Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de

D y E. aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más bajas. es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. B. es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis. ensaladas. La especie aureus. leche y sus derivados. pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. meningitis. También es importante observar. C. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas. osteomielitis. son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica.0 microgramo). del orden de 0. provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento. rellenos para sándwiches y papas. de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana. sin embargo Jablonski et al.01 microgramo. no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia. que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas. establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno. productos de pastelería. pies de crema. son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. sin causar daño aparente (portadores asintomáticos). se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida. por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. para causar intoxicación. es de 106 UFC/g de alimento. en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento. las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo. suficientes para provocar una intoxicación en el hombre.conservación inapropiadas. como pasteles rellenos con crema. cabello y piel del 50% o más de los individuos. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias. sabor y olor. que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo. este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva. que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. . son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7. coberturas de chocolate. En los humanos.2° C y por debajo de 60° C) después de su preparación. siendo la “A” la más nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1. neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A. por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo. comentan que el FDA.

el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus.El establecimiento de los síntomas de la intoxicación. en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. consiste en los siguientes pasos: 1. la cantidad consumida del alimento contaminado. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva . existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. Sin embargo. 3. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días. pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo. es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. dolor o espasmos abdominales y postración. Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. Recuperación de la cepa. aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina. mediante el uso de plasma. 2. este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus. Identificación bioquímica. vómito. Demostrar la contaminación postproceso. la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas. En casos más severos. por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda. la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas. se utiliza un medio selectivo sólido. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus. Aislamiento selectivo. se puede presentar dolor de cabeza. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones.

0 mL cada uno de caldo manitol c.33 mL por caja. HCl 1N.0 mL de agar Baird Parker a.1 M de pH 7. la Norma establece un límite máximo de 106 UFC/g de alimento para que éste pueda ser consumido. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20. (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d.La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en superficie. . SOLUCIONES.0 mL de agar DNA c.2 a. no sólo desde el punto de vista económico.0 mL de la primer dilución del alimento. en caso de no contar con la orto toluidina d. es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar más de 100 células de Staphylococcus aureus/g ó 10 células de Staphylococcus aureus/ mL de alimento. utilizando el método de extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10 UFC/mL para alimentos líquidos. 1 caja de Petri con 20. El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma importancia.2 a. BIOLÓGICOS Plasma de conejo c.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b.1 M de pH 7. (opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agua peptonada al 0. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3. (sólo si se siembra en caldo manitol) Colorante azul de orto-toluidina 0. esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0. NOTA La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0. Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada. sino en el de salud pública. distribuido en tres placas de agar Baird Parker. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3. solamente si se coloca 1. REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para Tinción de Gram b Parafina o aceite mineral estérilc.0 mL de agua peptonada al 0. la sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.1M.

d Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica. pinzas. a. a.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica. c. Autoclave Baño de agua a ebulliciónd Incubadora a 35 ± 2°Cd NOTAS a b Material necesario al inicio de la práctica.MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a. Propipeta. . c. d Varillas de vidrio de 3. espátulas y separador de huevo. Microscopio óptico b. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón . estériles (se debe utilizar una por dilución). c. Motor para licuadora o Stomacher a. b. tijeras. c Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica. Balanza granataria a. a Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a. de largo. a Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos. Portaobjetosb. (en caso que la muestra sea líquida. (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) Pipetas Pasteur estériles a. b. dobladas en ángulo recto (forma de “L”). d. Asa bacteriológicab. Horno para esterilizar material de vidrio. cucharas.

Consultar Cuadro 1 .48 h a 37°C Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estéril Contar aquellas colonias negras con hidrólisis de lecitina Coagulasa Incubar 24 h 37°C Fermentación del manitol Plasma más desarrollo en BHI DNAsa termoestable Realizar pruebas bioquímicas a cada tubo Siembra de colonias típicas en tubos con caldo BHI.0 mL 1.0 mL 1.DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS Homogenizar con 90. Incubar 24 .0 mL Pesar 10.0 mL de solución diluyente 1.0 mL de diluyente Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.1 mL 10-1 10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4 10-5 Depositar por duplicado 0.1 mL de cada dilución en cajas petri con agar Baird Parker.0 g de muestra en condiciones de asepsia 0.

también pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor estimado”. 1. 6. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mínima. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas. Recuperación de la cepa. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril. convexas. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. Aislamiento selectivo. Adicionar 90. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9. 5.2. 10-2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas. 2.0 mL de agua peptonada estéril al 0. 10. brillantes. utilizando asa bacteriológica recta estéril. iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie). en caldo infusión cerebro corazón. dentro de estas últimas están comprendidas la coagulasa y la termonucleasa. tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas. muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. que son características de este microorganismo. en forma de “L”. 4. seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra más diluidas. durante 45 a 48 h. 8. 2. Con ayuda del cuadro 1. si no es posible. observar las colonias características de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). 9. . circulares. aureus. 3. 2. Éstas se presentan como: colonias negras. Pesar 10. entre 5 y 10 minutos aproximadamente.1 mL de las diluciones 10-1. 4. 5. 1. 3.1% o solución amortiguadora de fosfatos 0.0 mL del mismo diluyente.0 g de muestra en una caja de Petri estéril. determinar el número de colonias a evaluar. Incubar a 35 1 C durante 24 h. no obstante que contengan más de 150 colonias. Después de incubar. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker. lisas con diámetro de 1 a 2 mm. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. 7.PROCEDIMIENTO 1.1M de pH 7. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S. Transferir 0.

entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. en caso de no presentarse formación de coágulo. prolongar el período de observación hasta por 24 h. 2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado 3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado .5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa VALOR CARACTERÍSTICA negativa No se observa formación de coágulo.6. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril. Pruebas bioquímicas. Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo. 3. 1. Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar en una caja representativa bioquímicamente Menos de 50 UFC 3 51-100 UFC 5 101-150 UFC 7 3. NOTA Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta. adicionar 0. posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%. aureus. como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioquímicas. tomar 0. de acuerdo con los valores del cuadro 2. en intervalos de 1 hora. epidermidis ATCC 12228.2 mL de plasma de conejo. tomar 0. haciendo las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa. cepas tipo de S. 1.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. Formación de coágulos pequeños 1+ (positiva) desorganizados. Inocular e incubar en la misma forma. Con una pipeta estéril de 1 mL. aureus ATCC 6538 y S. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o superior a 2 cruces. se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos. 3. 2. CUADRO 1. Número de colonias a evaluar de S. Incubar en baño María o en incubadora. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo. CUADRO 2.2 mL de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón.

Incubar a 35C 2 C por 24 h. De encontrarse esta enzima. se puede utilizar HCl 1. Inocular 2 asadas en caldo manitol. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio. en caso de encontrarse dicha enzima. seguido de un precipitado blanco. cuando ambas pruebas son positivas. con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó. 3. 2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana. durante 4 a 24 h.1M a los orificios hechos en el agar DNA. Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa. Calentar 0. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda. generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina. quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima catalasa.0N como indicador. Después de incubar. se observa un halo transparente alrededor de la colonia. 1. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina). y observar los resultados. En el caso de no contar con orto toluidina.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo. 3. 3. aureus ATCC 6538). NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial. 2. no lo exige la norma). Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S. entre 0. 6. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado.5 mL de parafina o aceite mineral estéril. . de la suspensión del microorganismo que desarrollado en el medio infusión cerebro corazón. 4. 3. 5. indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional.4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado. en donde se inoculó.3 y 0. 1. adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0. como negativos (S. del punto anterior. epidermidis ATCC 12228).2 Prueba de la enzima termonucleasa. Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el fondo del mismo.

1 mL de dilución 10-3: 100% X . Con una asa bacteriológica. solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa. 3. Considerar la prueba como positiva. aureus (negras. mezclar perfectamente bien y observar los resultados. brillantes con halo y precipitado blanco). el medio debe virar a color amarillo por la producción de acidez. contenía 70 UFC sospechosas de S. 3. 2. se considera positiva la prueba. Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0.001g/mL). como en este método se inoculan 0. expresado en forma aritmética es: 5 UFC 2 UFC X= 40% El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0. se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. esto es que sí contiene la enzima catalasa. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima. se encuentran en este alimento? y ¿se puede consumir el alimento?. Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol. si se presenta desarrollo y vira el indicador. ¿a qué porcentaje corresponden?. Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas. dos colonias positivas.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas.4 Prueba de la catalasa (opcional. Tomando en cuenta el cuadro número uno. y colocarlo sobre un portaobjetos. aureus toxigénico. 1. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S.4. aureus enterotoxigénico presentes en 1. no lo exige la norma).0001g) para este caso. Si se presenta formación de burbujas. se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente. auresus toxigénico. Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología. De estas 5 colonias analizadas.1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0. tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón después de su incubación. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para determinar el número de S.

2001) presentan riesgo para la salud pública. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado. aureus toxigénico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación alimentaria. se reporta como en el ejemplo antes descrito. pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones. se debe reportar la sensibilidad del método.000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g). sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski. de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana. están dentro del rango estadístico (de 15 a 150 UFC/caja). NOTA No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que solamente números de unidades formadoras de colonias de S.0001 g (10 -4g) 1g X= 700. .000 UFC/g de alimento.70 UFC X 0. Para elaborar un informe de resultados.000 UFC/g de alimento. se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan: Cuando las UFC encontradas en una caja Petri. por lo que no se debe consumir. Si se está en el valor estimado. De las 700. esto es que no existen colonias típicas. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma específica.000 UFC/g X X=280. la forma correcta de expresar el resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g Estas 280. para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado.000 UFC/g 100% 40% Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10. en este caso será de 100 UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas. solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este alimento? 700.

& Montville T:J. Arlington. & Ito K. Beuchat. & Bohach G:A. (Eds.M. Downs F.Cuando todas las pruebas bioquímicas son negativas. and Staphylococcal Enterotoxins”.htmL . Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”.fda. (Eds. International Commission on Microbiological.) APHA. 2nd ed. Jablonskin L. 2001.) Food Microbiology Fundamentals & Frontiers. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. NOM-115-SSA1-1994. (2001) “Staphylococcus aureus. ASM. Lancette G. & Bennett W. L:R.gov/~ebam/bam-1. Washington. Bienes y servicios.cfsan. se informará: < 10 UFC/mL en muestras líquidas de la dilución 1:10 < 100 UFC/g para muestras sólidas de la dilución 1:10 BIBLIOGRAFÍA. 387-403. VA: AOAC. 4th ed. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. “Staphylococcus aureus” In:Doyle M.P. USA: 411-434. 9th ed.A. http://www.

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