UNIVERSIDAD RICARDO PALMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Cultivo in Vitro de tejido meristemtico de Morus nigra L. ``Mora negra``

CURSO: TALLER DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL INVESTIGADORES: Custodio Zegarra, David. Dvila Burga, Nicholas. Rivera Charun, Maria Lucia. ASESOR: Dr. Mauro M. Quiones A. 2012 I

Cultivo in Vitro de tejido meristemtico de Morus nigra ``Mora negra``

I. INTRODUCCIN: La morera es una especie caducifolia que pertenece al orden Urticales, familia Moraceae y gnero Morus. La familia Moraceae se subdivide en cuatro subfamilias que agrupan 55 gneros y 950 especies, en su mayora intertropicales. Es originaria de China y es un rbol frondoso de ramas finas, cuyas hojas se utilizan, desde hace cinco mil aos, para alimentar a los gusanos de seda. Las especies ms conocidas son Morus alba y Morus nigra (Snchez, 1999).

Esta planta es conocida por su valor comercial, tanto para consumo masivo, como por sus valores antioxidantes, y para la crianza de gusanos de seda. Actualmente en el pas, no existe una produccin a gran escala de Morus nigra, teniendo que importar la planta de otros pases como Chile.

El cutilvo de meristemos de Morus nigra, tiene como objetivo la produccin de plantas libres de virus, que puedan reproducirse asexualmente de forma rpida, eficiente y en grandes cantidades. Esto tendr como efecto la baja de precio de los productos obtenidos de esta planta y la mayor probabilidad del uso masivo de sus beneficios.

II. ANTECEDENTES

1. Sharma et al., (2002) Para la aplicacin de un mtodo de micropropagacin de

Crataeva adanson planta de templo, se tomaron tres tipos de explantes: segmentos nodales conteniendo una yema axilar, brotes conteniendo las primeras dos o tres yemas axilares; y meristemos apicales. 2. Salas et al. (2005) Para inducir la brotacin, y multiplicar Morus alba morera va segmentos apicales se adiciona al medio de cultivo MS, 0.5 mg.l de 6-BAP

y 0.5 mg.l ANA. Se observ un 95% de supervivencia en la fase de aclimatizacin.

3. Rachu et al., (2005) Tinospora cordifolia guduchi tiene una germinacin pobre
en su habitat natural. La micropropagacin puede ayudar en la propagacin y conservacin de esta planta. El cultivo de meristemos, permite una propagacin rpida de ciertas plantas y un alto grado de uniformidad gentica en la progenie. Este estudio reporta un mtodo de propagacin eficiente y rpido para Tinospora cordifolia. 4. Jenni et al., (2005) Se determino la respuesta de los brotes apicales y axilares de la Lactuca sativa lechuga en cultivos in vitro. Explantes apicales y axilares fueron extrados y colocados en medio MS. Luego de 3 meses de cultivo, las plantas derivadas del meristemo apical crecieron ms rpido y desarrollaron un promedio de 6.6 hojas a comparacin de promedio de 3.0 hojas. las plantas derivadas de los meristemos axilares que crecieron en menor tiempo y desarrollaron un

5. Valencio et al., (2007), Un protocolo eficiente fue desarrollado para la

propagacin in vitro de Curculigo orchioides rizoma de curculigo a travs del cultivo de meristemos apicales. Se indujo multiplicacin clonal de los meristemos apicales cultivados en medio MS suplementado con 1.5mg/l. de benzyladenina, 100mg. de sulfato adenina y 3% de sacarosa. La inclusin de cido butrico-3-indol (IBA) o de cido indol3-actico (IAA) en el medio de cultivo mejora la formacin de mltiples brotes. 6. Sujatha y Hazra (2007) El medio MS con benzylaminopurina (BA), kinetina (KN), zeatina (Z) y thidiazuron (TDZ) fueron probados para la induccin de mltiples brotes de meristemos de tres rboles maduros de Pongamia pinnata algarrobo aceitero.

7. Kalinina y Brown (2007) Se desarrollo un sistema seguro de micropropagacin para nueve especies de rboles ornamentales del gnero Prunus, que tiene una alta importancia comercial en Amrica del Norte. El duraznero GF305 (Prunus prsica), se us como indicador de enfermedades de Prunus para la certificacin de plantas libres de virus. El protocolo de esterilizacin del

meristemo minimiza la contaminacin bacterial y fungica. La propagacin en las especies de Prunus fue obtenida utilizando 1 mg.l de benzyladenina.

8.

Anis et al., (2008) Estudiaron una tcnica de propagacin in vitro del rbol multiuso Balanites aegyptiaca heglig. Utilizaron segmentos nodales incluyendo yemas axilares del rbol maduro, su potencial morfogentico fue probado en medio MS con varias concentraciones de 6-benzyladenina (BA), kinetina, y thidiazuron, solo, o en combinacin con diferentes concentraciones de cido naftaleno actico.

9. Najaf-Abadi y Hamidoghli (2009)

El propsito del estudio fue establecer la

mejor condicin para la propagacin in vitro de Rubus sp. mora. Fueron usados explantes de yemas axilares. Luego de la esterilizacin, los explantes fueron colocados en medio MS suplementado con 2mg.l de BA., dos semanas despus, en el estado de proliferacin, el medio de cultivo conteniendo MS suplementado con 3 concentraciones de BA, slo o en combinacin con GA3 fueron comparados.

10.Snyman et al., (2010) Se desarrollaron varios sistemas rutinarios para investigar y comercializar Saccharum officinarum caa de azcar in vitro. Estos sistemas fueron: Micropropagacin de genotipos, produccin de plantas libres de virus de meristemos apicales, germoplasma, generacin de somaclones, investigaciones de resistencia a enfermedades rpidas y conservacin de germoplasma.

11.Aubakivora y Kalashinova (2010) Una tecnologa para la micropropagacin clonal de Betula pendula abedul fue desarrollada por la activacin de meristemos existentes en la planta.

12.Mahadev et al., (2011) El estudio utiliza meristemos florales masculinos y explantes para la micropropagacin de ecotipos de Musa spp. banana de monte Virupakshi y Sirumalai. Los explantes de meristemos florales

masculinos fueron cultivados en medios MS suplementados con diferentes combinaciones de benzylaminopurina (BAP), agua de coco, cido naftalinactico, cido giberlico y adicionales. El medio MS suplementado con 5mg/l. de BAP y agua de coco al 15% fue el ms eficiente para la multiplicacin clonal de un meristemo.

13.Zeni y Molin, (2008). El extracto acuoso de las hojas de Morus nigra administrado por va oral a ratas hiperlipidemicas, redujo significativamente el nivel de triglicridos en plasma en un 55,1%.

14.Benavides, (1999) Cit. Por Garcia y Montejo (2003). El forraje fresco o ensilado de Morus alba se utiliza como suplemento proteico para los rumiantes y puede estimular altos niveles de produccin de leche y ganancias de peso.

15.Duke (2001) Cit. Por Garcia y Montejo (2003). Las hojas de Morus alba contienen atrayentes del gusano de seda, Bombix mori (Citral, acetato de linalilo, linalol, acetato de terpenilo, hexenol) y terpenoides, los cuales controlan las mordidas que realizan los gusanos a las hojas.

16.Lescano, (1999). Los rboles multipropsitos, como Morus nigra, son severamente afectados por microorganismos patgenos, es necesario practicar estrategias integrales de control que utilicen al mximo las medidas culturales, la resistencia gentica y el control biolgico, as como que minimicen el empleo de agroqumicos para de esta forma garantizar sistemas agroforestales armnicos, econmicamente viables, socialmente tiles y ecolgicamente sanos.

17.Lindsey y Jones (1992). La tcnica de cultivo tisular con meristemos como un mtodo importante y efectivo para la eliminacin de virus se ha desarrollado

porque se observ que la distribucin de partculas vricas en la planta era irregular y que existan menos partculas vricas en los meristemos apicales.

18.Lindsey y Jones (1992). Los meristemos apicales de los vegetales son grupos de clulas localizadas en el extremo del pice de crecimiento, de unos 0.1 mm de dimetro y de 0.25 -0.3mm de longitud y que normalmente se dividen activamente y de modo organizado.

19.Lindsey y Jones (1992). En algunos casos resulta efectivo el tratamiento trmico (por ejemplo durante 10 a 20 das a 30C) antes de que se efecte la escisin porque muchos virus son sensibles a las temperaturas elevadas.

20.Lindsey y Jones (1992). Los meristemos sin enfermedades en cultivo constituyen tambin un material de partida ideal para la micropropagacin.

21.Lindsey y Jones (1992).

En el medio de cultivo pueden utilizarse distintos

agentes qumicos, incluidos los anlogos de purina y de pirimidina, aminocidos, reguladores del crecimiento y antibiticos (actinomicina D, la glutamicina), contribuyendo en algunos casos dichos tratamientos a la erradicacin del virus.

22.Lindsey y Jones (1992). En todas plantas regeneradas se deber comprobar la ausencia de partculas vricas mediante tcnicas ELISA estndar o sondas con cDNA

23.Benavides, (2002). Debido a su poca fibra y alto nivel de carbohidratos el follaje de Morera, Morus nigra, puede ensilarse sin aditivos, mostrando un patrn lctico de fermentacin muy superior a los de ensilajes fabricados con forrajes tropicales. ,

24. Bhau y Wakhlu (2001); Lu (2002) Cit por Barbosa Et al. 2005 Las tcnicas convencionales para la propagacin de morera incluyen las estacas y semilla, dependiendo del cultivar; sin embargo, existen ciertas limitantes como baja tasa de supervivencia, dificultad de enraizamiento y baja tasa de multiplicacin, que las hacen no viables, tcnica y econmicamente para la propagacin de esta especie vegetal. 25. Jones (1992). La variacin de temperaturas que se puedan relizar sobre una planta, afectan tambin a los virus hospedados en ella. Ya que estos son altamente sensibles a la temperatura. Por lo que se recomienda un tratamiento trmico antes de cualquier procedimiento.

26. Garcia et al (2003). La especie Morus nigra contiene, tanto en las hojas como
en los tallos tiernos, fenoles , flavonoides, cumarinas, carbohidratos solubles, esteroles, alcaloides y saponinas.

27. Sigarroa y Garcia (2011). El pice meristemtico es un tejido que resulta eficaz
como explante primario para iniciar un proceso de micropropagacin de mora sin espinas. Sus clulas en divisin permiten un rpido crecimiento, siempre y cuando se encuentren en el medio de cultivo apropiado; adems, facilita la obtencin de plntulas libres de contaminantes endgenos para la fase de multiplicacin.

28. Sigarroa y Garcia (2011). La desinfeccin con solucin jabonosa (agua +

detergente comercial), cinco minutos; alcohol al 70% durante dos minutos e hipoclorito de sodio al 3% (cinco o diez minutos) permite un 100% de desinfeccin de los pices meristemticos de Morus alba morera. 29.Vargas (2011). Para la induccin de brotes en meristemos de Rubus brasus morera, se recomienda tratamientos con MS + 50 mg/l de adeninas + 0.10 mg/l de AIA y MS + 0.50 mg/l de BAP + 0.10 mg/l de AIA + 0.25 mg/l de G3, por ser los de mejores resultados en la investigacin realizada. 30.Barbosa et al (2005). En el establecimiento de yemas apicales de morera es necesaria la suplementacin con 0.5 mg.l -1 6-BAP al medio de cultivo basal para inducir la brotacin; sin embargo, para la multiplicacin de las yemas axilares se debe adicionar 0.5 mg.l-1 6-BAP y 0.5 mg.l-1 de ANA al medio de cultivo basal. El mejor sustrato para la aclimatizacin de las plantas in vitro de morera fue el compuesto por 85% humus de lombriz y 15% zeolita.

III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En condiciones de crecimiento normales Morus nigra puede ser susceptible a una serie de agentes patgenos entre los que se incluyen bacterias, virus (Carlavirus, Tsuchizaki, 1976), viroides, hongos, nematodos (Meloidogyne incognita) e insectos. Los contaminantes superficiales pueden eliminarse fcilmente por esterilizacin superficial, pero es importante que otros patgenos estn ausentes de las plantas almacenadas antes de que estas pasen a cultivo. Es posible propagar in Vitro plantas que estn enfermas, particularmente las infectadas por virus, nematodos o por infecciones bacterianas sistmicas, lo cual reduce las tasas de multiplicacin o crecimiento, la produccin de metabolitos secundarios, y perdidas econmicas de produccin. De esta forma la tcnica de cultivo tisular in Vitro de meristemos caulinares es un mtodo importante y efectivo para la eliminacin de partculas vricas y de agentes patgenos ya que ellas existen menos en los meristemos apicales. As mismo permite la produccin masiva de esta planta en Per ya que actualmente es importada, permitiendo el uso de sus bondades en nuestro pas.

V. HIPTESIS

Debido a la existencia de microorganismos que infectan a Morus nigra Mora negra, el uso de la tcnica de cultivo in Vitro de meristemos apicales es necesario para obtener plantas libres de virus, de este modo se realizara la produccin masiva de plantas sanas con alta tasa de productividad.

VI.

OBJETIVOS

a) GENERAL: Obtener plntulas libres de microorganismos patgenos a partir de cultivos in Vitro de meristemos caulinares de Morus nigra Mora negra b) ESPECFICOS:

- Adquirir el material biolgico. - Esterilizar el material biolgico. - Introducir los explantes in vitro - Monitorear y determinar el tiempo de formacin de la plntula de Morus nigra Mora negra.

VII.

IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIN

La morera Morus nigra (o alba) es una planta de alto valor comercial por su gran variedad de usos, lo que permite un aprovechamiento eficiente de la planta. Gracias a su capacidad de produccin de biomasa, composicin qumica (agente pronutricionales (flavonoides), cumarinas, esteroles, saponinas, lectinas y fitoestrogenos.), alta digestibidad, adaptabilidad a diversas condiciones de clima y suelo, y disponibilidad se usa como fuente de forraje. Esta planta es de mucha importancia en la industria de produccin de seda, ya que, sus hojas son el principal componente de la dieta de los gusanos de seda Bombyx mori. Su alto contenido de antioxidantes (flavonoides, tocoferol, caroteno, acido ascrbico, selenio) tambin permite su uso en beneficio de la salud, habindose demostrado que estas caractersticas inhiben la arteroesclerosis y al reducir los niveles de azcar en la sangre puede prevenir la diabetes. Al tener control sobre la produccin de plantas de morera Morus nigra se puede aprovechar al mximo todos estos beneficios.

VIII.

MATERIALES Y METODOS:

Material Biolgico:

 Planta de Morus nigra ``Mora negra``

Material de Vidrio: (Esterilizado)

Beaker Placa Petri Frasco de Vidrio Mechero de alcohol Tubos de ensayo

Equipo de diseccin:

Bisturi Pinza Tijeras Agujas biologicas

Soluciones y Reactivos:

Hipoclorito de sodio Alcohol 96

 Cloruro de mercurio

Equipo:

Cmara de flujo Laminar Autoclave PH METRO Cmara fotogrfica Destilador. Estereoscopio

Otros materiales:

Detergente Cepillo Algodn Azcar Termostatos Medio MS Papel Aluminio Agua destilada esterilizada Gasa

IX.

METODOLOGIA:

Obtencin del material biolgico Se trabajara con el meristemo apical del tallo (o yema terminal) de Morus nigra (o alba) morera. De las plantas, ubicadas en Av. Nazarenas cdra 8 en el distrito de Santiago de Surco (Lima), se seleccionaran ramas jvenes y cortaran muestras de la estructura requeridas, las cuales se colocaran en tapers con algodn hmedo, garantizando la viabilidad celular del explante. Inmediatamente se trasladaran los explantes al laboratorio de Bitecnologia vegetal de la Universidad Ricardo Palma para el tratamiento de esterilizacin y el respectivo procedimiento.

Esterilizacin del material biolgico Luego de la seleccin de los tallos en mejor condicin de Morus nigra se proceden a lavar con agua y detergente, luego se enjuagan con agua destilada. Fuera de la cmara de flujo laminar se separan las yemas axilares que se encuentran entre el tallo y la hoja. Se procede despus a juntar las yemas apicales en una bolsita de gasas para sumergirlas en una solucin de cloruro de mercurio al 0.1% durante 6 a 10 minutos. Transcurrido el tiempo de esterilizacin en cloruro de mercurio, se retira la bolsita de la solucin y se enjuaga de 5 a 6 veces con agua destilada esterilizada con un intervalo de 5 minutos por enjuague, Se deben utilizar hasta dos beakers con agua destilada esterilizada en la cmara de flujo laminar para no ocupar mucho espacio. Introduccin in vitro del explante En la cmara de flujo laminar las yemas estriles se transfieren a una placa Petri esterilizada y se realiza el aislamiento del meristemo con un estereoscopio binocular. Se libera la yema de las hojas que la cubren con ayuda de agujas biolgicas y pinzas.

Luego en total asepsia los meristemos aislados se introducen con una pinza en tubos de prueba con medio de cultivo, se flamear el cuello del tubo para asegurar la asepsia y se sellan los tubos con papel platino o parafilm. Cada tubo se debe rotular adecuadamente y luego se llevan a incubar al cuarto de cultivo a la cmara climtica a una temperatura de 25 C con iluminacin.

Monitoreo Se llevara a cabo la observacin del desarrollo del meristemo y su posible

contaminacin cada 4 das, se registrarn los datos utilizando una cmara digital.

X. CRONOGRAMA DE TRABAJO:

DURACIN DEL PROYECTO Semana 1 ACTIVIDADES Recopilacin Informacin Obtencin de X X X Material biolgico Esterilizacin del material de vidrio y Aislamiento tejido. Introduccin in vitro de los de la X X X X X explantes Monitoreo del callo Redaccin investigacin Sustentacin de la Investigacin X de X X X de X X X X Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5

formacin in vitro del X

informe final de la

XI.

PRESUPUESTO:

MATERIALES Alcohol etlico al 96% (3L) Algodn (500gr) Azcar Papel platino (16m) Mascarillas Detergente Leja (500ml) TOTAL

PRESUPUESTO S/.16.00 S/.12.00 S/. 2.50 S/.12.00 S/. 3.00 S/. 3.50 S/. 3.50 S/. 50.50

XII.

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA:

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