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Manual de Toxicologia

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA

MANUAL DE LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA Clave 1848 Horas de teoría: 3 Horas de prácticas: 4

Profesores: Adelina Jiménez Arellano Lourdes Mayet Cruz Liz Jannet Medina Reyes Carlos Pérez Muñoz Laura Cedillo Camarillo Javier Carballo Perea Francisco Hernández Luis Juan Gabriel Navarrete Vázquez Ciudad Universitaria México, D.F. 2001

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INDICE Página 2 3 4 5 10 20 22 26 32 36 39

Reglamento para el Laboratorio de Toxicología Criterios de Evaluación para el Laboratorio de Toxicología Reporte de Seguridad e Higiene EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE TOXICOS NO VOLATILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA. EFECTOS TÓXICOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE PLOMO EN RATAS EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIÓN DE METALES PESADOS POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO DETERMINACION DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA CUANTIFICACIÓN DE UN TÓXICO VOLÁTIL (CIANURO DE HIDRÓGENO) EN GLUCÓSIDOS CIANOGÉNICOS. IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES Y BARBITÚRICOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS PRODUCCION DE MiHb POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO” DETERMINACIÓN DE MALATIÓN RESIDUAL

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REGLAMENTO PARA EL LABORATORIO DE TOXICOLOGIA

1. Dentro del laboratorio es obligatorio el uso de la bata de algodón, perfectamente cerrada. 2. Todos los alumnos durante la sesión de laboratorio deberán usar zapato cerrado con un tacón no mayor a tres centímetros 3. Sólo se prestará material mediante un vale firmado por el alumno con su credencial universitaria vigente. 4. El alumno se hace responsable del material en el momento de recibir la charola, por lo tanto se les aconseja, revisar con todo cuidado éste, pues el laboratorista no admitirá reclamaciones posteriores. 5. Las ordenes de pago, para los adeudos pendientes, deberán recogerse a la semana siguiente. Es recomendable pagarlos inmediatamente y evitar que se puedan extraviar. 6. Los comprobantes de pago de material se reciben de lunes a viernes de 10 a 13 h en el anexo 1-E/F. 7. Si el alumno desea reponer el material roto con otro que adquiera fuera de la Facultad, es indispensable presentar la nota de compra actualizada, de otra manera no se le podrá recibir. 8. En ninguna práctica el alumno podrá pipetear las diversas soluciones con la boca. Es obligatorio el uso de perillas para tal fin, además será indispensable el uso de lentes de seguridad durante toda la práctica. 9. Se requiere de una fotografía tamaño infantil para el control interno de su asistencia y evaluación. 10. Está terminantemente prohibido fumar, ingerir alimentos o bebidas y hablar por teléfono en el laboratorio. 11. Es deseable que se pueda demostrar nuestro espíritu universitario al mantener las áreas de trabajo limpias después de cada sesión. 12. Para que el alumno tenga derecho a la calificación del laboratorio, debe entregar su comprobante de inscripción en el periodo indicado y no tener adeudo pendiente de material. 13. Quedan estrictamente prohibidas las visitas, durante las horas de laboratorio. 14. Si el alumno necesita salir por cualquier motivo durante la sesión del laboratorio, deberá comunicarlo a los profesores. 15. Es necesario que el alumno sea puntual a la sesión del laboratorio, teniendo como tolerancia 15 minutos. 16. Una vez que se reparta la última muestra problema, no se dará a ninguna otra persona que haya llegado tarde. 17. Para que el alumno tenga derecho a calificación final de laboratorio, no deberá tener adeudo pendiente de material.

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CRITERIOS DE EVALUACION DEL LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA La calificación del laboratorio estará constituida por los siguientes puntos: 1.- Reporte y trabajo en el laboratorio 2.- Examen 3.- Reporte de seguridad e Higiene 50% 40% 10%

Antes del inicio de cada guión o práctica, el alumno deberá presentar un diagrama de flujo en el que se describan las actividades que se llevarán a cabo durante la misma, así como la investigación previa que debió haber realizado para poder llevar a cabo la práctica (propiedades fisicoquímicas, solubilidad, toxicidad de los reactivos, etc.). 1.- EL REPORTE de los guiones consistirá en una serie de preguntas relacionadas con los fundamentos del guión, resultados y conclusiones del mismo, de manera que únicamente se entregará el cuestionario completo a la siguiente sesión de haber finalizado la misma. Para el caso del reporte de prácticas, este deberá contener: introducción, respuesta al cuestionario, diagrama de flujo de las actividades a realizar, reacciones y fundamentos de la misma, resultados, conclusiones y bibliografía. 2.- EXAMEN. Consistirá en preguntas relacionadas con la práctica a realizar. El alumno no tendrá derecho a reprobar más de dos exámenes durante el semestre, de lo contrario será dado de baja. 3.- REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE. Se deberá de entregar al final de cada práctica y sólo por los alumnos que en esa práctica hayan sido designados como jefes de mesa. La hoja de seguridad e higiene será proporcionada por el profesor y contendrá los siguientes puntos: Utilización de reactivos.- que contempla los reactivos utilizados, la cantidad final e inicial de los mismos y como fueron manejados los residuos al final de la sesión. Vigilancia del equipo utilizado.- Se deberá indicar la hora en que se prendieron y se apagaron todos los equipos empleados durante la práctica y las observaciones iniciales y finales. Medidas de seguridad.- Se deberán anotar todas las medidas de seguridad que emplearon los integrantes de la mesa durante la práctica. (ejemplo, el uso adecuado de lentes de seguridad, bata, zapatos y alguna medias particulares). NOTA: POR NINGUN MOTIVO SE ACEPTARAN REPORTES DE SEGURIDAD DESPUES DE LA HORA DE LABORATORIO. EL ALUMNO TENDRA DERECHO A FALTAR SOLO UNA VEZ DURANTE EL SEMESTRE, PREVIA JUSTIFICACION.

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REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE LABORATORIO DE TOXICOLOGIA GRUPO:___________________ FECHA:___________________ PRACTICA:_______________________________________________________ RESPONSABLE:__________________________________________________ INTEGRANTES (CLAVES):___________________________________________ ___________________________________________________________________ 1. UTILIZACION DE REACTIVOS. REACTIVO CANTIDAD INICIAL CANTIDAD FINAL OBSERVACIONES

2.- VIGILANCIA DE EQUIPO. EQUIPO HORA INICIO

HORA FINAL

OBSERVACIONES

3.- MEDIDAS DE SEGURIDAD EQUIPO DE SEGURIDAD

OBSERVACIONES

Vo.Bo.

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TITULO DEL GUION: EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE TOXICOS NO VOLATILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA. ASIGNATURA: Toxicología (8o semestre, carrera Q.F.B.) DEPARTAMENTO: Farmacia OBJETIVO ACADÉMICO: Que el alumno emplee métodos de extracción ácida y básica para obtener eficientemente tóxicos no volátiles de naturaleza ácida y básica en una muestra problema y explique que método de extracción es el más eficiente. PROBLEMA: Establecer las condiciones más adecuadas para realizar una extracción del 90% de los tóxicos no volátiles ácidos y básicos (ácido acetilsalicílico y cafeína) presentes en una muestra problema. La muestra deberá trabajarla en medio ácido y medio básico. METODOLOGIA: El profesor proporcionará 30 mL de muestra, la cual deberá dividirse en dos porciones (cada una de 15 mL) para realizar la extracción en medio ácido y en medio básico. La cuantificación de ácido acetilsalicílico y cafeína se determinará siguiendo los apéndices correspondientes. A) PROCESO DE EXTRACCION EN MEDIO ACIDO PARA TOXICOS NO VOLATILES: 1. Agregar a la muestra biológica ácido tartárico hasta un pH= 2 y agitar. 2. La solución ácida se extrae con 2 porciones de 15 mL de éter, separando las fases etéreas y reuniéndolas en un matraz. 3. La fase acuosa remanente se guarda, etiquetándola como fracción A ( sustancias básicas). 4. La fase etérea se extrae con dos porciones de agua destilada (10 mL) y se reúnen las fases acuosas con la fracción A. 5. Tratamiento de la fase etérea: ésta fase se trata con 5 mL de una solución saturada de bicarbonato de sodio, se separan las fases. En la fase acuosa se concentran los ácidos fuertes (fracción B). Tratar esta fracción como se indica en el apéndice I. 6. A la fase etérea se le añaden 5 mL de NaOH 0.15 N, mediante este proceso se extraen los ácidos débiles en la fase acuosa, etiquetarla como fracción C y trabajarla como se indica en el apéndice I. 7. Tratamiento de las fracción A. Las fases acuosas reunidas en el inciso 4 se alcalinizan hasta pH = 10 con NaOH 2.5 N. 8. Extraer con dos porciones de CHCl3 (10 mL) y separar las fases. 9. Concentrar la fase orgánica hasta sequedad (en rotaevaporador), etiquetar como fracción D (sustancias básicas) y tratarlo como se indica en el apéndice II.

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B). PROCESO DE EXTRACCION EN MEDIO BASICO PARA TOXICOS NO VOLATILES: 1. La muestra se ajusta a pH = 10 con NaOH 2.5 N. 2. Realizar la extracción con dos porciones de CHCl3 (15 mL), separando las fases. 3. La fase orgánica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fracción E (sustancias básicas) y se trata como se indica en el apéndice II. 4. La fase acuosa se etiqueta como fracción F (sustancias ácidas) y se trata según el apéndice I. EQUIPO Espectrofotometro Rotaevaporador Lámpara de luz ultravioleta Potenciómetro Balanza analítica MATERIAL Gradilla Tubos de ensayo Matraz aforado de 10 mL Matraz aforado de 25 mL Embudo de separación 250 mL Matraz Erlenmeyer 250 mL Matraz Erlenmeyer 50 mL Gogles Anillo metálico Para curva patrón Gradilla Matraz volumétrico de 10 mL Matraz volumétrico de 25 mL Tubos de ensayo REACTIVOS Ácido tartárico Hidróxido de sodio Nitrato férrico Ácido clorhídrico Bicarbonato de sodio Eter etílico Cloroformo Salicilato de sodio Cloruro mercúrico 1 5 5 10 Vaso de precipitados 100 mL Pipeta graduada de 1 mL Pipeta graduada de 10 mL 1 1 1 1 4 2 2 2 1 2 1 2 Piseta con agua destilada. Matraz de bola de 50 mL Pipeta Paster Probeta de 25 mL Espátula cromo/niquel Pipeta graduada 10 mL Pipeta graduada de 5 mL Pipeta graduada de 1 mL 1 2 2 1 1 2 2 1

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APÉNDICE I a) Tratamiento de la muestra: Tome 1 mL de la muestra (fracción B, C y F) y adicione 5 mL del reactivo para desarrollar color (apéndice III), agite, espere 2 min. y determine la absorbancia a 540 nm. Si la lectura de absorbancia no cumple con la ley de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias, repita el procedimiento y vuelva a realizar la lectura. Calcule la concentración de AAS presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la curva patrón. b) Curva patrón del ácido acetil salicílico: 1) Preparar una solución patrón de salicilato de sodio (1000 µg/mL): Pesar 25 mg de salicilato de sodio y disolverlo en 10 mL de agua destilada y llevar hasta 25 mL con agua destilada (preparar 25 mL por curva patrón). 2) A partir de la solución patrón de salicilato de sodio (1000 µg/mL), preparar la curva patrón como se describe a continuación (realizar dos curvas patrón por grupo). Alicuota de la solución patrón (mL) 0.5 1 3 5 7 Aforo con Agua destilada 10 10 10 10 10 Concentración (µg/mL) 50 100 300 500 700

En un tubo de ensaye colocar 1 mL de las soluciones recién preparadas y adicionar 5 mL del reactivo para desarrollar color (apéndice III), agitar la muestra en un vórtex durante 1 min. esperar 2 min. y determinar la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm, ajustando a cero con un blanco (1 mL de agua y 5 mL del reactivo para desarrollar color).

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APÉNDICE II Cuantificación de cafeína: a). Tratamiento de la muestra 1. Disolver por separado los residuos D y E en 5 mL de NaOH 0.1 N, pasarlo a un matraz volumétrico de 25 mL y aforar con NaOH 0.1 N. 2. Determinar la absorbancia de la solución a 275 nm utilizando NaOH 0.1 N como blanco. Si la lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias con NaOH 0.1N. 3. Calcular la concentración de cafeína presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la curva patrón. b) Curva patrón 1. Solución patrón de cafeína (100 µg/mL) Disolver 10 mg de cafeína anhidra en 10 mL de NaOH 0.1 N y afore con la misma solución a 100 mL. 2. A partir de la solución patrón de cafeína (100 µg/mL) preparar la curva patrón como se describe a continuación. Por grupo realizar dos curvas patrón. Alicuota de la solución patrón (mL) 1 2 3 4 5 Aforo con NaOH 0.1 N 25 25 25 25 25 Concentración (µg/mL) 4 8 12 16 20

3. Determinar la absorbancia de la curva patrón a una longitud de 275 nm, ajustando a cero con un blanco (NaOH 0.1 N).

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APÉNDICE III Reactivo para desarrollar color: Pesar 4 g de cloruro mercúrico y disolverlo en 12 mL de HCl 1N, adicionar 4 g de nitrato férrico, agitar hasta disolver y diluir con agua destilada a 100 mL. Solución de hidróxido de sodio 2.5 N Disolver 10 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL. Solución de hidróxido de sodio 0.1 N Disolver 0.4 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL. Solución de ácido clorhídrico 1 M Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L. CUESTIONARIO 1. Con la experiencia que adquirió al realizar los procesos de extracción ¿qué sustancias ácidas o básicas recomendaría para ajustar el pH antes de efectuar la primera extracción en muestras biológicas? Justifique su respuesta. 2. Esquematice los procesos de separación empleados tanto en medio ácido como en medio básico y especifique que especies químicas se encuentran en cada uno de las fases. 3. Al realizar las diferentes extracciones con el disolvente orgánico indique en cada proceso dónde permanece la fase orgánica y la fase acuosa. ¿Por qué?. 4. En la extracción ácida ¿por qué se pueden juntar las fracciones acuosas en la fracción A? 5. ¿Por qué se determina la cafeína y ácido acetil salicílico a diferentes longitudes de onda? Justifique su respuesta. 6. Una vez desarrollado el guión ¿qué puntos del proceso de extracción cree usted que son críticos para la extracción de su tóxico no volátil? 7. ¿Qué propiedades fisicoquímicas podrán mejorar el rendimiento de la extracción de un xenobiótico? 8. Presente los datos de absorbancia contra concentración de las curvas patrón de AAS y cafeína con sus respectivas gráficas y los datos de regresión lineal correspondientes. Interpole los datos de absorbancia de sus muestras tanto en la extracción ácida como en la básica. 9.¿Es necesario considerar las diluciones realizadas durante el proceso de extracción para calcular la concentración inicial de los xenobióticos en su muestra? Justifique su respuesta. 10. Indique el procedimiento para los cálculos de la concentración de AAS y cafeína en su muestra.

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TÍTULO DEL GUIÓN: “EFECTOS TÓXICOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE PLOMO EN RATAS” ASIGNATURA: Toxicología (8o semestre, carrera Q.F.B.) DEPARTAMENTO: Farmacia OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno visualice las alteraciones morfológicas del hígado, bazo y células sanguíneas y relacione la variación cuantitativa en el valor de hematocrito, hemoglobina libre y total al administrar dosis diferentes de plomo. PROBLEMA Indique que solución causa mayor efecto tóxico al observar macroscópicamente los cambios morfológicos del hígado, bazo y microscópicamente células sanguíneas, y cuantifique el valor de hematocrito, hemoglobina libre y hemoglobina total. PROCEDIMIENTO El trabajo experimental se desarrollará por equipo en cuatro sesiones de laboratorio. SESION I (PRIMERA SEMANA) 1) Traer 4 jeringas de 1 ml por equipo. 2) Pesar los animales, anestesiarlos con éter etílico y marcarlos de acuerdo al sistema de marcaje. (El profesor indicará que numeración se asignará a cada equipo y el sistema de marcaje.)
2 4 1 20 40

OREJA DERECHA (UNIDADES ) OREJA IZQUIERDA (DECENAS) 3) El profesor dará cuatro soluciones etiquetadas como sol. A, B, C, y D (SSI) a cada equipo. Cada una de las soluciones será administrada por vía intraperitonial en un volumen de 0.5 mL /rata con peso de 250 – 280gr.

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MATERIAL • • • • • • • Balanza para animales (una por equipo) Caja de contención ( una por equipo) Perforador ( uno por grupo) Algodón Cuatro jeringas para insulina (traer por equipo) Cubre boca (traer por equipo) Guantes de hule (traer por equipo)

REACTIVOS Acetato de plomo Solución salina isotónica MATERIAL BIOLÓGICO * 4 ratas del mismo sexo (por cada equipo) Eter etílico Etanol

SESION II y III (SEGUNDA Y TERCER SEMANA) 1) Pesar a los animales nuevamente 2) Realizar una segunda administración de las soluciones A, B, C, y SSI a la rata correspondiente. MATERIAL: • Caja de contención (una por equipo) • Algodón • Cuatro jeringas para insulina (traer por equipo) • Cubre boca (traer por equipo) • Balanza para animales REACTIVOS. Acetato de plomo Solución salina isotónica.

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SESION IV (CUARTA SEMANA) MATERIAL POR EQUIPO: 1 navaja para bisturí 4 pipeta shalii 1 cubrebocas ( traer uno por persona ) 1 tijeras de disección 4 jeringas de 3 ó 5 ml (por equipo) 8 tubos capilares 1 caja de contención 16 portaobjetos 2 pipetas volumétricas de 5 ml 1 vaso de precipitados de 250 ml 1 pipeta graduada de 1 ml 4 cajas de Petri REACTIVOS Nuevo azul de metileno Solución de heparina Estándar de cianometa hemoglobina Solución salina isotónica. Bencidina al 1% Solución de Drabkin Colorante de Wrigth Eter dietílico Etanol Agua oxigenada al 1% 1 boquilla para pipeta shalii (traer una por equipo) 1 gradilla 1 par de guantes (traer uno por equipo) 6 gogles 1 pinzas de disección 20 tubos de ensayo 13X100 1 Tabla de disección 2 pipetas graduadas de 10 ml 5 tubos de ensaye de 16x150 2 vasos de precipitado de 100 ml 2 celdas de vidrio (por grupo) Algodón

MATERIAL BIOLÓGICO * 4 ratas del mismo sexo (por cada equipo) EQUIPO • • • • Microcentrífuga Espectrofotómetro Microscopio de inmersión Centrífuga

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PROCEDIMIENTO: 1) Preparar 4 jeringas con 0.1 ml de solución de heparina o EDTA y 4 tubos de ensaye con 0.3 mL del mismo anticoagulante e identificarlos de acuerdo al No. de rata correspondiente. 2) Realizar punción cardiaca a cada una de las ratas, previamente anestesiada con éter dietílico, para la obtención de la muestra sanguínea. 3) Una vez obtenida la muestra (aproximadamente un volumen de 5 ml de sangre), colocarla en el tubo correspondiente, TENER CUIDADO DE NO HEMOLIZAR LA SANGRE RETIRANDO LA AGUJA DE LA JERINGA. 4) Sacrificar a la rata por desnucamiento, hacer una incisión en la parte media del abdomen observar la cavidad abdominal, colocar el hígado y el bazo en una cajas de petri con 0.5ml de solución salina para evitar la deshidratación. Tratamiento de la muestra biológica: 5) Homogeneizar la sangre. Llenar 2 capilares (Apéndice I) por rata y centrifugar en la microcentrífuga a 11000 rpm por 5 minutos. Calcular el hematocrito (Hto). 6) Preparar un frotis con tinción de Wright. Utilizar agua de la llave en vez de sol. amortiguadora. Observar en el microscopio, identificar y anotar las alteraciones morfológicas de los eritrocitos encontrados en las tinciones. Hacer un mínimo de 2 tinciones con la sangre de cada animal. 7) En un tubo de 13 X 100 mm colocar una gota de sangre y adicionar una gota de nuevo azul de metileno, mezclar suavemente, dejar reposar 5 minutos, hacer un frotis y observar al microscopio los reticulocitos, su morfología y cantidad. 8) A la muestra de sangre restante, cuantificar la Hemoglobina total (Hb) por la técnica de hemoglowiener (Apéndice I) y Hemoglobina libre por el método de la bencidina (Apéndice I).

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CUESTIONARIO 1) Construir una tabla con la siguiente información: POR CADA EQUIPO Órganos No. RATA/ SOLUCIÓN A B C D (SSI) 2) Según las dosis administradas ¿cuáles fueron las diferencias en las alteraciones morfológicas en hígado y bazo? ¿cuáles en las células sanguíneas con respecto al control (rata D)? 3) ¿Qué relación observó entre las alteraciones morfológicas de las células sanguíneas y los valores de hematocrito para cada una de las soluciones? 4) ¿Qué solución provocó la aparición de un mayor número de reticulocitos en el frotis y cómo se relaciona con los valores de hemoglobina libre y hemoglobina total? 5) ¿Qué solución provocó el mayor daño en la morfología de los eritrocitos y cómo se relaciona con los valores de hematocrito y el número de reticulocitos? 6) ¿Cómo afectó la dosis de la solución A, B y C al valor de hemoglobina libre y hemoglobina total con respecto al control? 7) ¿De qué manera se correlacionan los valores de hemoglobina total y hemoglobina libre con el hematocrito en cada una de las ratas con respecto al control? 8) Con base en los resultados descritos en la tabla, explique ¿qué solución provocó mayor efecto tóxico? 9) De los resultados obtenidos experimentalmente ¿qué factores podrían influir para que éstos no se correlacionen al 100 %? 10) Con la experiencia que adquirió en le desarrollo de este protocolo describa ¿cómo podría obtener resultados más confiables? Hb total Hb-L (g/dL) (mg/L) Hematócrito % Hígado Bazo Frotis Wright Nuevo Azul de metileno Efecto tóxico

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APÉNDICE I TÉCNICA DE MICROHEMATOCRITO 1) Se llenan con sangre proveniente del tubo de la muestra, las 2/3 partes de dos tubos capilares. 2) El extremo vacío se cierra con plastilina efectuando un movimiento de rotación. 3) Colocarlos en los canales o surcos radiales de la centrifuga (cabezal ranurado con numeración para colocar los capilares) con el extremo cerrado dirigido hacia afuera, centrifugar a 11000 rpm durante 5 minutos. 4) Cálculos Calcular el hematocrito midiendo la altura del paquete globular (M2) con relación a la altura total dela muestra (M1) y expresarla en %. M1 ----------- 100% M2 ----------- X% TINCIÓN DE WRIGHT. 1) Colocar una gota de sangre en un portaobjetos y hacer un extendido delgado. 2) Dejar que los extendidos sequen al aire. 3) Fijar los extendidos con alcohol metílico absoluto durante dos o tres minutos, (el color del frotis pasara de rojo a marrón). Lavar con agua . 4) Cubrir el portaobjetos por completo con la tinción. Después de otros cinco minutos, enjuagar muy bien con agua potable; primero, dejar salir el agua con mucha lentitud y luego con más fuerza para eliminar del extendido todo el exceso de tinte. Limpiar la parte posterior del portaobjetos en posición vertical en una rejilla para portaobjetos. Cuando seque por completo, cubrir el extendido con un cubreobjetos rectangular, fijándolo en la posición correcta . 5) Observar al microscopio con el objetivo de 100x. TINCIÓN CON NUEVO AZUL DE METILENO 1) Con una pipeta Pasteur, agregar cantidades iguales de sangre y de nuevo azul de metileno (3 gotas de cada uno) a un tubo de 12 x75 mm y mezclar. 2) Dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min. 3) Después de mezclar nuevamente, colocar una pequeña gota de la mezcla en un portaobjetos y hacer un extendido delgado. Dejar secar al aire. 4) Observar al microscopio con el objetivo de 100x.

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DETERMINACION DE HEMOGLOBINA TOTAL (Por la técnica de hemoglowiener) MATERIAL * 6 tubos de ensayo 13X100 mm * 6 pipetas de 1.0 ml * 1 pipeta de 5 ml * 1 boquilla * 1 gradilla * celdas de 1 cm de diámetro REACTIVOS * Sol. de EDTA al 10% o heparina 1000 UI * Reactivo de Drabkin * Sol. Estándar de cianometahemoglobina 15.1 m g/dL (puede variar la concentración del estándar, verificar para realizar sus cálculos) TOXICIDAD DE SUBSTANCIAS El reactivo de Drabkin y la sol. Estándar de (HbCN) contienen derivados de CIANURO, los cuales son tóxicos, sin embargo las concentraciones de éstos están por debajo de la dosis letal referido a un litro de solución. SE RECOMIENDA UTILIZAR PERILLAS DE SEGURIDAD PARA PIPETEAR ESTAS SOLUCIONES Y NO INGERIR ALIMENTOS DURANTE LA PRACTICA, AL FINALIZAR LA DETERMINACIÓN ES NECESARIO LAVARSE BIEN LAS MANOS. PROCEDIMIENTO PREPARACION DE CURVA ESTÁNDAR: Tubos Sol. Estándar de (HbCN) (ml) Muestra problema (ml) Reactivo de Drabkin (mL) Blanco 0 ---5 Control 0.02 ---5 A B C D ---- ---- ---- ---0.02 0.02 0.02 0.02 5 5 5 5

Agitar cuidadosamente después de la adición de cada reactivo, dejar reposar 10 min. Leer la absorbancia contra el blanco de reactivos a 540 nm. Calcular la concentración de hemoglobina total en g/dL Cprob = Aprob * F F= Cestándar / DOestándar

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donde: Cprob: concentración del problema (g/dL) Aprob: absorbancia del problema F: factor de la solución estándar Cestándar: concentración de la solución estándar (g/dL) Aestándar: absorbancia de la solución estándar HEMOGLOBINA LIBRE EN PLASMA MATERIAL * 4 tubos de ensaye de 13X100 mm * 6 tubos de ensaye de 16X150 mm * Pipetas serológicas de 0.1, 1.0, 5.0 y 10.0 ml * 1 Propipeta * 1 Piseta * 1 Gradilla * Celdas MATERIAL BIOLÓGICO * Sangre venosa o arterial EQUIPO * Centrífuga * Espectrofotómetro REACTIVOS * Heparina * Bencidina al 1 % * Agua oxigenada al 1 % *Estándar de hemoglobina 300 mg/L (puede variar la concentración del estándar, verificar para realizar sus cálculos). TOXICIDAD DE LAS SUSTANCIAS La bencidina es un reactivo considerado como carcinogénico por lo que se deben extremar precauciones en su manejo. TÉCNICA La muestra de sangre con anticoagulante se centrifuga a 2500 r.p.m. por 5 min., se separara el plasma cuidadosamente y se transfiere a otro tubo.

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Marcar 6 tubos de 16 X 150 mm y trabajarlos según la siguiente tabla: PROBLEMA ESTANDAR BLANCO (A, B, C, SSI) Bencidina 1% 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Plasma 0.02 ml -----Estándar de Hb --0.02 ml ---Agua destilada ----0.02 ml H2O2 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml MANTENER LOS TUBOS A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 20 MIN. Acido acético 10 % 10.0 ml 10.0 ml 10.0 ml Mezclar y dejar reposar 10 min. A temperatura ambiente, leer a 515 nm. Cálculos: Absorbancia del problema mg de Hb/L = -------------------------------------- * [Concentración del estándar]mg/L Absorbancia del estandar

APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS: SSI. Solución salina isotónica. (Puede utilizarse la solución comercial o preparar una solución de cloruro de sodio al 0.9 %) Solución de Drabkin: Bicarbonato de sodio Ferrocianuro de potasio Cianuro de potasio Saponina Agua destilada c.b.p 1.0g 0.20g 0.05g 0.1g 1000 ml

Solución diáfana de color amarillo pálido, estable en frasco ámbar a temperatura ambiente durante seis meses, la aparición de coloración azul claro o intenso indica el deterioro total o parcial del reactivo.

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Solución Nuevo Azul de Metileno: (preguntar al profesor si ésta se encuentra ya preparada). Nuevo azul de metileno 0.5g Oxalato de potasio 1.40g Cloruro de sodio 0.80g Agua destilada c.b.p 100 ml Filtrar antes de usar. Solución de Bencidina al 1% Solubilizar 1 gr de bencidina en 100 ml de ácido acético al 10%. Colorante de Wright (preguntar al profesor si ésta se encuentra ya preparada). Agregar el alcohol poco a poco, unos cuantos mililitros cada vez, y mezclar bien con la ayuda de 10 a 20 esferillas de vidrio. Conservar bien tapado para evitar la evaporación, guardar en un sitio oscuro durante dos o tres semanas, mezclar con frecuencia. Filtrar antes de usarlo. Amortiguador: Na2 HPO4 .....................2.56 g KH2 PO4........................6.63g Agua destilada (cuanto baste para un litro) Fijador. Alcohol metílico absoluto Heparina Agua oxigenada Ac. acético al 10%

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“EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIÓN DE METALES PESADOS POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO” OBJETIVOS. * Determinar cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de cerámica a diferentes valores de pH. * Discutir los efectos toxicológicos que presenta el plomo sobre los organismos vivos. MATERIALES. Vasija de cerámica Rejilla de asbestos Tubos de ensayo 13x100 Termómetro Anillo metálico Papel pH REACTIVOS. Agua destilada Hidróxido de sodio 1 N Yoduro de Potasio

3 1 10 1 1 3

Mechero Gradilla Baño María Pipetas de 1 ml Pinza para tubos Probeta de 100 ml Ácido Clorhídrico conc. Acido Nítrico

1 1 1 3 1 1

PROCEDIMIENTO. 1.- El alumno debe traer tres vasijas de barro vidriadas, iguales y nuevas. 2.- Marcar las vasijas como A, B y C. 3.- Colocar agua destilada en la vasija A. Colocar agua destilada y ajustar a pH < 2 con HCl conc., en la vasija B. Colocar agua destilada en la vasija C y ajustar a pH > 10. Medir el pH de cada vasija. 4.- Calentar las vasijas a ebullición y dejarlas hervir 30 minutos. En caso de que el contenido de agua disminuya considerablemente puede agregar mayor cantidad de la misma. 5.- Enfriar la solución y medir el pH. 6.- Colocar por separado 0.5 ml de solución de cada vasija en tubos de ensayos más tres gotas de HNO3 concentrado. 8.- Agregar a cada tubo, 1 ml de la solución de yoduro de potasio (16.5 g de yoduro de potasio aforados a 100 ml; esta solución es sensible a la luz), procurando que la solución caiga directamente en el contenido del tubo. No agite y observe. 9.- Un precipitado amarillo indica la presencia de plomo en la solución original 10.- Emplee un blanco de agua destilada y proceda de la misma forma como se indica en el paso 5 al paso 8. 11.- Para el reporte elabore una tabla que relacione el valor de pH en los pasos 3 y 5 con la presencia del plomo.

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CUESTIONARIO. 1.-¿Cuáles son los minerales que pueden ser fuentes de contaminación de plomo? 2.- Mencione 5 alimentos cuyo pH sea ácido y 5 cuyo pH sea alcalino. 3.- Construya una tabla donde se indiquen otras fuentes de exposición al plomo y la cantidad estimada que estas fuentes contienen del metal. 4.- ¿Cómo influye la edad del individuo en la absorción gastrointestinal del plomo? 5.- ¿Cuáles son los tejidos principales de distribución y depósito del plomo en el organismo? 6.- ¿Qué efectos ocurren en los eritrocitos cuando la concentración de plomo rebasa el valor de 80µg/dl y que es lo que provoca esta manifestación? 7.- Diga el nombre de los dos sistemas enzimáticos que intervienen en la síntesis del grupo Hem y que se ven afectados en una intoxicación por Pb. 8.- Proponga a través de un esquema la influencia del plomo en la biosíntesis del grupo Hem. 9.- ¿Cómo se manifiesta principalmente la intoxicación por plomo en el sistema nervioso central? 10.- ¿Cuáles son los síntomas principales de intoxicación por plomo en el tracto gastrointestinal? 11.- ¿Cómo influye la edad y el sexo en los niveles de plomo en sangre en los seres humanos? 12.- ¿Qué efectos producen la anemia que se manifiesta por la intoxicación por plomo? 13.- Esquematice los valores de plomo en sangre debajo de los cuales no hay manifestación clínica de intoxicación. 14.- ¿Cuál es la t1/2 del plomo en sangre y huesos? Y ¿qué papel juegan los eritrocitos en la relación de concentración plasma/orina en la eliminación del mismo? 15.- ¿Cómo se manifiesta una intoxicación crónica (30-50 g/dl) por plomo en los niños? 16.- Qué papel juega la sal Na2CaEDTA, en dosis de 40 mg/Kg en el diagnóstico por intoxicación por plomo? 17.- ¿Qué medidas terapéuticas se toman en una intoxicación por plomo y que concentración plasmática del mismo debe de estar presente para que se aplique a los niños? 18.- ¿ Cómo va a influir la intoxicación por Pben los valores de HbL y Hbt. ?

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Titulo del guión: DETERMINACION DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA ASIGNATURA: Toxicología (8o semestre, carrera Q.F.B.) DEPARTAMENTO: Farmacia OBJETIVO ACADÉMICO: Que el alumno identifique y determine la concentración de etanol en muestras problema, mediante un método indirecto PROBLEMA Cuantificar la concentración de etanol en mg/dl en muestras problema y mediante los resultados obtenidos indique en qué grado de intoxicación se encuentra cada una de ellas. MATERIAL Caja de Petri con centro de vidrio Pipeta volumétrica de 2 mL. Pipeta volumétrica de 1 mL. Gogles Tubos de ensayo 16 X 150 Celda de vidrio para espectrofotométro Pipeta volumétrica de 5 mL. EQUIPO: Espectrofotómetro Estufa Balanza analítica Baño maría REACTIVOS Dicromato de potasio Ácido sulfúrico Carbonato de potasio (Solución saturada) Etanol R. A. 3 3 4 1 6 2 5 Matraz volumétrico de 10 mL Pinzas para tubo de ensayo Papel filtro (2X5 cm) Pipeta graduada de 5 mL Pipeta graduada de 1 mL Pipeta pasteur con bulbo 3 3 1 3 3 4

PROCEDIMIENTO A cada alumno se le proporcionarán 2 muestras problema donde se identificará y cuantificará la concentración de etanol. I.- Prueba presuntiva para Etanol

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1.- Rotular 4 tubos como A, B, C, y D. Al tubo A agregarle 5 gotas de etanol (control positivo). Al tubo B agregarle 5 gotas de agua destilada (control negativo). A los tubos C y D agregarles 1 mL de cada una de las muestras problema respectivamente. 2.- A cada uno de los tubos, añadirles 0.5 mL de solución de dicromato de potasio (solución A) y tapar el tubo con papel aluminio. 3.- Colocar los tubos en baño maría durante 2 minutos. Se desarrolla un color azul-verdoso en caso positivo. II.- Cuantificación de etanol Cada una de las muestras se tratarán de acuerdo al siguiente procedimiento.

1.En el recipiente A de una caja petri colocar 1 mL de la muestra problema y en el recipiente B, colocar 2 mL de la solución B de dicromato de potasio, agitando suavemente el recipiente coloque 1 mL de solución saturada de carbonato de potasio. 2.Tapar con el recipiente C y mezclar suavemente. Meter la caja petri con las celdillas durante 45 min en una estufa a 37 o C. 3.Una vez transcurrido este tiempo, transferir el contenido de B a un tubo de ensayo, lavando perfectamente dicho recipiente y la parte externa de A, y finalmente aforar a 10mL con agua destilada (al final puede aparecer un precipitado que desaparece al llevar a volumen con agua destilada). 4.- realizar un control positivo contres gotas de ETOH o MeOH. 5.Tomar la lectura de absorbancia a 450nm utilizando como estándar, la solución de dicromato de potasio ( solución B ). Si es necesario realizar otra dilución, puede hacerla hasta ajustar la absorbancia ( 450nm ) entre los límites establecidos por la ley de Lambert-Beer (D.O.= 0.2-0.7). Leer contra un blanco de agua destilada. 6.-Tomar la absorbancia del problema, utilizando como blanco agua destilada. NOTA: A) Las lecturas de absorbancia que se obtienen en sus muestras se deben al dicromato de potasio residual en la reacción. Reacción: R-OH Calor CH3OH + K2Cr207 → Cr+3 OH + R-COO +

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PREPARACION DE REACTIVOS Solución de dicromato de potasio ( solución A ). Pesar 2.5 g de dicromato de potasio y solubilizarlo en 20 mL de ácido sulfúrico al 50%, aforar a 100mL con ácido sulfúrico al 50%. Solución de dicromato de potasio( solución B ). Disolver 3.37 g de dicromato de potasio en 150mL de agua destilada y agregar cuidadosamente 280mL de ácido sulfúrico concentrado, dejar enfriar y diluir con agua destilada a 650mL. Solución saturada de carbonato de potasio:Disolver la cantidad necesaria de carbonato de potasio en 100 mL de agua destilada. PM del Etanol: 46 gr PM del K2Cr2O7: 294.7 gr Densidad del Etanol: 0.7893 a 200C EJERCICIO (para entregar al inicio de la práctica): Calcular la concentración de etanol en sangre en el siguiente problema: Estándar: 2 mL de una solución 0.01 M de dicromato de potasio se diluyeron a 10 mL, de esta solución se tomaron 5 ml y se diluyeron a 10 ml. La última solución se leyó en un espectrofotómetro a 450 nm dando una lectura de 0.205 de absorbancia. Problema: 2 ml de la solución 0.01 M de dicromato de potasio se colocaron en la celdilla B y se hicieron reaccionar con 1 ml de muestra problema (celdilla A). Al término de 45 minutos de calentamiento, el contenido de la celdilla B se diluyó a 10 ml y se leyó a 450 nm, dando una absorbancia de 0.23. Respuesta. 60.72 mg de etanol/100 ml de sangre. CUESTIONARIO. 1.-¿A qué se debe la presencia de un color verde-azul en una prueba presuntiva positiva? 2.- Con la prueba presuntiva podría asegurar la presencia de etanol en sus muestras. Justificar su respuesta. 3.- Indique las lecturas de absorbancia obtenidas para cada muestra. Muestra Absorbancia

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1 2 Estándar Calcular la concentración de etanol en la muestra en mg/dl, desglosando los cálculos realizados para cada una de las muestras Tomando en cuenta la lectura de absorbancia de la solución estándar, considere todas las diluciones realizadas tanto de su muestra biológica como de su estándar. Muestra 1 2 Concentración( mg/dl )

4.- Con los valores obtenidos considere si sus muestras biológicas corresponden a personas que están bajo los efectos del etanol desde un punto de vista legal, de acuerdo a la tabla siguiente. Concentración (mg/dl): 10-50 90-120 100-150 150-200 Concentración (mg/dl): 200-250 250-450 Observaciones clínicas: Euforia nula o leve Influencia ligera sobre la visión estereostópica y la adaptación a la oscuridad Euforia, desaparición a la inhibición, tiempo de reacción prolongado Intoxicación moderadamente intensa. Tiempo de reacción muy prolongado, perdida de inhibición y ligeros trastornos en el equilibrio y coordinación. Observaciones clínicas: Grado intenso de intoxicación, trastornos de equilibrio y coordinación. Coma profundo y posiblemente mortal.

5.- ¿De qué manera se puede hacer cuantitativa la prueba presuntiva?

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TITULO DEL GUIÓN: CUANTIFICACIÓN DE UN TÓXICO VOLÁTIL (CIANURO DE HIDRÓGENO) EN GLUCÓSIDOS CIANOGÉNICOS. ASIGNATURA: Toxicología (8o semestre, carrera Q.F.B.) DEPARTAMENTO: Farmacia OBJETIVO ACADÉMICO: Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrógeno liberado a partir de glucósidos cianogénicos presentes en muestras de plantas y semillas que forman parte de la dieta de humanos y animales, y relacione la concentración con su potencial toxicológico. PROBLEMA: Que el alumno cuantifique la concentración de cianuro de hidrógeno presente en una serie de 3 muestras de semillas o plantas. Una de estas será proporcionada por el profesor y se deberá reportar al menos el 80% de la concentración real. Al final de la práctica el alumno indicará cual semilla podría presentar mayor riesgo de toxicidad para el humano, en base a la cantidad de HCN que estaría presente en el consumo de 50 g de muestra. INTRODUCCIÓN: Existe en la naturaleza una amplia gama de vegetales, alrededor de 1000 especies, que contienen glucósidos cianogénicos. Algunos de éstos están constituidos por alfa-hidroxinitrilos (aglucón), unidos a través de un enlace beta a un carbohidrato, que puede ser un monosacárido o un disacárido. Al hidrolizar estos compuestos, se obtiene, entre otros productos, ácido cianhídrico. Dicho proceso requiere de la presencia de la enzima β-glucosidasa, que rompe el enlace glucosídico, y de la enzima hidroxinitriliasa, que libera el ácido cianhídrico. Estas enzimas se encuentran presentes en la misma planta y actúan sobre los glucósidos, cuando la planta sufre ruptura del tejido debido a daños mecánicos( 2,3 ). La importancia de estos compuestos desde el punto de vista toxicológico radica en que se encuentran presentes a diferentes concentraciones, en vegetales que forman parte de la dieta de humanos y animales. Los estudios realizados en algunos alimentos, han permitido detectar glucósidos cianogénicos tales como: faseoliona, amigdalina, durrina y linamarina entre otros( 2 ). Entre dichos alimentos se encuentran leguminosas (varios tipos de frijol incluyendo el colorin); tubérculos como la casava; cereales como el sorgo; y semillas de algunas frutas como limón, lima, manzana, pera, cereza, durazno, albericoque y ciruela( 1, 4, 5 ). FUNDAMENTO:

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El método en el presente guión aprovecha la reacción, sensible y específica de Guignard, la cual es ampliamente utilizada en pruebas cualitativas para la detección de HCN como de glucósidos cianogénicos; sin embargo, con el uso de una curva estándar de cianuro alcalino, se podrá realizar dicha prueba en forma cuantitativa, expresándose en base al ácido
OH O2 N NO2 OH Medio Alcalino O 2N NC NO2 Isopurpurina NHOH

+ 2HCN
NO2 Acido pícrico

+ 1/2 O2
CN

cianhídrico liberado( 4, 6, 7 ). MATERIAL CANTIDAD. Tubos de ensaye( 20*150) con tapón de hule. 10 Cajas petri 1 Papel filtro cualitativo( filtración rápida ) 2 x10 cm. Tijeras, pinzas de disección y regla o escuadra graduada 1 juego (Traer por persona) Matraz erlenmeyer de 250ml. con tapón de hule. 10 Mortero con pistilo 1 Navaja 1 (Traer por persona) Pipeta de 1ml. graduada. 3 Probeta de 50ml. 1 Matraces volumétricos de 10 ml 6 Embudo de cola corta. 5 Vaso de precipitado de 100ml. 3 Tubo de ensaye( 13*150 mm ) 2 Celdas de 1 cm de diámetro 2 Guantes de hule 1 par (Traer por persona) Hielo Traer por equipo MATERIAL DE ESTUDIO Traer por persona aproximadamente 1g de muestras de plantas o semillas de: durazno, manzana roja, ciruela pasa, sorgo, bambú, colorín, lima, almendra de capulín, germen de soya. REACTIVOS Acido clorhídrico concentrado. Acido pícrico. Carbonato de sodio. Cloroformo. Cianuro de potasio

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PRECAUCIÓN: ALTAMENTE TÓXICO, PREPARAR Y MANEJAR CON GUANTES ( SOLUCIÓN ESTÁNDAR II). SEGURIDAD: A pesar de que la concentración utilizada de KCN en este guión es de aproximadamente 0.24 mg/mL y esta concentración está por debajo de la DL50 en ratones, no deberá descuidar las medidas de seguridad para su trabajo. MANEJO DE RESIDUOS: Los residuos de las soluciones que contienen KCN no deberán ser tiradas al drenaje directamente, recolectarlas en frascos y etiquetarlas. Tratamiento de residuos de soluciones que contienen KCN: colocarlas en hielo y adicionar lentamente una solución de hipoclorito de sodio, se dejan reposar por 24 horas y posteriormente podrán ser desechadas por la tarja con abundante agua. EQUIPO Espectrofotómetro Balanza analítica Estufa PROCEDIMIENTO: El alumno trabajará 3 muestras problema de plantas o semillas según la lista mencionada. Una de las cuales será proporcionada por el profesor. A) PREPARACIÓN DE LA TIRA REACTIVA Cortar papel filtro en tiras exactamente de 2x10 cm (preparar 1 tira por muestra), se sumergen en el reactivo de Guignard, dejándose escurrir. Introducirlas en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50-55oC, donde se dejan por aproximadamente 10 min (las tiras reactivas preparadas deben quedar ligeramente humedecidas al ser utilizadas en el procedimiento). B) PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS DE SEMILLAS O PLANTAS. Pesar 1 g de muestra de y colocarla por separado en el mortero, y con la ayuda de las pinzas de disección y navaja cortarlas y macerarlas lo más rápido posible. A cada una de las muestras se le realizará el siguiente procedimiento: Colocar la muestra fragmentada en un matraz erlenmeyer de 250 mL, medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumétrica y agregarlos al matraz. A continuación añadir 2 gotas de cloroformo y 1 mL de HCl 0.5 N. Colocar con cuidado la tira de papel reactivo humedecida como se ilustra en la figura (1). PRECAUCIÓN: No mojar la tira reactiva con los reactivos anteriores y tapar inmediatamente cada uno de los matraces erlenmeyer con su tapón después de concluir este procedimiento. Colocar el matraz Erlenmeyer en la estufa a 40oC por espacio de 1 h, agitando suavemente a intervalos de 15 min, teniendo precaución de que el contenido del matraz no tenga contacto con la tira reactiva de papel filtro, meter simultáneamente a la estufa los matraces con las diferentes concentraciones de la curva estándar de HCN. (El gas de HCN

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liberado reacciona con el reactivo de Guignard de la tira reactiva, formando un complejo NO TÓXICO).

TAPON DE HULE PAPEL FILTRO (TIRA REACTIVA)

MUESTRA

FIGURA 1. Preparación de la muestra en el matraz y colocación de la tira reactiva. C) PREPARACIÓN DE LA CURVA ESTÁNDAR La curva estándar de HCN se prepara colocando en matraces volumétricos de 25 mL los volúmenes de la solución patrón indicados en la siguiente tabla y llevando a volumen con agua destilada: CURVA ESTÁNDAR DE HCN. Alícuota de la solución Concentración (µg/mL) patrón (mL) 0.0 Blanco 0.1 0.4 0.2 0.8 0.3 1.2 0.4 1.6 0.5 2 Tratamiento de la curva estándar: 1) Una vez preparadas las soluciones de la curva patrón, pasarlas inmediatamente a matraces erlenmeyer de 250 ml, debidamente etiquetados.

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2) Colocar la tira reactiva en el matraz como se indica en la figura 1 y agregar a cada matraz 1 ml de la solución de HCl 0.5 N y dos gotas de cloroformo. PRECAUCIÓN: No mojar la tira reactiva con los reactivos anteriores y tapar inmediatamente cada uno de los matraces erlenmeyer con su tapón después de concluir este procedimiento. 3)Incubar por una hora con agitación cada 15 minutos. D) TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PROBLEMA, CURVA ESTÁNDAR Y BLANCO. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, los matraces se sacan de la estufa y se dejan enfriar. Se observan las tiras reactivas de las muestras problema y aquellas que no muestren ni siquiera una leve coloración café-rojiza se considerarán como prueba negativa; en tanto que aquellas que sí lo presenten son positivas y se introducen en un tubo de ensaye al cual se le adiciona 20 ml de agua destilada, se tapa y se agita vigorosamente con el fin de extraer el pigmento colorido; se procede a filtrar (con papel Whatman No. 40) para eliminar residuos de la tira de papel. Se determina la absorbancia de las muestras y de la curva patrón en el espectrofotómetro a 520nm, utilizando como blanco el primer punto de la curva. NOTAS: a) Las soluciones II, III y agua destilada deben de estar en baño de hielo antes de usarse. b) No olvidar poner 2 gotas de cloroformo a los matraces de la curva patrón. c) Antes de meter a la estufa los matraces de la curva patrón, colocar las tiras reactivas a cada uno de ellos (como se indica en la figura 1). PREPARACIÓN DE SOLUCIONES: Reactivo de Guignard: Se disuelve en agua destilada 2.5 g de ácido pícrico y a continuación 12.5 g de carbonato de sodio, llevándose a un volumen de 500 ml con agua destilada. MANEJAR CON CUIDADO EL ÁCIDO PÍCRICO, YA QUE ESTAS SUSTANCIA ES CANCERÍGENA Y SE ABSORBE FÁCILMENTE POR PIEL. Solución patrón de cianuro de potasio: se pesa exactamente 12.05 mg de KCN y se lleva a 50 ml de agua destilada. MANEJAR CON CUIDADO Y CON GUANTES LA SOLUCIÓN DE CIANURO ALCALINO YA QUE ES ALTAMENTE TÓXICO COLOCAR LA SOLUCIÓN EN BAÑO DE HIELO DESPUÉS DE PREPARARLA. Ácido clorhídrico 0.5 N. COLOCAR LA SOLUCIÓN EN BAÑO DE HIELO DESPUÉS DE PREPARARLA. CUESTIONARIO: 1.-¿Qué importancia tiene durante la práctica que la trituración de la muestra se realice rápidamente? 2.-¿Por qué la tira reactiva de papel no debe tocar la solución y por qué se da una reacción positiva sin que la tira reactiva esté en contacto con la muestra? 3.-¿Por qué considera necesario colocar la solución patrón de cianuro de potasio y el HCl 0.5N en baño de hielo? 4.-¿Por qué es necesario agregar cloroformo en el paso B) a sus muestras y en el paso D) a su curva estándar?

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5.- Por qué es necesario calentar la muestra? 6.-¿Cómo podría eliminar la presencia de glucósidos cianogénicos de una planta comestible? 7.- Grafíque los valores de absorbancia vs concentración obtenidos e interpole las absorbancias de las muestras. 8.- Reportar los resultados obtenidos en mg/50g de muestra, tomando en cuenta que la solución patrón es equivalente a 100 µg HCN/ml y llenar la siguiente tabla:. Muestra de semilla Concentración de mg HCN/50 g de muestra HCN (µg/mL) Riesgo de Toxicidad (marque con cruces)

9.- Con base a los resultados obtenidos ¿cuál muestra considera que representa un mayor riesgo potencial en su consumo? 10.- Proponga un método para extraer tóxicos volátiles a partir de una muestra. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Linder, E.; Toxicología de los alimentos; Acribia, pg. 15-19, Zaragoza ( 1978 ). 2. Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides. In: Toxicants ocurring naturally in foods; National Academy of Sciences; 2th Edition, pp. 290-308, Washington, D.C.( 1973 ). 3. Montgomery, R.D.; Cyanogens: AToxic constituyent of plant food stuffs; Liener, I.E; Academic Press, pp. 143-160, N.Y.( 1980 ). 4. Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides; Agr. Food Chem. 17, 519-526 (1969). 5. Eyjolfsson, R.; Recent Advances in chemistry of cyanogenic glucosides; Fortsch. Chem. Orgn. Naurist. 28, 74-108 (1970). 6. Fabre, R. Y Truhaht, R.; Tratado de toxicología; Paraninfo, S.A., Vol. I, pág. 311-332, Madrid (1976). 7. Lucas, B. and Sotelo, A.; A simplified test for the quantitation of cianogenic glucosides in wild and cultivated seeds; Nutr. Rep. Int. 29 ( 3 ), 711-719( 1984 ).

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“IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES Y BARBITURICOS EN MUESTRAS BIÓLÓGICAS”. OBJETIVOS. 1. Aplicar los procesos de extracción en medio ácido y medio básico para extraer alcaloides y barbitúricos en muestras biológicas. 2. Aplicar la cromatografía en capa fina (CCF) para identificar tóxicos no volátiles (alcaloides y barbitúricos) en muestras biológicas. MATERIAL Embudo de separación de 250 ml Embudo de cola corta Matraz Erlenmeyer de 125 ml Matraz de bola de 50 ml Vaso de precipitado de 250 ml Vaso de precipitados de 100 ml Pipeta pasteur Tubo capilar REACTIVOS Hidróxido de amonio Metanol Ácido acético glacial, Carbonato de bismuto Acetato de cobalto tetrahidratado Silica Gel Yodo metálico Ioduro se sodio Acetato de etilo Isopropilamina 2 Agitador de vidrio 2 Probeta de 10 ml 3 Pipeta graduada de 10 ml 2 Gogles 3 Anillo metálico 4 Tubos de ensayo 3 Anillos de corcho 2 1 1 2 1 1 4 2

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EQUIPO Rotaevaporador Lámpara de luz ultravioleta Bomba de aspersión Potenciómetro

PROCEDIMIENTO 1. Obtener en forma no ionizada los alcaloides (ergotamina y cafeìna) y barbitúricos (fenobarbital), proporcionados por sus profesores, de su muestra problema empleando técnicas de extracción en medio básico y/o en medio ácido. 2. Una vez obtenida la forma no ionizada de las sustancias a evaluar dividirlo en 2 partes, ambas se evaporarán a sequedad en un rotaevaporador, se dejaran enfriar y los residuos se reconstituirán con 0.5 mL (3 o 4 gotas) de metanol. 3. Solicitar a los profesores 2 placas para cromatografía en placa fina. 4. Preparar la fase móvil, investigada previamente, para eluir sus cromatoplacas y sature sus cámaras cromatográficas con la mezcla correspondiente, durante 10 minutos. 5. Realizar por separado, la placa cromatográfica de su muestra problema con su referencia (colocar una gota de la fracción de alcaloides o de barbitúricos, con un capilar, y una gota del estándar proporcionado por el profesor), desarrolle el cromatograma correspondiente en cada uno de los sistemas de elución. 6. Visualice la presencia de alcaloides y/o barbitúricos con una lámpara de luz U.V. y posteriormente revele las placa cromatográficas en una cámara de yodo. Calcule el Rf para de cada sustancia y compare el valor obtenido con el del estándar. 7. Con la otra parte, realizar el siguiente procedimiento (pruebas de identificación): 7.1 Alcaloides a) Colocar 2 gotas de la fracción, previamente solubilizada en metanol y agregar 2 gotas de HCl 1N más 2 gotas del reactivo de Dragendorff (solución reveladora). La aparición de un precipitado color marrón indica positiva la reacción. b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con agua) para esta reacción. 7.2 Barbitúricos

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a) Colocar tres gotas de la fracción correspondiente previamente solubilizada en metanol y agregar tres gotas del reactivo A y tres gotas del reactivo B (Dille-Koppanyi), la aparición de un color púrpura-rojizo indica prueba positiva. b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con agua) para esta reacción. PREPARACION DE REACTIVOS a) Reactivo de Dragendorff (Solución stock) Solubilizar 2.6 g de carbonato de bismuto y 7.0 g de yoduro de sodio en 25 ml de ácido acético glacial, calentar por l0 minutos a 40oC para solubilizar el reactivo Dejar reposar por 12 horas y posteriormente filtrar la solución. 20 ml del filtrado (solución rojo-café) se mezclan con 8 ml de acetato de etilo, la solución anterior guardarla en un frasco ámbar (la cual es estable por 6 meses). b) Reactivo de Dragendorff (Solución reveladora) Mezclar 10 mL de la solución stock con 25 ml de ácido acético glacial y 60 mL de acetato de etilo. c) Reactivo A (Dille-Koppanyi) Solubilizar 0.1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 ml de metanol absoluto, y agregar 0.2 mL de ácido acético glacial. d) Reactivo B (Dille-Koppanyi) Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 25 ml de metanol absoluto NOTA: El reactivo A y el reactivo B son estables por 2 días.

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CUESTIONARIO 1. Esquematice la forma no ionizada de sus tóxicos 2. ¿Cómo identificó los alcaloides de su muestra problema? 3. ¿Cómo identificó los barbitúricos de su muestra problema? 4. ¿Cuáles son las reacciones que se llevan a cabo en esta práctica? 5. ¿Qué ventajas podría señalar en el uso de la extracción ácida para alcaloides y en la extracción básica para barbitúricos? 6. Desde el punto de vista químico ¿cómo se comportan los alcaloides (Nicotina y Cafeína) en un medio ácido y en un medio básico? 7. Desde el punto de vista químico ¿cómo se comportan los barbitúricos (Fenobarbital y Pentobarbital) en un medio ácido y en un medio básico? 8. ¿Qué parámetro resulta más importante para realizar una extracción del 100% para alcaloides y barbitúricos, el valor del pka ó el valor del pH? REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Clark E. E. Isolation and identification of Drugs. Pharmaceutical Press, London, 1972 Vol. I y II 2. Bowman y Rand. Farmacología. Bases Bioquímicas y Patológicas. 2ª. Ed. Interamericana, 1984. 42.25-42.32. 3. Goodman and Gilman. Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica. Panamericana. México. 8ª. Ed 1991.

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“PRODUCCION DE MiHb POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO” OBJETIVO: Demostrar la formación de metahemoglobina (MiHb) por la administración de nitrito de sodio in vivo y el efecto protector del azul de metileno. MATERIAL: Jeringa de insulina Tubos de ensaye de 13x100 Pinzas de disección Caja de contención Balanza para animales Pipeta graduada de 5 mL Centrífuga Pipeta graduada de 0.1 mL

3 10 1 1 1 2 1 1

Jeringa de 3 mL Tijeras de disección Tabla de disección Rejilla Pipeta graduada de 1 mL Tubos de ensaye de 16x150 Espectrofotómetro Frasco gotero con su gotero

3 1 1 1 1 3 1 1

REACTIVOS: Heparina 1000 UI al 30% o EDTA al 10% Cianuro de potasio Solución salina isotónica (SSI) Acido acético glacial Hidróxido de amonio conc. MATERIAL BIOLOGICO: 3 ratas del mismo sexo de 200-250 g por equipo. PROCEDIMIENTO:

Buffer de fosfatos pH 6.6 Ferricianuro de potasio 20% Nuevo azul de metileno (4 mg/rata en SSI) Nitrito de sodio (50 mg/Kg en SSI) Eter dietílico

1. En esta sesión se trabajará en equipos, a cada uno de los cuales les serán proporcionadas 3 ratas.

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2. Pesar cada uno de los animales e identificarlos como I, II y III. 3. Administrar a la rata III, por vía intraperitoneal (i.p.) una dosis unica de 4 mg de la solución de azul de metileno disueltos en 0.5mL de SSI y 15 minutos después administrar por la misma vía 50 mg/Kg de la solución de nitrito de sodio. 4. Administrar a la rata I (rata control) por vía i.p., 0.5 mL /rata de SSI. 5. Administrar a la rata II por vía i.p., 50 mg/kg de nitrito de sodio disuelto en un volumen máximo de 0.5mL de SSI. 6. Extraer de cada rata 30 mim después de cada administración y por punción cardiaca, bajo anestesia con eter, 3 mL de sangre y colocarla en un tubo de ensaye con 5 gotas de heparina o EDTA. Mezclar perfectamente por inversión los tubos para evitar la coagulación de las muestras. 7. Determinar el contenido de metahemoglobina y hemoglobina total de cada muestra como se indica a continuación: a) Colocar 4.9 mL de solución amortiguadora de fosfatos en un tubo de ensaye. b) Agregar 0.1 mL de sangre. c) Mezclar y dejar reposar durante 5 minutos. d) Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos. e) Separar el sobrenadante. f) Medir la absorbancia del sobrenadante a 630 nm (Lectura A1), contra un blanco de buffer de fosfatos. g) Devolver la solución al tubo de prueba. h) Agregar una gota de la solución neutralizada de cianuro de potasio al sobrenadante y al blanco. i) Mezclar y dejar reposar 2 minutos. j) Determinar nuevamente la absorbancia a 630 nm (Lectura A2). k) Agregar una gota de hidróxido de amonio concentrado al tubo del inciso i, y mezclar. l) Transferir 2 mL de la solución del tubo del inciso i, a otro tubo y agregar 8 mL de la solución amortiguadora y 0.1 mL de la solución de ferricianuro de potasio al 20% en solución acuosa. m) Preparar un blanco empleando 2 mL de agua destilada, 8 mL de solución amortiguadora y 0.1 mL de la solución de ferricianuro de potasio al 20% en solución acuosa. n) Después de 2 minutos agregar una gota de la solución neutralizada de cianuro de potasio a cada tubo (blanco y problema). o) Mezclar, esperar 10 minutos y determinar la absorbancia a 540 nm contra su respectivo blanco (Lectura A3). 8. Cálculos: Hemoglobina total (Hbt) en g/100 mL = A3 x 37.4 Metahemoglobina total (MiHbt) en g/100 mL = (A1-A2) 23.4 % de MiHb en sangre total = (MiHbt) x 100/Hbt 9. Reporte Con las absorbancias obtenidas en el grupo, hacer una tabla con los valores de Hbt y MiHbt en g/100 mL para cada rata. Para cada tratamiento, promediar los valores obtenidos y graficar los resultados de Hbt y MiHbt . Realizar otra gráfica únicamente con los % de MiHbt promedio de cada tratamiento y,

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Analizar y concluir sobre los resultados obtenidos. 10. Preparación de soluciones: a) Solución amortiguadora de fosfatos (M/60, pH = 6.6). Preparar inicialmente una solución amortiguadora M/15, pH 6.6 disolviendo 3.8 g de fosfato disódico anhídro y 5.44 g de fosfato monopotásico anhídro en 1000 mL de agua destilada. A partir de esta solución M/15 mezclar una parte con tres partes de agua destilada, para obtener la solución M/60. b) Solución de cianuro de potasio neutralizada: mezclar una parte de la solución de cianuro al 10% y otra parte de ácido acético glacial al 12% (v/v). CUESTIONARIO: 1. Proponga un esquema que explique el efecto protector de los nitritos en una intoxicación por cianuro y el efecto protector del azul de metileno, en una intoxicación por nitritos. 2.-¿Qué complejo se esta determinando a 630 nm y a que corresponde A1, A2 y A3, 3.-¿Por qué leemos en el espectrofotometro a dos diferentes longitudes de onda? 4.-¿Para qué se agrega hidróxido de amonio en el paso “k” de su técnica? 5.-¿Por qué se agrega ferricianuro de potasio? 6.-¿Para qué se agrega el cianuro de potasio neutralizado? REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: 1. Amadeo J. Pesce, Kaplan, L.A. Methods in Clinical Chemistry c.v. Mosby Co. USA 1987. 2. Boer N.C. et. Al Clinical Chemistry. Plenum press. USA 1989. 3. Frank, K.R., Blood Essay in Toxicology Academic Press. Vol. I 1969. 84-109.

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“DETERMINACION DE MALATION RESIDUAL” INTRUDUCCION El desarrollo de compuestos tóxicos con mayor especificidad hacia los insectos, es un camino que se ha seguido en la industria de pesticidas; de los cuales los insecticidas organofosforados son los de mayor uso en la actualidad. Este grupo de compuestos, a diferencia de los organoclorados no causan daños severos al medio ambiente, ya que son biodegradables (1,2). Los insecticidas organofosforados actúan por fosforilación de una enzima sérica de suma importancia en el metabolismo del insecto. Las enzimas destoxificantes tanto en los mamíferos como en los propios insectos son: carboxiesterosas, oxidasas (microsomales) y carboxiamidasas; sin embargo, en los insectos éstas son muy poco efectivias (1). El malatión es un insecticida de amplio espectro, especialmente útil contra ácaros y otros parásitos y desde su lanzamiento en los años cincuenta, es uno de los de mayor uso, que se puede encontrar frecuentemente en los alimentos aunque a un nivel bajo de contaminación (3,5). FUNDAMENTO: El malatión residual que se encuentra en la superficie de una fruta se extrae con tetracloruro de carbono y se somete a una hidrólisis alcalina en presencia de etanol para efectuar una β-eliminación (2)´el O,O-dimetil-fosforoditionato de sodio al ponerse en contacto con el catión Cu+2, nos forma un complejo quelante de coloración amarilla, el cual es directamente proporcional a la concentración de malatión en la muestra y puede ser medido a una longitud de onda de 416 nm (3,4,5). MATERIAL Pipeta volumétrica de 20 mL Matraz aforado de 10 mL Pipeta graduada de 1 mL Pipeta graduada de 5 mL Pipeta graduada de 10 mL Embudo de filtración rápida

1 1 3 2 2 1

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Embudo de separación de 250 mL 2 Probeta graduada de 100 mL 2 Tubo de ensaye de 16x150 mm 2 Propipeta 1 Vaso de precipitado de 250 mL 6 Soporte universal con anillos de fierro 2 jgos. Nota: Traer guantes y cubrebocas por alumno

REACTIVOS Sulfato de sodio Hidróxido de sodio Cloruro férrico Sulfato cúprico Malation al 50% Fenolftaleína al 1% en etanol Etanol Tetracloruro de carbono

PREPARACION DE LAS SOLUCIONES: I) Solución patrón: 0.1 mL de malatión al 50% se lleva a 100 mL con etanol; en esta solución se toman 8 mL y se llevan a 100 mL nuevamente con etanol. II) Disulfuro de carbono al 0.5% en tetracloruro de carbono. III) Solucion de sulfato de sodio al 9%. IV) A 100 mL de la solución anterior adicionarle 3 mL de HCl concentrado (solución ácida de sulfato de sodio). V) Hidróxido de sodio 6N. VI) 5 g de cloruro férrico se disuelven en 1 mL de HCl 6N (4.85 mL de HCl concentrado en 10 mL de agua destilada), y después se lleva a 100 mL con agua. VII) Solución de sulfato cúprico al 3.5%. VIII) Fenolftaleína (gotas por muestra). IX) HCl 6N (gotas por muestra). PROCEDIMIENTO: a) Se colocan 25g del material sospechoso en un frasco de vidrio de boca ancha y se le añaden 25 mL de tetracloruro de carbono, se tapa y se agita vigorosamente por 5 minutos, se procede a filtrar a través del papel filtro recolectándose cuando menos 60 mL (medido con probleta). El material vegtal desecharlo en forma correcta. Se procede a preparar 3 tubos para la curva patrón y dos para el problema de la siguientes manera: b) Para los tubos problemas se colocan 10 mL del extracto filtrado y se le adiciona 0.2 mL de solución II y 5 mL de etanol, esta mezcla se pasa a un embudo de separación donde se agita suavemente y se le adiciona 15 mL de solución ácida de sulfato de sodio (IV).

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c) Agitar vigorosamente el embudo por 1 minuto, separar las fases y filtrar la fase orgánica colectándola en un embudo de separación limpio, añadir 5 mL de etanol, agitar y después añadir 0.2 mL de NaOH 6N (sol. V) agitando nuevamente por 5 minutos, dejar reposar otro minuto y adicionar 15 mL de solución de sulfato de sodio (III), mezclar y descartar la fase orgánica. d) Añadir 5 mL de tetracloruro de carbono a la fase acuosa y 0.3mLde sol. de sulfato cúprico (sol. VII) gota de indicador de fenolftaleína, agitando el embudo se procede a neutralizar gota a gota con HCl 6N hasta desaparición del color azul violeta.

e) Una vez neutralizada la mezcla anterior se añade 0.2 mL de solución de cloruro férrico (sol.VI) se agita y se deja reposar para poder desechar la fase orgánica. f) Por último se añaden a la fase acosa 5 mL de tetracloruro de carbono y 0.3 mL de solución de sulfato cúprico (VII); en el caso del blanco de la muestra se sustituye por agua destilada, se agita vigorosamente por 1 minuto y se colecta la fase orgánica, la cual se lee en el espectrofotómetro a 416 nm, ajustándolo previamente con su respectivo blanco. En el caso de los tubos de la curva estándar se preparan de la siguiente forma: Tubo 1 ⇒ 1 mL de solución patrón (I)/ 4 mL de etanol Tubo 2 ⇒ 2.5 mL de solución patrón (I)/ 2.5 mL de etanol Tubo 3 ⇒ 5.0 mL de solución patrón (I) Cada uno de ellos se colocan en un embudo de separación y se le adicionan 15 mL de tetracloruro de carbono y 0.2 mL de solución II. Se agita suavemente y se continua como en los párrafos anteriores. CALCULOS: Construir la curva de referencia ajustando a 100 % T con el solvente orgánico de uso en la extracción. Al revisar los resultados, sí encontró la presencia de malatión en su muestra, reportarlo en ppm. CUESTIONARIO: a) Escriba la estructura química del malatión y cuales son los productos de la β-eliminación. b) Indique brevemente el mecanismo de toxicidad del malatión en el insecto. c) C) ¿Por qué el malatión relativamente es inofensivo a los mamíferos? d) Indique el DL50 del malation para un insecto y un mamífero cualquiera y dé un breve comentario. e) La cantidad de malatión que usted encontró en su alimento analizado, ¿cómo lo considera? BIBLIOGRAFIA:

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1. Albert, Adrien. Selective Toxicity (the physico-chemical basis of theraphy) 6th Edition Chapman and Hall, pp. 455-463, London (1979). 2. Esto, Morifusa Organophosphorus pesticides: Organic and Biological Chemistry CRC Press, pp. 62-77, 103, 196-199, Cleveland (1976). 3. Norris, M.V.; Voil, W.A. and Averall, P.R. Colorimetric estimation of malation residues. J. Agric. Foof Chem. 2, 570 (1954). 4. Cremlyn, C. Pesticides and mode of action John Wiley & Sons, N.Y. (1978). 5. White-Stevens, R. Pesticides in the enviroment Part I and II, Marcel Dekker, Inc., N:Y: (1971).

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