INTRODUCCIN

Objetivo de las clases sobre Biotecnologa Mdica

Ofrecer un resumen de gran parte del conocimiento cientco que sustenta la biotecnologa dirigida al diagnstico y la terapia en el entorno de la salud y de sus aplicaciones actuales y futuras, como fuentes posibles de creacin de valor y nuevos mercados en el sector de la Biomedicina

La Biotecnologa
Est contribuyendo al desarrollo de nuevos frmacos biolgicos, muy difcilmente obtenibles o inabordables por los mtodos clsicos Proporciona nuevos mtodos para la produccin a gran escala de sustancias ya existentes, que son signicativamente ms ecaces Es la base de nuevos tests diagnsticos ms sensibles y especcos Est permitiendo ampliar el espectro, el enfoque y la seguridad de nuevas vacunas Contribuye a que los tratamientos mdicos sean ms ecaces, preventivos y personalizados Desarrolla terapias que corrigen el defecto bioqumico, en lugar de aliviarlo

Hitos de la Biotecnologa en salud humana

1972. La obtencin del primer ADN recombinante (Paul Berg, Premio Nobel de Qumica
en 1980) 1973. La transformacin de la bacteria Escherichia coli con un plsmido recombinante (Herbert Boyer (Genentech)) 1982. La aprobacin del primer frmaco producido por ingeniera gentica (insulina humana) 1986. La primera vacuna diseada por ingeniera gentica (hepatitis B) 1988. La primera patente de un animal transgnico (onco-ratn) 1990. El primer tratamiento experimental de terapia gnica en humanos (ADA) 1997. La primera clonacin animal a partir de una clula del animal adulto (Dolly) 1998. El establecimiento de clulas madre (troncales) embrionarias humanas 2003. La nalizacin del mapa del genoma humano 2004. Obtencin de la primera lnea de clulas madre embrionarias humanas con el material gentico de una clula adulta

Cifra de ventas de empresas farmacuticas

Cifra de ventas de empresas biotecnolgicas

Etapas en el desarrollo de un frmaco

PharmaMar: grupo Zeltia

Frmacos biotecnolgicos en desarrollo en el mundo

Solicitudes de patentes internacionales en biomedicina en el CSIC

Contratos de explotacin de resultados en el CSIC

TEMA1-BiotecMed Los cidos nucleicos como herramientas de diagnstico. Tests genticos. Microarrays.

La mayora de los tests genticos detectan la presencia de variantes en un nico gen que conducen a la ausencia o al funcionamiento anmalo de una protena esencial.

Fenilcetonuria
- Deciencia en Phe hidroxilasa que provoca acumulacin de Phe y otros metabolitos. - Causa dao cerebral postnatal, con el consiguiente retrasa metal. - Afecta 1/10.000 nacidos. - Se debe a mutaciones en un nico gen autosmico recesivo. - Dependiendo de la dieta, la Phe puede estar hasta 40 veces ms concentrada en sangre.

Test de Guthrie
- Ensayo semicuantitativo diseado para detectar elevados niveles en sangre de Phe. - Se basa en la capacidad que tiene la Phe de facilitar el crecimiento bacteriano en un medio con un inhibidor del crecimiento. - Se hace una puncin en el taln de bebs de pocos das. La gota de sangre se recoge en un papel de ltro y se coloca en una placa de petri que contiene Bacillus subtilis y el inhibidor 2-tienil-alanina. La presencia de una cantidad extra de Phe permite el crecimiento bacteriano. Las bacterias crecen alrededor del ltro y cuanto ms grande es el dimetro de crecimiento, ms Phe haba en el ltro. Esto se compara con unos patrones de referencia.

www.youtube.com/watch?v=KUI8GPqgyvM&feature=related

Alternativas y complementos al test de Guthrie

- La espectrometra de masas en tandem permite detectar las alteraciones de una gran variedad de enfermedades congnitas. - La secuenciacin del gen identica las mutaciones y, con las debidas correlaciones previas, permite conocer la severidad de la enfermedad y por tanto el tratamiento correspondiente. - Se podra suministrar a los pacientes la enzima Phe hidroxilasa, pero es un complejo multienzimtico muy inestable y requiere un cofactor para su actividad. En cambio se est probando la Phe amonio liasa, que convierte la Phe en amonio y acido transcinmico. Esta enzima es estable y no requiere cofactor. Al menos en ratones esta enzima es ecaz incluso suministrada oralmente.

Cncer de mama - La sobreexpresin de Her2 indica la malignidad del tumor

Intensidad de tincin 0 1+ 2+ 3+ Patrn de tincin No se observa Ligera/levemente perceptible, Tincin completa de dbil a moderada Tincin completa de moderada a fuerte Sobreexpresin de HER2 Negativo Negativo Dbil a Moderada Moderada a fuerte

- Herceptin de Roche es un anticuerpo monoclonal que impide la divisin celular y activa las defensas del organismo

Uso de los cidos nucleicos en los tests genticos

- Hibridacin con sonda especfica - Secuenciacin - PCR (polymerase chain reaction) Microarrays

Tcnicas de biologa molecular

http://bcs.whfreeman.com/lehninger/ picar en Technique Animations http://www.dnai.org/b/index.html picar en Techniques

Mtodo de PCR/OLA
(Polymerase Chain Reaction / Oligonucleotide Ligation Assay)

Mtodo de LCR (ligation chain reaction)

-Variante ms simple pero menos sensible de PCR/OLA -Se mezcla la muestra de ADN con un exceso de oligos OLA en presencia de una ligasa termorresistente -1 ligacin a 65C, desnaturalizacin a 95 para separar lo ligado, ligacin a 65C... as X veces -Si hay ligacin, tras 20 ciclos podemos ver lo ligado en gel de electroforesis o ELISA

Sondas con candado

Deteccin de una mutacin en una nica base mediante PCR usando un oligonucletido uorescente

DNA ngerprinting
Mtodo para detectar diferencias entre individuos de la misma especie mediante anlisis de ADN

Microsatlites: unidades repetidas de 1-6pb Minisatlites: unidades repetidas de 6-25pb

1. Hibridacin de ADN no degradado con ADN de mini-satlites

Southern-blot de una muestra de ADN forense

2. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Tipos de alteraciones del ADN que permiten realizar un test gentico

Tipos de anlisis de diagnstico gentico

Deteccin de secuencias especficas Deteccin de mutaciones simples y SNP Test citogenticos Anlisis epigentico

Tipos de anlisis de diagnstico gentico

Deteccin de secuencias especficas Deteccin de mutaciones simples y SNP Test citogenticos Anlisis epigentico

Diagnstico de la malaria
- Plasmodium falciparum (protozoo introducido por el mosquito Anopheles). - Afecta a un tercio de la poblacin mundial. - Infecta y destruye los glbulos rojos provocando ebre y en los casos severos daos en el cerebro, rin, etc. - Se diagnostica examinando frotis sanguneos al microscopio para ver el parsito. La deteccin inmunolgica tipo ELISA (que es rpida y automatizable) tampoco es ecaz porque no distingue entre actuales o antiguas infecciones, porque se limita a detectar los anticuerpos antiPlasmodium. - Lo ms ecaz es una hidridacin para detectar ADN del microorganismo.

Ms de 100 sondas
- Legionella

pneumophila (fallos respiratorios) - Salmonella typhi (ebres tifoideas) - Campylobacter hyointestinalis (gastritis) - Escherichia coli enterotoxignica (gastroenteritis) - Etc..

Deteccin de Trypanosoma cruzi

- Este protozoo provoca la llamada enfermedad de Chagas. - Invade el hgado, bazo, ndulos linfticos y sistema nervioso central, se multiplica y destruye las clulas. - Este parsito es diseminado por insectos (chinche gaucha) y mata a 50.000 personas/ao. - Se diagnostica examinando una muestra fresca de sangre al microscopio para ver al parasito moverse (solo se ve en la fase aguda). Alternativamente se puede dar sangre del paciente a insectos no infectados y tras 30-40 das ver al microscopio si el intestino del insecto tiene parsitos. - Los tests inmunolgicos dan muchos fasos positivos. - PCR: se amplica un fragmento de 188 pb del genoma del parsito que est en multicopia y que no est en parsitos relacionados ni en el hombre.

Otra serie de kits detectan y cuantican: - HIV (Sida) - Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) -Chlamydia trachomatis (ceguera, etc..) - Etc..

Tipos de anlisis de diagnstico gentico

Deteccin de secuencias especficas Deteccin de mutaciones simples y SNP Test citogenticos Anlisis epigentico

Fibrosis qustica
-Enfermedad gentica provocada por alteraciones en el gen CFTR (cystic brosis transmembrane conductance regulator). -La enfermedad se produce porque ciertas clulas, incluidas las que revisten el pulmn y el pncreas, no permiten el paso normal de Cl-, lo que retiene tambin el Na+ en el exterior celular. Como consecuencia, estas clulas producen una secrecin mucosa espesa y pegajosa, que obstruye los pulmones y causa problemas de respiracin. Adems, este moco espeso provoca que se acumulen las bacterias y causen infecciones, lo que termina daando los pulmones y contribuye a la muerte prematura (hacia los 30 aos). Adems, el bloqueo del pncreas por el moco causa problemas digestivos y retraso en el crecimiento. -Es un gen autosmico recesivo. -Afecta a 1/2500 europeos. Portan el alelo 1/25. -Se conocen hasta 500 mutaciones del gen que provocan la enfermedad, aunque en Gran Bretaa 4 mutaciones representan el 81% de las causas de la enfermedad. Pero cada mutacin requiere un test individualizado. Las mutaciones raras se escapan. De todas formas se est intentando desarrollar un test para el estudio de un nmero alto de mutaciones potenciales en un solo gen.

Anemia falciforme
- Enfermedad gentica provocada por un cambio en un nico nucletido del codn que codica para el 6 aminocido (Glu a Val) de las cadenas de la hemoglobina (-globina). - Los individuos con homocigosis para el defecto (S/S) tienen los glbulos rojos con una forma irregular (hoz) debido a la conformacin de la hemoglobina. - La enfermedad provoca una anemia severa con progresivos daos en el corazn, pulmn, cerebro, etc. causados por la incapacidad de la hemoglobina mutante se transportar suciente oxgeno. -Los heterocigotos (S/A) tienen glbulos rojos con forma normal y no tienen sntomas salvo que estn en condiciones de bajas tensiones de oxgeno. - Esta mutacin es frecuente entre los africanos negros y sus descencientes en Amrica.

Deteccin de la anemia falciforme

Tipos de anlisis de diagnstico gentico

Deteccin de secuencias especficas Deteccin de mutaciones simples y SNP Test citogenticos Anlisis epigentico

Sonda para el sndrome DiGeorge/ Velo-Cardio Facial/ CATCH 22/ Shprintzen, causado por una microdelecin en el cromosoma 22

Sonda para la deciencia de esteroidesulfatasa, causada por una microdelecin en el cromosoma X

Clulas de uido amnitico analizadas con sondas de ADN para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y

El ncleo de la izquierda se ha hibridado con sondas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo), y tiene claramente tres seales rojas. El ncleo de la derecha se ha hibridado con sondas para los cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (rojo). Puesto que muestra dos seales verdes y ninguna roja, es femenino.

Spectral Karyotyping (SKY)

Tipos de anlisis de diagnstico gentico

Deteccin de secuencias especficas Deteccin de mutaciones simples y SNP Test citogenticos Anlisis epigentico

EPIGENTICA

Estudia la regulacin de los cambios en la expresin gnica debidos a mecanismos que no implican cambios en la secuencia de ADN: - Modulacin de la estructura de la cromatina - Represin transcripcional - Inactivacin del cromosoma X - Impronta genmica - Supresin de los efectos perjudiciales de secuencias de ADN sobre la integridad del genoma

MSP (Methylation-specic PCR )

Utilidad de los tests genticos - Permiten conrmar el diagnstico de individuos afectados con
algn padecimiento gentico - Detectar el riesgo de que sufran una patologa los portadores sanos de una determinada alteracin gentica - Determinar la presencia de un agente infeccioso.

Ventajas y desventajas de los test genticos

Las ventajas enumeradas se traducen en Una mejor capacidad de diagnstico Pronstico Deteccin de enfermedad mnima residual Prediccin de respuesta y de toxicidad a frmacos

Tests rutinarios introducidos en clnica

Carga viral de VIH Presencia del virus de la hepatitis en sus distintas formas Identicacin de Chlamydia Perl de mutaciones en la brosis qustica. Otros tests menos utilizados Mutaciones del Factor V Leyden (trastornos en la coagulacin) Caracterizacin gentica de leucemias y linfomas Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 (cncer de mama) Determinacin de mutaciones en cncer colorrectal Deteccin del papilomavirus humano (cncer de cuello de tero)

Principales tests genticos comerciales utilizados en clnica

Principales tests genticos no comerciales utilizados en clnica

Microarray (micromatriz) Dispositivo sobre cuya supercie se disponen, de forma ordenada y precisa, un gran nmero de entidades diversas (pptidos, oligonucletidos, molculas biolgicas, clulas, tejidos, etc.) para ser evaluadas simultneamente en un nico ensayo

Microarray de ADN La secuenciacin de genomas completos Miniaturizacin Han permitido situar en posiciones concretas de un portaobjetos cientos de miles de fragmentos de ADN, obteniendo as un microarray de ADN.

Estudio de la expresin diferencial de genes mediante microarray de ADN

Negro: no hibridacin

Microarray de genoma (transcriptoma) completo

De uso preferencial en investigacin en salud humana. Permite la identicacin de nuevos genes relevantes en la gnesis y desarrollo de enfermedades, que pueden representar nuevas dianas teraputicas y la caracterizacin de patrones de expresin gnica con carcter diagnstico o pronstico. Diagnstico: se asume que los genes que se activen o repriman diferencialmente entre los tejidos sanos y los patolgicos deben cumplir algn papel en tal enfermedad (diana en futuros tratamientos farmacolgicos) Pronstico: parte de un supuesto relacionado como es que el tipo de genes expresados en los tejidos patolgicos, y el nivel al que lo hacen, determinan cul va a ser la evolucin futura de la enfermedad

Patologa Molecular

Cada crculo es una copia de un gen humano

Ejemplo de microarray de ADN

Crculos ROJOS representan genes sobreexpresados en el tumor

Circulos VERDES representan genes infraexpresados

Circulos AMARILLOS representan genes no alterados

Microarrays de ADN y comportamiento clnico

Supervivencia

Usos de los microarrays de ADN

-Estudio de la expresin diferencial de genes Microarrays de genoma completo Biochips a la carta (baja densidad) -Determinacin de las variantes de determinados genes (alelos) Anlisis completo del genoma de los individuos SNP que coneran susceptibilidad por una enfermedad -Produccin de chips dedicados a procesos particulares Caracterizacin de los diferentes genes de los citocromos P450 Hipercolesterolemia familiar Agentes infecciosos

Microarrays de protenas Faltan herramientas con suciente especicidad: los anticuerpos monoclonales. Deben ser generados uno a uno Pueden tener una baja anidad por su epitopo Pueden dar reacciones cruzadas con otras protenas Hay que adherir los anticuerpos al soporte (se alteran?) No se cubren todas las protenas Pero son importantes porque no siempre existe una relacin directa entre el nivel de expresin de un gen y la protena correspondiente.

Tipos de microarrays de protenas - Anticuerpos monoclonales - Autoantgenos recombinantes - Alrgenos recombinantes - Anticuerpos monoespeccos - Anticuerpos articiales (Phage dispay) - Aptmeros - Otros agentes - Microarrays de fase reversa - Microarrays funcionales

Microarrays de clulas y tejidos

- Microarray de tejido: validacin de nuevas dianas - Microarray con electrodos de tejido cerebral - Microarray de clulas: efecto de ARNi