Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de

comentan que el FDA. que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos. es de 106 UFC/g de alimento. en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento. establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno. son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. meningitis. provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento. leche y sus derivados.0 microgramo). neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias. las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo. este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva. para causar intoxicación. La especie aureus.01 microgramo. suficientes para provocar una intoxicación en el hombre. cabello y piel del 50% o más de los individuos. pies de crema. C. tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina. En los humanos. siendo la “A” la más nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas. osteomielitis. se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida. rellenos para sándwiches y papas. B. coberturas de chocolate. del orden de 0. pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia. por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A. es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7. También es importante observar. que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo. como pasteles rellenos con crema. son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias. por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo. sin embargo Jablonski et al.conservación inapropiadas. productos de pastelería. aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más bajas. sin causar daño aparente (portadores asintomáticos). que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre.2° C y por debajo de 60° C) después de su preparación. D y E. ensaladas. . son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica. sabor y olor. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas.

Identificación bioquímica. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días. utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva . Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus. consiste en los siguientes pasos: 1. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea. es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas. vómito. 3. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas. aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina. calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico.El establecimiento de los síntomas de la intoxicación. mediante el uso de plasma. existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo. 2. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos. sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. se utiliza un medio selectivo sólido. Demostrar la contaminación postproceso. Sin embargo. Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. Recuperación de la cepa. la cantidad consumida del alimento contaminado. se puede presentar dolor de cabeza. este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus. Aislamiento selectivo. dolor o espasmos abdominales y postración. En casos más severos. el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus. por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda.

la Norma establece un límite máximo de 106 UFC/g de alimento para que éste pueda ser consumido. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.2 a. 1 caja de Petri con 20. (opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL de la primer dilución del alimento. HCl 1N. NOTA La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL. no sólo desde el punto de vista económico. esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0. solamente si se coloca 1. es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar más de 100 células de Staphylococcus aureus/g ó 10 células de Staphylococcus aureus/ mL de alimento. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20.1M.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en superficie. SOLUCIONES.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.33 mL por caja.0 mL de agua peptonada al 0. en caso de no contar con la orto toluidina d. (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b.0 mL de agar Baird Parker a. Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada.0 mL cada uno de caldo manitol c. .1 M de pH 7. distribuido en tres placas de agar Baird Parker.0 mL de agua peptonada al 0.1 M de pH 7. (sólo si se siembra en caldo manitol) Colorante azul de orto-toluidina 0. REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para Tinción de Gram b Parafina o aceite mineral estérilc. sino en el de salud pública. BIOLÓGICOS Plasma de conejo c. la sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa. El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma importancia.2 a.0 mL de agar DNA c. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9. utilizando el método de extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10 UFC/mL para alimentos líquidos. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.

Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica. a. . d Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica. a Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón . Horno para esterilizar material de vidrio. Autoclave Baño de agua a ebulliciónd Incubadora a 35 ± 2°Cd NOTAS a b Material necesario al inicio de la práctica. (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) Pipetas Pasteur estériles a. pinzas. a. b. Portaobjetosb. espátulas y separador de huevo. Microscopio óptico b. cucharas. d Varillas de vidrio de 3. Motor para licuadora o Stomacher a. (en caso que la muestra sea líquida. c. tijeras. c Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica. b. Propipeta. dobladas en ángulo recto (forma de “L”). c. de largo. d. Asa bacteriológicab.MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a. Balanza granataria a. estériles (se debe utilizar una por dilución).5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. c. a Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos.

Incubar 24 . Consultar Cuadro 1 .0 mL 1.0 mL Pesar 10.0 mL de diluyente Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS Homogenizar con 90.48 h a 37°C Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estéril Contar aquellas colonias negras con hidrólisis de lecitina Coagulasa Incubar 24 h 37°C Fermentación del manitol Plasma más desarrollo en BHI DNAsa termoestable Realizar pruebas bioquímicas a cada tubo Siembra de colonias típicas en tubos con caldo BHI.0 g de muestra en condiciones de asepsia 0.0 mL 1.1 mL 10-1 10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4 10-5 Depositar por duplicado 0.0 mL de solución diluyente 1.1 mL de cada dilución en cajas petri con agar Baird Parker.

seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra más diluidas. 7. utilizando asa bacteriológica recta estéril.0 mL de agua peptonada estéril al 0. Transferir 0.1% o solución amortiguadora de fosfatos 0. Aislamiento selectivo. 5. determinar el número de colonias a evaluar. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas.1 mL de las diluciones 10-1. lisas con diámetro de 1 a 2 mm. 2. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mínima. 2. entre 5 y 10 minutos aproximadamente. Después de incubar.2. dentro de estas últimas están comprendidas la coagulasa y la termonucleasa. 9. Éstas se presentan como: colonias negras. que son características de este microorganismo. 6. 10. en forma de “L”. Recuperación de la cepa. circulares. observar las colonias características de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). brillantes. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. Adicionar 90.PROCEDIMIENTO 1. 4. 8. si no es posible. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas. 1. no obstante que contengan más de 150 colonias. durante 45 a 48 h. 2. también pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor estimado”.0 mL del mismo diluyente. 3. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S. en caldo infusión cerebro corazón. convexas. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas.0 g de muestra en una caja de Petri estéril. 4. muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. 5. 1. Pesar 10. . iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie). aureus. Con ayuda del cuadro 1. 3. Incubar a 35 1 C durante 24 h. tomando en cuenta el número de colonias típicas de S.1M de pH 7. 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker. 10-2.

adicionar 0. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril. 3.2 mL de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón.6. aureus ATCC 6538 y S. 1.2 mL de plasma de conejo. Con una pipeta estéril de 1 mL. 2. Incubar en baño María o en incubadora. Inocular e incubar en la misma forma. Formación de coágulos pequeños 1+ (positiva) desorganizados. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o superior a 2 cruces. aureus. 2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado 3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado . Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo. se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos. en caso de no presentarse formación de coágulo.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. CUADRO 1. haciendo las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa. como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioquímicas. prolongar el período de observación hasta por 24 h. Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar en una caja representativa bioquímicamente Menos de 50 UFC 3 51-100 UFC 5 101-150 UFC 7 3. tomar 0. tomar 0. 3. entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa VALOR CARACTERÍSTICA negativa No se observa formación de coágulo. en intervalos de 1 hora. posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%. Pruebas bioquímicas. Número de colonias a evaluar de S. de acuerdo con los valores del cuadro 2. NOTA Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta. 1. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo. CUADRO 2.5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm. epidermidis ATCC 12228. cepas tipo de S.

3. aureus ATCC 6538). Calentar 0. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo.0N como indicador. como negativos (S. seguido de un precipitado blanco. 4. 2. indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa. con ayuda de una pipeta Pasteur estéril.3 y 0.5 mL de parafina o aceite mineral estéril.4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado. 1. epidermidis ATCC 12228). Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S. Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el fondo del mismo. 6. se puede utilizar HCl 1. . entre 0.2 Prueba de la enzima termonucleasa.1M a los orificios hechos en el agar DNA. Después de incubar. de la suspensión del microorganismo que desarrollado en el medio infusión cerebro corazón. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana. 3. por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó. quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima catalasa. 1. 3. adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0. 2. Inocular 2 asadas en caldo manitol. en caso de encontrarse dicha enzima. del punto anterior. De encontrarse esta enzima. no lo exige la norma). en donde se inoculó. cuando ambas pruebas son positivas. y observar los resultados. NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial. 3. se observa un halo transparente alrededor de la colonia. generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina). durante 4 a 24 h. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado. Incubar a 35C 2 C por 24 h. Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa. En el caso de no contar con orto toluidina. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional. 5.

1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0.001g/mL). aureus toxigénico. Considerar la prueba como positiva. aureus (negras.0001g) para este caso. y colocarlo sobre un portaobjetos. se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente. 1. contenía 70 UFC sospechosas de S. dos colonias positivas. Con una asa bacteriológica. esto es que sí contiene la enzima catalasa. aureus enterotoxigénico presentes en 1. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para determinar el número de S. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%.1 mL de dilución 10-3: 100% X . se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. expresado en forma aritmética es: 5 UFC 2 UFC X= 40% El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0. no lo exige la norma). Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol. Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas. Si se presenta formación de burbujas. el medio debe virar a color amarillo por la producción de acidez. Tomando en cuenta el cuadro número uno. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima. brillantes con halo y precipitado blanco). 3. 2. tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón después de su incubación. Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0. De estas 5 colonias analizadas. se encuentran en este alimento? y ¿se puede consumir el alimento?.4 Prueba de la catalasa (opcional. el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S. se considera positiva la prueba.4. Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología. solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa. como en este método se inoculan 0. si se presenta desarrollo y vira el indicador. 3. ¿a qué porcentaje corresponden?. auresus toxigénico. mezclar perfectamente bien y observar los resultados. Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas.

NOTA No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que solamente números de unidades formadoras de colonias de S. De las 700. de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana.000 UFC/g 100% 40% Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10. pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. aureus toxigénico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación alimentaria.000 UFC/g de alimento. esto es que no existen colonias típicas.70 UFC X 0. el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones. 2001) presentan riesgo para la salud pública. para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado. la forma correcta de expresar el resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g Estas 280.000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g).0001 g (10 -4g) 1g X= 700. están dentro del rango estadístico (de 15 a 150 UFC/caja). Para elaborar un informe de resultados.000 UFC/g de alimento. solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este alimento? 700. se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan: Cuando las UFC encontradas en una caja Petri. Si se está en el valor estimado. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma específica. se reporta como en el ejemplo antes descrito. por lo que no se debe consumir. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado. . en este caso será de 100 UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas. se debe reportar la sensibilidad del método. sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski.000 UFC/g X X=280.

Washington. (2001) “Staphylococcus aureus. se informará: < 10 UFC/mL en muestras líquidas de la dilución 1:10 < 100 UFC/g para muestras sólidas de la dilución 1:10 BIBLIOGRAFÍA. 9th ed.fda.Cuando todas las pruebas bioquímicas son negativas. (Eds. ASM. and Staphylococcal Enterotoxins”.htmL . VA: AOAC. Jablonskin L.P. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. Arlington.gov/~ebam/bam-1. “Staphylococcus aureus” In:Doyle M. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. L:R. Lancette G. Downs F. Beuchat. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. & Montville T:J. 387-403. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. http://www. USA: 411-434.cfsan. Bienes y servicios. NOM-115-SSA1-1994. (Eds.M. International Commission on Microbiological. & Bennett W. 2nd ed. 4th ed. & Bohach G:A.) Food Microbiology Fundamentals & Frontiers. & Ito K.) APHA. 2001.A.

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