticas reasociadas) durante su trnsito por el gradiente de una columna cromatogrfica (Oefner y Underhill, 1998). En el ADN amplificado de cadena doble, los nucletidos que se incorporan errneamente a causa de mutaciones y polimorfismos se hacen evidentes despus de la formacin de heteroduplex. La presencia de estos polimorfismos crea una mezcla de heteroduplex y homoduplex durante la reasociacin del ADN salvaje y del mutante. Si esta mezcla de fragmentos se hace migrar, mediante HPLC en condiciones parcialmente desnaturalizantes, los heteroduplex fluyen de la columna antes que los homoduplex debido a su temperatura de fusin ms baja. Este anlisis puede hacerse para detectar variaciones de secuencia entre individuos o para determinar la heterocigosidad. Esta metodologa permite el descubrimiento de nuevas mutaciones y polimorfismos en cualquier fragmento de ADN o en cualquier secuencia especfica de un gen, as como tambin para detectar la presencia de mutaciones conocidas. Si bien este tipo de tecnologa sirve para identificar la presencia de diferencias en las secuencias y no la variante gentica en si, ayuda a reducir el intervalo de posibles estrategias que se emplearan para detectarla. 1.3.8 ADN mitocondrial y polimorfismos del cromosoma Y. Las tcnicas del ADN, no slo se aplican al estudio de loci autosmicos, sino que tambin son de gran utilidad para el estudio de ADN no nuclear como el ADN mitocondrial (ADNmt) (Ron et al., 1992, 1993; Suzuki et al., 1993; Loftus et al., 1994a, 1994b; Cymbron et al., 1999; Yu et al., 1999; Meirelles et al., 1999) y para el anlisis de los polimorfismos del cromosoma Y (Bradley et al., 1994; Gwakisa et al., 1994; Kemp et al., 1994; Teale et al., 1995; Hanotte et al., 1997, 1998; Nijman et al., 1999). En los mamferos el ADNmt es una molcula circular que presenta una organizacin extremadamente compacta, no presenta intrones y la mayora de los genes se encuentran solapados. En el caso del ser humano el ADNmt presenta una regin control (D-loop) y 13 regiones codificantes que corresponden a las protenas del aparato respiratorio de la clula. Entre estas podemos mencionar el citocromo b, tres subunidades de la citocromo oxidasa, una de las subunidades de la ATPasa y siete subunidades de la NADH deshidrogenasa. Otra caracterstica del ADNmt es la heteroplasmia, es decir heterogeneidad de mitocondrias en un mismo organismo.

La regin mas estudiada del ADNmt es el segmento de la regin del D-loop, ya que tiene una alta tasa de evolucin por lo que presenta un alto poder de resolucin para estudios microevolutivos. Adems, no sufre recombinacin y se hereda nicamente por lnea materna. En humanos, el ADN mitocondrial representa la molcula mas intensamente estudiada, sin embargo gracias al desarrollo de nuevas tecnologas de citogentica y al desarrollo del proyecto genoma humano se han podido detectar tambin marcadores del cromosoma Y, los cuales son especficos del sexo masculino. En contraste con los numerosos estudios realizados en poblaciones humanas acerca de los polimorfismos en el cromosoma Y, las investigaciones realizadas en otros mamferos son escasas. La mayora han sido realizadas en poblaciones de ratones y han incluido varios tipos de marcadores como ser micro y minisatlites (Boissinot y Boursot, 1997). El cromosoma Y presenta una regin pseudoautosmica que es la que recombina durante la meiosis con el cromosoma X, y una regin haploide que en muchos aspectos se comporta como el ADN mitocondrial. A diferencia de los autosomas y de la regin especfica del cromosoma X, tanto el ADNmt como la regin haploide del cromosoma Y no sufren recombinacin, por lo tanto los polimorfismos presentes en una molcula de ADNmt o en la regin no homloga al X del cromosoma Y comparten la historia de nico linaje femenino o un nico linaje masculino respectivamente (Petit et al., 2002). Mas all de estas caractersticas comunes, el cromosoma Y presenta una serie de propiedades muy interesantes cuando se lo compara con el ADNmt, como ser la ausencia de heteroplasmia y la presencia de una gran variedad de polimorfismos que no presenta el ADNmt, como ser SNPs, microsatlites y minisatlites. Diversos estudios realizados en cuatro regiones codificantes del cromosoma Y han revelado la existencia de un SNP cada 640-850 pb, siendo los microsatlites an mas abundantes. En poblaciones humanas es suficiente la utilizacin de siete microsatlites para alcanzar una diversidad haplotpica de mas del 99%, lo cual permite la utilizacin de estos polimorfismos para la identificacin de individuos (de Knijff et al., 1997). La utilizacin, en estudios de gentica de poblaciones, de los polimorfismos presentes tanto en el ADNmt como del cromosoma Y, acompaados del anlisis de loci autosmicos permiten inferir parmetros poblacionales especficos de cada sexo como as tambin conocer los efectos de los mecanismos de seleccin sexual y de los sistemas de apareamiento.

1.4. Conclusiones. Actualmente, la amplia variedad de tcnicas existentes para estudiar los polimorfismos bioqumicos, los grupos sanguneos y especialmente los marcadores de ADN, han permitido su aplicacin como herramientas de utilidad en la identificacin individual, en el control de filiacin y en la determinacin de la raza de origen de los individuos. Este ltimo punto resulta de mucha importancia para la validacin de diferentes productos alimenticios derivados de la explotacin animal. Esto se torna cada vez ms importante debido a utilizacin del nombre de la raza como marca de diversos productos crnicos y lecheros (carne Aberdeen Angus, quesos de leche Jersey o Ayrshire). La proteccin del nombre de la raza como marca del artculo puede, en ciertas ocasiones, requerir del control de origen mediante test de ADN. El advenimiento de las tcnicas moleculares permiti trabajar directamente sobre la fuente primaria de variacin o sea el propio material gentico, permitiendo el anlisis de cualquier cambio tanto en regiones codificantes como no codificantes. De este modo, hemos visto en forma resumida, como el avance metodolgico ha ido acompaando el desarrollo y descubrimiento de nuevos marcadores genticos, brindando la posibilidad de utilizar distintas estrategias para el estudio de los polimorfismos y como stos mismos se han convertido en una herramienta vlida en los diversos campos de la investigacin.

1.5. Referencias Bibliograficas.

Andersson - Eklund L, Danell B, Rendel I: Association between blood group blood protein polymorphisms and breeding values for production traits in Swedish Red and White Dary Bulls. Animal Genetics 1991, 24: 361-376. Arranz Santos JJ: Estudio gentico en poblaciones bovinas mediante polimorfismos bioqumicos y de DNA (Variaciones puntuales y microsatlites). Tesis doctoral de la Universidad de Len 1994, Facultad de Veterinaria, Departamento de Produccin Animal. Arranz Santos JJ, Bayon Y, San Primitivo F: Comparison of protein markers and microsatellites in differentiation of cattle populations. Animal Genetics 1996, 27: 415 - 419. Astolfi P, Pagnacco G, Guglielmino-Matessi CR: Phylogenetic analysis of native Italian cattle breeds. Z. Tierz. Zcht. Biol. 1983, 100: 87-100. Avraham A, Yoffre MB, Shani M, Ron M : Bovine dinucleotide repeat polymorphism at the aro26 locus. Animal Genetics 1993, 24 (2):147. Baker AC, Manwell C: Chemical classification of cattle. I. Breed groups. Animal Blood Groups Biochemical . Genetics 1980, 11: 127-150. Barendse W, Armitage S, Hetzel DJ: Human apolipoprotein B (ADOB) detects a polymorphism RSAI in cattle. Animal Genetics 1991, 22: 444. Barendse W, Armitage SM, Kossarek LM, Shalom A, Weiss BK, Creighton P, Mccarthy F, Ron M, Teale A J, Fries R, Mcgraw RA, More SS, Georges M, Soller M, Womack JE, Hetzel DJ., Kirkpatrick J, Ryan AM, Clayton D, Li L, Neibergs HL, Zhang N, Grosse W: A genetic linkage map of the bovine genome. Nature Genetics 1994, 6: 227 - 237. Beckmann JS, Kashi Y, Hallerman EM, Nave A, Soller M: Restriction fragment length polymorphism among Israeli Holstein-Friesian dairy bulls. Anim Genet. 1986,17(1):25-38. Bensaid A, Kaushal A, Machugh ND, Shapiro SZ, Teale AJ: Biochemic characterization of activation associated bovine Class I major histocompatibility complex antigens. Animal Genetics 1989, 20: 241255. Bishop MD, Kappes SM, Keele JW, Stone RT, Sunden SL, Hawkins GA, Solinas Toldo S, Fries R, Grosz MD, Yoo J, Beattie JW: A genetic linkage map for cattle. Genetics 1994, 136: 619-639. Boissinot S y Boursot P: Discordant phylogeographic patterns between the Y chromosome and mitochondrial DNA in the house mouse: selection on the Y chromosome?. Genetics 1997, 146: 10191034. Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW: Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics 1980, 32: 314-331. Bradley DG, Machugh E, Loftus RT, Sow RS, Hoste CH, Cuninngham P: Zebu-taurine variation in Ychromosomal DNA: a sensitive assay for genetics introgession in West African trypanotolerant cattle populations. Animal Genetics 1994, 25:1-12. Braend M: Studies on the relationship between cattle breeds in Africa, Asia and Europe: evidence obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms. World Review of Animal Production 1972, 8: 9-14. Braend M, Stormont C: Studies on hemoglobin and transferrin types of horses. Nord. Vet-Med. 1964, 16: 31-37.

Brezinsky L, Kemp SJ, Teale A: ILSTS001: A polymorphic bovine microsatellite. Animal Genetics 1992, 23 (1): 81. Brezinsky L, Kemp SJ, Teale A: Five polymorfhic bovine microsatellites (ILSTS010-014). Animal Genetics 1993a, 24 (1): 74. Brezinsky L, Kemp SJ, Teale A: ILSTS005: A polymorphic bovine microsatellite. Animal Genetics 1993b, 24 (1): 73. Britten RJ, Kohne DE: Repeated sequences in DNA. Science 1968, 161: 529-540. Cavalli-Sforza LL, Bodmer WF: Gentica de las poblaciones humanas.Ed. Omega 1981, Barcelona. Charlier C, Farnir F, Berzi P, Vanmannshoven P, Brouwers B, Vromans H, Georges M: Identity-bydescent mapping of recessive traits in livestock: Application to map the bovine syndactyly locus to chromosome 15. Genome Research 1996, 6: 580-589. Ciampolini R, Goudarzi K, Vaiman D, Leveizel H: A new bovine dinucleotide repeat microsatellite: microsatellite INRA 30. Animal Genetics 1993, 24(3): 221. Ciampolini R, Moazami-Goudarzi K, Vaiman D, Dillmann C, Mazzanti E, Foulley JL, Leveziel H, Cianci D: Individual multilocus genotypes using microsatellite polymorphisms to permit the analysis of the genetic variability within and between Italian beef cattle breeds. Journal of Animal Science 1995, 73: 32593268.

Cowan CM, Dentine MR, Ax RL, Schuler LA: Restriction fragment length polymorphisms associated with growth hormone and prolactin genes in Holstein bulls: evidence for a novel growth hormone allele. Anim Genet. 1989, 20(2):157-65.
Cymbron T, Loftus RT, Malheiro MI, Bradley DG: Mitochondrial sequence variation suggests an African influence in Portuguese cattle. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1999, 266: 597-603. Damiani G, Ferretti L, Rognoni G, Sgaramelli V: Restriction fragment length polymorphism analysis of the kappa-casein locus in cattle. Animal Genetics 1990, 21:107-114. David V, Deuhtch A: Detection of S1-casein genomic variants using the allele-specific polymerase chain reaction. Animal Genetics 1992, 23:425-429. Denicourt D, Sabour MP, Mcallister AJ: Detection of bovine -casein genomic variants by the polymerase chain reaction method. Animal Genetics 1990, 21: 215-216. Ejima H, Kurokawa K, Ikemoto S: Phenotype and gene frequencies of red blood cell groups in dogs of various breeds reared in Japan. Jpn. J. Vet. Sci. 1986, 48(2): 363-368. Ellegren H: Genome analysis with microsatellite markers. Department of animal breeding and genetics 1993, Swedish University of Agricultural Sciences. Uppsala. Erlich HA: PCR technology: principles and applications for DNA amplification. Stockton Press 1989, Nueva York, NY, 246 pp. Ford EB: Polymorphism. Biology Reviews 1965, 20:73 - 88. Fries R: Mapping the bovine genome: methodological aspects and strategy. Animal Genetics 1993, 24: 111 - 110.

Gahne B, Juneja RK, Grolmus J: Horizontal polyacrylamide gel electrophoreisis for the simultaneous phenotyping of transferrins, albumins and post-albumin in the blood plasma of cattle. Anim. Blood Grps. and Biochem. Genet 1977, 9: 37-40. Georges M, Gunawardana A, Threagill DW, Lathrop M, Olsaker I, Mishra A, Sargeant LL, Schoeberlein A, Steele MR, Terry C, Threadgill DS, Zhao X, Holm T, Fries R, Womack JE: Characterization of a set variable number of tandem repeat markers conserved in bovidae. Genomics 1991, 11:24-32. Georges M, Larthrop M, Dietz AB, Lefort A, Libert F, Mishra A, Nielsen D, Sargeant LS, Steele MR, Zhao X, Leipold H, Womack E: Microsatellite mapping of the gene causing weaver disease in cattle will allow the study of an associated QTL. Proceedings of the National Academy of Science USA 1993, 90: 1058-1062. Gerard C, Christophe D, Compere T, Vassart G: The poly (purine) poly (pyrimidine) sequence in the 5 end of the thyroglobulin gene used as a probe identifies a DNA fingerprint in man. Nucleic Acids Research 1990, 18: 4297. Gerbi SA: Interdigitated repeated sequences in bovine satellite DNA. Nature 1975, 253: 367-370. Goudarzy K, Ciampolini R, Vainman D, Leveziel H: A new bovine dinucleotide repeat microsattellite: microsatellite INRA 18. Animal Genetics 1993, 24(3): 221. Gwakisa PS, Kemp SJ, Teale AJ: Characterization of Zebu cattle breeds in Tanzania using random amplified polymorphic DNA markers. Animal Genetics 1994, 25: 89-94. Haberfeld A, Kalay D, Weisberger P, Gal O, Hilliel J: Application of multilocus molecular markers in cattle breeding. 1. Minisatellites y Microsatellites. Journal of Dairy Science 1993, 76: 645-652. Hanotte O, Okomo M, Verjee Y, Rege E, Teale A: A polymorphic Y chromosome microsatellite locus in cattle. Animal Genetics 1997, 28: 318-319. Hanotte O, Okono M, Bradley DG, Verjee Y, Ochieng JW, Teale A, Rege EO: Geographic distribution and frequency of taurine Bos taurus and zebu B. indicus Y chromosome haplotypes amongst subSaharan African catlle breeds. Animal Genetics 1998, 29 (Suppl. 1): 9. Harris H: Enzyme polymorphism in man. Proceedings of the Royal Sociecty London, Ser. B 1966, 164: 298-310. Hashimoto Y, Yamakawa T, Tanabe Y: Further studies on the red cell glycolipids of various breeds of dogs. A possible assumption about the origin of Japanese dogs. J. Biochem.1984, 96: 1777-1782. Hedrick PW: Shooting the RAPDs. Nature 1992, 355:679-680. Herrmann B, Hummel S: Ancient DNA. Recovery and analysis of genetic material from paleontological, archeological, museum, medical and forensic specimens. Springer-Verlag 1994, Nueva York. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ: PCR Protocols: A guide to methods and applications. Academic Press 1990, San Diego, CA, 482 pp. Irvin DM., Prager EM, Wilson AC: Evolutionary genetics of rumiants lysozymes. Animal Genetics 1992, 23: 193-202. Jadot M, Laloux J, Burny A, Kettmann R: Detection of bovine -lactoglobulin genomic variants by the polymerase chain reaction method and molecular hybridization. Animal Genetics 1992, 23(1): 77-80.

Jamieson A, Taylor CS: Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion. Animal Genetics 1997, 28: 397-400. Jeffreys A.J, Wilson V, Thein SL: Hypervariable minisatellite regions in human DNA. Nature 1985a, 314: 67-73. Jeffreys A.J, Wilson V, Thein SL: Individual specific fingerprints of human DNA. Nature 1985b, 316:7679. Jeffreys AJ, Macleod A, Tamaki K, Neil DL, Monckton DG: Minisatellite repeat coding as a digital approach to DNA typing. Nature 1991, 354: 204-209. Jordana J, Piedrafita J, Sanchez A, Puig P: Comparative F statistics of the genetic structure of ten spanish dog breeds. Journal of Heredity 1991a, 83:367-374. Jordana J, Piedrafita J, Sanchez A: Variabilidad gentica en diez razas caninas espaolas. Archivos de Zootecnia 1991b, 40(147):115-129. Juneja RK, Christensen K, Andresen E, Gahne B: Frequencies of transferrin types in various breeds of domestic dogs. Anim. Blood Grps. Biochem. Genet. 1981a, 12: 79-88. Juneja RK, Reetz I, Christensen K, Gahne B, Andresen E: Two dimensional gel electrophoresis of dog plasma proteins: Genetic polymorphism of an a1-proteasa inhibitor and another postalbumin. 1981b, 18(4): 225-233. Kappes SM, Keele JW, Stone RT, Mcgraw RA, Sonstegard TS, Smith TPL, Lopez-Corrales NL, Beattie CW: A second generation linkage map of the bovine genome. Genome Research 1997, 7: 235 - 249. Kemp SJ, Teale AJ: Dinucleotid repeat polymorphism at the bovine locus FSHB. Animal Genetics 1991, 22(5): 435. Kemp SJ, Teale AJ: Randomly primed PCR amplification of pooled DNA reveals polymorphism in a rumiant repetitive DNA sequence which diferentiates Bos indicus and Bos taurus. Animal Genetics 1994, 25: 83-88. Kidd KK, Cavalli-Sforza L: The role of genetic drift in the differentiation of Icelandic and Norwegian cattle. Evolution 1974, 28: 381-395. Kidd KK, Pirchner F: Genetic relationships of Austrian cattle breeds. Animal Blood Groups Biochemics and Genetics 1971, 2: 145-158. Kidd KK, Stone WH, Crimella C, Carenzi C, Casati C, Rognoni M: Immunogenetics and population genetic analysis of Iberian cattle. Animal Blood Groups Biochemics and Genetics 1980, 11: 21-38. Kienast M: Estudio de polimorfismos genticos en poblaciones equinas de Argentina.Tesis Doctoral de la Facultad de Ciencias Veterinarias. U.N.L.P. La Plata, Argentina. 2004. Kingsbury N, Masters CJ: Heterogeneity, molecular weight interrelationships and developmental genetics of the esterase isoenzymes of the rainbow trout. Biochim Biophys Acta. Feb 28 1972, 258(2):455-65. de Knijff P: Chromosome Y microsatellites: population genetic and evolutionary aspects. Int. J. Legal Med. 1997, 110: 134-140. Kobayashi R, Miyakawa H, Tanabe Y, Hashimoto Y, Ota K, Faruque MO: Blood protein polymorphism in the Bangladesh native dogs. Genetic studies on breed differentiation of the native domestic animals in Bangladesh.1987, 2: 93-103.

Kornberg A: For the love of Enzymes: The odyssey of a Biochemist. Cambridge, Mass.: Harvard University Press. Landsteiner, K: Ueber heterogentisches antigen und hapten. Biochem. Z. 1901, 119: 294-306. Lenstra JA, Van Boxtel JAF, Zwaagstra KA, Schwerin M: Short interspersed nuclear element (SINE) sequence of the bovine. Animal Genetics 1993, 24: 33-40. Lewin, B Genes VI. Oxford University Press 1997, New York. USA. Lewontin RC, Hubby J: A molecular approach to the study of genic heterozygosity in natural populations. II. Amount of variation and degree of heterozygosity in natural populations of Drosophila pseudobsucura. Genetics 1966, 54: 595-609. Litt M, Luty JA: A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics 1989, 44: 397-401. Loftus RT, Machugh DE, Bradley DG, Sharp PM, Cunningham EP: Evidence for two independent domestications of cattle. Proceedings of the National Academy of Science USA 1994a, 91: 2757-2761. Loftus RT, Machugh DE, Ngere LO, Balain DS, Badi AM, Bradley DG, Cunningham EP: Mitochondrial genetic variation in European, African and Indian cattle populations. Animal Genetics 1994b, 25: 265-271. Lucotte G : Le polymorphisme biochemique et les facteurs de son maintien. Masson 1977, Pars, Francia. Mac Hugh DE, Loftus RT, Bradley DG, Sharp PM, Cunningham P: Microsatellite DNA variation within and among European cattle breeds. Proceedings of the Royal Society of London 1994, 256: 2531. Mac Hugh DE, Shriver MD, Loftus RT, Cunningham P, Bradley DG: Microsatellite DNA variation and the Evolution, Domestication and Phylogeography of Taurine and Zebu Cattle (Bos taurus and Bos indicus). Genetics 1997, 146: 1071-1086. Mac Hugh DE, Loftus RT, Cunningham P, Bradley DG: Genetic structure of seven European cattle breeds assessed using 20 micrisatellite markers. Animal Genetics 1998, 29: 1-8. Mac Hugh DE, Troy CS, Mccormick F, Olsaker I, Eythrsdottir E, Bradley DG: Early medieval cattle remains from a Scandinavian settlement in Dublin: genetic analysis and comparison with extant breeds. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 1999, 354: 99-109. Manwell C, Baker MA: Chemical classification of cattle. 2. Phylogenetic tree and specific status of the Zebu. Animal Blood Groups Biochemics and Genetics 1980, 11:151-162. Mar Z, Beever JE, Da Y, Green CA, Russ I, Prak C, Heyen DW, Everts RE, Ficher SR, Overton KM, Teale AJ, Kemp SJ, Hines HC, Gurin G, Lewin HA: A male linkage map of the cattle (Bos taurus) genome. J. Hered 1996, 87: 261-271. Maxam AM, Gilbert W: A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74: 560564. Medjugorac I, Kustermann W, Lazar P, Russ I, Pirchner F: Marker-derived phylogeny of European cattle supports demic expansion of agriculture. Animal Genetics 1994, 25:19-27.

Meirelles FV, Rosa AJM, Lobo RB, Garca JM, Smith LC, Duarte FAM: Is the american zebu really Bos indicus?. Genetics and Molecular Biology 1999, 22-4: 543-546. Meselson M, Yuan R: DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 1968, 217: 1110-1114. Messelson M y Sthal F: The replication of DNA in Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci., USA 1958, 44: 671-682. Miller JM, Koopman M: Isolation and characterization of two male-specific DNA fragments from bovine gene. Animal Genetics 1990, 21: 77-82. Moazami-Goudarzi K, Vaiman D, Mercier D, Grohs C, Furet JP, Levziel H, Martin P : Emploi de microsatellites pour lanalyse de la diversit gntique des races bovines francaises: premiers resultates. Genet. Sel. Evol. 1994, 26 (Suppl 1): 155-165. Moazami-Goudarzi K, Laloe D, Furet JP, Grousclaude F: Analysis of genetic relationships between 10 cattle breeds with 17 microsatellites. Animal Genetics 1997, 28: 338-345. Mullis K, Faloona F: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzimology 1987, 155: 335-350. Nijman IJ, Bradley DG, Hanotte O, Otsen M, Lenstra JA: Satellite DNA polymorphisms and AFLP correlate with Bos indicus-taurus hybridization. Animal Genetics 1999, 30: 265-273. Oefner PJ, Underhill PA: DNA mutation detection using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Current Protocols in Human Genetics 1998, 19: [7.10.1]-[7.10.12]. Wiley & Sons, NY, E.U. Park CH, Russ I, Da Y, Lewin HA: Genetic mapping of F13A to BTA23 by sperm typing: Difference in recombination rate between bulls in the DYA-PRL interval. Genomics 1995, 27:113-118. Peelman LJ, Mortiaux F, Van Zeveren A, Dansercoer A, Mommens G, Coopman F, Bouquet Y, Burny A, Renaville R, Portetelle D: Evaluation of the genetic variability of 23 bovine microsatellite markers in four Belgian cattle breeds. Animal Genetics 1998, 29: 161-167. Peral Garcia P: Caracterizacin Racial de Equinos de Pura Raza Criolla. Su Comparacin con los Equinos de Pura Raza Espaola Mediante el Anlisis de sus Polimorfismos Genticos. Tesis Doctoral de la Facultad de Ciencias Naturales y Museo. U.N.L.P. La Plata, Argentina. 1994. Petit E, Balloux F, Excoffier L: Mammalian population genetics: why not Y?. Trends in Ecology and Evolution 2002, 17(1): 28-33. Pinder SJ, Perry BN, Skidmore CJ, Savva D: Analysis of polymorphism in the bovine casein genes by use of the polymerase chain reaction. Animal Genetics 1991, 22:11-20. Richardson KK, Crosby RM, Good PJ, Rosen NL, Mayfield JE: Bovine DNA contains a single major family of interspersed repetitive sequences. European Journal of Biochemistry 1986, 154: 349-354. Ron M, Genis I, Ezra E, Yoffe O, Weller JI, Shani M: Mitochondrial DNA polymorphism and determination of effects on economic traits in dairy cattle. Animal Biotechnology 1992, 3: 201 - 219. Ron M, Yoffe O, Weller JI: Sequence variation in D-loop mtDNA of cow lineages selected for high and low maternal effects on milk production. Animal Genetics 1993, 24: 183 - 186. Sambrook J., E. F. Fritsch, T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1626 pp.

Sanger F, Nicklen S, Coulson AR: DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977, 74: 5463 5468 Shuster DE, Kehrli ME, Ackermann MR, Gilbert RO: Identification and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle. Proceedings of the National Academy of Science USA 1992, 89: 9225-9229. Sibley CG, Ahlquist JE: Phylogeny and Classification of Birds. New Haven 1990, CT: Yale University Press. Siguroardottir S, Lunden A, Anderson L: Restriction fragment lenght polymorphism of bovine lysozyme genes. Animal Genetics 1990, 21: 259-266. Siguroardottir S: Studies of Class II genes of the Major Histocompatibility Complex in cattle. Swedish University of Agriculty Science, Department of Animal Breeding 1991, Uppsala. Simonsen V: Electrophoretic studies on the blood proteins of domestic dogs and other Canidae. Hereditas 1976, 82: 7-18. Simonsen V: Low level of heterozygosity among carnivores. Hereditas 1979, 91: 315. Smithies O: Zone electrophoresis in starch gels: group variations in ths serum proteins of normal human adults. Biochem. 1955, 61: 629-641. Sobrino B, Brion M, Carracedo A: SNPs in forensic genetics: a review on SNP typing methodologies. Forensic Sci. Int. 2005, 154: 181 194. Southern EM: Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis. J. Mol. Biol. 1975, 98:503 517. Steffen P, Eggen A, Dietz Ab, Womack Je, Stranzinger G, Fries R: Isolation and mapping of polymorphic microsattellites in cattle. Animal Genetics 1993, 24: 1221-1224. Sugiura S, Tanabe Y, Ota K: Genetic polymorphism of eserine resistant esterases in canine plasma. Anim. Blood Grps. Biochem. Genet. 1977, 8: 121-126. Sun H, Hart GL, Kirkpatrick BW: A polymorphic microsatellite (UWCA1) detected on bovine chromosome 23. Animal Genetics 1993, 24(2): 142. Sun H, Dentine MR, Kirkpatrick BW: A polymorphic microsatellite (UWCA4) detected on bovine chromosome 23. Animal Genetics 1993, 24(2): 149. Sun H, Dentine MR, Kirkpatrick BW: A polymorphic bovine microsatellite. Animal Genetics 1994, 24(2): 149. Sun H, Dentine MR, Barense W, Kirkpatrick BW: UWCA19 and UWCA20: Polymorphic bovine microsatellite. Animal Genetics 1994, 24(2):142. Sunden SLF, Stone RT, Bishop MD, Kappes SM, Keele JW, Beattie CW: A highgly polymorphic bovine microsatellite locus: BM2113. Animal Genetics 1993, 24(1):69.

Suzuki R, Kemp SJ, Teale AJ: Polymerase chain reaction analysis of mitochondrial DNA polymorphism in N'Dama and Zebu cattle. Animal Genetics 1993, 24: 339-343. Swarbrick PA, Dietz AB, Womack JE, Aston WP: Ovine and bovine dinucleotide repeat polymorphism at the MAF46 locus. Animal Genetics 1990, 23: 182. Tabel H, Groat HJ, Kraay GJ, Aston WP: Genetic polymorphism of complement factor H in cattle. Animal Genetics 1990, 21: 123-128. Tanabe Y, Sugiura S, Asanoma M, Ota K: Genetic polymorphism of leucine aminopeptidase in canine plasma. Anim. Blood Grps. Biochem. Genet. 1974, 5: 225-230. Tanabe Y, Omi T, Ota K: Genetic variants of glucose phosphate isomerase (E.C. 5.3.1.9) in canine erythrocytes. Anim. Blood Grps. Biochem. Genet. 1977, 8: 191-195. Tanabe Y, Omi T, Ota K: Genetic variants of hemoglobin in canine erythrocytes. Anim. Blood Grps. Biochem. Genet. 1978, 9: 79-83. Tautz D: Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research 1989, 17 (16): 6463-6471. Teale AJ, Wambugu J, Gwakisa PS, Stranzinger G, Bradley D, Kemp SJ: A polymorphism in randomly amplified DNA that differentiates the Y chromosomes of Bos indicus and Bos taurus. Animal Genetics 1995, 26: 243-248. Theilmann JL, Skow LC, Baker JF, Womack JE: Restriction fragment length polymorphisms for growth hormone, prolactine, osteonectin, cristallin, fibronectin and 21-steroid hydroxilase in cattle. Animal Genetics 1989, 20: 257 - 266. Trommelen GJ, Den Daas JHG, Vijg J, Uitterlinden AG: DNA profiling of cattle using micro- and minisatellites core probes. 1993, 24: 235-241. Usha AP, Simpson SP, Williams JL: Probability of random sireexclusion using microsatellite markers for parentage verification. Animal Genetics 1995, 26: 155-161. Vaiman D, Mercier D, Moazami-Goudarzy K: A set of 99 cattle microsatellites: characterization, synteny mapping, and polymorphism. Mammalian Genome 1994, 5: 288-297. Watson J, Crick F: Molecular estructure of nucleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 1953, 171:737-738. Weber JL, May PE: Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. American Journal of Human Genetics 1989, 44: 388-396. Westemeier RLl, Brawn JD, Simpson SA, Esker TL, Jansen RW, Walk JW, Kershner EL, Bouzat JL, Paige KN: Tracking the long-term decline and recovery of an isolated population. Science 1998, 282:1695-1698. Williams JGK, Kubelik AR, Livak J, Rafalski JA, Tingey SV: DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 1990, 18: 6531-6535. Yu Y, Nie L, He ZQ, Wen JK, Jian CS, Zhang YP: Mitochondrial DNA variation in cattle of south China: origin and introgression. Animal Genetics 1999, 30: 245-250. Zabeau M, Vos P: Selective restriction amplification: a general method for DNA fingerprinting. Publicacin Europea de Patente 92402629 (Publicacin No. EP0534858A1) 1993.

Figura 1.1. Representacin esquemtica de sitios de digestin correspondientes a cuatro enzimas, dos que producen extremos romos (HaeIII y AluI) y dos con extremos pegajosos (TaqI y HinfI).

Figura 1.2. (a) Representacin esquemtica de los patrones de restriccin correspondientes al cuarto exn del gen -casena (CAS) digerido con la enzima HindIII y (b) su posterior visualizacin en un gel de poliacrilamida.

(a) 583 pb Exn 4 CAS

CAS A 583 pb

CAS B 380 pb Hind III 203 pb

(b)

AA

AB

BB

583pb

380pb 203pb

Figura 1.3. Procedimientos empleados en la tcnica de Southern Blot

Figura 1.4. Procedimiento para secuenciacin de DNA ideado por Sanger et al. (1977).