ANALISIS DE PROTEINAS

PROTEINAS Y SU NECESIDAD Entre todos los compuestos qumicos, las protenas deben considerarse ciertamente como los ms importantes, puesto que son las sustancias de la vida. Las protenas constituyen gran parte del cuerpo animal; lo mantienen como unidad y lo hacen funcionar. Se las encuentra en toda clula viva. Ellas son el material principal de la piel, los msculos, tendones, nervios y la sangre; de enzimas, anticuerpos y muchas hormonas. Desde un punto de vista qumico, las protenas son polmeros grandes. Son poliamidas y los monmeros de los cuales derivan son los cidos a -aminocarboxlicos. Una sola molcula protenica contiene cientos, e incluso miles, de unidades de aminocidos, las que pueden ser de unos 20 tipos diferentes. El nmero de combinaciones diferentes, es decir, el nmero de molculas protenicas distintas que pueden existir, es casi infinito. Es probable que se necesiten decenas de miles de protenas diferentes para formar y hacer funcionar un organismo animal; este conjunto de protenas no es idntico al que constituye un animal de tipo distinto. Las protenas son necesarias para la formacin y renovacin de los tejidos. Los organismos que estn en perodo de crecimiento necesitan un adecuado suministro de protenas para su aumento de peso. Los organismos adultos que tienen su peso estabilizado estn en equilibrio dinmico, en el que sus protenas se degradan y se regeneran continuamente, aunque su composicin permanece constante. Para ello debe existir en la dieta un suministro regular y continuo de protenas. PROCEDIMIENTO DE KJELDAHL Aunque se ha modificado durante aos, el procedimiento bsico de Kjeldahl mantiene an su posicin como la tcnica ms fidedigna para la determinacin de nitrgeno orgnico. En consecuencia, es incluido entre los mtodos oficiales estatuidos y es aprobado por las organizaciones internacionales. Adems, los resultados obtenidos mediante el mtodo de Kjeldahl se usan para calibrar los mtodos fsicos y los automticos. Se han empleado muchos catalizadores. Se ha considerado que el ms efectivo es el mercurio en forma de xido mercrico; as como el selenio, que es casi tan efectivo como aqul, pero ambos tienen riesgos txicos y problemas para desecharlos. Adems, el mercurio forma complejos con el amonaco en el lquido de digestin que requieren la adicin de tiosulfato de sodio para romper

esos complejos y liberar el amonaco. Williams (1976) recomend el uso de una mezcla de sulfato de cobre (II) y bixido de titanio. A pesar de ello, Wall y Gehrke (1975) consideraron que esta mezcla es menos efectiva. Tambin se ha conseguido reducir el tiempo de digestin por adicin de sulfato de sodio o de potasio que elevan la temperatura de digestin. Los catalizadores metlicos se pueden obtener en forma de tableta muy convenientes, compuestas en una base de sulfato de potasio. Concon y Soltness (1973) y Koops y cols. (1975) han informado que la adicin de perxido de hidrgeno acelera significativamente la digestin y disminuye la formacin de espuma. Tradicionalmente, el amonaco liberado del lquido de digestin hecho alcalino se destila a una cantidad de cido diluido normal, que finalmente es titulado con lcali normal para dar el contenido en nitrgeno orgnico en la muestra. Ahora es ms popular destilarlo a una solucin de cido brico al 4 % y titular directamente al amonaco con cido sulfrico normal. EQUIPOS,MATERIALES Y REACTIVOS Balanza analtica. Baln de Kjeldahl. Hornillas elctricas. Aparatos de destilacin de Kjeldahl. Mltiple con elementos de calentamiento y sistema de absorcin de gases. Papel de filtro Whatman (no importa la malla) o papel glacine. Vasos Erlenmeyers y buretas. Acido sulfrico concentrado. Mezcla sulfato de cobre - sulfato de potasio (mezcla catalizador-elevador de la temperatura). Acido brico. Soda custica al 50 %. Acido clorhdrico 0,1 N. Indicador rojo de metilo. Granallas de zinc. DETALLES EXPERIMENTALES

1.- Pese 1 gramo de muestra en el papel de filtro, envolver e introducirlo en el baln de Kjeldahl. 2.- Aada una cuchara a ras de la mezcla catalizador-elevador de la temperatura, adicionar 25 ml. de cido sulfrico concentrado por los bordes del baln con sumo cuidado. 3.- Coloque el baln de Kjeldahl en la hornilla elctrica para su ataque durante una hora y media aproximadamente. La finalizacin del ataque se observa por la aparicin de una solucin de color verde-esmeralda lmpido. Durante la hora y media de digestin, el baln de Kjeldahl se v rotando peridicamente con la finalidad de que la combustin de la materia orgnica en la muestra sea homognea. 4.- Deje enfriar el producto as obtenido y adicione aproximadamente 500 ml. de agua. 5.- Antes de iniciar el proceso de destilacin, en un vaso erlenmeyer aada 50 ml. de cido brico y 3 a 4 gotas de indicador rojo de metilo. Coloque el vaso erlenmeyer en el terminal del equipo de destilacin de modo que el terminal quede inmerso en la solucin brica. 6.- En el baln de Kjeldahl, despus de adicionar los 500 ml. De agua, aada unas cuantas granallas de zinc e inmediatamente 50 ml de solucin de soda al 50 % y coloque en el equipo de destilacin, ajustando bien la parte inicial de ste al baln de Kjeldahl. 7.- Inicie la destilacin, hasta obtener un volmen aproximado de 250 ml. de destilado en el vaso erlenmeyer e interrumpa el proceso de destilacin. 8.- Titule el contenido del vaso erlenmeyer con HCl 0,1 N hasta variacin de color, en este caso amarillo a rojo. Anote el volmen gastado.

CALCULOS :

V x N x 14 x f % PROTEINA = -------------- x 100 % 1000 x W

Donde : V = volmen gastado de HCl en la titulacin. N = normalidad del HCl. 14 = equivalente-gramo del nitrgeno. W = peso de muestra. f = factor proteico. FUNDAMENTO DEL METODO DE ANALISIS Segn lo descrito en el procedimiento, la muestra se disuelve en cido sulfrico concentrado y se calienta con la finalidad de que la materia carbonosa se libere en forma de CO2, los minerales se sulfaten y el nitrgeno se transforme en sulfato de amonio. Como catalizador se utiliza CuSO4, puede usarse sales de Hg, Zr, Se, pero stos dos ltimos son muy caros y el Hg es txico. El K2SO4 sirve como elevador de la temperatura de ebullicin (no es catalizador), por cada 10 C de elevacin de la temperatura, la velocidad de la reaccin se duplica. El ataque finaliza cuando la solucin se torna de un color verde-esmeralda lmpido. En este proceso de digestin o ataque de la muestra, se libera en la digestin la grasa, fibra, carbohidratos presentes en la muestra en forma de CO2; la parte oxigenada de la protena tambin se libera, slo queda la parte nitrogenada de la protena. Al final del ataque, se tiene en la solucin H2SO4 sobrante, sales sulfatadas de los minerales disueltas, y el sulfato de amonio. En el proceso de destilacin, se aade al baln de Kjeldahl 500 ml. de agua con la finalidad de diluir al cido sulfrico remanente, a la vez que el sulfato de potasio, sulfato de cobre y sulfato de amonio disueltos precipiten, dejando libre en la parte superior el H2SO4 sobrante; es decir hay formacin de dos fases. Luego se aaden algunas granallas de zinc con la finalidad de evitar la ebullicin tumultuosa creando ncleos de vaporizacin. Inmediatamente despus de este paso se adiciona la soda custica por los bordes del baln, para evitar una reaccin violenta con el cido sulfrico remanente y el (NH4)2SO4. La adicin de la soda neutraliza la accin del cido sulfrico sobrante, favorece la liberacin del amonaco en forma de NH4OH que ser recibido en el vaso erlenmeyer que contiene la solucin de cido brico. Inicialmente, al producirse el calentamiento desaparecen las dos fases, se forma una solucin de color celeste-oscuro, luego al ebullir se torna color marrn debido a la presencia de un complejo cprico, que desaparece a medida que se libera el amonaco. El amonaco es captado por la solucin de H3BO3, que forma un complejo estable, esto se observa debido al cambio de

color que experimenta la solucin de cido brico, rojo a amarillo, producido por el amonaco y que alcaliniza la solucin progresivamente, a medida que es captado por el cido brico; esto es visible gracias al indicador rojo de metilo, pudindose usar otro indicador segn el rango de viraje. Posteriormente, se determina por titulacin con HCl 0,1 N hasta cambio de color, en este caso, amarillo a rojo-grosella, el volmen gastado de cido y se procede con los clculos. Este mtodo de anlisis es aplicable a todo tipo de alimento en general. Si el alimento ha sido enriquecido con rea, la expresin del resultado es engaosa. METODOS RADIOQUIMICOS PARA EL CONTENIDO DE NITROGENO Se han descrito tcnicas automticas rpidas, sencillas y seguras, basadas en el anlisis por activacin neutrnica (Doty y cols., 1970) y anlisis por activacin de protones (Dohan y cols.,1976). Williams y cols.(1978) han publicado informacin sobre estudios comparativos usando anlisis de Kjeldahl, KjelFoss, KjelTecpor, reflectancia infrarroja, activacin de neutrones, activacin de protones y descomposicin trmica. Los autores afirman que para la determinacin de nitrgeno en trigo, todos los mtodos fueron satisfactorios y pueden tomar el lugar del mtodo de Kjeldahl como mtodos estndar. Se afirma que el anlisis por activacin de neutrones es el ms exacto, preciso y econmico. FACTORES DE CONVERSION DE NITROGENO A PROTEINA CRUDA La determinacin de nitrgeno total por los procedimientos normales de Kjeldahl no incluyen la forma de nitrgeno inorgnico, por ejemplo, los nitritos y nitratos. Sin embargo, los mtodos radioqumicos pueden detectar y medir el nitrgeno en todas las formas de combinacin. En ciertos alimentos es alto el nitrgeno no protenico (pescado, frutas y legumbres), pero los factores usados comnmente para convertir nitrgeno en protena cruda estn basados en el contenido promedio de nitrgeno en las protenas contenidas en ciertos alimentos en particular (Jones, 1931). FAO/WHO (1973) recomendaron incluir los siguientes factores : Trigo-harina entera ............................. 5,83 Harinas (excepto la entera) ................. 5,70 Salvado ..................................... 6,31 Arroz ........................................... 5,95 Cebada, avena, centeno .......................... 5,83 Maz ............................................ 6,25 Soya ............................................ 5,71

Nueces-cacahuates, nueces del Brasil............. 5,41 almendras ................................... 5,18 otras nueces ................................ 5,30 Leche y productos lcteos ....................... 6,38 Gelatina ........................................ 5,55 Todos los otros alimentos........................ 6,25 DETERMINACION DIRECTA DE PROTEINAS Las protenas de los alimentos contienen aminocidos que tienen varios grupos funcionales, por lo que muestran una amplia variedad de reacciones qumicas. Debido a que los alimentos contienen mezclas de protenas, los mtodos directos para la estimacin de protenas deben ser calibrados contra un mtodo estndar de referencia para nitrgeno, por ejemplo, el procedimiento de Kjeldahl. TITULACION CON FORMOL Cuando se adiciona formalina a una solucin acuosa neutralizada, que contiene protenas, el grupo -NH2 reacciona para formar el grupo metilenoimino -N=CH2 con la liberacin de un protn que puede titularse. METODOS COLORIMETRICOS Se ha empleado la reaccin de Biuret que d una coloracin prpura cuando los enlaces peptdicos reaccionan con los iones cpricos a un pH alcalino y se ha informado que no interfieren pequeas cantidades de azcares reductores (Mitsuda y Mitsunaga, 1974). El mtodo ha sido mejorado considerablemente mediante el uso de propano-2-ol y la aplicacin de calor (Noll y cols.,1974). El reactivo de Folin (cido fosfomolbdico-fosfotngstico) es reducido por las protenas para formar un complejo azul de molibdeno. Los colorantes de cidos sulfonados reaccionan con protenas a pH bajo para formar un cogulo protena - colorante insoluble-. Si se separa este cogulo por filtracin o centrifugacin, la cantidad de color que permanece en el lquido sobrenadante es indirectamente proporcional a la cantidad de protena en la muestra. La reaccin del colorante con las protenas es compleja y no uniforme, por lo que este mtodo es altamente emprico y requiere estandarizacin y calibracin. DESTILACION DIRECTA Debido a la presencia de los aminocidos asparagina y glutamina que reaccionan tanbin como amidas, los alimentos protenicos desprenden amonaco cuando se destilan con un exceso de solucin concentrada de

hidrxido de sodio. Ronalds (1974) us esta tcnica empleando el aparato de destilacin de Kjeldahl para la determinacin de protenas en trigo y cebada. METODOS AL INFRARROJO La radiacin infrarroja es la base del amplio uso de un rpido equipo automtico, particularmente para leche y para granos. Las series IRMA de NEI Electronics son absorcimetros de doble rayo, diseados para la determinacin simultnea de protenas, lactosa y grasa en la leche. La reflectancia en el infrarrojo cercano es el desarrollo ms moderno para el anlisis de cereales molidos y otros alimentos slidos. Tanto el Rank Neotec GQA como el Technicon InfraAlyzer pueden estimar protenas, aceite y humedad en tan slo unos pocos minutos. Los instrumentos son calibrados con muestras de composicin conocida. Al establecer la confiabilidad de cinco mtodos para la determinacin de protenas en la cebada y en la malta (Pomeranz y cols.,1977) encontraron que el mtodo del Biuret y el del colorante asociado a protenas fueron los ms coincidentes con el de Kjeldahl, los mtodos de reflectancia al infrarrojo fueron intermedios y la destilacin alcalina directa fu el ms pobre.