Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de

conservación inapropiadas. meningitis. que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. ensaladas. comentan que el FDA. por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina. para causar intoxicación.0 microgramo).2° C y por debajo de 60° C) después de su preparación. En los humanos. cabello y piel del 50% o más de los individuos. por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo. siendo la “A” la más nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1. La especie aureus. de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana. es de 106 UFC/g de alimento. del orden de 0. sin embargo Jablonski et al. neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. pies de crema.01 microgramo. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A. . son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias. rellenos para sándwiches y papas. D y E. pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas. es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. sin causar daño aparente (portadores asintomáticos). establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno. como pasteles rellenos con crema. B. son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento. es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis. productos de pastelería. aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más bajas. este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva. C. que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos. También es importante observar. las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo. se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida. que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo. coberturas de chocolate. leche y sus derivados. sabor y olor. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7. no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia. osteomielitis. suficientes para provocar una intoxicación en el hombre. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas. son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias.

en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. En casos más severos. es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. dolor o espasmos abdominales y postración. la cantidad consumida del alimento contaminado. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva .El establecimiento de los síntomas de la intoxicación. 2. Aislamiento selectivo. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo. vómito. calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas. el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus. Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. Recuperación de la cepa. consiste en los siguientes pasos: 1. mediante el uso de plasma. 3. sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. Sin embargo. se puede presentar dolor de cabeza. se utiliza un medio selectivo sólido. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días. por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda. Identificación bioquímica. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos. este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus. la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas. existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea. aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina. Demostrar la contaminación postproceso. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus.

0 mL de agar Baird Parker a. no sólo desde el punto de vista económico.0 mL de agua peptonada al 0. esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0. El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma importancia.1M. BIOLÓGICOS Plasma de conejo c. la sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa.0 mL de agar DNA c. utilizando el método de extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10 UFC/mL para alimentos líquidos. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3. sino en el de salud pública. . 1 caja de Petri con 20. es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar más de 100 células de Staphylococcus aureus/g ó 10 células de Staphylococcus aureus/ mL de alimento.1 M de pH 7. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b.La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en superficie. REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para Tinción de Gram b Parafina o aceite mineral estérilc.0 mL de agua peptonada al 0. (opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.33 mL por caja. solamente si se coloca 1.0 mL cada uno de caldo manitol c.1 M de pH 7. (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d. SOLUCIONES. NOTA La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL. (sólo si se siembra en caldo manitol) Colorante azul de orto-toluidina 0. HCl 1N.2 a.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.2 a. la Norma establece un límite máximo de 106 UFC/g de alimento para que éste pueda ser consumido. en caso de no contar con la orto toluidina d. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9. Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada. distribuido en tres placas de agar Baird Parker. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.0 mL de la primer dilución del alimento.

5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. Motor para licuadora o Stomacher a. estériles (se debe utilizar una por dilución). d Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica. Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica. b. c. (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) Pipetas Pasteur estériles a. Balanza granataria a. c. Asa bacteriológicab. a Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos. c Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica. Autoclave Baño de agua a ebulliciónd Incubadora a 35 ± 2°Cd NOTAS a b Material necesario al inicio de la práctica. b. d. dobladas en ángulo recto (forma de “L”). espátulas y separador de huevo. Propipeta. d Varillas de vidrio de 3. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón . a.MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a. pinzas. Horno para esterilizar material de vidrio. Microscopio óptico b. a Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a. (en caso que la muestra sea líquida. de largo. tijeras. c. Portaobjetosb. cucharas. . a.

0 mL Pesar 10.48 h a 37°C Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estéril Contar aquellas colonias negras con hidrólisis de lecitina Coagulasa Incubar 24 h 37°C Fermentación del manitol Plasma más desarrollo en BHI DNAsa termoestable Realizar pruebas bioquímicas a cada tubo Siembra de colonias típicas en tubos con caldo BHI. Incubar 24 .0 mL 1.1 mL de cada dilución en cajas petri con agar Baird Parker.0 mL de solución diluyente 1.DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS Homogenizar con 90.1 mL 10-1 10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4 10-5 Depositar por duplicado 0.0 g de muestra en condiciones de asepsia 0. Consultar Cuadro 1 .0 mL de diluyente Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL 1.

en caldo infusión cerebro corazón. convexas. 2. 10. . 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker.0 g de muestra en una caja de Petri estéril. muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. si no es posible. brillantes. 5.1M de pH 7. 5. Transferir 0. observar las colonias características de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). determinar el número de colonias a evaluar. Pesar 10. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S. Recuperación de la cepa. 10-2. dentro de estas últimas están comprendidas la coagulasa y la termonucleasa.1 mL de las diluciones 10-1. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mínima.0 mL del mismo diluyente. 2. durante 45 a 48 h. Incubar a 35 1 C durante 24 h.2. no obstante que contengan más de 150 colonias. 4. 8. Aislamiento selectivo. 2. Con ayuda del cuadro 1. utilizando asa bacteriológica recta estéril. 3.1% o solución amortiguadora de fosfatos 0. que son características de este microorganismo. 6. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. en forma de “L”. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril. lisas con diámetro de 1 a 2 mm. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. 1. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas. iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie). 4.0 mL de agua peptonada estéril al 0. Después de incubar. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9. 1. seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra más diluidas. circulares. 7. aureus. también pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor estimado”. 9. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas. Éstas se presentan como: colonias negras. entre 5 y 10 minutos aproximadamente. 3. tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. Adicionar 90.PROCEDIMIENTO 1.

2 mL de plasma de conejo. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o superior a 2 cruces. prolongar el período de observación hasta por 24 h. 2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado 3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado .1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar en una caja representativa bioquímicamente Menos de 50 UFC 3 51-100 UFC 5 101-150 UFC 7 3. Incubar en baño María o en incubadora. tomar 0. tomar 0. Formación de coágulos pequeños 1+ (positiva) desorganizados.6. en caso de no presentarse formación de coágulo. Número de colonias a evaluar de S. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo. NOTA Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta. aureus. de acuerdo con los valores del cuadro 2. Con una pipeta estéril de 1 mL. 3. Pruebas bioquímicas.5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm. adicionar 0. en intervalos de 1 hora. Inocular e incubar en la misma forma. 1. cepas tipo de S. epidermidis ATCC 12228. aureus ATCC 6538 y S. entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. CUADRO 2. 1. CUADRO 1. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril. posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%. como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioquímicas. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa VALOR CARACTERÍSTICA negativa No se observa formación de coágulo. haciendo las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa. Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo. 2. se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos. 3.2 mL de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón.

en caso de encontrarse dicha enzima.4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado. generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina. En el caso de no contar con orto toluidina. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda. 1. 3. De encontrarse esta enzima. 6. Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S. Calentar 0. . 1. como negativos (S. con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0. 4. seguido de un precipitado blanco.1M a los orificios hechos en el agar DNA. 2. durante 4 a 24 h. 3. Después de incubar. 5. del punto anterior.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado. cuando ambas pruebas son positivas. NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial. Inocular 2 asadas en caldo manitol. quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima catalasa. en donde se inoculó. se puede utilizar HCl 1. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio. por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó. se observa un halo transparente alrededor de la colonia. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina). Incubar a 35C 2 C por 24 h. epidermidis ATCC 12228).0N como indicador. entre 0. no lo exige la norma). y observar los resultados. Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el fondo del mismo. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana.3 y 0. Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa. 2. 3. de la suspensión del microorganismo que desarrollado en el medio infusión cerebro corazón.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional.5 mL de parafina o aceite mineral estéril. 3. indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa. aureus ATCC 6538).2 Prueba de la enzima termonucleasa.

mezclar perfectamente bien y observar los resultados. se considera positiva la prueba.001g/mL). CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para determinar el número de S. como en este método se inoculan 0. brillantes con halo y precipitado blanco). Considerar la prueba como positiva. dos colonias positivas. Con una asa bacteriológica. solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa. aureus enterotoxigénico presentes en 1. aureus toxigénico.1 mL de dilución 10-3: 100% X . aureus (negras. no lo exige la norma). Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología. se encuentran en este alimento? y ¿se puede consumir el alimento?. se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente. el medio debe virar a color amarillo por la producción de acidez. Si se presenta formación de burbujas. se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. auresus toxigénico.1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. De estas 5 colonias analizadas. expresado en forma aritmética es: 5 UFC 2 UFC X= 40% El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0. 3. 3. 1. y colocarlo sobre un portaobjetos. tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón después de su incubación.4. Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S. Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima. 2. esto es que sí contiene la enzima catalasa. si se presenta desarrollo y vira el indicador.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas.4 Prueba de la catalasa (opcional. el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S.0001g) para este caso. Tomando en cuenta el cuadro número uno. ¿a qué porcentaje corresponden?. contenía 70 UFC sospechosas de S. Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol.

000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g).000 UFC/g de alimento. por lo que no se debe consumir. pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. están dentro del rango estadístico (de 15 a 150 UFC/caja).000 UFC/g X X=280. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado.000 UFC/g de alimento. Para elaborar un informe de resultados. en este caso será de 100 UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas.0001 g (10 -4g) 1g X= 700. sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski. solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este alimento? 700. el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones. se reporta como en el ejemplo antes descrito. la forma correcta de expresar el resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g Estas 280. 2001) presentan riesgo para la salud pública. aureus toxigénico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación alimentaria.70 UFC X 0. se debe reportar la sensibilidad del método. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma específica. se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan: Cuando las UFC encontradas en una caja Petri. de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana. De las 700. NOTA No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que solamente números de unidades formadoras de colonias de S. Si se está en el valor estimado. esto es que no existen colonias típicas.000 UFC/g 100% 40% Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10. . para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado.

Arlington. se informará: < 10 UFC/mL en muestras líquidas de la dilución 1:10 < 100 UFC/g para muestras sólidas de la dilución 1:10 BIBLIOGRAFÍA. “Staphylococcus aureus” In:Doyle M. 2nd ed. Washington. Bienes y servicios. Jablonskin L.) APHA. Downs F.M. Lancette G. & Bohach G:A. NOM-115-SSA1-1994. 387-403. International Commission on Microbiological. (Eds. & Bennett W. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. and Staphylococcal Enterotoxins”. (2001) “Staphylococcus aureus. & Montville T:J. (Eds. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 9th ed. 2001.) Food Microbiology Fundamentals & Frontiers.gov/~ebam/bam-1. http://www. USA: 411-434.htmL .cfsan. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. VA: AOAC. & Ito K.fda. ASM. Beuchat.A. 4th ed. L:R.P.Cuando todas las pruebas bioquímicas son negativas.

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