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CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO

I.- RESUMEN Se desarrollo el Cultivo Celular Continuo Aireado de la Levadura Kluyveromyces

marxianus ATCC-16045, la cual se inicio desde la resiembra del medio de mantención

usando

Extracto de Levadura 10 gr,

Extracto de malta20 gr, Peptona 20 gr, Agar 20 gr la

cepa utilizada estaba refrigerada. Se uso como sustrato limitante la sacarosa, siendo la concentración celular máxima final esperada de 3g/l el pH es de 5.98. Se empezó con la preparación de los medios de

activación sacarosa 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l y la solución de sales (K 2 HPO 4 = 5g/l

(NH 4 ) 2 SO 4 =5 g/l ; MgSO 4 .7H 2 O= 0.5 ;g/l )y HCl

=0.57 g/l se llevo al shaker para la

fermentación obtener el cultivo por lote. Del cual se obtuvo la grafica de la cinética de

crecimiento microbiano, curva de calibrado de biomasa y azucares reductores (sacarosa) por medio del método de DNS. La grafica de la cinética de crecimiento nos sirvió para poder observar en que momento la levadura alcanzo los 2/3 de su crecimiento exponencial, para este fin se prepararon dos medios de fermentación uno que sirvió como control para el incremento de la biomasa y el otro para la experiencia en el Quimiostato.

Luego se prosiguió con la puesta en marcha del Quimiostato, el cual se inicio con el montaje e instalación de este sistema y su respectiva esterilización, luego se prosiguió ala inoculación del medio liquido del Quimiostato y se controlo el lote hasta que este alcanzara los 2/3 de crecimiento logarítmico el cual fue al cabo de 3 horas, dato que se igual al obtenido en el cultivo celular por lote. Paralelo a esto se prepararon los medios de alimentación para los estados estaciones a volumen ya calculado.

De aquí en adelante se prosiguió con el muestreo y análisis de X y S para los cinco estados estacionarios, siendo estos tomados según los tiempos calculados 43h

(F=0,8ml/min), 29h (F=1,2ml/min), 19h (F=1,80ml/min) ,14h(F=2,5ml/min), 12h(F=3,0ml/min) para cada estado. Con estos datos se obtuvo la curva característica del cultivo continuo con cinco estados estacionarios. Paralelo a la toma de muestras del cuarto y quinto estado estacionario se prepararon los medios de fermentación bajo limitación de nitrógeno reduciéndolo a la mitad (( NH 4 ) 2 SO 2 =1g/l) y perturbación del

estado estacionario por calculados.

aumento de la concentración de sacarosa(15 g/l)

en volúmenes ya

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La toma de la muestra bajo limitación de nitrógeno con un flujo de 2.5ml/min. Nos sirvió para comprar este punto con el obtenido en la curva característica de la grafica de los e. e. siendo el resultado que el hecho de limitar al microorganismo de la fuente de nitrógeno no afecta considerablemente su crecimiento. La perturbación nos indica que a niveles altos de la fuente de carbono el microorganismo mantiene un equilibrio en su crecimiento.

Se preparo el medio para el método de lavado en volumen necesario dado por la

velocidad de dilución y el flujo requerido (F=12ml/min ) estos datos son un tiempo de 4

  • h. El método de lavado nos permitió determinar la velocidad específica de crecimiento

máximo, Finalmente se prosiguió con el desmontaje y lavado cuidadoso del sistema

continuo montado en el laboratorio de Bioprocesos.

II.- INTRODUCCIÓN

La vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, con una temperatura máxima de crecimiento entre 24 y 48ºC. Solo unas pocas (2%) son psicrófilas con una temperatura máxima de crecimiento por debajo de 24ºC, pero mayor es el número de las levaduras que tienen la temperatura óptima de crecimiento por debajo de 20ºC. No hay levaduras que puedan crecer a 50ºC y solamente unas pocas pueden desarrollar cerca de 0ºC, entre las que se encuentran Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii y Pichia membranaefaciens. Por otra parte, Kluyveromyces marxianus crece a 48ºC. En general, la presencia de etanol o bicarbonato aumenta la temperatura mínima de crecimiento (Déak & Beuchat 1996).

La mayoría de las levaduras que causan deterioro de alimentos crece a una actividad de agua mínima de 0,90-0,95. Sin embargo Zygosaccharomyces rouxii puede crecer sobre substratos azucarados a una actividad de agua igual a 0,62, pero son pocas las levaduras que desarrollan en presencia de altas concentraciones de azúcar o sal. En general las levaduras toleran mejor altas concentraciones de azúcar que de sal.(Déak & Beuchat

1996).

La mayoría de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero prefieren un medio

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ligeramente ácido con un pH de 4,5 a 6,5. las células son inactivadas a presiones entre 7 y 20 MPa, a 25-35°C (Déak & Beuchat 1996).

Las levaduras son organismos aerobios y aunque unas especies son fermentadoras otras no lo son, como por ejemplo los géneros Cryptococcus y Rhodotorula. Saccharomyces y unos pocos géneros más, son fermentadores enérgicos de los azúcares pero pronto detienen su crecimiento y multiplicación por falta de oxígeno. Solo unos pocos glúcidos, principalmente hexosas y oligosacáridos, pueden ser fermentados por las levaduras, pero el rango de compuestos que pueden asimilar es mucho más amplio incluyendo además, pentosas, alcoholes, ácidos orgánicos, aminoácidos y glicósidos.

La utilización de nitratos está confinada a ciertas especies de levaduras, mientras que las fuentes comunes de nitrógeno son amonio, urea y aminoácidos. Muchas especies sintetizan todas las vitaminas necesarias pero otras requieren biotina y otros compuestos.

Los aceites esenciales de ajedrea, ajo, canela, cebolla, clavo de olor, orégano, pimienta de Jamaica y tomillo son inhibidores de varios géneros de levaduras. El aceite esencial de ajo inhibe a una concentración de 25 mg/L y los de cebolla, orégano y tomillo a 100 mg/L. La cafeína presente en cacao, café, nuez de cola, yerba mate y té, inhibe el crecimiento de las levaduras. Sin embargo, las levaduras casi no son afectadas por 20 mg de taninos/mL (Davidson 1997). El agua desionizada con 0,188 mg ozono/L causa la reducción instantánea en 5 unidades logarítmicas del número de células vivas por mL, de la levadura Z. bailii (Restaino et al. 1995)

III.- OBJETIVOS:

  • 3.1 Objetivos generales:

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Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular continuo en quimiostato empleando una cepa de Kluyveromyces marxianus ATCC-

16045

  • 3.2 Objetivos específicos:

Diseñar medio de cultivo.

Activar células y desarrollar el inóculo.

Obtener la curva característica del cultivo continuo considerando al menos cinco estados estacionarios.

Obtener

y

caracterizar

un

estado

estacionario

bajo

limitación

por

nitrógeno.

Perturbar un estado estacionario mediante aumento de la concentración del nutriente limitante en la alimentación y su seguimiento hasta el nuevo estado estacionario.

Determinar la velocidad específica máxima de crecimiento mediante operación de lavado.

IV.- FUNDAMENTO TEÓRICO

4.1 Las levaduras : Son los microorganismos más antiguamente conocidos, mejor estudiados y generalmente mejor aceptados por los consumidores. Las levaduras son raramente tóxicas o patogénicas y pueden ser utilizadas en la alimentación humana. A pesar de que su contenido de proteínas no excede el 60%, su concentración de aminoácidos esenciales tales como la lisina, el triptofano y la treonina es satisfactoria, aunque tiene un bajo contenido de metionina y cisteina. Las levaduras son muy ricas en vitaminas (grupo B) y su contenido en ácidos nucleicos es bajo ya que está en el rango de 4 a 10%.

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En cuanto a su tamaño las levaduras son más grandes que las bacterias, lo que facilita la separación.

CUADRO DE CLASIFICACION

Género

Especies mas frecuentes

 

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyce unisporus

LEVADURAS

Candida kefir

Kluyveromyces marxianus var.

 

marxianus.

Características
Características

Levaduras no fermentadoras de la lactosa, que producen alcohol y

CO 2 a partir de glucosa.

Levaduras fermentadoras de la lactosa. Responsables de formación de CO y contribuyendo al característico sabor y
Levaduras
fermentadoras
de
la
lactosa.
Responsables de formación de CO
y contribuyendo al característico
sabor y aroma.
2

Fuente : SCHENEIDER, A; MERKLE, R.; CARVALHO, M.; JONAS, R.; BURLAN, S. Oxygen tranfer on b galactosidase production by Kluyveromyces marxianus using Sugar Cane molasses as Carbon Source. Biotechnol. Letters. 23 (7):547-550. 2001

4.1.1 Levaduras (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045) Estas levaduras pertenecen a la división Ascomycotina. Las levaduras de este género se reproducen por gemación multilateral, es una de las levaduras que más abunda en los productos lácteos, son los microorganismos más antiguamente conocidos, mejor estudiados y generalmente mejor aceptados por los consumidores. Las levaduras son raramente tóxicas o patogénicas y pueden ser utilizadas en la alimentación humana. A pesar de que su contenido de proteínas no excede el 60%, su concentración de aminoácidos esenciales tales como la lisina, el triptofano y la treonina es satisfactoria, aunque tiene un bajo contenido de metionina y cisteina. Las levaduras son muy ricas en vitaminas (grupo B) y su contenido en ácidos nucleicos es bajo ya que está en el rango de 4 a 10%. En cuanto a su tamaño las levaduras son más grandes que las bacterias, lo que facilita la separación. Las levaduras son hongos unicelulares, con una morfología característica esférica u ovalada.

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Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Figura 4.1.A : células de levadura Kluyveromyces marxianus s de

Figura 4.1.A : células de levadura Kluyveromyces marxianus s de agar placas petri usado para la inoculación de glucosa media

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Figura 4.1.A : células de levadura Kluyveromyces marxianus s de

Figura 4.1.B: células de lavadura Kluyveromyces marxianus en medio de glucosa media bajo condiciones aerobicas - shaker Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST STRAIN Erika Guimarães Madeira Reeves B.S., Louisiana State University, 2001 May 2004

Las levaduras se hallan ampliamente distribuidas en la naturaleza y se encuentran frecuentemente en forma de polvillo blanco que cubre los frutos y las hojas.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Figura 4.1.A : células de levadura Kluyveromyces marxianus s de

4.1.2 Composición típica de las levaduras

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Algunos de estos usos están basados en la composición de las levaduras. Los componentes principales de la biomasa de levadura están presentados en la siguiente tabla:

Componentes

%

Componentes

%

Proteínas

45,0-55,0

Calcio

0,6-1,3

Hidratos de carbono

25,0-35,0

Fósforo

1,4-1,7

grasas

2,0-5,0

Potasio

1,2-1,9

Cenizas

6,0-8,0

Magnesio

0,1-0,2

Hierro

9,3-35,0 mg/%

Cobre

2,0-13,4 mg/%

Molibdeno

1,3-12,3 mg/%

Cinc

3,3-16,3 mg/%

Fuente: Departamento de Investigación Agosto 2005

Alrededor del 70% del nitrógeno total de las levaduras esta en forma de proteínas, el 8 - 10% como purina y el 4% como pirimidina. El resto esta en forma de aminoácidos y nucleótidos. Por ejemplo, analizando el extracto de la levadura Saccharomyces cerevisiae, que se usa en la industria alimentaria, se puede observar el alto contenido de aminoácidos esenciales. Esta característica de la levadura S. cerevisiae se utiliza para la producción del complemento dietario.

Aminoácidos

%

Aminoácidos

%

Lisina

8.2

Valina

5.5

Histidina

4.0

Isoleusina

5.5

Arginina

5.0

tirosina

5.0

Leucina

7.9

   

Fuente: Departamento de Investigación Agosto 2005

4.1.3 Importancia de la levadura Kluyveromyces marxianus:

  • a) Obtención de la inulinasa , se sabe que la inulinasa es una enzima que es utilizada para

la hidrolisis de la inulina en una única etapa, obteniéndose productos con 95% de frutosa

esta puede ser obtenida de plantas o através de microrganismos como bactérias, hongos o levaduras. Las levaduras Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 e NRRL Y-7571 es de gran interes industrial debido las características fisiológicas de accecibidad.

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b) Obtención de la lactasa o b-galactosidasa es una enzima exclusivamente intracelular en Kluyveromyces marxianus ATCC 8554, es una enzima que ha despertado gran interés biotecnológico por razones básicamente nutricionales e industriales. La enzima causa la

hidrólisis del enlace b-1,4 de la lactosa hasta sus monómeros glucosa y galactosa, originando un producto con mayor poder edulcorante. Los jarabes obtenidos de esta hidrólisis sirven como sustituto del jarabe de maíz o sacarosa en las industrias de heladerías, reposterías y panaderías; además su adición a productos lácteos como leche, yogurt, crema agria y mantequilla mejora el sabor sin que ocurra un incremento calórico, beneficiando el consumo en individuos con intolerancia a la lactosa. La hidrólisis enzimática de la lactosa del suero permite el aprovechamiento de este subproducto de la industria láctea, el cual se ha convertido en un grave problema de contaminación ambiental, debido a que generalmente se descarga en cuerpos de aguas, esto ha conllevado a que actualmente existe una amplia información sobre la b-galactosidasa obtenida de diferentes fuentes y donde se han considerado aspectos como selección de géneros, condiciones de cultivo, procedimientos de extracción, purificación, estabilidad, obtención de plásmidos y mutantes, entre otras . Su aplicabilidad involucra mayoritariamente sistemas alimenticios, por lo que resulta idóneo trabajar con enzimas generalmente reconocidas como seguras (GRAS) y aceptadas por agencias de control de alimentos y drogas como la Food and Drug Administration (FDA). Actualmente el estatus GRAS es validado sólo para las lactasas de

Aspergillus níger, Aspergillus orizae, Kluyveromyces lactis y Kluyveromyces marxianus

[9]. La lactasa más conveniente para utilizar en leche, productos lácteos y sueros dulces es

la proveniente del género Kluyveromyces, donde representa un producto estrictamente intracelular .

Varios métodos han sido usados para solubilizar este tipo de enzimas, dependiendo de su localización dentro de la célula, intenciones de uso y estabilidad; los métodos mecánicos son predilectos en aplicaciones a gran escala, pero requieren alta inversión, costos operacionales y además el extracto obtenido resulta cargado de fragmentos celulares, sumando así mayor grado de dificultad al momento de purificar la enzima. La autólisis no es un método apropiado, porque requiere de temperaturas que comprometen la estabilidad de la enzima y los detergentes. son difíciles de remover de las preparaciones enzimáticas.

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Uno de los métodos más utilizados para la extracción de la b-D-galactosidasa a partir de levaduras es el uso de solventes orgánicos como el tolueno, cloroformo y alcohol isoamílico. El análisis por MET de las células de K. marxianus reveló que el tolueno ejerce un efecto permeabilizante, ya que ninguna célula mostró rompimiento de la pared celular. En la FIG. 1 se observa el efecto plasmolizante producto del tratamiento con el solvente, manifestado por la formación de pliegues de la membrana (_), vesícula en el espacio intra y extracelular (), lo cual puede explicarse por la salida de compuestos marcadores del espacio intracelular y corroborado por la valoración de la actividad de la enzima. También se observa una desorganización de los organelos citoplasmáticos con ausencia de núcleo y mitocondrias y la presencia de fragmentos de membrana () que podrían ser considerados como restos de organelos dentro de un citoplasma que se observa muy denso.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Uno de los métodos más utilizados para la extracción de

Fig : Muestra de células de Kluyveromyces marxianus ATTC 8554 tratada con tolueno en la extracción de enzimas

c) Obtención de concentrados proteicos: Se puede obtener un concentrado proteico a partir de biomasa microbiana Kluyveromyces marxianus var. marxianus cultivada en suero lácteo desproteinizado. El suero lacteo que se ha propuesto su empleo como sustrato de fermentación para microorganismos capaces de asimilar la lactosa, tales como la levadura Kluyveromyces marxianus var. marxianus, con el propósito de obtener biomasa microbiana, también conocida como “proteína unicelular” . Esta tiene un contenido proteico que oscila entre 40 y 80% en base seca y su calidad la asemeja más a la proteína animal que a la vegetal . Sin embargo, el uso de proteína unicelular para consumo humano presenta importantes limitaciones: la presencia de las paredes celulares, pues éstas reducen la biodisponibilidad de las proteínas, además contienen factores antigénicos y alergénicos; el alto contenido de ácidos nucleicos (básicamente ARN) los cuales pueden ocasionar trastornos renales y gota, y por último las reducidas propiedades funcionales que exhibe la biomasa celular deshidratada . Estas limitaciones pueden superarse mediante la elaboración de concentrados proteicos, tal y como ha sido descrito para Candida tropicalis y para Kluyveromyces

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marxianus var. marxianus utilizando la extracción alcalina y precipitación isoeléctrica; sin embargo, esto no es suficiente, dado que los niveles de ácidos nucleicos deben ser reducidos, bien sea por métodos químicos o métodos enzimáticos. Entre los métodos químicos, uno de los más aceptados es la fosforilación con oxicloruro de fósforo o alternativamente con trimetafostato de sodio, donde se han obtenido concentrados proteicos a partir de Saccharomyces cerevisiae, los cuales han sido luego deshidratados a través de métodos sofisticados, como la liofilización o el secado por aspersión, respectivamente. La suplementación de productos cárnicos y de panadería con concentrados proteicos bajos en ácidos nucleicos, mejora las propiedades funcionales de dichos alimentos. Se ha ensayado la incorporación de harinas y autolizados obtenidos de Candida utilis y Saccharomyces cerevisiae en la elaboración de los mencionados productos con excelentes resultados .

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS marxianus var. marxianus utilizando la extracción alcalina y precipitación isoeléctrica;

d) Obtención de etanol :

Tabla: Resumen de artículos de trabajo para parámetros de crecimiento cinético con especies de Kluyveromyces en la obtención de etanol:

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Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST STRAIN Erika(azúcar de mesa) es un disacárido de glucosa y fructosa. Se sintetiza en plantas pero no en animales superiores. No contiene ningún átomo de carbono anomérico libre, puesto que los carbonos anoméricos de sus dos unidades monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí covalentemente 12 " id="pdf-obj-11-8" src="pdf-obj-11-8.jpg">
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST STRAIN Erika(azúcar de mesa) es un disacárido de glucosa y fructosa. Se sintetiza en plantas pero no en animales superiores. No contiene ningún átomo de carbono anomérico libre, puesto que los carbonos anoméricos de sus dos unidades monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí covalentemente 12 " id="pdf-obj-11-10" src="pdf-obj-11-10.jpg">

Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST STRAIN Erika Guimarães Madeira Reeves B.S., Louisiana State University, 2001 May

4.2 Sacarosa.

La sacarosa (azúcar de mesa) es un disacárido de glucosa y fructosa. Se sintetiza en

plantas pero no en animales superiores. No contiene

ningún

 

carbono anomérico libre,

puesto que los carbonos anoméricos de sus dos

unidades monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí covalentemente

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mediante un enlace O-glucosídico. Por esta razón, la sacarosa no es un azúcar

reductor y tampoco posee un extremo reductor.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS mediante un enlace O-glucosídico. Por esta razón, la sacarosa noazúcar reductor y tampoco posee un extremo reductor. 4.3 Quimiostato: El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución ( D ) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos parámetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación: Donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por consiguiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el número de volúmenes de reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo. Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de substrato está dentro del reactor. Tanto la tasa de crecimiento μ como el nivel de población microbiana están relacionados con el valor de D . 13 " id="pdf-obj-12-16" src="pdf-obj-12-16.jpg">

4.3 Quimiostato:

El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución (D) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos parámetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación:

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS mediante un enlace O-glucosídico. Por esta razón, la sacarosa noazúcar reductor y tampoco posee un extremo reductor. 4.3 Quimiostato: El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución ( D ) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos parámetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación: Donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por consiguiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el número de volúmenes de reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo. Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de substrato está dentro del reactor. Tanto la tasa de crecimiento μ como el nivel de población microbiana están relacionados con el valor de D . 13 " id="pdf-obj-12-24" src="pdf-obj-12-24.jpg">

Donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por consiguiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el número de volúmenes de reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo. Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de substrato está dentro del reactor. Tanto la tasa de crecimiento μ como el nivel de población microbiana están relacionados con el valor de D.

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Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Fuente: Microbiología General, Cultivo de microorganismos. A velocidades de D

Fuente: Microbiología General, Cultivo de microorganismos.

A velocidades de D muy bajas, pequeños incrementos de la velocidad de dilución producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan

más nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento (μ) según lo indicado en la ecuación de Monod. La velocidad de crecimiento aumenta (μ aumenta y τ disminuye) cuando la energía aportada por los nutrientes entrantes supera la energía de mantenimiento de los microorganismos del cultivo.

A valores bajos de D

la concentración de nutriente limitante (

S
S

) en el efluente

es
es
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Fuente: Microbiología General, Cultivo de microorganismos. A velocidades de D

baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo

que alcanzan unas poblaciones de gran tamaño creciendo a una tasa (μ) baja porque se encuentran en condiciones de limitación de nutrientes (S<Ks). A valores más altos de D no todo el nutriente es consumido por los microorganismos del cultivo por lo que S en el efluente aumenta.

En una situación de equilibrio, velocidad de dilución D se iguala a la tasa de crecimiento μ, de forma que el control de la tasa de dilución (control del flujo f) permite regular la tasa de crecimiento y, de esa forma, la situación fisiológica del

organismo.

A valores de D> μmax

ser eliminado
ser eliminado

, el microorganismo

no
no

es capaz de

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crecer lo

suficiente como para evitar

del cultivo por el rebosadero y, por

consiguiente

S alcanza un valor máximo

(el nutriente limitante no es consumido en

el cultivo y la concentración del substrato en el efluente es igual a la del substrato en

el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos (μ) dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece). La evolución de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuación siguiente:

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Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Microbiología General, Cultivo de microorganismos. 4.4.- Metabolismo: 4.5 Factores Fisicoquímicos( www.unsa.edu.ar ) ∑ El pH es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos ya que estos sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. 15 " id="pdf-obj-14-8" src="pdf-obj-14-8.jpg">

Microbiología General, Cultivo de microorganismos.

4.4.- Metabolismo:

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Microbiología General, Cultivo de microorganismos. 4.4.- Metabolismo: 4.5 Factores Fisicoquímicos( www.unsa.edu.ar ) ∑ El pH es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos ya que estos sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. 15 " id="pdf-obj-14-14" src="pdf-obj-14-14.jpg">

4.5 Factores Fisicoquímicos que Afectan la Rapidez de Crecimiento.

Dentro de los factores ambientales que afectan el crecimiento de las levaduras

tenemos:

La temperatura puede, en parte, determinar la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microorganismos, además las variaciones de temperatura también pueden influir en los procesos metabólicos y en la morfología celular. Pelczar et al. (1977) reportó, cada especie de levadura crece a la temperatura que esta dentro de cierto límite de 28 a 48 °C ejemplo el Kluyveromyces marxianus crece a 48 ° C. (www.unsa.edu.ar)

El pH es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos ya que estos sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica.

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Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. El decremento del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta .Por consiguiente, es necesario controlar el pH de los cultivos para evitar que un descenso excesivo pueda producir la auto esterilización del cultivo. Por ejemplo el pH óptimo de crecimiento de las levaduras esta en el rango de 3 a10. (www.unsa.edu.ar)

El potencial redox y el oxígeno son factores determinantes del crecimiento y del metabolismo del cultivo. El potencial redox del medio de cultivo nos indica su capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno, O 2 . Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que se produzca el crecimiento. Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos) o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácticas o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios). El rendimiento Y x/s de los procesos fermentativos es menor que el de los respiratorios: las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando.

Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR). El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl) donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la solvatación

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de los iones de la sal disuelta. En este último caso, la actividad de agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada. La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes:

bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80.

La concentración de los compuestos que se necesitan para el crecimiento es importante porque puede provocar una disminución de la tasa de crecimiento a causa de la alta presión osmótica del medio.

4.6 Extracto de Levadura

Los extractos de levadura son excelentes para muchos microorganismos. Son producidos a partir de la levadura de panadería mediante autólisis a 50 – 55 ºC o

mediante plasmólisis en presencia de altas concentraciones de NaCl. El extracto de levadura contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. Muestra algunos análisis típicos, la composición del extracto varía parcialmente debido a que los substratos utilizados para el cultivo de las levaduras afectan la calidad del extracto de levadura.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS de los iones de la sal disuelta. En este último

Tabla N° xxxx. Composición del Extracto de Levadura.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS de los iones de la sal disuelta. En este último

17

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Extracto de Levadura producido mediante

Autólisis

Plasmólisis con NaCl

Composición (%) Materia seca Nitrógeno total Proteína (N*6.25) NaCl Aminoácidos (%) Alanina Ácido aminobutírico Arginina Asparagina
Composición (%)
Materia seca
Nitrógeno total
Proteína (N*6.25)
NaCl
Aminoácidos (%)
Alanina
Ácido aminobutírico
Arginina
Asparagina
Cistina
Ácido glutámico
Glicina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Ornitina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Tirosina
Valina
Contenido en vitaminas (ppm)
Tiamina
Riboflavina
Piridoxina
Niacinamida
Ac. Pantoténico
70
80
8.8
7.4
55
46
< 1
18
3.4
2.3
0.1
0.1
2.1
1.1
3.8
3.1
0.3
0.2
7.2
5.1
1.6
1.6
0.9
0.8
2.0
1.6
2.9
2.3
3.2
2.9
0.5
0.5
0.3
0.9
1.6
1.6
1.6
1.5
1.9
1.5
1.9
1.4
0.8
0.5
2.3
1.9
20-30
10-15
50-70
50-70
25-35
20-30
600
100
200
350

Fuente: Ohly Gmbh y Hamburg, citado en Wulf C., 1989.

18

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

  • 4.7 Antiespumantes:

    • 4.7.1 Silicona liquida: El Dimetilpolisiloxano (Simeticona), es una silicona inerte

derivada del silicio desprovista de acción sistémica que desarrolla un efecto espumolítico-

antiflatulento. Químicamente es un polímero linear de siloxanos metilados, con un número de unidades entre 200 y 350 dependiendo de su viscosidad.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS 4.7 Antiespumantes: 4.7.1 Silicona liquida: El Dimetilpolisiloxano (Simeticona) , es
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS 4.7 Antiespumantes: 4.7.1 Silicona liquida: El Dimetilpolisiloxano (Simeticona) , es
  • 4.8 Crecimiento microbiano en medio líquido

Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano:

19

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Fase lag o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.

Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio. La evolución del número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS ∑ Fase lag o de adaptación durante la que los

Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano.

20

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales.

Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables

del cultivo.

4.9 Cultivo por Lotes

La fermentación por lotes se refiere a un sistema completamente cerrado donde todos los materiales requeridos están cargados en el fermentador, previamente desinfectados antes del proceso de fermentación y los residuos removidos al final.

Los únicos materiales extraídos y agregados durante el curso de una fermentación por lotes son el intercambio de gases y las soluciones de control de pH, respectivamente. En este modo de funcionamiento, las condiciones están cambiando continuamente con el tiempo, y el fermentador es un sistema de estado inestable.

La ventaja principal

es el menor riesgo de contaminación con respecto a otros

procesos de fermentación (cultivo continuo y cultivo por lote alimentado)

La desventaja principal

del cultivo por lotes es el

alto tiempo improductivo entre

lotes,
lotes,

comprendiendo

la

carga

y

descarga

del

fermentador,

la

limpieza,

esterilización y procesos de salida. Otra desventaja es la

inhibición del crecimiento

por metabolitos primarios, secundarios y por la ausencia de nutrientes.

  • 4.10 Cultivo por Lote Alimentado En el cultivo por lote alimentado, el inicio es una fermentación por lotes y

posteriormente se alimenta con un nutriente limitante o un precursor continuamente

o intermitentemente, durante el curso de la fermentación, a modo de controlar la

cantidad disponible del mismo en el medio.

Al final del ciclo el fermentador puede

vaciarse parcialmente y repetir un nuevo ciclo.

Básicamente, el crecimiento de las células se da bajo un cultivo por lotes durante algún tiempo, normalmente hasta cerca del extremo de la fase de crecimiento exponencial. A estas alturas, el biorreactor se alimenta con una solución de nutrientes. Este alimento debe ser bastante equilibrado para persistir el crecimiento de los microorganismos en una proporción de crecimiento específica deseada y

21

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

reduciendo la producción de derivados simultáneamente (ése puede ser crecimiento

o producción del producto inhibitorio). Es el proceso más usado en la producción de metabolitos complejos.

La ventaja de esta técnica es

la producción de densidades celulares altas debido a la

extensión de tiempo (particularmente importante en la producción de productos

crecimiento-asociados) por lo que existe un

mayor rendimiento y productividad.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS reduciendo la producción de derivados simultáneamente (ése puede ser crecimiento

Otra ventaja es reducir la formación de productos secundarios formados cuando hay

exceso de nutrientes (sobrealimentación).

La

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS reduciendo la producción de derivados simultáneamente (ése puede ser crecimiento

desventaja es que requiere

instrumentación adicional para el control

,

operarios
operarios
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS reduciendo la producción de derivados simultáneamente (ése puede ser crecimiento

entrenados para operar el biorreactor y la

toma de decisiones,

especialmente cuando

no se dispone de elementos de control automático. Otra desventaja es que existen

riesgos de contaminación del medio de cultivo.

  • V.- MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES: 5.1 Diseño del medio de cultivo y preparación de los medios.

5.1.1 Medio de mantención y resiembra del microorganismo.

5.1.1.1 Materiales y equipos

Balanza analítica Olla a presión Mechero Bunsen Pipetas de 10 ml. Aza bacteriológica Tubos de ensayo con tapas (8 tubos) Varilla de vidrio Matraz erlenmeyer (250ml) Guantes. Espátula Probeta graduada Capachos de papel

22

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

5.1.1.2 Reactivos

Muestra: Kluyveromyces marxianus ATCC-16045

Sustrato: sacarosa

Agua destilada.

Extracto de levadura.

Peptona.

Agar.

5.1.1.3Procedimiento

Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de cultivo de mantención para Kluyveromyces marxianus ATCC-16045. (Tabla Nº 1 de anexos)

Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 de anexos se pesan las

cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado. Medir en una probeta graduada 50 ml de agua destilada.

Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer

adicionando el agua destilada.

Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el

matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.

Preparar

8

tubos

de

ensayo

con

tapa,

y

en

caliente

adicionar 6ml de la mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos.

Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la

olla a presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases.

Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a

partir

de

ello

controlar

de

15

a

20

minutos,

finalizando

la

esterilización.

 

23

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la

olla, luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

Luego preparamos nuestra área de trabajo, desinfectando

con alcohol. para tener una área estéril

prendemos el mechero cinco

minutos antes

de

realizar

el

resiembro

con

el

Kluyveromyces

marxianus

Abrimos los tubos de ensayo cerca al mechero bunsen ,

flameando

para

aza calentado al rojo vivo esperamos un momento que se

,

evitar

la

contaminación

teni8endo

el

bacteriológica

enfríe .

Sacamos 2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar ,

flameamos y cerramos el tuvo y así en los 8 tubos con agar

5.1.2 Medio de activación

  • 5.1.2.1 Materiales y equipos

Matraz de 250ml.

Matraz de 125 ml

tubos de ensayo con tapa

Algodón

Gasa

Varilla de vidrio

Balanza analítica

Espátula

Agua destilada

Pinzas

Guantes

Shaker

Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

Olla a presión

24

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

 

Pipetas

Capachos de papel

PHmetro

  • 5.1.2.2 Reactivos

Componentes según Tabla Nº 2

Alcohol

HCl cc.

  • 5.1.2.3 Procedimiento

Pesar los componentes descritos

en

la

tabla Nº

2

de

anexos. Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y sales en un tubo de ensayo (enrazar hasta 14 ml con agua destilada), la sacarosa en un matraz de 125 ml (14 ml con agua destilada).

Previamente a la esterilización utilizar NaOH y acido

ortofosforico para ajustar el pH a 5.0 de la solución que contiene

sacarosa. Mezclar estos componentes para el medio de activación “bajo mechero” para evitar la contaminación.

Tener

el

resiembro

activado

en

una estufa por un

promedio de 1.5 a 2 horas.

 

Sacamos tres

azadas

y colocamos en

el

medio de

activación.

 

Colocar en el shaker hasta que la concentración sea de

3gr/l para un tiempo de 12h.

25

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Luego se inocula en un matraz de 250 ml con un medio

liquido de

136

ml que contiene sacarosa, sales

y extracto

de

levadura.

5.1.3Medio de fermentación y proliferación

  • 5.1.3.1 Materiales y equipos

Matraz de 1 L

Matraces de 125 ml

Varilla de vidrio

Capachos de papel

Balanza analítica

pHmetro

  • 5.1.3.2 Reactivos

Según la tabla Nº 3 de anexos Agua destilada

Alcohol

  • 5.1.3.3 Procedimiento

Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 3 de anexos.

Se diluye completamente cada compuesto con agua destilada de la siguiente manera:

Sacarosa en un matraz de 1 L con 400 ml de agua destilada

Extracto de levadura y el sulfato de amonio en un matraz con 212 ml. de agua destilada Las sales, K 2 HPO 4 , MgSO 4 . 7H 2 O

26

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Regular

el

þH de

la solución

de sales

con acido

ortofosforico e hidróxido de sodio hasta un pH de 5.0

 

Esterilizar las diluciones por separado.

Dejar enfriar

Mezclar

el extracto

con el azúcar (sacarosa)

y

adicionar el inoculo.

 

Colocar en Baño Maria con el agitador magnético e

iniciar el cultivo continuo con adición de nutrientes

5.1.4 Medio para el quimiostato V= 680 (viernes 29/02/08 8:00m.)

Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 4 de anexos):

sacarosa, 220 ml de agua destilada en el quimiostato

Solución de sales MgSO 4 .7H 2 O y K 2 HPO 4 (NH 4 ) 2 SO 2 en un matraz de 250

  • ml con 100 ml de agua destilada

Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100

  • ml de agua destilada

Se taparon, esterilizaron 121 °C tiempo 20 minutos y se dejo enfriar hasta su posterior uso.

  • 5.1.5 Medios para el flujo de alimentación de los estados estacionarios V=2.4 L (viernes 31/02/08 9:00 am)

Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 5 de anexos):

Sacarosa,220 ml de agua destilada en un botellón ámbar de 2.5 L

27

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Solución de sales 11.5 ml, 100 ml de tampón, MgSO 4 .7H 2 O y K 2 HPO 4 c

en un matraz de 125 ml Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100

ml de agua destilada. Se taparon, esterilizaron 121 °C tiempo 20 minutos y se dejo enfriar hasta su posterior uso.

  • 5.2 Medio bajo limitación por nitrógeno:

Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla de anexos 7):

sacarosa, y agua destilada en un botellón ámbar de 2.4 L

Solución de sales, tampón, MgSO 4 .7H 2 O y K 2 HPO 4 (NH 4 ) 2 SO 2 en un

matraz de 125 ml

Sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100 ml de agua destilada

Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso.

  • 5.3 Medio para perturbación con alta concentración de sacarosa:

Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 8 de anexos):

sacarosa, 220ml de agua destilada en un botellón ámbar de 2.4 L

Solución de sales ml, tampón, MgSO 4 .7H 2 O y K 2 HPO 4 (NH 4 ) 2 SO 2 en un matraz de 125 ml

Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100

ml de agua destilada Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso.

  • 5.4 Medio para el lavado

Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 9 de anexos):

sacarosa, tampón y ml de agua destilada en un botellón ámbar de 2.4L

28

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Solución de sales ml, ml de tampón, MgSO 4 .7H 2 O y K 2 HPO 4 (NH 4 ) 2 SO 2 en un matraz de 125 ml

Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100

ml de agua destilada Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso.

  • 5.5 Puesta en marcha del quimiostato

De la cinética seguida en los matraces se determino el tiempo para las 2/3 partes del crecimiento logarítmico para dar inicio al cultivo continuo

  • 5.6 Obtención de la curva característica de crecimiento de una levadura

Se trabajo con 5 e.e. para la obtención de esta curva, es haciendo variar la velocidad de dilución de acuerdo al tiempo calculado en el Anexo Nº ...

Estados estacionarios:

dx

dt

;

ds

dt

;

dp

dt

= 0

Considerando que en estado estacionario se cumple que:

µ=D

5.7 Obtención y caracterización de un estado estacionario bajo limitación por nitrógeno.

Nutriente limitante: nitrógeno

 

Concentración celular final de 3g/l

Para

este

estado

estacionario

consideraremos

los

siguientes

datos:

con

la

experiencia 4

 

29

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

 

= 0.2206 h -1 F = 2.5 ml/min t = 14 h *V = 2.4 L

 

*Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentación.

 

5.8

Perturbación

de

un

estado

estacionario

mediante

aumento

de

la

concentración del nutriente limitante en la alimentación.

Habiéndose obtenido los 5 estados estacionarios en el crecimiento de la levadura, se perturba este estado aumentando la concentración de sacarosa (Nutriente limitante) en la alimentación.

Este nuevo flujo trabajo una concentración de sacarosa = 15 g/l. Para este estado estacionario consideraremos los siguientes datos:

= 0.2650 h -1

F = 3.00 ml/min

t = 12 h

*V = 2.4 L *Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentación.

Se tomaron 11 muestras cada hora

  • 5.9 método de lavado Se aumento el flujo para determinar el max

D = 1.0588 h-1

30

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

F = 12 ml/min

t = 3 h V L = 680 ml Donde V L = Volumen del Quimiostato

*V = 2.4 L *Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentación.

Se tomaron 11 muestras cada hora

VI.- RESULTADOS Y DISCUSION:

1
1
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS F = 12 ml/min t = 3 h V =

La Inoculación Kluyveromyces Marxianus Del Fue De La Siguiente Manera

1

  • SHAKER

  • SHAKER

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS F = 12 ml/min t = 3 h V =
  • 2

    • SHAKER

2
2
  • SHAKER

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS F = 12 ml/min t = 3 h V =

Muestreo para

seguimiento de la

cinética del cultivo por lote

  • 3

SHAKER
SHAKER

Muestreo para

obtención de la Curva de calibrado de

biomasa y sustrato

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS F = 12 ml/min t = 3 h V =
31
31

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

1.- EL CULTIVO POR LOTE

Del matraz N° 3 se extrajo las muestras para realizar la curva de calibrado o curva patrón para biomasa que nos fue proporcionado por el profesor del curso y azucares reductores por método rápido DNS presentamos los datos en el cuadro Nº 2 , obteniéndose así los resultados :

Se tomaron 20 ml, cada muestra de 5 ml, se midió absorbancia 540 nm y para la biomasa de 640 nm se centrifugo para hallar peso seco.

METODO D.O (Datos para la curva de calibrado para la concentracion celular Biomasa):

CUADRO Nº 1: DATOS PARA LA CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA

32

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

 

ml

ml de

Absorbancia

Capachos

Capachos

Celulas

X

Capacho

Dilución

Caldo

H 2 O

(640nm)

(gr)

+ Celulas

secas (g)

(g/L)

 
  • 1 01:01

5

0

1.23

0.2156

  • 0.2244 0.0088

 

1.76

 
  • 2 01:02

2.5

2.5

0.9

0.2126

  • 0.2191 0.0065

 

1.3

 
  • 3 01:05

1

4

0.487

0.2046

  • 0.2072 0.0026

 

0.52

 
  • 4 01:10

0.5

4.5

0.272

0.2082

  • 0.2094 0.0012

 

0.24

GRAFICA Nº1: CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA

Curva de Calibrado de Biomasa (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045) 1.4 1.2 y = 0.6094x + 0.1403 R
Curva de Calibrado de Biomasa (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045)
1.4
1.2
y = 0.6094x + 0.1403
R 2 = 0.9955
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
CC de Biomasa (G/L)
Absorbancia (640nm)

Obteniéndose un

- - =0.452 h =0.452 h m m
-
-
=0.452 h
=0.452 h
m
m

33

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

y = 0.6094x + 0.1403

R2 = 0.9955

El tiempo de muestreo para la fermentación del cultivo por lotes fue de 10 hr y se ha

considerado los 2/3 del crecimiento logarítmico, porque a este tiempo las células son más

viables y están en pleno crecimiento exponencial, pues es en ese momento en la que se

puede dar inicio al cultivo continuo. La inoculación al quimiostato es la primera etapa

para dar inicio a este cultivo, a esta etapa se le llama puesta en marcha y con ella

empezara el conteo hasta luego de las 4h Como se muestra a continuación para un m

=0.452h -1 obtenido por el profesor.

C 1 V 1 = C 2 V 2

2 (g/l)*20(ml)= X 0 *680(ml)

0.0588 g/l= X 0

Ln(X / X 0 ) =

m t

Ln((3g/l)/(0.0588g/l)) = 0.452h -1 t

3.777=t

T=4h

En las que las células se encuentren en pleno crecimiento. En la experiencia las células

inoculadas tuvieron una absorbancia de 0.206 y luego en el quimiostato tardaron 4 horas

hasta alcanzar los dos tercios de su crecimiento logarítmico pues durante este lapso de

tiempo las células se adaptan al nuevo medio siendo este el momento ideal para iniciar el

cultivo continuo

La determinación experimental de este momento se logro gracias a la medición de la

absorbancia, cuyo valor al cabo de las 4 horas fue de 0.830 , que al comprobarla con la

absorbancia del cultivo por lote existe una semejanza significativa con lo obtenido en la

34

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

cinética

de

crecimiento

en

el

cultivo

por

lotes.

2/3 T
2/3 T

Fuente : instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente.

A. METODO DNS (Datos para la curva de calibrado de sacarosa (6 g/L) )

CUADRO Nº 2: DATOS PARA LA CURVA PATRON DE SACAROSA

ml de caldo

 

C 2 de Sacarosa

 

TUBOS

V

1

ml de H 2 O

(g/L)

ABSORBANCIA

1

2

0

 
  • 6 0.951

2

 
  • 1.6 0.4

 
  • 4.8 0.646

3

 
  • 1.2 0.8

 
  • 3.6 0.597

4

1

1

 
  • 3 0.488

5

 
  • 0.8 1.2

 
  • 2.4 0.317

35

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

6 0.4 1.6 1.2 0.21 7 0.2 1.8 0.6 0.07 8 0 2 0 0 GRAFICA
6
0.4
1.6
1.2
0.21
7
0.2
1.8
0.6
0.07
8
0 2
0
0
GRAFICA Nº2: CURVA PATRON DE LA SACAROSA
Curva de Calibrado de Sacarosa
1
0.9
y = 0.1528x - 0.0028
R 2 = 0.9785
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
CC de Sacarosa (g/L)
Absorbancia (540 nm)
  • 2.- CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO:

2.1PUESTA EN MARCHA DEL QUIMIOSTATO

La puesta en marcha se realiza luego de montaje del quimiostato. Tal como se muestra en

la figura

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS 6 0.4 1.6 1.2 0.21 7 0.2 1.8 0.6 0.07

º

36

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS º Siendo las 8: 00 am del día viernes se
º
º

Siendo las 8: 00 am del día viernes se inoculo el matraz N° 3 en el quimiostato se saco

una muestra y se leyó la absorbancia dando ABS = 0.206, lo cual indica que el inicio del

cultivo continuo aun no debe empezar.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS º Siendo las 8: 00 am del día viernes se

37

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Toma de muestra para la lectura de la absorbancia.

Por lo que luego de aproximadamente 4 horas se toma una muestra mas dando la ABS.=

0.830 esto indica que se debe dar inicio al cultivo continuo.

2.1 parámetros para cultivo continuo.

Las variables que comúnmente se controlan en un cultivo continuo son: el pH, la

temperatura, la cantidad de espuma formada, la velocidad de agitación, etc( Instituto

Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente, A)

pH.- En trabajo realizado en el laboratorio se trabajo con un pH inicial de 5.88 y se

termino con un pH de 5.5 contrastando de acuerdo a la teoría las levaduras como

Kluyveromyces marxianus toleran mejor altas concentraciones de azúcar que de sal, pero

toleran un rango de entre 3 y 10, pero prefieren un medio ligeramente ácido con un pH de

4,5 a 6,5.Kluyveromyces marxianus (1)

La temperatura. En trabajo realizado en el laboratorio se trabajo con una temperatura de

baño Maria de 30 ºC; La vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, pero en el caso de

Kluyveromyces marxianus es aerobia porque es una especie fermentadora así mismo la

mayoría de las levaduras tienen una temperatura máxima de crecimiento entre 24 y 48ºC.

La temperatura optima se encuentra por lo general entre 30 – 45 ° C, (Elsevier, 1990).

La filtración.- En la practica de laboratorio se utilizo el sulfato de cobre como un

filtrador que permite eliminar las partículas en suspensión en el aire y así eliminar a los

microbios que son, generalmente, adsorbidos .La gran mayoría de partículas tienen un

diámetro comprendido entre un décimo y algunos micrones .En el aire seco, están

animadas de un movimiento browniano que les da una talla aparente diez veces superior a

su tamaño real .Es posible eliminar las gracias a dos formas diferentes de filtración.

(Scriban, R. (1984).

La agitación.- en la práctica realizada se utilizo un agitador magnético para que acelere

el contacto entre dos o varias fases. En la fermentación, la fase soporte es con frecuencia

38

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

el medio cultivo .La agitación tiene por objeto mezclar con esta base soporte varias fases

que se adicionan .Una fase sólida (especial) constituida por las células microbianas, la

operación mezcla consiste en llevar a cabo una suspensión que debe ser lo mas

homogénea posible, pero conservando la integridad de las células , en la practica se utilizo

para tener en suspensión a las células y tener una mejor distribución de los nutrientes

agregados al medio.

Una segunda fase gaseosa constituida por el gas de oxigenación para los procedimientos

aerobios .La operación en este caso es una emulsión. (Scriban, R. (1984).

Una fase liquida constituida por los reactivos que se adicionan en el curso de la

fermentación: silicona liquida, nutrimentos, soluciones para corregir el pH. La operación

que se realiza es una mezcla.

La agitación mecánica, además de realizar las operaciones de mezcla y de suspensión,

mejora la emulsión dividiéndolo las burbujas de gas introducidas haciéndolas circular en

el líquido (Scriban, R. (1984).

La producción de espumas: la formación espuma puede ser un problema serio en la

fermentación. Si se permite su formación puede bloquear los filtros de salida, estimular la

contaminación o reducir el rendimiento. Lamentablemente la mayor parte de los medios

de fermentación facilitan la formación de espuma y su reducción puede conseguirse

mecánica o químicamente.

Existen un conjunto de antiespumantes en el mercado que incluyen aceites naturales ,

alcoholes superiores,, siliconas , n- parafinas. Algunos antiespumantes son metabolisados

por los microorganismos y es necesaria la dicción regular al fermentador ; en efecto , por

diseño cuidadoso del medio el antiespumante puede ser utilizado como una fuente

adicional de carbono, frecuentemente mas eficientemente que la principal fuente de

carbono. (J BULOCK; B.KRISTIANSEN. 1991)

Durante el proceso de fermentación, puede ser tolerable en cierta cantidad, pero este llega

a un punto que es necesario reducirlas para evitar que se desborden dado los

inconvenientes y los riesgos que esto entraña.

La espuma aparece cuando la dispersión de gas en la fase liquida se estabiliza a causa de

películas liquidas resistentes que envuelven las burbujas de gas .Aparece tanto mas

fácilmente y con mayor abundancia cuando mas débil es la tensión superficial. La

temperatura, el pH y la viscosidad del fluido de fermentación juegan también un papel

importante en la formación y persistencia de espumas.

39

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Las sustancias antiespumas como los productos a base de silicones , recurre a la acción

global sobre la tensión superficial , además su elección de producto para contrarrestar en

el problema de las espumas , es debido a que este producto presenta un poder inhibidor

mínimo o nulo sobre el microorganismo que se cultiva, a comparación de medio químicos

( sustancias iónicas) .Las espumas pueden disminuir la capacidad de transferencia de

oxigeno de la instalación .Así mismo pueden provocar una especie de envenenamiento de

las interfases de intercambio gas liquido .Asimismo pueden perturbar los intercambios

celulares por envenenamiento , en este caso , de las envolturas de la célula .Se les puede

imputar un aumento del tamaño medio de las burbujas de gas en el seno del liquido , de

donde resulta un aumento de la velocidad media ascensional del gas y por consecuencia

una disminución de la retención gaseosa y del aire interfacial especifico que puede llegar

hasta el 25%.La transferencia de oxigeno es globalmente disminuida hasta el 60% , con la

consecuente e inevitable baja de productividad (Scriban, R. (1984).

Otro de los motivos de la formación de espuma es a causa de las proteínas que contiene el

extracto de levadura y los metabolitos que se van formando durante la fermentación.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Las sustancias antiespumas como los productos a base de silicones

Formación de espumas en el bioreactor

La transferencia de oxigeno.- De las burbujas gaseosas hacia los sitios de su utilización

en las células se hace en varias etapas, representa una transferencia unidireccional. Esta

transferencia se efectúa a través de varias películas, cada una de ellas ejerce cierta

resistencia .Se considera que en la interfase gas-liquido del lado gaseoso esta recubierta

de una película gaseosa ( etapa 1) y del lado liquido , de una película liquida (etapa 2),

40

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

esta ultima ejerciendo una gran influencia sobre la transferencia. El oxigeno disuelto

difunde entonces hacia las células (etapa 3 ) , al contacto de las cuales se encuentra de

nuevo a una película liquida (etapa 4 ).Finalmente el oxigeno debe penetrar a la célula

( etapa 5)se puede considerar lo que paso dentro de la célula en donde el oxigeno debe

difundir hacia el sitio donde es efectivamente utilizado para el metabolismo .En las

levaduras las enzimas respiratorias están localizadas dentro del mitocondrias. El oxigeno

debe entonces difundir en el citoplasma y atravesar la pared mitocondrial. A esto se le

agrega , el fenómeno ya considerado de la formación del micelio en pelota que hace mas

difícil aun la transferencia del oxigeno al seno del amontonamiento microbiano. El

oxigeno juega un papel fundamental en el metabolismo aerobio productor de energía,

como receptor final de los electrones y de los protones producidos en las reacciones de

oxidación. El oxigeno interviene en ciertos mecanismos de regulación del metabolismo en

forma directa, como inductor o como represor de la síntesis de enzimas respiratorias, pero

también en forma indirecta en su papel en el metabolismo energético

La instalación debe concebirse en su conjunto en forma que permita: La esterilización y el

mantenimiento de asepsia, la distribución de aire, en procesos aerobios, la reducción o

eliminación de espumas, la transferencia de fluidos y de suspensión de una cuba a

otra.

.

(Scriban, R. (1984).

Para que un microorganismo se multiplique, es necesario que se desarrolle en un medio

donde haya oxígeno, ya que este le sirve para producir energía e incrementar la oxidación

(que es una de las causas por las cuales crece). Los requerimientos de oxígeno pueden ser

expresados en términos de qo2, esta es la cantidad de oxígeno consumido por unidad de

tiempo y por unidad de biomasa, esta varia de acuerdo al microorganismo y del estado

fisiológico de las células, substratos de carbono y los parámetros fisicoquímicos.

(Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente, A)

41
41

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Medidor de oxigeno.

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS.

CUADRO Nº 3: DATOS EXPERIMENTALES DE LOS 5 ESTADOS

ESTACIONARIOS OBTENIDOS EN LA PRACTICA

Fecha

Hora

Absorbancia

pH

Responsable

Observaciones

d/m/a

(h)

640 nm

   

N° Experiencia

Cambio

29/02/2008

07:30 a.m.

0.206 (X i )

5.88

Grupo D1,2

OK

 

29/02/2008

11:30 a.m.

0.83 (X 2/3 )

4.492

Grupo D1,2

OK

 
             
         

Experiencia N°3 (19

 

01/03/2008

07:00 a.m.

0.928

5

Grupo A1

h)

Cambio de F=3 ml/min

01/03/2008

08:00 a.m.

0.817

   

F= 1.8 ml/min

Hora: 8:15 am

       

Cesar

Experiencia N°5 (12

Cambio de F=0.8

01/03/2008

07:00 p.m.

0.922

5.5

Moreno

h)

ml/min

01/03/2008

08:00 p.m.

0.785

   

F= 3 ml/min

Hora: 8:15 pm

             
         

Experiencia N°1 (43

 

03/03/2008

01:00 p.m.

Augusto

h)

1:00 pm se observa

03/03/2008

02:00 p.m.

0.975

 

B1 no se

F= 0.8 ml/min

en el frasco de alim.

03/03/2008

03:00 p.m.

0.896

 

presento

 

solidos en suspension.

             
         

Experiencia N°2 (29

 

04/03/2008

07:00 p.m.

0.866

5.5

h)

Cambio de F=3 ml/min

04/03/2008

08:00 p.m.

0.848

   

F= 1.20 ml/min

Hora 8:00 pm (Exp.

42

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

           

N°5)

             

05/03/2008

07:00 a.m.

0.937

       

05/03/2008

08:00 a.m.

         

1. CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO: ESTADOS ESTACIONARIOS

Para alcanzar los estados estacionarios se tiene en cuenta que deben pasar 3 tiempos de

residencia (siendo 3 : tiempo de residencia y = D -1 , donde se ha alcanzado

aproximadamente el 90% de equilibrio celular, por este motivo la toma de la absorbancia

de realiza una hora antes y una hora después para verificar que la célula esta llegando o se

encuentra en su estado estacionario. En la experiencia se tomaron tres muestras siendo la

segunda muestra la que corresponde a la hora central; para afirmar que se ha alcanzado el

estado estacionario se comprobaron con las lecturas del espectrofotómetro no habiendo

mucha diferencia, +/- 5% entre cada dato. En general los cálculos para los tiempos de

fermentación son casi exactos, pues luego de este tiempo la células se encontraban en su

estado estacionario.

Cerca de las 12:00 pm. se da inicio al cultivo continuo la toma de muestras se realizo de

acuerdo a los cálculos realizados; los muestreos obtenidos se presentan en la siguiente

tabla. Sabiendo que en los estados estacionarios D = μ se opta por dar las velocidades de

dilución que se presentan; con sus respectivos flujos. Los sobrenadantes guardados en los

viales, sirvieron para la evaluación del consumo de sustrato según el método DNS y

utilizando la curva de calibrado para azucares reductores hallamos la variación de

concentración del sustrato, lo obtenido se presenta en la siguientes tabla.

En este tipo de cultivo continuo hay una aportación continua de los substratos para la

alimentación de los microorganismos, el propósito de el estado estacionario es mantener

constante la producción de biomasa. Esto se logra alimentando al quimiostato a un ritmo

estable, el volumen es mantenido constante quitando la misma cantidad que se (3).

43

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

La adición de nutrientes al medio como, como sales de amonio y extracto de lavadura

puede tener un efecto beneficioso

CUADRO Nº 4: DATOS OBTENIDOS DE LOS 5 ESTADOS ESTACIONARIOS

F

       

(ml/min)

Absorbancia

X (g/L)

Absorbancia

S (g/L)

   
  • 0.975 1.3697

0.007

0.1099

0.8

 
  • 0.896 1.2401

0.009

0.1361

   
  • 0.866 1.1908

0.01

0.1492

1.2

 
  • 0.848 1.1613

0.005

0.0838

*1.8

 
  • 0.928 1.2926

0.04

0.5419

 
  • 0.817 1.1104

0.011

0.1623

   
  • 0.778 1.0464

0.006

0.0969

2.5

 
  • 0.723 0.9562

0.009

0.1361

   
  • 0.922 1.2827

0.09

1.1963

3

 
  • 0.785 1.0579

0.01

0.1492

 
  • 0.686 0.8955

0.01

0.1492

* Para el flujo de 1.8 ml/min tuvimos que hacer un promedio de los dos valores de

absorbancia y tomar este promedio para hallar el X (g/L) (1.2015) como valor para

nuestro grafico Nº 3 y Nº 4.

* Los valores que se encuentran de color rojo, son los valores que se han tomado en

cuenta para el grafico Nº 3 y Nº 4.

CUADRO Nº 5: VALORES TOMADOS DE X y S PARA LAS GRAFICAS Nº 3 y

Nº4.

µ=D (h -1 )

X (g/L)

S (g/L)

0.0706

1.2401

0.1361

0.1059

1.1908

0.1492

0.1588

1.2015

0.5419

44

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

0.2206

1.0464

0.1361

0.2647

1.0579

1.1963

0.4520

0

5.93

GRAFICA Nº3: CULTIVO CONTINUO AIREADO

CULTIVO CONTINUO AIREADO 1.4000 6.0000 1.2000 5.0000 1.0000 4.0000 0.8000 3.0000 0.6000 2.0000 0.4000 X (g/L)
CULTIVO CONTINUO AIREADO
1.4000
6.0000
1.2000
5.0000
1.0000
4.0000
0.8000
3.0000
0.6000
2.0000
0.4000
X (g/L)
1.0000
0.2000
S (g/L)
0.0000
0.0000
0.0706
0.1059
0.1588
0.2206
0.2647
0.452
D (h-1)
Biomasa X (g/L)
Sustrato S (g/L)

GRAFICA Nº 4: CULTIVO CONTINUO AIREADO CON LINEA DE

TENDENCIA

45

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Cultivo Continuo Aireado 1.4000 6.0000 1.2000 5.0000 1.0000 4.0000 X (g/L) 0.8000 Linea Tendencia 3.0000 S
Cultivo Continuo Aireado
1.4000
6.0000
1.2000
5.0000
1.0000
4.0000
X (g/L)
0.8000
Linea Tendencia
3.0000
S (g/L)
0.6000
Linea Tendencia
2.0000
0.4000
1.0000
0.2000
0.0000
0.0000
0.0706
0.1059
0.1588
0.2206
0.2647
0.452
D (h-1)
Biomasa X (g/L)
Sustrato S (g/L)

Los valores tomados en el laboratorio se supone que sebe ser el mismo para cada estado

estacionario por tener una alimentación constante de sustrato; se tomaron para el grafico

Nº3 y Nº4 se encuentran en el cuadro Nº 4, y el criterio que tuvo el grupo para escoger

estos valores fue por lo siguiente; inicialmente tomamos el promedio de estos valores

pero al ver que no nos proporcionaba una grafica adecuada ni dada por referencias

bibliografícas; decidimos en el caso de sustrato que tenia que ir aumentado la

concentración y en el caso de biomasa disminuir tomando valores que se ajusten a la

curva dada por referencias bibliograficas.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS Cultivo Continuo Aireado 1.4000 6.0000 1.2000 5.0000 1.0000 4.0000 X

Si observamos el grafico anterior Nº 3 y Nº 4 podemos comprobar que en los resultados si

hay un aumento de la velocidad de dilución (D), entonces menor será la concentración de

46

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

biomasa, por consiguiente tendremos una mayor concentración de sacarosa cuando

aumentemos la velocidad de dilución ya que al formase menos biomasa consumirán

menos sacarosa. Esto se puede contrastar con las siguientes bibliografías:

La productividad de biomasa de 1,61 g / L • h en estado puro

hidrolizado a pH 4 y 38 ° C, a una tasa de dilución de 0,1 h -1, fue

mayor que el valor de 1,13 g / L • h obtenido en el 50% diluido en el

hidrolizado El mismo pH y la temperatura, pero a una tasa de dilución

de 0,15 h-1. No substrato de carbono residual fue detectado en

ninguna de las anteriores condiciones de cultivo”. (Cultivo en

Quimiostato de Candida blankii en Bagazo de la caña de azúcar

hemicelulosa hidrolizado P.S. Meyer, J.C. du Preez, * y S.G. Filian).

Otro autor nos menciona:

“En la Figura se aprecia la disminución en la concentración de biomasa

conforme aumenta el valor de la tasa de dilución, pasando de un valor

inicial de 3,3 g/L para una tasa de dilución de cero, que corresponde a

una operación del sistema en forma “batch”, hasta una concentración

de 0,2 g/L para una tasa de dilución igual a 0,5 h-1.

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS biomasa, por consiguiente tendremos una mayor concentración de sacarosa cuando

Para la última tasa de dilución (0,5 h-1), la concentración de azúcares

totales en el medio de cultivo se mantuvo aproximadamente igual a la

concentración del medio de cultivo fresco con que se alimenta el

proceso, indicando que la operación del sistema continuo tuvo lugar

con una tasa de dilución lo suficientemente alta que provocó el lavado

de células o producto, lo cual se debe evitar.

La tasa máxima de dilución, Dmax, con un valor de 0,19 h–1, se obtuvo gráficamente

donde las curvas de concentración de biomasa y sustrato en la Figura 5, se interceptan.

47

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

De igual forma, la tasa de dilución crítica, Dcri, corresponde al valor aproximado de

0,30 h-1, este valor tiene lugar donde la concentración de azúcares totales en el medio de

cultivo comienza a mantener un valor constante y similar a la concentración de azúcares

totales del medio de cultivo fresco, además, se da inicio al lavado de células. Ambos

parámetros son posibles de conocer a partir de los resultados cinéticos obtenidos

previamente”. (Evaluación de parámetros cinéticos para la Sacharomyces cerevisiae utilizando agua de coco como sustrato. Oscar Ramírez Sánchez).

DETERMINACION DE μ max Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS:

CUADRO 6: DATOS PARA LA DETERMINACION DE μ max Y Ks

S (g/L)

1/S

D(h -1 )

1/D

  • 0.1361 7.3475

 
  • 0.0706 14.1643

  • 0.1492 6.7024

 
  • 0.1059 9.4429

  • 0.5419 1.8454

 
  • 0.1588 6.2972

  • 1.1963 0.5895

 
  • 0.2647 3.7779

GRAFICO Nº 5: CURVA DE μ max Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS

48

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

DETERMINACIÓN DE µm Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS 16.0000 14.0000 y = 1.221x + 3.3885
DETERMINACIÓN DE µm Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS
16.0000
14.0000
y = 1.221x + 3.3885
12.0000
10.0000
Datos dispersos
8.0000
Lineal (Datos
dispersos)
6.0000
4.0000
2.0000
0.0000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1/S
1/D

Para determinar m y Ks se deben obtener datos de varios estados estacionarios, lo que

permite construir experimentalmente un grafico tipo Monod. En principio, de este grafico

se podría calcular Ks como el valore de S al cual = m /2 ya que:

m /2 = m *(S/(Ks+S) y

S = Ks

Por otra parte m se podría calcular del grafico como el mayor valor de , lo que equivale

a su valor asintótico. Sin embargo el valor así estimado resulta muy impreciso, lo cual

repercute en el calculo de Ks, que es un numero sensible a pequeñas variaciones, por lo

que esta forma de calculo no es recomendable.

Una mejor forma de determinar m y Ks es graficando los valores recíprocos de = D y

S, obteniendo un m del intercepto de la recta con el eje de 1/ y Ks del intercepto con el

eje de 1/S o de la pendiente Ks/ m . este método es formalmente inobjetable, pero aun asi

los valores obtenidos pueden presentar variaciones apreciables. Ello es debido a que los

datos experimentales se ubican relativamente alejados de los ejes, por ser ellos valores

recíprocos. Por lo tanto pequeñas diferencias en la pendiente de la recta trazada se

amplifica notoriamente en la intersección y afecta de m . también es importante el hecho

que obtener 5 o 6 estados estacionarios requiere de una semana o más de trabajo.

(copias de ingeniería de fermentación y enzimas – Ing Augusto Castillo)

Ecuación para determinar el m y el Ks:

49

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

y = 1.221x + 3.3885

El m se calcula intersectando la recta con el eje Y(1/D):

1/ m = 3.3885

Entonces:

m = 0.295 h -1

El Ks se calcula de la pendiente de la recta:

Pendiente = Ks/

m

Entonces:

Ks = m * 1.221

Ks = 0.36h -1

La velocidad de crecimiento en los microorganismos es función del nutriente limitante, la

velocidad de adición de medio determina la velocidad de crecimiento del microorganismo

y el sistema está autorregulado.

De acuerdo al trabajo de investigación de otro autor. “el crecimiento de Kluyveromyces

marxianus en lactosuero, dicho medio estuvo caracterizado por una fase exponencial con

una duración de 6 a 7 horas aproximadamente .El valor de la velocidad máxima de

crecimiento específico (μmax) fue de 0,42 h–1 (promedio de 5 procesos fermentativos

independientes) lo que corresponde a un tiempo de generación de 1,65 h ”. (5)

“La concentración de biomasa alcanzada al final del crecimiento osciló entre 3,67 y 4,65

g/L, consumiéndose casi la totalidad de la lactosa, con un valor promedio de 93,21%,

correspondiente a 14,6 g/L. Estos datos permitieron calcular el rendimiento en biomasa

referido a lactosa consumida, el cual osciló entre 0,28 y 0,33 g/g. Es importante destacar

que los valores de los distintos parámetros de cultivo determinados en el presente estudio

guardan cierta similitud con los reportados por otros autores a pesar de que en algunos

casos las condiciones de operación fueron marcadamente diferentes. Así, Vananuvat y

Kinsella [36], utilizando tanques agitados reportan valores de μmax en el rango de 0,35

h–1 y 0,44 h–1 para velocidades de agitación de 300 rpm y 700 rpm respectivamente;

Castillo y Sánchez [3], empleando fiolas agitadas obtienen valores de μmax de 0,41 h–1

a 35°C, y Chinappi y Sánchez [5] hicieron determinaciones de μmax entre 0,34 y 0,62 h–

50

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

1, al emplear diversos tipos de biorreactores operados a altas tasas de aireación y

agitación.” (5)

En nuestra investigación obtuvimos un m = 0.295 h -1 a una agitación de 200rpm.

DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE MANTENCIÓN REAL:

CUADRO 7:

D(h-1)

y(x/y)

qs

0.0706

0.2098

0.3365

0.1059

0.2057

0.5149

0.1588

0.2112

0.7520

0.2206

0.1910

1.1552

0.2647

0.2335

1.1334

GRAFICO 6: CURVA DEL COEFICIENTE DE MANTENCION REAL

DETERMINACION DEL COEFICIENTE DE MANTENCIÓN REAL 1.4000 1.2000 y = 4.4681x + 0.0451 R 2 =
DETERMINACION DEL COEFICIENTE DE MANTENCIÓN REAL
1.4000
1.2000
y = 4.4681x + 0.0451
R 2 = 0.9531
1.0000
0.8000
qs
Lineal (qs)
0.6000
0.4000
0.2000
0.0000
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
D(h-1)
qs(g/g*h)

Ecuación para determinar el coeficiente de mantencion:

y = 4.4681x + 0.0451

El coeficiente de mantencion se calcula del intercepto de la recta con el eje qs.

  • m = 0.0451

  • m = coeficiente de mantencion.

51

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

DETERMINACION DE µ m POR LAVADO (F = 12 g/L)

CUADRO Nº 8: DATOS PARA EL µ m POR LAVADO

Fecha

Hora

Absorbancia

X

LNX

Tiempo

d/m/a

(h)

(640 nm)

(g/L)

   

07/03/2008

08:00 a.m.

 

0.9562

  • 0.723 -0.044802392

0

07/03/2008

08:30 a.m.

 

0.8249

  • 0.643 -0.192481296

0.5

07/03/2008

09:00 a.m.

 

0.6772

  • 0.553 -0.38975393

1

07/03/2008

09:30 a.m.

 

0.4376

  • 0.407 -0.826350435

1.5

07/03/2008

10:00 a.m.

 

0.2637

  • 0.301 -1.332935594

2

07/03/2008

10:30 a.m.

 

0.1570

  • 0.236 -1.851256568

2.5

07/03/2008

11:00 a.m.

 

0.0668

  • 0.181 -2.706246774

3

GRAFICA Nº7: CURVA DE µ m POR LAVADO X(g/L) vs T (h)

DETERMINACION DE µm POR LAVADO 1.2000 1.0000 0.8000 0.6000 0.4000 0.2000 0.0000 0 0.5 1 1.5
DETERMINACION DE µm POR LAVADO
1.2000
1.0000
0.8000
0.6000
0.4000
0.2000
0.0000
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
TIEMPO (h)
[ ] BIOMASA (g/L

GRAFICA Nº 8: CURVA DE µ m POR LAVADO LnX vs T (h)

52

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

DETERMINACION DE µm POR LAVADO (F = 12 g/L) 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5
DETERMINACION DE µm POR LAVADO (F = 12 g/L)
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
-0.5
-1
-1.5
-2
-2.5
-3
Tiempo (h)
Ln X

GRAFICA Nº 9: DETERMINACION DE µ m POR LAVADO; POR LA

PENDIENTE

DETERMINACION DE µm POR LAVADO 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 -0.2 -0.4 -0.6
DETERMINACION DE µm POR LAVADO
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
-0.2
-0.4
-0.6
y = -0.8521x + 0.3597
R 2 = 0.9776
-0.8
Serie1
-1
Lineal (Serie1)
-1.2
-1.4
-1.6
-1.8
-2
TIEMPO (h)
Ln(X)

53

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

Así como se calcula el m por el método de los estados estacionarios, otra alternativa es el

denominado método del lavado, que consiste en aumentar el valor de D de un cultivo en

estado estacionario sobre el D c , de forma de producir intencionalmente l lavado y graficar

los datos obtenidos en la forma de LnX vs tiempo.

En la situación de lavado rige la ecuación diferencial:

m = D + ((1/X)*(dX/dt)) = D + (dLnX/dt)

Y dado que D es mayor al D c las células crecerán a su máxima velocidad m .

Por lo tanto m se calcula determinando la pendiente de un grafico LnX vs tiempo,

restándola (la pendiente es negativa) del valor de D escogido para producir el lavado. El

experimento debe prolongarse lo suficiente para obtener una buena recta dejando de lado

los primeros puntos que corresponden a un periodo transitorio de ajuste a las nuevas

condiciones. El valor de m obtenido del lavado es tan bueno como lo es su determinación

a partir de la fase de crecimiento exponencial de un cultivo por lotes. En ambos casos se

trata solo de una aproximación, ya que m es un límite teórico ( a infinita concentración

de sustrato) y no se la puede medir directamente, sino que aproximar u obtener por

extrapolación, como en el método de los recíprocos. El valor obtenido por el método e

lavado más bien es D c que m .

Ecuación para determinar el μ max por el lavado:

y = -0.8521x + 0.3597

μ max = D – pendiente

μ max = 1.0588 + (-0.8521)

μ max = 0.2067 h -1

Teóricamente, el kluyveromyces marxianus presenta un µ =0.48 h -1 pero como se puede

notar el µ calculado prácticamente, es mucho menor que el teórico, esto debido a que la

excesiva fase de latencia por las condiciones que no fueron las favorables, ya que el

volumen del matraz empleado ha sido muy pequeño, el cual no permitió una aireación

correcta por el área de contacto de la muestra con el aire, todos estos propiciaron que el

tiempo de fermentación se incrementara de forma notable, y con estos resultados el µ =0.55

h -1 . Una consecuencia de las ecuaciones que describen el quimiostato simple es que la

velocidad máxima de dilución esta limitada a un valor ligeramente menor que la velocidad

54

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

máxima de crecimiento especifico u m .Esta se denomina velocidad de dilución critica para el

lavado ,D c . El lavado tiene lugar cuando las celulas estan siendo sacadas del fermentador a

una velocidad D c .x vo que es igual a la velocidad maxima ux vo -d c x vo a la que pueden crecer

en el fermentador, de forma que el unico valor estable para la concentración de celulas es

cero. En el lavado el estado de equilibrio es aquel en el que no existen celulas o crecimiento

y el substrato pasa sin cambio por el fermentador.

Para poder determinar el F =12 ml/min tomamos como referencia la grafica:

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS máxima de crecimiento especifico u .Esta se denomina velocidad de

Determinando el D c = µ m = 0.452 y con este valor podemos calcular el F de lavado

F = V*D c

F = 680ml*0.452h -1 *1/60

F = 5.12 ml/min, este seria el flujo de lavado a utilizar porque si observamos en el grafico

a un D c la concentración de biomasa se hace cero con lo cual realizamos el lavado, pero

para poder garantizar el verdadero lavado en la practica tomamos un F mucho mayor que

el teórico y este F = 12 ml/min

Comparando los m del cultivo por lote, m de los estados estacionarios y el m del lavado

podemos ver que este ultimo es mucho menor que los otros esto debido justamente que en

el lavado el crecimiento es mas lento porque se esta sometiendo a una velocidad de

dilución mas grande en comparación a los otros.

El μ ma en los estados estacionarios es menor que en el por lote debido a la existencia del

Ks, y mientras sea mayor el valor de μ será menor.

PERTURBACION DE

Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS máxima de crecimiento especifico u .Esta se denomina velocidad de

E.E (Incremento) [Sacarosa] = 15g/L

55

Laboratorio de Bioprocesos

Ing.Agroindustrial - UNS

CUADRO Nº 9 perturbación por sacarosa en el experimento nº 5.

 

Tiempo

         

F (ml/min)

(h)

Absorbancia

 

X (g/L)

 

X (g/L)

Absorbancia

S (g/L)

Experiencia

0

0.686

 

0.8955

 

0.8955

0.18

1.19634

N° 5

2

0.806

 

1.0924

 

1.0924

0.102

0.68586

F = 3

4

0.93

 

1.2959