Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de

aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más bajas.0 microgramo). osteomielitis. establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno. son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias. ensaladas. La especie aureus. cabello y piel del 50% o más de los individuos. tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina. sabor y olor. C. En los humanos. de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana. pies de crema. son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto.conservación inapropiadas. que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7. . Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias. sin embargo Jablonski et al. rellenos para sándwiches y papas. sin causar daño aparente (portadores asintomáticos). es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis. para causar intoxicación. comentan que el FDA. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A. productos de pastelería.2° C y por debajo de 60° C) después de su preparación. que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas. D y E. como pasteles rellenos con crema. este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva. B. por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo. leche y sus derivados. que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo.01 microgramo. siendo la “A” la más nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1. provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento. en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas. del orden de 0. suficientes para provocar una intoxicación en el hombre. es de 106 UFC/g de alimento. se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida. no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia. son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica. meningitis. las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo. coberturas de chocolate. También es importante observar.

En casos más severos. calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. 2. se puede presentar dolor de cabeza. pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda. en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus. consiste en los siguientes pasos: 1. es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva . Identificación bioquímica. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus. mediante el uso de plasma. este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días. Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. Demostrar la contaminación postproceso. la cantidad consumida del alimento contaminado. utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. se utiliza un medio selectivo sólido. Recuperación de la cepa. existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. dolor o espasmos abdominales y postración. vómito. la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas. sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. Sin embargo.El establecimiento de los síntomas de la intoxicación. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos. Aislamiento selectivo. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo. 3.

33 mL por caja.0 mL de la primer dilución del alimento.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0. la Norma establece un límite máximo de 106 UFC/g de alimento para que éste pueda ser consumido. (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d. El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma importancia. 1 caja de Petri con 20. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3. Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada. solamente si se coloca 1.1 M de pH 7. NOTA La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20. no sólo desde el punto de vista económico.2 a.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b.La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en superficie.0 mL de agua peptonada al 0. BIOLÓGICOS Plasma de conejo c.0 mL cada uno de caldo manitol c.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3. REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para Tinción de Gram b Parafina o aceite mineral estérilc. distribuido en tres placas de agar Baird Parker.0 mL de agua peptonada al 0. (opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90. . en caso de no contar con la orto toluidina d.1 M de pH 7. (sólo si se siembra en caldo manitol) Colorante azul de orto-toluidina 0. HCl 1N. la sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa.0 mL de agar Baird Parker a. sino en el de salud pública. utilizando el método de extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10 UFC/mL para alimentos líquidos. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agar DNA c.1M. esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0. SOLUCIONES. es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar más de 100 células de Staphylococcus aureus/g ó 10 células de Staphylococcus aureus/ mL de alimento.2 a.

a Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a. d Varillas de vidrio de 3. (en caso que la muestra sea líquida. Propipeta. Balanza granataria a. Asa bacteriológicab.MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a. Motor para licuadora o Stomacher a. c Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica. (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) Pipetas Pasteur estériles a. Horno para esterilizar material de vidrio. d Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica. . b. b. c. Microscopio óptico b. dobladas en ángulo recto (forma de “L”). espátulas y separador de huevo. a Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos. tijeras. d. Portaobjetosb. de largo. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón . estériles (se debe utilizar una por dilución). a. cucharas. c. a. Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica. pinzas. c. Autoclave Baño de agua a ebulliciónd Incubadora a 35 ± 2°Cd NOTAS a b Material necesario al inicio de la práctica.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm.

0 mL 1.48 h a 37°C Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estéril Contar aquellas colonias negras con hidrólisis de lecitina Coagulasa Incubar 24 h 37°C Fermentación del manitol Plasma más desarrollo en BHI DNAsa termoestable Realizar pruebas bioquímicas a cada tubo Siembra de colonias típicas en tubos con caldo BHI.DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS Homogenizar con 90. Consultar Cuadro 1 .0 mL de solución diluyente 1.1 mL de cada dilución en cajas petri con agar Baird Parker.1 mL 10-1 10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4 10-5 Depositar por duplicado 0. Incubar 24 .0 mL 1.0 mL Pesar 10.0 mL de diluyente Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 g de muestra en condiciones de asepsia 0.

4. brillantes. 1. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas. entre 5 y 10 minutos aproximadamente. observar las colonias características de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S. lisas con diámetro de 1 a 2 mm. seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra más diluidas. 4. aureus. 9. convexas. determinar el número de colonias a evaluar. 2.0 mL del mismo diluyente. 5. durante 45 a 48 h.0 g de muestra en una caja de Petri estéril. 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker. iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie). Transferir 0. 8. en forma de “L”. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mínima.1% o solución amortiguadora de fosfatos 0. utilizando asa bacteriológica recta estéril. . Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9. 2.1 mL de las diluciones 10-1. Pesar 10. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril. 6. 1. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. que son características de este microorganismo. en caldo infusión cerebro corazón. tomando en cuenta el número de colonias típicas de S.PROCEDIMIENTO 1. también pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor estimado”. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. Con ayuda del cuadro 1. 2. circulares. Éstas se presentan como: colonias negras. Adicionar 90. 3. 10. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas.2. 7. Recuperación de la cepa. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. Después de incubar. 5. Aislamiento selectivo. Incubar a 35 1 C durante 24 h. dentro de estas últimas están comprendidas la coagulasa y la termonucleasa. muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas. 3.1M de pH 7. no obstante que contengan más de 150 colonias. 10-2.0 mL de agua peptonada estéril al 0. si no es posible.

adicionar 0. 1.2 mL de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón. haciendo las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa.5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm. de acuerdo con los valores del cuadro 2. Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar en una caja representativa bioquímicamente Menos de 50 UFC 3 51-100 UFC 5 101-150 UFC 7 3. se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos. CUADRO 2. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o superior a 2 cruces. Con una pipeta estéril de 1 mL. Inocular e incubar en la misma forma. Incubar en baño María o en incubadora. aureus. 3. 1. CUADRO 1. en caso de no presentarse formación de coágulo. 2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado 3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado . NOTA Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta. entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%. Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo. como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioquímicas. 3. Formación de coágulos pequeños 1+ (positiva) desorganizados. aureus ATCC 6538 y S.6. 2. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo.2 mL de plasma de conejo. epidermidis ATCC 12228.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. en intervalos de 1 hora. Número de colonias a evaluar de S. tomar 0. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa VALOR CARACTERÍSTICA negativa No se observa formación de coágulo. prolongar el período de observación hasta por 24 h. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril. tomar 0. cepas tipo de S. Pruebas bioquímicas.

generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina. Incubar a 35C 2 C por 24 h. como negativos (S.3 y 0. De encontrarse esta enzima. se observa un halo transparente alrededor de la colonia. no lo exige la norma). del punto anterior. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina).2 Prueba de la enzima termonucleasa. 4.5 mL de parafina o aceite mineral estéril. En el caso de no contar con orto toluidina. 3. de la suspensión del microorganismo que desarrollado en el medio infusión cerebro corazón. por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó. .3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional. 1.4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado. con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. Calentar 0. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio. adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0. NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial. 1. 3. 3. indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa. 5. 2. se puede utilizar HCl 1. epidermidis ATCC 12228). Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana. quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima catalasa. cuando ambas pruebas son positivas. 6. en caso de encontrarse dicha enzima. durante 4 a 24 h. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado. 3. 2. aureus ATCC 6538). y observar los resultados. Después de incubar. seguido de un precipitado blanco. en donde se inoculó. Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el fondo del mismo. entre 0. Inocular 2 asadas en caldo manitol. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda. Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S.0N como indicador.1M a los orificios hechos en el agar DNA.

esto es que sí contiene la enzima catalasa.4 Prueba de la catalasa (opcional. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%.001g/mL). 1. se considera positiva la prueba. Con una asa bacteriológica. Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0. 3. auresus toxigénico. 2. brillantes con halo y precipitado blanco). aureus toxigénico. y colocarlo sobre un portaobjetos. aureus enterotoxigénico presentes en 1. el medio debe virar a color amarillo por la producción de acidez. se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. mezclar perfectamente bien y observar los resultados.1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0. Tomando en cuenta el cuadro número uno. el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S. 3. solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa. Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas. contenía 70 UFC sospechosas de S. tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón después de su incubación. se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente. Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas. ¿a qué porcentaje corresponden?.4. como en este método se inoculan 0. si se presenta desarrollo y vira el indicador. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima. De estas 5 colonias analizadas. no lo exige la norma). expresado en forma aritmética es: 5 UFC 2 UFC X= 40% El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0.1 mL de dilución 10-3: 100% X . se encuentran en este alimento? y ¿se puede consumir el alimento?. Considerar la prueba como positiva. aureus (negras. dos colonias positivas. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para determinar el número de S. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol.0001g) para este caso. Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S. Si se presenta formación de burbujas.

. se debe reportar la sensibilidad del método. aureus toxigénico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación alimentaria. en este caso será de 100 UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas. solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este alimento? 700.0001 g (10 -4g) 1g X= 700. Para elaborar un informe de resultados. Si se está en el valor estimado. están dentro del rango estadístico (de 15 a 150 UFC/caja). NOTA No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que solamente números de unidades formadoras de colonias de S. sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski. el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones. esto es que no existen colonias típicas. De las 700. 2001) presentan riesgo para la salud pública. de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana. para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado.000 UFC/g de alimento.70 UFC X 0. la forma correcta de expresar el resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g Estas 280. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma específica. pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. se reporta como en el ejemplo antes descrito. por lo que no se debe consumir. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado.000 UFC/g 100% 40% Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10.000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g).000 UFC/g X X=280.000 UFC/g de alimento. se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan: Cuando las UFC encontradas en una caja Petri.

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