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Mejoramiento gentico: Obtencin de planta haploides a travs del cultivo de granos de polen.

Daz, Juan Fernando; Gonzlez, Andrea. Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales in vitro, Ingeniera en Biotecnologa, Departamento de Ciencias de la Vida, Escuela Politcnica del Ejrcito. 18 de enero de 2012 Resumen: La obtencin de individuos haploides estriles mediante anteras es una de las tcnicas de cultivo de tejidos in vitro que est ganando auge, en especial cuando se trata de hacer fitomejoramiento. El objetivo de la prctica fue sembrar y cultivar anteras de las flores empleadas por nosotros, lirios (Lilium candidum), siguiendo la metodologa adecuadamente en cuanto a desinfeccin y sembrado del material se refiere. Tras el lavado y desinfeccin de las flores, las anteras se cultivaron completas en medio Murashige y Skoog enriquecido con 2.5mg/L de 2,4-D, 40g/L de azcar y 7.5g/L de agar, y pH ajustado a 5.7-5.8. Se control contaminacin durante la segunda y tercera semana luego de la siembra, durante la incubacin, consiguiendo un 0% de frascos contaminados. De los cuatro frascos sembrados, dos de ellos empezaron el proceso de necrosis del tejido de la antera, que cubre al polen, lo que antecede normalmente a la generacin de callo a partir de los granos polnicos. Adems se discuti de los posibles resultados obtenidos tras ms semanas de incubacin, y de los factores que afectan la andrognesis. Introduccin: Los organismos haploides han tenido una enorme importancia desde que se los descubri naturalmente en algunas especies vegetales, las cuales los producan espontneamente, pero con una frecuencia muy baja (7). Existen algunas formas de considerar a los organismos haploides, esto respecto a si provienen de otros seres diploides o poliploides. Independientemente de ello, para este caso se considerar como individuos haploides a aquellos que tengan una constitucin cromosmica igual a la mitad del nmero cromosmico normal de la especie, en clulas somticas (7). La demanda mundial actual no puede ser satisfecha con las tcnicas tradicionales de mejoramiento vegetal, es por ello que con los avances en biotecnologa y biologa molecular se ha implementado el desarrollo de los haploides y los doble haploides (7). Para originar este tipo de organismos, la ciencia se ha valido de la hibridacin interespecfica o intergenrica, y el cultivo de esporas masculinas y femeninas. Estas metodologas de fitomejoramiento han permitido fijar sistemas genticos de gametos individuales, fciles de evaluar en cualquier momento del mejoramiento; adems se puede conseguir lneas homocigticas sin usar la endogamia normal (6, 8). El obtener lneas puras (homocigotas) suele requerir de una cantidad importante de autofecundaciones, mientras que con el uso de los haploides y doble haploides se puede llegar a tener homocigotas en apenas una sola generacin, lo cual implica reducir costos de

produccin y tiempo utilizado. Por otra parte esta tecnologa tiene su aplicacin en estudios genmicos y citogenticos, construccin de mapas genticos y evaluacin de diversidad gentica (7, 10). El uso de anteras para generar organismos haploides, a partir del polen contenido en ellas, fue descubierto por Guha y Maheshwari en 1966, al cultivar anteras de Datura innoxia Mill. (7). Este proceso se llama andrognesis (8), y ha demostrado su utilidad en la familia de las solanceas, crucferas, gramneas y ranunculceas (7, 8, 10). Sin embargo, no se ha conseguido el mismo xito con especias arbustivas y arbreas (7). Se debe tener claro que las plantas originadas por esta tcnica de cultivo de tejidos, no se originan de la antera en s, sino del grano de polen, ya que es ste el que tiene la carga gentica haploide, mientras que la antera es tejido diploide (4, 7). El objetivo de esta prctica fue el de sembrar y cultivar anteras en medio MS enriquecido, para mediante los granos de polen, obtener plantas haploides estriles. Materiales y Mtodos: Material vegetal Se emple cuatro flores cerradas de Lirio (Lilium candidum) (1). Todas ellas estaban ya en un estado alto de maduracin, ya que el color de los tpalos era de un rosa junto a verde. Se seleccion esta especie ya que posee flores grandes, donde las anteras son igualmente grandes y facilita su manipulacin. Desinfeccin Se lav las flores con agua corriente durante algunos minutos. Posteriormente, se sumergieron los botones en 500ml de solucin de detergente al 3% ms tres gotas de Tween, y se mantuvo en agitacin por 10 minutos. Pasado el tiempo, se enjuag las flores con agua destilada un par de veces y una tercera con agua estril, para luego sumergir las muestras en una solucin de cloro al 4% ms tres gotas de Tween 20, durante 10 minutos en constante agitacin. Finalmente, dentro de la cmara de siembra, se realizaron 3 lavados con agua destilada estril. Siembra del material El procedimiento normal para la siembra del material vegetal, indica que se sobre un pedazo de papel autoclavado, se debe rociar las flores con alcohol al 90% y luego flamearlas sobre el mechero hasta que la llama se extinga por s sola1. Sin embargo, solo se flame las flores sobre el mechero, cuidando que no se cocine el tejido vegetal. A continuacin, se cort la flor longitudinalmente, sacudiendo las anteras para que los granos de polen ya desarrollados caigan al medio Murashige y Skoog (MS) enriquecido con 2.5mg/L de 2,4-D, 40g/L de azcar y 7.5g/L de agar (pH ajustado a 5.7-5.8). Tambin se cort las anteras y se las coloc en el medio ya descrito. Se flame la boca del frasco y se lo tap con papel plstico. Todo este procedimiento se efectu con los dos lirios. Los frascos se incubaron a oscuridad, y la contaminacin se evalu una semana ms tarde.
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Protocolo entregado por la Msc. Mnica Jadn.

Resultados y Discusin: Los resultados obtenidos hasta la fecha han sido satisfactorios, ya que ninguno de los cuatro medios sembrados se ha contaminado, indicando que los mtodos de desinfeccin utilizados (8) son eficaces, incluso a pesar de que no se asperj las flores con alcohol al 90% por ciento para luego flamearlas, el uso solo de fuego fue eficiente (Imagen 1).

Imagen 1. Anteras, una semana tras la siembra. El medio de cultivo junto a las anteras no presenta ningn tipo de contaminacin, una semana despus de la siembra.

Imagen 2. Proceso de necrosis. Las anteras muestran zonas oscuras, las que corresponden a la necrosis que ha dado inicio dos semanas despus de la siembra. Adems no hay contaminacin alguna.

Por otra parte, el proceso de necrosis en las anteras inici, en las dos semanas posteriores a la siembra del tejido, en dos de los cuatro frascos (Imagen 2). Esto se puede observar en el aspecto del material vegetal colocado sobre el medio MS, ya que los bordes de las anteras se han oscurecido y han forma irregular (3). Si se quiere ir ms all, segn Vlez et al. (2010), los mejores resultados al obtener callo se obtienen con anteras completas, sin que ellas hayan sufrido algn tipo de corte o incisin con el objetivo de generar una abertura por la cual los granos de polen tengan un contacto ms directo con el medio enriquecido. Esto ocurre porque el tejido diploide de las anteras (4) acta como amortiguador fisiolgico, almacenando granos de almidn, lo que a su vez le permite al grano de polen germinar (7). Los dos resultados posibles para el cultivo de anteras son: la formacin de callos u organognesis, donde se puede obtener tejido haploide (proveniente de granos de polen) o tejido diploide (proveniente del tejido propio de la antera); el segundo resultado es la embriognesis, donde se obtienen clulas conocidas como poliembriones (2, 4, 7). La formacin directa de embriones somticos en lugar de callos, ayuda a reducir la variacin somaclonal posible (10). Otro aspecto importante a tener en cuenta, es que el genotipo del material de origen (o de la planta madre), ya que la forma en que las anteras respondan al cultivo depender en gran parte de este factor. En especial porque se ha detectado que la formacin de callo y la regeneracin de las plntulas es heredable, lo que significara una ganancia en cuanto al fitomejoramiento (5, 8). Adems, el genotipo tambin afecta la habilidad del callo para regenerar vstagos y establecer la corona (5).

Relacionado al origen del material vegetal y el genotipo, est saber si el tejido proviene de una planta monocotilednea o dicotilednea. En este punto se puede ver algo que discutir, ya que segn Roca et al. (1991), se ha hecho ms andrognesis en plantas monocotiledneas como el arroz, la cebada y el maz (8), mientras que Polci et al. (Sin ao), afirma que hay ms facilidad de conseguir andrognesis en especies dicotiledneas (7). Esto debe ser un mbito de investigacin, para determinar porque en ciertas especies es ms fcil obtener organismos haploides, antes que en otras. Por otra parte, identificar correctamente la etapa ms sensible a la induccin andrognica en la microgametognesis ayudara a obtener mejores resultados en la obtencin de callos y regeneracin de plantas. Por ejemplo, en un estudio efectuado sobre tomate Solanum lycopersicon, se encontr que la mayor produccin de callos ocurre cuando el meiocito est entre metafase I y telofase II. La determinacin de esta etapa incluso influir en la consecucin de haploides o dobles haploides (9). Roca et al. (1991) menciona que las mejores respuestas se han conseguido cuando las anteras se cultivaron en un desarrollo del polen entre la microespora tarda y el polen temprano (8), sin embargo es posible que este factor cambie entre especies (7). El pretratamiento de las anteras puede ayudar a la andrognesis, cambiando la expresin de genes relacionados a la generacin del esporofito. Hasta ahora las bajas temperaturas se han considerado como el mejor tratamiento (7, 8), sin embargo existen muchos tratamientos ms, as se tiene: al calor, el choque osmtico, la centrifugacin de anteras, realizar incisiones en la parte superior de las anteras, aunque como se vio ms arriba no necesariamente funciona bien (10). Otros pretratamientos probados son: la poda, la pulverizacin con etrel, la irradiacin, la reduccin de la presin atmosfrica, la anaerobiosis, una atmsfera saturada de agua o la aplicacin de gametocidas (7). El usar bajas temperaturas estimula la embriognesis, la divisin mittica simtrica de las microesporas (7, 8). La composicin del medio de cultivo es de igual manera un aspecto a considerar para cada especie cultivada. As se ha visto que un medio solidificado con agar y carbn activado da una mejor respuesta que al solo emplear agar (7). El medio de cultivo tambin debe poseer carbohidratos que le servirn como nutrientes al tejido. Respecto a los reguladores de crecimiento, los ms usados son las citoquininas y las auxinas, como el 2,4-D usado para esta prctica. La presencia de estos reguladores exgenos es requerida principalmente por especies cereales de plantas (7), a pesar de ello, se ha reconocido que la respuesta del cultivo depende mucho ms de los niveles endgenos de los mismos reguladores (7, 10). Este factor es ms influyente en la generacin de embriones somticos, por ello, probar varios medios con distintas combinaciones de fitorreguladores y de sus concentraciones, ayudara a seleccionar los mejores tratamientos para obtener buenos resultados, y no solo eso, sino de igual forma conseguir callos o embriones segn se desee (10).

Finalmente, el fotoperiodo, la intensidad de luz, la temperatura y la nutricin e incluso la posicin de la antera sobre el medio, son factores que se controlan al momento de originar andrognesis, ya que pueden afectar los resultados alcanzados en algunas especies (7, 8, 10). En un caso particular, uno de los medios se volvi totalmente lquido, a pesar de ello las anteras de este frasco presentaban un aspecto parecido a las de los otros tres. Conclusiones: Los mtodos de esterilizacin y desinfeccin tanto del lugar de trabajo como del material vegetal fueron 100% efectivos, ya que no existi un solo frasco contaminado. La formacin de callo o de embrin depender de los factores externos o de estrs a los que est sometido un explante, de esta forma, la respuesta conseguida, en un tiempo determinado y con caractersticas especficas depender del ambiente y el medio de cultivo que se les d a las anteras. Seleccionar un buen genotipo, mediante eleccin de las caractersticas favorables para lo que busca el investigador, es muy importante. Aqu estar presente la influencia del pretratamiento dado al material de origen, ya que al inducir la expresin de genes que se observan durante la embriognesis, tambin se estar influenciando sobre la presencia y cantidad de fitorreguladores endgenos, lo que es ms importante que la presencia exgena de los mismos. El establecer en qu estado se hallan las anteras, o en qu etapa es ms conveniente utilizarlas es primordial, ya que se est descubriendo que este factor s cambia el tipo de respuesta obtenida en un callo o un embrin. El porqu la andrognesis no puede ser inducida en todas las especies monocotiledneas y dicotiledneas de inters, es un rea que necesita desarrollarse e investigarse, para ver qu factores, seguramente propios de cada especie, interfieren con este proceso in vitro. Bibliografa: 1. Foro creativo. 2009. Azucena, Lirio de San Antonio. http://www.forocreativo.com/viewtopic.php?f=55&t=6666 2. Infojardn. 2011. Cultivo in vitro de rboles frutales. Multiplicacin o reproduccin de frutal in vitro. http://articulos.infojardin.com/Frutales/cultivo-in-vitro-reproduccion.htm 3. Jauch, C. 1979. Necrosis. Patologa Vegetal. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. 4. Lentini, Z.; Roca, W.; Martnez, Z. 1997. Cultivo de anteras de arroz en el desarrollo de germoplasma. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. pp. 2-8 5. Muoz, S.; Espsito, M.; Cravero, V.; Garca, S.; Lpez, F.; Cointry, E. 2006. OBTENCIN DE PLANTAS A PARTIR DE ANTERAS DE ESPRRAGO (Asparagus officinalis L.). Revista de Investigaciones de la Facultad de Ciencias Agrarias. Nm. 9. 6. Polci, P.; Conti, V.; Aldao, G.; Miranda, R.; Echenique, V. 2005. Obtencin de Plantas haploides de Cultivares Argentinos de Trigo Pan (Triticum aestivum L.) por Cultivo de

Anteras y Cruzamientos con Maz. Revista de Investigaciones Agropecuarias. Vol. 34, Nm. 3, pp. 151-176 7. Polci, P.; Conti, V.; Miranda, R.; Gear, N. Sin ao. Obtencin de Plantas Doblehaploides. Mtodos para acelerar programas de mejoramiento e identificacin varietal. Biotecnologa y mejoramiento vegetal. pp. 19-36,295-350 8. Roca, W.; Mroginski, L. 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. pp. 272-290 9. Segu, J.; Nuez, F. Sin ao. Obtencin de plantas doble haploides andrognicas mediante cultivo in vitro de anteras de tomate. Instituto de Conservacin y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV). Universidad Politcnica de Valencia. 10. Vlez, M.; Robledo, A.; Corona, T.; Heber, V.; Ramrez, P.; Surez, J. 2010. OBTENCIN DE PLANTAS HAPLOIDES EN CHILE MIAHUATECO (Capsicum annuum L.). Revista Mexicana de Ciencias Agrcolas Vol.1, Nm.2, pp. 189-201