P. 1
Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus

|Views: 66|Likes:
Publicado porLinlin297
Microbiologia de los alimentos
Staphylococcus aureus en alimentos, prueba de la coagulasa
recuperacion de cepas
pruebas bioquimicas
Microbiologia de los alimentos
Staphylococcus aureus en alimentos, prueba de la coagulasa
recuperacion de cepas
pruebas bioquimicas

More info:

Published by: Linlin297 on Jun 11, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

11/04/2013

pdf

text

original

Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de

Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas. productos de pastelería. provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento.0 microgramo). son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. D y E. que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo. aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más bajas. que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. es de 106 UFC/g de alimento. es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis. sabor y olor. siendo la “A” la más nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1. pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto.01 microgramo. . son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias. suficientes para provocar una intoxicación en el hombre. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas. La especie aureus. neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. También es importante observar. este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7. sin causar daño aparente (portadores asintomáticos). se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida. como pasteles rellenos con crema. pies de crema. cabello y piel del 50% o más de los individuos. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A. que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos. C.2° C y por debajo de 60° C) después de su preparación. coberturas de chocolate. para causar intoxicación. en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento. tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina. del orden de 0.conservación inapropiadas. sin embargo Jablonski et al. comentan que el FDA. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias. meningitis. ensaladas. es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno. son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica. las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo. osteomielitis. leche y sus derivados. no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia. B. por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo. En los humanos. de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana. rellenos para sándwiches y papas.

consiste en los siguientes pasos: 1.El establecimiento de los síntomas de la intoxicación. calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. la cantidad consumida del alimento contaminado. 2. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días. sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. Recuperación de la cepa. utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas. Aislamiento selectivo. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas. Identificación bioquímica. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo. mediante el uso de plasma. dolor o espasmos abdominales y postración. en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. se utiliza un medio selectivo sólido. aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina. vómito. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus. En casos más severos. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva . por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda. este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus. el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. se puede presentar dolor de cabeza. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos. la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. 3. Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. Sin embargo. Demostrar la contaminación postproceso.

(opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.1 M de pH 7. 1 caja de Petri con 20.33 mL por caja. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.1M. Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada. en caso de no contar con la orto toluidina d. distribuido en tres placas de agar Baird Parker.2 a. NOTA La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL. sino en el de salud pública.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0. SOLUCIONES.0 mL cada uno de caldo manitol c.2 a.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b. El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma importancia. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3. (sólo si se siembra en caldo manitol) Colorante azul de orto-toluidina 0. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agar Baird Parker a.La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en superficie. REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para Tinción de Gram b Parafina o aceite mineral estérilc.0 mL de la primer dilución del alimento. solamente si se coloca 1.0 mL de agar DNA c. la Norma establece un límite máximo de 106 UFC/g de alimento para que éste pueda ser consumido.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0. HCl 1N. BIOLÓGICOS Plasma de conejo c. .0 mL de agua peptonada al 0. (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d. la sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa. no sólo desde el punto de vista económico.0 mL de agua peptonada al 0. esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20.1 M de pH 7. es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar más de 100 células de Staphylococcus aureus/g ó 10 células de Staphylococcus aureus/ mL de alimento. utilizando el método de extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10 UFC/mL para alimentos líquidos.

b. Autoclave Baño de agua a ebulliciónd Incubadora a 35 ± 2°Cd NOTAS a b Material necesario al inicio de la práctica. Propipeta. (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) Pipetas Pasteur estériles a. Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica. c.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. dobladas en ángulo recto (forma de “L”). de largo. c Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica. pinzas. . Microscopio óptico b. Motor para licuadora o Stomacher a. Portaobjetosb. a. estériles (se debe utilizar una por dilución).MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón . Balanza granataria a. Asa bacteriológicab. c. espátulas y separador de huevo. a Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos. a. d Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica. cucharas. (en caso que la muestra sea líquida. a Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a. d Varillas de vidrio de 3. b. c. tijeras. d. Horno para esterilizar material de vidrio.

Incubar 24 .1 mL de cada dilución en cajas petri con agar Baird Parker.48 h a 37°C Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estéril Contar aquellas colonias negras con hidrólisis de lecitina Coagulasa Incubar 24 h 37°C Fermentación del manitol Plasma más desarrollo en BHI DNAsa termoestable Realizar pruebas bioquímicas a cada tubo Siembra de colonias típicas en tubos con caldo BHI.0 mL 1.0 mL 1.0 mL de solución diluyente 1.0 g de muestra en condiciones de asepsia 0.1 mL 10-1 10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4 10-5 Depositar por duplicado 0.DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS Homogenizar con 90.0 mL de diluyente Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL Pesar 10. Consultar Cuadro 1 .

PROCEDIMIENTO 1. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril. 8. Después de incubar. 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker. determinar el número de colonias a evaluar. 2. 1. en caldo infusión cerebro corazón. durante 45 a 48 h. lisas con diámetro de 1 a 2 mm. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S. muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia.0 mL de agua peptonada estéril al 0. Aislamiento selectivo. en forma de “L”. 3. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. utilizando asa bacteriológica recta estéril. 9. no obstante que contengan más de 150 colonias. Incubar a 35 1 C durante 24 h. entre 5 y 10 minutos aproximadamente. que son características de este microorganismo. circulares.1% o solución amortiguadora de fosfatos 0. 4. aureus. 5. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. 7. Éstas se presentan como: colonias negras. 4.2. 6. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9. también pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor estimado”. brillantes. 2. Adicionar 90. Recuperación de la cepa. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas.1M de pH 7. si no es posible. iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie). convexas. observar las colonias características de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). 5.1 mL de las diluciones 10-1. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mínima. 3. Transferir 0. tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. 2. Con ayuda del cuadro 1. 10.0 g de muestra en una caja de Petri estéril. seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra más diluidas. 10-2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas. Pesar 10.0 mL del mismo diluyente. . 1. dentro de estas últimas están comprendidas la coagulasa y la termonucleasa.

NOTA Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. CUADRO 2. entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. 3. posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%.2 mL de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón. como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioquímicas. aureus ATCC 6538 y S. se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos. Pruebas bioquímicas. en intervalos de 1 hora.5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm. aureus. epidermidis ATCC 12228. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril. 3. adicionar 0. Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar en una caja representativa bioquímicamente Menos de 50 UFC 3 51-100 UFC 5 101-150 UFC 7 3. 2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado 3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado .6. 2. Con una pipeta estéril de 1 mL. CUADRO 1. 1.2 mL de plasma de conejo. tomar 0. Incubar en baño María o en incubadora. en caso de no presentarse formación de coágulo. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o superior a 2 cruces. prolongar el período de observación hasta por 24 h. tomar 0. cepas tipo de S. 1. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa VALOR CARACTERÍSTICA negativa No se observa formación de coágulo. Formación de coágulos pequeños 1+ (positiva) desorganizados. de acuerdo con los valores del cuadro 2. Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo. Número de colonias a evaluar de S. haciendo las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa. Inocular e incubar en la misma forma.

NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial. adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.0N como indicador.2 Prueba de la enzima termonucleasa. 1. cuando ambas pruebas son positivas. Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el fondo del mismo. Calentar 0. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado. Incubar a 35C 2 C por 24 h. indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa. Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S.1M a los orificios hechos en el agar DNA. con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. se puede utilizar HCl 1. Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa. como negativos (S. del punto anterior. Después de incubar. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana.3 y 0.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo. se observa un halo transparente alrededor de la colonia. en donde se inoculó. 5.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina). seguido de un precipitado blanco. Inocular 2 asadas en caldo manitol. y observar los resultados. 3. De encontrarse esta enzima. 3. de la suspensión del microorganismo que desarrollado en el medio infusión cerebro corazón. 3. entre 0. . 6. aureus ATCC 6538). no lo exige la norma). En el caso de no contar con orto toluidina. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda. en caso de encontrarse dicha enzima. durante 4 a 24 h. quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima catalasa. 1. por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó. 3. 2. generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina. 2. epidermidis ATCC 12228).5 mL de parafina o aceite mineral estéril. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio. 4.4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado.

1. el medio debe virar a color amarillo por la producción de acidez. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. si se presenta desarrollo y vira el indicador.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas. brillantes con halo y precipitado blanco). se considera positiva la prueba. mezclar perfectamente bien y observar los resultados. expresado en forma aritmética es: 5 UFC 2 UFC X= 40% El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0. se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología. 3. Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S. tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón después de su incubación. esto es que sí contiene la enzima catalasa.001g/mL). contenía 70 UFC sospechosas de S.1 mL de dilución 10-3: 100% X . Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas. el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S. Si se presenta formación de burbujas. dos colonias positivas. De estas 5 colonias analizadas. Tomando en cuenta el cuadro número uno. aureus enterotoxigénico presentes en 1. 2. y colocarlo sobre un portaobjetos. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para determinar el número de S. no lo exige la norma). auresus toxigénico. Considerar la prueba como positiva. se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente.4 Prueba de la catalasa (opcional. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima. aureus (negras. aureus toxigénico. Con una asa bacteriológica. 3. se encuentran en este alimento? y ¿se puede consumir el alimento?. Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0.1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0. ¿a qué porcentaje corresponden?. como en este método se inoculan 0.0001g) para este caso.4. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol. solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa.

están dentro del rango estadístico (de 15 a 150 UFC/caja). la forma correcta de expresar el resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g Estas 280. De las 700. de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana. por lo que no se debe consumir.000 UFC/g X X=280.000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g).70 UFC X 0. para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado.000 UFC/g de alimento. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado. se reporta como en el ejemplo antes descrito. Para elaborar un informe de resultados. en este caso será de 100 UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas. pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski. . aureus toxigénico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación alimentaria. esto es que no existen colonias típicas. se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan: Cuando las UFC encontradas en una caja Petri. solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este alimento? 700. NOTA No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que solamente números de unidades formadoras de colonias de S. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma específica.000 UFC/g 100% 40% Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10. se debe reportar la sensibilidad del método. Si se está en el valor estimado.0001 g (10 -4g) 1g X= 700.000 UFC/g de alimento. el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones. 2001) presentan riesgo para la salud pública.

(2001) “Staphylococcus aureus. and Staphylococcal Enterotoxins”.A. Washington. Lancette G. ASM.gov/~ebam/bam-1. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. & Bohach G:A. “Staphylococcus aureus” In:Doyle M.) Food Microbiology Fundamentals & Frontiers. (Eds. Beuchat.) APHA. Arlington. (Eds. & Bennett W.Cuando todas las pruebas bioquímicas son negativas. & Montville T:J. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 4th ed. Downs F.htmL . Jablonskin L. VA: AOAC. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. NOM-115-SSA1-1994. 387-403. http://www. USA: 411-434.cfsan. 2001.P. Bienes y servicios. 2nd ed. & Ito K. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. International Commission on Microbiological. 9th ed. L:R.M. se informará: < 10 UFC/mL en muestras líquidas de la dilución 1:10 < 100 UFC/g para muestras sólidas de la dilución 1:10 BIBLIOGRAFÍA.fda.

You're Reading a Free Preview

Descarga
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->