Cultivo de Embriones vegetrales

Cultivo in vitro de rboles frutales

Multiplicacin o reproduccin de frutal in vitro

Cultivo in vitro
El cultivo in vitro es un mtodo de propagacin de plantas de aplicacin profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estriles y con unas instalaciones especiales. Un dato para dar una idea comercial es que en Espaa haba en 1.990 28 laboratorios dedicados a la produccin de plantas por cultivo in vitro como negocio. El cultivo in vitro consiste en tomar un trocito de hoja, un embrin, una porcin pequeita de tallo (de 0,2 a 1 milmetro) o cualquier otra parte de una planta y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo sobre un medio acuoso nutritivo. Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estriles: utensilios, cmara de manipulacin, etc., todo est desinfectado en autoclave. El cultivo in vitro es muy caro, entre otras cosas porque no se puede mecanizar. Slo son rentables aquellos laboratorios muy grandes y con mucho mercado. La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatacin en el laboratorio; en el invernadero y despus una segunda aclimatacin en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros slo se encargan del primer paso.

Fase de aclimatacin en invernadero

Aplicaciones prcticas del cultivo in vitro: Propagacin vegetativa. Esto es lo ms prctico. Dos tcnicas: - Micropropagacin de estaquillas - Organognesis de callos Produccin de plantas libres de virus mediante dos tcnicas: - Cultivo de meristemos - Microinjerto in vitro Permite hacer germinar semillas que son muy difcil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orqudeas tienen en los campos unos parsitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parsitos o in vitro. Eliminar la inhibicin de germinacin de las semillas. El cultivo in vitro es lo ms eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrin. Prevencin del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de inters cientfico o intergenticos, sobre todo en plantas herbceas. Los cruces incompatibles dan abortos. Aplicacin en mejora gentica para obtener hbridos, para introducir material gentico, etc. Acortar los ciclos de mejora gentica. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del rbol para ver resultados. Produccin de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Ventajas:

- Obtencin rpida de homocigotos.

- Produccin de hbridos (frutos puros).

Equipo necesario para el cultivo in vitro

Autoclave Cmara de flujo laminar Medio de cultivo Planta Cmara de cultivo

- Autoclave

Es donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presin, pero de mayor tamao, donde se controla la presin y la temperatura (hasta 120). - Cmara de flujo laminar

Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitculo con un operario en un ambiente estril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire. - Medio de cultivo

Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapn. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado. - Planta

El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminacin, aunque se lave mucho y bien. Lo ms corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla menos infecciones. - Cmara de cultivo

La cmara de cultivo es una habitacin de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variacin da-noche, etc..

Condiciones del cultivo in vitro

En la cmara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema ms importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones. En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibiticos, cido giberlico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas. El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias. Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo. El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Se necesita agar y medio slido 0,6-0,9%. El medio de cultivo realmente slo tiene que llevar agua, fuente de energa (azcares) y reguladores de crecimiento. El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos aos en prepararlo. En la cmara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). Tambin existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas tambin varan. Lo normal son 22-26C, aunque en ocasiones se exigen fros de 4C y tambin 28-30C para plantas tropicales. Igualmente, en el xito de esta tcnica de propagacin tambin influyen determinadas caractersticas de la planta, como el tipo, gentica e incluso el tipo de implante, parte ms juvenil o ms adulta. En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la prdida de agua, lo que provocara un aumento de la concentracin de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ah la importancia del cierre.

Subcultivos o replicado

Cuando sembramos microestaquillas en cultivo in vitro, no nos interesa que se emitan races ni hojas, sino que se produzca una proliferacin (crecimiento) para obtener nuevas microestaquillas. Son lo que se denominan subcultivos. No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal; tan slo se hace 8-10 veces. Ocurre entonces lo siguiente: El medio nutritivo se agota y se seca. El material vegetal ocupa todo el tubo. Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias txicas). El medio se hace lquido.

Fases del cultivo de meristemos 1. Toma un pice meristemtico (0,2-1 mm). 2. Siembra en el medio del tubo. 3. Fase de proliferacin: crecimiento de brotes. Subcultivos. 4. Fase de enraizamiento (cambiar el medio). 5. Primera fase de aclimatacin. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plstico, bandejas de vidrio, etc.. 6. Segunda fase de aclimatacin. Siempre en invernadero. 7. Plantacin en el campo. Fases del cultivo de embriones Se utiliza mucho en manzano. 1. Se desinfecta el fruto en alcohol. Se flamea. 2. Se coge el embrin de la semilla. 3. Se inocula en el tubo. 4. A las 1-2 semanas, la planta est ms o menos reconocible. 5. Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatacin. Micropropagacin

Se parte de una yema, de brctea o axilar. Se empieza a desarrollar en el medio de cultivo. Entre la fase de proliferacin y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener ms plantas). El nmero de subcultivos depende del material vegetal. Ejemplo de micropropagacin de Kiwi: - Se parte de un trozo de tallo. - Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote. - En la fase de proliferacin intentamos obtener gran cantidad de brotes. - Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio. - Al aumentar la concentracin de auxinas se obtienen plantas enraizadas. - Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo. Cultivo de callo in vitro Se parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro. El medio puede ser slido o lquido. Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o tambin proembriones, que al unirse forman una estructura similar al embrin. A partir de entonces se desarrolla normalmente. Obtencin de plantas haploides Normalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriognesis u organognesis. Embriognesis: se forman clulas (poliembriones). Organognesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide).

No se riega nunca por aspersin (riesgo de patgenos), siempre con regadera. Problemas en el cultivo in vitro

* Contaminacin: es grave. * Vitrificacin: es una reaccin de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio. La nica solucin es hacer un subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estn bien.