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Metanobacterias y biometanacin Introduccin

Por cerca de medio siglo, la vida fue clasificada al ms alto nivel en dos taxones, procariotas y eucariotas, sobre la base de las caractersticas fenotpicas celulares que incluyen la presencia o ausencia de membranas nucleares, organelos o paredes celulares (Rasche and Ferry 2005). Se han publicado varias revisiones sobre la taxonoma de los metangenos desde finales del siglo pasado, luego del conocimiento de las propiedades bioqumicas y genticas nicas de estos organismos que llevaron al concepto de Achaebacteria al final de los setenta (Garcia 1990). Sin embargo, no fue sino hasta 1990 que un enfoque molecular, basado en la comparacin de las secuencias ribosomales 16S de RNA, revel que todas las formas de vida se dividen en tres divisiones primarias (dominios) de la vida: la Eucarya, que abarca a todas las eucariotas, las Bacteria (o Eubacteria), incluyendo a las Eubacteria "tpicas", y las Archaea (o Archaebacteria). Las Archaea comprenden cuatro reinos: Euryarchaeota, Grenarchaeota, Korarchaeota, y el recientemente descrito Nanoarchaeota. En trmino evolucionarios, los dos dominios procariticos son ms genticamente distintos unos de otros que uno de los grupos, los Archaea, a partir de los Eucarya. Los ms grandes, diversos, y bien estudiados representantes de los Archaea son los anaerobios productores de metano (methanoarchaea), que proveyeron las primeras pistas que condujeron al descubrimiento del concepto de los tres dominios. Las methanoarchaea son miembros de los Euryarchaeota. La investigacin sobre los methanoarchaea durante las pasadas dos dcadas han impactado grandemente sobre nuestra comprensin de la ecologa, fisiologa, y bioqumica de los Archaea (Rasche and Ferry 2005).

El rumen bovino y los metanognicos


Numerosos investigadores han demostrado que se forma mucho metano en el rumen, sugiriendo que las bacterias metanognicas (archae metanognicas) son abundantes en este entorno (Bryant and Boone 1987; Attwood et al. 2011). Los gneros metanognicos responsables de la produccin de CH4 incluyen un gran grupo que carece de representantes cultivados (Attwood et al. 2011). La informacin sobre su naturaleza fue escasa incluso a mediados del siglo pasado, as como la abundancia de estos organismos. La importancia de las bacterias metanognicas en el rumen y el hecho de que stas son los principales componentes bacteriales conocidos que eludieron largo tiempo el cultivo puro, estimul a los investigadores a aislar los tipos predominantes en cultivos puros (Bryant and Boone 1987). El hidrgeno y dixido de carbono son los principales sustratos de la metanognesis en el rumen. El hidrgeno puede ser liberado a las bacterias metanognicas por las bacterias hidrognicas. Se han reportado datos (Vogels, Hoppe, and Stumm 1980) que indican que esta interaccin metablica esta acompaada por una interaccin somtica entre bacterias metanognicas y ciliados pertenecientes a la familia Ophryoscolecidae (orden Entodiniomorphida). El conocimiento de las caractersticas de las bacterias metanognicas del rumen ha requerido de investigaciones que en un primer momento aportaron como caractersticas los resultados de la tincin de Gram, caractersticas morfolgicas, y condiciones de crecimiento (pH, temperatura, sustrato) (Paynter and Hungate 1968). Por otro lado, y con objeto de reducir las emisiones de CH 4 de los rumiantes, se ha sealado (Attwood et al. 2011) que las tecnologas deben tener como objetivo todos los metanognicos del rumen para prevenir cualquier metangeno afectado se expanda para ocupar el nicho vacante. Las

intervenciones tambin deben ser especficas para los metangenos de modo que otros microbios del rumen puedan continuar las funciones digestivas normales. sto requiere un conocimiento detallado de la diversidad y fisiologa de los metangenos del rumen para definir caractersticas de conservacin que puedan ser objeto de inhibicin metangena. Los proyectos de secuenciacin del genoma estn en marcha en Nueva Zelanda y Australia (Attwood et al. 2011) sobre muchos grupos metangenos ruminales, incluyendo representantes del gnero Methanobrevibacter, Methanobacterium, Methanosphaera, Methanosarcina, y el grupo subcultural, Rumen Cluster C. El genoma completado de Methanobrevibacter ruminantium y los proyectos de secuencias de otras especies metanognicas del rumen empiezan a permitir la identificacin de procesos celulares subyacentes que definen a estos organismos, y esto lleva a una mejor comprensin de sus estilos de vida en el rumen. A pesar de que las investigaciones estn principalmente en la etapa explorativa, estn surgiendo dos tipos de oportunidades para inhibir los metangenos, cuando ste es el objetivo, siendo el primero la inactivacin de las enzimas conservadoras de los metangenos por screening de los mismos, y el segundo el diseo de pequeos inhibidores va enfoque quimiogenmico, e identificando protenas de superficie comunes a los metangenos del rumen que pueden ser usados como anticuerpos en vacunas anti-metangenas. Las excretas bovinas tambin ha sido empleado como inculo en fermentadores de desechos agroindustriales, y la aclimatacin de los metangenos que contiene ha sido estudiada (Goberna et al. 2010), mostrando que Methanosarcina domina en la excreta inicial, y durante la codigestin a 37C; mientras que el aumento de temperatura (y de presin parcial de gas hidrgeno) genera un crecimiento explosivo de otros metangenos (Methanobacterium, Methanoculleus, Methanothermobacter, y un grupo de archaea no cultivadas). En todo caso, Methanosarcina fue el metangeno ms verstil, y an queda por estudiar si hay un vnculo entre el incremento de la diversidad metanognica y la productividad del reactor.

Metanognicos en el lodo de biodigestores


Empleando excretas de bovino, se ha obtenido una alta riqueza filogentica en los lodos, con representantes de tres los cuatro rdenes taxonmicos encontrados en digestores (Goberna et al. 2010). Se han aislado tambin especies de Methanobacterium de biodigestores de aguas residuales domsticas, y establecido sus condiciones de crecimiento (Bryant and Boone 1987). Durante el crecimiento de Methanobacterium thermoautotrophicum en un fermentador fedbatch, las clulas se enfrentan a la disminucin constante de la concentracin del suministro de energa de hidrgeno. Con el objeto de investigar cmo el organismo responde a estos cambios, se examinaron las propiedades metanognicas de clulas recolectadas en diferentes fases de crecimiento (Pennings et al. 2000). En el estudio mencionado se determinaron tambin los niveles celulares de varias isoenzimas metanognicas y enzimas funcionalmente equivalentes. Se hall cmo las clulas mantienen las tasas de metanognesis por disminucin de su afinidad por hidrgeno: el KH2m disminuye al pasar de la fase exponencial a la fase estacionaria. Simultneamente, la tasa mxima especfica de produccin de metano cambia. Los niveles de H2dependiente metenil-tetrahidrometanopterin deshidrogenasa (H2-MDH) y la coenzima M reductasa isoenzima II (MCR II) decrecen a la entrada de la fase estacionaria. Las clulas que crecen en condiciones que favorecen la expresin de MCR II tienen altos niveles de MCR II y H2-MDH, mientras que en las clulas que crecen en condiciones que favorecen MCR I, los niveles de MCR II y H2-MDH fueron mucho menores y las clulas tuvieron una incrementada afinidad por el hidrgeno durante todo el ciclo de crecimiento. Se encontr que el uso de tiosulfato como medio reductor tiene un efecto negativo sobre los niveles de MCR II y H 2-MDH. De stos resultados se concluye que M. thermoautotrophicum responde a las variaciones en la disponibilidad de hidrgeno y otras condiciones ambientales (pH, temperatura de crecimiento, medio reductor) mediante la

alteracin de su fisiologa. La adaptacin incluye, entre otros, la expresin diferenciada de las isoenzimas MDH y MCR. La temperatura de fermentacin de un biodigestor, pueden no impedir el aislamiento de metangenos de diferente comportamiento en el lodo, as, un Methanobacterium autotrfico termoflico (cepa CB12, DSM 3664) fue aislado de un digestor mesoflico de biogas (Zhao et al. 1986). Su temperatura ptima (56C) fue menor a las de otros miembros termoflicos del gnero Methanobacterium, tambin se observ su velocidad especfica de crecimiento mxima como de 0,564 h (tiempo de duplicacin de 74 minutos). Otro estudio (Patel, Sprott, and Fein 1990) aisl la cepa bacterial GP9T (T = tipo de cepa) de una bacteria metanognica mesoflica, no mvil, no formadora de esporas, del lodo primario obtenido de las instalaciones de tratamiento de residuos de una gran fbrica de pasta de papel kraft en Canad. Las clulas individuales fueron de 6,0 por 0,8 m y tieron como gram positivas. El crecimiento y produccin de metano se produjo nicamente con H2-CO2 como sustrato. El acetato , formato, propionato, butirato, piruvato, metanol, o trimetilamina no pudieron servir como nica fuente de carbono y energa para el crecimiento. El pH ptimo de crecimiento estuvo entre 5,6 y 6,2; no se observ crecimiento consistente y produccin de metano por debajo de pH 4,68. La temperatura ptima de crecimiento fue de 35C. Por otra parte, el sobrenadante del lodo primario aument el crecimiento en cerca de 10%. Como se mencion anteriormente, los metangenos se han empleado en bioremediacin. As un estudio (Cabirol et al. 1998) deriv un consorcio metanognico y sulfato reductor que desclora y mineraliza altas concentraciones de PCE, a partir de lodo digerido de forma anaerobia de una planta de tratamiento de residuos (Bourg-en-Bresse, Francia).

Bsqueda de metanobacterias en la actualidad


En nuestro siglo se siguen realizando aislamientos de metangenos en ambientes o ecologas regionales no estudiadas, pero que permiten sospechar su presencia. Tales estudios han realizado pruebas piloto de produccin de metano con los gneros hallados, as como determinado mtodos para su conservacin (Acua Gonzlez et al. 2008). Otros, describen las caractersticas de cepas especficas de metanobacterias, que pueden diferir en cuanto a condiciones de crecimiento (temperatura, pH) las unas respecto a las otras (Maestrojun and Boone 1991). Tcnicas como las micrografas electrnicas con tincin negativa han revelado una nueva caracterstica de metangenos, as, se descubri que la cepa O1M9704 de Methanosarcina mazei cuenta con vacuolas de gas y una estructura tubular extendida fuera de las clulas. La estructura tubular y vacuolas de gas, como las mencionadas en el estudio anterior, pueden beneficiar la adaptacin de methanoarchaea en entornos de estuarios (M.-C. Lai et al. 2000). Ms recientemente, el secuenciado genmico, el desarrollo de sistemas genticos e investigaciones sobre la biologa molecular de los methanoarchaea ha expandido significativamente nuestro conocimiento del dominio Archaea (Rasche and Ferry 2005). Para el nombramiento de las bacterias aisladas, se han empleado mtodos como la composicin base de ADN, caractersticas fisiolgicas, tipificacin por inmunofluorescencia indirecta, y estudios de hibridacin ADN-ADN (Patel, Sprott, and Fein 1990). Los mtodos modernos tambin se vienen empleando en la identificacin de cepas aisladas, como se dijo, de nuevos ambientes o ecosistemas (M.-C. Lai et al. 2000), donde ha sido especialmente importante la comparacin de las secuencias de 16S rDNA para las comparaciones filogenticas.

Aplicaciones industriales de las metanobacterias


Importantes factores econmicos han colocado a estas bacterias en un primer plano, incluyendo la necesidad de desarrollar formas alternativas de energa, control de la polucin xenobitica, el mejoramiento del rendimiento crnico en la industria ganadera, la distincin entre la

generacin biolgica y termocataltica del petroleo, y la distribucin del metano en la atmsfera de la tierra (Garcia 1990). Las bacterias metanognicas tambin se han empleado en bioremediacin de materiales peligrosos. El tetracloroetileno (PCE) es un compuesto txico esencialmente usado como desengrasante y solvente de limpieza en seco. Un estudio (Cabirol et al. 1998) aisl una bacteria metanognica, cepa FR, de un consorcio aclimatado en lodos de una planta de tratamiento de residuos. Sobre la base de las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas, la cepa FR fue clasificada en el gnero Methanosarcina. El anlisis de filogenia con la secuencia de gen 16S rRNA revela que la cepa FR esta altamente relacionada con Methanosarcina mazei y Methanosarcina frisia (99,6 y 99,5% de identidad, respectivamente). Fueron descloradas completamente altas concentraciones (50-87M) de PCE por cultivos de la cepa FR a la tasa de 76mMmg de protenada. La descloracin de PCE produjo un compuesto no identificado. Los experimentos de rastreo con [C]PCE revelan que el producto fue un no clorado. La decloracin de PCE a tricloroetileno era todava activa en presencia de extracto de clulas hervidas de la cepa FR. Sin embargo, no se observ una posterior decloracin. Este resultado sugiere que un cofactor antes que un sistema enzimtico, es responsable de la primera decloracin de PCE. Las fracciones de la decloracin activa purificadas del extracto de clulas sobre una columna XAD-4 revelan la presencia de F420, F430 y factores cobamidas. ste fue el primer reporte del aislamiento de una bacteria metanognica con la capacidad de declorar altas concentraciones de PCE a un producto no clorado. Las bacterias metanognicas obtienen su energa mediante la produccin metablica de gas metano, utilizando sustratos como dixido de carbono, acetato y sustratos de metilo a travs de procesos de hidrlisis y acetognesis y son esenciales en la degradacin anaerobia de la materia orgnica en la naturaleza (Acua Gonzlez et al. 2008).

El proceso de metanognesis
Generalmente se atribuye al fsico italiano Alessando Volta el descubrimiento de la produccin de metano biolgico (gas natural), metanognesis, hace ms de 130 aos atrs. En el desempeo del "Experimento Volta", perturb el sedimento del lago Cono al norte de Italia con un polo que libera las burbujas de metano atrapadas. El encendido del gas produjo una flama que l llam "aire combustible". La figura 1 muestra un experimento Volta algo ms actualizado, en que el gas del sedimento de un estanque de agua dulce es recolectado en un embudo invertido sumergido en la columna de agua y encendido a su liberacin por inclinacin del embudo (Rasche and Ferry 2005).

Figura 1: Un experimento Volta contemporneo El proceso de metanognesis requiere un consorcio de al menos tres grupos interactuantes metablicos de microorganismos estrictamente anaerobios (figura 2). El grupo fermentativo descompone la celulosa y otras molculas complejas a cidos carboxlicos y gas hidrgeno (Rasche and Ferry 2005). nicamente el acetato, dixido de carbono, hidrgeno y formato son los principales sustratos para los methanoarchae (Rasche and Ferry 2005). La produccin de metano a partir de acetato es un paso importante en el proceso de digestin anaerbica, ya que es bien conocido que el acetato es el principal intermediario en la bioconversin de la materia orgnica a metano y dixido de carbono (Wandrey and Aivasidis 1983), y que cerca del 70% del total de metano producido en digestin anaerbica se origina a partir del acetato (Fukuzaki, Nishio, and Nagai 1990; Rasche and Ferry 2005); as, el grupo acetognico productor de hidrgeno es necesario para favorecer la metabolizacin de butirato y propionato a sustratos para las methanoarchaea (Rasche and Ferry 2005).

Figura 2: Un esquema que muestra el flujo de carbono a travs de los tres principales grupos metablicos de anaerobios involucrados en la conversin de materia orgnica compleja a metano en ambientes de agua dulce El cido actico ha sido considerado como un sustrato deseable, y se ha ensayado el crecimiento de Methanosarcina barkeri (DSM 804) sobre el mismo (Wandrey and Aivasidis 1983). El cido actico por s mismo causa demanda qumica de oxgeno (COD) en el agua de desecho de importantes procesos industriales, por ejemplo, en la industria del papel y pulpa. Aqu en el

condensado de la concentracin del licor de sulfito agotado, el cido actico se encuentra como casi la nica forma de carbn. Tales aguas de desecho "destiladas" son muy apropiadas para la transferencia de resultados con el modelo de agua de desecho a un caso de importancia prctica (Wandrey and Aivasidis 1983). Adems, desde que nicamente pocos microorganismos pueden crecer de forma anaerbica con cido actico como nica fuente de carbono, tal cultivo es potencialmente autoestril. Generalmente el acetato se forma va fermentacin de azcares y aminocidos o va oxidacin de cidos grasos voltiles. Se convierte a metano y dixido de carbono por metangenos aceticlsticos, es decir, Methanosarcina spp., y Methanothrix spp. Por lo tanto, en el lodo de digestin, una especie con un uso ms efectivo del acetato, dejara fuera de competencia a las otras por el acetato, dependiendo de la concentracin de acetato. Se ha demostrado que los cambios en la composicin de la poblacin aceticlstica metanognica ocurren cuando el tiempo de retencin o la velocidad de alimentacin se ajusta para mantener la concentracin de acetato alta o baja. As, en el lodo de digestin, una especie con un uso ms efectivo del acetato, dejara fuera de competencia a las otras por el acetato, dependiendo de la concentracin de acetato. Se ha demostrado que los cambios en la composicin de la poblacin aceticlstica metanognica ocurren cuando el tiempo de retencin o la velocidad de alimentacin se ajusta para mantener la concentracin de acetato alta o baja (Fukuzaki, Nishio, and Nagai 1990). Las methanoarchaea emplean dos vas separadas en que el metano se deriva tanto del grupo metil del acetato (reaccin 1) o de la reduccin del dixido de carbono con electrones del hidrgeno o formato (reacciones 2a y 2b) (Rasche and Ferry 2005). El H2 es un donante de electrones clave para muchos microorganismos anaerbicos; por lo tanto, ocurre una fuerte competencia por el H 2 entre los grupos que los utilizan. Se han estudiado los parmetros de la cintica de Monod (Karadagli and Rittmann 2005) dado que proveen informacin esencial para el anlisis cintico de la competencia por H2.

Pasos comunes a las dos principales vas de metanognesis


Los pasos mostrados en la figura 3 son comunes a las dos principales vas para la produccin de metano en la naturaleza, reduccin de dixido de carbono y fermentacin de acetato. Las dos vas difieren principalmente en la manera por la que un grupo metil se genera y pasa al cofactor tetrahidrometanopterin (H4MPT) para formar CH3-H4MPT. La conversin de CH3-H4MPT a metano es esencialmente la misma en ambas vas. El paso 1 en la figura 3 es catalizado por Nmetiltetrahidrometanopterin: coenzima M metiltransferasa, que ha sido recientemente revisada. La metiltransferasa es un complejo integral unido a la membrana que tambin funciona generando un gradiente de iones sodio a travs de la membrana y acoplado a la reaccin de la metil transferasa. La enzima como se caracteriza desde Methanobacter marburgensis y Methanosarcina mazei contiene un cofactor corrinoide, cobalamina (5'-hidroxibenzimidazolil cobamida), que acepta el grupo metil de CH3-H4MPT en la primera de las dos reacciones parciales catalizadas por la enzima. La segunda reaccin parcial involucra la transferencia del grupo metilo desde CH3-cobalamina a coenzima M (HS-CoM) produciendo CH3-S-CoM. El complejo metiltransferasa contiene ocho subunidades no identificadas (MtrA-H). MtrA contiene al cofactor cobalamina sobresaliendo en el citoplasma que se somete a la metilacion y desmetilacin. Esto propone que la metilacin es catalizada por MtrH y la desmetilacin por MtrE, que tambin translocaliza iones sodio. El mecanismo de translocacin se cree que involucra cambios conformacionales inducidos en MtrA

por metilacin y desmetilacin que son transmitidos a MtrE, que impulsa la translocacin. El crecimiento de las methanoarchaea utilizando cualquiera de las dos vas es dependiente del sodio, y se propone utilizar gradientes de sodio para las funciones energticas (Rasche and Ferry 2005).

Figura 3: Pasos comunes a las dos principales vas de metanognesis La metil-coenzima M-reductasa cataliza el paso 2 en la figura 3. El donante de electrones es la coenzima B (CoB) y adems de metano se produce el heterodisulfuro CoM-S-S-CoB. Methanothermbacter marburgensis y Methanothermobacter thermoautotrophicus contienen dos isoenzimas (MCRI y MCRII) con masas nativas moleculares de aproximadamente 300 kDa compuestas de tres diferentes subunidades con masas moleculares de 65 (), 46 (), y 30-35 () kDa en una configuracin 222. La estructura cristalina de la isoenzima MCRI de M. marburgensis muestra la coenzima F430 (F430) posicionada al fondo de un canal estrecho en dos sitios activos independientes separados por aproximadamente 50 . Los dos sitios activos estn formados por residuos de las unidades ' o ''' indicando que dos trmeros son necesarios para formar los sitios activos. Las estructuras, acomplejadas ya sea con HS-CoM ms HS-CoB o CoM-S-S-CoB, han sido las bases para un mecanismo de reaccin propuesto. Las posiciones relativas de CoM, CoB, y F430 en la estructura cristalina sugiere un ataque nucleoflico de [F430]Ni(I) sobre CH3-SCoM que forma el intermediario [F430]Ni(III)-CH3. En el prximo paso, [F430]Ni(III) oxida HSCoM produciendo el radical thiyl S-CoM y [F430]Ni(II)-CH3. En el paso final, la protonlisis de [F430]Ni(II)-CH3 libera metano y el radical thiyl se acopla a S-CoB para formar el heterodisulfuro (CoB-S-S-CoM) acompaado por una reduccin de un electrn de Ni(II) al estado activo redox. La unin de CoM induce cambios especficos conformacionales que aseguran la entrada de CH3-S-CoM adyacente a F430 y antes de la entrada de CoB en el estrecho canal del sitio activo (Rasche and Ferry 2005). La heterodisulfuro reductasa cataliza el paso final en la figura 3 liberando las formas activas sulfhidrilo de los cofactores. La enzima se compone de dos subunidades (HdrDE). La ms pequea HdrE es un citocromo tipo b conteniendo hemes de bajo y alto spin. HdrE acepta electrones de metanofenacina, un componente de la cadena de transporte de electrone unido a la membrana. HdrE dona electrones a HdrD, que contiene dos centros Fe4-S4, uno de los cuales es el sitio activo propuesto junto con un disulfuro redox-activo de dos cistenas. De la otra mano, se ha propuesto a partir de experimentos cinticos con la heterodisulfuro reductasa de Methanosarcina thermophila que el heme de bajo potencial est involucrada en la reduccin de heterodisulfuro. En ambas vas, la reduccin del heterodisulfuro est unida a la formacin de un gradiente electroqumico de protones que lleva a la sntesis de ATP catalizada por una ATP sintetasa tipo A1A0. Existe la hiptesis de que un gradiente de protones es generado a travs de la membrana en un mecanismo en que los protones son translocalizados desde la metanofenacina al heterodisulfuro (Rasche and Ferry 2005).

Desarrollos en biometanacin
A pesar de la creciente importancia de la digestin anaerbica, se sabia poco sobre los datos cinticos de los microorganismos importantes. Con objeto de obtener un diseo fiable de los reactores de tratamiento y a fin de identificar factores limitantes, era esencial evaluar tales datos cinticos por medio de mediciones apropiadas. Tales experimentos deban ser llevados a cabo continuamente en un quimiostato a fin de establecer condiciones reproducibles. Se usaron cultivos puros, de modo que adems de las condiciones de reaccin, las "condiciones de catlisis" estn tambin bien definidas (Wandrey and Aivasidis 1983). Con el propsito anterior, la investigacin sobre la cintica de los metangenos de inters ha sido objeto de varias investigaciones. Un ejemplo es que se han elaborado modelos experimentales (Karadagli and Rittmann 2007) en batch que describen exactamente el consumo de H2, generacin de CH4, crecimiento de biomasa, umbrales de sustrato, y estado de sobrevivencia. Se observ que para Methanobacterium bryantii M.o.H la formacin de metano se detiene cuando la energa libre de Gibbs es igual a cero, aunque esto no interrumpe la oxidacin de H 2. El umbral termodinmico para la oxidacin de H2 ocurre cuando la energa libre para oxidar H2 y transferir electrones a la biomasa ya no es negativa, a -0,4 nM. Este umbral no es controlado por la ecuacin de energa libre de Gibbs para la metanognesis de H2 + HCO3, como se muestra en una investigacin de los mimos autores (Karadagli and Rittmann 2005). Ms all de este umbral, los microorganismos cambian a un metabolismo de bajo mantenimiento llamado "el estado de sobrevivencia" en respuesta a la extendida necesidad de H2, aadiendo la respuesta de necesidad como otra nueva caracterstica del modelo cintico presentado. Tambin por el modelo obtuvieron un lmite cintico (Smin), caracterstica natural de la cintica de Monod, a una concentracin de H2 cercana a -2400 nM. Smin es la concentracin mnima de sustrato para mantener la concentracin en estado estacionario de biomasa. Este tipo de estudios es til para interpretar resultados de umbrales y disear nuevos estudios para comprender los umbrales y sus implicancias ecolgicas. Investigaciones sobre la bioconversin de celulosa en metano (Miller, Currenti, and Wolin 2000) sugieren que manipulando las diferentes fases de la fermentacin de celulosa de forma separada, se pueden balancear efectivamente en la fermentacin general, el pH y requerimientos inicos de la fase de produccin de cido con la fase que usa el cido. La bsqueda de formas de mejorar el proceso de obtencin de metano por digestin se basa sobre todo en los bioprocesos metanognicos de las bacterias, y en las condiciones del mismo. Un estudio sobre Methanosarcina barkeri DSM 804 (Banik et al. 2006), revela que cuando se la expuso a la radiacin de microondas a frecuencias de 13,5 a 36,5 GHz, mostr un rpido crecimiento en comparacin con el cultivo bacterial no irradiado. La concentracin de metano en el biogas generado por el cultivo irradiado fue ms alta que la del cultivo no irradiado, que fue de 76,3% en el da 15 de la incubacin a frecuencia de microondas de 31,5 GHz, 10 dbm de poder cuando se irradi por 2 horas. El estudio microscpico del cultivo puro revel que las clulas de M. barkeri fueron mayores en nmero y sus dimetros celulares aumentaron en 20%. Las especies de Methanosarcina con una alta velocidad especfica de crecimiento (max) y alto coeficiente de saturacin medio (Ks), y especies de Methanosaeta con bajos max y Ks, son los nicos metangenos aceticlsticos. Debido al bajo Ks de Methanosaeta, las bajas concentraciones de acetato en la digestin anaerbica mesoflica convencional cede el paso a la dominancia de Methanosaeta. Sin embargo, Methanosarcina absorbe los incrementos de acetato ms eficientemente y por lo tanto promueve una digestin ms estable. Ya una investigacin (Conklin, Stensel, and Ferguson 2006) ensay la hiptesis que disminuyendo las frecuencias de alimentacin del digestor, se puede incrementar la predominancia de Methanosarcina. Para ello se establecieron dos reactores alimentados por acetato a un tiempo de retencin de slidos de 17 das. Un reactor fue alimentado cada hora, y otro fue alimentado una vez al da. Se utilizaron mtodos microscpicos y

moleculares para verificar el enriquecimiento del reactor alimentado cada hora con Methanosaeta, y el enriquecido cada da por Methanosarcina. Se midieron las cinticas del crecimiento y consumo de sustrato para cada reactor. Se simularon las condiciones de sobrecarga del digestor, y se encontr que el reactor enriquecido con Methanosarcina se desempe mejor que el enriquecido con Methanosaeta. stos hallazgos indican que se puede lograr la dominancia de Methanosarcina con alimentaciones infrecuentes, conduciendo a una digestin y metanognesis ms estable.

Inhibicin
En estudios donde se evalu la digestin de desechos agroindustriales, se ha corroborado el efecto inhibidor de algunos compuestos y elementos. El cobre tiene un efecto inhibidor sobre la actividad metanognica, e impide la digestin (Goberna et al. 2010) de desechos de olivo, dado el alto contenido que presenta de este elemento. Sin embargo, se ha aislado de un rea minera de cobre en Michigan un metangeno resistente al cobre (B.K. Kim et al. 1996) para el cual los MICs CuSO4 fueron ~2- a 36 veces mayores que para aquellos otros metangenos probados. El metangeno en forma de varilla usa H2-CO2 o formato, pero no acetato o metanol, como sustrato de crecimiento. El mantener la incubacin con medio H2-CO2 o formato, result en una superficie de crecimiento similar a una matriz, dependiente de la presencia de hidrgeno. La presencia de 1 mM de sal cprica result en clulas entrelazadas y de filamentos ms largos. La toma de huellas antignicas, anlisis del gen 16S rRNA, morfologa, y uso de sustrato sugieren que el nuevo aislado fue una nueva cepa de Methanobacterium bryantii que es capaz de usar el formato. Los antibiticos tambin tienen un efecto inhibidor sobre las metanobacterias. La kanamicina y bacitracina fueron severos inhibidores del crecimiento y metanognesis de Methanobacterium espanolae sp. nov., aislada de lodo de biodigestin de un planta de papel, mientras que 100M de cido bromoetanosulfnico causaron 30% de inhibicin (Patel, Sprott, and Fein 1990).

Methanobacterium
Como se ha sealado, en muchas revisiones se han indicado diferentes caractersticas de metanobacterias (Kotelnikova et al. 1993) y su clasificacin taxonmica. Las tablas 1 y 2 muestran algunas caractersticas de especies de Methanobacterium, tomadas de una de estas revisiones (Garcia 1990).

Tabla 1: Caractersticas morfolgicas y de crecimiento de Methanobacterium

T abla 2: Uso de sustratos y contenido de DNA de Methanobacterium

Algunas especies de Methanobacterium, como Methanobacterium bryantii M.o.H. tienen nicamente al H2 como su donador de electrones. Esta caracterstica (la utilizacin de un nico donador de electrones) fue aprovechada por un estudio (Karadagli and Rittmann 2005), ya que se evitan las complicaciones de las rutas metablicas alternas. Tal estudio, empleando un conjunto de experimentos en batch diseados para proveer los mejores estimados para cada parmetro, obtuvieron los valores de mxima velocidad especfica de crecimiento (max = 0,77/da), mxima velocidad de consumo de sustrato (qmax = 2,36 mol-H2/g clulas/da), rendimiento real (Y = 0,325 g clulas/mol H2), fraccin de donantes de electrones a la sntesis (fs = 0,03 eclulas/edonados), concentracin de sustrato para la media velocidad mxima (Ks = 18000 nM = 18 M H2), y la tasa endgena de descomposicin (b = 0,088/da). Estos parmetros indicaron que, cuando el H2 no es limitante, M. bryantii M.o.H es de crecimiento lento (baja max) comparado con otros metangenos oxidantes de H2 y reductores de sulfato, y esto principalmente debido a su bajo Y real, no a una baja qmax. Los relativamente altos valores Ks y b sugieren que M. bryantii tampoco puede ser un fuerte competidor cuando el H2 es limitante. La cintica clsica de Monod, con modificaciones, ha sido aplicada (Karadagli and Rittmann 2007) a datos experimentales de Methanobacterium bryantii M.o.H para describir el consumo de sustrato, teniendo en cuenta sus lmites y modo de supervivencia.

Methanococcus
Como se ha sealado, en muchas revisiones se han indicado diferentes caractersticas de metanobacterias y su clasificacin taxonmica. Las tablas 3 y 4 muestran algunas caractersticas de especies de Methanococcus, tomadas de una de estas revisiones (Garcia 1990).

Tabla 3: Caractersticas morfolgicas y de crecimiento de Methanococcus

Tabla 4: Uso de sustratos y contenido de DNA de Methanococcus

El reaislamiento, cultivo, y mtodo de preservacin de stas bacterias ha sido objeto de varios estudios. Varios han aislado bacterias del gnero Methanococcus en fuentes de agua (Acua Gonzlez et al. 2008). En uno de ellos (Jones and Stadtman 1977), se describen tales mtodos para Methanococcus vannielii, y tambin se seala que el crecimiento del organismo sobre el formato es marcadamente estimulado por concentraciones de los metales selenio y tungsteno. La mayora de los Methanococcus son H2 oxidantes. Se han estudiado varias de las especies de ste gnero, como por ejemplo Methanococcus voltae (Whitman and Ankwanda 1982) de quin se estudi su nutricin y metabolismo de carbono. sta bacteria tiene un tiempo de duplicacin de 1,2 h a su temperatura ptima de 38C en medios complejos. En medio definidos, el crecimiento ptimo se obtiene con 0,75 mM de isoleucina, 0,75 mM de leucina, 2,5 mM de acetato, 5 mM de NH4Cl, 84 mM de MgSO4, 0,4 M de NaCl, 1 mM de CaCl2, 10 M de Fe2O3, y 0,2 M de NiCl2. En adicin, el pantotenato, selenato de sodio, y el cobalto estimulan el crecimiento. El crecimiento ptimo se obtiene a pH entre 6,0 y 7,0 con H2 o formato como donante de electrones. Los cidos grasos voltiles 2-metilbutirato e isovalerato pueden sustituir a la isoleucina y leucina, respectivamente. El carbn celular se deriva del acetato (31%), isoleucina (22%), leucina (25%), y dixido de carbono (23%). Los aminocidos y cidos grasos son incorporados casi exclusivamente en la protena. Una comparacin realizada en el mismo estudio, entre la incorporacin de U-Caminocidos y 1-C-cidos grasos indica que los cidos grasos son degradados durante la incorporacin en protena celular. La distribucin del carbono de los aminocidos sugiere que la acetil coenzima A no es un intermediario principal en la degradacin de estos compuestos. En consecuencia, M. voltae puede convertir la isoleucina y leucina a otros aminocidos por un nico mecanismo. El carbn lipdico se deriva en gran parte del acetato. As, los lpidos isoprenoides son sintetizados de nuevo del acetato antes que degradados de la leucina. El carbono en los cidos nucleicos se deriva del dixido de carbono (45%), el C-1 del acetato (25%), el C-2 del acetato (22%), y de la isoleucina y leucina (7%). Este patrn de etiquetado es consistente con las rutas bioqumicas conocidas. Otro estudio (Koval and Jarrell 1987) sobre Methanococcus voltae investig sobre la ultraestructura y composicin qumica de la pared celular de dicha achaebacteria por tincin negativa y grabado-congelacin por microscopa electrnica y por electroforesis con gel de sodio docecil sulfato-poliacrilamida. M. voltae posee una nica capa de protena de estructura regular (RS) externa a la membrana plasmtica. Las preparaciones de grabado-congelacin de las clulas indicaron que las subunidades de protena son organizadas hexagonalmente con un espacio de centro-a-centro de aproximadamente 10 nm. Las protenas de RS extradas tuvieron un peso molecular de 76000. stas estuvieron presentes en sobres preparados por cizallamiento en una prensa francesa, lisis osmtica o sonicacin, como indica la electroforesis con gel de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida. No se requiri de NaCl para la unin de protena RS a la membrana plasmtica subyacente. Se pudo demostrar el arrego hexagonal por sombreado con platino y grabado-congelacin de los sobres, pero fall la tincin negativa en ausencia de NaCl para estabilizar la matriz. Las protenas RS pueden ser solubilizadas por urea, clorhidrato de guanidina, ditiotreitol, y muchos detergentes, incluyendo Nonidet P-40, Triton X-100, y Tween 20. Sin mebargo, la liberacin ms especfica de la protena de la pared celular de los sobres ocurre luego de un tratamiento trmico en buffer HEPES (cido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfnico) de 50 a 60C.

Methanosarcina

Methanosaeta El proceso y la automatizacin de la generacin de biogs


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