Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de

C.2° C y por debajo de 60° C) después de su preparación. La especie aureus. en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento. cabello y piel del 50% o más de los individuos. sabor y olor. osteomielitis. comentan que el FDA. son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias.0 microgramo). que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. También es importante observar. aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más bajas. que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo. suficientes para provocar una intoxicación en el hombre. . En los humanos.conservación inapropiadas.01 microgramo. sin embargo Jablonski et al. D y E. rellenos para sándwiches y papas. es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis. sin causar daño aparente (portadores asintomáticos). Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas. no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas. por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. productos de pastelería. se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A. tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina. neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. del orden de 0. ensaladas. de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana. B. es de 106 UFC/g de alimento. meningitis. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7. este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva. provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento. siendo la “A” la más nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1. como pasteles rellenos con crema. leche y sus derivados. son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo. establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno. para causar intoxicación. es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. pies de crema. que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias. por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo. son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica. pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. coberturas de chocolate.

por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda. la cantidad consumida del alimento contaminado. utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus. se puede presentar dolor de cabeza. este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus. 3. dolor o espasmos abdominales y postración. mediante el uso de plasma. sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva . existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. En casos más severos. pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas. se utiliza un medio selectivo sólido. en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea. Recuperación de la cepa. la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas. 2. Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. vómito. es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días. Identificación bioquímica.El establecimiento de los síntomas de la intoxicación. Demostrar la contaminación postproceso. Aislamiento selectivo. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo. consiste en los siguientes pasos: 1. la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. Sin embargo.

la sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa. esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0. utilizando el método de extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10 UFC/mL para alimentos líquidos. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20. distribuido en tres placas de agar Baird Parker. (opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL de agua peptonada al 0.0 mL cada uno de caldo manitol c. en caso de no contar con la orto toluidina d. REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para Tinción de Gram b Parafina o aceite mineral estérilc. la Norma establece un límite máximo de 106 UFC/g de alimento para que éste pueda ser consumido. es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar más de 100 células de Staphylococcus aureus/g ó 10 células de Staphylococcus aureus/ mL de alimento.0 mL de la primer dilución del alimento. (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0. HCl 1N.2 a.La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en superficie.1 M de pH 7.0 mL de agar DNA c.33 mL por caja. 1 caja de Petri con 20.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b.0 mL de agar Baird Parker a.1M. solamente si se coloca 1. NOTA La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agua peptonada al 0. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9. El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma importancia. no sólo desde el punto de vista económico.2 a. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3. sino en el de salud pública. (sólo si se siembra en caldo manitol) Colorante azul de orto-toluidina 0. BIOLÓGICOS Plasma de conejo c.1 M de pH 7. SOLUCIONES. . Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada.

Horno para esterilizar material de vidrio. d Varillas de vidrio de 3. Microscopio óptico b. Autoclave Baño de agua a ebulliciónd Incubadora a 35 ± 2°Cd NOTAS a b Material necesario al inicio de la práctica. c. c. dobladas en ángulo recto (forma de “L”). Motor para licuadora o Stomacher a. Asa bacteriológicab. (en caso que la muestra sea líquida. (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) Pipetas Pasteur estériles a. b. a. Propipeta. a. d Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica. estériles (se debe utilizar una por dilución). b. tijeras. pinzas. Portaobjetosb. d.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. . Balanza granataria a. c Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica. de largo. espátulas y separador de huevo.MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón . Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica. a Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a. a Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos. cucharas. c.

Consultar Cuadro 1 .0 mL Pesar 10. Incubar 24 .0 mL 1.0 mL 1.1 mL 10-1 10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4 10-5 Depositar por duplicado 0.48 h a 37°C Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estéril Contar aquellas colonias negras con hidrólisis de lecitina Coagulasa Incubar 24 h 37°C Fermentación del manitol Plasma más desarrollo en BHI DNAsa termoestable Realizar pruebas bioquímicas a cada tubo Siembra de colonias típicas en tubos con caldo BHI.0 mL de diluyente Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de solución diluyente 1.0 g de muestra en condiciones de asepsia 0.DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS Homogenizar con 90.1 mL de cada dilución en cajas petri con agar Baird Parker.

en forma de “L”. Éstas se presentan como: colonias negras. 2. 7. lisas con diámetro de 1 a 2 mm.0 g de muestra en una caja de Petri estéril.0 mL de agua peptonada estéril al 0. 3. 4.1 mL de las diluciones 10-1. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C.1% o solución amortiguadora de fosfatos 0. observar las colonias características de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). 2. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril. tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. Con ayuda del cuadro 1. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mínima. 10-2. 5. utilizando asa bacteriológica recta estéril. aureus. Después de incubar. Adicionar 90. si no es posible. muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra más diluidas. 1. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas. 9. Recuperación de la cepa. 3. durante 45 a 48 h. 10.1M de pH 7. . 1. determinar el número de colonias a evaluar. 4. Transferir 0. también pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor estimado”. 8. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas. circulares. 6. no obstante que contengan más de 150 colonias. 5. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S.0 mL del mismo diluyente.2. brillantes. Incubar a 35 1 C durante 24 h. entre 5 y 10 minutos aproximadamente. que son características de este microorganismo. dentro de estas últimas están comprendidas la coagulasa y la termonucleasa. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. 2. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas. convexas. en caldo infusión cerebro corazón.PROCEDIMIENTO 1. Aislamiento selectivo. iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie). 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker. Pesar 10. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9.

posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%. aureus ATCC 6538 y S.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa VALOR CARACTERÍSTICA negativa No se observa formación de coágulo. Con una pipeta estéril de 1 mL. CUADRO 1. Número de colonias a evaluar de S. 1. prolongar el período de observación hasta por 24 h.5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm. Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o superior a 2 cruces. como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioquímicas. epidermidis ATCC 12228. 1. entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. Inocular e incubar en la misma forma. cepas tipo de S. Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar en una caja representativa bioquímicamente Menos de 50 UFC 3 51-100 UFC 5 101-150 UFC 7 3. haciendo las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa.2 mL de plasma de conejo. de acuerdo con los valores del cuadro 2. Formación de coágulos pequeños 1+ (positiva) desorganizados. en caso de no presentarse formación de coágulo.2 mL de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón. CUADRO 2. 3. aureus. 2. Pruebas bioquímicas. se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos. en intervalos de 1 hora. adicionar 0. NOTA Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta. Incubar en baño María o en incubadora.6. tomar 0. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril. 2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado 3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado . tomar 0. 3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo.

Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado. indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa. Incubar a 35C 2 C por 24 h. Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio.2 Prueba de la enzima termonucleasa. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda. Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S. Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el fondo del mismo. como negativos (S. De encontrarse esta enzima. quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima catalasa.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo. de la suspensión del microorganismo que desarrollado en el medio infusión cerebro corazón. se puede utilizar HCl 1. . Después de incubar. 3. NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial. 1. adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0. 3. del punto anterior. y observar los resultados. por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó. 6. 1. se observa un halo transparente alrededor de la colonia.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional. 4. seguido de un precipitado blanco. En el caso de no contar con orto toluidina. cuando ambas pruebas son positivas. en donde se inoculó.0N como indicador. 3.1M a los orificios hechos en el agar DNA. 5. durante 4 a 24 h. con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. no lo exige la norma). en caso de encontrarse dicha enzima.5 mL de parafina o aceite mineral estéril. aureus ATCC 6538). Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana. Inocular 2 asadas en caldo manitol. entre 0. 3. Calentar 0. generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina. epidermidis ATCC 12228). 2. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina).3 y 0.4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado. 2.

se considera positiva la prueba.0001g) para este caso. se encuentran en este alimento? y ¿se puede consumir el alimento?.1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas.1 mL de dilución 10-3: 100% X . Con una asa bacteriológica. aureus toxigénico. se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol. contenía 70 UFC sospechosas de S. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima. no lo exige la norma). auresus toxigénico. 3. esto es que sí contiene la enzima catalasa.001g/mL). mezclar perfectamente bien y observar los resultados. como en este método se inoculan 0. 1. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para determinar el número de S. Tomando en cuenta el cuadro número uno. Si se presenta formación de burbujas. Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0. el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S. De estas 5 colonias analizadas. Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S.4 Prueba de la catalasa (opcional. 2. aureus enterotoxigénico presentes en 1. si se presenta desarrollo y vira el indicador. Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas. Considerar la prueba como positiva. tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón después de su incubación. Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología. brillantes con halo y precipitado blanco).4. dos colonias positivas. el medio debe virar a color amarillo por la producción de acidez. ¿a qué porcentaje corresponden?. solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa. y colocarlo sobre un portaobjetos. 3. aureus (negras. expresado en forma aritmética es: 5 UFC 2 UFC X= 40% El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente.

se debe reportar la sensibilidad del método. Si se está en el valor estimado. están dentro del rango estadístico (de 15 a 150 UFC/caja).000 UFC/g de alimento. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma específica. aureus toxigénico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación alimentaria. en este caso será de 100 UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas. sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski.0001 g (10 -4g) 1g X= 700. Para elaborar un informe de resultados.000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g).000 UFC/g X X=280. se reporta como en el ejemplo antes descrito. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado. se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan: Cuando las UFC encontradas en una caja Petri. de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana. 2001) presentan riesgo para la salud pública. De las 700.70 UFC X 0. por lo que no se debe consumir.000 UFC/g de alimento. NOTA No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que solamente números de unidades formadoras de colonias de S. pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este alimento? 700. para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado. . el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones. esto es que no existen colonias típicas. la forma correcta de expresar el resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g Estas 280.000 UFC/g 100% 40% Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10.

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