Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de

que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. osteomielitis. D y E. neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica.0 microgramo). . Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7. rellenos para sándwiches y papas. tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina. productos de pastelería. provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento. en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento. B. por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. pies de crema. este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva. La especie aureus. no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A. es de 106 UFC/g de alimento. es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis.2° C y por debajo de 60° C) después de su preparación. leche y sus derivados. que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas. como pasteles rellenos con crema. meningitis. para causar intoxicación. cabello y piel del 50% o más de los individuos. que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo. siendo la “A” la más nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias. son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno. ensaladas.conservación inapropiadas. suficientes para provocar una intoxicación en el hombre. del orden de 0. por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo.01 microgramo. C. comentan que el FDA. son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias. de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana. pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. coberturas de chocolate. sin embargo Jablonski et al. las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas. En los humanos. se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida. sin causar daño aparente (portadores asintomáticos). sabor y olor. aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más bajas. es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. También es importante observar.

es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. se puede presentar dolor de cabeza. Demostrar la contaminación postproceso. este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus. Aislamiento selectivo. consiste en los siguientes pasos: 1. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva . 2. 3. aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus. vómito. pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. se utiliza un medio selectivo sólido. utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. dolor o espasmos abdominales y postración. la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo.El establecimiento de los síntomas de la intoxicación. En casos más severos. Sin embargo. Recuperación de la cepa. existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea. el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus. mediante el uso de plasma. la cantidad consumida del alimento contaminado. Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda. Identificación bioquímica. calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos. en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.

la Norma establece un límite máximo de 106 UFC/g de alimento para que éste pueda ser consumido.0 mL de agar DNA c. .1M. (opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90. la sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa.La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en superficie.2 a. distribuido en tres placas de agar Baird Parker. BIOLÓGICOS Plasma de conejo c. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL cada uno de caldo manitol c. esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0. en caso de no contar con la orto toluidina d. (sólo si se siembra en caldo manitol) Colorante azul de orto-toluidina 0.0 mL de agua peptonada al 0. solamente si se coloca 1.0 mL de agar Baird Parker a. (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d.33 mL por caja. El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma importancia. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20. SOLUCIONES. sino en el de salud pública. HCl 1N. Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3. 1 caja de Petri con 20. NOTA La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL. REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para Tinción de Gram b Parafina o aceite mineral estérilc. no sólo desde el punto de vista económico.1 M de pH 7.0 mL de agua peptonada al 0. es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar más de 100 células de Staphylococcus aureus/g ó 10 células de Staphylococcus aureus/ mL de alimento.1 M de pH 7.0 mL de la primer dilución del alimento.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.2 a. utilizando el método de extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10 UFC/mL para alimentos líquidos.

Motor para licuadora o Stomacher a. d. tijeras. Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón .5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. a. Propipeta. a. Horno para esterilizar material de vidrio. c. (en caso que la muestra sea líquida. d Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica. espátulas y separador de huevo. Balanza granataria a. c Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica. pinzas. c. d Varillas de vidrio de 3. cucharas. Microscopio óptico b. estériles (se debe utilizar una por dilución). . Asa bacteriológicab. c. de largo. a Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a. (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) Pipetas Pasteur estériles a. b. a Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos. dobladas en ángulo recto (forma de “L”).MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a. Autoclave Baño de agua a ebulliciónd Incubadora a 35 ± 2°Cd NOTAS a b Material necesario al inicio de la práctica. Portaobjetosb. b.

0 mL Pesar 10.0 g de muestra en condiciones de asepsia 0.DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS Homogenizar con 90.48 h a 37°C Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estéril Contar aquellas colonias negras con hidrólisis de lecitina Coagulasa Incubar 24 h 37°C Fermentación del manitol Plasma más desarrollo en BHI DNAsa termoestable Realizar pruebas bioquímicas a cada tubo Siembra de colonias típicas en tubos con caldo BHI.0 mL de solución diluyente 1.0 mL 1. Consultar Cuadro 1 .0 mL de diluyente Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9. Incubar 24 .1 mL de cada dilución en cajas petri con agar Baird Parker.1 mL 10-1 10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4 10-5 Depositar por duplicado 0.0 mL 1.

1 mL de las diluciones 10-1. observar las colonias características de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). 10. entre 5 y 10 minutos aproximadamente. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. que son características de este microorganismo. 10-2. determinar el número de colonias a evaluar. no obstante que contengan más de 150 colonias. aureus. 1. . Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas. Después de incubar. 9. iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie). en caldo infusión cerebro corazón. Éstas se presentan como: colonias negras.1% o solución amortiguadora de fosfatos 0.0 mL de agua peptonada estéril al 0.0 g de muestra en una caja de Petri estéril. Incubar a 35 1 C durante 24 h.1M de pH 7. muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. convexas. 6. 2. Adicionar 90. 4. también pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor estimado”. 4. lisas con diámetro de 1 a 2 mm. en forma de “L”. si no es posible.0 mL del mismo diluyente. Con ayuda del cuadro 1. Transferir 0. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. 8. 2. Aislamiento selectivo. 2. circulares. 5.2. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mínima. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S. 7. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. Recuperación de la cepa.PROCEDIMIENTO 1. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas. 3. brillantes. Pesar 10. dentro de estas últimas están comprendidas la coagulasa y la termonucleasa. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas. tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. 3. seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra más diluidas. 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker. durante 45 a 48 h. utilizando asa bacteriológica recta estéril. 5. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril. 1.

Número de colonias a evaluar de S. 1. tomar 0. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa VALOR CARACTERÍSTICA negativa No se observa formación de coágulo. haciendo las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa. posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%. aureus. CUADRO 1. en intervalos de 1 hora. Inocular e incubar en la misma forma. epidermidis ATCC 12228.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. prolongar el período de observación hasta por 24 h. 2. Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar en una caja representativa bioquímicamente Menos de 50 UFC 3 51-100 UFC 5 101-150 UFC 7 3. Pruebas bioquímicas. tomar 0. Formación de coágulos pequeños 1+ (positiva) desorganizados. Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo. de acuerdo con los valores del cuadro 2.2 mL de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón. 2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado 3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado . Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril. CUADRO 2. Con una pipeta estéril de 1 mL. NOTA Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta. aureus ATCC 6538 y S. como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioquímicas.5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm.2 mL de plasma de conejo. 3. en caso de no presentarse formación de coágulo.6. Incubar en baño María o en incubadora. 1. adicionar 0. 3. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o superior a 2 cruces. cepas tipo de S. se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos.

3. durante 4 a 24 h. 1. como negativos (S. no lo exige la norma). Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa.4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado. epidermidis ATCC 12228). aureus ATCC 6538). entre 0. Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el fondo del mismo. 4. Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda. . con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. En el caso de no contar con orto toluidina. adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0. del punto anterior. indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa.2 Prueba de la enzima termonucleasa. 6. en caso de encontrarse dicha enzima. se puede utilizar HCl 1.0N como indicador. 2. Incubar a 35C 2 C por 24 h. 3. 3.3 y 0. 5. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado.1M a los orificios hechos en el agar DNA. Calentar 0. se observa un halo transparente alrededor de la colonia. NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial. Inocular 2 asadas en caldo manitol.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional. 1. de la suspensión del microorganismo que desarrollado en el medio infusión cerebro corazón. seguido de un precipitado blanco. Después de incubar. por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó. De encontrarse esta enzima. generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio. 3. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina).3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo. cuando ambas pruebas son positivas. y observar los resultados.5 mL de parafina o aceite mineral estéril. en donde se inoculó. quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima catalasa. 2.

se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente. 3. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol.1 mL de dilución 10-3: 100% X .1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0. Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas. el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S. 1.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas. aureus enterotoxigénico presentes en 1. Si se presenta formación de burbujas. dos colonias positivas. mezclar perfectamente bien y observar los resultados. se encuentran en este alimento? y ¿se puede consumir el alimento?. si se presenta desarrollo y vira el indicador. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. Tomando en cuenta el cuadro número uno.0001g) para este caso. se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. brillantes con halo y precipitado blanco). el medio debe virar a color amarillo por la producción de acidez. no lo exige la norma). Con una asa bacteriológica. aureus (negras. Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S. aureus toxigénico. se considera positiva la prueba. 3. contenía 70 UFC sospechosas de S. 2. solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa. tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón después de su incubación.4. y colocarlo sobre un portaobjetos.001g/mL). Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0. De estas 5 colonias analizadas. auresus toxigénico. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima. Considerar la prueba como positiva. expresado en forma aritmética es: 5 UFC 2 UFC X= 40% El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0. Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología. ¿a qué porcentaje corresponden?.4 Prueba de la catalasa (opcional. esto es que sí contiene la enzima catalasa. como en este método se inoculan 0. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para determinar el número de S.

70 UFC X 0. la forma correcta de expresar el resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g Estas 280.000 UFC/g de alimento. De las 700.000 UFC/g de alimento.000 UFC/g X X=280. esto es que no existen colonias típicas. Si se está en el valor estimado. 2001) presentan riesgo para la salud pública. Para elaborar un informe de resultados. se reporta como en el ejemplo antes descrito. en este caso será de 100 UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas. .000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g). se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan: Cuando las UFC encontradas en una caja Petri. sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski.000 UFC/g 100% 40% Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10. el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones. por lo que no se debe consumir.0001 g (10 -4g) 1g X= 700. pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este alimento? 700. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado. aureus toxigénico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación alimentaria. están dentro del rango estadístico (de 15 a 150 UFC/caja). NOTA No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que solamente números de unidades formadoras de colonias de S. para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma específica. se debe reportar la sensibilidad del método. de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana.

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