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Ch.

ALAIS

Principios de tcnica lechera

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CHARLES ALAIS

Ciencia de la leche
Principios de tcnica lechera

Versi() espaots por :

Don Antonio Lacasa Godina


Doctor en Veterinaria Diplomado en Lactologfa

EDITORIAL REVERT, S. A.
Barcelona - 8ogot6 - Bueno Aires C1rac11 - Mblco

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Titulo de la obra original: Scieoce du lait. Prindpes des lechnique-s laitieres. 4." dition Edicin original en le.n~:,TJta francesa publicada por: S.E.P.A.I.C. S<tcit d ' Edition el de Promotion Agro-alimentaires, lndustrielles el Commercialcs, 42, rue du Louvre 75001 Pars.

Copyright S.E.P.A.I.C. Soc:it d ' Editlon et de Promolion Agro-allmenlaires, l ndustrieUes el Commerciale-s, Paris

Propiedad d e:

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E:.:dicin en espmiol

EDITORIAL REVERT,S. A., 1985 RE IMPRESIN: Abril de 2003


lmm:so en Espa Printed in S1)ain

ISBN: 84-291 - 1815-2 Depsito legal: SE- 1557-2003 Impresin: Publicaciones Digitales, S.A. www.publidis:t.com - (+34) 95.458.34.25. (Sevilla)

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fndice analtico

Prlogo del autor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Prlogo la tegUnda edicin espaola . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

vn

PRIMERA PARTE
GENEBAL IDADESLA LECHE Y LOS PRODUCTOS LACTEOS
Capt ulo l. Nociones fundamentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Capi tulo 2. Secrecin de la leche ... , , ... , .. . .... , , , , . . , , Captulo 3. Composicin de la leche ........ , , . , , . . . . . . . . 3 13 21

SEGUNDA PARTE

OUIMICA. BIQOUIM ICA Y FISI CA DE LA LECHE


Captulo 4. GlcidOL LaciOA. Acldo IW::t.ico . , , . . . . . . . . 31 Captulo 6. Lpldoa. Materia CJ'U&. Nata ... , . . . . . . . . . . . 53 Captulo 6 . Prtldoc. Cuena y fenmeno de la coagulacin ... 103

ndice analltico

TERCERA PARTE
MICROBIOLOGIA E HIGIENE DE LA LECHE Y DE LOS PRODUCTOSLACTEOS

Captulo 10. Microflora de la leche y de los productos


lcteos
o o o
1

'

'

'

'

'

'

'

'

'

323 337 359 405

Captulo 11. Desarrollo y accin de microorganismos en la leche ..... . ....... . . . .... ... ... . ... . Captul o 12. Bacterias lcticas y fermentos .. ... .. . .. ... .. . Captulo 13. lnfeccin de la mama y sus consecuencias . . .. . . . Cap t ulo 14. Problemas higinicos . Saneamiento de la leche
o o o
1

433

CUARTA PARTE
PRODUCCION DE LA LECHE

Captul o 15. Factores que influyen en la produccin y composicin de la leche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Captulo 16. Condiciones de la produccin. El ordeo ....... . Cap tulo 17 . Condiciones de la recogida de la leche, Reirigeracin. Limpieza .. ... . .. . . . .. . .. . . . .. Capt ulo 18. Comprobacin de la calidad de la leche . . . . ... . .

459 479 495 521

QUINTA PARTE
PRODUCTOS LACTEOS. PROBLEMAS TECN ICOS Y A L IMENTARIOS

Captulo 1 9 . Leche de consumo. Pasterizacin y

549 Captulo 20. Nata y mantequilla . .. . . . . . . .. . .. . ... . . . , . . 588 Captulo 21. Quesos. Enzimas coagulantes. Mtodos

t T " esJ!rJ 1zacJoo . .. . . . . .. . . . . ... . . . .. . . ... . . .

mo.demos .............................. . 617 Captulo 22. Productos lcteos diversos .. . ... , ..... . .. .. . . 763 Captulo 23. Problemas alimentarios .... ..... .. ... . .. .. . 809
Bibliografa . . . . . . .. . .. . . .... .... ... .. . ... . . . . .. . . , . 843 lndjce alfabtico , . . . . . . , .. .... . . . , . .. .. , . .. , . . ... . , , . 8 57
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PRIMERA PARTE

Generalidades

La leche y los productos lcteos

Copynqhted malenal

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Capitulo 1 Nociones fundamentales

1 CIENCIA DE LA LECHE

El eaLudio completo de la leche ha sido elevado a la catqora de cien ca por alunos autores ("lactologa'' o "plactologa"). Abarca un campo cuya ex:Lensin ea impreaionanLe, ya que .e ~laciona con nu mcroau y variadas di&eiplinas. Su plan podr1a eatablecerae como si gue: l. Secrecin de la leche en la mama (histologa, fisiologa, patolo ga); 2. Constitucin de la leche (tsica, qumica, bioqumica, anlisis); 3. Variacin de la produccin y composicin de la leche (etnologa, alimentacin, z.ootecnia); 4. Microbiologa de la leche y de los productoalc:leol; 5. Hiiene; 6. La lecbe como alimento (nubicin, pediatra); 7. Tecnoloa de la leche y lUI d~rivados; - produccin higinica y econmica de la leche, -leches de consumo, - productos derivados de la leche. No ea frecuente que el estudio de la leche ae realice de una forma tan general en un libro o en un curso. Para una obra de dimensiones limitadas, es fon:osamenLe necesario hacer una 1eleccln de Lemas, por lo que hemos establecido el siguienre plan: En una primera parLe, que iniciamos aqu, ae exponen nociones

Nociones fundamentales

fundamentales relativas a la leche conaiderada como producto biol gico, como meterla prime y como alimento. Veremos de una forma sucinta lo que ea indispenasble conocer aobre la morfologa de la ma me y la fisiol<>Ja de la aecrecln lctea. En la segunda parte ae desarrolla, con la debida Importancia, el estudio fsico, qumico y bioqumico de la leche. Cualquiera que aea la actividad del lector especialista (cra, higiene, fisiologa, nutricin, tecnologa, etc.), siempre le aer indlapenaable poaeer un conocimiento completo de la composicin de la leche y de las propiedadea de aua componentes. A continuacin, en la tercera parte, la microbiologa y la higiene de la le,che son objeto de una amplia atencin. En estas dos ltimas partes, y a prop6aito del estudio de aua com ponentes y de la actividad de los microorganismos ae habla de las tranaformaciones de la leche. Nos ha parecido lgico estudiar la nata y las modificaciones que puede experimentar, especialmente su trans fomacin en mantequilla, en el captulo " Materia grasa"; lo mismo la bioqumica de la coagulacin, que se estudia tras las protenu: Los captulos reservados a la tecnologa, que no son esenciales en esta obra, sern un tanto resumidos. En la cuarta y quinta partes se exponen loa principio de los mto dos y tcnicas referentes a la produccin de leche y a las transforma clones que puede experimentar. La leche es un producto biolgico lbil; su recogida y conservacin plantean problemas que no estn an perfectamente resueltos. La leche se consume cada vez en menor proporcin en estado crudo; la leche de ordeo ea objeto de trata mientoa encaminados a sanearla y a asegurar la duracin de "su vida". Los sistemas empleados son recientes: aplicacin racional del fro y calor, radiaciones, mtodos de uepsia, etc. Para lu transformaciones de la leche loa problemas son diferentes. Se trata ma de dominar un arte que de considerar tcnicas racionales. La evolucin para todos loa productos ea rpida hacia una etapa verdaderamente industrial, con aumento de la estandarizacin de los productos, de la automatiza. cin y de la fabricacin "en continuo". Al final de la quinta parte de la obra, y despus del estudio de los problemas tcnicos sigue el de los problemas allmentarloa. Los principios de los mtodos analticos ae exponen en los captu los correspondientes a las sustancias a determinar o las propiedades objeto de estudio.

11 CARACTERISTI CAS ESENCIALES DE LA LECH E


1. Complejidad La leche es un lquido secretado por laa glndulas mamarias de las hembras de los mamferos, traa el nacimiento de la cra.
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Noclone fundamental..

Ea un lquldo de compolicin compleja, blanco y opaco, de ..bor dulce y reacci.n inlca (pH) prxima a la neutralldad. La funcin natural de la leche es la de aer el alimento excllllivo de lo marnferoa j6venu durante el perodo crtico de u exiltencla, tru el naclmiento, cuando el dell&mlllo u rpido y no puede ter sustituida por otro alimental. La gran complejidad de la composicin de la leche retponde a eate necesidad. La mama con1tltuye lualmente un emuntorio; por ello se pueden encontrar tambin en la leche austanclu de eliminacin, aln valor nutritivo.

2. Heterogeneidad
La leche ea una emullln de materia IIJ'aaa, en forma lobular, en un lquido que mu&~tra analogas con el plasma aanufneo. Este lquido ea aslmlamo una 1uapensin de material proteicu en un 1uero con,tituldo por una 1olucln neutra que contiene, principalmente, lactosa y aalea mlneralea. Hay por lo tanto en la leche cuatro tipo de componentes impartantea: a) Loa l!pidoa, componentes esenciales de lu gruas ordinarias (trlllllcridoa). b) Laa protenas (cuenaa, albminas y 11lobuilnu). e) Lot glcidos, esencialmente la Jacto... d) Las talet. A ello ae aaden otros componente numero10s, preaentes en cantidadea mnimas: ledtlnu, vitaminas, enzimas, nucletidos, gases dlaueltoa, etc., alunoa de los cuales tienen unalll'an Importancia de bido a au actividad biolgica.

3. Varleblllded de la composicin La composicin de la leche vara en el traracurso del ciclo de la lactacin. En la poca del nacimiento, la mama aegrep el calo1tro, lquido que se diferencia principalmente de la leche en 1ua partel proteica y aalina. El ettado de lalud Influye en la compo1lcin de la leche (leches patolgicas). La composicin de la leche normal vara sensiblemente de una especie animal a otra.

4. Alterllblllded
La leche et un producto que se altera muy fcilmente . El calor lamodifica. Numeroso mlcroorganiamos pueden proliferar en ella, en e& pacial aquellos que degradan la lacto~& con produccin de cido, oculonando, como consecuencia, la floculacin de una parte de las protenas. La leche no posee ma que una dbil y efmera proteccin natural. Su UIO para el coneumo y para lae transformaciones industriales exige
:

nal

Nociones fundamentales

medidas de defensa contra la invasin de los microbios y contra la actividad de las enz!mu.
5. C8rac18risticulegales

De una manera general, las diferente. legialaciones toman como bue las dlapoelciones establecidas en el primer Congreso lntemacionel de la Represin de los Fraudes Alimentarios (Ginebra, 1908): a) La leche es el producto ntegro procedente del ordeo completo, ininterrumpido de una hembra lechera en buen estado de salud, bien alimentada y no CBI!Bada. Por consiguiente se consideran impropias para el consumo humano las leches procedentes de animales enfermos y mal nutridos, as como las que contengan celostros (ordeadas antes de transcurrir 7 das despus del parto). b) La leche debe ser recogida con toda limpieza; no debe ser coloreada ni maloliente y no debe contener grmenes patgenos.

111 DIFERENTES CLASES DE LECHES. ASPECTOS BIOLOGICOS

A) L43 diferentes especies de mamferos producen leches que, en lneas generales, tienen una composicin semejante pero pueden ofrecer diferencias importantes en su composicin centesimal y tener, como consecuencia, propiedades muy diferentes. Por ejemplo, todas las leches contienen casena (protena que precipita a pH 4,6) y otras protenas del grupo de las albminas. Algunas leches contienen mucha ms casena que albmina, como ocurre con las de los nmiantea cuya leche se llama "caseinosa ",lo que lleva consigo una reaccin ligeramente cida y la posibilidad de coagular por el cullio y no por la ebullicin. Por el contrario, otras leches son "albuminosaa ", especialmente las de loe carnvoros, y muestran propiedades opuestas. Se ha analizado la leche en numero888 especies; el ltimo gran inventario realizado es el de Jeunesa y Sloan (1970). Todas las leches contienen protenas y sales; algunas contienen indicios de lpidos y existen otras en las que no se encuentra lactosa (leches de pinnpedos); en estas ltimas, el porcentaje de materia grasa es elevado, ya que este componente es el que acta como Cuente de energa. No existe una relacin general entre la composicin de la leche, por una parte, y las afinidades zoolgicas o los caracteres fisiolgicos (nutricin), por otra. Sin embargo, se pueden hacer algunas observaciones derivadas de los datos que constan en el Cuadro l.
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Cuadro 1. Datoa analftlcoa y (ialol(ficoa aobre laa diferente clase de leches.


Compolllcio por 100 a El<tracto
Tiempo pua Duuci Meteriu nitroienedu doblar hab . de d peso aesta Peto del Totales Proporcin de de nacl ci6n cerebro ca.. iDa N.P .N. miento DIu ( )% Dlu % (S) (7) (6) (8) (9) (lO)

M.G.
(2) 3,5 1,5 1,5 3.S 4 ,3 1,5 1,5 17 .S 6

Lac toso

Solea

aeco
(total) (1) Lecbe humana . Equ.idoa Yel\la . . . . . . . . . 11 ,7 10 10 12,5 13,6 19,1 17.8 31,9 18,3 20 24,2 29,3 (3)
(4)

6,S S,9
6,2 4 ,7 4 ,5 4,5 4 ,7 2,S 5,4

0,2 0,4

1,5 2,2 1,8 3 ,5 4 6

28

17

170 40

270 340 360 28 S

1200

Bu.rra .. .

O.S
0.8 0,8 1,1 0,8

so
4S 78 75 17 80 80 50 33

S
7

650
360 500 130

Rumi.ullet Vaca . .. .. ..

3S
22 20

C.abn .........
()veja . . . . . . . .

l SS
I SO 230

Bfala . . .....

4,8
10,4 6
9 10 13,5

Reno . . ........ Saidoo Cerda ...... Camhoroo y Roedoru Gata ........

l ,S 0,9
1 1,2 2 0,6 O.S

13

liS
60 63

160 2S 10

S
10 12 46 35

S
3 1,8 1,3 0,8

Perra . . ......
Cetkeoo

Conej.a . .......

70

so
-

9 6

3S

Marsopa . .......
Ballena .. ......

59,9
46,3

12 10

55

( ) N. P. N. : materias nltroenadaa no proteicas

Nociones fundamentales

OBSERV ACIONBS AL CUADRO 1


La leche de los rumiantes comunes es la nica que ha sido anliuda con la

frecuencia neoesaria para poder estableoer una composicin media fidedl&na; en estas especies, la seleccin tiende a wformar la composicin . Para la lecbe de otras especies, no se pueden dar m que cifras aproximadas; en efecto, es posible comprobar Yllriaciones muy importantes aun en leches de mezcla. Por ejemplo, al anali.tar dos leches de mezcla, prooedentes de un lactarium de Pars (lecbe humana exenta de calostros), hemos encontrado valores muy alejados dolos del cuadro 1: -Materias nltrosenadas totales . . . . . . . . . . . 0,95 0,98 !,SS - Proporcindecase.na . .. ... . .. . .. . .. . 18,35 19,75 29,50 -Proporcin de N.P.N . . .. .. .... .. ...... 27,20 17,00 Numerosos resultados referentes a lecbes individuales de especies dl-sas tienen poco lnter6s, pues se dan sin Indicacin del momento de la lactacin ni del estado del animal.

Los mamferos nacen en muy diferentes niveles de madurez fisiolgica, y no dependen en igual grado de la leche; adems, la cantidad de leche ingerida no suele conocerse bien. Se observa que en general,las leches son tanto ms ricas, principalmente en materias nitrogenadas y en sales (materias plsticas), cuanto menos completo es el desarrollo in-utero y ms rpido el crecimiento. El contenido en lactosa sigue un orden inverso, pero paralelo, al desarrollo del cerebro; los tejidos nerviosos son ricos en galsctsidos. La materia grasa es un alimento energtico; se encuentra en proporcin elevada en la leche de los mameros de las regiones fras y de los ocanos (relacin climtica). La leche humana es la ms rica en lactosa, pero es relativamente pobre en elementos nutritivos; lo mismo ocurre con la leche de los quidos (la leche de burra se parece a la leche humana). La leche de los rumiantes se distingue no solamente por una elevada proporcin de casena en el contenido total nitrogenado, sino tambin por una proporcin bastante elevada de cidos orgnicos de bajo peso molecular en la grasa (cidos voltiles), consecuencia desu especial proceso de sntesis. Las leches de vaca y de cabra son las mejor equilibradas desde el punto de vista de la distribucin de los tres componentes principales: contienen alrededor del 4% de cada uno de ellos: protenas, grasa y lactosa. B) Dentro de una misma especie, las diferentes rozas producen leches cuya composicin vara, aunque dentro de lmites reducidos,

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Nociones fundamentales

conservndose constantes ciertos caracteres. En trminos generales, son ms bien la cantidad de leche producida y su riqueza global las que varan de una raza a otra y de una manera inversamente proporcional. Las leches ms ricas provienen de razas cuyo nivel de produccin es relativamente bl\jo (razas bovinas de Salers y de Jersey, por ejemplo). C) Existen, en fin, variaciones individuales; la aptitud lechera es hereditaria y una de las bases para la seleccin, tal como se ver en el Captulo XV.

IV LECH,ES IMPORTANTES EN LA PRACTICA ,.

Son las de las hembras de los mamferos domsticos cuya secrecin lctea ha sido desarrollada de tal manera por el hombre, que se produce un excedente considerable destinado a la alimentacin humana. No pertenecen ms que a un pequesimo nmero de especies (una docena entre 4.000). Algunas especies poseen "razas lecheras" obtenidas mediante seleccin y metodos especiales de explotacin. Entre la produccin de una vaca sin cuidar y otra excepcional, puede haber una relacin de 1 a 20. Por esta razn la produccin media de las vacas en Asia es baja, de 200 kg/afto en la India a 500 kg{ao en Malasia; mientras que en los pases de la Europa Occidental se sita en unos 4.000 kg{ao. Las especies lecheras varan segn las regiones, pero la especie bo vina es en mucho la ms extendida y su rea de difusin aumenta cada da. La leche de vaca es, por lo tanto, la ms importante y la nica que se utiliza de mltiples maneras. En determinadas regiones de aJ. gunos pases mediterrneos se produce tambin leche de cabra y oveja, que se emplean sobre todo para la fabricacin de quesos. En otros lugares se recoge leche de bfala, burra, yegua kirghiz, ceb, reno, camella, llama, yack, etctera. A escala mundial, la preponderancia de la leche de vaca es aplastante. La produccin, en millones de toneladas, segn las estadsticas de la FAO para 1983, es como sigue: -Leche de vaca .......... 500 000 (nmero proporcional 100) -Leche de bfala . .. .... .. 24 000 ( " " 4,8) -Leche de oveja ........... 6 500 ( " " 1,3) -Leche de cabra ... .. . . ... . 7500( " " 1 ,5) En adelante, cuando hablemos de leche sin indicacin de especie se tratar de leche de vaca. Es la mejor conocida y siempre el elemento de referencia.
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10

Nociones fundamentales

V PRODUCTOS LACTEOS

Antes de la moderna era induatrial existan pocos productoa lctaoa; eaencialmente estaban constituidos por la leche entera y dematada,la nata, la mantequilla y los quesos, sobre todo los madurados y duros. Se deaconocan loa mtodos para conservar la totalidad de los componentes de la leche, y solamente los elementos insolubles (casena y grasa) podan conservarse durante bastante tiempo en forma de queso o mantequilla, pero la parte soluble se despreciaba o se utilizaba mal. La conservacin de una perte importante de la leche producida en las "regiones lecheraa" ea una necesidad econmica y social; ello permite transportes en el tiempo y en el espacio y, como consecuencia, la regulacin de los mercados y la posibilidad de aprovisionar las zonas de.ficitarias. Esta conservacin puede realizarse, hoy en da, por diversos mtodos que permiten conservar casi indefinidamente la leche ntegra o privada de su agua de constitucin. La !lata de loa productos lcteos y de loa productoa derivados de la leche aumenta cada da; en la actualidad puede resumirse de la forma siguiente: l. Leches de consumo, no modificadas (excepto por la influencia del calentamiento y, a veces, por un desnatado parcial): 2. Leches concentradas (condensadas o evaporadas) y desecadas (leche en polvo) por la accin del calor y excepcionalmente por liofi lizacin (leche humaM). 3. Leches modificadas: -leches medicamentosas, maternizadas, humanizadas, - aromatizadas esterilizadas, -leches fermentadas o acidicadas: yogur, leche acidfila, kfir. -leches reconstituidas, en las que uno de sus componentes, en general la materia grasa, se sustituye por una sustancia extra a del mismo tipo ("f"illed milk") . 4. Nata: parte de leche muy rica en materia grasa y separada de la leche desnatada medianie reposo o centrifugacin: nata natural. El helado de nata es un derivado. 5. Mantequilla: obte.n ida por batido de la nata; la materia grasa ya no se encuentra en su estado original, puesto que se la ha separado del llamado suero de mantequilla o mazada (babeurre), que tiene una composicin parecida a la de la leche desnatada. Se utilizan tambin el aceite de mantequilla (butter oil) y diversos tipos de mantequilla fundida deshidratada. 6. Queso: obtenido por C098Ulacin de la leche, generalmente bajo la accin del cuajo. El cogulo se separa del suero (que contiene las sustancias solubles) y forma el queso, tras el desuerado y la maduracin; contiene esencialmente la casena y la grasa de la leche.
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Nociones fundamentales

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6 bis. La caaena se obtiene por coagulacin de la leche desnatada; ea un aubproducto de laa fbricaa de mantequilla, ma utilizado en la induatrla que en la alimentacin. 7. Producto& obtenidos de loa sueros: lactosa y cido lctico, ali mentoa diversos: queso de suero, requesn, concentrado protenico, productos vitaminados, etc. 8. Producto& alimenticios que contienen ms o menos componentea lcteos; Independientemente de los productos tradicionales de pastelera y fbricu de galletas, deben citane otroa productos nuevos o mejorados: "spreads", postres lcteos, pastas lcteas australianas elaboradas con "coprecipltado" de protenas exento de lactosa. Los tres principales productos lcteos, nata, mantequilla y queso, tienen una composicin caracterstica que se representa esquemtica mente en la figura l. Las transformaciones a que se somete la leche tienden, en general, a la reduccin del contenido en agua, lo que da producto& de mejor conservacin y ms fciles de transportar.

AGUA (87.5 %)

NATA

AGUA(54 % )

MANTE
QUILLA

AGUA (16 %)

QUESO

AGUA (45 % )

Figura 1. E$Quema analltieo cte los productos 1 4cteos.

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Capftulo

Secrecin de la leche

1 LA GLANDULA MAMARIA
lA leche forma en lu ~ulaa del epitelio que recubre lot alft<lloa o aclnl de la mm , que loa contiene en ran nmero : 111 forma de agrupane y el d!Jpo.ttlvo colector varan de unu eapeclet otru. lA e.m brloloaCa demueatra que la mama no ea otra CON que un lfllpo de clulu audor(paru modiflcedu. En la vaca, emten en realidad cuatro glndulu lnde~ndlentea habitualmente Uamadal "cuartoe" {anterior derecho, anterior l&quierdo, poaterlor dereclo y po~terlor l&qllierdo ), que no tienen en comn m que!& envoltllll cutnea. lA mama ee encuentra 1u.pendlda de la regin pubiana del abdomen mediante Upmentoa carentea de elut:idad. En otrunumer0111 etpeclet de mamteroe,lu nwnu ee encuentran J)Indaa y dilpueatu limt:rlcamente, doaa doa, dllde la regin tor6clca la recin inllinal. En la ubre de la vaca, loa acini ee renen en raclmoe formando los lbuloe; &to1 te comunican, por un conducto colector ramificado, con la c11tema {teno plactforo) dtuada en la bue de la mama. Elta clltema deeemboca en el .eno del pez6n por un repUecue de la muco... El pezn abre al exterior mediante un fino canal nico, ocluido por un pequeo eafnter lilo. El conjunto forma un reaervorl.o de importante capacidad, eatimedo en 11001 8 litro. pera la totalidad de los cuatro cnwto1 de una vaca lechera de tipo medio. Eata confluencia de lu teaeclonea en un colector n.ico no ea eneral; en otru eapeclea de nwntero no rumiante., como la m~er o la perra, los tuboa

14

Secrecin de la leche

colectores desembocan separadamente al exterior por mltiples orificios situados en el pezn. La ubre de la vaca se encuentra fuertemente irrigada por dos vastas redes capilares, alimentadas por laa arteria& pbicas externas. Los sistemas venoso y linftico son muy complejos. Ea de notar que alii\IDOS tipos de clulas mononucleares mviles (leucocito o glbulos blancos de un slo ncleo) se infiltran normalmente a travs de laa paredes de los acini y pasan de esta manera a la leche. El volumen de sangre que pasa por la ubre es grande, se estima que, en el caao de una buena vaca lechera, ae preciaa ''filtrar" alrededor de 400 litros de plasma sanguneo para ae que pueda formar 1 litro de leche. Esta cantidad puede ser mucho mayor y rebasar los 1.000 litros en el caso de vacas mediocres, viejas o mal alimentadas. De estos sucintos datos se deducen ali!IIDas conclusiones importan tes en lo que se reftere a la produccin de la leche de vaca: 1. La independencia de cada cuarto hace que, frecuentemente, se comprueben diferencias en la capacidad de produccin y en la composicin de la leche de unos y otros. Estas diferencias son debidas corrientemente a infecciones de la ubre, que pueden estar localizadas en un solo cuarto. 2. La existencia de un sistema colector convergente hacia una aalida nica hace inevitable la difusin de las infecciones a la totalidad del cuarto. La capacidad elevada de la ubre hace que, durante el perodo de replecin, pueda constituir un medio de culoivo para diverBOB microorganismos. 3. La suspensin no elatica de la ubre tiene por consecuencia el que toda deformacin con alargamiento del rgano sea irreveraible, ya sea accidental o debida, por ejemplo, a una prctica defectuoaa del ordeo. Este alargamiento se acompaa de UJl!l re~acin del tejido, que tambin favorece la infeccin. 4. El estado del orificio del pezn (meato) rev1ate tambin importancia; la "barrera" contra la penetracin de los prmenes puede ser ms o menos eficaz. A este respecto, es preciso sealar la oposicin que se manifiesta entre la facilidad para el ordeo (orificio que se abre ampliamente) y la proteccin contra la infeccin. 6. El considerable aporte sanguneo que la ubre recibe hace que este rgano acte como emuntorio, de modo que por esta va pueden eliminarse sustancias diversas, as como bacterias. La infeccin de la ubre puede tener origen "endseno", es decir, grmenes aportados por la sangre. 6. La migracin leucocitaria de la ubre a la leche es un hecho fisio lgico; pero esta migracin slo es responaable del paso de un nmero limitado de clulas. La presencia de numeroaos leucocitos, sobre todo polinucleares, tiene una significacin patolgica.

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s.c..-cl6n de la leche ptulo relaclonadoe con la higiene.

15

Eatal noclonea ae revilarn m adelante, etpec:ialmente en loa caNoto.- La fllun 7 , del capitulo XVI, mv- . liD eon. oocvem611eo de la ubn do ...ea.

11 MECANISMOS FISIOLOGICOS DE LA SECRECION V DE LA EVECCION DE LA LECHE

1. Secrecin
La actividad aecretora de la mama ae encuentra blllo la dependencia de un complejo hormonal lactpno elaborado por el lbulo anterior de la hlp6flala. Eate complejo no interviene m que tru la desaparicin oul completa de la folioulina y de la proeeterona como consecuencia del parto. Laa hormonu que poeeen una actividad laot(lena comprobada aon: - la prolactlna (exhormona luteotrope, LTH) - la hormona del crecimiento, HCH, (exbormona aometotrope, STH ) - la hormona placentaria lactpna, HPL (u hormona aomatotropina co.rinlca, RCS). &tal lnll hormonu muestran estreclw analogu biolgiou y bioqu(mlou. Se admite la emtencia de un reflejo nervioao de origen mamario que ettlmula la aecrecin de la hormona laotpna por la hipfiail, lo que permite el manteninliento de la lactacin huta que la influencia de una nueva geatacin ae deja sentir, modificando el equilibrio hormonal. Sin embar(lo, parece que esta forma de estmulo no ea general. La aecrecln de la leche ae produce en el Intervalo entre doa ordeos, y ae detiene cuando la presin de las mamas alcanza un determinado valor, que en la vaca ea del orden de 40 mm de mercurio. La eecrecln puede producine a velocidad co11.1tante durante unu 16 horu. Es un dato inlportante cuando ee coiUidera espaciar loe ordeoa.

2. Eyeccln
~edor de 101 acini ee encuentran diJpuettal clulu mioepitelialea.

Una hormona del lbulo poaterior de la hipflait, la oxltocina, provoca la contraccin de las clulu mioepitelialea que rodean a 101 acini, y ello da como reaultado la expulsin de la leche hacia loa conductos y cilte.m a, y la elewcin de la presin intramamarla. El ordeilo no puede aer completo en auaencia de la oxltocina e.n la sangre; el vaciado puramente mecnico no extrae m que la leche de la cisterna y de loe canales grueaos. En el cuo de la leche de vaca, apyr htf r ater a

16

Secrecin de la leche

ta no representa ms que el 30 o el 40% del total; en el caso de la cabra o de la oveja el 80 %; en la yegua, la extraccin es nula en ausencia de oxitocina. Como se ha indicado, la secrecin de esta hormona que permite la eyeccin de la leche, es el resultado de un reflejo nervioso de origen mamario. El reflejo de la eyeccin depende, por una parte, de la existencia de estmulos favorables y, por otra, de la auaencia de estmulos inhibidores. Los estmulos favorables ms importantes son proporcionados por el masaje de la mama y provocan una descarga de oxitocina que llega por va sangunea a la mama en unos 40 segundos. Su accin es ftJ8az; dura como trmino medio de 5 a 6 minutos. Los estmulos inhlbidores se originan en las situaciones de miedo o susto, y en todas las modificaciones de las manipulaciones habituales. Puede tratarse de una inhibicin de la descarga de oxitocina (accin de la corteza cerebral) o de la formacin de adrenalina; esta sustancia provoca una contraccin intensa de los vasos mamarios e impide la llegada de la oxitocina a las clulas mioepiteliales. La evacuacin de la leche depende del orificio del pezn; las vacas "duras de ordear" suelen ser las que tienen un orificio estrecho. El conocimiento de estas nociones es muy importante para una buena comprensin de las tcnicas de ordeo (captulo XVI).
111 ACTIVIDAD DE SINTESIS DE LA G LANDULA MAMARIA O " LACTOGENESIS"

La glndula mamaria efecta la sntesis de la mayor parte de los componentes orgnicos de la leche: lactosa, materia grasa (trlglicridos), casenas, 13lactoglobulina y a-lactalbmina, y cido ctrico. Estas sustancias secretadas representan alrededor del 92 %del extracto seco de la leche de vaca. Los otros componentes proceden directamente del circuito sanguneo; sin embargo, en lo que se refiere a las globulinas inmunizantes, en trabajos recientes se indica que una parte de ellas podra sintetizarse en la glndula. Volveremos a tratar este punto en el captulo VI. La glndula mamaria tiene, por consiguiente, una gran actividad de sntesis a partir de los materiales aportados por la sangre. Esta activi dad se limita en algunos casos a la unin, mediante un enlace qumi co, de molculas orgnicas relativamente grandes, como son loa cidos grasos superiores; pero en otros casos es ms importante y se hace a partir de molculas pequeas: aminocidos y cidos grasos voltiles. La leche contiene elementos que atestiguan esta actividad de sntesis; se trata de sustancias solubles presentes en pequeas proporcio nes, que son productos intermedios de loa procesos bioqumicos que

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Secrecin de la lecha

11

conducen a la fo. macln de 101 glcidos, Lpldoe y prt!doa: Jteres r follfrieot de loa azcares, i.cidoa graso& voltlet, cetoicldoe, nucletldoa, i.cldo ortico (precunor de loa nucletldat}, eU:. En loa n1miantes, la actividad sintetizadora de la aJi.ndula mamaria tiene un upecto particular por el hecho de la produccin en el rumen de importantes cant.dadet de cidos voltUee: a~tlco y propinlco principalmente. La lallgrll tranaporta eatoa cido& a la mama, donde 10n utillzadoe. Para el eatudio de la fi&ologia de la lactacin ae utilizan diferentes mtodoe: 1. El mtodo clsico para lat grandea animales, mediante anlisis de la aangre arterial (antes de la glndula) y de la aangre venoea (a la &alida de la glndula). Las diferencia& 10n notables para cierto& elementoa retenidoe en la mama. La preclain del mtodo se encuentra limitada por laa dificultadea de conocer con preci&in el caudal. 2. El mtodo de la perfusin, sobre la mama aeparada del animal, con un diapoeitivo para asegurar la constancia de la temperatura y el &UIDJ6tr0 al &i&tema vaacular. Se pueden aeparar la clrculacin de do. partes de la aJi.ndula, dejando una para control. La velocidad de ainteei& de lo. componentes de la leche por este sistema a notable. 8. t.o. mtodos modemoa que utilizan cortes de tejido, homogeneizados y extractoa poseen un gran inte~. 4 . La t.cnica de loa elementos marcadores, principalmente radiolatopoa de carbono, de nitrgeno y de fsforo, utilizada como uno de loa m~todoa anteriores, ha permitido grandes progresos en el conocimiento de la lactogneai&. La fillUra 2 esquematiza laa vas principales de la lactognesis recientemente revi&adaa por Jones (1969).
IV BIOSINTESIS DE LOS COMPONENTES DE LA LECHE
A) Lactosl

Su principal or:ien eati. en la glucosa de la lallgTe ; el tejido mamario la bomerlza en galactosa y la Lipa un reato de gluooaa para formar la molcula de lactosa (captulo IV). La i&omerizacln se hace mediante el paso por dos formas intermedia&: glucosa-fosfato y UDF.Iucosa (urldlna-difollfato ). La condensacin hace Intervenir a una enzima muy Interesante, la lactosa alntetaea, que eati. constituida por dos putea, una de las cuales ea la o-lactalbmina, que veremoa en el captulo VI. La mama puede realizar tambin la sntesil de la lactoaa a partir de los cldoa rasos voltUea; este proceso se ha demoatrado en los ru-

18
IIICIIO, alrededor

Secrecin de la leche

miant., aunque el porcen~ de lacto. producido de eeta IIWIIIn ea


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B) Llpldos

Loa 'Cidoa IJ'UOI Y el licerol, que corutituyen loa t.rillcldoe de la materia rasa (captulo V), proceden en perte del torrente Rnllllneo, pero ot.ra cantidad oe sintetiza en la mma a partir de molculaa pe

Secrecin de la leche

19

queu. En loa rumiantes, el acetato y el IJI\idroxibutirato aon loa precunom m importantes de eata antesia; la 1luco11la activa pero no ea un buen precursor por s misma; el cido proplnlco lo ea de loa icldoa sra- de nmero impar de tomo de carbono. La sntesia ee efecta p'8dualmente por condenacin de rupoa de doa mo de carbono, balta el cido palmtico incluaive (C 16 ), y puede in fiulne mediante determinadu hormonu, como la INulina; lin em bargo, en loa rumiantes, eata hormona parece no tener ninguna accin. Los cidos gruoa por encima de C 16 proceden de la sangre; te ab sorben bajo forma de triglicridos. Debe subrayare& que puede haber una Importante incorporacin de materia grua alimenticia a la mata ria grua de la leche, hasta un 25 %de eata ltima. El eatearato Incorporado ea deahldrogenado en parte a oleato en la mama. En menor grado ocurre lo mismo con el pelmitato. La compoelcin de los triglicridoa exiltentes en el circuito sanguneo ea dl!erente de la de loa trilicridoa de la leche. Se ignora si te trata de un aimple reagru~nto de loa cido gruoa abiOrbidoa o de una degndacin m aCUlada eeguida de una reconltruccin de loe trilicrldoe.

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C) Proterna

Laa prlncipalea protenas de la leche ae lintetlzan en la lndula mamaria a partir de un conjunto de amino!cldoa Ub-. No 18 ha encon trado ninuna prueba de que te produzca una Incorporacin de pt!pti doa o de protenas ntegras a las protenas elaboradas por la llndula. E.l enlace de loa aminocidos, para formar laa cadenu peptdlcu ae realiza probablemente como en los otros tejld01 del oranillmo: activa cln, traslado por un ARN y condensacin. Una parte de estos aminocidos 18 deriva de los aminocidos Ub- del pluma sanguneo; pero otra parte (aminocidos no eaenciales) ae elntetlza en la llnduia a partir de la lucoea, del acetato, etc.; la fuente de nltrpno no ae conoce bien. Experiencias realizadas con glucoea marcada con c:arbono-14 han demoltrado que sta auminiltra una parte importante del carbono de la aerina y de la lnina. El !e!oro de la cuena (ca ptulo V) tiene como precunor el fe!oro nornlco de la 11nre y te incorpora a la cadena poUpeptdlca tru la bloafnteaill de sta por la intervencin de una !osfoprotena kinaaa,llegD una secuencia cdigo que ae estudiar en el captulo V. Esta modificacin molecular deno minada "postranslacional", como ocurre con la lllco.Uacin de la casena K, ee produce sobre una parte de la estructura celular llamade "aparato de Golfll". La blosnteaill de las casenas se encuentra inducida y eatimuieda por la prolactlna que se fija sobre un receptor de la membrana de la clula secretora. La progesterona limita fuertemente esta induccin,

e, pyr

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20

Secrecin da la lecha

mlentru que loa pucocortlcoldea, que eolot 10n lnactivot, amplifican lot afectot de la prolectina. &te hOI'IDOIII. lntemene tambim en la blolnteeia de lu protew del a.c. Debamoa eellalar que la wca puede producir leche de une compolic:ln proteica normal, no obeiante titar eometida a une llmenta cln totalmente exenta de protema, liD m que UNa y aalee amonlacalea uocladu a material hidrocarborwc!aa purttcw!.., YitamiM y aalea mlnAiralea, como ha demo.trldo Vlrtanen (1966).

V CAUSAS FISIOLOOICAS DE LAS VARIACIONES DE LA SECRECION


La produccin de leche ae deurrolla II8IIil un ciclo relacionado con lu faaee de la vida aexual. El perodo vare con lu 11peclet; para la vaca ea, como trmino medio, de un aio. &te factor ee el de mayor Influencia aobra la produccin y compoeicin de la leche. Pueden dia tlnulne tree etapu: 1 . Tru el puto, la lndula mmarla IJ8Il'8P un lquido cuya compoeicln y upecto aon muy diferentea de loa da la leche normal; ea el "calortro". La actividad de anteeia de la mama no ae encuentra an plename11te deurrollada; adem, el lquido eecretado contiene una elavada proporcin de inmunopobnl!n11 prooedentea probablemente de la aanre. Por eete hecho, el caloatro tiene una propiedad eapeclal, puaa !al lnmunoliobnlln" aon anticuerpo que proteen al oranlamo joven contra lu lnfaodonee mlcroblanu. 2. La faae caloatral ea corta; al cabo da pocot d u el lquido aegrapdo mueatra ya lu propiadadea de la lecha "normal". Sin embargo, la compotlcin de sta no ea invariable, ya que la capacidad de produccin de loa elemento principaitl no 18 deurrolla de manera iual para cada uno de ellot. 8. Tru la fecundacin 11 deja eentir el11fecto de la nueva seatacin en un pluo variable, eegn lu eepeclet. Se trata de un afecto frena dor de la eeaecln, que conduce al eecado. El eimen alimenticio Influye tambin en la produccin y la com pollcin de la leche. Eata Influencia ea eapecialmente evidente en loa rumiante., por razn del pepe! que tienen en la blotnteeia loa cidot voltilea formedot en el rumen; eatoe cidot aon producto. de fer mentadn cuyo desarrollo depende de la calldad y la naturalesa de 1011lcidoa inlerldoa. Estu cauau de variacin ee aaden a loa tactorea cllmtlcoa, zootcnico y hereditarios. Ms adelante veremoa con ma detalle au influencia cuantitativa en el captulo XV.

Caprtulo

Composicin

de la leche

1 LA LECHE ES UNA MEZCLA. ESTADO DE EQUILIBRIO


Una de 1M propiededea fundmentalea de la leche ea la de 111' una mezcla, talto flica como qumicamente. E. una IIIHCla de IUft&n c:iu dellnldM: Jact.o., stieftldoc de kidoc puoe, cuefDu, albminu, lalee, etc. Deade el punto de vilta fIco, coexllten varfoc eat.doc; emuW.6n,aupenli6n y 10lucl6n. La liet.eropneldad de la ledle e1 conocida por el vulo; como se ube, la ledle abandoneda a la temperatura ambiente se separa pro llftivamente en tnll pene. {flc. 3): - lo Mta: capa de llbuloc puoe reunldoc por efecto de la gra veded ; - lo CIUI/od.IJ: cuena co.cuJada como consecuencia de la acciu mic:robiana; - tiiiUTO, que contiene 101 :woducto. .olublea y de la cu~eda (ea ltima ntr m o meooc te, Iilla naturalesa de la mlcroflora pnunte).

,tt,'::U

De eate conoepcl6n de la leche, conaiderada como una me&cla, ae derivan importaltea coDI8CUenc:iu: 1. Lal proporcionea de lot componente. de la mezcla pueden variar ampliamente.

2. Ceda uno de eetoe elemento. puede aialane de la mezcle ain modificacin.

22

Composicin de la leche

LECHE

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LECHE
(blnco uulacto)

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LACTOSUERO
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b e de las modificaciones que experimenta la leche Figura 3. Representacin esquemtica abandonada a la temperatura ambiente.

3. A pesar de ello, estos componentes no disponen, en la leche, de la lndependiencia que ee podra suponer cuando ee los estudia aiala demente con un fin didctico. Existen, por el contrario, Interdependencias ms o menos estrechas. Pueden citarse numerosos ejemplos: casena y fosfato de cal; agua ligada a las protenas; colesterol y lecitina, etc. 4. Las modificaciones experimentadas por uno de ellos pueden influir sobre el estado del otro. Existe por lo tanto en la leche un estado de equilibrio que puede romperee por acciones diversas, circunstancia en extremo importante para la tecnologa lechera. Cuando ee pretende aplicar un tratamiento a la leche, ea necesario pensar en los cambios que puede provocar en el estado de uno o de varios de sus componentes y las repercusiones eecundariaa que ee derivan y que
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Composicin de la leche

23

en ocuion81 100 inesperadas. Normalmente 118 trata de cambios previlibll!l de lu cualidades fsicas, orpnolpticu, nutritiva&, etc. que deben J)C*8lla leche y loa productoa lcteoa. Verem01, tambin, numer01001 ejemploa; be aqu doa mu.y ca.nu:teraticoa: - La d~n de la lactoaa por lu bacterlalte acompeda de produccin de cidos; como consecuencia 118 provoca la floculacin de la c:uena que, ain embargo, no haba sido atacada por aquellu hacteriu. - El calentamiento de la leche reduce la Ionizacin del calcio y aumenta la 81tabilidad del foafocaaelnato en una determinada zona de temperatura, y de aqu las dificultadea de coagulacin por lu enzimas. Adems, desnaturaliza ciertas protenu y retarda el deanatado espontneo.

11 DIFERENTES "FASES" EN LA LECHE


A ) Recordemos que ee llama ''fue", en un medio heterogneo, a cualquier parte que constitu.ya una de lu material homogneu., cual - eu estado de divWn. En la leche te pueden disnguir trea fuea : - la emu1.16n de materia grua bajo forma globular; - la eupe114Wn de caaena, ligada a las aalea mlneralea; - 14 tolucln o fue bdrica, que forma eliiiAidio ma voluminoso, continuo. La leche puede contener gases disueltos, pero en realidad no constltu.yen una fue gaseosa diferenciada.

B) La dl.etincin de una ''fase coloidal", que comprendera la casena y las protenas llamadu "aolub181" (globullnaa, albminaa) no est jUJti.tlcada. Se trata de un siatema heteroneo. El estado "coloidal" no se considera por 101 flsicoqumicos como tundame.n talmente diferente del estado "criltaloldal" (aolucionea " verdaderu" de suatanclaa cristalizables de bajo peao molecular}. Cuando el tanW\o de las molculaa en solucin te vuelve cada vez ma grande, las propiedades aparecen cada vez ma sealadu, pero no hq dlacontlnuldad. Las protenaa solubles de la leche pertenecen al tipo de 101 "coloidea macromolecuiarea hidrfilos" , pues poseen una gran afinidad por el disolvente, en este caso el agua pero se debe considerar que eu estado fsico ea el de aoluci6n. Por el contrario, ll8 puede diferenciar el estado micelar, que corresponde a la aregacin de variaa molculaa en una misma partcula. Por otro lado, tales partculaa pueden ter separadaa ms fcil y completamente que las molculas de las protenuaolublea. opyr r nted malcr al

24

Compoelcln de la leche

111 FASE HIDRICA. LACTOSUEROS


lA r- bdrl.c:a puede coi!Oiiderane como fonllllda por el conjunto de au.tandu di.leltu en el acua, "'!quiera que - el tanwo de 1111 molkulu (incluidu 1M protena aolublea), o nicamente por 1M au.tanciM de bl,lo pelO molecular; princlpelmente la 1aetola y lu sales que collltltuirflll la eolucin verdadera. Eata f - .U repreaentada, mM o menot completamente, por los
"lactoeuerot" , que pueden obtenene de dlvei'IU form.u.
l. .lcloeuero (falcoa La apUcacln de mtodos fsicos no desnaturall:r.ante permite separar el lactoeuero or:lglnal; talee eon la filtracin a travt! de membranaa d e poroe muy finos (ultraflltracln) o la eedlmentacin bajo la innuencla de campos centrfugo muy elevado, huta 800.000 veces la aceleracin de la gravedad (ultracen trifup cl6n). La 1eparacin completa de 1M protenu eolublel ee difcil, perv loa equlllbrioa entre lu diferentea fuet no 1e modlfic.n.

2. LociOIUU08 tU cot/~Ulocin Loa lactoauero. obtenldoa en la prctica, no reprentan fielmente la aolucin orilnal. La ~epuacin de la c:aee na por coeulacin cida o enzimitlc:a (cu.Jo) .e acompaa de modlficado i181 de la eolucin. El lectoauero de queaera 1e denomina en Franela " petn-lait". La facilidad de ata aeparac:in hace que ae utill.ce , habitualmente, inclueo en el laboratorio, para la preparacin del lactoauero, que ea interesante para numeroaos ettudlot. La faae hldrlca, reducida a la aolucin de mol6c ulu pequeas, tiene una propiedad importante: la constancia de au compoeioin mo lecular. l..a cantidad total de molculas no dleocladu y de lonee, en la unidad de volumen, vara muy poco . Ea la conaecuencia de un hecho fialol,Pco: la pre1i6n o~mtica de la leche en la mama debe ter eemejUite a la del auero aanguneo, que ea u imlamo cul conltallte ; ahora bien , la presin oamtlca depende Cllll excllllivamente de la concen tracin de lal molculu pequea diaueltu, tonlreda o no. Se dice que el lactoeuero ea i>tnlco con elauero aanuneo . Lal caracteristlcaa del lactocuero aon lot Ya.lo~ m conetllltea de toda& cuantO& ae refieren la leche, como wremoa en el captulo IX.

IV SUSTANCIAS ELABORADASSUSTANCIAS EXCRETADAS


Hemos visto que la mama sintetiza la mayor parte de los componentes orgnicos que no existen en la sangre. El cuadro 2 muestra que la

Composicin de la leche

25

composicin de la leche y de la sangre, que en la mama no se encuentran separadas ma que por una fina pared, son muy diferentes una de otra. Estaa diferencias se atenan en las leches anormales, fisiolgicas o patolgicas, como consecuencia de un incremento de la filtra. cin de los componentes del plasma sanguneo. Cuadro 2. CompO&icwn de la leche y del plaaTTUJ sangu(neo de los
bvidos (promedios).
(Jjlitro) Leche Materia gnsa . . . . . . . . . . .. Lactosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a-lactoalbmina + !-tactolobulina ... . . . Albmina + globutina . . . . . . . . . . . . . . .. Acido ctrico . . . . . . ... ... .. . . Cloruros Fosfatos (en P2 Os) . .. . . . . . . . . . . . . Plasma

sanauneo

. .. .

. .

..

Casena . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .

... . .. .. .. . ... . . . .. .. . . . .

35 49 27 4 l,S 2 1 ,6 2,5

o o o 15 o
6 0,3

Ahora bien, existe otra causa de anomalas de composicin; se trata de la disminucin de la activided sintetizadora de la mama en determinadaa enfermedades; la consecuencia analtica es un descenso del contenido en lactosa, grasa y casena y, por el contrario, una ele vacin del contenido en albmina + globulina y cloruros. Estaa y otras variaciones importantes en laa propiedades de la leche hacen que, aparte de las razones puramente higinicaa, laa leches enfermas (patolgicaa) no son aptaa para la mayor parte de las utilizaciones de la leche normal. Existen casos aberrantes; aa, por ejemplo, el contenido en grasa puede aumentar como coii88Cilencia de un descenso rpido e importante de la cantidad de leche producida por la mama de un animal enfermo. La leche puede contener, de forma accidental, diversas sustanclaa excretadaa por la mama al actuar como emuntorio: sustancias ingeridaa con los forrajea y drogaa diversas. Un problema Importante para la higiene es la presencia eventual de insecticidaa clorad08 en la leche, D.D.T., H.C.H., aa como de antiparasitarios, antibiticos, etc. Posteriormente volveremos a tratar sobre estaa ltlmaa sustenciaa (captulos XIII y XXlll).
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Cuadro 3. LECHE DE VACA . Comoosicion t iro y propiedades fsicas.


Composicin

pamoa
por litro
.A\18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . .

Estado fsko de los componentes Agua libre (disolvente+ aua Uada (3 ,7 Solucin

Glcidos: lactosa . . . . . . . . . . . . . . ... . Lpidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... Materia grasa propiamente dicha .. .. . .. . Lecitina (fosfolpidos) .. . . .. . ..... ..

905 49

%)

35
34 0,5
Emulsin de los glbulos grasos (3 a S micras)

Parte insaponificable {esteroles, carotenos. toco


feroles) . ... . .. .... . . . . . . . . . ... .. Prtidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . ... .

O,S
34 27 Suspensin micelar de fosfocueinato do cal (0,08 a 0,12 micru)

Casen.a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
Prtidos "solubles" (globulinas, albminas) ...

5,5
1,5

Sustancias nitrogenadas no proteicu . . . . . .. Sales .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..


delcido ctrico (en cido) . . . ..... . deUcido fosfrico (P, Os ) . . . . . . . . . . .. del cido clorll drico (N aO) . . . . . . . . . . .. .

9
2 2,6 1,7

Solucin (coloidal) Solucin (verdadera) Solucin o estado coloidal (P y Ca) (Sales de K, Ca, Na, Mg, etc.)

Componentes diversos .. ..... . .. ..... .. .


(vitaminas, enzimas, sases dbueltos) Extracto seco (total) ... . . . . . . . . . . . . . . . Extracto seco desengrasado ... . .. .. .. DenJidad de la lecho complota . . . Densidad de la leche descremada . Densidad de la materia pasa . . . . Poder calrico (por litro), caloraa .... . ... .. 1,032 9,036 0,949

indicios
127

92
Conductibilidad ol6ctrica, mhos . . . Toasln superficial (dinas/cm/15) . Viscosidad abaoluta (15) . . . . . Inclice de refraccin . . . . . . . Punto de c:onplaci6n . . . . . . . . . Calor especfico . . . . . . . .

... ..
... ..

700
6,6-6,8

pi{ . . . . . . . . . .

. . . . . .

. .. 45 X 10.. . . 53 ... 0,0212.0,0254 . .. 1,35 .. . - o,S5 .. 0,93

Composicin de la leche

27

V COMPOSICION MEDIA DE LA LECHE DE VACA E IMPORTANCIA RELATIVA DE SUS COMPONENTES

En el cuadro 3 se da la composicin media de la leche de vaca en sus principslea elementos y las propiedades fsicas ma Importantes. Ea corriente reducir la leche a SUB custro componentes ma Importantes: lactosa, graaa, protenas y sales, y despreciar las &Uataneia&
presentes en pequeas cantidades. Esta simplificacin no puede aceptarse ma que para un balance de anlisis ponderal o para el clculo del valor energtico de la leche. Desde cualquier otro punto de vista no pueden despreciarse los pequeos componente que en buen nmero se encuentran en la leche, ya que slo pueden considerarse como secundarios en lo que se refiere a su proporcin nfima; en determinadas circunstancias pueden tener una Importancia preponderante. Tales son los represententes de grandes familias de la bioqumica: - Fo&folpidos (lecitina); - Carotenoides, esteroles, tocoferoles; - FlavinaB y vitaminas hidrosolubles;

-Enzimas;
- Nucletidos. El perfeccionamiento de las tcnicas analticas y los progresos de las Investigaciones sobre la fisiologa de la lactacin, han permitido descubrir una gran variedad de susteneia& orgnicas en la leche; muchas de ellas relacionadas con derentes metabolismos. En los captulos siguientes estudiaremos separadamente los componentes Importantes de la leche agrupados segn el esquema clsico: -Glcidos. - Lpidos y suStancia& asociadas a la materia grasa. - Protidos y sustancia& nitrogenadas diversas. -Sales. - Enzimas y vitaminas. Las variaciones de la composicin se estudiarn despus (captulo XV).

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SEGUNDA PARTE

Qumica, bioqumica y fsica de la leche

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Glcidos Lactosa. cido lctico

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danta y IU tctivided o.mtica global ee mucho m elevada que la de loa otro. componente.. Deede el punto de vista biolgico, la I'Ctola M dlatmue de los ucaree comlln4ll, por IU estabilidad en el c:lrcuito alimentario. Las endmaa especUicaa que aseguran la bidtli de la lactoA y la des mollala de la placto.a eon o poco abundante. o poco activas. La lactosa no ee aimplemente un glcido enertlco para loa Miel huma noa y pan numero.oa animales, la lactoaa et, en la prctica, la nica fuente de plactosa, que es un componente de loa tejido. nervi0101. En el captulo XX IJI, ae tratar de otru propiedades de la lactosa y su adaptacin a la alimentacin humana. La lactosa ea el componente de la leche ma lbil frente a la accin microbiana. La leche ee fcilmente presa de bacterias de divereos ti poa, q ue transforman la lactosa en cido lctico y en otroa cidos allfticoa; transformacin a veces nociva y frecuentemente muy til. En la leche de vaca, el contenido de lactosa vara poco, entre 48 y 50 g(l. El (actor m importante de variacin ee la inleccl6n de lama ma, que reduce la eecrecin de lacro.. . Debido a la reaulacin oam tica (captulo VU), el contenido en lactoaa de la leche ee (aproxima demente) inveraamente proporcional al contenido de aalee.

111 LA LACTOSA Y SUS ISOMEROS

Al E11rUctur1 El cuadro 6 muestra los diholosidos (o diaacridoa) de la familia de la


lactoea que ee interesante tener en cuenta. Estas auatancias, aparte el lactinol, son, en diferentes grados, ismeros: la manosa ea un epmero de la glucoaa, la alolactosa es un ismero de poalcln de la lactosa, etc. Pero el trmino "ismero", en el caso de la lactosa, ae utiliza en general para designar a los dos "anmeroa" 01 y {J del mltmo diholsi do que eon conaecu. ncia de la estructura clclnlca, como Jo muestra e la flcura 4, y del hecho de que la mitad glu001a lleve una funcin semlaldehdlca libre. De pasada puede indicarae que la tacaroaa no tiene eet.a propiedad. El pe.o molecular de la lactou. anhidra ea 342. Erilte un equilibrio en!le loa ilmeroa o y {J y las formas anbidru e hid111t.adu, aunque no ee ha puesto an en evidencia la lactoa {J-hidrat.ada. Lactota anhidra (o o {J) ,.. Lactosa hidratada (01 o {J) Lactosa 01 (anhidra o hidratada) .. Lactoaa {J (anhidra o hidratada) Se ha dicho que la lactosa se encuentra enteramente en la forma tl en la ltcht humana, lo que constituira una ven~a deade el punto de vista nutritivo. No obstante, lo ms probable ea que en la leche huma na exista el mismo equilibrio que en la leche de vaca, como vamos a ver.

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Glcidos-Lactosa. cido lctico

Cuadro 5. Diholsidos de la {amili4 de la lactosa.


Nomb<e comn
l. Lactosa

CompOJiicln ( 0 ) Galactosa (3 ( 14) glucosa G81actota /l (14) manosa Galactosa Jl (1 4) fructoaa Galactosa /l (1~) lucosa Galactosa /l ( 1~) galactosa Galactoaa fl (1 4) aorbitol

Oriaen Glcido dominante de la leche 1) en la leche Cllentada fuertomento (120 e, 30 mln) 2) tratamiento a!CIIino productos de tranclucosUacin por una jl-plactoslda sa (Jactasa) producto de reduccin do la lactosa

2. Epilactasa
3. Lactulosa 4. Alolactua

7 6. Laetinol

S.

Todas las monosu son de la serie D. Todos los dlholsidos tienen las 2 formas anom~rieas a Y /l (el lactlnol no os realmente un dlhol6sido ). Los nomb[es cientficos son mucho ms largos; por ejemplo, el de la lactosa : 4.Qil-D.alactoplranosiiD'IIucsido.

B) Cristalizacin de la lactosa La lactosa ordinaria (azcar de leche comercial), que se obtiene por cristalizacin por debajo de la temperatura crtica de 94C, se encuentra bajo la forma Q.bidratada: e, H 22 0 1 1 , H, O; la forma QBn hidra se obtiene por desecacin al vaco con calentamiento moderado. La forma J-anhidra cristaliza a partir de laa soluciones concentradas a una temperatura superior a 94 C. Si se somete la leche a una desecacin prcticamente instantnea, en el polvo se encontrarn las dos formas, a y tJ. Estos dos anmeroa se distinguen por sus propiedades fsicas (cuadro 6). En una atm!!Cera hmeda, la lactosa Q-a!lbidra se convierte en Q hidratada por debajo de loa 94 e, pero por encima de esta temperatura crtica, se convierte en lactosa /l-anhidra. Las condiciones de la cristalizacin influyen sobre la forma de los cristales. La lactosa es un interesante ejemplo de polimorfismo cristalino, que ha dado lugar a extensos estudios la razn no es solamente cientfica y en el subttulo IV podremos ver el inters de este fenmeno desde el punto de vista tecnolgico. La cristalizacin forzada y
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o

(grupo t-k$1t!kUeo)
CHOH-CJ~Ot'-CiiOtt-cHOH-CH-C'H,

o
f \j

HOCHl-CHOH-CHOH-QIOH.....C'M--O~o-cootl

...._....
:0014,

"'
:

'

--

Acldo~

Agur 4. Frmulas dolos ghl cldos

rpida (con aiembra de lacto&a cristalizada o de leche en polvo) da solamente pequeos prismas paralelepipdlcoa si es lenta permite obaervar formas variadas: pirmides, "tomahawka" y finalmente el cristal completamente desarrollado, que ea un priama cuya complejidad resulta de la velocidad de crecimiento que no ea la miama para las diferentes caru. La figura 5 muestra variu formaa de criatalea de lactoaa. Algunas auatanciu pueden retardar o impedirla criatallzacin de la lacto&a al 1er adaorbidaa sobre los ncleoa; eate erecto puede manifeatane a muy pequeas dosia. Un ejemplo nos lo da la ribotlavina que ea un componente normal de la leche (0,5 ma/100 ) por debajo de una concentracin critica de 0,25 a temperatur111 poco elevadaa esta sustancia impide la cristallzacin. Loe agentes tensioactivoa tienen un efecto ~emejante.
C) Mutarrotaci6n

Cuando se duelve lactosa ordinaria en agua, se observan algunas particularidades en el poder rotatorio y en la solubilidad. A la temperayr Qhled rnater ol

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Glcidos-Laclosa. Acldo lctico

>----4
0,1

*""'
5.
Mlcrofoto~

Flg ~o~r

grafla de cristales de glclaos.

Arriba a la derecha, un grueeo cristal de slam(0, 7 bra ae lactosa mm de longHud: foto amablemente oediaa por A. Van Kreveld).

Arriba. a la Izquierda. lactosa cristalizada cOdex: la lorma predomlnantv es la de un


prlema tangular de

arlttas cortado. (foto Al ala y Bracquart).


En la parte de abajo, cristales en forma de erizo da cido N-acolllneuramlnlco extraldos de la caserna. (Ribadaau-Oumas y Alala, 1961).

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tura ambiente, la rotacin especfica baja lentamente de +as a +55, en IIIUI.S 24 horas en medio neutro; la tranarormacin es mucho ms rpida cuando el pH ea superior a 9,0 (alcallnir.acin con un poco de amonaco). Esta rotacin rmal, + 55 C, ea la del equilibrio a .,. (J a l5C; se encuentra en solucin una parte a y 1,63 partes de (J-lactosa. Es el fenmeno de la mutarrotacin, cuyo conocimiento es Importante para la valoracin polarimtrica de la lactosa en los productos donde este azcar se halla cristalizado. La constante de equilibrio 1,63 vara poco con la temperatura, no es ms que de 1,36 a 1ooc. En una solucin alcalina de metano!, se observa la transformacin de la lactosa a en lactosa /J.

DI Solubilidad
Por ser la lactosa-/l la ms soluble, la solubilidad inicial de la lactosa ordinaria a 1sc , 7,3 g en 100 mi de agua, se eleva, tras agitcin prolongada, hasta 17 g. Debe destacarse que la lactosa es un azcar relativamente poco soluble : unas 1 O veces menos que el azcar ordinario . La solubilidad de la lactosa aumenta fuertemente en caliente como se seala en la figura 6. Por tanto, cristaliza al enfriar sus soluciones concentradas. En este principio se basa el mtodo habitual de preparacin del azcar de leche a partir del lactosuero; el suero se separa de sus protenas por ebullicin, luego se concentra al vaco y se enfra. Con la lactosa no se pueden obtener jarabea espesos ni confituras estables a la temperatura ordinaria. Las soluciones concentradas de lactosa quedan en estado de sobreaaturacin durante la refrigeracin; a 25c la solubilidad lmite de la lactosa es de 22 g por 100 g de agua, por lo que una solucin de lactosa con 50 g por 100 g de agua, enfriada a esa temperatura, comienza a cristalizar naturalmente. La presencia de alcohol reduce la solubilidad de la lactosa; la forma a precipita la primera. E) Sabor dulce La lactosa tiene un dbil sabor dulce; su poder edulcorante ea seis veces menor que el del azcar ordinario (a ttulo comparativo, si consideramos un valor edulcorante para la sacarosa de 100 tenemos: para la lactosa 16, para la gluooaa 75, para la fructosa 170 y para la sacarina 45 .000). En la leche, por otra parte, el sabor dulce de la lactosa est enmascarado por la casena; el suero tiene un sabor dulce ms acusado que el de la leche de que proviene, aunque la proporcin de lactosa sea del mismo orden. El dbil sabor dulce de la lactosa se considera como una cualidad desde el punto de vista diettico. Hace so portables las dietas lcteas.
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Glcidos-Lactoaa. cido lctico

1~ r-----------------,-----------------~

50

temperatura

100"C

Figuro 6. Solubilidad de la lactosa en agua

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IV ASPECTOS TECNOLOGICOS. LACTOSA AMORFA

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A) Leches y lactosueros ooncentrados En la Jeclle concentrada a un tercio de su volumen (3:1), la lactosa se encuentra prxima a su grado de saturacin a la temperatura ordinaria; la refrigeracin o la adicin de sustancias extraas muy solubles, como la sacarosa, pueden provocar la cristalizacin de la forma a-hidratada de la lactosa cuya aftnldad por el agua es mucho ms dbil. Hecho que ocurre en la "leche concentrada azucarada". La cristalizacin lenta produce cristales gruesos y muy duros, el producto preaen ta caractersticas desagradables para el consumo; ea el defecto "are noao" que aparece cuando loe cristales tienen una longitud superior a 0,03 mm. Se precisan pooos cristales para dar origen al defecto. Por lo tanto, deben buscarse las condiciones que favorezcan la formacin rpida de cristales Jo ms pequeos posible, que no puedan ser detec tados por la boca; tienen menos de 0,01 mm; para ello se fuerza la cristalizacin sembrando la masa con lactosa finamente cristalizada, o con leche en polvo de calidad adecuada, y agitando. En el Jactoauero, una buena cristalizacin reside, por el contrario en la formacin de cristales gruesos, regulares y slidos, como los que se ven en la figura 5 (arriba a la izquierda). La cristalizacin depende de varios factores, sobre todo de la forma en que se refrigera y de la agitacin del concentrado en caliente.

B) La lactosa amorfa y las leches en polvo La eliminacin rpida del agua en determinadas condiciones de secado, provoca la formacin de lactosa amorfa. Se trata en realidad de soluciones extremadamente concentradas, que contienen las dos for mas a y 'Y en proporciones variables; su tensin de vapor, en las con diciones habituales, no se encuentra en equilibrio con la del aire; por ello, los productos que contienen lactosa bajo ese estado son fuertemente higroscpicos. Es el caso de las leches en polvo obtenidas por Jos mtodos corrientes; en contacto con el aire hmedo, las partcu las tienden a aglutinarse y durante la disolucin se forman grumos. Se puede obtener un producto no higroscpico y m.s soluble, favoreciendo la cristalizacin de la lactosa mediante la humidificacin del polvo, seguida de una nueva desecacin simplificada, de forma que no se destruya su estado cristalino, (polvos "instantneos", captulo XXII).
C) Leches congeladas

Este sistema de conservacin para productos lcteos es de delicada aplicacin, a causa de la frecuencte aparicin de un defecto grave: la floculacin de la casena nativa en el curso de la descongelacin. Este
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fenmeno ea la consecuencia de la separacin de la lactosa, que cristaliza en la fase no congelada. En efecto, por debajo del punto de congelacin, no toda el agua se encuentra en forma de hielo, sobre todo en la leche concentrada. En una leche desnatada, concentrada al tercio de su volumen, a -4c hay todava un 50%de agua sin congelar y a -zoc queda solamente el 15%1 las cifras correspondientes para la leche dematada no concentrada son de 12 y 5%. A muy bajas temperaturas, ms all de -zo C, la proporcin de agua sin congelar ea muy baja y la lactosa es incristalizable, se encuentra en estado amorfo estable. Existe por lo tanto, una zona crtica -de temperaturas de --2 a -20 C. Probablemente se producen dos efectos: l. Efecto de concentracin de la fase hdrica; cuando la lactosa cristaliza se congela una gran cantidad de agua; la acidez de esta fase aumenta; el pH del ultrafiltrado, que es de alrededor del 6,7 con la leche natural, baja hasta 5,8 en la parte no congelada de la leche concentrada. Por otra parte, la concentracin salina se aumenta; ms cantidad de fosfato clcico pasa a estado coloidal (cap. VI y VIl) y contribuye a la noculacin de la casena. 2. Efecto protector de la lactosa, independientemente del efecto como sal. Es posible que la lactosa en solucin secuestre calcio. Adems la lactosa aumenta la viscosidad de la parte fluida y reduce la movilidad y orientacin de las micelas y de las molculas; es una barrera contra la agregacin que precede a la no. culacin. Se puede decir que todo aquello que favorece la cristalizacin de la lactosa (agitacin en el curso de una congelacin lenta, largo interva lo entre concentracin y congelacin~ reduce el perodo de estabilidad del producto congelado (perodo de induccin de la cristaliza cin). Por el contrario, la fioculacin de la casena no se produce si se impide la cristalizacin, por ejemplo, hidrolizando una par,t.e de la lactosa mediante la lactasa. Se ha propuesto la adicin de otros azcares, de glicerina, de dextrina, etc., para impedir la desestabilizacin de la leche concentrada congelada. Parece que el procedimiento ms recomendable es el de la lactasa.
V PRINCIPALES PROPIEDADES QUIMICAS DE LA LACTOSA

A) Propiedades reductoras. Datenninacin Por poseer un grupo aldehdico libre, la lactosa es un azcar reductor. Reduce especialmente al licor cupro-alcalino de Fehling, princi plo en que se basa la determinacin corriente, (la sacarosa debe hi drolizarse para que se pueda valorar). Es interesante resaltar que el poder reductor de la lactosa es considerablemente ms dbil que el de
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la glucosa (70 partes de glucosa reducen al licor de Fehling lo mismo que lOO de lactosa). SI se hidroliza la lactosa por un cido el poder reductor aumenta conaiderablemente (X 1,37). El mtodo anterior es cada vez ms sustituido por la determinacin colorimtrica. Esta se basa en la reaccin que dan, con diversas sustancias orgnicas, los productos de degradacin de los azcares reductores en medio fuartemente cido (reaccin de Bial con el orci no!, reaccin con la antrona, etc.). Estos mtodos han sido a su vez sustituidos por la cromatografa en fase gaseosa, para la que los azcares se vuelven voltiles bajo forma de steres sililados (por ejemplo por el trimetilclorosilano) y, to dava ms reciente, por la cromatografa HPLC (cromatografa lquida de alto rendimiento).
Bl Hidrlisis qumica La hidrlisis de la lactosa es bastante difcil; es un azcar que presen ta una cierta estabilidad frente a los agentes qumicos. Se precisa la

accin de los cidos en caliente para desdoblarla:

Lactosa

Glucosa Galactosa

La hidrlisis de la sacarosa es mucho ms rpida, se denomina inversin. En las condiciones en que habitualmente se prctii:a la hidrlisis para determinar este azcar, la lactosa no es atacada. Es importante retener estas nociones para el. anlisis de los productos lctees azucarados y en especial de la leche condensada. La hidrlisis cida es un procedimiento industrial sobre el que se hablar en el captulo XXII. Se realiza sobre soluciones de lactosa, sobre suero o sobre el perrneado de la ultrafiltracin, utilizando cidos minerales o resinas sulfnicas cambiadoras de iones. Este tipo de hidrlisis tiene un fuerte competidor en el procedimiento enzimtico.
Cl Reacciones oon las sustancias nitrogenadas

Por su funcin aldehdica los azcares reaccionan con diversas sustancias nitrogenadas: amonaco, aminas, aminocidos, etc. Esta reaccin se puede apreciar en la leche con la lactosa. No se trata de una reaccin simple, sino de un conjunto de reacciones complejas, que se agrupan bajo el nombre genrico de reacciones de Maillard, y conducen finalmente a la formacin de compuestos condensados reductores que son pigmentos oscuros (melanoidinas). Esta es una de las causas del oscurecimiento de los alimentos, que se acompaa frecuentemente de una disminucin del valor nutritivo de las protenas. Existe otras causas de oscurecimiento, pero la reaccin de Maillard prevalece,
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ya que exle una dbil energa de activacin y ea, en parte, autocataltica. La primera etapa es la formacin de un compueato de adicin que lleva el grupo CH-NH-<:HOH-. A continuacin ee forma una base de Schiff por deshidratacin y despu. de un reagrupamiento llamado de Amador!, aparece un importante intermediario, la aminadesolricetoea con el grupo -NH-<:H2 -co-<:HOH- a partir del cual ae forman por eaclain y deshidratacin, aldehidoe y cetonaa con 3 - 4 carbonoe y derivados del Curfural (ver ma adelante). Estos cuerpos producen, por interaccin con aminocidos (reaccin de Strecker), gas carbnico, aminu y aldehdos de cadena corta. Estaa do1 ltimas sustanciu se condensan y polimerizan por fin para dar lu melanoidinaa. Hay que resaltar aqu un fenmeno que tiene consecuencias analticas. En el curso de la hldrliaia cida (con vlataa a la determinacin de los aminocidos) de leches sobrecalentadas, se observa la formacin de dos nuevos aminocidos la furoana y la plrldollna. Se producen por la deshidratacin de la amino-desoxicetosa correapondiente a la U.ina. El porcentaje de bloqueo de la liaina puede deducirse de la cantidad de furosina medida por cromatografa, tras hidrlilil. Estaa reacciones de Maillard son cataliadaa por los metales, como el Fe, Cu, etc., y los fosfatos. La elevacin de la temperatura las acelera considerablemente lo mismo que la humedad en el caso de productos deahidratados. Se manifiestan por los fenmenos siguientes: - decenso del pH, - llberacln de gas carbnico, - produccin de compuestos reductore~ (reduccin del ferrlcianuro), - produccin de compuestos fluorescentes, con una fuerte absorcin para loa ultravioleta (compuestos carbonUos), - disminucin de la solubilidad de las protenas, - coloracin oscura, - sabor a caramelo. En la leche calentada la reaccin ea rpida; en las leches en polvo la reaccin es lenta durante el almacenamiento, correapondiendo a un "envejecimiento bioqumico". Un grupo arninado de la lisina, NH 2 -(CH 1 ) 4 -<:H(NH1 )-()OOH, reacciona inicialmente con el grupo aldehdico de la lactosa para formar un compuesto fuertemente reductor, en el cual los dos componentes estn "enmIICV&dos". La lisina pierde as sus propiedades nutritivas de aminocido esencial. En la leche en polvo, la velocidad mxima de la reaccin se observa cuando la humedad relativa e de 60-70 %. Tambin son atacados otros aminocidos: arginina, histidina, metionina y triptfano. Desde el punto de vista tcnico, es evidente que la eliminacin del hierro y del cobre en los materiales, as como el empleo de temperaturas lo ms bajas posibles y el mantenimiento de los productos despyr t
f"'>!ltr ;;1

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hidratados en atmsfera seca, son recomendables para reducir estos inoonvenientea. O) Achorcl6n por le IICtOtl di ~stencl11

de bejo peso II)Oieculer

No ae trata de eniec:ea qumieot1 de naturaleza oovalente, sino de enlaces secundarios, del tipo "fuerza de Van der Waals" y "enlsce hldr6geno", que implicara dos posiciones especiales sobre la molcula de lactoea. Este fenmeno tiene importancia en la prctica, ya que aclara el notable poder de la lactosa para fijar aromas. La adsorcin y la deaorcin ae han estudiado referidas a diferentes SU8tancias; las velo cidades y las proporciones dependen de la estructura qumica. Los alooholea ae adsorben fcmente, a oontinuacin vienen los steres, las cetonas y loa cuerpos con ncleo aromtioo.

VI DEGRADACION DE LA LACTOSA POR EL CALOR


Entre 110 e y 130 e, la lsctoaa pura pierde su ~ de cristalizacin; ms all de 160 e amarillea y hscia los 176 C se oscurece y carameliza. La caramelizacin directa tiene una energa de activscin elevada; ea por lo tanto de menor importancia que las reacciones pre cedentea en el caso de la leche calentada. Al calentar la leche, el oscurecimiento sobreviene a temperaturas ms bejas. La leche esterilizada 20 minutos a 120 e (en autoclave) ae muestra ya coloreada; adems aparece el llamado sabor a cocido, que no ea el de caramelo. Antes de la aparicin del oscurecimiento ae forma un complejo entre la casena y la lactosa (por ejemplo, por calentamiento durante 1 hora a 97 C); a ms alta temperatura este complejo se destruye y aparece el oscurecimiento (p. 'e j., durante 10 minutos a 120 C). La descompolcn de la lactosa en.. el curso del calentamiento de la leche, conduce a la formacin de productos cidos, segn el proceso siguiente:
f!!O yRO COOH
1

~JIOH

~."OH

HOII

f HOH CH,OH

- an,o

~~~~ 1
~ + zu.o o
CH,OH

~H,

~H,

+ H-COOH

yo
CH,

Hexosa

Hldroximetllfurfural

A e!do lewlieo

Aeido

f6nnico

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El bidroximetll furfural ea un cuerpo lbU; tiende a descomponer se en cidos levlico y frmico. De la misma manera, puede formar fcilmente productos de condensacin relacionados con loe que se presentan en los procesos de oecurecimiento, mencionados ms arriba a propsito de la reaccin de Maillard. Junto a los cidos 88 forman tambin alcoholes y aldehdos. Un aspecto interesante es la formacin de "reductonas", sustanclaa fuer temente reductoras caracterizadas por la presencia en sus molculas del grupo -c(OH)=C(OH)- como en el cido ascrbico (captulo
VID). La degradacin de la lactosa tiene otras consecuencias adems de

las citadas anteriormente: l. Los cidos formados en el curso del calentamiento tienen la propiedad de activar el crecimiento de las bacterias lcticas (captulo XI). 2. Algunos de los productos de descomposicin son solubles en ter, y pueden eer cauaa de error en la determinacin de las materias grasas (captulo V).

VIl TRANSFORMACIONES BIOQUIMICAS Y BIOLOGICAS DE LA LACTOSA


A) Hidrlisis enzimitica La lactosa no entra directamente en loa ciclos biolgicos del metabolismo, sino traa la degradacin, con liberacin de energa y produc cin de importantes productos intermedios (catabolismo) o por la sntesis de poliholsidos, como el glicgeno (anabolismo). Son las dos bexosas que la constituyen, glucosa y galactosa,las que entran en los ciclos tras su foaforilacin. Por lo tanto, la lactosa ser utilizada por loa organismos superiores o por los microorganismos, solamente cuando produzcan la oxidasa especfica que rompe el enlace /J (1-4) de la lactosa. Esta enzima es la (J..galtu:tosidtUKJ (en la clasificacin internacional: EC.3.2.1.23), comnmente denominada: lactase. Otra enzima cata liza esta hidrllsia, la (J-6P~ctosidasa (EC.3.2.1.86); sta acta cuando la lactosa ea previamente foaforilada sobre el carbono 6 de la galactosa; es la nica presente en la mayor parte de los estreptococos lcticos. La presencia de la lactase en la leche ha sido discutida durante mu cho tiempo; parece que se encuentra en ella normalmente en peque ila cantidad. Las glndulas intestinales secretan una lactase a nivel del yeyuno, pero nunca en grandes cantidades, la secrecin debe depei der de la existencia de un substrato; liD ciertas razas humanas ea fre. cuente la deficiencia de lactase. Estas nociones son importantes desde el punto de vista de la nutricin (ver captulo XVll).
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Algunas levaduru producen lactaaa. Las levaduru alcohlicas habituales no fermentan la lactosa. De la mlama forma dentro del im portante grupo de las bacterias lcticaa, se encuentran microozganlsmoa, tales como el Lactobaclllua delbruckii, productores de cantida des elevada& de cido lctico, que no pueden desarrollane en la leche o en medioslactosadoa. La hidrliaia enzimtica de la lactosa ha pasado a ser una operacin indtutrial cuya importancia va en aumento (captulo XXII). En el momento actual se utilizan dos tipos de enzimas: - lactasas de levaduru; Kluyveromycea fralilis o Saccharomycea /QctiB; - lactaaaa fngicaa: A6pergi/lus nier, Rhyzopua oryzae, etc.

Estas enzimas catallzan la misma reaccin; sin embargo, son muy diferentes en algunas de sus propiedades. Las lactasas de levadura actan en medio neutro y a temperaturu medias; las condiciones ptimas son pH 7 ,O y 36 oC; se inactivan rpidamente por encima de loa 40 C. Las lactases fngicaa actan en medio cido (pH 4,6) y a temperatura bastante elevada (46-60 oC), son relativamente termoesta bies: se pueden encontrar en este grupo enzimas que son capaces de hldrollzar la lactosa en condiciones cercanas a la pasterizacin. Todas estas lactaaaa son inhibidas por los metales pesados. Hay un aspecto bioqumico que no debe olvidarse. Las lactasas son de hecho "transferasas" (como la mayor parte de las glicosidasas); tras rotura del enlace oadico, el reato gl.icona puede unirse a una molcula de agua dando galactosa o a otra molcula de osa dando un nuevo diholaido o tambin molculas ms largas de oligoholsidos. Existe una competencia entre el agua y las molculas de osas; pero la primera es privilegiada y los diholsidos, como las sustancias nm. 4 y 5 del cuadro 6, no se forman ms que en pequeas cantidades; sin embargo, su proporcin aumenta cuando la concentracin de la lactosa se eleva. Hay que indicar que el enlace P(11) no se forma en el curso de la transglicoailacin. B) Transformacin en cldo lctloo y fermentllciones secuncleries Es con mucho la ms importante. Numerosas bacteria& realizan esta transformacin, cuyo eaquema terico ea:
CuHnOu , H , O - 2 C.HnO.- CH.-CBOH-c:OOH

Acido lletico

La transformacin es en realidad muy compleja, se produce por la va de las hexoaas f011fatos, o va de Meyerhof-Embden. A partir de la giucoaa, hasta cido lctico, hay hasta diez etapas y hasta la nove-

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Glcldos-LactOM. cido "ctico

na la va 81 comn a diferentes fermentacion81, entre 1u cual81 .e encuentra la alcohlica, lieodo el iotennediario comn final el cido pvioo CH, -co-cooH. La mitad ~. antes de entrar en el ciclo debe 1\lfrir una iaomerisacio en aluco.&lfocfato por intermedio de una enzima denomioada habibJa!mente: /lllloctoll.lllliUruua. El cido pirvico no oontiene ningn carbono ulmtrioo; por el cootnrio, el cido lctico que .e forma por reduccl6n del anterior, cateliudo por la lctico.<feahidrogea., puede aer leviro (L) o dextr(iro (D). El iimero producido no 81 el miamo con laa diferentes 81peciea de bacteriu. Ea un cazcter secundario de determinacin, ya que la forma del cido lctico L, D o inactivo (racmlco) puede de pender, tambin, de las condiciones de cultivo. Debe d81tacarae que aolamente la forma L se encuentra pre.ente en el metabolilmo humano. La acidificacin 81pontnea ea el hecho m oomnmente obeer vado en la leche cruda conservada ala temperatura ambiente. La aci dez ee eleva muy lentamente al principio, lueao, tras a1unaa horu (1181D la temperatura), muy rpidamente; en eneral, ae trena UD poco cuando el oontenido en cido lctico Uep all t. En este momento, solamente 1 /4 de la lactosa ha sido degradada; eata ralentilw:in ae debe al efecto iobibldor del cido eobre 1u bacteriaa. Si ae neutraliza el medio, con creta, por ejemplo, ae puede oolllelllir la transforma cin induatrlal de cido lctico a partir del suero de queaera. Ante de Uegar a la proporcin dell% de cido, aproximdameute bacia el 0,6 t a temperatura de 20 C, se coagula la leche, en lensuaje comente se "corta". El cido ha roto el equilibrio entre eatado coloi dal y la aolucin, teniendo como consecuencia primera la inolubili zacin de la casena (captulo VII). La leche acidificada tiene un aabor y un olor diatlntoa al del cido lctico puro. Como en todas las reaccione bioqumlcaa, se forman pequeaa cantidadea de productos secundario junto al producto principal de la fermentacin. En general, por cada lOO parte. de lactosa tranaformada por laa bacteriu lcticu homofermentatlvaa, ae obtie nen 96 de cido lctioo y 5 de subproductos dlver101 : C02 , cido bu trico, aceWmetil-carbinol, etc. Algunos de ettcll productos preeentan UD olor fuerte. En la prctica, se puede bUICIIt la produccin de cido lctioo aolo o bien acompaado de suatanc:iu aromticas; en mante quera, por ejemplo, intereu.la formacin de aceWmatilcarbinol y de diacetilo; este ltimo ooJUtituye el elemento dominante del aroma de mantequilla. Ella ms simple de laa dioetonas:
CU, - 00- CHOH- CH, + 0= CH, - CO - 00 - CU,

r K,O

(AcolUmetUcarbinol)

(Diocot.llo)

e, pyr

rtro ~"'

GlcldosLactoaa. cido lctlco

47

Se han dado YIJOS eequemaa de fermentac:ln p.... explicar la for macin de e.t.. dos IIIStanciaa, a partir del acetolad:ato o del cido ctrico, que UDen re.pectivamente a la va de laa hexOAa-fosflto, por el acetaldebfdo y 11 ciclo de Krebl. La tnnaform8CI6n de uno en otro rall.za icuaJ.mente, por va enm!~Mtic:a (diaceWcHeductaa). Otra l\lltanda de molcula ma pequea juep un papel Importante en el aroma de loa productos lcteos cidos, ea el acetaldehdo, o etanll, CH, -cHO, que ee forma a partir del cido plrvico. Son in dlapenaablea pequeu concentracionea de e1tu auatanclu para el desarrollo del aroma de loa yogure. y otroa productoa fermentado; por el contrario , en la nata y en la mantequilla, un con tenido demuiado elevado de etanal provoca la aparicin de un defecto (IIU&to de yoiiUl, "green flavour"). El cido lctloo puede experimentar tarnbl6n la fermentacin proplnlca, por ejemplo, en el curso de la maduracin deiiiNY8re, ae forman otros cidos orPnicos y carbnico, reaponaable eate ltimo de la formacin de "ojos".
3 CH, -<:HOH-<X>OH l CB, -<:H,-<X>OH
(Addo 16edco)

+ CH, -<X>Oit + Jt2 0 + C02

(Addo propl6nleo) (Addo ~deo )

C) Tr.nsformecln en alcohol Laa levaduru producen una carboxilaaa que tranlforma el cido plr
vico en acetaldehfdo, el cual ee reduce a etanol CH, -eH, OH por medio de la "alcohol-deshidrogenaaa" (el msculo y laa bacterlaa lcti cas n o tienen eate sistema enzimtico ). Eeta fermentacin produce cido carbnico gaeeoso, como ee ve en la aigulente reaccin global:
C6 H12 0 6 = 2 CH, -<:H,OH + l 00 2

En la plictlca, eata transformacin ea menoa (recuente que la ante rior. Ya hemos viJto que existen pocu levaduru capacea de hidrozar la lactou. Se produce accidentalmente en lallnduttriu Ltcteu, y contt.ituye un peliro, aobre todo por la formacin de pa durante el "deauerado" de los quesos, en las nataa mil cuidadu, procedentes de lulfll\lu, etc. En loa Eatados Unidos ee ha llevado a eaclla lnduatrillla fermentacin alcohlica del auero de queeera, con o aln enriquecimiento, me dlante meluu. Eata fermentacin puede Ir M(Uida de la a~tica, para la produccin de UD vinagre que tiene cierta aceptacin en dicho paa. En cierto pa(eea orientales ee utiliza esta fermentacin junto a la fermentacin lctlca, para la preparacin de bebidas cidas, eapumo181 y dbilmente alcohlicas: kefi.r, leben, etc. (captulo XXfi).

48

Glcidos-Lactosa. cido tctico


Tn~nsformecl6n

O)

en licido butrico

Se produce a partir de la ladoaa o del cido lctico, con formacin abundante de gas, en medio neutro o poco cido:
2 CH.....aiOII-COOH = C.H,....Q)OIJ ~ 2 CO,

+ 2 H,

Aparece en la leche o en el suero fuertemente contaminado por Clostrldla o fermentos butricos (captulo X). Al olor desa:radable del cido butrico se aade el producido por fermentaciones ptridas concomitantes. En los quesos de pasta cocida, puede ser causa de graves accidentes (hinchamiento); como consecuencia de la produccin de gas, sobre todo hidrgeno, que es poco aoluble en agua. Se ha ensayado la produccin industrial de este cido a partir del suero, ya que ea un producto qumico Importante para las Industrias de sntesis (caucho sinttico). Asimismo, se ha estudiado a eacala induatrial una fermentacin derivada de la butrica, para la produccin de acetona y oloohol butlico , que 10n dbolventea indlatriales. Va acompaada da un enriquecimiento en vitamina B, (ribofiavlna), que puede extraerse del medio.

VIII LACTOSA Y SUEROS- ACIDO LACTICO


A) lA lactosa constituye la parte esencial del extracto seco de los sueros, en los que se encuentra en un porcen~e del 70 al 75 %. Algunas determinaciones realizadas sobre el lactoauero son de hecho, una valoracin aproximada de la lactosa (medida del ndice de refraccin). En las transformaciones experimentadas por la leche, la lactosa se encuentra iempre en la parte acuosa: leche desnatada (tras la separacin de la nata), mazada o "babeurre" (tru la separacin de la materia grasa de la nata), suero (tras la separacin de la cul\iada de casena y materia grasa en quesera), etc. En estos producto., la lactosa se encuentra en la proporcin de 40 a 50 g por litro (figura 7). La lactoaa ha sido, durante mucho tiempo, el componente despreciado de la leche de vaca, por no tener aplicacin para su consumo al natural. Pero hoy da, la situacin ha evolucionado: se ha adquirido el conocimiento de buenos mtodoa de recuperacin y de las amplias posibilidades de utilizacin de los lactosueroa, que se deacribinin en el captulo XXIl. AJiada de la leche, la lactosa tiene varias aplicaciones, ya sea formando parte de productos dietticos, como aoporte y diluyente de diveraas drogaa en farmacia, y como componente de los medios de cultivo de mohos y acti.nomices en la industria de loa antibiticos (penicilina, terramicina, etc.). Los jarabes de lactoaa hldrolizada tiepyr
t f"'>!ltr ;;1

Glcidos-Lactosa. cido lctico

49

nen an poca demanda, pero ofrecen posibilidades para una mejor utilizacin de este azcar; el jarabe tiene un sabor ms dulce, no cristaliza, y por lo tanto no da la sensacin de "arena", y fermenta fcilmente; en la alimentacin evita las diarreas que a veces provoca la lactosa (captulo XXlll).

1
(desn!tacro}

UCHE

1
(GOOgu\.e,on)
LACTOSUE'AO

..-------'1 1 - - - , .....

Figura 7... oesuno .. Industrial de la lactosa. (En les principales transformaciones de la leche, nunca se encuentra la lactosa en el

producto ms Importante}.

B) El 6cldo /6ctico slo existe como indicios en la leche fresca, con un porcentaje medio de 30 mgfl . Es, ante todo, el resultado de la fermentacin lctica, y, segn veremos ms adelante, dentro de la industria lctea puede presentar un carcter beneficioso o perjudicial. El cido lctico de fermentacin se ha convertido en un importante producto qumico; en estado puro o en forma de salea recibe diversas aplicaciones: industriu alimentarias , farmacia, industria textil, curtidos, induatriu de materias plsticas, etc. Su produccin a partir de leche o del suero es muy limitada comparada con la de origen vegetal de naturaleza hidrocarbonada. El cido lctico puro es un lquido de tipo jarabe, incoloro e inodoro. El olor de los productos lcteos acidificados se debe a otras sustancias. Es un cido "no voltil", es decir, que no es arrastrado por el vapor de agua, contrariamente a lo que ocurre con los cidos butrico y caprolco, que son liberados por la lipllsls (captulo V). La dosificacin del cido lctico es una operacin importante, especialmente para descubrir la neutralizacin de las leches o del suero en polvo. Hoy da se dispone de mtodos colorimtricos convenienCopynghtC'd rnatenal

50

Glcidos-Lactosa. cido lctico

tes: el de Davidaon (1949) es el ms preciso; consiste en oxidar el cdo lctico en ecetaldehdo, por el cido sulfrico concentrado y en formar un derivado purpreo con el parahidroxidifenilo (o parafenlfenol). Existen tambin mtodos enzimticos que permiten determinar separadamente las formas L o D del cdo lctico.
IX OLIGOHOLOSIDOS DE LA LECHE

Hemos visto que estos elementos, tambin denominados sacridos, se encuentran siempre en pequea cantidad, pero, sin embargo, tienen un gran inters por sus actividades biolgicas. Los de la leche humana son los mejor conocdos; son suatancas formadas por 2 6 molculas glucdicas y poseen un resto de lactosa en posicin reductora-terminal y existen tres especies: l . Sscridos no nitrogenados, que contienen glucosa, galactosa y una metilpentosa: la {ucosa (6-desoxi-L-galactosa). La ginogalactoaa es una mezcla de estos holsidos. 2. Sscridos que contienen un azcar nitrogenado, la N-cetilglucosamina. Poseen actividad biolgica variada; uno de ellos es un factor de crecimiento del LactobaciUus bifldus (flora intestinal de los lactantes alimentados con leche materna, captulo XU); otros tienen actividad serolgica (antihemaglutinacin). La leche de vaca posee escaaa cantidad de estas sustancias; si la actividad de la leche humana se expresa como valor 100, se tendr para el calostro de vaca 40 y para la leche de vaca 2 a 4. Esta es una de las razones de la superioridad de la leche materna humana para la alimentacin infantil. 3. Sscridos que contienen cido neuramnico bl\io formas acetiladas sobre el nitrgeno o sobre el oxgeno, y que reciben el nombre de cidos silicos. Son cidos fuertes (pK prximo a 2-2,6 ), que cristalizan bajo formas caractersticas (Fig. 5). A los sacridos que contienen cidos silicos se les han atribuido dlveraas actividades biolgicas. La actividad inhlbidora del crecmiento de determinadas bacterias (Eschericha coli, Staphilococcus aureus) mostrada por diveraas secrecones corporales, parece estar ligada a la presencia de estos cidos; esta actividad se ha puesto de manifiesto en la leche humana. El grupo prosttico de la casena K contiene galactosa, galactosamina y cido 0-!iilico que probablemente influye en las propiedades especficas de esta protena (captulo VI).
X POLIHOLOSIDOS
La leche no contiene sustancias hidrocarbonadas de alto peso molecular, como el glicgeno de los animales y el almidn de los vegetaCopyrighted rPatorial

Glcidos-Lactosa. cido !Actico

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lea. Pero es de lntera comiderar en este captulo, consagrado a la qumica de los glcidos, a loa pollholsdos producidos por loa vegetales superiores y que son sustancias importantes para la Industria alimentaria en general y la Industria lctea en particular. Estas auatancias se incluyen en la categora de loa hidrocoloidea, teniendo propiedades eapeaantea, gellflcantes y suapemoldea (diapersantes), loa ms Interesantes son preciaamente loa derivados de la galactosa. Las gomaa no son galactsidoa simples; por ejemplo, en la molcula de goma arbiga se encuentra alrededor del 45 %de galactoaa, al lado de arabinoaa (30 a 35 %), ramnosa y cido glucurnico. Se trata de molculas enormes muy ramificadas, muy solubles pero que slo dan soluciones de alta viscosidad a concentraciones elevadas (15% y ms). Por el contrario, los CGn"ll&eMtos producidos por las algas marinas, son galactsdos formados esencialmente de galactosa, de la que una parte ea aulforilada. La frmula dada ms adelante rapresenta una malla frecuente en estas sustancias, la carrabioaa kappa, donde M representa un metal. La cadena no ramificada est formada por esta bioaa, en la que el enlace interno ea ll (1-4),1Jgado al siguiente por un puente cr (1-3). Se encuentran tambin redes en las que un residuo de galactoaa est dos veces sulforilado, en 2 y 6.
M

CHzOH

'
H OH

OH

Los carragenatos tienen una solubilidad bastante baja (menos del 2 %) pero son capaces de geliflcar la leche a concentraciones an muy bajas. Tienen un poder estabilizante pronunciado hacia el O,Hl,2 %; estabilizan la leche con cacao sin aumentar su viscosidad sensiblemente . Las aptitudes ms interesantes de estas sustancias (estudiadas especialmente por Reea, 1969) se derivan de sus propiedades fsico qumicas que se pueden reaumiz as: l. Son capaces de formar pelculas adhirindose en la superficie de mioelas hidrfobas, porque son cidos fuertemente ionizados en el agua (las mioelaa hidrfobas llevan ordinariamente una carga positiva) y son agentes mojantea. 2. Frenan los movimientos de las micelaa impidiendo que se fusio nen, por una parte aumentando la viscosidad del medio disperaante y, por otra, diaminuyendo la tensin superficial.
Copy nghtC'd m aten al

52

Glcldos-uctosa. Acldo lctco

En el CiliO de la leche plfficada, se ha demo.tndo que la cuena reacc:iona con loa carragenalol tanto ma, cuanto la leche ha calentado dunnte tiempo a temperatura cercana a lot 100 C. Otru IUJtancias tambin producid-. por alpa marina~, tienen propledadea y estructura puecidu, pero estn menoa IUI!oril.ad-.. Los carrqenatot contienen entre 20 y 30% de tulfato, lu furcellalanas (aar dan&) contienen del 16 al 20%. El agar.qar (geloaa) no poaee ml que entre un 2 a un 3% y contiene, al lado de la p.lactosa, manoaa. Batas austanciu no plantean problema aluno a loa higienistas, aunque ~tan digerldu,lo que no parece ser el cuo, y liberan molculu de oau inorentivu y , en parte, metaboliublea. Lu pectina vegetala aon tambin galact6aidoa, pero la red de la cadena polloadica est conttltulda por otru derivada de la plactosa y aobre todo del ter metlico del cido p.lacturnlco.

Captulo 5 Lpidos. Materia grasa-Nata

1 GENERALIDADES

En la fase llpdica de la leche se encuentran tres clases de sustancias asociadas: l. Los lpidos neutros, es decir la materia grasa propiamente dicha, constituida por glicridos, que supone alrededor del 80% del conjunto, en el caso de la leche de vaca. Se trata de una grasa que a temperatura ambiente, unos 20 e, ea slida. 2 . Los lpidos polares: son fosfolpidos de naturaleza compleja; constituyen alrededor dell% del conjunto. 3. Las sustancias lipo(dtcas, o "insaponificables" de naturaleza diferente de laa precedentes aunque tambin insolubles en el agua; entre ellas se encuentran las vitaminas; estn presentes en la grasa de la leche de vaca en una proporcin menor del 1%. Como en el caso de los glcidos se pueden distinguir los lpidos libres, con mucho los ms abundantes y los lpidos ligados a las protenas. Los primeros, se pueden extraer por medio de los disolventes ordinarios de las grasas, tras ruptura de la emulsin, por ejemplo, con el benceno, el ter etlico y el ter de petrleo; para extraer los segundos es preciao utilizar una mezcla disociante y disolvente como la de etanol-cloroformo (2/1). En la leche, loslpidos neutros estn casi enteramente libres; la casena no alcanza ms que el 0,05 %; por el contrario, los fosfolpidos se encuentran en forma ligada y principalCopy nghtC'd m aten al

54

Llpidos. Materia grasa-Nata

mente en la membrana de los glbulos gr&808. Cuando se funde mantequilla a temperatura moderada, a unos 60 o 60C, y se separa el aceite por centrifugacin, este no contiene fosfolpidos, se quedan en el fondo con las protenas. Los lpidos se encue.ntran dispersos en la leche en forma globular. Esta dispersin es inestable y las sustancias que la componen son las ms fciles de extraer de la leche, sin modificar los otros componentes. De este estado se derivan consecuencias prcticas Importantes. Los problemas que se presentan en el estudio de la materia grasa de la leche son de dos tipos: l. Problemas qumicos y biolgicos relativos a los distintos componentes. 2. Problemas fsicos relativos al estado globular y a las modificaciones que puede sufrir. Hemos visto anteriormente que una parte de la materia grasa se sintetiza en la glndula mamaria a partir de los cidos grasos voltiles, sobre todo en los rumiantes; el resto se forma a partir de los cidos grasos que se encuentran en la sangre. El rgimen alimenticio tiene, por consiguiente, una influencia considerable sobre la composicin de la materia grasa de la leche. Por otra parte, esta ltima difiere por su composicin de las otras grasas del cuerpo. La materia grasa es el componente de la leche que vara en mayor proporcin. Diversos factores influyen sobre el "porcentaje graso". Durante mucho tiempo la grasa ha sido el nico componente de la leche determin'ado sistemticamente con objeto de estimar el valor del producto y las aptitudes del ganado lechero; sin embargo, esta simplificacin es exces.va, puesto que la relacin entre el porcentaje i de materia grasa y el de los otros elementos no es estrecha, sobre todo en lo que se refiere a las materia& nitrogenadas. (Cap. XV.) La materia grasa vara tambin en su composicin. No son fijas, ni mucho menos, las proporciones de los diferentes cidos grasos, de los distintos tipos de fosfolpidos y de las diversas sustancias insaponicables. De ello resultan diversas variaciones en las propiedades de la materia grasa. La materia grasa se altera ms lentamente que la lactosa; sus modificaciones no provocan grandes cambios en la estructura fsico-qumica de la leche, pero son importantes por ser causa de la aparicin de sabores desagradables.

11 COMPOSICION DE LOS TRIGLI CER IDOS


Los trlgllcrldos son steres del glicerol y de cidos grasos alifticos. Los radicales cidos R pueden ser idnticos o diferentes (glicridos homogneos o mixtos). Estos steres pueden dejar libres sus compoCopynghted r- atonal

Llpidos. Materia grasa-Nata

55

nentea por hidrlisis, con fijacin de tres molc:ulu d.e aua:

f" flt

O- CO - R

- 0 - CO- R -LlH,O

=V"

~H, - OH - OH +

J it....COOH
(Acldoa cruoa}

bf, - 0 - CO-R
('l'rifli~ridoa)

CH. - OH

(Ollcerol)

La hidrliaia puede realizarse de diferentes maneras, entre las cua-

les dos nos interesan de manera particular. - Accin enzimtica de las lipasas que Intervienen especialmente en el ennmciomiento; - Medios qumicos, principalmente la accin de loa lcalis; en este caso la reaccin se denomina soponlf:ocl6n, ya que la sal RCOONa ea un jabn; se utiliza como mtodo analtico. La naturaleza de los cidos grasos R y aua proporciones respectivas diferencian loa diversos cuerpos grasos y determinan aua propiedades. La materia grasa de la leche presenta tres caracteres distintivos: l. Gran variedad de cidos grasos; se han Identificado ms de 150. 2. Proporcin de cidos saturados igual a 2/3 y de cidos no saturadoa1/3, como trmino medio, en la leche de vaca. 3. Proporcin elevada de cidos voltiles de bajo peso molecular y, en especial, de cido butrico en la lecbe de loa rumiantes; como consecuencia, el ndice de saponificacin ea alto. (Cuadro 8.) Dentro de una misma especie, la composcin de la grasa de la lecbe vara poco segn las razas y mucho ms segn la naturaleza de la alimentacin. Sin embargo, los caracteres fundamentales citados no se modifican.
cu, - (Oieico)
1
CH - (Palm!tlco)

t11, - 0-CO-R

SI ae conocen ms de un centenar de cidos grasos, existe un nmero mucbo IDJIYOr de glicridos, debido a la exlatencia de gllcridos mixtos. Se identifican fcilmente separando, por presin, la parte lquida de la parte slida a diferentes temperaturas; en la parte slida, se encuentra el cido butrico; dado que la tributirina ea lquida, este cido ae halla invariablemente asociado a otros cidos grasos de punto de fusin elevado. El glicrido mejor representado ea el que se expresa en la frmula anterior en la que R ea un cido de bajo peso molecular (C4 a C14 ). Al lado de loa triglicridos se encuentran di- y mono.glicridos, pero solamente estn presentes en la grasa de la leohe en una proporcin muy dbU, respectivamente 1,5 y 0,25% de loslpldos totales.
pyr t f'"latn ;;1

Cuadro 7. Principales cidos lfT'd$08 de la grasa de la leche de vaca ( 1 ).


Careaorf Nmero de 'tomot de carbono
Propord6n

(del total) (3)

Estado fiai<:o (temperatura de f...;6n) (2)

l. ACIDOS SATURADOS (CH 2 -(CH 2 ) 0 2 -<00H)


a) Vol4tl~tl0lublts

b} Vol4tllts insoluble

e} Fijos

Butlrico Caproico Caprilico Cprico Uurlco Mir tico Pentadecanoico Palmtico

c.

c.
e,, e,. Cu c.. e,. c.o
Ca C,o

3 a 4 (n) 2 a S (in) 1 a I,S (in}


2 (2} 3 (8) 11 (10) 1,5 2S a 30 (23} 12 (7) 0,2

. Esterico
Ataqudico

Lquido(- s) Lquido ( - 3) LqUidoiiiido ( + 16) Slido ( + 30) Slido(~ 42} Slido(+ S4) Slido(?} Slido(+ 62} Slido(+ 70} 0 Slido(+ 7S )

Continuacin cuadro 7.
Cateaorla Nmero de tomos de carbono Proporcl6n del tolll (3)

Estado fsico (temperotura de ful6n) (l)

!1. ACIDOS INSATURADOS

1
a) MonMnos: CH3 -{CH2 ) -CH=CH-(CH2 )
'

- COOH
y

Palmitoleico Oleico Vacc6rtico (trans)

e,. e,. e,. e,.


Cu

2 (S) 23 (35) 2a3


. COOH

Sldo~quido

Lquido ( + o s) (+ 16) Slido(+ 43) Lquido Lquido Lquido

b) Polllnlllturtzdos no conjugados: - CH 1 -CH=CH-CH 2 -CH=CH-CH1 (dienos) Unoleico c.. (trienos) Unoleico c .. (tetraenos) Araquid6n!co Dieno 1iieno y tetraeno

2 (8,5) O,S (2) 0,3


0,8 in.

e) Pollln14turados conjugados: -CH, -CH=CH-CH=CH-CH, .. . ..COOH

c ..
1 1

1
(1)

Lquido Lquido

(2) (3)

Las proporciones dadas en este cuodro representan las medias obtenidas en Franela (S.Kuutzal-&voie, R . Al(ax). El punto de fusin del trlallc6rido bomog6neo est prximo al del cido paso, en el cuo de Jos cidos fos. Entre par6ntesis, alunas medias (menos sllnillcativas) para la leche humana. (in): (indicios).

Cuadro 8. CaroctersllctU de la materia l{ra!Kl de divei'IIIU leclu!s comparodtU con /u gra101 comunea
Materia srua

Indico de Reiehtrt MoiJiel (R.M.W.)


lS 33 19 -2 S 2S -31 1,4 2 ,7

Rcfroccl6o Indico de Polenske Indico de yodo l odice do saponlflcacl6n


220-232 232-240 23024S 20S-212 250-260 196203 1,469 1,480 1,464

Indico

Oleo
refraetmetro

De las leches de: Vaca . . . . . . . . . Cabra ......... . Oveja . . ........ l..uhc humona . . . .

I,S- 3 S -JO 4,3 6,6 1,7- 2,2


16,8-17,8 8,5-11

322S 30 44-

42 33 JS 47

1,460

- Jo

Grasas vesetalu: Coco Palmiste . . . . . . Palma .........


Aceites:

..

6,S- 8 S - 7 0.3- I,S


o o

8- JO so- s2 85- 90 100-180 40- so


Nmero de do ..

1,4S4

- s4

Comesti bles ..... Secantes . .......

.l
1

187-195

+ 6 (cacah.) + so (Unua)

Grasas animales : {Sebo, manteca cerdo)


Signfcado de los

0 ,3- 1,5
Proporcin

190-200
Volumen molecular medio de los 4cldos crasos

u (sebo)

lndices . . .......

Proporcin

do 'cldos vol4tlles solublos


{1)

de 4cldo volitiles insolubles

bies enlaces
(cidos insatu-

rados)

{2) {3)

Las proporciones dadas en esto cu.dro representan las mediaa obtenidas en Francia (S. Kuzdzai-Savolo, R. Alifax). El punto de fusin del triUC'!rido homoc6neo esU prximo al delicido graso, en ol caso de los 4cidos fijos. Entre par6ntesis, aJcunas mediu (monos si&nificativss) para la leche humana. (in): {indicios).

Llpidos. Materia grasa-Nata

59

difcil de romper que los enlaoes en 1 y 1' (o a, a'). No se han aislado glicridos pticamente activos de las sustancias graaas naturales, aunque hay tericamente 9 enantiomorfos entre los 13 ismeros de posiciones posibles en los mono-, los di y los trlgli cridos. La existencia de una asimetra de sustitucin sobre el carbo no 2 explica esta iBomeria. Por convenio se ha fijado una numeracin estereoespecfica del "sn11licerol": la funcin -oH o -oa mediana est orientada a la izquierda cuando la frmula se escribe como en la pgina 56; el carbono 1 sera el de arriba y el 3 el de abajo, no siendo equivalentes estos dos carbones. La glicerina no existe en estado libre en la leche; por el contrario, se encuentra un ligero exceso de cido grasos (0,6% en cido oleico); por este hecho, la grua presenta siempre una ligera acidez, an antes de iniciarse la hidrlisis. El tratamiento trmico aumenta la proporcin de cidos grasos, por ejemplo la esterilizacin al autoclave a 120 e durante 20 minutos.
NotiJ.- La lecho de vaca contiene en muy toe- proporcin (O,Ol%delool pldoo totolea) 'kru del lloorol (por lo menoo lleva un tomo de oxeno en el e,W,. entro una llmo16n alcohol del licero! y una funcl6n alcohol indulda en una cadena laqa). Una parte de HIU ouotanclu coneaponde al rupo de loa "plumalbenoo". La leche humana contiene unu 10 vecu ms 'toreo del licero! que la lecho de vooa.

Las tres posiciones no son Idnticas en la molcula del glicerol, de aqu la posibilidad de iBomeria y hay dos posiciones primarias -eH, OH y la posicin secundaria -eHOH-. La rotura del enlace ster por las lipasas no se produce a la miama velocidad en las diferentes posiciones, el enlace sobre el carbonp 2 o /l (secundario) es ms

111 PROPORCION DE ACIDOS GRASOS METODOS ANALITICOS


El cuadro 7 presenta los principales cidos grasos de la leche de vaca clasificados segn su estructura qumica, diferencindose principalmente los cidos saturados de los no saturados. Lo mismo que ocurre en numerosaa grasas alimenticias naturales, existe un notable predo minio de un cido en cada uno de los dos tipos, el palmtico saturado en C 16 y el oleico insaturado en C,., cada uno en un porcentaje prximo al 26%. Se trata de un valor relativamente bajo, en otros muchos cuerpos grasos, se observe un predominio ms sealado de uno o de dos cidos grasos (por ejemplo, en el aceite de oliva, los dos cidos piecedentes forman alrededor del 90% del conjunto y una menor variedad de los otros cidos). Los 18 cidoa grasos individualizados en el cuadro 7 son todos de cadena lineal y de un nmero pat de tomos de carbono (a excepcin
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Llpldos. Matarla grasa-Nata

de uno aoJo). Se han identificado I!I de cien pero no te encuentran m que en eeatl8 o muy escasa proporcin. La determinacin metdica de los cldotllliiOI por medioe qumiCOI ea difcil. Lo1 viejos ndice. ma illllificativo te indiam en el cuadro 8. Muy empleldoa anteriormente para la lnvwtipcin de fraudet, !al pruebu qumica~ aon cada vez menoe utlll""'" en favor de loa mtodos talcoa, mucho ma een.iblea. Loa mtodoa modernos de anlilia han permitido snndet progre801 en el eatudlo de loa cidoa graaos, que han llevado al descubrmiento de componentes de la grua de la leche que solamente exllten como lndlcioa y que no 81 poalble Identificar por loa mtodoa qumicos ni por la tcnica de la deetllacin frecclonada. Eatoa mtodos anaJtlcoa falcoa no aon antagnicos, lino ma bien ae complementan. Por ello, ae pueden delimitar las poalb!Udadea de loa principales de entre ellos: l . La e1f1ectrofotometrJ u/trrwloleto permite doaltlcar loa pollenoa huta 6 dobles enlaces, conjugados o no (ver aubttulo V); pero no da Informaciones preciau sobre la longitud de !al cadenu de loa cidoa raaoa, nl aobre el lugar de loa doblea enlacet. 2. LG crotn4tOINJ(I en (a gtUeoltJ pe mita determinar el nmero de carbon.o por el tiempo de retencin. Para una miama longitud de la cadena, loa cidoa 11f8101 insatundoa aalen tma el cido aaturado, pero no ae pueden dlatinguir las varlaclonea de eatructura de loa pollenoa. Ea un mtodo muy utilludo y al alcance de laboratorloa de tipo medio; pero debe practlcarse con prudencia para tener buenaa aeparaclonea y evitar una sobrevaloracin de ciertoa cldoa raaoa; probablemente ea aqu donde reside la explicacin de loa reaultadoa diacordantea; aobre todo en la zona de los C-18. 8. LG pectro(otometra infrarrojos es til sobre todo para Investigar los Ismeros GIS y TRANS de loa cldoa lnl8turados, tras su abaorcln en la zona de 2 a 15 micraa. 4 . Para el eatudlo comploto de la eatructura ea lndlapeneable la espectrofotometro de maao, pero preciea de 111'8Jldea medios. El cuadro 9 preeenta loe reaultadoe de un eatudlo oomparativo de la leche de clnoo eapeci&~ dlatintea, aplicando el mi1mo mtodo: la cromatografa en faae gaseosa. Para erectuar 8lte an.lisla 18 18para la materia graaa y 18 forman los sterea metD!eot de loe cidos grasoa (por accin de metano! y potasa caatica); la mezcla de steres se fracciona en la columna de cromatografa a 200C; un diapoa!tlvo de detecci6n con resiJtra<ior proporciona grficu, como !al que 18 mu&~ tran en la figura 8, que permiten calcular !al proporcioD81 relatiVB&. Ea de notar que Cite mtodo da valorea muy be,joe para el cido butrico. Loa picos numerados de 1 a 8 corresponden a loa cido saturados de 4, 6 , 8, 10, 12, 16 y 18 tomos de carbono, el pico nm. 9 corresponde al cido oleico.

y h !d 'Tlatenal

Llpldos. Materia grasa-Nata

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Cuadro 9. Proporcin de cidoegrruoe de 14 trtJ84 de leche de varl4e et peciea. (Cromatografa en faae gaseosa; %de steres metlicos totales)

tAche
Vaca Oveja Cabra Mujer Cerda

Grupo

c.

Grupb

e,

Grupo
Ca

Grupo

c,o

Grupo

e"
4,0 5,5 4,7 7,2 0,8

1,4 1,1 0,7 0,1 0,2 Grupo

2,2 2,7 2 ,4 0,2 0,2 Grupo

1,8 3,3 3,2 0,3 0,2

3,6 7 ,6 8,7 2,1 0,6

e,.

e,.

e,.
13,7 11,8 13,0 7,3 4,6

c .. :1
27,1 22,7 25,2 35,4 44,9

e,.:
3,0 3,1 2,9 6,7 9,7

Vaca
Oveja Cabra Mujer Cerda

13,0 14,1 10,7 10,9 4,1

30,2 28,1 28,5 29,6 35 1

Seln S. Kuzdui.S.YOie (1963)


De lot cuales el 94% en

e,. : 1

Dicho cuadro 9 indica tambin que ae encuentran loa miamos tipoa de cidos gr11801 en laa diferentes leches e:r.aminadu, pero con una distribucin caracterJtica para cada eapecie. La materia grasa de la leche de loa monoatricos es mucho ms rica en cidos mono y poli lnJaturadoa y ms pobre en cidos voltiles (de C4 a C, 0 } que la de loa rumiantes. Reaalta el elevado contenido en cido cprico de laa leches de oveja y cabra, de cido !urico en la leche de mujer y de cido palmltolelco (C 16 : 1 ) en la leche de cerda. Aparte los cldoa graaoa mencionados, en la materia grasa de la leche de vaca ae encuentran pequeas proporciones de cidoa con nmero impar de tomoa de carbono (por ejemplo el cido margrico, de e17 ), cidoa ramificadoa (cidoa "!so... "), cidos saturados, de alto peso molecular (C22 y ma: cldoa bebnico, linocrico, etc.) e ismeros de posicin de loa cidos insaturadoa ma conocidos. Estudios muy profundos de la composicin en elementos menores de los lpidos de diferentes leches deberan permitir el aporte de Informaciones preciosaa, desde el punto de vlata de la tecnologa y la nutricin. En relacin con estos componentes menpres pueden darse fenmenos de difcil explicacin. En este orden de ideas veremos que
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7
11

Om

5
9

10

15

20m

10
11 12

Om

10

15

20

25m

Figura 8. Anlisis. mediante cromatografla en rase gaseosa. de steres metilicos de


cidos grasos. (Segun S. Kuzdzai-Savoie. 1963). A) Leche de vaca (Columna de 305 x 0,63 cm, 220') B) Leche humana

CopynghtC'd rnatenal

Llpldos. Materia grasa-Nata

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alunu alteraciones de loe lpdo1 no alcanz.an m que a una proporcin nfima de la materia graaa, como en el cuo de la oxidacin.

IV ESTRUCTURA DE LOS TRIGLICERIDOS. REPARTICION DE LOS ACIDOS GRASOS


A) El anlW. directo de los trigliorido por cromatografa en fase paeosa ea hoy da po.ible de forma cuantitativa, uijll111ndo un soporte, un u de arrutre, un agente de imprenacin y un prosrama de temperatura que e.tn bien adaptadoa. Los llcrido1 18 18peran en plcoa diltintoa, en funcin del nmero total de carbonee. Cada pico puede representar varios trillcridoa del milmo peso molecular, pero de diferente composicin en cidoa1Jl'8101. Por otra parte e~tOI triglicrido .e pueden fraccionar por cromatografa en cape fine (el de slice e.pecal, indicador fluorescente, dilolvente cido). Este anJW. permite establecer lu relacione. entre la oranlzacin nativa y lu propedades fsico.qumlcu de laa er-. Hoy en da este debe completar obliptoriamente la determinacin de loa cidos graaoa. AJcunoa autores piensan que laa variaciones eataclonales que afectan a loa lipldoe de la lecl!e de vaca 18 deben a diferenclu debidas ms a laa proporciones de triglicridoa definido que a la naturaleza misma de e.toa trillorid01. La distribucin de loa triglioridoa, een el nmero de carbon01, perece eer un carcter especfico; existen sin embaro similitudes en el grupo de lo rumiantes. Loa triglloridos de la leche de vaca se reparten segn un esquema bimodal. Una primera onda va de 34 a 40 carbono, con un mximo en 38; una 18gunda va de 42 a 54 carbonee, con un mbimo en 50-52. Esta diferenciacin en dos grupos tiene sin duda au origen en laa modalidades de ant.esil de loa trilioridoa en la mama, a pertr de loa cido raaoa de la aangre o sintetizados "in situ" (Kuzdz.al-8avoie, 1979). Debe deatacarae el comportamiento muy diferente que presenta la grue de la leche bu mana. La reperticln de loa trigUoridoa ea unlmodal , de 84 a 66 carbon01, con un mximo en 50-62. S) La diltribucin de loa cidos gruoa aobre laa S policionea del sn-Jicerol puede deterrnnane en la actualidad con butante precisin. La propiedad de la lipasa pancretica de liberar lo cidos graeoa ligado en po.lcin 1 y 3, permite calcular laa proporciones por el anlilil de loa monoliordos. De esta forma se dl1pone de un mtodo de anlWs estereospecfico para "sondear" laa 8 posiciones. En la leche de vaca, los cidos grasos cortos estn ligados principalmete a la posicin S (el cido butrico lo est casi totalmente). Con el alargamiento de la cadena de los saturados se observa una porcin

e, pyr

rtro ~"'

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Llpldot. Materia grasa-Nata

creciente en posicin 2. El cido palmtloo tambin est ~partido entre 1 y 2 y el cido ollco entre 1 y 3. El cido esteico est sobre t.odo en po~icin l. A caua de la especificidad de la lipeaa panc:mltlca, que no loca la ~cin 2, y por una Mnilacin fcil del mono2-clicmdo, existe otro intera en oonooer la distribucin de loa ddoa llfUOI. En la leche de mll)er, el cido pelmtico est prererentemente lipdo a la posicin 2; lo nutricionistas consideran que es un (actor favorable para la ulmllacln de este cido por el nlfto. La diversidad de los cidos grasos podra hacer pensar en un nmero muy elevado de especies moleculares de trlallcridos. Sin embargo p~ce que ol nmero est limitado por lo oxlstenclo de posiciones preCerentee de esterificacin; a peaar de todo habra varios centenares.
V AClDOS GRASOS SATURADOS

Cui lodos los cidos grasos saturados tienen un nmero par de .tomoa de carbono, y el punto de partida de su sinteslt es el cido actico (C,) huu e,.. Los cidos de nmero lmpw de tomos de carbono tienen probablemente su origen m el cido proplnlco !C.); a caua de su esca11 proporcin influyen pooo en lu propiedades que se citan a continuacin. Eataa propiedades varan progresivamente cuando 111! cluifica a los cidos IP.&n sus pesos molec:ularet crecienl.et (cuadro 7). Los cinco primero trminos son "voltiles", ello slanlCica en realidad que son arrastrado por el vapor de agua cuando se destila la mezcla, tras saponificacin y acidificacin. El quinto, el cido 11\urlco, se encuentra prcticamente repartido entre este grupo y el de loa cidos fijos. Los dos primeros cidos grasos voltiles aon solubles en agua {el cido capr{lic:o muy poco); no representan ms que un 5 t del conjunto, pero sin embargo constituyen la parte m caracterstica de la leche de lot rumianl.et. La acidez voltil 10luble ae expreta en la prc: tlca por el ndice de Reichert.Mesel. El cuadro 8 muestra las diferenc:iu lmportanl.et entre la grasa de la leche de lot rumiantes, la leche humana y lat otras grasas comunet. Eata clrcunat.ancla constituye un medio pwa la investigacin de los fraudet mliztdoa en la grasa de la leche y la mantequilla. Antes ae admita que estos cidos gruos eran producto de la degradacin de cidos superiores. Son ante todo productos metablicos intermedloa que permanecen bajo forma de lterea en el curso de una secrecin rpida. En loa no rumiantes, donde la utillzacl6n del cido actico en la mama ea mucho menos intensa, la proporcin de estos cidos volnUiea ea pequea. La proporcin de cidos voltiles soluble Influye un poco sobre el

Upldos. Maten a grasa-Nata

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punto de fusin de la grua, ya que sus glicrid0110n Jiquld01; cuantitativamente no reprl!lelltan m que una pequea parte del conjunto de 6dd01 aturad01 (men01 de 1/10). El olor de e1t.o1 cld01 voltiles mu.y fuerte y c:aracterlu el enranciamlento. El olor dilminuye rpidamente cuando ee pua a 101 homlog01superiore~ . En 101 cidos aluientea, la hidrofobia de la cad.ena que se alarga lleva rpidamente hacia la bldrotula del COOH, cada ve menos dieo dado. Los cld01 caprlico y cprico, con una parte del cido !urico, co111tltuyen la parte etenclal de la fraccin de 101 cidos frOtO lnaolub~ en agua; ee pueden expresar en %o por el odlce de Polenske. En la leche de vaca ee obtienen valores bej01 en relacin con loe de las leches de cabra y oveja; en e. ect.o, la materia pua de eatu eepeC ciea M dl.atinue por au contenido ma alto en cidoa caprlico y cprlco, propiedad eata que .e utiliu pera el descubrimiento de la mez. cla de leche de vaca con estu otras leches, en que.era, cuyo valor comercial ea m elevado, pero el mtodo carece de .enllibilldad. Un fraude, que afortunadamente es cada vez m raro, conwte en mez. ciar a la mantequilla puaa veget.alea (de coco o copra); el reaultado ae caract.erlza por un contenido en dd01 raaoa voltiles lnlolublea alrededor de 10 veoes mtyor que el de la mantequllla de nca, lo que permlte su deacubrlmlento. Debe tenene en cuenta que la ul;ilizadn de una Importante propordn de tortas de copn no desenra lada del todo en las racionea de las vacas lechera, aumenta el contenido en cld01 volitlea nlolublea, eapecialmente el de cido !urico (que oollltltu.ye alrededor del 50 t de los cid01rU01 de esta grua); aln embarro, pera la mantequilla de tipo lnduatrlal que procede de la mezcla de cantidades de nata de diferentes origenea, esta reeerva tie ne poca Importancia. Los oldos grasos de Cl6 y Coa (palmtiCO y esterico) aon como de coatumbre, loa ms abundantes en las grasas naturales, lo que es difcil de explicar. Su punto de fusin es elevado , por encima de 101 Delde el punto de vl.ata de sus propiedadea qumicas, los cid0111 tundoa son poco reactivos. contrariamente a los dd01 lr~~~tunodoa. Por el contnrlo, numero101 orpnismos vivoa poaew un equipo enrimtlco que permJte IU degradacin en pequeu moWculu. FAti fa. .e de la dlgeatin ea bien conocida en el hombre; la ji-oxidacin que oomlenza por una desbldrogenacin (el cido .e vuelve iOJaturado entre 101 carbonos 2 y 3 ), ae contina por la fijacin de una molcula de agua y la formedn de un jl-hidroxicldo y luego de un 6cldo (l-eet6nloo, R-co-<::H, -cooH. Eate cuerpo es poco estable, sufre el laminado ''tioclstico": M libera una mol,cula de 6cido actico y el icldo reducido ~ 2 carbonos puede sufrir de nuevo eate ciclo. Los mlcroorrantsmos pueden digerir loe cidos rasos de esta C orroa, pero con variantes en el proceso que puede aer detenido en una etapa Intermedia.
IT

so c.

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Llpldos. Materl1 grua-Nata

Se hin eetudlldo d01 modificacione. que se pueden experimentar en loa producto. lc:teo..

1) ~o IIICcin de moh01, oxidacin 10bre el JI'Upo metili! y descarboxi.Jacln con foliiiiCn de a-metU-caton1 (y pn1lda de un carbono):

R-cH 2 -cH,-oClOH-+ R-<:HOH-<:H, -(X)() J i - R-<X>--afs

Eatu 01tonu aon lquidos voltiles muy oloro101 y probablemente M producen en 11 madumcin de loa que.ot "uulee"; por otra p.rte, pueden ser 11 caua de 11 n:~~~cidu "t6nloa delu mantequillu enmohecldu. b) Loa cidos aaturados pueden ser fcilmente dt~aturados o deshidrogenadoa blijo la accin de bacteriu y mohoa, con aparicin de doblee enlaoet. Este fenmeno se produce en w mantequlllu alteradu y, de UDI manera aealada, en cierto tlpoa de qUftOI madurados (captulo XXI) .

VI ACIOOS GRASOS INSATURAOOS


Se encuentran en pan variedad en 11 leche y p~ntln de 1 a 6 doble. eniiOM (de monoeno a hezMDo), pero tan elo uno aparece en proporcin importante: el cido mono-inaaturado de C 11 , o cido olelco, que conatltuye lu 3/4 partes de loa cldoa de e.tl categora (cuadro 7). De hecho se hin encontrado en lllecbe 9 ilmeroe de posicin, de.plaz.ndoee el doble enlice del carbono 7 al 16. Adems, para cada uno de eatos cidos ezJste una ilomera geomtrica: derivado CIS y derivado TRANS. El cido oleico tiene la forma CIS y el doble enlaoe en el carbono 9. La grasa de la leche no contiene cido .nll&tUradO de larga cadena (como el cido erciOO C, ; 1 de la (:Olza, conalderado como txico). La proporcin de cld01 insaturadoe vara mucho con la alimentacin. Son loe lpidoe veetalee 101 que conatltuyen la fuente de los cld01 con C 11 o menos; la grua de 11 hierba ..U formad aproximadamente por el 60 t de cido linoleioo (trieno) qUI, en pan parte, 18 hldroen1 en el rumen en dieno y monoeno, produc:Wndoee principalmente kldo oleloo, pero tambin, en pequea proporcin., otrOI iamer01 entre 101 que se eDcnentra un deriVIIdo ''tranl", el cido vaccnlco, que t.iene propiedades fsicaa muy di!erentea, pues ea Illdo, mlentru que loe derivadoe "cil" 10n todoe lquldoe. El tetraeno, cido .nquldnlco, no ezJste en loe ali!Mntol de la vaca, y procede del cido linolelco por tranafonncin en el orpnlamo animal. El perodo de lactacin y la edad de la vaca tiene UDI intluencia menoe acueada : a medida que uno y otro avanzan, ee eleva 11 inlaturacl6n de la gra~~&. Al parecer existen dlferenclu raclllea en la aptitud para producir una materia grua ms o menos saturada.

Upldoe. Materia grasa-Nata

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cialmente importantec; aoln au doble enlace o en au entorno pueden fljaree dllenntea ele mentol: a) Fijacl6n de hidrpno: ea la reaccin invena de la qua hemoe citado en al apartado anterior. La reduccin de un cido etllico conduce a un cido menoe inlaturado o a un aaturado del mlamo nmero de tomos de carbono. Puede llevarse a efecto por v(a enzimtica, pueda, tambin, realizane en el laboratorio y en la indUlltria por medio de la hld~nacin CGtaltlca. Es una operacin Importante en la induatria alimentaria pva obtener buea p-uu 16Udu, especialmente en Ju fbrica~ de lll&lllarina. No 18 produce 1in conaecuencias eobre Ju propiedades nutrit!YU, a cauaa de la reduccin del contenido en cldoe 11JU08 eeenclal81, de la fonnacin de ilmer01 cuya utilizacin metablica plantea problemu y por el descenso del valor vitam nlco. b) Fijacin de oxgeno, seguida de ruptura de la molkula y formacin da derivadoa oxldadoe con olor y aabor deaagradable (ver ma adelante). e) Fijacin de baltenoe, intereaantec aobre todo pva los ans.listas; la fijacin de yodo constituye el principio del m6todo wual pva expre-.r el ndo de insaturacin; el ndice de yodo vara ~ellliblemente en relacin con la proporcin de cidoe inaaturadoe (cuadro 8). Lo1 cidoa insaturad01 que po-n doe dobles enlace. en posicin conjupda, eatructura eritrnica: -cH=CH-CR CH- , aon ma raroa y tienen propiedades especiales. Presentan una ablorci6n caracterstica en el ultravioleta (280 nm), lo que hace se puedan valorar por espectrototometra. Loa cidos pollill88turados no conjugados tienen bandu de abiOrcin dbilea a longitudes de onda m altu, pero se laomeri.zan en medio alcallno, adquiriendo de esta manera la propiedad anterior,lo que permite au determinacin. Lo1 dicridos inaaturadoa de forma "cil", que constituyen los 4/5 del total lnaaturado, tienen un bajo punto da fuafn; cuanto ms abundantes, tanto ms blanda es la grMa, lo cual es muy importante con fllpecto a las prop'"*' no/661u de la tn411tequU/a. El rgimen all"*>t!cio tiene notable influencia aobre la textura de la mantequilla, a cauaa del contenido en cidos inaaturadoe que la determinan. La alimentacin con hierba, fresca o ensilada, contribUYe a la produccin de mantequilla m blanda. Por el contrario, lu dietas ricu en celul01a y otroa l!lcid01 (alimentoe ordinarl01, cuell01, etc.) contribuyen a la produccl6n de mantequilla ma duza, por aumentar la produccin de cido actico y la sntesis de cid01 aaturad01 alldOI. El ndice de yodo de la rasa de la leche del pnado que vive en el

Lol enlace. etilniCIC confieren una gran reactlvlded a Ju molcu181 da ddoe era- inaturedoe. Lu propiedades aditivu eon espe-

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Upldoa. Materia grua-Nata

peat.o vvfa poco en el cuno del ano; otella entre 38 y 43. BD el c:uo de animal que viven atabulado. durante ellnvlemo ea baJo {- 30), pero en la 6poca de alida 11 PMto eleva lmllcomente hllte 40, manten16ndoee con un valor 11to hllte el retomo a la eatabulacin. En el primer cuo la mantequilla tendr una conliltencla plUca butan te recular en todu 1aa eateclonea {cuo de la mantequilla normanda), en el aecundo cuo, eeri aenenlmente dura en Invierno y blanda en verano.

VIl EL ACIDO LINOLEICO. MODIFICAC ION DE LA COMPOSICION EN ACIDOS GRASOS

sra-

La materia craaa de la leche t11 m pobre en cidoa lfiiOIInaatumdoa que 1aa materlaa sr- vepteltll {llrededor de un 36 t de loa cidos totalea en la leche de vaca contra un 60 t o m en loa aceites veptalea). Tru el poroen~e de coleaterol, eate dato ha aervido de bel8 para nuevoa atequea contn la mantequilla acuuda de favo.r ecer la arter!Oicleroal., aobre cuyo tema .. hablar en al capt'tulo Como coDM<:Uencia ha pen.ado en la forma de poder aumentar la proporcin de cldoa 11'1101 inlaturadoe en la lec:be de vaca. En realidad, lo que ee pretende aumentar el contenido en ido linolelco por nuevu ruonea. El tkldo liw~loo tiene reconocido un carcter como aencial, aobre todo para loe nioe; eate C&!ter debe 11 hecho de que no puede formane en el orpniamo bu!Dino por d-turacln del enlace w 67 en el cido oleico y que el precunor da 1aa proat~&landinas {flura 9), suatenclaa que tienen propiedadea blolllcu variables, comparablee a 1aa de 1aa hormonaa. El contenido en cido llnolico de la teche de vaca vara poco a lo laro del ao, de 1,2 a 2% de loe cidos IIJ'UOa totalea. Ea un vllor b~o en relacin con el que .. encuentra en la leche humana {89 %) y ea aobre eate hecho aobre el que recaen 1aa crtlcu de toe nutricioniltaa contra la materia rua. De aqu 1aa invelt!pclonea rea!iq daw loa ltlmoa aoa para aumenter el porcen~e de eate ido llUO en la leche de vaca, lin incorporacin de ~ extranu, con el fin de reapetar la lecialacin. Se ben enaayado doaaoluclonea : zootbica y tecnolllca. El medio m eflcu ea el auminiJtro alaa vacu lacberu de loe llimentoe Uamadoa "protetidoe", compueatoa de un aceite rico en cido Unotelco (aceite de crtamo en Auatralia, de aoja en Dinamarca, de inaol en Francia); el aceite ae Incluye en una mua proteica como la caaena o el extracto aeco deaenraaado de la leche, que aufre una eapecie de curtido mediante el tratamiento con un lldebdo, enerllmente el formol (IIJ'U&I encaptUladaa). De eate manera ae forma en la auperficie una pelcula protectora; toa cidos polnaatu-

xxm.

Llplcloa. Materia grasa-Nata

69

rtdot 100 protecidot contra la hldrocmaci6n en el rumeo . Con este m'todo puede obtenene "a YOluotad" una materia pua c:oo un c:oo tenido dado de cido liooleico. LOI nYeftipdotet a1.11trallaoot bao Uepdo huta el 30% de loe 6cld01 raaot rotal; lita valor excelivo en ruo de loe feomenot de olrldacio que aparecen. Slalo ae con aldera la allmentacln de lot lactantea, ea IUnclente un valor lmite del6 %. La aoludn tec:nolcic:a no est an puesta a punto . Se puede traedonar la materia grua lctea mediante c::riatallzacin, pero el tratamiento ln adltivoa lleva a una fraccin lquida en la que la propor cln de cido lio. leico no rebua el 4 %de loa cido raaot totalea,lo o que ea lniU.fidente. Adem, eata aolucin tiene el riet~o de no eer lnte~te deade el punto de vWt& comercial.

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..Cit ,l.w t ( A t i ..Cit< U ( A I,U) Zw -C zt:4wl,l1U I (A U . 11,U)
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a~,.a.z Cllz ~ ~ Obl'C*z4tz ClloCIH:IIz-Qiz-CIIrQiz~z-atrCDCIII

ACIDO OLEICO ,...-- ACIDO LINOLEICO J-- ACIDOARAQUIDONICO

CMJ
..,'DH PROITAOLANDINA (E2 1

VIII FOSFOLIPIDOS V ACIDOS GRASOS POLARES A. Fotfollpldol


La leche contiene en pequea cantidad puaa foaforadu y aminadu. FAtal c:uerpoa pertenecen a un rupo importante de la qunic:a bio lclc:a y ae encuentran en todu lal ~lulaa vivientes, eapec:lalmente en 1a1 c61ulal nerrioeu. Juean un importante pepe! en la conatitucin

70

Llpldos. Materia gresa-Nata

de la membrana, formando la lmina Upoprotelcu. En la leche ee encuentran de doa fol'lllll8:


a) Lo1 g/lcero(oa(tidol

Su estructura 1e aproxima a la de la materia rae propiamente dicha, pero una de la funciones del glicerol est elterificada con el cido foatrlco, el cual a su vez, eat ligado a una bale ornica nitrogenada. La ~cltlno contiene colinD: la cefolinD contiene ettiiiOIIlmiM.

Hz- Q-CQ-R1 H-0-Co-R, Hz- o-P- o-cH,-CH,-N (CH,l:, O

Hr- o-Co-R, H-o-co-R2 Hz-o-P-OCH,-CH,-NH, O

OH

OH

OH

(Lecitlna)

(C.fallna)

b) lAa eflfi#Jm~liMI

El glicerol eat reemplazado por un dWcohol aminado !Juaturado: la esfingosina. Una sola molcula de cido grua (R, ) est ligada por un enlace amida, ms reslltente a los agentes hldrolticoa que el enlace ster de loa glicridos. La parte foaforada (R2 ) ea la misma que en la lec! tina y ocupa una posicin anloga:
Cl-11 - (CH1) 12 - CH CH- CH- OH CH-NH-R 1 CH. -0-R,

Eat.ol dos tipos de sustancias presentan grandea analoga qumicas


y ffsico.qumlcu; generalmente en la materia viva ee encuentran asociada. En la prctica, cuando no 1e ba profundizado en la qumica de eataa &UJtanclaa 1e laa puede agrupe bajo la dealgnacin de "lecitinaa". En la leche 1e encuentran trea suatanciu de eate tipo, con la siguiente proporcin media: - lecitina (fosfatidilcolina) ...................... 30

- cetallna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 - esfingomielina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
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Llpldos. Materia grasa-Nata

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Anotemos que los cidos grasos de estos lpidos son siempre de cadena larga (16 carbonos y ma); pueden ser saturados o insaturadoe. Laa lecitinas son sustancias fuertemente polares a causa de la presencia en la misma molcula de un grupo cido fosfrico y de un grupo bsico (amlna o amonio cuaternario). En el aspecto falco, estos cuerpos tienen una propiedad exoepcio nal: aunque de naturaleza grasa, son intensamente hldr6filor (fuerte capacidad de absorcin de agua, con la cual se hinchan). Forman un puente entre las fases grasa y acuosa y se encuentran en la leche des natada y en el mero de mantequilla, as como tambin en la nata y en la mantequilla (cuadro 10).

Cuadro 10. Contenido en lecitina


Producto Leche entera (Yllca) ......... . .. . . Leche descremada . . . . . . . . . . . . . . Nata (40% de M.G.) . . . .. . . .. ...... Mantequilla ... ....... . ........ Suero de mantequilla (0,7% de M.G.) . . . Leche en polro completa . . . . % del producto 0,03 0,04 0,015 -0,018 0,15 0 ,25 0,12 0,18 0,11 0,18 0,24 %de la materia arasa 0,65 1,05 0,3 0,5 0,2 20

.. ... ..

La lecitinas son excelentes agentes emul$ionantea (tienen aplica clones industriales); en la leche contribuyen a hacer estable la suspen-

sin de la materia grasa; constituyen uno de los componentes de la pe lcula adsorbida en la ruperflcie de loa glbulos grasos. Al destruirse una parte de esos glbulos en el curso de la formacin de la mantequi Ua, la proporcin de Jecltlna en la materia graaa de la mantequilla ea menor que en la nota. Las lecitinas que pasan alruero de mantequilla le comunican un sabor caracterstico. Debe sealarse que el aceite de mantequilla (parte lquida separada por centrifugacin de la mante quilla fundida) no contiene fsforo. La lecitina por sus grupos cido y bsico, se puede combinar con sustancias diversas. En la leche, la lecitina se une a las protenas y al colesterol. B. Acidos grasos polLa grasa de la leche contiene muy dbil proporcin (0.5%del total de loa cidos grasos) de cidos cetnicos e hldroxicidos, en su mayor
Copynghted r- atonal

Llpldoa. Materia grasa-Nata parte derivados del cido esterico y llevan una funcin cetona (-co-) o una funcin alcohol (-cooH-),Io ma frecuente en P<lti cin 3 5. Se les conaidera como teat01 metablic01, ya que representan etapu intermediasen la bioentesia de loe kidoa gruoe norma les o en au digestin; muy pocos de ellos eoo inaaturados. Las loclontu derivan de hidroxi-cidoe por eaterificacin interna:
- CH1 -CH-CH, - CH,-CH1 -C O (delta lactona)

'--- o----"1
Estas auatanclaa solamente existen como indicios en la graaa natu ral, el calentamiento aumenta su concentracin. Algunas de estas SUS tancias tienen un sabor muy fuerte. Una pequeila cantidad de lactona coo(iere a los productos lcteos un aroma agradable, pero por encima de un lmite ea po.r el contrario desagradable. Loa 8\lltos defectuosos a nuez de ooco o de apio, por ejemplo, e.tn Updoa a la presencia de lactonas. Una de laa causas del defecto del sabor azucarado de la m& teria graaa de la leche de Jos animales que reciben raciones de avena molida y de alfalfa verde, est collJtituida por una lactona illlaturada procedente del cido olico. Los cido grasos hidroxilados y oetnicos ocupan la posiciqn a en loa triglicrdos.

IX PROPIEDADES FISICAS DE LA MATERIA GRASA. LA CR ISTALIZACION


La variabilidad de laa principales propiedades Caicas de la materia graaa de.mueatra perfectamente que se trata de una mezcla de varios cuerpos, los trigUcridos: Densidad (15) .................... . 0,936 a 0,950 29 a 34 Punto de fusin ...... .. ......... . .. 24 a 19 Punto de aolidifi.cacin .. . ........... lndioe de refraccin................. . 1,463 a 1 ,462 No hay un punto de fusin ni de .olid(iC4cln bien determinados. El cambio de estado se produce con un margen de temperatura de unos 6"C. Adema, las temperatu.ru de fusin y de solidificacin no coinciden (las materias grasas puras se comportan de diferente ma nera).
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Upldos. Materia grasa-Nata

73

La fusin y la congelacin no son los nicos fenmenos que se observan. Enlagrasadela leche hay glicridos en estado lquido a oc y otros que no funden ms que por encima de 60 C. El conjunto es una disolucin de grasas de alto punto de fusin en las grasas lquidas. La temperatura en que la licuacin es total no puede considerarse como punto de fusin, ya que el punto en que las grasas menos solubles se disolvern en el lquido formado, tiene una temperatura ms baja. Sucede lo mlamo con la cristalizacin en el curso de la refrigeracin. Hemos visto que el punto de fusin depende de la naturaleza de los cidos grasos. Es una cuestin muy importante en el caso de la mantequilla; pero hay motivo para oonsiderarla a nivel de las propiedades reolgicas propiamente dichas, que se estudiarn en el captulo

XX.
La cristalizacin de la materia grasa se refiere a las mezclas ''isomorfas". A causa del fenmeno de la intersolubilidad se forman cristales mixtos que contienen no slo uno, sino varios glicridos que presentan una cierta similitud qumica: nmero de ca,rbonos no muy diferente (diferencia mxima de 4 a 5), tipo saturado o insaturado, etc. La cristalizacin fraccionada permite separar diferentes tipos de glicridos. La cristalizacin es un fenmeno de dos fases : la nucleacin y el crecimiento del cristal. La presencia del ncleo inicia la cristalizacin; en la materia grasa lctea, se trata de una nucleacin heterognea, en la superficie de impurezas catalticas; no es necesario realizar una refrigeracin importante para poner en marcha la cristalizacin; en los glbulos grasos no ocurre lo mismo, ya que en este caso se exige una "sobre-refrigeracin". Ello significa que en los triglicridos separados la cristalizacin ser espontnea entre los 20. e y 30. e, mientras que en los glbulos grasos en suspensin, ser necesario llegar a temperaturas inferiores entre 10 e y 20 c. En la grasa natural el crecimiento de los cristales es lento, mucho ms que en los triglicridos puros. El polimo!Smo cristalino existe en la materia grasa lctea oomo en muchas otras sustancias. Las diferentes formas se caracteriUUI por sus redes particulares y por us diferentes puntos de fusin . La forma con ms alto punto de fusin es la ms estable; las otras formas son metaestables, aunque pueden transformarse irreversiblemente en forma estable tras una fusin local intermediaria. En la materia grasa de la leche se observan por lo menos 3 formas: a, (3 y (3 '. Los cristales a son los menos estables y los (3 los ms estables. En Jo que se refiere a los triglicridos aislados, no se observan siempre las 3 formas. La forma amorfa 1 de hecho se deriva de la forma a y se produce en el curso de la refrigeracin rpida de esta ltima, de una manera reversible. La refrigeracin rpida favorece la cristalizacin en forma a, que es la ms simple estructura cristalina. Las otras aparecen ms tardamente, o en el curso de una refrigeracin lenta.

Copy nghtC'd m aten al

Lfpldos. Materia grasa-Nata En la materia grasa lctea, el punto de fualn Inicial ae encuentra hacia loa22 e para a, 30 e para ll' y 36 e para , He.y que aenalar el hecho de que la velocidad de refrigeracin y la temperatura alcanzada tienen una clara influencia sobre el punto de fuain y de solidificacin de la materia grua, y que te puede producir una evolucin en el tran.cuno del tiempo, vari<M daa despus de un tratamiento trmico dado. Ea de intenls conocer la relacin slido/lquido; de hecho ea un indtoe de conaiatencla, para un cuerpo graso dado que ae encuentra en eate.do de equilibrio. Se le puede determinar por mtodos fsicos: dUatmetro (el volumen especfico aumenta tras la fusin), termotll'llfa diferencial (comparacin de los calentamientos y enfriamientos entre el cuerpo graso y un lquido de referencia), resonancia m~~gD tica nuclear (loa protones de loa gllcridos lquidos dan una seal ms lntenaa). Las doa primeraa medidaa aon baatante aencillaa de realizar; la ltima exige un utillaje importante. El ndice de refraccin es un valor intereaante a peaar de aua variacionea, ya que el reato de las graau comunes tienen, en au mayor parte, ndices muy diferentes de loa de la mantequilla (cuadro 8). La re{ractometro se e.mplea para investgar las falalflcacionea. En la prctica se mide la refraccin relativa mediante el o.leorre.f ractmetro por comparacin con un aceite tipo (aceite de pata de cordero). La materia grasa pura ea blanca; el color amarillo de la grasa de la leche se debe a los carotenos. Como todu laa graau ordinarias, la de la leche ea inaoluble en agua, poco soluble en alcohol y muy soluble en loa diaolventea o:gniC<A: ter ordinario, ter de petrleo, benceno, acetona, etc. Pero estos diaolventes no alcanzan a la grasa en au estado globular nativo, que estudiaremos ms adelante.

X LAS REACCIONES DEL EN LACE ESTER


El enlace ater, entre un cido graao y una funcin alcohol del glicerol, puede ter roto de varias formaa, que ae esquematizan en la figura 10. Las reaccionea entre un glicrido, por un lado y el agua, un alcohol o un ate.r de otro, son lentas e incompletas.; aon aceleradas por catalizado- qumicos o bioqumicos (enximaa). Las doa primeru reacciones, alcoboliaia e bidrolilil, rompen el enlace ster y regeneran el glicerol. En el caso de la bidrllail, te libera el cido gruo, en el caso de la alcoholiaia loa -iduos acil y alkil se combinan para dar un nuevo ster. La bidrliala enzimtica o llpolisis, presenta un gran inters para los productoa lcteos. La alcoholiais por el contrario ea desde nuestro punto de viata poco importante, el desplazamiento del residuo acil R,-co se acelera por el empleo de un alcoholato alcalino.

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Llpldos. Materia grasa-Nate

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La tercera reaccin de tron.estl!rificacln (o intereaterificacin) ea en suma UD reenlace de los reaiduos alldlos R" y G (gliceril) y de reai-

duos cidos R 1

y R2 Existen diferentes

medios para desplazar el

GOH- - H - -, OR' - - - R.-CO-OR' Alcoholisis (ster)

..

(Glicerol)

G-OH-

R- C"- oG~n~~.~ ?Jo.r'~.'~!)

"/~\'\ , \
.

T.

'

OH 1

R1 CO-OH

Hidrolisls (cido graso)

o\/ , o
.1
' \\ ..
OR

R2COOG- R2 C Glicrido (nuevo) Residuos: G


~

Transe$teriticacin

- --R,.CO-OR"
(ster) R'R" = alkll

gllceril

R1 A, ~ acll

Agura 10. Reacciones del enlace ster.

equilibrio: adicin de un catalizador, como el metilato de sodio, trabajo presin y de 110 a 150 C, etc. Se forma UD nuevo glicrido. Ea un medio para introducir un cido graao elegido en una graaa, con el f'm de modificar sua propiedades fsicas y sua caractersticas analticas. De esta forma es posible fabricar grasas especiales, que imitan a otras grasas de mayor valor. Un mtodo moderno de falsificacin de mantequilla se basa en el empleo de grasas transesterifi cadas. Es ms provechoso, en este caso, aportar el cido graso a incorporarla en forma de glicridos. El producto de partida puede ser el sebo; por tratamiento con la tributirina y lo mismo con la tticarpina, adquiere un porcentaje de cidos grasos voltiles semejante al de la mantequilla y los ndices se vuelven muy prximos. El fraude puede ser difcil de poner de manifiesto. Frecuentemente la proporcin de monoglicridos es muy elevada, ms del 1% (normalmente es tan solo de 0,1-0,3% Si para la ). transeaterificacin se ba utilizado un cuerpo graso vegetal se puede utilizar para su descubrimiento la identificacin de eateroles aplicanCopy nght::'d m aten al

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Lfpldos. Materia grasa-Nata

do la cromatopafa en fue pseou efectivamente,laa raau vegetales contienen eateroles (estigm&sterol, atoeterol, campettrol, etc.) derentet de los que ae encuentran en laa ruu animales.

XI LIPOLISIS Y ENRANCIAMIENTO A) El fenmeno La hidrliais de los triglicridos, con liberacin de cidos gruos, es el resultado de una accin enzimtica QUe puede aparecer en todos los productos lcteos y es la causa de uno de los doa randes defectos que puede presentar la mantequilla: el enranciamiento o rancidez hidroHtica. En laa condiciones habituales, la liplisla es muy parcial, ya que la acumulacin de cidos solubles inhi.be la accin endmtlca; no obstante, son suficientes cantidades pequeaa de cido butrico para que el olor a rancio ae acuae. El mecaniamo del fenmeno es an duda menos simple que una hidrliaa; el glicerol y los cidos librea deben experimentar con aeguridad cambios ulteriores. Normalmente entran en juego dos de Upaaas; laa que existen de forma natuzal en la leche y las producidaa por detenninadcx mipasas microbiana croozp.nismos. Es dificil derenciar au accin; laa U son probablemente ms activas en los productos con alto contenido de bacterias. Las vacaa con sua alteracionea ovrlcaa producen leche que contiene una llpaaa anormal. (Cap. Vlll.)

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B) La ectividad llpaica y 1111 coni8CIIanciaa La actividad de la lipasa normal de la leche es an notable a la temperatura de oe; por el contrario, esta enzima se destruye en el curso de la paaterlzacin. Algunas Upasas microbiana& son ms tennorresistentes. Las mantequillas de natas paaterizadas, conservada& en friorfico, dcllmente ae enrancian. Este defecto ae produce sobre todo en las mantequilla de raija fabricada con natu an puterizar. La actividad lipaca se mide habitualmente mediante valoracin a.cicll.JMtrica; el fndice de IJCidz representa el nmero de millitroa de lcall nomal utilizados para neutralizar 100 1 de rasa. El valor normal ea de O,! en la leche; cuando ae eleva por encima de l,! el aabor a rancio se hace perceptible. La determinacin apuentemente es ample teniendo infiuencla sobre los reaultadoela forma de extraccin de la rasa. Ea necesario indicar el mtodo utilizado. En la leche, la accin de las lipuu se halla limitada por la proteccin que ofrece la membrana globular. Loa tratamientos que la alteran favorecen el enranclamiento: homoeneizacln, altaci6n, cambios bi'UICOI y repetidos de temperatura. La dispenln de materia rasa en la leches desnatadas para "reconstituir" leche, prodUce slbulos de

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Upldos. Materia grasa-Nata

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perficie ms permeable, de modo que estas leches experimentan fcil mente una liplisia. Resaltemos el hecho de que una simple agitacin favorece la lip lisis y esta provoca una activacin de la lipasa de la leche (cap. Vill) que desarrolla la lip6118s lnducl. Todos los medios tomados para reducir la turbulencia de la leche tibia, en especial traa el ordeo, tie nen por consecuencia un retardo e incluso llegan a impedir la liplisia. Ea de gran importancia suminiattar a las industrias lcteas, sobre todo a las fbricas de mantequilla, leches y natas con eacaso ndice de acidez grasa. ayudndose para ello de mtodos adecuados de recogida, conservacin y transporte. Existe un antagonismo entre el defecto enzimtico de la rancidez y el defecto qumico de la oxidacin. Por ello, la acidez, el oxgeno diauelto, los metales Cu, Fe, etc., tienen una accin retardadora sobre la lipliaia, pero favorecen la oxidacin. La liberacin de los cidos grasos provoca una reduccin de la ten sin superficial (el grado de hidrlisis se determina por esta medida); por lo tanto, la aptitud para la produccin de espuma aumenta. En las natas es cause de que se presenten dificultades para el batido. En los quew madurados la Uplisia es un proceso normal a cause de las Upasaa microbianas y fngicas, que influyen en el aroma. La proporcin de cidos grasos libres, que normalmente es de 0,5% en la grasa de la leche, puede elevarse hasta el 6% en los quesos madurados con mohos superficiales (tipo Camembert); por el contrario, aumenta poco en los quesos no enmohecidos (Saint Paulin, Gruyere, etc.). La hidrlisis libera preferentemente cidos insaturados. (Cap. XXI.) C) Aspectos zootcnicos En el desarrollo de la rancidez se comprueban grandes variaciones segn el origen de la leche. Las leches de las diferentes vacas no tienen la misma aptitud para el enranclamiento en las mismas condicio nes. Se trata de un carcter hereditario; por otra parte se observa una correlacin entre una produccin baja y el desarrollo de la Upliais. Se puede aconsejar el control de esta prediaposicin mediante la medida de los cidos librea; lo que permite descubrir las vacas dudosas y no utilizarlas como reproductoras. En ltimo extremo y si el problema de la lipliais es grave se las puede eliminar del establo. La proporcin de vacas que dan una leche con liplisis espontnea es bastante elevado; se las encuentra en todas las grandes explotado nes. En general, el problema se plantea cuando ms del 25% de la le che producida procede de estas vacas. No se han observado diferenclas significativas entre las diferentes razas bovlnas,en cuanto a la tendencia de la leche a la liplisis. Las leches del final de lactacin ("leches viejas") son las ms sensi bies a la accin de las lipasas. El sistema de partos agrupados favore
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Upidos. Materia grasa-Nata

cen la produccin de leches que presentan el defecto de enranciamiento cuando la mayora de las vacas se encuentran en igual momento de final de lactacin, con una baja produccin individual. Por lo tanto, debera evitarse esta prctica y acelerar el secado cuando las vacas dan 2 litros diarios. Aun se discuten las relaciones entre la aptitud pare la pliata y el regimen alimentario. Una alimentacin de buena calidad y de un nivel energtico conveniente reduce los peligros de la iiplisia. El efecto estacional sugerido por algunos autores desaparece cuando en invierno se reduce la racin de heno o de e~e defectuoso y se sustituye por forrlije de buena calidad y se aade concentrado. Influye tambin la composicin de la racin de Ipldos, el elevado contenido en cidos grasos no saturados de loa lpidos de los vegetales verdea, reduce la lipliais durante la poca del pasto. La alimentacin de invierno aporta ms cidos grasos saturados y se aumenta la Iiplisia.

XII OXlDACION DE LA MATERIA GRASA Y FENOMENOS AFINES


Este fenmeno ha sido ampliamente estudiado, ya que tiene como consecuencia la aparicin de trascendentes anomalas en la leche y productos lcteos y especialmente en la mantequilla conservada en frigorfico. Se trata principalmente de un proceso de orden qumico ; sill embargo, pueden intervenir algunas enzimas microbianas, como las lipooxidasas. Existen, por una parte, reacciones qumicas complejas de conocimiento reciente y por otra, la apreciacin subjetiva de la anomala. Ambos factores son difciles de relacionar; para el segundo no existe un aabor a oxidado bien definido, y pare designarlo se han utilizado numerosos trminos en general imprecisos, como: sabor aoeitoao, a cartn, metlico, seboso, etc., que corresponden, aproximadamente, a grados crecientes en la intensidad del defecto de la oxidacin. El sabor a peacado podra corresponder a un fenmeno especial. Se emplea tambin, aunque de forma impropia, el trmino: mncidez por oxidacin. Estas anomalas no se deben a una simple modificacin de la grasa; est demostrado que intervienen asimismo los componentes no gra. sos.

Al Oxidacin de los cidos grasos insaturlldos


Es la reaccin principal. Anteriormente se la describa de una forma dudosa: formacin de un perxido (1) -por fijacin de dos tomos
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Upldot. Materia grasa-Nata

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de oxgeno sobre el doble enlace- que .e deteompondrfa en epxido (2):

con liberacin de oxgeno y, en una 8e11Jnda fue, .e eacindiran en molculu m pequeilu: aldehdos y cetonu:
- Aldehdo ma16nico CHO - Cll, - CRO
-eplhldrina CH., CHO

r"'-o

No se ha demostrado la presencia de estas sustancias en la materia IJrU8 oxidada a temperaturaa bajas y medias ee las supone por analoga de reaccin coloreada y por el hecho de habene encontrado pequeilaa cantidades de compuestos epoxi tras calentamiento del cido olelco a altas temperaturaa. La reaccin m importante ea la formacin de llidroperxlda~~, fuera del doble enlace. Se han aislado e identitcado cuerpos de la forma:

-r -CR G1.1i0 - 011

Se trata de un mecaniamo de autooxidacln en el que la primera etapa es la formacin de un radical libre, por IM!paracin de un tomo de hidrgeno en el grupo rnetileno adyacente al doble enlace: -CH-CH~CH-, este radical, estabilizado por reaonancla, tija dos tomos de oxgeno, luego reacciona con otra molcula de cido inaaturado para producir hidroperxido y un nuevo radical libre capaz de continuar la reaccin en cadena. Se ha demostrado tambin que posteriormente se forman com puestos con el radical carbonlo en posicin a o ll en relacin con el doble enlace: -cH= CH-co-, y que estos cuerpos, aldehidos o cetonu, son los principales responsables del sabor "aceitoso", (la acrolena ea el m simple de los cuerpos de la aerie CH1 = CH-cHO). La conservacin del doble enlace parece sorprendente sin embargo, ha sido perfectamente demostrada. La velocidad de la oxidacin crece con el nilrnero de dobles enlaces; aproximadamente se duplica por cada doble enlace supletorio. Existe una relacin positiva entre la aptitud para la oxidacin y el contenido en cidos fuertemente insaturados en C 11 , sobre todo aquellos con dobles enlaces conjugados -cH= CH-cH= CH- . En la leche, los cidos grasos inaaturados de las lecitinas ee oxidan en primer lugar y m rpidamente que los triglicridos. Ea probable que la oxidacin comience en la capa de contacto entre la materia grasa y el agua.
pyr htf r ater a

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Llpidos. Materia grasa-Nata

La oxidacin se produce en dos fases: 1. Perodo de induccin. La absorcin de oxgeno es lenta y limitada, no hay aparicin del defecto oganolptico y su duracin es variable, segn la composicin en cidos grasos poliinsaturados y segn diversos factores que veremos ms adelante. 2. Perodo de oxidacin activa, cuando el potencial redox alcanza un nivel suficientemente elevado.
B) Sabor a paseado

La aparicin del 8tlbor o pescado se ha atribuido a la oxidacin de la colina contenida en la lecitina, cuerpo que se descompone fcilmente en glicol y trimetilamina, N(CH3 ), , sustancia que se encuentra en las salazones de pescado. Esta suposicin ha sido discutida, pues los cuerpos causantes del sabor a pescado son los derivados de la oxidacin de los cidos insaturados de la lecitina y de la grasa propiamente dicha. Este defecto se encuentra sobre todo en la mantequilla y en las leches en polvo. La aparicin del sabor a pescado puede producirse como consecuencia de la alimentacin con abundancia de productos que contienen beta(na (remolacha y pulpa). La betana, COOH-CH,-N(CH 3 ),0H, se comporta como la colina y se difunde en la leche. Consecuencia prctica: el suministro de estos alimentos no debe hacerse antes del ordeo, sino duramente 'el mismo o inmediatamente despus.

C) Reacciones de oxidacin afines Las reacciones de oxidacin estudiadas anteriormente no son probablemente las mismas en todos los casos. La leche totalmente desnata do bajo la accin de la luz, puede adquirir el sabor oxidado que algunos denominan "sabor a cartn". Se sabe que la leche descremada contiene fosfolpidos que se pueden oxidar, pero es probable que tambin sea atacada una parte de las sustancias nitrogenadas (captulo VI). Reconstituyendo la leche completa por emulsin de la grasa, oxidada separadamente, en la leche desnatada, se obtiene el sabor oxidado tpico de las leches. Corrientemente existen por lo menos dos componentes que intervienen en el defecto de oxidacin. O) Fluctuacin de la aptitud para la oxidacin Este es un hecho de importancia prctica reconocida. En idnticas condiciones, las grasas de diversas leches no se oxidan a la misma velocidad; estas variaciones Individuales son a veces difciles de explicar. Aparte de los factores que veremos ms adelante, se reconocen tres influencias: a) El ciclo de lactacin. Al principio, la aensibilidad a la oxidacin

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Upidos. Materia grasa-Nata

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es, en general, ms grande -aunque el contenido en grasa sea ms blijo- que 111 final del ciclo. b) Laa Influencias estacionales son consecuencia de la influencia de la temperatura y, sobre todo, de la alimentacin.
e) La Influencia de la alimentacin es la ms acusada y compleja,

ya que puede manifestarse de dos maneras con efectos opuestos: l. Influencia sobre la proporcin de cidos grasos insaturados susceptibles de oxdarse; algunos alimentos, tales como la soja, el lino e igualmente los alimentos verdes, provocan un aumento del contenido en cidos polinicos; 2. Influencia sobre el contenido de cuerpos reductores que retardan la oxidacin. Laa leches de invierno son, en general,las ms susceptibles a la oxidacin, ahora bien, el porcentaje de los cidos grasos insaturados es relativamente bl\ib en esa estacin, y probablemente el segundo factor de los citados es el que tiene ms importancia. Por el contrario, en lo que se refiere a la mantequilla, y en algunos pases, se comprueba que la oxidacin se produce ms fcilmente en verano; es por lo tanto el primer factor, el que predomina. Ms adelante veremos que el cobre es, en la prctica, el principal factor de oxidacin. El estudio de la aptitud para la oxidacin de las leches individuales demuestra que algunas se oxidan fcilmente an en presencia de pequesimas cantidades de cobre. La eliminacin de estas leches permite evitar el defecto, aunque su deteccin es difcil. E) Deternoinaci6n del grado de oxidacin Existen numerosas reacciones que permiten determinar los dos tipos de sustancias responsables. a) Los perxidos: - liberacin del yodo del yoduro potsico; el yodo es fcil de va !orar, y se obtiene as el ndice de perxido expresado en mili equivalentes de oxgeno absorbido por 1.000 g de grasa. Por encima de 0,3 es perceptible el sabor oxidado - conversin de una sal ferrosa en sal frrica, que se determina por el sulfocianuro amnico; mtodo muy sensible para seguir el proceso de oxidacin. b) Los grupos aldehdicos y cetnicos: - reaccin del cido tiobarbitrico (T.B.A. test); -reaccin con la 2-4-dlfenilhldracina (D.P.N.H.). Estos diversos mtodos no tienen una sensibilidad suficiente como para poder detectar el defecto de sabor antes de que sea perceptible por los sentidos.
Copynqhted malenal

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U pidas. Materia grasa-Nata

XIII FACTORES QUE ESTIMULAN LA OXIDACION

1. El efecto de la luz solar es bien conocido a cauaa de la actividad fotoqumica y debe tenene muy en cuenta en el envuado y conservacin de la leche y productos lcteos; el envase opaco es el ms racional. 2. Los metales pesados, sobre todo el cobre, tienen una accin cataltica. El hierro es menos activo que el cobre; el estao y el aluminio son prcticamente inactivos. El material de chapa o de cobre es taado se encuentra en vas de deaaparicin, ya que la proteccin de la capa de estao es efmera, porque el metal se di&uelve rpidamente en la leche cuando se forma un par elctrico entre los dos metales en las zonas de desgaste. Las protenas y laslecitinas se combinan con el metal, favoreciendo su solubillzacin y poniendo en contacto directo el cobre con loa glbulos grasos. El acero inoxidable o las aleaciones especiales de aluminio son los materiales ptimos para la construc cin de cualquier aparato u objeto cuyas superficies deban estar en contacto con la leche y la nata. Normalmente, la leche no contiene ms que escaaos indicios de CO bre: 0,12 p.p.m. Cuando esta cantidad se eleva a 1,5 p.p.m. existe peligro de oxidacin rpida. Las mantequillas con ms de 0,2 p.p.m. de hierro o 0,07 de cobre, son propensas al defecto de oxidacin (p.p.m. = partes por milln o miligramos por kilogramo). 3. El pH es un factor importante en el caao de la nata y de la man tequilla. La acidez favorece la oxidacin, acidez procedente de un principio de liplisis o de la fermentacin lctica. Las mantequillas de natas cidas (mantequilla de granja, mantequillas con mucho aroma) tienen, en general, un pH inferior a 5 y son ms sensibles a la oxida cin que las de nata neutra o neutralizada. Las primeras no pueden almacenarse durante mucho tiempo. La influencia de la acidez sobre la oxidacin puede que sea solamente indirecta, en relacin con el desarrollo microbiano (que es ms intenso en medio neutro) y el potencial redox, pero no se puede descartar una influencia directa sobre la velocidad de las reacciones de oxidacin. 4. El oxgeno del aire disuelto interviene en las reacciones. En efecto, las condiciones que favorecen la conservacin del oxgeno disuelto acusan los defectos de oxidacin. El fro acta de la misma manera. Se sabe que en el caso de la leche estos defectos son ms fre. cuentes en invierno que en verano; pero se superponen otras causas, como por ejemplo la alimentacin. 5. La sal (NaCI) tiene una accin oxidante, sobre todo en las man tequillas saladas de natas cidas. Esta accin ea propia de los halogenuros. Los sulfatos y fosfatos son inactivos. 6. Por su estado de di&persin, el a,gua influye sobre la velocidad de

Copynqhted malenal

Llpldoe. Materia grua-Nata

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oxidacin. t. mantequilla 1e oxida ma fcilmente que la grua deahi dratada.


lo - orillo, a craaoforma ., un clerindo oxidado IDcoloro. blaDquea.

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XIV CONDICIONES ANTAGONICAS DE LOS FENOMENOS DE OXIDACION


A) Rlductoret y entioxidantes Los cuerpo~ ma een.aibles a la oxidacin que la grua ae oxidan en primer luar y la protegen de dicho fenmeno, al menoe puajeremente. La leche contiene factorea zeductorea que ae oxidan a un potencial redo..c (Eh) ma blljo que aquel por el cual ae produce la fijacin del o:dceno activado sobre los cldoe no aturados. Eatoa cuetpO&actan como antioxidantes, pero no rematen a Ju reecciones; no eon cataJ!zadora neptlvos. Son rapo11111bles del per(odo <U Induccin. En el capitulo vm veremos que la leche contiene un alatema reductor enzimtlco (zeducta de Sclwdi.Der), adems de otra& llllltanciu reductora: cido ucrbico, tlavinu, tocoferoles; estu motn ciu IOn vitaminas. t. existencia de nivele crtico de potencial redo..: se pone en evidencia por el estudio de la oxidacin del cido ucrbico en la leche. Cuando ae ha oxidado el 40% de la can~idad de esta auatancla preeen te originariamente en la leche, aparece el mal aabor debido a la oxidacin de Ju cruu; pero al se oxida bruacamente ma all del 70% {por ejemplo, aadiendo un oxidante como el agua oxigenada), el sabor a oxidado no aparece. Por lo tanto, para impedir la aparicin del defecto puede utilizarse, tanto un acente oxidante como uno reductor; cuando el potencial redox alcanza bruacamente un nvel elevado, probablemente ae forma un cuerpo muy oxidado inspido. Ea de notar que en proporcin elevada, el cido ucrbico, que es un reductor, protege a las gruu de la ollidacin. En Amrica, el producto de anteala ~e utiliza para este fin. Se ha intentado mejorar la conaervacin de la mantequilla y de otra& cruu allment!ciu median te la edicin de antioxidntet; para ello ae han enaayado numerosu auatanciu reductoras, aobre todo compuestoa fenlicoe con un grupo hidroxllo en poeicin orto. En Francia eatn autorizados cuatro antloxidantet: loa calatoa de propilo, octilo y dodecilo y el BHT (dibutilterciario-paracreaol); pueden aadirse a la mantequilla (en loa paquetea auperlorea a 1 kg) deatinada a las lnduatrial alimentarias. La leche en polvo completa es tambin aenalble a los defectos de oxidacin. Se han realizado muchos eatudlo para locrar estabilizar
pyr ttE'd fl'atcr di

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Upldoa. Matarla grasa-Nata

su aroma y guito naturales. El envuado en atmetera de gas inerte ea eficaz, pero costoso. Se han ensayado diver- antioxidante. y ae ha obtervado una relacin entre el coeficiente de reparto y la eficacia. La leche ea un producto complejo "mulillue" y el antioxidante no pasa de forma completa a la fase pasa. El hldroxianiaol butilado (BHA) tiene un coeficiente de reparto elevado y una gran eficacia. En loa galatos el coeficiente de reparto depende de la longitud de la cadena alltU, cuanto ma larga ea, mayor ea aqu61. En una leche entera concentrada al 50% de extracto seco, caal todo el BHA se encuentra en la fue grasa, ain embaqo, solamente puede encontrarse el 90% del galato de hexllo y solamente el 20% de galato de pro pilo.
Nota.- Loa ren6menoa de xido reduc:c:i6n,. ..tudlarn en el captulo IX.

Bl Condiciones reduc:toras
Los efectos protectores contra la oxidacin se deben a la aparicin de sustancias reductoras que aparecen en el calentamiento , en la prolife. racin microbiana y cuando ae produce una proteollala limitada. a) El calenl4m~nto de la leche por encima de los 80 e la vuelve prcticamente lnaens!ble a la oxidacin. Un slatema redox nuevo ae forma bl\io la accin del calor, por degradacin de una fraccin proteica, principalmente la fllactoglobulina. Aparecen sustancias del tipo glutatln que poseen el grupo tiol, muy lbil, que actan como anti oxidantes o que regeneran a loa antioxidantes destruidos.
R-S 2R-SH+O,.o

+ H,O

R -
Estas mismas sustancias son, en parte, responsables del 81lbor a co cido; existe por Jo tanto un determinado antagonismo ent.re ambos defectos. b) La contami11Llci6n bacteriana frena loa procesos de oxidacin, por una parte, absorbiendo oxgeno (fenmeno de respiracin que rebaja el potencial redox), por otra, produciendo siab!maa reductores propios de las bacb!rias. Algunas de st.aa, presentes sin exoepcin en las leches obb!nldaa sin loa debidos cuidados, tales como las bacterias coliformes, son eficaces desde el punto de vista de au actividad reductora. Evidentemente, stA! no es un remedio para loe defectos de oxi dacl6n. Duranb! el perodo de vida activa de loa fermentoe lcticoa, pre sentea en la nata y la mantequilla, el potencial redox ae mantiene dentro de unos valorea negativos que ae oponen a la oxidacin de la grasa. Ea preciso evitar una acidificacin muy rpida y acentuada de la nata, ya que ea perjudicial para las bacterias.
pyr ttE'd fl'atcr di

Llpidos. Materia grasa-Nata

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e) Ciertos productos de las reaccione protiUJltlctu llmltadas en la leche Impiden o retardan la oxidacin, ya que se forma un tipo de compuesto antioxidante nuevo. Se han propuesto enzimas pancre ticu para pro~er a los productos lieteos, a escala industrial; esta sera una soluclon econmica. La enzima se aade a la leche precisa mente antes de la pasterizacin baja o a l 6 2 horas antes de la pasterizacin alta. Al fmal de la pasterizacin la enzima se destruye y las protenas no han sufrido ninguna modificacin. Este prooedimiento se ha ensayado en los U .S.A. Es posible que la causa de este defecto antioxidante se deba al aumento de los grupos reactivos libres (NH 1 , COOH y SH) capaces de formar complejos con el cobre.
C) lnestabilidld de los perxidos Loa perxidos no son sustancias estables. En determinadas condicio nes se descomponen rpidamente tras su formacin. Es lo que ocurre especialmente en loa productos rancios que contienen cidos grasos libres; se sabe que existe un antagonismo entre las dos anomalas.

XV GLOBULOSGRASOS
En los prrafos anteriores los datos anotados se basaban en la qufmi ca de los cuerpos grasos. En la leche la fase lipdica es discontinua, el estudio fsico-qumico de este estado disperso tiene, por lo menos, la misma Importancia que el estudio qumico de sus componentes. Varios procesos industriales muy importantes tienen que ver con este estudio, especialmente la fabricacin de mantequilla.

Al Dimensin
La materia grasa se encuentra dispersa en la leche bajo forma de glbulos esfricos, visibles al microscopio ptico. Tienen tendencia a reunirse en racimos. Su dimetro vara con las especies; por ejemplo, los glbulos grasos de la leche de cabra son ms pequeos que los de la leche de vaca. En general, las razas bovinas que producen una leche rica en grasa, dan una elevada proporcin de glbulos grasos grandes; y a la inversa. El dimetro medio de loa glbulos tiende a disminuir a medida que avanza el ciclo de lactacin. En el curso de un ordeo, las primeras porciones contienen glbulos ms pequeos que en las ltimas. Las dimensiones extremas que han sido observadas van de 0,1 a 20 micras. De hecho, el dimetro de los glbulos grasos raramente es in ferior a 2 micras, ni superior a 12. En la leche de vaca el dimetro medio se sita entre 3 y 5 micras (dimetro de una pequeila clula de levadura). Numerosos estudios se han realizado sobre la distribucin Copy nghtC'd m aten al

.. . ...

86

Llpldoa. Materia grasa-Nata


IU dimetro

de 101 albulOI ~~ segn pruentan un inter capital.

o segn su volumen, que no

La dispersin de la materia

tante el preaentula con una IUperficie muy conalderable; loa glbulos IIJ'UO de un Utro de leche conttituyen una poblacin de 1,5 a 3 billonet de unidades que repreaentan una superficie de unoa 80 m' .

crasa tiene como conaecuencia impor-

8 ) Estructura

Los 81bul01 8fUOI IOn heterogneos, estn OOnJtlluJdOI etencialmante por una micro.gota de uilicridoa, parcialmente cristaUzadoa a la temperatura ambiente, recubierlOI de una envoltura compleja, membrana o pelcula de adaorcin. Parece que loa glbuloa no se encuentran en forma tfalcamente bomornea en la parte Updlca. El enmen a la luz polarl~:&da pone de manlfieato la presencia de cristales.dlridoa tanenclalmente hacia la superficie globular. Loe trab.joa reciente. de Earnann (1969) con la moderna tcnica del crkxUC4Podo (examen mlc:roecplco eledrnlco de un corte de objeto congelado y lueo Uofillzado) han revelado una ealructura en lminu concntricas. No nlat.e en el glbulo IIJ'UO de la leche ninguna inclusin, ninguna orpnll:8dn 1 por consiguiente, no ae le puede comparar a una clula. Lo1 81bulos graiOI de la Jecbe perecen gol:&l de una cierta independencia. Loa diaolventea de las graau puettol en contacto con la leche no extraen tenaiblemente la materia grua y no modifican los glbulos. Anteriormente 1e admita que estaban envuelto en una verdadera membrana original . Ms tarde 1e ha adoptado el concepto de una pellcula protectora muy fina, formada por el ftnmeno de od'!'rcl6n. que impide la reu~Jin de loa glbulos llfiiiOS en una f~ continua. Este fenomeno est mi.IY generalll:8do en tod01 loa 111temas conatituidoa por pequeu pvtculal de materia en contacto con lquidos o a condicin de que IU dimetro - l o suficientemente pequeo para que la IUperficie exterior alcance un determinado valor por unidad de peso. Se crean as considerables fuenu de auperficie que aon las reaponaablea de la adaorcl6n de alunu mo~ (un glbulo raso ea giganteaco comparado con una mol6cula). Las modificaclones de la composicin de la pelcula en funcin de lea condiciones exteriores, estn a favor de esta concepcin. Sin embuo,loa modernos estudios aobre la compotlcin de la parte externa y obre- la aecred6n de la lecbe en la mua tienden a admitir una eslructura mixta. .Esta pvte est formada por una membrana derivada de la membrana externa de las clulu de aclnia y auatanclu adsorbldu prooedentes del pluma.

e-

Lfpldos. Materia grasa-Nata


XVI LA MEMBRANA DE LOS GLOBULOS GRASOS

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El estudio de esta "membrana" es muy difcil, ya que es frgil en al guna de aua partes y numero8011 autores han debido analizar produe tos modificados en el curso del tratamiento de extraccin. Por esta causa no se han podido dejar del todo las hiptesis referentes a su es

tructura.
Habitualmente, la membrana se extrae de la nata lavada con el fin de eliminar la mayor cantidad posible de plasma (leche desnatada), pero al mismo tiempo se elimina tambin, en el agua, la solucin sali na de lavado o la solucin de sacarosa tamponada a pH 7, suatancias hidrosolublesque se sabe son componentes normales de la membrana nativa. Para separar la membrana de la fase lipdica el procedimiento ms corriente es la asitacin (batido h se puede tambin utilizar un reactivo qumico no custico, como el desoxlcolato de sodio. Por otra parte, el anlisis del babeurre o ma:r.ada (suero de la mantequilla separada de la nata no lavada), por comparacin con la leche desna tada, puede suministrar datos sobre la composicin de la membrana. La membrana puede separarse tambin directamente de la nata por ultracentri!ugacin a 25 e y a 200.000Xg; las sustancias que la constituyen forman una capa-tapn bajo la capa aceitosa y sobre la fase lquida, quedando las protenas en el sedimento.

Al

Composicin

El estudio analtico revela la presencia de varios tipos de sustancias: o) fosfolpidos y colesterol; b) protenas y especialmente una glicoprotena, semejante al componente III de las proteosas-peptonas de suero (captulo VI); e) enzimas: parece que el glbulo graso de la leche tras el ordeo, es portador de numerosas actividades enzimticas y que estas se redu cen en el curso de los tratamientos. Las dos principales enzimas de las membranas son la fosfatasa alcalina y la xantina oxidasa (o reduc tasa aldehdica), pero se manifiestan tambin actividades catalsicas, aldolaicas, etc.; d) sustancias divenaa: riboflavina (vitamina B1 ), cido ribonuclei co. Cuando se realiza un fraccionamiento tras la solubilizacin en las soluciones salinas, los fosfolpidos se encuentran en la parte insolu ble, con la xantina oxldasa. Por el contrario, la fosfatasa alcalina se encuentra en la fraccin soluble. Algunos autores incluyen, en la membrana, a los triglicridos de alto punto de fusin; esta concepcin es discutible, como veremos ms adelante. Es necesario insistir sobre el hecbo de que la composicin de la
Copynghted r- atonal

88

Llpldotl. Materia grasa-Nata

membrana varia con loa tratamiento que sufre la leche. Probablemente exilte un equlllbrio, para determinado componentes, entre la membrana y el pluma. Se puede oontlderv que la pelcula normal ea la que envuelve a los glbuloe IJ'UOI 18ml..lidoe, a temperaturas de tipo medio. Lo1 tratamlentoe ~rml001 y mecnl001 reducen lu cantidades de sllltanclu nltrocenadu y de fOI!olpidoe que 18 encuentran alrededor delalbulo ara-o. CUando ae aun nuevu superficies entre el albulo ruo y el plasma. ae obeerva una acborcln de protenu del mero y de caaena; tambin ba licio obaervada la pnnnda, en la intert.e, de mlc:elaa enteru de cuena. E.te heeho ae produoe cuando ae unulsiona un aceite en leche desnatada, o cuando 18 practica la bomoreneizacin bajo presin.
B)

Estructun

Ha dado lupr a representac:lonet eaquemtlc:u variadu. Mucbas tie-

nen por bue la ..Wctura de las membranal oelulares, especialmente de los eriuoc:itoe; no ae treta m que de una blptesll: presenta una o variu capu protelc:u, oon tUl putAs bldzf'l.lat orientadas hacia el exterior. lueao una capa de roero! pldoe aaoc:iadoe al colesterol y a los carotenos en el interior, teniendo las mol6culas una ordenacin radial. Esta membrana recubrira unitormemente la s otlta Updlca. Enue lot numerosos trabajos con que ae ha desarrollado esta cuestin, deben aeilalarae loe de Oowben, Brunner y Pbllott (1967) que han obtenido, por congelacin y aonlcac:ln, la envoltura del glbulo graao en forma de "sombra", teniendo un espesor de 9 nm, y que han demosuado que la membrana posee reacciones aerolgicaa eapecficaa; en IUI trebeJo concluyen que ae trata de una verdadera membrana biolgica y que la permeabilidad aelectlva a loa Iones no ea un fenmeno de amoala, tino un trantporte activo con intervencin de enzimal. Loa traccionam!entos perticularet han dado resultados difciles de interpretar ; pvtculal OICW'II denom!nadu "mlcroaomu" de unos 10 nm de dimetro han aldo aitladu por ultracentrlfupcin de lamazada; representaran IUbunldadea llpproteicu de la membrana. Teniendo en cuenta la IPWI cantidad de trabajos publicados, antiuos y modemoe (an han aparecido en 1982), ae pueden admitir Jaa oonclllllonet preaentadu por Prent1oa (1969), eecn laa cua1ea la membrana est conltitulda -ncialnwnte por doe partes diferentes: a 1 La capa In torna, que 18 parece a una membra.na celular y que est formada por protanu globularee y foafolpid01. Es butante resistente y su funcin la de lisiar elpbulo puo,tolamente tiene unu pocu activld8des ~tlcu. Esta capa ae encuentre firme. mente unida a la parte utema delllbulo tipdlco, tonnada por una .:apa de tri&llcridoe de alto punto de fu.dn; no est claro que esta

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ltima capa forme pete de la membrana propiamente dicha. No es neceurlo oblervar eni!ICH qumicoa entre laa .u.taociu de la membrana y la p-ua, ya que fueru del tipo van der Waat. aon auficieo te1 para explicu esta estructura. b) Lo capa ex temo donde ae encuentran localizadu laa actividades enzlmticu. Se conoce mal au estructura intima, pero ea probable que loa principales ejea moleculares aean tangencjalea. E1t.e CIPI debe ju11ar un pipel importante en la estabilidad de la emulaln, en part. cular en lo que ae refiere a loa fenmenos de adlorcln y de aglutina.cin.
C) Propiedades diversa La membrana oontiene metales, la presencia de molibdeno elt asociada a la de la untina oxidaaa; por el contrario, el hierro y el oobre diauelto1 en la leche,aon fijadoa fcilmente en la membrana y de esta forma 18 Uevan a la proximidad de los lpidot, a loa que catalizan la

oxidacin. Alrededor de las gotitu lquldu de grua. emulaionadu en la leche deanatada, puede forllUU'Ie una membrana, que en elte caao sera mejor deslllnada oomo "pelcula de adaorcin " . Elto oc:une cuando 18 " reoor11t:Uuye" la leche o la nata mediante una fuerte aitacin de mantequilla fundida, o de otro. cuerpo ~. en una leche obtenida por dilolucin de leche en polvo deanatada en aua. Hay que indicu que no 18 obtiene nunca el estado inicial. Erta pelcula ea men06 reaiatent.e que la membrana original; prticularmente, un tratamiento mediante benceno, puede extraer huta un 80 %de araaa, mientras que en la leche normal este dilolvente no logra ext.rae.r ma que muy poca.
O) Fenmenos de edscwcln en la superficie del glbulo greao La membrana de loa lllbuloa 11f8101 tiene la facultad de adaorber par-

tculu de pequeiiu dimenaionea, a parte loa componentes de plasma. Oetpun de la 18paw:in espontlea de la nata, estaa panculas son arrutradal hacia la superficie y en loe tubol 18 forma un anillo que tiene el oolor de estu pertcnlos, al es que existen. El calentamiento de la leche modifica laa propiedades de la membrana y la adaorcin no tiene lupr. En ocaaionee, loe aglomeradoa de becteriu pueden hacer el papel de prtculu. La pruebe del anillo o ''ring-test ", ea muy utUJU(Ja para la identificacin de la b.ruceloall. Si 18 adiciona a la leche c.ruda de una vaca b.ruceiiica una auapenain de Brucello {por ejemplo, el antaeno de Merieux,que es una IUipeoain de cuerpoa microbiano. mue.rtoa y coloreado& por el trife.n iltetrazolium),la crema forma un anillo coloreado por encima de la leche, que eat blanca. Con la leche de una vaca

90

Lfpldos. t.Aaterta grasa-Nata

sana la nata ea blanca y la leclle coloreada; esta leche no contiene

anticuerpo especficos que provocan la algutincin de tu c4lulu coloreadu (cuyoe agl.omeradoe son arrutradoe por la nata en formacin). La leche de una vaca vacunad puede dar rftU!tadoe pcGtivoa.

XVII FENOMENO DE AGLUTlNACION - DESNATADO A) Sep1recin de la f - globul


Al tener los glbulos grasos una densidad Inferior a la del lquido en el que ae encuentran emulsionados, tienden a elevarse hacia la superficie, donde forman una capa llamada comnmente nata. Se dice, en eete caso, que ae trata de un deiiUitado e6pontneo. La nata ae forma tambin por aplicacin de una fuerza mecnica: la fuerza centrfuga. Se dice entonoee que ae trata de un de1natado centrffugo. La velocidad de eacensin de los glbulos depende de varios factores que ae resumen en la frmula clsica de Stolrea,
2 r' (dm-dt) g

V =
9 n

La velocidad es proporcional a la dimenain de lo Jbulot (r = radio), a la diferencia entre la densidad del medio no ruo (dm) y la de la graas (di) y a la tuerza aplicada (g). Etlnvenamenta proporcional

a la vitcolidad (n) que frena los movimientos de1u partculu. Ahora bien, en la prctica, etta regla no puede comprobarae por exllltir un detacuerdo entre V calculada tomando como base el dimetro medio r de los glbulos y la duracin rell del deanatado. Esta ae puede medir en how, mientru que V corrwponde a das. Por otro lado, el efecto de la temperatura es contrario 1 lu previsiones tericas. En efecto, la vilco1idad disminuye al aumentar la temperatura, mientru que la diferencia dm-<11 aumenta (la densidad de la graas decreoe ma rpidamente que la del meda); e1ta1 dos variaciones deberan tener como coDieCU8Ilcia una aceleracin del dematado e.pontneo por elevacin de la temperatura. Pero, en la prctica, ae comprueba que ste ae favorece con temperatura~ relativamente ~.

5atoc.

B) Aglutlnecln espon1nea La Q1/uttnocl6n eapontnea de los glbuloa rasos en forma de raci-

mo que agrupan numerosos individuos (varios centenares) explica


las anteriores anomalas. Teniendo en cuenta lu dlmenaiones de estas

pyr

rtcd m

ter

Llpldos. Materia grasaNala

91

masas, 88 comprueba bien la regla de Stoltes. La temperatura de 7-8 C es favorable para la aglutinacin, y ea este factor el que domina sobre loe otros cuando 88 coDJidera el efecto dala temperatura sobre el desnatado espontneo. Loa raclmoe son de forma y dimeDJionea inqularea; entn loe gl bulos 88 retiene una cierta cantidad de pluma; a biJa temperatum, loe racimos son voluminosos y f"mnes porque retienen m plasma; la "lnea de nata" obtenida ea gruesa. A mayor temperatura loa racimos son ma pequeos y compactos. La algutinacin desaparece progresivamente cuando 88 calienta la leche por encima de los 60 C. A estas temperaturas, 1u protenas so lublea se modifican; una parte de ellas, probablemente una globulina que forma parte de la pelcula de adsorcin, constituye una verdade ra Q(flutlnln4, que puede desnaturalizarse por el calor. El cuadro 11 muestra la relacin entre la diarninucin de la capacidad de desnatado y la desnat uralizacin de las protenas solubles.

O!adro 11. FormliCin de ID nato a diferentes temperotunu


%de prottlnaa tolublu desnalurtlhodu
Leche crudo . . . .. . .. Leche calentada (JO mln.):
t2,3 mm

o
2,7
7,4 1S ,6
33,4 99,1

:!i :~ g :::::::::: a 65 e .. .. .
a so
a 1o

e .... ... . . .
e . . . ... ... .

14 13,3 S,J

2 2

Ses\ln S. J. Rowlond (1957).

La aglutinina 88 adaorbe en la superficie de loe glbulos grasos en estado 88mlllido, pero no sobre loe que se encuentran en estado lquido. Por tanto, a temperaturas elewdu no se produce la agregacin de Jos glbuloe grasos. En consecuencia, ciertas transformaciones, como la incorporacin de aire en el batido y la fabri.c acin de mantequilla, no pueden llevarse a cabo ms que imperfectamente. El pH de la leche influye sobre la aglutinacin . La acidificacin de la leche acelera la aglutinacin debido a que el descenso del pH lleva conslo una disminucin de las cargas electronegativas de las mem branas; por este hecho se favorece la aglutinacin.

y hted 'lla

al

92

Llpldos. Materia grasa-Nata

C) Efectos de la homogeneizacin sobre la aglutinacin ~La homogeneizacin mecnica de la materia grasa de la leche, dispersa los glbulos grasos en fragmentos muy pequeos que no vuelven a aglutinarse en las condiciones normales. En la lecbe homogeneizada, la nata se forma muy lentamente. Pero si se homogeneiza separada mente la nata o la leche enriquecida en materia grasa (ms del 10 %), se comprueba un aumento de la tendencia a la aglutinacin. Si se diluye esta nata en leche desnatada para obtener el porcentaje medio habitual del 4% de grasa, se comprueba que la capa de nata, que se form rpidamente, es ms gruesa que en las condiciones normales y est constituida por racimos muy lnegulares que retienen mucho plasma. Eate aumento de la tendencia a la aglutinacin no se produce ms que cuando el contenido en materia grasa es bastante elevado, es decir, en condiciones tales que los glbulos fragmentados por homogeneizacin se encuentran muy prximos los unos a loa otros,lo que hace posible que puedan actuar las fuerzas de atraccin antes de que se produzca una adsorcin abundante de molculas diversas en la superficie globular.
0) Desnatado centrfugo

La fuerza de la gravedad se reemplaza por la fuerza centrfuga y se aplica la frmula de Stokes. La separacin de la materia grasa debe

ser rpida y completa, no realizndose la operacin en las condiciones de temperatura que favorezcan la formacin de gruesos racimos de glbulos (7-8 e), ya que stos se rompen con la gran velocidad de giro, provocando una homogeneizacin parcial. Deben buacarse las condiciones que aumentan la velocidad de separacin, segn la frmula indicada. La diferencia de densidad dm - di y la viscosidad del plasma son ms favorables entre 32 y 38 C. Es, pues, entre estas dos temperaturas a las que se calienta la leche antes del desnatado.

XVIII MODIFICACION DEL ESTADO GLOBULAR. INCORPORAClON DE AIRE ELABORACION DE MANTEQUILLA (Mantequil la y margarina)
A) Desestabilizacin La dispersin globular de la materia grasa no es un estado estable,la membrana que envuelve los glbulos es una pelcula frgil. Varios tratamientos mecnicos y trmicos y diversas acciones enzimticas modifican ms o menos gravemente este estado y la acidez favorece en general, la desemulsificacin. En la leche sometida a una prolongada agitacin y a temperatura de tipo medio, se produce una desestabilizacin parcial con libera
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Llpldos. Materia grasa-Nata

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cin de lll'aa&. Por ello, pueden observarse granos de mantequilla en la superficie que ha sufrido un largo transporte en el verano. En loa pases orientales se obtie.n e un determinado tipo de mantequilla agitando leche acidificada (Leben). En la nata freaca recin obtenida, prcticamente no existe 11l'888 libre, tan solo en pequesima cantidad, por el contrario, se puede encontrar en cantidad apreciable en la crema cida del comercio. La cantidad de 1ll'8Be libre se puede apreciar fcilmente, eegn Schultz y colab. (1968) utilizando un colorante liposoluble, el Sudn m, disuelto en ter etlico y centrifugando la nata (o la leche),la lll'& ea libre forma un anillo rojo, ms o menos amplio en el tubo. El estado globular puede ser modificado tambin por la accin de enzimas que actan aobre loa componentes de la membrana. Es el caso, sobre todo, de las lecitlnasaa producidas por microorganismos comunes (Bacillue cereue, mycoidea, etc.), estas enzimas hidrolizan las lecitinas de la membrana y provocan su degradacin; se produce la rotura de la emulsin. Este fenmeno ea el origen del defecto que se designa con el trmino de "nata cortada". B) lncorporaci6n de aire y elllboraci6n de mantequilla En determinadas condiciones de concentracin de materia 11l'888 y tempera~ura, la !~Ptacin viva (batido para obtener la nata montada o para la elaboracion de mantequilla) provoca primero la formacin de UJl& espuma fume, y, si se prosigue esta agitacin, 8e llega a la destruccin de la espuma con separacin de la 1ll'8Be en forma de granos de mantequilla. Se trata de fenmenos fsicos complejos, cuya explicacin ms aceptable ea la siguiente: l. La agitacin provoca la Incorporacin de burbujas de aire; se forma entonces una fase gaseosa discontinua lll'&claa a la adsorcin de sustancias proteicas que forman una fina capa protectora en la interfase aire/lquido, que se vuelve estable cuando las burbujas de aire Incorporadas se subdividen formando pequeos ncleos, alrededor de los cuales se 811l'8i&n loa racimos de glbulos 11l'&BOS. ConsecuenciD: el volumen y la viscosidad aumentan, formndose una espuma slida a temperatura ordinaria si el contenido en materia 11l'&Ba es superior al 30-35 %2. El aumento de las microburbujas de gas Incorporadas bajo la Influencia de la agitacin prolongada, provoca una fuerte compresin de los glbulos lll'8BOS. Una parte de stos se destruye; la pelcula de adsorcin se rompe y las sustancias que la componen se disuelven. La materia 1ll'8Be liberada forma una fase continua, que envuelve a las gotitas acuo888 y a los glbulos lll'BSOB intactos, produciendo el hundimiento de la emulsin gaseosa.
CopynghtC'd rnatenal

94

LipldoS. Materia grasa-Nata

Co11M1cuencia: los granos de mantequilla se separan del plasma que

constituye el suero de manteca. Se produce una inversin parcial; el tipo de emulsin original "grasa en agua" se sustituye por el de "agua en grasa", propio de la mantequilla (figura 11 ). El agua ya no constituye la fase continua; las sustanciaa hidrosolubles, por ejemplo, los colorantes, no se difunden en la masa y la evaporacin del agua slo se produce en la superficie de la mantequilla.

L.che, ,.,.
(emu:IIII\ tipo Qlasl t n o~gu)

MM rooulN (emulsin UI)O gua on gras~~ con ms o tnenos


g lOulos grasos inl.teiOs)

Solucin acuosa

o o o

Gotitas acuosas Fase grasa continua

Glbulos grasos con

pelcula de adsotci6n
F6gura 11. Inversin de fases en la fabricacin de'mantequilla,

La fase grasa continua lleva tambin materia grasa en fase discon-

tinua que ha quedado en forma globular y cuya proporcin vara segn la forma en que se ha tratado la nata (cuadro 12}. Estos glbulos se encuentran ms o menos dafiados y estn acompailados por trozos de membranas. En el procedimiento de batido clsioo, aproximadamente la mitad de la materia grasa permanece en estado globular; la otra mitad forma la fase continua, o "cemento", que englobla loa glbulos intactos y las gotitas de agua, as como un poco de aire. CopynghtC'd rnatenal

llpidos. Materia grasa-Nata

95

Cuadro 12

%de materia ar- que


Procedimientos de mborsdn do mantequilla Oslco (mantequera) Procedimiento continuo (Frltz) Procedimiento de doble desnatado (Alfa) Procedimiento "Golden.flow" (aceite de mantoquilla; Cherry-Burell)
permanece en estado

alobulu

so
30-40 80-90

En los procedimientos ms difundidos de "fabricacin continua" (derivados del sistema Fritz), la elaboracin de la mantequilla se pro duce tambin por agitacin de la nata en presencia de aire; ahora bien, esta agitacin es muy intensa y la transformacin rpida, destruyndose ms de los 2/3 de los glbulos grasos. C) Elaboracin de mantequilla por concentracin En algunos procedimientos poco empleados en Francia, la formacin de la mantequilla se produce sin la incorporacin de aire; los fenmenos fSicos que intervienen en este caso son diferentes. El tratamiento de natas muy concentradas (Alfa, Meleshin) provoca una inversin limitada si la temperatura es lo suficientemente baja para que la mayor parte de los triglicridos cristalicen totalmente. En estas condiciones, y bajo agitacin moderada, se libera una parte de la grasa. Esta parte an fluida permite la aglomeracin de Jos glbulos alterados o no y la formacin de granos de mantequilla. En el procedimiento que parte del aceite de mantequilla ("Golden Flow"), no hay inversin de fases propiamente dicha. La destruccin del estado globular es completa y se separa un aceite exento de lecitino-proteinas que a continuacin se recombina con leche desnatada.
O) Margarin a

En el mtodo clsico para la obtencin de margarina se sigue un proceso anlogo a la elaboracin de !IWltequilla, pero la emulsin grasa es artificial. Se trata de una mezcla de grasas animales o vegetales, elegidas para que den las mismas propiedades fsicas que la materia grasa de la mantequilla, que se emulsionan en leche desnatada y se tratan a continuacin como la nata. Se utilizan tambin aceites normalmente fluidos (de pescado, de colza, de soja) que se hidrogenan por procedimientos de qumica industrial (catlisis mediante metales) lo quemodifica sus propiedades nutritivas (subttulo 6). El producto es un suCopynghtC'd rnatenal

96

Upidos. Materia grasa-Nata

cedneo artfcal de la mantequilla, que de ninguna manera puede considerarse como lcteo, a pesar de los argumentos de su inventor, el francs Mege-Mouries, en 1870. Este crey que haba obtenido una "verdadera mantequilla tomada de su fuente originaria", que en realidad era grasa de buey, si bien es cierto que aada extracto de ma ma a la mezcla! Hoy en da corrientemente las margarinas ae obtienen emulsionando grasas con el 1O% de leche desnatada.
Nota.-

Estoa procedimientos ae dKttlblrin en el capltlllo XX.

X IX SUSTANCIAS ASOCIADAS A LA MATERI A GRASA

Algunas de estas sustancias tienen las propiedades de las vitaminas liposolubles, que ae estudiarn en el captulo VIII.

Al Esteroles
Como en todas las grasas animales, en la graaa de la leche se encuentra el colesterol, acompaado de sustancias muy semejantes, en pequeas proporciones. Los esteroles se caracterizan por un ncleo policclico que lleva una funcin alcohol, la cual se encuentra en otras sustancias importantes de la bioqumica: cidos biliares, hormonas sexuales, etc. Ligeras variaciones en la ordenacin qumica de este ncleo tienen como consecuencia propiedades biolgicas muy diferentes. (Fig. 12.) La grasa de la leche contiene alrededor de un 3% de colesterol, o sea unos 0,1 g por litro de leche; es el componente ms importante de la parte insaponificable; est en parte esterificado por los cidos grasos. La leche de mujer contiene el doble (0,2 gl). Se ha demostrado que la alimentacin desproteini.zada de las vacas lecheras provoca un claro aumento del contenido en colesterol de la leche (de 0,3 a 0,4% de la grasa). Este hecho est a favor de la blosntesis de los lpidos, a partir de los lpidos de la glndula mamaria, por el sistema de tranaesterificacin por los steres del colesterol; la conoentracin en colesterol constituira un ndice de esta actividad (Homer y Virtanen, 1967). Los esteroles de la leche parecen estar estrechamente asociados a la lecitina, regulando su poder hidroflico. Esta asociacin tiene un importante papel en la estabilizacin del estado de emulsin de la materia grasa. El colesterol tiene un efecto inhibidor sobre la accin de las lipasas. Algunos esteroles son precursores de las vitaminas D; la transformacin se efecta por irradiacin (rayos ultravioleta). La leche irra diada adquiere acusadas propiedades antirraquticas. Como sea que el

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Llpldos. Materia grasa-Nata

97

colesterol puro no se transforma en vitamina, es evidente que la leche contiene otros esteroles, probablemente dehdrocolesterol y tal vez ergosterol. La activacin se realiza por apertura del ciclo, entre los carbonos 9 y 10. Tambin se ha encontrado lanosterol.

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10 8

DEHIOOOCOLESTEAOL

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Figura

12. Los esterotes.

B) carotenoides

Son colorantes amarillos o rojos, solubles en las grasas, muy difundidos en el reino animal; su frmula se caracteriza por una cadena que tiene por unidad el isopreno (se le encuentra en numerosas sustancias naturales, desde los terpenos al caucho). Son, por lo tanto, hdrocar: buros que llevan numerosos dobles enlaoes. En la leche se encuentran principalmente los carotenos ismeros a y Jl, la vitamina A que deriva de ellos, y pequeas cantidades de xantofila, escualeno y licopeno. La frmula del caroteno se deriva del licopen<f, el colorante del tomate, por ciclacin de sus dos extremos. (Fig. 13.) Los carotenoides se encuentran probablemente ligados en la leche a una protena, bajo forma de lipoproteiUIS.
CopyrrghtC'd rnaterral

98

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Llpldos. Materia grasa-Nata

99

El caroteno ea el colorante dt llz 8I'DJ dt la tecll.. Por au alto grado de inaturacin es un cuerpo fcilmente oxidable; ya bemoa visto que deaparece al principio del prooeao de oxidacin de la IIRI* El caroteno ea el precur>r de /JJ uitamin4 A, en la cual ae convierte por hidrllaia en el organismo. Debe notarae que el carote no P puede dar tericamente doa molculu de vitamina, en tanto que el Ismero a no da ms que una, a causa de una lige.ra variante en la frmula (potlcln del doble enlaoe ). La leche de cabra no contiene nunca 11-caroteno. En esto ee basa un m. todo de investigacin de la leche de vaca aadida a la de cabra. Por el contrario, el calostro de cabra puede contenerlo. Tampoco contienen tl-caroteno 1aa leches de oveja y bfala. La leche humana contiene cui tanta cantidad como la leche de vaca. La cantidad de caroteno existente en la leche depende estrechamente de la alimentacin, de aqu lae amplias variaciones obaervadas de una estacin a otra en la mayor parte de laa reglonee. En invierno, el nivel de caroteno es mnimo debido a la carencia de alimentos verdet. Puede elevarse con una alimentacin adecuada, por ejemplo con enallado de hierba mezclada o hierba secada artificialmente, y mantenerlo durante todo el ao e.n un porcenlollie suficiente. En ge. eral, el n contenido en caroteno es doa veces ms elevado en verano que en invierno; como ttmino medio de 0,5 mg a 1 mg por 100 g de grasa de la leche. Parece aer que determinadas razas aon m aptaa que otras para dar un nivel de caroteno ms alto, tal es el caso de la rua anglonormanda de Guernesey (0,85 a 1,65 mg). Un carotenoide vegetal es el pigmento de una materia colorante roja que puede aadirse a lu mantequillas de invierno y a loa quesos; ea la bixina de bija (extracto de bija, Bixa ore/lana). El empleo de esta sustancia est autorizado legalmente.
Nota. La 1rua do la teehe dt vaea contiene tamb"n hldrocarburoo oolurados (alceoo) aunque en pequea cantJdad.
C) Tocoferoles

Batos cuerpoc tienen algunu analogaa de estNclura con los carotanos, au parentesco es ms prximo con el fitol, componente de la clorofila, a partir del cual ee ha realizado su sntesis. ~'retentan une funcin fenllca por la que ae forman ateres. El ismero a es la vitamina
E . (Fig. 13.)

liemos visto que los tocoCeroles aon cuerpos antioxidantes. Protegen a !u grasu y tambin a los caroten.oa de la oxidacin huta su propia desaparicin. Son sensibles a la accin destructora de los rayos ultravioleta. En ausencia de oxgeno, resisten bien el calentamiento. Su contenido en la leche parece ser muy variable, de 0,2 a 1,2 mlligramoa por litro. Es interesante obaervar que la leche humana es mucho m rica: 5 a 35 mg/lltro.

100

Llpidos. Materia grasa-Nata

XVI PRINCIPIOS DE LA DETERMINACION DE LA MATERIA GRASA


Al Medida de la cantidad de materia gral8 .aparada Para poder separar la materia grua de la leche es necesario destruir el estado globular o extraer aqulla por medio de un disolvente. Loa cidos concentrados y calientes son loa ms empleados, lo mismo para la leche que para aua productos derivados. De esta manera ae logra, adems de la destruccin de la "membrana" globular,la disolucin total de la casena y una buena separacin de las dos fases. Este tratamiento enrgico puede provocar una degradacin parcial de loa glcidos presentes, con formacin de auatancies solubles en las graaaa y en sus disolventes, como se ha visto en el captulo anterior. Los mtodos que utilizan cidos concentrados y calientes dan, en general, resultados ma elevados que los otros, sobre todo en los productos que contienen azcar (nata helada, leche condensada con azcar), ya que en las mismas condiciones, este azcar se degrada ms intenaamente que la lactosa. Los Ipidos de la leche son tal como se ha sealado, complejos y la materia grua separada no contiene las mismas proporciones de tz1llcridos, lpidos polares, colesterol y steres de cidos grasos, segn el tratamiento sufrido por la sustancia analizada. El problema de cual es la materia grua que se determina no ha sido an resuelto, sin embargo los estudios cromatogrficos realizados han dado ya datos tUea (Grupo de trabajo del C.N .E.R.N .A. 1972). Para la determinacin de la materia grua Ubre, se utilizan actualmente dos tipos de mtodos:
l. Mtodos uolumtricos Se mide simplemente el volumen de la fase grua, separada de la fase

acuosa por centrifugacin, en aparatos graduados especialmente lla mados "butirmetros". Son mtodos de rutina, de ejecucin rpida y lo suficientemente precisos en la prctica. El mtodo cido-butiromtrico, de Gerber en Europa y Babcok en Amrica, siguen siendo los ma utilizados para el anlisis de la leche, a pesar del empleo de un reactivo peligroso, el cido sulfrico, al que se aade alcohol ammco para ayudar a la separacin de las dos fases. El sistema est respaldado por una experiencia muy larga y numerosas mejoras para su estandarizacin. Ha hecho posible grandes progresos, tanto en la explotacin del ganado vacuno , gracias al control lechero, como en la industria lctea. Su aplicacin se ha extendido a la nata (mtodo de Van Gulick); para este ltimo producto se emplea tambin el cido clo.r hdrico con cloruro de estao (mtodo de Roeder). La materia grasa "Gerber" se caracteriza por la presencia de steres tsoam licos y una proporcin elevada de cidos grasos libres y de gli

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Llpldos. Matarla grasa-Nata

101

cridos, como conaecuencia de una fuerte hidrollala de la materia graaa; por el contrario contiene pocos lpidos polares. Se ban propuesto tambin reactivos menos peligroeoe. Sin embaro, no han logrado sustituir al cido aulfrico. 2. M~todo ponderok La graaa ae extrae mediante disolventes, en eneral el ter etlico, ya aea de una manera discontinua, por decantaciones euoeaivae en tubos o ampolial, o de una manera continua en aparatos especialea huta aotamlento, como el "Soshlet" o el "Extractor B.B.S.". Tras la evaporacin del dieolY8nta, que no es ma que un vehculo transitorio, ae peaa la graaa. Son mtodos preciaoa, pero de ejecucin relativamente
lara.

El reactivo utilizado para liberar la graaa, vara con loe mtodos: a) Mtodo etero-61Jloniacal, o de ROae-Gottlieb, eleido como mtodo de referencia internacionalmente, los lpidoe eon libe.rados por el amonaco y el alcohol, estos aon menos hidrolizadoe que con los mtodos que utilizan cidoa. La materia rasa ROae.Oot tlieb es ma pobre en cidos rasoa libres y la ma rica en lpidos polares. b) Mtodo etero-clorhdrico que es el mtodo de referencia en Francia desde 1970. Este mtodo es ma universal que el ante rior {lo que basta cierto punto explica la oriinalidad francesa), ae aplica a laa leches alteradal y a laa leches conaervadas por adi cin de formol. La materia rasa est un poco ma hidrolizada que el mtodo amoniacal, pero los resultados analticos son muy.anloos a los de la leche fresca. e) Mtodo del metal-metanol, preconizado en Francia por Navalier y Brunin (1960). El metilal, un aceta! de frmula CH, (OCH, )2 , disuelve las material graaaa tras haber coaulado laa protenas; se usa alamente un reactivo; loe mejom resultados ae han obtenido con leches formoladas y las leches concentradas y en polvo. d) El mtodo internacional para el anlil!a de los queaoe (mtodo "S.B.R.", de Schmidt, Bondzynaki y Raztlaff) pmcribe el cido clorhdrico concentrado y caliente para disolver la casena, an tes de la extraccin con la mezcla de teres. Se han establecido diveraas variantes de este mtodo para eliminar el error debido a los productos de deecompoaicln de los azcam.
8) Mtodos bllaldoa en determinada propiededea de los glbulos "aos o de loa triglic*ldoa
l. Turbldimetria

Los lbulos rasos dispersan la energa luminosa, aen veremos en


CopynghtC'd rnatenal

102

Llpkla.. Materia grasa-Nata

el captulo IX , dedicado a las propiedadea f.lcaa. Cuando un rayo de luz, cualquiera que aea su lonitud de onda, atravleu una capa de leche, ,. produce una prdida de eneJ'Ia por difulin , que ea la cama

de la turblda. FAta prdida no depende Iio de la c:antidld de materia grua, sino tambin de la di met!M'l de loa Jbulo.. Se ba comercializado con xito un aparato pua la determinacin rpida de la materia grua de la lecbe, que Ueva un bomoceneizador bellido en el principio de la turbidimetria (''Mllko-Tester", de la Foos Electrlc) de llraD difuain en el momento actual. Ser pretent.ado en el captulo xvm.

2. Ab110rc/6n de rod/acione Los trlllcrldos contienen ncleos carbonUoa productorea de una banda de abeorcin caracterstica en loa lntrarrojot, hacia los 6800 llll'. En Inalaterra ae ha puesto a punto un aparato eapecial para el anllail rpido y en .erie de la leche (analizador " lrma" de Goulden), que ae deacribin ma adelante en el captulo IX . El "MllkoScan-300" ae besa tambin en la espectrofotometra por lnfrarrojce. 3. Onda. ultnuono~W La w!ocidad de propapcin de loa ultruonidot depende de la con ceotradn de lu 1\lStaocias en &Uspeosin. ~o eate principio, otro aparato especial , el "Darison", se ha puesto en \UO en loa EE.UU. (ca ptulo IX). Las determinaciones son muy rpidas.
4. Reaccione de/ enlace ter La hldroxlklm/na, NH2 0H rompe el enlace tter en loa glicridos y toma, con loa cidos grasos, un hidroxamato: -cH,-c-NHOH. El cloruro frrico reacciona con los bidroxamato1, dando un cuerpo CO !oreado. llay doa cauaas de error: la coloracin vara ligeramente con la naturaleza del cido graso, y el nmero de cldcegrasoa preaentes en un peao dado de materia grasa no ea Invariable. A peaar de ello, se ha eoaayado un mtodo de este tipo, pero no ae preeta a operaciones automtlcaa y no parece que se utilice mucho en la prctica.

Captulo 6 Prtidos de la leche. Casena y fenmeno de la coagulacin

1 GENERALIDADES
Lu lllltanciaa nJtrogenadu foDIWl la parte m compleja de la leche; an no bien conocida nJ en su constitucin ni en lu trantfonnacione que puede experimentar. Los nuevo m&d01 de e.xamen y anJi. ala (mlcrotcopio electrnico, electroforeaie, r81onancla magntica nuclear, dlfutln de la luz, etc.) han aportado un gran nmero de re IUltadoa que muchaa veces son difcilet de Interpretar. La caracterizacin de lu eUitancias recientemente deecublertaa ha sido con fre. cuencla Incompleta; ello 81 motivo de cierta confut!n en lo referente a 111 nomenclatura. En e.tecaptulode la bioqumica de la leche 81 sin duda aJcuna donde mayores avancea .e han rullzado en 101 ltimos
lWOI.

vana. ra.zonet:

La importancia de la parte protdica de la leche ea muy p'aDde por

1. La lllltanciaa nitrogenada que .e enc:uentn.D entre 1aa m abundante&; aunque en la leche de 101 Nmlant.ee .e haDan aproxi JDAd.omente en la mltma proporcin que 101 lpld01, en 1aa otras lechea oonatlt~o~yen la fraccin dominante, eapedalmente en los mamferos monotr!COI de crecimiento rpido.

2. Lal propiedades fsico-qumlcaa ma Importantes de la leche, eepeclalmente laa relacionadas con su eatabUidad, derivan de la preaencla de pr6tldo1 en forma mlcelar.

Prtidos. CaMina y fenmeno ct. la coagulacin

S. Oelde el punto de vista nutritivo,loa prticlo collltituyen la par te m Importante de la leche. 4. Lu proteDIIIIOD loa componentes fundmentalee de 1aa clulas y loa m importantes de todos loe materialee biols!co. A1unas protenu del lactoluero tienen actividades biol6slcu: enzim11, inhi bldoret, antic:uerpoe. Lu protenu de la leche, como 1aa de la .angre, 100 caracter aticaa de cada especie por sUJ propiedades lnmunol icaa. Lu auatanciaa nitroenada.l hallada en la leche 10n muy numero au y variadas. Ant.eriormente ee 1aa clalificaba en cinco ll"UPOI aegn su comportamiento flente a dilerentea -aentes precipitantes: caaena, lobullna, albmina, prot.eoaa-peptona y suatanclaa nitroaenatJu no protelcaa. Eatu suatanciaa apareoen en la figura 14, donde 1e han rerumldo loa mtodos claic:oa de fraccionamiento en el laboratorio, u como un procedimiento prctico que puede utllizaree tambin para dicho freocionamiento. Estos procedimientos no llevan a la obt.encin de c:uerpoa puros, aino a freociones oompleju. Eatudlaremoa en este captulo los mtodos m eticaoea de ~eparacln. En el cuadro 18 1e enumeran laa auatanciaa que ee utudiarn en ette captulo, con las proporciones medi.u en la leche de vaca normal. He aqu IUI carecterea det.ennlnantes :
1) Us proteIW

Recordemos que 10n macromolculu alimlables a beteropolmeroa, en las cuales se encuentren reunidoa por el nico enlaoe peptdico, en encadenamientos no ramificados, unidades repreeentadae por 20 crmlnocidos. Sus propiedades se derivan a la vez de su composicin y de una particular estructura espacial. Lu protenas no atravieaan lu membranas dializablea y &e precipitan fcilmente de su solucin por divertoa reactivos, especialmente loa cidos tricloroactico y fosfotnptico, u como las sales minera lea a concentracin elevada. Se pueden diatlnulr en la leche trea
randeall"Upo: La -~M entero: Ba un complejo de proteDIII foaforedu y constituye la parte nitroenada m caracterstica de la leche; no em. te ninuna IUitancia parecida, ni en la Pnre ni en loa tejidos de los mamferos. La caaena precipita alo cuando se acidifica la leche a pH 4,6 . Por ello ee la ba llamado "protena IDIOluble" de la leche. Es la fraccin nitrogenada m abundante en la leche, 10bre todo en la

de loa rumiantes, donde conatituye oerca del 80 % total nitrogena. del do . Lu protentJJ~ del lactoruero o protenas 10lubl81. Lu m abun dan tea tienen las propiedades de las albmin y de tu lobulinas. Se lniOiubWzan por el calor antes de loalOO" C. Una parte de estupro

LECHE DESNATADA

Acidificacin pH4,6

Supercentfugacin

Cuajo

20% Na,SO,

+Ca++

(Preclpltaclo)
CASENA (isoeleltlca)

(Suero)

(Seclimento) CASEINA nativa (Mieelas do losfocaseinato)

(Cogulo) PARACASEINA (pa1'11caseinato ele Ca)

+LACTOSUEROS
Calentamionto

(Precl~ltado) CASE NAS GLOBULINAS PROTEOSA.PEPT

(SobT~rt)
pH 2,0

90-100"

so..o.m,
1/2 saturado

(Sobren.danto) ,8-LACTOGLOBUU NA

+ NPN

(Preclpolado) a -LACTOALBMINA

(Precipitado) ALBMINAS totales (desnaturalizadas)

(Suero desproteinizado)

(Precipitado) GLOBULINAS

+ SO,Am,
saturado

(Proclpilado) PROTEOSAPEPTONAS

N.P.N. (sobrenadante)

(Precipitado) ALBMINAS proteosas-pepL

~
3

:::r
1'19ura 14.. Separacin de los prtldos de la lec/le.

106

Prtldos. caserna y fenmeno de la coagulacin

tenu no ee lintetiza en la glndula mamaria; normalmente se encuentran en muy pequeas cantidades. Lu proteo~~:a-pepiDn.tU. Son suatanciaa glicoprotelcu con un volum.e n mol.ecular Intermedio entre el de laa protenu y el de loe pptidoa. En la leche abundan poco. En loa aubttuloe I1 al VII se expondrin a1unu nociones generales cuyo conocimiento es Indispensable pan el estudio individual de loa componentes proteicos.
2) Sustancias nitrogenadas no proteicas

Constituyen una parte escasa, pero que comprende un gran nmero de sustancias de peso molecular Inferior a 600. Estu sustancias son dlali%ables, y permanecen en solucin en las condiciones en que se produce la precipitacin de las protenas. Su estructure qu mica es muy variada. Al parecer no existen polipptidoa en la leche.

11 COMPOSICION DE LAS PROT EINAS DE L A L ECHE

Lu m 1imples son las holoprotenu, que no contienen m que alfa-aminocidos bajo forma 1 (Fig. 15) son 1aa doe protenas m importante. dellactoauero, ji..Ja.ctoglobullna y a-lactalbmina. Lu fosfoprotenas contienen cido fosfrico, y las Ucoprotenas contienen una parte prosttica glucdica. Lu dos protenas ms abundantes de la leche de vaca son fosfoprotenas: casena a, y casena ll; la casena ~ es una fosfolicoprotena. El cuadro 14 mueatra la composicin en aminocidos de las principales protenas de la leche de vaca ; se trata de la composicin centesimal que intereaa fundamentalmente a lo1 nutrlogos. Los bioqumicos prefieren lo datos analticos expresadoe en restos de aminocidos por molcula-gramo, Jo que satisface m desde el punto de vista cientilioo. Puesto que los peaos molecularea de loa aminocidos son muy diferentes (gticocola = 75, triptfano = 204), utilizaremos estos datos a Jo largo del presente captulo. Lu propiedades de las protenas dependen de las proporciones de amlnocldoe pertenecientes a diferentes categor as, segn la natureJeza de la " cade01 lateral", que es la parte de la molcula exterior al ncleo fundamental-<:H(NH, )-COOH. La figura 14 mue~tra la frmula de los amino!cidos que ee encuentran en laa protenas de la leche. Lo aminocidos neutros, o no polares, tienen una cadena lateral conltituida por grupos -<:H, - y -<:H,. que son hidrfobos; cuanto m numerosos son, menos soluble es la protena. Adems, estas cadenas no polares permten Interaccione~ que intervienen en la estructura espacial. El tript!ano y la metionina se comportan como ami-

y hted 'lla

al

Prtidos. Gaselna y fenmeno de la coagulacin

107

nocidos neutros, en las condiciones fsicoqumicas que rigen en la leche. Cuadro 13. Di8tribucin de las principales sustancial nitrogenadas de la leche de vaca.
Proporciones medl.u a por litro relallvu Prtidos totsles l. Protenu: A. Casena isoel6ctrica a) Casena a, 1 b) Casena a,1 e) Casena fl d) Casena K e) Casenur 1 ,')'1 ,r3 B. Protenas del suero B.! Albmnu: a) fl~actoglobulina b) a~ctoalbmina e) Seroalbmina 8.2 Globulinas inmunes 8 .3 Proteosas.peptonas U. Sustancias nitrogenadas no proteicas 32

lOO
78 9,0 2,S 8,S 3,2 1,7S 100 36 10 34 13 7 ,o 100

25

S,4 2,7 1,2 0,2S 0,6S 0,6

17

so
22 S 12 10 S

1,6

Los otros aminocidos llevan grupos polares. Los grupos ionizables carboxilo y amino influyen en el carcter cido o bsico, y por lo tanto sobre el punto isoelctrico de la protena, pero una parte de los grupos carboxilo puede encontrarse ~o forma de amida no disocia ble, -c-NH2 Los grupos hidroxilo no se ionizan en las condiciones habituales; constituyen factores de solubilidad y permiten el esta blecimiento de enlaoes de hidrgeno. Los grupos sulfhidrilo de la cistena son importantes por su susceptibilidad de oxidarse para dar puentes disulfuro que originan enlaces intramoleculares, muy impar. tantea para determinar la estructura espacial de las protenas. Se trata de un enlace de covalencia producido por oxidacin y que une dos restos de cistena para formar cistina Cs-6-6-Ca. Sealemos que la cistena es poco estable en medio alcalino; tambin se descompone en sulfuros en el curso del calentamiento por encima de los 100 C. Entre los otros aminocidos es una excepcin la prolina, que es un aminocido secundario cclico; el ncleo pirrlico provoca por su rigi dez un cambio de direccin de la cadena peptdica.
CopynghtC'd rnatenal

Cuadro 14. Compoicln en amnodcldoa de llu protena~ de IG leche (%en ~~~Utancla .eca)
Compolleatea de la locbe de YOCa

Pr61i
a.bclooJb6.

C..lueaten

Amir>o6eidoo
( 1) Addo upVtico ... . .

C..lna()

lilo-

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tlobu
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(3) 7,30 6,64 6/)9 17 ,3S 8,78 1 ,31 5,41 2,8 S,l 1,0 6.14 7,40 4/)7 1 /)S S,76 1,67 4/J

7 (4)
4/J 4,4 S.S 22,9 17 Jj 1,S 2,3

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...... ........
(6)

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TreoaJaa ...... . . .. SeriDa .. Acido alutmi<:o Pl'otlD.a .. Q.iciAa . . AJanina , , , , , , . .. . .


o

7,59 3/) 5,8


20~

Clodaa (1 /2) . . . . . . ValiDa .. JlioiIII . . . .... . . bD~~ . . . l..euclaa o

7,8 2,37 3,18

S,l 6,8 23,2 161J 2,4 1,7 10,2 3,4 11,6 3,2 0,83 6,5 3,1 3,4

~ -- PeaJ1 IIIIIII . . . . . .
Ttlplfo.ao .... ...
J ..... . . . .. . .. . . ..

Hlsdlu .. . .. . . ...

Atain" lD&

5,36 2 ,44 S,l6 8 ,6S 7 ,11 S ,o6 2,13 8,56 2,70 3,74

s.s

61J8

s.a

! O,S 4,1 4 ,4 121J 3,7

11,39 SJjl 3,58 19,12 S,l2 1,24 6,7 3,4 6,11 3,16 6,16

18,6S S,SO 4,76 12,8S 1,98 3,21 2,14 6 ,4 4 ,66


o~s

23~

7 ,4 4 ,7 61J

ISIJS
3,87 3.S3 2,62 JI ,93 1.63 2,7 8

s.s

1,2 6,2 3,7 1,9

6,80 II ,S2 S,37 4,47 6,0 11 ,47 2,8S 1,1 S

11,3 21J 3.S 1,8 11J 2.S 6.S 10,0 S,l 4 ,9 1,4 7,9 2,7 3,7

6,3 22,4 11 ,3 2,7 31J 0,34 7,2 2 ,8 6 .1 9,2 6,3

s,o

1,7 8 ,2 3,1 4 ,1

3{>1 S .S 20,79 10,89 21'6 3/) 1,34 6,47 0.6S 4 ,4 9,79 4 ,76 S,l2 2,2S 1,o6 2.S4 2.6

1.S 4,35 4,3 18,3 10,9 1,8 2,8 1,90 4,8S 0 ,7 4 ,4 10,8 5,1 3,8 2 ,4 3,8S 2,15 2,0S

(1) Sean Hlpp y col., 1961 . (a11 + "oll (2 ) Sesdn Gordon y col, 1949. (3)Se&(onJol.l6ay Alolt, J962.
l

(4) Silln Gordon y col., 1953. (S) Sellin Gordon y col., 1961. (6) Selo Gordon y Ziealer , 19SS. 0 ) La compoalcln eo reaiduos de amiDo,cldot ae da 011 el cuadro 19. (

(7) Sean Orr y Wott, 1951. (8) Sell6n Jol.l6a y Alolt (Do public:ado). (9) SelD Alalo Y Jo iJja, 1962.

'

Prtldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

109

Amlno6~(ne-)
O}

R-Ol<

NN,

R OIC) Gficoookl(gllclna)
1

Alanina
Valinli Levcina e l'$oltucina
H C n CH,

COOf<

'

H:CvcH-COOH
NH

Profina

(lndol)

, .. 1

cido npMi~
cido ghJI8mk:o

pK .. J,I (d pK . ... . ....

Amlno6cldo len611co ("'bllmente cido)


Timsina - - - - - pK .. 10.) I.IJ (Fet.olico)

Amlnocldoa bblcoa
bJHlf';- CH) - o1tJ - CH<

""
COOH

Lialna

- -----pK
t

IO.ShJ
amonio)

HlatiOI:""

-----pi(. "' 6<1


jlmklrNOI)

Amlno6cldoa alcoholes (no lonlzadoa en laa condlclo,.. habituales)


HO - CH1 -CH /

""

'-.COOH

Slna

u,C- CH tOH I - ctt( ""

Tretanlna

'""'"

Figura 15. Aminoaci<los encontrados en las protelnas dala leche.

Copynghted r- atonal

110

Prtldos. CUefna y fenmeno de la coagulacin

Continuacin na. 16
~~-

...,
""""

P.l HS -

0t,-

CM<

~/ Cistina

-~1 -CM, -

,e

JQ.Jlu

u)c-

s- o., - eH(""'

Netlonina

COOH

Loe aminocidos poco solubles (cistena, leucina, i&oleucina, tiro sina) pueden fonnar cristales o depsitos traa la hldrlieia de las protenas, slsu concentracin es suficientemente grande. De esta manera se forman grnulos de leucina y de i&oleucina en ciertos quesos, cristales de tlroalna en determinados cuajos alterados, depsitos de composicin variada en el contenido intestinal, etc. La leche no contiene ornitina; por el contrario ae puede formar este aminocido a costa de la arinlna en loe productos fermentados. Se encuentran pequei\as cantidades en el queso y en la leche desna tade.
Nota.- En el ~\Wbo U, los amino~idos ealtn clulfludo1 ~n IIJ'!'eC)o al or de.n de 11.1 el uc:in en el cuno del an'Ui po.r medlo del moderno mltodo automitleo de c:romU>rro!Ca en eolumna. Loo que 10n indllptll.l&bloo al hombre fi curan en nerrll.a (la cltte{na .. i.ndlopelllable eomo fuente do uufre). No figun. el amonfaeo de loo rrupoo amidadoo de la 1lutunina y do la uparoaina, ya que no puede det.ermfnaroe ~on preclain por eate mflodo.

111 ESTRUCTURA DE LAS PROTEINAS DE LA LECHE. DESNATURALIZACION

l. Eatructuro prlmariD El enlace peptdco {enlace de covalencia) confiere una gran solidez a la estructura primaria. Las cadenas no son linealea; ae deberan representar por una lnea quebrada con ngulo de no a 120; ain embargo, la cadena es flexible, ya que exiete la poeibilldad de libre rotacin a nivel de loa -cH-.

R,
NH, -

CO - NH-

CO ................. NH -

t1 H

Rn

COOH

pyr ttE'd fl'atcr di

Prtldos. C-lna y fenmeno de ta coagulacin

111

La tecuencla de loe aminocidos se determna genticamente; volveremos sobre eata importante cueatin en eliUbcap tulo vn. Por el contrari.o , la fosforilacio y la glicoeilacn de las heteroprotenu te determinan enzirnticamente (modlficacionea potranalacionales).

2. Estructuro secundara Las molculas proticas tienen una conformacin espacial determinadA que no se debe al azar, Bino que resulta de lal diferentes fuerzas de enlace entre diversas partes de la cadena peptdica. En lal protenas globulares la estructura ma estable ea la unin de los aminocidos segn una hlllice que comprende ma de 10 unidades; es la estructura a. Otra conformacin frecuente ea la estructura /1, en hojas plegadas. Estas estructuras estn conaolldadas por enlaces de hidrgeno. Las cadenas peptdlcas pueden formar un codo en la parte media de un tetrapptido; se le llama "ll-tum"; ea a esta posicin a la que parece unirle preferentemente los grupos prmttlcos de ciertas heteroprotenu, eapecialmente loa glcidos. Las protenu del suero tienen una estructura bastante ordenada, con partes a y partes /1. En cuanto a las casenu, se saben pocas cosas sobre au estructura leCUlldaria .
3. Estructurw terciaria y cuaternara Una protena puede estar formada por una cadena nica replegada sobre s mlama, o por varias cadenas. La rigidez est asegurada por puentes dlrulfuro. En laa cuenaa, que no contienen clatina o contienen muy poca, ea probable que intervengan interaccionea entre grupos no polares, tales como los enlaces hidrfobos que ae eatablecen cuando loa grupos hldrocarbonados son numerosos y ae encuentran muy cerca unos de otr08. En el aspecto de la estructura espacial, ae diatlngu.e n netamente los dos grande rupos de protenas citados anteriormente: a) Las casenaa .t ienen una estructura lua; cuando se renen, aua cadenas peptdicas se enredan; se oonaervan suficientes espacios para fijar el f08fato clcico u otros iones; lal proteasu penetran fcilmente. b) Las protenu del suero tienen, por el contrario, una estructura compacta. como un ovillo de cuerda apretado; los iones y las enzimas te introducen difcilmente en la eatNctura nativa.

4. E.tado nativo y desnaturalizacin En la leche, las protenas tienen una estructura definida, que puede modificarse bajo la accin de diversos tratamient08 aplicados en el
t.
ynght~:d

atenal

112

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

laboratorio o en la industria, especialmente el calentamiento a ms de 70 o e, tambin por reactivos desnaturalizantes variados: cidos, lcalis, urea, detergentes, etc. La "desnaturalizacin" ea una modificacin sin ruptura de los enlaces covalentes, ni separacin de fragmentos; consiste en una ruptura de enlaces que aseguran las estructuras secundarias y terciarias, seguida de un reagrupamiento que conduce a una nueva conformacin. Las protenas del lactosuero se desnaturalizan fcilmente por el calor y se vuelven ms o menos insolubles; sin embargo, son ms fcilmente digeridas por las proteasas. Las enzimas pierden su actividad tras la desnaturalizacin. Disminucin de la so lubilidad y prdida de la actividad son las consecuencias de una mo dificacin estructural profunda de la molcula, que, en general , es Irreversible, y corresponde al paso de un estado de orden superior a un estado de orden inferior. Este fenmeno parece que no concierne a las casenas. Observadn: Recientes trabajos han demostrado que numerosas protenas se sintetizan bllio la forma de cadenas polipeptdicas nuis largas que las de las protenas correspondientes; es el precursor o preprotena, que lleva un pptido "seal" suplementario, el cual desem pea un papel en el paso de la cadena naciente a travs de la membrana del retculo endoplasmtico. Este pptido es separado rpidamente por una proteasa especfica que libera el extremo N-terminal de la protena. Este fenmeno se ha estudiado en varias protenas de la leche.
IV PROPIEDADES IONICAS DE LAS PROTEINAS DE LA LECHE. ELECTROFORESIS

Al Disociacin. Punto isoelctrico Es interesante recordar, por ser el fundamento del mtodo electroC ortico, que las protenas son electrolitos anfteros,lo mismo que loa aminocidos que las componen. Pueden existir tres especies ioniza das con este tipo de dipolo:
Reaceonea de disociacin
(1)

NH)

12; NHJ

13J NH,

R-C<

coon

.. R--CII(

coo-

.. R-CH(

coo-

pK

1 at )K

Con valores bajos de pH se encuentra el catin (1); cuando el pH se eleva, aparece el ion hbrido (2); con valores elevados de pH preCopy nghtC'd m aten al

Prtidos. Case!na y fenmeno de la coagulacin

113

domina el anin (3). Las reacciones de disociacin se caracterizan por el pK, que corresponde al valor de pH en el cual la proporcin de la forma ionizada se eleva al 50%; este valor depende de los grupos veci nos. Para los aminocidos neutros, pKa 1 se encuentra cerca de 2,3 y pKa, de 9,6 . El punto isoetctrico es igual a la media de estoa dos va lores; la carga neta es nula (en ausencia de sales se obtiene el punto "isoinico "). La forma no disociada no existe en solucin ms que en cantidad extremadamente baja. Para los aminocidos que tienen un grupo ionizable suplementario, existe un tercer equilibrio, cuyo pK se menciona en la figura 15. La figura 16 muestra la curva de valoracin de un aminocido no polar (curva b); el centro del rellano medio (1) corresponde al punto isoelctrico.

0) -.....--

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1
1

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..
e::

"

CT

...
:r
u

Principio d&l viraje

de la fenolftalerna

10

12

Figura 16. Valoracin d e un aminocido no polar {solucin 1 molar).

(a) En presencia <le formol (10 %) - (b) En agua. En ordenadas: 1 equivalente da cido o de base

Las protenas son electrolitos muy complejos y su punto isoelctri co depende de la proporcin de grupos ionizables laterales; se les puede tambin designar segn la curva de valoracin de la protena. En las fosfoprotenas intervienen los grupos cidos fosfricos, que contribuyen a la fijacin del punto isoelctrico a un valor relativa mente bll,jo en las casenas.
Copy nghtC'd m aten al

114

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

B) Elec:1roforesis Es uno de los mtodos ms utilizados para la identificacin y separacin de las protenas; se basa en la movilidad de los iones en un campo elctrico. En una mezcla, las protenas emigran independientemente unas de otraa, segn su carga y el tamao de la molcula. Existen numerosas tcnicas de electroforesia. La que permite medir con precisin la "movilidad", es la electroforesia en fase lquida de Tiaelius; la migracin se sigue en funcin del tiempo mediante un procedimiento ptico. La electroforesia de zona permite poner de manifiesto las fracciones proteicas gracias a coloraciones especficas (negro amido, azul de Commasie, verde de 1li88Jnina, etc.); la manipulacin es mucho ms simple que en el mtodo precedente y exige menos cantidad de sustancia. Se realiza sobre un soporte slido (ban da de papel o de acetato de celulosa) o bien en un gel de almidn, de agarosa o de poliacrllamida. La electroforesis en gel y en medio diso ciante (tampn que contiene urea) permite excelentes separaciones, ya que adiciona un efecto de tamizado molecular. Ma adelante veremos su aplicacin a laa protenas lcteaa (figuras 18 y 21 ).

V PROPIEDADES FISICAS DE LAS PROTEINAS DE LA LECHE


Al Solubilidad y estabilidad de las soluciones Todas las protenas contienen grupos polares que poseen una gran atraccin por las molculas de agua, pero no todaa son igualmente "solubles" en sta. Aparte de la proporcin relativa de los grupos polares y de los grupos no polares, intervienen en la solubilidad de las protenas la fuerza de los enlaces intramoleculares y las posibilidades de enlace con los cationes y los aniones. A este respecto existen grandes diferencias en los componentes de la leche. La afinidad de las protenas por el agua depende mucho de las condiciones flBicoqu micas. Sus soluciones no poseen la estabilidad de las soluciones de sustancias de molculas pequeas, como la lactosa. El pH tiene una gran influencia; en el punto isoelctrico cesa la repulsin de las molculas, con tendencia a agregarse y a flocular. En las condiciones de concentracin en que se hallan las protenas y las sales de la leche, solamente las protenas que forman la casena precipitan por un cambio de pH, hacia 4,6. Las sales aadidas a las soluciones de protenas tienen efectos variables segn su naturaleza y concentracin. Si la concentracin es dbil, las sales no desnaturalizantes se d.isocian en iones, que se ligan a la molcula proteica, aumentndose aa su afinidad por el agua. Por el contrario, una fuerte concentracin de sal cuyo anin se encuentra fuertemente cargado (sulfato, cloruro) orienta las molculas de agua;
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Pr6tldos. Casena y fenmeno de la coagulacin

115

de ello resulta una competicin entre estos iones y los grupos polaxes de las protenas, lo que provoca ls floculacin. Es el efecto de "ensanchamiento", debido a ls modificacin de la actividad del agua. La floculscin puede lograrse tambirt por ls adicin de un solvente miscible con el agua (alcohol, acetona, etc.), pues disminuye Is constante dielctrica y reduce ls atraccin de Jos grupos polares por el agua. Estas propiedades se utilizan para separar y purificar 1ss protenas de ls leche, puesto que la floculscin o ls solubilizacin no se producen en 1ss mismas condiciones para cada una de ellas.
B) Densidad La densidad de las protenas de la leche es cercana a 1,8. Debido a la

carga de las molculas, hay una contraccin de volumen en el curso de ls disolucin, que vara del 5 al 8%- Para ls casena, el volumen especfico pasa de 0,774 a 0,731; lo que corresponde a densidades de 1,292 (slida) y 1,367 (solucin). Para la 1-Isctoglobulina, el volu men especfico pasa de 0,802 a 0,751 y la densidad de 1,247 a 1,331. El volumen especfico de una protena se encuentra en relacin con su composicin en aminocidos. C) lndice de refraccin El ndice de refraccin de una protena pura se deduce de las determinaciones del ndice de sus soluciones; pero puede tambin calculsrse segn su composicin en aminocidos, ya que es un valor caracterstico. Los valores obtenidos son bastante concordes. Las diferentes protenas de ls leche no tienen el mismo ndice de refraccin (es tanto ms elevado cuanto ms bajo es el volumen especfico), pero las desviaciones son limitadas (casena a , 1 = 1,618; ll-lactoglobullna = = 1,594, etc.). En solucin, el ndice vara proporcionalmente a ls concentracin, pero el "incremento" difiere muy poco de una protena a otra. Se trata de un valor interesante en ls prctica, ya que permite determi nar la concentracin de una solucin de protenas mediante medicin de la refraccin. En ls leche y otros productos lcteos, un nmero bastante grande de componentes son activos; por este hecho,la dosificacin refractomtrica de 1ss protenas es poco utiliUlda (no ocurre lo mismo para la dosificacin polarimtrica). D) Propiedades espectrofotomtricas l. Las protenas de ls leche no muestran bandas de absorcin en el espectro visible ya que son incoloras, salvo un componente menor ,la lactoferrina. Por el contrario, originan bandas caractersticas en loa espectros ultravioleta e infrarrojo. Una de las ms interesantes es aquella cuyo punto mximo se sita hacia 280 m , y se debe a los aminociCopy nghtC'd m aten al

116

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

dos de la serie aromtica, tirosina y triptfano. Esta propiedad per mite valorar laa prote naa por eapectrofotometra en el ultravioleta; pero e9 preciso anotar que el coeficiente de extincin vara segn la composicin en aminocidos. 2. Por la misma razn (presencia de aminocidos aromticos) las protenas de la leche son fluorescentes; con una activacin a 280 DJSI. La radiacin de fluorescencia alcanza su mximo hacia 340 DJSI. La medicin en el fluormetro ea rpida y sumamente sensible; no obs tante, la intensidad de la fluorescencia depende de numerosos facto res, difciles de controlar. Por ello, esta propiedad no suele utilizarse para la determinacin de laa prote naa Jcteaa.
Nota.- La CIIUlturolizocin trmica tiene poca influencia aobre loa valorea foicoo eotudadoo. Lll unloneo ~ de loo amino"=ldoo lnDuyen qoaoamon te en estu propiedadet.

VI DIVERSAS REACCIONES DE LAS PROTEINAS DE LA LECHE. HIDROLISIS

Nos limitaremos a algunaa reacciones que tengan un inters prctico o analtico. El tema importante del efecto del calentamiento se estudiar ms adelante {captulo IX) por razn del carcter determinante de laa condiciones del tratamiento trmico. A) Reaccin con las bases Se forman los "proteinatos", que se han comparado con laa salea, pero se encuentran poco disociados; se trata ms bien de complejos de tipo "quelato". La casena tiene propiedades especiales debido a la presencia del radical fosfrico; ms adelante estudiaremos los casei natos. Las protenas incrementan la solubUizacin de los metales pesados por secuestro del ion metlico que se encuentra en solucin; por este hecho se desplaza el equilibrio entre el metal y el ion, con lo que puede entrar en solucin una nueva cantidad del metal, ionizndose: Algunos metales, como el hierro y el cobre, son prcticamente in solubles en el agua, pero en un medio rico en protena, es notable la solubUi:u.cin; ello explica por una parte la corrosin del material de lechera, y por otra la catlisis de ciertas reacciones en la leche. 8) Reaccin con los cidos y colorantes Se conocen muy poco las propiedades de laa "sales" as formadas, en las cuales la protena constituira el catin. La casena, insoluble en el
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PrOtldoe. c-IM y lenOmeno de la coagulacin

117

punto ~. ee diauelve tanto en los .c:idoe como en lu be-. Pero e. precilo obeerwr que c:iertoa cidoe ~ propiedade. dema turallsantel especie!, y por ello precipitan a lu proteinM. Una rea.ccin intere.nte la de loe colorante. c:idoe. A UD valor de pH IUtlc:ientemente blljo para que las protenu te encuentren en eat.do de catin, esto. colorantes se combinan con ellaa y, en el caso de la leche, lu precipitan. Doe colorantes aul!nlcoe, el negro amido y el naranja O (figura 17) ae utilizan pera la valoracin rpida de las protenu de la leche.

o.

0 -"""' ...

.... ...

--0

CMnt $WP'IR.~
~

--........

O -
Flgura 17. Colorantes sultnlcos utilizados para la valoracin do las meterlas nilrogenadu IO!Aitt.

Otn reaccin interesante e. la de loe polilidoc aninlcoa, que son acentel e.pe.antea, gelifiCIJitea y en ocasiones precipitantes; tales son: - lu auatanciu c:arbo~ illc:aa que llevan un IIJ'I.D nmero de grupos -coo-: pectinu, derivados de la celulosa, principalmente la c:arboxlmetilceluloaa; - lu austanc:iu aul!ric:aa, como loa c:arracenatoa. No sa pueden describir sus reacciones en trminos simples y de una forma eneral; se trata corrientemente de lnt.eracclonea electrostti c:aa, dependientes del pH y a veces de la presencia de calcio. Las que tienen UD inters prctico aern eatudlsdas en el captulo XXD .

118

Pr6tidos. Casena y fenmeno de la coagulacin

C) Reaccin con fmmol

Se trata de la reaccin de Sorensen, por la que se forma un producto de adicin sobre los grupos amino o imino no ionizados. Se produce un desplazamiento del equilibrio de disociacin del catin -NH; , con liberacin de un protn y disminucin del pH. Una solucin neutra de protena presentar una reaccin cida tras la adicin de for mol. La figura 16 muestra un desplazamiento de la curva de valoracin (curva a). Los productos de adicin formados son bases muy dbiles; su disociacin puede ser despreciada.
-QOC-R-NH, + 2 HCHO,.. -QOC-R-R-N(CH,OH), -QOC-R-NH 3 + .. -QOC-R-NH2

+ H'

Esta reaccin se aproveeha en la prctica para la valoracn rpida de las materias nitrogenadas de la leche, mediante una simple acidl metra. Sin embargo, las sustancias nitrogenadas no proteicas tam bin intervienen de forma importante en esta reaccin, por lo que la correlacin con el contenido en protenas no es muy buena.

0) Hidrlisis qumica
Es una degradacin consecutiva a la ruptura de enlaces peptdlcos; por lo tanto existe una destruccin de la estructura primaria con libe racin de fragmentos moleculares ms o menos largos. Algunos agentes desnaturalizantes pueden provocar la hidrlisis si se lea hace actuar de una manera intensa o ms prolongada. Es el caso del calenta miento a ms de 100 o e de los cidos fuertes y bases. La hidrlisis total, por cido clorhdrico 6 N, a 110 oc, se utiliza en el laboratorio para la determinacin de los aminocidos, que de esta forma son completamente separados uno de otro. La industria prepara por va cida hidrolizados de protenas de la leche Oo mismo que de otras protenas animales o vegetales), que se utilizan para preparar sopas, caldos, productos dietticos varios, etc. Lo ms corriente ea que se tenga que neutralizar el hidrolizado, lo que eleva mucho el contenido en sales y es un serio inconveniente para loa alimentos dietticos.

E) Pro11161isis Las protea8a8 catalizan la hidrlisis enzimtica, eapecia1mente las del sistema digestivo: pepsina, tripsina y quimotripsina. Cada una de ellas tiene preferencias por la ruptura de determinados enlaces peptdicos, con fijacin de una molcule de agua. El cuajo es una proteasa de alta
CopynghtC'd rnatenal

Prldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

119

especificidad; en las condiciones prcticas de empleo rompe muy pocos enlaces. Una fase esencial de la fabricacin de los quesos es la protelisis parcial de la casena durante la "maduracin" (captulo XXI); la protena inspida e Insoluble se transforma en productos spidos y solubles; la protelisis se complica con degradaciones secundarias. El primer producto de la descomposicin de una protena fue aislado del queso madurado por Proust en 1818, y se le dio el nombre de "xido caseoso" ,llamado luego leucina. Se pueden realizar hidrolizados enzimticos con varias proteinasas y en un grado de hidrlisis ms o menos grande, pero en el caso de las casenas existe el problema de la aparicin de pptidos amargos, a los que nos referiremos ms adelante. Pese a todo, se dispone de armas para disminuir el amargor, perticularmente el tratamiento con la leucina aminopeptidasa. Otras protelisis mucho ms limitadas son interesantes para meorar las llamadas "propiedades funcionales" de las protenas lcteas, tema que se ver ms adelante. Estas hidrlisis tienen adems inters para producir alimentos de reanimacin y tambin para destruir las propiedades alrgicas de las protenas, lo que se utiliza en la formulacin de alimentoa destinados a los nios alrgicos a las protenas de la leche.

VIl f.'L POLIMORFISMO HEREDITARIO DE LAS PROTEINAS

En los tejidos animales se han descubierto protenas muy semejantes entre s por su composicin, peso molecular y propiedades; representan varias formas genticas de una misma protena; es decir, se trata de ''variantes" cuya sntesis est gobernada por un gen particular. Las principales protenas de la leche se presentan bajo 2, 3, 4 5 formas genticas. Las variantes genticas se designan por las letras A, B, C. Existen individuos homocigotos: AA, BB, CC, que producen una sola variante; por el contrario, la leche de los individuos heterocigotos contiene una mezcla de dos variantes: AB, AC, BC. En la especie bovina, la frecuencia de los tipos genticos vara con la raza. Por ejemplo , en lo que se refiere a la casena ll y las razas bovinas, el gen A es en mucho el ms extendido y el nico encontrado en las razas Shorthom y Ayshire, su frecuencia rebasa el 90% en las razas risona y de Flandes (cuadro 15); el tipo C, solo o mezclado, no se ha encontrado ms que en algunas razas. En cuanto a la casena ", un amplio estudio realizado en los Estados Unidos sobre cerca de 1.400 vacas pertenecientes a cinco razas, demostr un predominio sorprendente del tipo BB.
Copyrighted rPatorial

Cuadro 15. Frecuencia de los genes que determinan la biosntess de las prote(nas de la leche en dl{eren tes razas bouinas
Cueinas
<>SI 8
Normanda ... . . . . . . . .

13
D

e
18 1 8 9

8
4S 1

e
1 2

8
66 34 15

tJ.U,toglobulino A

Fron (Holanda) .. .... Friso na (U .S.A.) .. .. Montbeliarda . ... . . . . . Fla.menca . . . . . . . . . ' Jersey . . . . . . . A.Yrshlre . . . . . .. . . Shorthoro . . . . . . . . . . .

. . ... .. . .. .

82 99 87 91 87 60-90 100 99

54
(A) S

9 40-10

(0)4

93 98 79 94 60 100 100

2
19

34
66 SS

50
52

so
46 55

6 40

(D) 2
(C) 4

10-SO 80

9050

20

40 30 11

70 89

n: vuiantc rara. e Existen u es variantes llA: A3, es nna; Al y Al Crecuent. mente exlsteo ea igual proi)Orci6n. (Valores extta idos J)Or Aschaffenburc de una revista. 1968).

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

121

Las variantes de una protena no se distinguen ms que por mnimas diferencias de composicin. En general, no se trata ms que de la sustitucin de uno o dos aminocidos en el interior de las cadenas peptdicas. A veces hay una delacin; es decir, falta un resto en una cadena. Cuando la sustitucin se refiere a aminocidos de cargas diferentes, por ejemplo, un aminocido dicarboxlico que reemplaza a un aminocido neutro, se derivan ligeras diferencias en las propiedades fisicoqumicas. La carga neta de la molcula no es la misma, y de esta forma se pueden poner en evidencia las variantes por electroforesis. Son los progresos de este mtodo analtico los que han permitido desvelar las variaciones genticas. La separacin de las variantes por los mtodos habituales de preparacin es difcil, aunque sea por cromatografaen columna de intercambiadores de iones. Para obtener una variante dada, es preferible partir de leche de una hembra hamocigoto, lo que implica efectuar la determinacin del fenotipo previo de numerosos individuos. En la actualidad,los mtodos electroforticos estn suficientemente perfeccionados para permitir la tipificacin directa a partir de la leche de las casenas "' ~y K y de la ~-Jactoglobulina. . La figura 18 presenta un ejemplo de tipificacin del fenotipo por electroforesis en gel de almidn, a pH 8,6 en presencia de urea y de mercaptoetanol. Las vacas Iet. (f) y (d) son homocigticas para las 3 protenas, y as, aplicando esta tcnica se pueden distinguir las variantes: jl-lactoglobulina-8, casena IIA y casena K -A. La vaca letra (e) es heterocigtica para estas 3 protenas, A/8. Debe sealarse que la ct-lactalbmina migra a nivel de la casena "' y que no se pueden distinguir claramente las variantes en este tipo de electroforegrama. Es posible que existan otros tipos de variaciones que no modifican la carga de la molcula; la electroforesis por s sola no permite diferenciarlas. Estudios de estructura han permitido aislar una variante 8Z (ceb) de la casena (J, que tiene la misma migracin electrofortica que B, aun haciendo variar el pH; es una variante "muda". El estudio de las variaciones posee un gran inters desde el punto de vista gentico y de la seleccin del ganado . El predominio marcado de un tipo, sealado anteriormente, es el resultado de mutaciones recientes?, o bien estn en relacin con otras caractersticas base de la seleccin en zootecnia (conformacin del animal, produccin de leche, produccin de carne, etc.)? En el momento actual no se puede responder con seguridad a tales preguntas, pero es preciso sealar que la seleccin pone en juego numerosos genes. Se tiende a considerar que el tipo ms frecuente es el original; los otros procederan de l por una simple sustitucin de la base de los tripletes de codificacin del RNA-mensajero. El polimorfismo de varias protenas de un mismo medio puede depender de loci estrechamente ligados o confundidos sobre los eroCopynqhled malenal

122
l1l
(2J<3)

Prtldos. Cuelna y fenmeno de la coagulacin


(4 1 (1) Caserna
(8)

(2)

(3) (4) caserna K

a, /J lactoglobullna Caserna p

(b)

(Foto J. Gurln)

(Cl

..,
(11

!di

+ ..

Figura 18. Determrnacr6n del lenotfpo de leches de vaca.

mosomas. Esto se ha demostrado para las casenas "' y {j por el estudio de la descendencia de toros heterocigticos; el padre no transmite todas las combinaciones posibles a sua hijas; por ejemplo, dos solamente Jo son en el caso de las variantes By C de "' y A y B de {J. La existencia de fonnas genticamente determinadas, con propiedades diferentes y en proporcin variable en la leche, es quiz la cau sa principal de las diferencias que se observan en el curso de los tra tamientos induatriales de la leche; citemos por ejemplo la estabilidad duzante el calentamiento y la capacidad para la coagulacin con el cuajo. Volveremos sobre este punto al estudiar las casenas.

VII I CASEINA ENTERA


Al Definicin. Composicin La casena entera es el complejo proteico foaforado, de carcter cido, que precipita a pH 4,6. S la designa igualmente con los trminos: casena isoelctrica y "casena de Hammarsten", por ser este
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Prtldos. C&sefna y fenmeno de la coagulacin

123

autor el primero en publicar un trabajo robre el tema (1870), aunque los primeros que describieron claramente su preparacin fueron los franoeaes .Brllconnot (1830) y Quvenne, en 1841. La parte que sobrenada del precipitado ya no contiene protenas que posean las mismas caractersticas. El valor 4,6 para el pH del mnimo de solubilidad ae comprueba tambin en el caso de otras leches. Las curvas de la figura 19 corresponden a la casena humana; son las mismas que ae obtienen con la casena bovna.

o.a

80

..
o
N

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O.D.

80

40

.. ..
o

tD0 . 4

a.

0 .2

20 Ul

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-a .

4.0

4 .4

4 .8

&.2 pH

&.8

Figure 19. Solubilidad de la easelna humana en funcin del pH. Concenlracin: O, 1 %:

0 .0 .: densidad ptica (Aiais y Jolles 1970).

Desde hace mucho tiempo se ha considerado la casena iroelctrica como una protena pura y homognea, en razn de la constancia de su composicin elemental: C e 52,96, H ~ 7 ,05, N ~ 15,65, P ~ ~ 0,85, S~ 0,72 y, por diferencia, O~ 22,78%. En realidad, ea una sustancia muy heterognea. A pesar de ello, la casena completa, robre todo la de vaca, tiene mucha importancia tanto desde el punto de vista cientfico como desde el prctico, por dos razones principales. Por una parte, es una protena de preparacin fcil; obtenida en condiciones defmidas, a partir de la leche de mezcla de varios animales, tiene una composicin y propiedades constantes; se puede pensar
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124

Prtldos. Caaelna y

ono de la coagulacin

que su collltltucin (en las fracciones a-.,11 ) ) debe aer tambin poco variable; ae utiliza mucho en el laboratorio y en la ind.uatz-iA; por el contrario, sua componentes, difciles de purificar, son an suatanciu raraimas. Por otra parte, la proporcin de caaeina entera es fcil de determinar por medios analticos simplee, Jo que no oc:urre con sus componentes, de los que se conocen slo aus proporciones aproximadu. En la leche, la casena se encuentra incluida en un complejo aalino en estado "micelar", que se comporta como suatancia homognea en la electroforesis en medio lquido; m adelante estudiaremos estas micelas, que representan la forma nativa. Para designarla se ba propuesto el trmino "caselngeno", que no ae utl.liza en Francia. La composicin de la casena iaoelctrica vara de una especie a otra, como se puede ver en el cuadro 16. En particular,la casena bumana ea ma rica en azufre, en cistina y en Jcldoe que la casena de vaca. Este hecho se considera como una de laa caui8B de la superioridad de la leche materna en la alimentacin de loa nios recin nacidos. Todas las casenu enteras que se bao analizado contienen una parte prosttica glucdica con .tzes tipos de lcidos (cuadro 16}; en lo que se refiere a la cuena de vaca, oe sabe que oe encuentran Ugadoa a una sola fraccin: la casena.
8) Proporcin. Preparacin

La cuena abunda considerablemente en la parte protidica de la leche de loa rumiantes. Su contenido medio ea de 27 g{l en la leche de vaca. Puede variar en valor absoluto pero mucho menos que la materia grasa. La proporcin de casena del total nitrogenado vara de 74 a 79% en leches normales. Se ha establecido un "n.dice de casena", cuyo valor desciende por debl\jo del 77% en lulechea anormales, especialmente en lu leches mamticas. Esta nocin ha sido abandonada boy en da. Las variaciones de la proporcin de casena en las materias nitrogenadas totales se debe, sobre todo, a las variaciones del contenido de sustancias nitrogenada no proticas. La casena y lu protenas del suero varan en el mismo sentido en una relacin butante constante. En la leche de loa animales monogatricoa,la proporcin de casena es muy variable, frecuentemente Inferior al 60:t del total nitrogenado. Veremos mas adelante (subcaptulo XV) que la compoeicin de la casena depende de la especie animal. La preparacin de la casena es muy simple, tanto en el laboratorio como en la Industria. Se precipita la leche de vaca desnatada median te un cido comn (clorhdrico, sulfrico, etc.) ailadiendo lentamente, bajo agitacin fuerte; se separa la caaena pulverulenta y se lava y seca. La Industria produce tambin la caaena tctica, por acidificacin espontnea de la leche desnatada. En el laboratorio se practica
pyr ttE'd fl'atcr di

Cuadro 16. Preparacin y compoicin de la8 divert148 CiJ$enu illoelctricos


Cuelnabvoda
Reod.lIIeAto

Cue na aiD lpldoo '(%)

Espio

. p. 1000
lecbede

materia

natada
Vaca ... .
()yeja . . . . . . . .

Cabra . .. ....

Coneja . .........
Lecho humana ... .

23,5 40 26 80-90
4-S

4,5
7,5

%de

N1traeno

F61foro

Azufre

He:m111

Hexoea-

6,5 12 25

1S ,25 15,35 15,55 15,00 14,85

0,85 0,86 0,78 0,54 0,48

0,72

-0,36 0,24 0,31

NANA
()

0,38 0,33 0,39


1,2~

0,36 0,09 0,13

1,10

2,50

2,50

0,60

(*) Acido N-acetilneuram nico

(Aiais y Joma, 1970.)

126

Prtidos. Case!na y fenmeno de la coagulacin

un redisolucin, con sosa, a pH 7 ,0, seguida de una nueva precipitacin con cido clorhdrico. La deshidratacin de la casena recientemente precipitada ae suele realizar por tratamiento con alcohol y luego con ter etlico. En algunas leches, como la de mujer, la floculacin a pH 4,6 es a veces incompleta; en este caao, una dilucin de la leche o una dilisis previa mejoran la separacin de la casena. El calentamiento al final de la acidificacin hace m completa la fioculacin. La casena, aun despus de variaa redisoluciones y precipitaciones sucesivas, contiene lpidos que ae pueden considerar ligados a la protena. Para extraerlos completamente es preciso hacer un tratamiento por medio de alcohol en caliente o cloroformo. Estoslpidos son diferentes de los que constituye la materia grasa procedente del desnatado. En el cuadro 16 constan las proporciones.

IX REACTIVIDAD DE LACASEINA. LOSCASEINATOS


Ms de la mitad de los aminocidos de la casena entera tienen grupos ionizables libres. En 100.000 gramos, ae encuentran alrededor de lOO grupos bsicos (arginina,lisina, histidina), 90 grupos de cic!os orgnicos (glutmico y asprtico ), 28 X 2 grupos de cido fosfrico (pK 2,2 y 7 ,O) y ms de 30 grupos fenlicos dbmente cidos de la tirosina. Por lo tanto, en la molcula de casena existe un notable exceso de grupos cidos que tienen un papel importante en la valoracin de la acidez de la leche. La curva de valoracin de la casena tiene puntos de inflexin que reflejan la disociacin de sus componentes, principalmente el cido fosfrico, pero no acusa los caractersticos valores de pH que corresponderan a la existencia de determinadas sales. No puede considerarse la casena como un policido ni cabe hablar de caseinato mono, di-, triclcico, etctera. No existen puntos de neutralizacin precisos. Cuando ae valora la solucin de casena en presencia de un indicador, se realiza el ajuste a un pH arbitrario. Por otra parte, la curva de valoracin depende en gran manera de la presencia de salea, aunque no posean poder tampn. Aa, cuando se valora por segunda vez un caseinato alcalino con Hct, la segunda curva no se superpone a la primera, sino que est modificada por la presencia de los iones Na y ct. Por tanto, la casena se comporta como un cido; desplaza el C01 de los carbonatos, se disuelve fcmente en las bases diluidas y tambin en las sales alcalinas, como boratos, fosfatos, ete. Para preparar una solucin neutra de caseinato, a pH 7, se necesitan 0,67 miliequivalentes de lcali por gramo de casena seea, o sea unos 6 a 7 cm3 de sosa decinormal; pero la casena puede absorber hasta 1,83 milequi valentes de lcali por gramo.
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Prtldos. caaelna y fenmeno de la coagulacin

127

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C.selna%

Temperatura

100"C

Flgur 20. Vitcosidad de las soluciones de ea.selna. CSogn Chick y Mertln).

Y' nted

al

128

Prtldos. CaMina y fenmeno de 111 coagulacin

Lu soludones de caaeinatos alcalin01 son claru; laa de loa caaeinatol alcalinot.neoa tienen aspecto lechoeo. Lu soludones conoentndu de caaeina son mu.y vbcotu. Bata vis coaldld depende del pH; para tma conoentncin del9l en caaena, el mximo de viacosidad se sita hacia pH 9,0; ms all, la viscosidad decrece como consecuencia de la bidr!ilil; el desoenso et ms rpido con sosa ~ue con amonaco. La viacoaidad de lu soluc:lonee de caaei nato a 26 C au.menta rpidamente pera conoentraclone superiores al 5 t, y clllminuye cuando la temperatura se eleva para una conoentm cln dada, como se mllfttra en la figura 20. Lu soluciones conoentradal de caseinatot tienen una gran impor tanela prctica; constituyen exoelentes collu y adheaf1101, utilizados

en la industria. Por otra pertA!, lu soluciones de alta vllco1idad pueden hUarse mediante prealn a travs de una hilera y coli\llacln in mediata en baos cidos formoladoa. Se ha obtenido u( en Italia una fibra ttxllf llamada "lanital" (antes de 1939). X COMPOSICION DE LA CASEINAENTERA
La extrema sencille: de 101 sistemas qu.e conducen al alalamiento de la caaeina denuncian su heteroceneidad; en un medio tan complejo, la simple acidifjcacin no es un procedimiento eflcu de fracciona-

miento. Tal heterogeneidad se puso primeramente de manll'letto al estudiar la solubilidad de la casena en alcohol y ddo1 dUuldoa. El uso del mtodo de electroforeais en fue lquida en el laboratorio corull)ll y precis esta observacin; sin embargo, los trea componentes descu blortos por Mellander en 1939, laa casenaa a, 11 y y, no representan ms que una etapa. Los procedimientos de fraccionamiento utiliza. dos en aquella poca (precipitacin en medio cido a diferentes temperaturaa, dilucn de la solucin de casena en urea concentrada), permitieron descubrir sustanciaa complejas, sobre todo la [raccin a, que actualmente no tiene ms que un intem hlatrico. Loa perfeccionamiento. del m~todo electrofotico han permitido diferenciar un gran nmero de fracciones. &tos perfeccionamientos se refieren al empleo de soportes con alto poder de resolucin, como los eles de almidn y de reactlVOI que provocan la disociacin molecular de componentes fuertemente liad.01 entre s, como la urea. Lo1 mtodos modemoa de comatogra!a en columna de lntercam blo in.ico, de aprosa o de poliacrUamida, de hldrnlliapatlta, de in teracclone hidrfobas o de exclusin (tamizado molecular) han per mitido buenas separacione' de loa componentes de la cuena. Todos lo que se pueden descubrir por eledroforeaia no han sido an asla dos y caracteriudos; pero en el caso de la cuena de vaca quedan poco1 annimos.

Prtidos. Casefna y fenmeno de la coagulacin

129

No se pueden dar con detalle, en el marco de esta obra, todas las tcnicas de purificacin. Precisaremos simplemente que para cada uno de los componentes importantes se dispone de varios medios que permiten alcanzar, ms o menos fcilmente, lo que se designa como "homogeneidad" de la fraccin; es decir,la pureza tal como se puede deducir de los electroforegramas a varios pH, de los cromatogramas y del anlisis de los grupos N- y C- terminales. La complejidad que aparece cuando se examina la composicin de las casenas, se aclara un poco si se tienen en cuenta las siguientes observaciones: a) Con las casenas propiamente dichas precipitan otras protenas a pH 4,6 de una manera constante; de hecho son impurezas que tienen un punto isoelctrico mucho ms elevado y que encontraremos con las "protenas solubles" (lactolina, protena roja, proteasas, etc.). b) Las modificaciones postransacionales se pueden realizar a diferentes niveles; resulta una "microheterogeneidad" (presencia de varias bandas), debida a una glicosilacin (casena ) o una fosforilizacin (casena o: 12 ) ms o menos acusada, por sistemas enzimticos en los que la regulacin no es siempre evidente. e) Las variaciones genticas afectan a todas las casenas conocidas hoy da; de aqu la posibilidad de la presencia de varias bandas para una misma especie proteica.
Noto.- Se pueden eoton\rar referencia de las t6cnieu en tu recientes reviaionl de Ribadeou-Oumu (1979, 1981).

La figura 21 representa los diagramas electroforticos de cinco

casenas; se han obtenido en presencia de mercaptoetanol; esta sustancia reductora evita la formacin de artefactos debidos a a&dciaciones al azar por "puente disulfuro" entre dos restos de cistena. En ausencia de resctivos reductores y disociantes no aparece un importante componente de la casena: la casena de vaca. Con las cinco casenas estudiadas, la adicin de mercaptoetanol modifica profundamente el diagrama de electroforesis y hace aparecer entre 15 y 20 bandas tras coloracin por el negro amido.

XI PROPIEDADES GENERALES DE LOS COMPONENTES DE LA CASEINA DE VACA

Al caractersticas moleculares
En la actualidad se admite que existen cuatro especies de casenas bovinas: o:,, , o:,,, fJ y ; sus principales propiedades se exponen en el
CopynghtC'd rnatenal

130

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

cuadro 17. Se ha aadido la casena 7 1 , conocida desde hace tiempo, pero que se ha revelado como un grueso fragmento de la casena {J.

(a)

( b)

(e)

(d )

(e)

+ ..... ~1-----tl
Figura 21. D iagrama de elec1rotoresis en gel d8 almidn (pH 8,6, urea 1 M, mercapto-

etanol 0,3 M) de las casenas de vace (a). coneja (b), mujer (e), cebra (d) y oveja (e). (1) casena a,, (2) caselna p , (3) caseina K.

Los pesos moleculares estn muy prximos unos a otros; se trata de pequeas protenas; pero es necesario subrayar el hecho de que estos "monmeros" no existen en solucin ms que en condiciones particulare, especialmente en medio alcalino. Una de las propiedades ms importantes de las casenas es la de polimerizarse o de formar complejos con otra especie de casena. Por esta raz se encuentran en la literatura datos muy fluctuantes sobre el tamao molecular. Sin embargo, los pesos moleculares aportados ms arriba, calculados se~ gn la estructura primaria, pueden considerarse como definitivos.

Copynqht

rrta!enal

Cuadro 17. Principales caracterrtic<u de los comporumtes mayores de ID leche de uaco*


Ca~enl a 11

Ca..IIUI a

12

Cuena/t 34 24.000 209 0,56 (S)

c..."""
13 19.000 (pept.) 169 0,20 (1) S 2 20

c...lna-y,
3 21.000 181 0,16 (1)

Proporcin meda % Mua molecular N" restos aminocidos Fsforo % (tomosjmo1) Glcidos% CisteiiUI, restos/mol Prollna Sensibilidad al calcio Senslbil. a la quimosina (**) Variantes pntcu Hldrofobicidad (en U) Grupos cidos (As!> + Glu + Px2) Grupos bsicos (Lis+ Arll +Ha>

36 23.600 199 1,10 (8)

o o

10 25.250 207 1 ,23-1,60 (1 013)

17 ++ +

2 10 +++

o o

o o

A,B,C, D
4,89 48 25

A,B,D
4,64 49-55 33

A1,

35 + + ~. A3 , B,C, B 5,66
31 20

34
1 A 1 , A2 , A3 , B

+++ A,B 5,30 18 17

16 16

Datosparalasvarianteso11 - B,o, 2 - A,Il-~,K-ByyA 2 +:reaccin lenta imperceptible en el momento do la coagulacin ordinaria.

132

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

Las dos fracciones ms abundantes, a,, y /l, o sea el 70% del conjunto, forman un bloque insoluble en presencia de calcio. La casena K es una fraccin ponderalmente menor (13%) que permite la existencia del estado disperso que estudiaremos ms adelante. Las proporciones que se Indican son aproximadas, ya que no se diapone an de buenos mtodos para dosificar los diferentes componentes de la casena. La electroforesls en gel, la cromatografa sobre hidroxiapatita, la determinacin de aminocidos terminales y la dosificacin del cido silico (para la casena K ) no permiten obtener valores precisos.

Bl Polimoisrno
Todas las casenas citadas existen bajo diferentes formas genticas; para la casena K se han encontrado hasta el momento solamente dos variantes, las otras tienen de 3 a 6. Se ha observado una estrecha dependencia de los k>ci que controlan el polimorfiamo. Las casenas de la leche de vaca son probablemente sintetizadas por un grupo de 4 genes estructurales contenidos en el mismo cromosoma (Grorclaude y colab., 1979). El cuadro 18 resume las sustituciones observadas en el caso de la leche de vaca. Para la casena 1}, la variante D, y para la casena la variante C, no han sido encontradas en la especie bovina.

a,,

C) Composicin en amino6cidos y estructura primaria El cuadro 19 muestra la composicin de las casenas citadas anterior mente. Si se separa la casena a , 2 , se destaca la elevada proporcin de aminocidos no polares, con un porcentaje de prolina muy alto. Tam bin se pone de manifiesto la ausencia de cistena en los compohentes dominantes a , 1 y jj. Estas dos molculas no pueden intervenir en asociaciones por puentes disulfuro; por el contrario tienen muchas posibilidades de enlaces hidrfobos. Se conocen todas las estructuras primarias; se representan en las figuras 22, 23, 24 y 26. Sern comentadas ma adelante. Consideran do los dos tipos de datos, no se puede concluir que se trate de un gru po homogneo. Hay ciertas partes con secuencias homogneas (ver ms adelante en F, la ms caracterstica); existe tambin el hecho de que los pptidos "seal" (no representados aqu) son casi los mismos; y estos hechos han servido de argumento a la hiptesis de un origen filogentico comn. Sin embargo, si esta hiptesis es correcta, implica un gran nmero de mutaciones en el perodo que ha seguido a la divergencia de las casenas, que es relativamente corto en la escalada biolgica. DI Fosforilizacin El fsforo de la casena se encuentra bajo la forma de monoster or tofosfrico de un aminocido hidroxilado, cuando este se encuentra
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Prtdos. Casena y fenmeno de la coagulacin

133

en una "secuencia c6digo", que ha sido puesta en evidencia por Mer cier (1981): -Ser-X-Giuo -5er-X-Ser(P)(Tr) (Tr)

Se aabe que la fosforilizacin es catalizada por una protena kinasa independiente del AMP-dclico, en la ~ula. a nivel del cuerpo de Gol gi. La enzima tiene una afinidad sealada por el cido glutmico en posicin n+ 2, mientras que la afinidad por el cido asprtico es esca sa. Glu es un emplazamiento primario; la serina ya fosforiliu.da es un

Cuadro 18. Polimorfismo gentico de /4$.casenas de

UIIC4*

A**
l. Casena a. 1 Posicin 53 Posicin 192 Movilidad

8
Ala

e
Ala

D
Tr. P. Glu 1,13

Ala Glu 1,18

Glu 1,lO

Gli 1,07

Al
2. Casena 11 Posicin 35 Posicin 36 Posicin 37 Posicin 67 Posicin 106 Posicin 122 MoYil.idad Ser. P. Glu Glu
His

Az
Ser. P. Glu Glu

Al
Ser. P. Glu Glu
His

8
Ser. P. Glu Glu
His His

e
Ser. Glu Lil
His

Ser. P. Lil Glu

Pro
His

Hls
Ser 0,80

Hls
His

Ser

ser
-

Gln

His

Arw
0,76

Ser 0,70

Ser

8
ne Ala 0,52

3. Casena K Posicin 136 Posicin 148 MoYil.idad


minal.

Tr.
Asp.

0,59

Posiciones segn Grosclaude y colab. (1972), a partir de amlno4cido N-ter MoYil.idad electrofor6tica a pH 8,6, aesn Walcey Y Baldwin. Las -!antes /l-A 1 , A 2 y A 1 se separan en medio tcido. . La variante a -A se distinsue de las otras por una sustitucin de loa restos 11 14 a 26.

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134

Prtidos. C3selna y fenmeno de la coagulacin

Cuadro 19. Composicin en aminocidos de las casenas de vaca (nmero de restos por molcula)

a.,
(o) Acldo asprtlco (g) !S (8) Treonina S Serino (e) 16 (8) Acido glutmlco (f) 39 (14) ProUna 17 Glicina 9 Alanina 9 1/2 Cistina o V aUna 11 Metlon. na i 5 11 lsoleucina Leucina 17 Tirosina 10 Fenilalanina 8 Tript6fano 2 l..i$ino 14 Histldlna S Arinina 6 Total a) b) e) d) 199

a,2
(b)
18 (14) !S 17 (1013) 40 (1 S) 10 2 8 2 14 4 11 13 12 6 2 24 3 6

/l
(e)

1,
7 (3)

(d)

9 (S) 9
16 (S) 39 (22) 34

S
19 6 10

22
4

11 (7) 14 13 (2) 27 (17) 20 2 !S 2 11 2 13 9 8

8
11 (1)

32 (22)
33

4 S

9
1 11 S 4 209

4
1

9
3 S 169

17 6 7 19 4 9 1 10 S

2
181

207

Variante B, (Mercier y colab., 1971) Variante A, (Brinon y colab., 1977) Variante A2 , (R.ibadeau-Dumu y colab., 1972) Variante A, (Jolles y colab., 1972)

e) ( ..): fosfoserina f) ( ... ): alutamina g) ( . . .): asparaina

emplazamiento secundarlo. Esta secuencia tripeptdica es una condi cin necesaria pero no suficiente, ya que pueden intervenir otros fac tores estructurales. Por ejemplo, la regla no se cumple en el caso de la casena K; varias treoninas en posicin conveniente no son fosforiliza das; la causa es probablemente un impedimento estrico debido a la existencia, en las cercanas, de una cadena glucdica.
E) DesfosfOf'ilizac:in

l. Las fos{atasas

Diversas fosfatasas son aptas para liberar el cido fosfrico y regene rar la cadena original de la serina y de la treonina; corrientemente se utiliza para este ftn la fosfatasa de la patata. La leche contiene una fosfatasa alcalina que al parecer no tiene accin sobre la casena nati va; por el contrario, puede desfosforilar la casena aislada; pero esta actividad ocurre a un pH ptimo de 6,8, muy inferior al ptimo que
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Prtldoe. Caelna y~ de la coagulacln


a1

135

dta habitualmente .m este enzima: pH 10,2, y el porcentaje de detiOiforilacln no rebua el 20% en preeencia del !Olfato libendo (podra acerame al 100% &i ae hubiera eliminado el !ce!ato Inorgnico, que tiene un efecto inhlbldor).
2. L4/HttHilmllulcl6n El Ntto !oe!rico ae elimina .fcilmente de le aerlna en medio moderadementa alcalino (0,1 N NaOH a so e. El calentamiento en medio neutro tiene el miamo efecto. No ae trata en eete cuo de hldrllm sno de una decradadn de le cadena lateral de le .erina elluetituyenta f\jado en el carbono (C.S) ee ~e.m (le mima eliminacin ae produce en el cuo de gllcoprotenu), con creacin de un doble entece. La aerlna ee tranaforma en dehidrolnlna, que ee cauea de una tuerta ablorcin eepectral eepeciticada a 241 nm, que aprovechada analticamente por Ice bioqumtcoe. La dehldroalanina et lbil inducir le formacin de puentes covalentes, eepeclalmente con la IWna pera formar le li&ino-alanlna.; cuyo &iltema de formacin eetudiaremce con Ice efectce de calentamiento.

F 1FOifop6ptidos Cuando hdrolizan

na, bipa!na, quimotripalna), 1e ot.erva la formacin de ~ptldos reaidualea, cuyo tamao no puede reducirse. Son rico en !aforo, basta el 6t. Sue lalet con lot metales di y bivalentea aon eolublet en el medio inteat!nal; ae w considera importante. deade el punto de vista de la nutricin mineral. Los fos!opptidos y las catefnu de les que proceden, tienen la propiedad de catallzar la oxidacin nl.pida del hierro terroso a frrico en presencia de oxgeno y formar complejce estables con loa reatos fosforiledoa. Eatoa foafopptidot (o "fosfopeptonu") contienen eaencllmente loa 2 pptidce tetrafosforados homlogos que ee encuentran en las dce caeenu cuyo encadenamiento 1e representan en w figuras 22 y 24, y ee upone a continuacin:
63 64 65 66 67 68 89 70 Caseno a ., ...GtuSot(PlIISot(PISer(P)Sot(P)-G iu-Giu
Caserna~

w casenas por w proteuaa dlaettlvaa (pepsi-

... GluSer(PILtuSar(PISer(P)Sit(P)-Giu-Giu .. 14 15 16 17 18 19 20 21

XII LAS CASE INAS


A) C.eelna cr,,

Cuando ee demostr la heterogeneidad de la Mtigua fraccin a por electroforesil en medio dieoclante, la parte m mvil so denomin

136

Pr6tldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

a, en razn de su sensibilidad al calcio a todaa laa temperaturas. La situacin se complic al observar que en la misma zona migraban varias protenas y descubrir en algunas de ellaa la existencia de variantes genticas.
10 20

H.Arg-ProLisHisProlltLis HsGin -GIILeuProG1nf31uVai Leu-AsnGiuAsnLeu

30

40

Leu ArgFen Fen ValAlaJ,Pro .f en Pr oG In Val Fen-Gii LisG fuLisVi iAsnGiuLeu


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Gh {varianle C)

Figura 22. Estructura primaria de la casefna

encuadradas: hay una delec<:,i n de 14 a 26 en la variante A. (Mercier y colab .. 1971),

a 51 -e. Las variantes genticas estn

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Pr6tldos. casalna y fenmeno de la coagulacin

137

La banda ms importante y la ms mvil que se obeerva en el curso de la electrotoresia en gel a pH 8,6 represe.n ta la cuena a, 1 El cuadro 17 muestra que la casena a., contiene 8 tomos de fsforo por molcula, pero la variante D contiene 9, pues la auatitucin, en posicin 53, de Ala por Tre, crea una nueva posicin. El contendo en fatoro ea por lo tanto elevado; sin embargo, es menor que en las fosvitinaa del huevo. La compoeicin en nmero de restos de aminocidos por molcula (cuadro 19) pone de manifiesto un claro predominio de loa grupos cidos (7 Aap, 25 Glu, 8 P) sobre los grupos baicos (14 Lis, 6 Arg, 5 His). La proporcin de cadenas laterales no polares es elevada; es una protena hidrfoba, (aunque menos que la casena ll) y sensible al calcio a todas las temperaturas. La molcula est constituida por una simple cadena peptdica, como se ve en la figura 22; existe una regin hidroflca, entre los restos 45 y 89, donde se encuentran reundos ms de la mitad de los grupos cidos y 6 de loa restos fosfricos, agrupados en dos partes (4648 y 64-68). Se sebe que se encuentra el mismo ordenamiento en la caaena ~-Otras relones son ms o menos hdrfobu. La prolina (17 restos) est repartida con bastante unformidad a lo largo de la cadena; es, por tanto, poco probable que en solucin exista una estructura secundaria regular en esta molcula. En ella, esta conformacin al azar hace pensar en una protena desnaturalizada; sin embargo, la estructura debe ser ms compacta, como consecuencia de las Interacciones ldrfobas. De las cinco variantes genticas conocidas actualmente, la variante B es en mucho la ms frecuente. La variante D ha sido descubierta en la raza flamenca y por su movilidad se la sita entre A y B; contiene un solo grupo fosforco, que est ligado a la treonlna de todas las casenas. La variante A es muy rara; se ha descubierto en U.S.A. en una J. nea de la rua Holsteln; mientras las otras variantes se distinguen por una simple auattucin, sta se caracteriza por una deleccin importante; en la parte N-terminal de la molcula faltan 13 restos de aminocidos; por Jo tanto, no se puede considerar como una variante en el aentido habitual del trmino. Se trata de mutaciones probablemente recientes y no simultneas. La variante A tiene propiedades fisicoqu mi.caa sensiblemente diferentes de las otras tres variantes. La casena a, 1 -A ea soluble en presencia de calcio a baja temperatura (como la casena 11), y las micelas que la contienen estn menos hdratadas y aon menoa establea que las formadas con las otras tres variantes. Ta.mbin se han obeervado diferencias en la coagulacin cida de la leche, mediante cultivos lcticos, cuando est presente la variante A. Se ha designado como a,0 a un componente menor, que migra un poco antes que a 11 y que parece ser idntico a este ltimo, salvo en

y h !d 'Tlatenal

138

Prtldoe. CaMina y lwlm<o de la 0011gulacln

que poeee un pupo foafrlco euplementarlo en potldn 41. Al pereoer u11te en todoe loe rumiante. una cueDa ..., ID va.rl01 ~01 de fOiforiltdn . lA antlua ~na a, (que corre.pollde por lo tanto a a,, + a 12 ) po-una propiedad particular, el"quimlotactlamo"; atrae a divenu ~lulu, como loe leucocllol. Enlle et1o1 wtimoe 11 encueotrao loe macrtaoe, que llevan eobre su membrana receptoree eapecticoe de esta cuena; probablemente intervienen pua reablorber lu cuenu en la J)ndula mamaria tras el ceee d.e la lactacin.

B) C..lne a,1

1Aa bandu aecundarlaa que mlran en el C\11"10 de la electrofo,.. a pH 8,6 entre la caeena a, 1 y (J haban aido denomlnldu a 12 , a,,, ... a,. . Se ha comprobado que las auatanciu correapondientee eran idnticu en IIU eatructura primaria y no se dlstinuan m que por el nmero de IJUPOI foefdcoe, que varia de 10 a 13 por molkula; una de eetu IIUitanciu (a.s) -a un dmero con, por lo menos, un enlace
dlaulfwo. La cuena a 11 est compuesta por 207 amlnoddo1, dos de loe cuales 10n cistenu. FAte hecho, junto al t.jo coaten.ldo en prolina y la d6bD bldrofoblcldad, la diltlnuen claramente de lu otras casenu sensibles al calcio, a pesar de que sea la m IIDiible a elte catin y que, como tu otru dos, sea estabilizada por la cuena" en medio clcico. A causa de la variacin del contenido en re~lduoe foafricoe, el peeo molecular va de 26 160 a 26 390. E1 po1ible que contenga tambin glcidos. En la !iura 23 ae representa la secuencia de la variante comn A. SI 11 alinean uno debajo de otro dos largos fnmentoe de 76 aminocido (60-123 y 132-207), se oblerva una destacada almilitud; el 38 t de los reetos eon idnticoe. &te hecho podra algniflcar que esta cal8!na tiene como origen la duplicacin de un gen primitivo. El deecubrimiento de una variante D en do ruu (ranoeu (Montb61iarde y Voagienne) ha pueato de manifiesto una fuerte deleccin; faltan 9 aminocidos que forman un pptido ml.IY cido (8 foa!atoa + + 2 Glu). Ea el segundo caao, tras a, 1 -A, de una delecdn notable en hu caaeinu. El ncleo de 3 fosfoserinu + Glu se encuentra dos veces en a,1 y una vez en a 11 y (J. Es un ejemplo de la ine1tabWdad gentica da 01te pptido en lu casenu (Gro.c14ude y colab., 1979). Gracias a la presencia de cistena, lu molculu de cueina o:.., pueden asociarse en dmeros, que a au vez se agJegaJin entre ellos por medio de lnteracclonea electrostticu, para formar polfmeroa.

Prtidos. Caserna y fenmeno de la coagulacin


10 20

139

30 40 l isGln G1 LlsAsn M Ala lleAsn ..Pro Ser LisGiu AS;n LeuCisSer TreF en CiS u tt 50 60 Lis-G fuVal.ValArg Asn Ala AsnG fu -G fu ~G,-11u-T;-,.oS. 1"'1o -G"'Ii r=""'t'"""' -;G:;-, Glu , -' "'" " "" r=r 1
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190 200 .Lis.T,~.V al TirGinHsGI n LisA la M LisPro Ttp-1 le-G In Pro Lis Tre LisVal et

207 lle-Pfo. TirVaiArg TifLeu.OH.


Figure 23. Estructura primaria de la casena a 12 A (encuadrada la deteccin de la variante 0). (Brignon y colab., 1977).

C) Casena X Se trata de un enigma "histrico-bioqumico", que quiz se resuelva pronto. Esta casena apareci er la literatura hace 25 aos y nunca ha sido plenamente identificada. La hemos situado en este punto porque hoy da se piensa que no es una casena original; podra ser
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140

Prtldos. Caaefna y lanmeno de fa coagulacin

uno o varios fragmentos de la caaena cru ; parece ser idntica a los productos de digestin de esta ltime caaena por la plaamina, proteua que exiate naturalmente en la leche. Es bastante rica en f6eforo (1,32 %). Alguno autores la dotan de ciltena y de glcidoe, lo que no clarifica en absoluto la cuestin.
~ Y

XIII LACASEINA

LAS CASEINAS 7

A) La ceselne ji
Presenta analogas con la cr, 1 : peso molecular prximo, cadena peptdica nica, no contiene ciltena ni glddoa; tambin es rica en proJina, muy hidrfoba y sensible al calcio. La eatructura primaria de estu dos cuenas (ftgUrU 22 y 24) pone de manifiesto aecuenclu homlogas, en particular el aorprendente foafopptdo que se ha citado anteriormente (Xl, F). La casena ji no es sensible al calcio m. que a la temperatura ambiente, hacia 20 oC y por encima de &toa. A baja temperatura, por deblijo de 10 oC, permanece aoluble en presencia de calcio. Ea cie. to r que cambios de temperatura dbUes deben provocar cambios marcados en la eatructura espacial, pero estas "transconformaciones" no estn determinadas de una forma clara. El contenido en prollna es ex. cepconalmente elevado: un resto de cada seis es Pro. Estos restos estn repartidos con bastante uniformidad y no se encuentran segmentos que contengan m de dos de ellos seguidos; se puede resumir que la caaelna {1 en aolucin no tiene estructura secundaria del tipo hlice cr o poliprollna. La casena P es an m hidrfoba que la casena "" ; la proporcin de cadenas laterales no polares es del 53%. Por el contrario, es menos cida, slo contiene 5 grupos fosfricos por molcula; 4 de ellos ae encuentran en el mismo enlace que en la casena cr, 1 Lascargas estn repartidas muy irregularmente a lo largo de la cadena peptdica. La regin N-terminal es fuertemente hidrfila y cida, mientras que la regin e-terminal es muy hidrfoba y tiene un papel esencial en la polimerizacin de esta protena. La importancia de los grupos stere. foafricos, en lo que se refiere a ciertas propiedades de las case[nas, se ha demostrado perfectamente con la casena /l. Tras deefosforUacin enzimtica, pierde su sensibilidad al calcio y ae vuelve capaz de impedir la precipitacin de la casena a, 1 por el calcio, pero con una menor eficacia que la casena. En lo que ae refiere al polimorfismo entlco,la casena ji presenta una particularidad; la variante A, tal como se ha revelado por electroforesis en medio alcalino, comprende en realided tres formas que solamente se separan en medio cido, A1 , A1 , A,. Una variante D se ha encontrado en la leche de ceb.
aLiena!

Prtidos. Caselna y fenmeno de 'la coagulacin

141

En la leche de otros rumiantes se encuentran casenas ti prximas a la de la leche de vaca. En la leche humana, lo esencial de la casena entera est constituido por una ca.ena fj, que muestra similitudes con las anteriores, pero fosforiladas en grados diversos; tio no lleva ningn grupo fosfrico,, lleva cinco y se conocen ls compuestos intermedios, lo .que puede indicar una fosforilacin progresiva. La secuencia 11 a 21, que contiene los emplazamientos, es casi idntica en las diferentes casenas estudiadas; lls -humana no tiene ms que dos &U8tituciones de aminocidos en esta zona en relacin con las ti-bovina, y stas se hallan aparte de la secuencia de las 4 serinas fosforiladas. La casena /l puede considerarse como una apreciable fuente de protenas y de pptidos formados por diversas proteasas, ya sea en la misma glndula mamaria, ya sea in vitro. El apartado siguiente y el subttulo XXVIII se consagrarn a los componentes normales de la leche derivados de la casena ti. Entre Jos pptidos interesantes de este origen se encuentran sustancias fuertemente amargas, que consideraremos en el captulo que trata de la quesera. Pero tambin se encuentran sustancias de activida des biolgicas especficas; tal es el segmento 60-66 de la casena 1J (Tir-Pro-Fe-Pro-Gii-Pro-lle) que se encuentra en los hidrolizados de casena cinpleta y que t iene una actiyidad anloga a la de las "opiatas"; este pptido se fija en los receptores de las endorfinas; por ello se .le ha denominado "/l-caseomorfina".

Bl Las casenas r
Se ha visto que Mellander (1939) separ este componente de la casena bovina entera; pero por razn de su dbil contenido en fsforo (0,1 %) y de su dbil movilidad electrofortica en medio alcalino, en donde se sita en la zona de las inmunoglobulinas, durante mucho tiempo se ha considerado a la casena r como una impureza. Por otra parte, esta casena tena un comportamiento especial en determinadas circunstancias; es ms soluble que las otras casenas en diversos reactivos, como la urea y el etanol; cuando se trata la casena completa con alcohol para deshidratada, se produce una prdida de case{ na r. De hecho, se puso de manifiesto rpidamente que esta casena r era una mezcla de pequeas protenas. Una fraccin denominada TS (hoy da casena r 2 ) tiene la pro piedad de no dar una solucin lmpida ms que a baja temperatura y a pH 8,6; cuando se recalien ta la solucin, se enturbia. Tras un decenio de investigaciones, hoy se conoce el origen de las tres casenas -y. Han sido Gordon y colaboradores (1972) quienes han mostrado que eran fragmentos e-terminales de la casena /l, tales como se representan en la figura 25. Se seala que las roturas se realizan tras una lisina, y se poda pensar en la accin de una enzima tipo tripsina en la misma glndula mamaria. La proteasa alcalina nativa de la
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142

Pr6tdos. Casena y fenmeno de la coagulacin

10 H.ArgGiu Leu-GIu -GIuLeu Asn Val-Pro- Gli -Gful leVaiG1u

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209 Vai Arg G1 Pro F en Pro 1 lleVIIOH i le

Flgura 24. Estructura primara de la caselna p -A1 (RibadeauOumas y colab .. 1972).

CopynghtC'd rnatenal

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

143

leche es probablemente la encargada de esta rotura; por otro lado, la plasmlna, que se considera idntica a la proteaaa de la leche, es capaz de esta rotura In uitro. Los segmentos N-terminales complementarios seran tres de las cuatro proteoeas-peptonas, sen Andrews (1979), que se estudiarn ms adelante. Es curioso comprobar que la plasmina es tambin activa sobre la casena a ,2 , pero con este substrato, la ruptura es mucho ms acusada, hasta el punto de no hallarse loa fragmentos por electroforesis. No se sabe por qu la casena /l no sufre ms que tres rupturas de enlaces peptdicoa. La casena 7 1 no lleva ms que un grupo fosfrico; las otras dos no poseen ninguno. Se encuentra el polimorfismo de la casena /l cuando el emplazamiento de sustitucin est en el encadenamiento de estas sustancias.

XIV LA CASEINA

A) Propiedades y ca111Ct81' rtices


Entre las diferentes fracciones que constituyen la casena entera, la casena K ocupa una posicin excepcional, a pesar de su proporcin relativamente pequea, del13 %. y ello por las siguientes razones : l. La casena es soluble en presencia de calcio a todas las temperaturas. Cuando se adiciona a una solucin de casena completa a pH 7 y a 20 c, cloruro de cal a concentracin de 0,4 M, el complejo se disocia, las casenas a, y {J precipitan, y la casena queda en el lquido que sobrenada. 2. La casena posee, sobre las otras casenas, un poder estabilizante frente al calcio. Tiene el papel de "coloide protector"; permite la formacin de micelas estables en presencia del calcio. 3. La molcula de casena contiene un enlace Fen-Met muy lbil; constituye el BUStrato eaiJ('cfico de la quimosina (cuajo) en el cuno de la fase primera que precede a la coaulacin de la leche. 4. La casena K contiene dos restos de ci8tena por molcula en estado nativo. En el curao de la preparacin se forman al azar puentea dsulfuro y ae observa una zona difusa en loa diagramas de electroforesis. En presencia de reactivoa reductores, esta zona se resuelve en bandea clarea. 5. La casena contiene glcidos; laa proporciones medias en la sustancia preparada por el mtodo de laa precipitaciones son:

- Galactoaa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,3 % - Galactosamina . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . , . . . 1 ,4 %


-Acldo N-acetneuramnlco (o silico) .. . ... , . .. 2,0%
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1
Ls Lis
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Pp 8 Ir)

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(PM. 11.800)

Arg

Lb
105 Proti!O$l.peptona 5

Hs
106111 Caseina7, (PM t t .800)

Val
209 (104)

Arg

Lis

Glu

Val
209 (102)

107 108(1) Protoosapeptona 5 (doblete) Casena73 (PM. 11 .500)

Lys 29 (1)

Lvs
107 (79)

a
3

Proteosapeptono 8 ( 1)
Figure 25. Formacin de las casenas "f y de las proteosas peptonu 1 expensas de la
4

casolna

p (r: rapida; 1: lenta).

Prtldos. Casena y fenmeno de la coagulacin

145

A esta composicin particular se debe un tipo especial de hetero

geneidad, puesto que el nmero de restos glucdicos fijados en la cadena peptdica puede variar, lo que explica la presencia de varias bandas electroforticas, correspondiendo la ms lenta a la protena desprovista de glcidos, y las ms rpidas a la protena que lleva de 1 a 5 grupos prostticos glucdicos. Esta heterogeneidad se encuentra en las dos variantes genticas conocidas, A y B, que se distinguen por una doble sustitucin (cuadro 18).
B) Estructura

Se ha establecido la estructura primaria completa de las casenas K de varias especies animales. La de vaca (figura 26) lleva 169 restos de aminocidos, lo que da un peso molecular de 19 000, menor que el de las casenas sensibles al calcio. El aminocido N-terminal no puede determinarse por Jos mtodos usuales; se trata del cido pirrolidn-carboxlico, ~orma cclica del cido glutmco, que se establece probablemente tras la secrecin. Se conocen dos variantes genticas separadas en el curso de la electrofore&is (cuadro 18). Esta cadena ofrece un ejemplo de polimorfismo llamado "silencioso" en el caao de las casenas " de bfala y de ceb (muy semejantes a la de vaca); en posicin 135, hay una sustitucin de Tre/lle, que no es revelable por electroforesis. La protelisla limitada de la casena" por dbiles concentraciones de quimosina, ha facilitado mucho Jos estudios estructurales, gracias a la ruptura especfica del enlace 105-106 (Fe-Met); de este modo se forman dos partes muy diferentes, un gran polipptido que representa alrededor de 1{3 de la molcula, que constituye el lado e-terminal, y una protena residual de baja solubilidad y marcado carcter hidrfilo, que constituye el lado N-terminal. El polipptido tiene un marcado carcter hidrfilo; la protena residual tiene carcter hidrfobo y una estructura espacial ms ordenada; por ello, la casena es una molcula tpicamente "anfifila". El "caseinopptido" (tambin denominado "caseino~lico-ppti do") se forma a partir de una secuencia de unos 65 aminocidos, la cuarta parte de los cuales son hidroxiaminocidos, repartidos con bastante regularidad en la regin media. Esta parte de la molcula tendra un poder de solvatacin que explicara las propiedades l!"tabilizantes citadas anteriormente, sobre las que se volver a tratar. Por otro lado, se pon.e de manifiesto que este largo pptido est desprovisto de varios aminocidos (Cis, Fen, Tir, Trp, Hia, Arg) y que la variacin gentica est localizada. Todos los glcidos estn fijados sobre este pptido, as como el nico resto fosfrico . La parte insoluble o "paracasena K" es ms hidrfoba que la precedente; predominan los restos bsicos; la carga neta es positiva, con-

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148

Prtldos. Casefna y fenmeno de fa coagulacin

trar!amente a la del pptido y de 1aa caaenu, y eata a\lltancia migra hacia el lado opuesto (hacia el ctodo) en la electroforeaia en medio alc:alino. Al iua1 que laa otras cuenu, la caaena ea rica en prolina, cuyos reatoa parece que estn repartidoe con butante reularidad, lo que limita laa poaibilidadea de una estructura secundaria recular. Por otro lado , resaltan en esta protena duplicaclonea y repeticiones de aecuenciaa.
10 20 PltoG fu ..0 fu..O lnAsnG In G1 GinProlleArv Cls G1 U lAIP.OIuArgF enFtn&r AIP u U
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Figura 28. Ealructura primaria da l a caserna K(Jollt y col abo., 1972; M.,clor y colabs . 1973).

yr hted 'llate

PI'tidos. Casena y fenmeno de la coagulacin

147

Cl La parte prosttica glucfdica En la casena K de vaca no existe ms que un emplazamiento de fijacin, mediante un enlace 0-glucosdico que fija un resto de treonlna de la parte caseinoglicoppt!do y la N-acetil.galactoaamina. Los restos osdicos pueden encontrarse en diferentes secuencias, ramificadas o no, por ejemplo:
(133) Tr.()-GaiNAc(31)Gai(32)NeuNac (133) TrOGaiNAc(3 11Gai(32)NeuNac L _(62 )NeuNac

En todos los casos, la galactoaamina est ligada a la cadena peptdica, y el cido neuramnico es terminal (Fournet y colab., 1979). En la casena K del calostro de vaca hay dos veces ms osas que en la de la leche, y 2 3 emplazamientos de fijacin; adems existe otra osamina: la N-acetll-glucoaamina; este componente desaparece en el curso de la maduracin de la protena, al final del perodo calostral. La casena K humana est mucho ms fuertemente glicsilada (5 veces m,a) que la de vaca, con 10 puntos de fijacin, pero siempre en la parte caseinoglicopptida. El papel de la parte glicnica est mal definido, independientemente del hecho de que aporta un gran nmero de grupos hidrfilos. Es posible que ayude a la protena a adoptar determinada estructura espacial, gracias a los enlaces hidrgeno o inicos. El cido neuramnico puede ser separado mediante una glucosidasa especfica (neuraminidasa) o por hidrlisis cida dirigida. Cuando se practica esta .ltima sobre la casena entera no se observan cambios notables de las diversas propiedades: diagrama de electroforesis, solubilidad a diferentes pH, viacosidad, sensibilidad a la quimosina. Existen reacciones antignicas cruzadas entre el caseinoglicopptido y las sustancias de grupo sanguneo N. Las estructuras de las par tes glicopeptdicas son comparables. Las casenas de los otros rumiantes conocidos muestran mucha afinidad estructural con la casena K bovina. Se encuentra la glicosilacin en diferentes grados; pero los contenidos de clstena y de fsforo pueden ser ms elevados. Por ejemplo, en la casena bovina hay 3 cistenas y 2 grupos fosfato, y la cadena peptdica es 2 unidades ms larga; se cuentan 26 sustituciones a lo largo de las cadenas, o sea, una . homologa del 85 % En la casena humana y en la de la yegua existe una fraccin correspondiente a la casena ; pero las diferencias con las casenas de los rumiantes son bastante grandes; a pesar de que el contenido en glcidos sea poco importante, la hidrofobicidad de la parte glicopeptdica es ms elevada.
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146

Prtidos. Casefna y fenmeno de la coagulacin

D) Observaciones filognicas Existe una destacada similitud estructural entre las casenas K y la ca sena peptdica que forma el fibringeno ., del suero sanguneo (P. Jo 1/s, 1978). Los dos restos de ci8tena se encuentran en posiciones parecidas; una larga secuencia que rodea el enlace sensible a la quimo sina, en la casena es homlogo a una secuencia de flbrlngeno.,. Desde el punto de vista de la estructura espacial, las partes N-termina les de las dos protenas muestran tambin similitudes con varias lar gas regiones en hlice a y algunas hojas (j. Los grupos glucdicos estn asimismo ligados a nivel de llturns. Se habla del "dominio casena K" en el fibringeno ., . Diversas consideraciones permiten pensar que la casena K , que es una protena relativamente joven (los mamferos aparecieron hace 90 millones de aos), es el resultado de una evolucin de la cadena del fibringeno ., , permitiendo la adaptacin a nuevas funciones.

XV ASOCIAClON DE LAS CASEINAS EN AUSENCIA DE CALCIO. PO LIMEROS Y COMPLEJOS

Al Propiedades asociativas La diversidad de grupos laterales de los restos aminados que forman el encadenamiento peptdico (restos apolares, polares, cargados o no disociados) explica la tendencia general de todas las protenas a aso ciarse en solucin acuosa mediante enlaces salinos, hidrgeno o hi drfobos. La mayor parte de las "esferoprotenas" (protenas globu lares) se encuentran por ello en forma de oligmeros, dicho de otra manera, de complejos que renen un pequeo nmero de molculas: 2, 3, 4, etc., y por lo tanto de masa molecular limitada. Las casenas se comportan de otro modo, y entramos con este estudio en un cami no difcil; es en esta parte, en la frontera entre la bioqumica y labio fsica de la ciencia de la leche, donde se encuentra el mayor nmero de resultados difciles de interpretar y muchas veces contradictorios. Anteriormente se ha sealado el hecho de que una de las propie dades ms destacadas de las casenas a., {J y K es pode.rse asociar para formar polmeros o complejos. La situacin es muy diferente segn que el medio contenga calcio, como la leche, o no lo contenga. En el primer caso,los complejos temarios forman micelas que se estudiarn en el prximo apartado . La formacin de polmeros y de complejos puede estudiarse por diversos mtodos fsicos. La ultracentrifugacin analtica muestra que el complejo se comporta como una sustancia homognea (en una mezcla sin asociacin habra varios "picos"); permite seguir el grado de polimerizacin segn el coeficiente de sedimentacin. Los mto
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Prtldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

149

dos pticos permiten tambin observacionet interesantes, especial mente la eepeetrofotometza diferencial. Ocurre lo mlamo con los mtodot vlaoosimtrlcos. El c&Jculo de los parimetzos termodinmicos (entalpa y entzopa) muestra que las uociaclonet entze caseinu 18 reallurn eobre todo por enlaces hidrfobos, del tipo de los de Van der Waals. Estos reaultan de interaccione. de los rupos no pola rea que son etpecialmente abundantes en lu casenu, en w que representan del 45% (a, 1 y K) al 53% (P) de loa grupot lateralet. Loa espectros de resonancia magntica nuclear confirman ette tipo de estructura. Se ha demoatzado, para los agreados de casena K, que loa lfUpol aromticos y la mayor parte de los otros grupos no polares Uenen una movilidad mclecular muy reducida , mientru que los gru pos hidrfilos poeeen una gran movilidad. Al parecer, la ett.abilidad de los complejos no .e debe a enlaces inic:os, porque stos subsisten con valorea de pH muy diferentes, para los cuales vara mucho lacar ga net.a de loa componentes. Sin embllrl!o, la casena o,1 puede for mar enlaces electroattlcos. Loa reactivos "diaociantea", como aquellos de loa que se ha hablado con motivo de la electroforeais de lu caseinu, provocan la ruptu ra de loa enlaces hidrfobos ain afectar los e nlaces covalentea. De ello resulta la despolimerizacin o la disociacin. La disociacin se produ ce tambin sin reactivos, a valorea butante elevados del pH, entze 10 y 12, en la zona de valoracin de dos aminocidos importantes, la tiroaina (carcter cido) y el grupo arnnico libre de la litina (carcter blco). Laa eeociacionet y dlaociaciones no se hacen de la mltma forma para cada una de lu casenas principales cuando estn en solucin. Dlnrlbucln de las cargas y de la hdrofoblclded Loa valorea globales de la hidrofobicidad y de las cargu de lu mol culu de casena se han indicado en el cuadro 17, pero ello no ea su ficlente para apreciar laa propiedades asociativu de estas molculas. Por ejemplo, las casenas o,, y K tienen indiCN de hidrofobicidad prximos y ain embaqo su comportamiento en eolucin es muy di rerent.e; ello se explica si se coJUidera el reparto de loa retlduos bidr robos y laa cargu a lo laro de la cadena peptdica. Esta falta de uniformidad entze las tzes principales caseinu se pone en evidencia en el cuadro 20. En la caaerw. o,,, el reparto de la hidrofobicldad es ma regular que en las otzaa dos. Los diagramu de sedimentacin de esta casena sola en solucin acuosa son caracterticos de una asociacin por etapu; 18 forman polmeros de manera consecutiva en equlllbrio rpido; se obeerva la preaencia de un nico pico asimtrico con un coeficiente de sedimentacin elevado. Para determinados autorea ex late un tetrmero cuando la concent racin en protenu ea muy baja; cuando

Bl

......

150

Prtidos. Casena y len!"eno de la coagulacin

sta aumenta, el polmero tiende hacia la reunin de 24 unidades;

por otro lado, se pone en evidencia una diferencia entre laa dos variantes comunes By C; la primera da polmeros ms pequeos que la segunda. Cuadro 20. Secuencia de 148 hidrofobicidades' y de 148 cargcul' de 148 casenas a, 1 , y .
Secuencia a,.-B
IJ- A 2

K-B

c.,...
120 21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-209
Total

Hidrofobld- Coqo dad ()d/ret)

Hldrofobicidad Qd/res)

c.,...
-3 +3 +1 +2 +2 +1,5 -3
- 5,1

Hldrofobici dad (Id/res)

+ 2,8 + 1,0 -6 ,7 - 10,2 - 1,0 + 1,7 + 0,9


- 2,0

- 1,0 - 3,0 (181-199) -17,5

4,9 6,3 2,7 3,0 5,3 5,8 3,5 7,1 5,4 4,8
4,9

- 9,6 -1,3 -2,5


+2,4

o o o o

3,5 3,6 4,3 6,8 6,3


6,7

-2,6 +0,8 +1,0

-11,8

S ,1 5,9 5,9 6,4 8,3 5,7

- 1 (161-169)

3,1 7,6 7,0 5,75 3,7 5,9 4,1 4,6 3,3 5,1

-3,2

(1) Estimadas segn Bigelow (2) pH 7

(Payens, 1982)

La casena no muestra una distribucin uniforme. La extremidad N-terminal ea poco hidrfoba y est fuertemente cargada; la otra extremidad posee caractersticas completamente opuestas; la secuencia e-terminal (181-209) no lleva ninguna cuga y es claramente hidrfoba. En la casena se encuentra una distribucin irregular; un largo segmento muy hidrfobo forma el corazn de la parte "paracasena" (restos 20 a 80), mientras que la parte "caseinoglicopptido" tiene un carcter hidrfilo (lado e-terminal). La distribucin desigual de los reatos cargados e hidrfobos en laa cadenas peptdicas lea confiere el carcter de un detergente, y pueden por lo tanto formar polmeros (que los especialistas denominan ''micelaa", en otra acepcin que la aplicada en general a la leche), por encima de una concentracin crtica. Las casenas y tienen aparentemente este carcter. Los diagramas de sedimentacin muestran dos picos correspondientes al monmero y a un polmero.
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Prtldos. Casefna y fenmeno de la coagulacin

151

En el cuo de la cue na ~, el grado de asociacin, a la temperatura


ambiente, y por tanto la masa molecular del polmero, vara con la concentracin en protenas y con la tuerza inica. Pero debe destacane una propiedad importante: a baja IA!mperatura, de loe O a 40 e, la cuena ~ ae deapolimeriza completamente, hecho que no ae produce con lu otras cuefnaa. Este comportamiento es tpico de la formacin de enlacea hidrfobot, que es endotrmica; ahora bien, la caaena ~ ea especialmente apta para reducirloa. La co.(M " ae asocia tambin, segn un mismo tipo de enlace, pero el polmero que se forma parece aer fijo, con una treintena de unidades y una masa prxima a 650.000. Los parmetros habituales de la polimerizacin no parecen tener inlluencia en el tamao de este polmero. Diversas medidas fsicas indican que el volumen especfico debe aer muy superior al que se encuentra habitualmente en las esferoprotanas (0,75 como trmino medio); probablemente ae trata de un glbulo fuertemente hidratado y de estructura lnte.m a laxa; Jo que nos lleva a un papel central de la casena" en las asociaciones he!A!rogneas.
C) Alociac~ de vi casenas El tipo de estructura laxa propuesto para las uociaciones de la case-

na ", llllgiere que la accin protectora de esta protena ea comparable a la accin solubilizante de un detergente; las otras casenas se encuentran incluidas en la casena " hidratada. Es posible que ae deban describir de esta forma las "submicelas" no mineralizadas, que son la base de la construccin de la casena en estado nativo . Las casenas se asocian entre ellas, principalmente por interacciones hidrfobas, como ya se ha visto. Se han observado tres asoclacio nes binarias: a,-, IJ- y a, .J. Las mediciones termodinmicas muestran que " se une ms fuertemente a a, que a (J. Existe una determi nada estequiometra; el valor l/3 se indic primitivamente para la relacin " fa, o "lfJ; pero el estudio de la asociacin ae hace difcil a causa de la polimerizacin de los componentes; las experiencias con electroforesla en gel han dado relaciones muy diferentes. La exiatencia de complejos entre las diferentes cuenas ae revela tambin por un curioso fenmeno. La casena " pura en solucin sin calcio da, por accin de la quimioeina, un cogulo fibrilar {muy diferente del co6ulo formado por las micelss, que estudiaremos ms adelante). En preaencia de otra casena, a, o {J, este cogulo no se forma; la polimerizacin de la casena " , modificada por la enzima, es por lo tanto muy limitada. Se puede pensar que cada complejo no lleva ms que una molcula de casena " y que su soldadura se limita a algunas unidades.
Noto.- Un artrculo do reviei6n de Payona (1982) rtoume loo Importante trabajo. de la 11 EIC'uela Holandeta" sobre lu uoelaclones de la caaenu.

yr htoo m

n 1

152

Prtidos. C&selna y fenmeno de la coagulacin

XVI ASOCIACIONES EN PRESENCIA DE CALCIO. SlRMICELAS


Al Poder Mtllbilizante de la caelna K La figura 27 es un intento de eaquema de las asociaciones que llevan a la formacin de las micelas. En presencia de calcio ionizado intervienen nuevos enlaces entre lo que se podra llamar los complejos primarioe, descritos anteriormente. El calcio, como otros cationes divalentes, debe formar puentes entre pares de grupos cidos. Se han observado varioe tipos de enlaces, implicando ya sea a las aerinaa-foafricas o a los aminocidos dicarboxlicos, pero las explicaciones no son muy claras. En ausencia de casena K y en presencia de calcio, no se forman micelas con las otras casenas; los caseinatos insolubles precipitan. La casena acta como coloide protector; se dice que tiene "poder estabilizador". impidiendo la precipitacin de la casena 1 hasta la relacin "fa, = l/10. El fsforo no interviene en el poder estabilizador de la casena"; por el contrario la casena "' desfosforilada no se puede estabilizar con casena K. El papel de los glcidos de la casena sigue en discusin; para algunos autores es nulo. Sin embargo. ciertas experiencias muestran que el poder estabilizante disminuye cuando se hacen actuar oxidasas, que desprenden restos osdicos (neuraminidasa,ll;lucuronidasa, heluronidasa, etc.). La modicacin de los restos de tirosina lleva a una prdida progresiva del poder estabilizante de la casena K frente a la casena a,; estoe restos estn por lo tanto libres y expuestos, e intervienen en esta importante propiedad. Anteriormente se ha hecho referencia (ap. XV, C) a una hiptesis sobre la accin protectora de la casena " (carcter anfifllo, estructura laxa muy hidratada). Esta hiptesis no excluye otras, especialmente la de los investigadores japoneses, que han modificado las propiedades de la casena tJ desfosforilndola (ap. XIII); por otra parte han injertado restos de lactosa en la molcula de casena tJ desfosforilada, aumentando de esta forma su poder estabilizante frente a la casena a, 1 Para estos autores (Yoshikawa y colab.), el carcter anfifilo no basta para adquirir este poder; se necesta adems que la molcula est poco fosforilada. La casena K foeforilada qumicamente perdera su aptitud para estabilizar las otras casenas en presencia de calcio. Las "micelas" formadas por las casenas K-a,iJ en presencia de calcio no son idnticas a las micelas natiY118; stas son mucho ms estables y su curva de distribucin de tamaos es muy diferente de la establecida con la leche. Las micelas perfectas exigen la presencia de iones fosfato y citrato. Experimentalmente se puede reemplazar el calcio por otros cationes bivalentes y obtener, por ejemplo, mioelas coloreadas con el nquel o el cobalto; por el contrario, el magnesio
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Prtldos. Caserna y fenmeno de la coagulacin

153

no es apropiado aunque pertenezca al mismo grupo que el calcio (la capa electrnica intermediaria del magnesio es incompleta). El calcio contribuye a la formacin de m.icelas cuando est presente en pequea proporcin, como en la leche (0 ,03 M). Una concentracin diez veces mayor, provoca, por el contrario, la disolucin del complejo Ca-a,13-, y la precipitacin de las casenas sensibles al calcio.

CASEiNAs

/ (solucin pH 6,7 + catin monovatente)

'

monmeros de ce a.(J. X

Polim:.os

C~plejos
,/
+ ca+-+ + fosfato + citrato

{+catin divalente: ca++)

Agregados y micelas Imperfectas

MICELAS

(Compacto)

Estructura hipottica (laxa)

(Ncleo at+ti)

{Distribucin uniforme)
N

(Corona K,o

+a)

Flgu111 27. Esquema de la edificacin de las micelas .

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154

Prtldos. Casena y fenmeno de la coagulacin

B) Las subunidadas miceiLas micelas que se describirn ms adelante no son probablemente homogneas. La observacin de corte& de micelas inmenas en una resina sinttica da Imgenes que muestran una especie de granulacin. El crioseccionado o el criofraccionamiento confirman esta estructura granular. Hoy da se admite que los grnulos son los agregados elementales que renen una decena de molculas de las cuatro casenas principales y forman "submicelas" cuyo dimetro estara comprendido entre 10 y 20 nm en el caso de la leche de vaca. Las submicelas no contendran calcio, pero fijaran alrededor de 1 ion ca++ por grupo fosfato (de la fosfoserina); estaran reunidas en la micela por lo que se llama el "fsfato coloidal" (ver ms adelante), desempeando el papel de cemento. La explicacin de la formacin de esta estructura en la glndula mamaria es bastante difcil. El fosfato triclcico amorfo se unira a la casena, en presencia de magnesio, en las vacuolas de Golgi, lo que impedira la precipitacin de la hldroxiapatta cristalina.

XVII LAS MICELAS EN LA LECHE

Al Morfologa
Los exmenes al microscopio electrnico, tras sombreado metlico (Y con un aumento medio: X 10.000), ponen de manifiesto la presencia en la leche de partculas esfricas de dimensin diferente. Son las micelas de casena nativa, que se encuentran en suspensin estable gracias, por una parte, a su tamao, que permite el movimiento browniano y, por otra, a la concentracin local de las cargas negativas, debidas sobre todo a los grupos fosfricos. La figura 28 presenta unas microfotografas obtenidas a partir de leche desnatada de 3 especies animales. El grado de dispersin es diferente. Las micelas de la leche de vaca aparecen de talla media entre las de leche humana, donde estn dispersadas muy finamente, y las de la leche de cabra. Las micelas de la leche de vaca tienen en su mayor parte un dimetro de 100 nm , y su masa debe estar comprendida entre 0,5 y 1 X 10 , habiendo confirmado las medidas por viscosimetra y difusin los clculos basados en el tamao y la hidratacin. En la leche normal, los tamaos parecen situarse entre 20 y 300 nm; sin embargo, algunos autores piensan que no existe un lmite inferior sino una evolucin continua entre los complejos primarios y las micelas mayores. Se han observado variaciones individuales; y tambin variaciones estacionales acusadas en las leches de mezcla, en las que las micelas seran mayores en invierno que en verano . En un solo individuo, el
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Prtidos. Casena y fenmeno de la coagulacin

155

dimetro medido indirectamente (turbidez en funcin de la longitud de onda, difusin de la luz) puede variar de 1 a 2 en diferentes perodos. En el calostro se observan micelas gigantes de 1.000 nm y ms, con, al parecer, una cavidad central. Existe una correlacin positiva entre el dimetro micelar y el contenido en fosfato inorgnico, pero no con la cantidad de calcio ligado a la casena, ni con el pH de la leche. Es probable que la asociacin de las partculas contine ms all de su formacin sobre el aparato de Golgi, tras la salida de la clula secretora. Una posibilidad de asociacin postsecretora podra residir en una protelisis limitada de las casenas, sobre todo durante la retencin de la leche en la mama.

,
'

. . . .

. .

Figura 28. Partculas de casena nativa de la leche. (Fotografias con microscopio electrnico cedidas por amablemente H. Hostetller y K. lmhof}.

1Aumenlo; .< 8.000 1

C) Leche humana

Copynghteo fTiatunal

156

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

El tamao de las micelas puede cambiar bajo la influencia de los diversos tratamientos de la leche, como se ver ms adelante. B) Composicin. La carga mineral En las micelas en estado seco, existe alrededor del 92-93%de protenas. La proporcin de las diferentes casenas es probablemente variable. La relacin media Q51 /fJ/K/Qn podra ser 3/3/1/1. La proporcin de casena K sera mayor en las micelas pequeas que en las grandes (variacin inversa de las de fosfato de calcio coloidal). Quiz sea la casene K el mayor factor limitante del tamao de las micelas. Las micelas contienen una carga mineral relativamente importante, entre el 7 y 8 %del peso seco, constituido por el fosfato clcico en un 90% representando el resto el citrato y el magnesio. , La micela hidratada que se separa de la leche por centrifugacin contiene aproximadamente el 70%de agua. . Se dice que la forma nativa micelar es el "fosfocaseinato cido de calcio". Como trmino medio, 1 litro de leche de vaca contiene: (27 g de casene + 0,37 g de CaO) + 1,7 de fosfato de calcio coloidal Al pH normal de la leche, alrededor de un tercio de loa grupos de la casena permanecen libres. Cuando se modifica el pH, la cantidad de calcio y fsforo ligados vara mucho. El fosfato es probablemente trclcico. Cuando se aade oxalato potsico a la leche, se aprecia una reduccin de la acidez valorable que se explica en la reaccin:
(P0 4 ), Ca,+ S (C00),K1 = 3 (COO),Ca + 2 P0 4 K3 (Precipitado) (Sal con reacci 6n alcalina)

Probablemente, el fosfato coloidal se encuentra en la micela en forma de pequeos agregados poco ordenados, de un dimetro de 0,95 nm, correspondiendo a un t r mero Ca 9 (P04 ) 6 El enlace con las submicelas se ver ms adelante. El fosfocaseinato sedimentado sobre las paredes de la ultracentrfuga se presenta bajo la forma de un gel traslcido y ellactosuero es claro. Sin embargo, el aspecto blanco opaco de la leche se debe a la suspensin del fosfocaseinato, y resulta de la reflexin total de la luz sobre las partculas en suspensin. Se pueden producir fcilmente fosfocaseinatos artificiales por el mtodo de Porcher: se disuelve la casena completa en agua de cal y se lleva el pH a 6 ,7 por ad.icin de cido fosfrico. Este sustrato es de utilidad en Jos estudios de qumica lechera.
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Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin C) El potencial ZlltB

157

Es un valor (en milivoltios) caracterstico de laa partculaa cargadas en suapensin en un suero de composicin mineral dada. En el caso de la leche se han dado valorea dlscordantes; se obtienen por la medida de la movilidad de las mcelas en un campo elctrico, y el resultado depende de la composicin del medio: dializado, cenlzifupdo, ultrafiltrado de la lecbe, o bien de 110luciones artificiales. Puede admitirse un valor prximo a -10 m V, a 2o c y a pH 6,8. Este valor no depende del tamao de laa mcelas; los tratamientos trmicos no lo modifican: por el contrario, es eenaible a !u variaciones del pH. Haca pH 4,0, el potencial zeta es nulo; por debajo de 4 ,0 se vuelve positivo. El d81108D10 de la temperatura tiene efectos anlogos.

O) Estldo de equlilbrlo

En la leche, las casenu no se encuentran totalmente en estado "mcelar"; del 5 al 10%de las casenaa ae encuentran bajo forma de monmeroa o de pequeos agregados; es la "caaens110luble". Laa mcelas pueden separarae por ultnfiltracln con membranas o por ultracentr!fugacin, es decir, mediante centrifugacin en un campo de muy e.Ievada velocidad y durante larga duracin, por ejemplo 35.000 v. durante 90 minutos. Exiate un equilibrio entre los componentes de las mcelas y las mismas sustanclaa en 110lucin; dicho de otra forma, las caaenaa pueden hacerse pasar de una manera reversible de un estado a otro. Los iones clcicos desplazan el equilibrio hacia la forma micelar; por este motivo, toda la casena puede aepararse por aedimentacin cuando la concentracin en calcio se aproxima a 0,08.(),10 M. Inversamente, si se reduce la ooncentl'3cin de estos iones, se observa una disociacin de las mcelaa, que oe traduce en una disminucin de la opacidad; se obtiene este resultado inaolubillzando el calcio (por ejemplo, por adicin de un oxalato soluble) o en el complejo con adicion, por ejemplo, de un citrato, de EDTA, etc.); la diluci6n tiene el mismo efecto. El ion fosfrico tiene un efecto oontrari.o al del ion calcio. La adicin de un foatato Inorgnico provoca un aumento de la parte soluble. La casena y loa iones foa!ricoa se comportan en competencia frente al calcio. La figuia 29 ilustra esta nocin de equilibrio: la proporcin de casena soluble en la lecbe es de 2,6 gfl; tiende hacia cero tras la adicin de ion calcio. El nivel de !u protenu del lactoauero no vara. Laa temperaturas bajas influyen en el estado de equilibrio. Tras dos d i'as a 2-4C,Ia proporcin de casena no oentr!fugable aumenta alrededor
ed

ae a

158

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

del 10%; la separacin de la casena /l del sistema micelar es la causa esencial (v.m.a.).

P.S. g /1
1 1

Protena!_d!:l~~~ _ _ _

_______ _

+ Poca++
4
/

/1

,/
~-'

,,"

,P/ C8selna + P

b
O

o.. \

Caselna + ca++

L_~~~-'-~--~~~~==~ Leche 0.05 0.10 M 0.15

Fig ura 29. Ultracentrifugacin de la leche (35.000 v/90 mn). P.S. = protetnas en la parte que sobrenada; P: ion ortofosfrico: M: molaridad (segUn Waugh. 1956).

XVIII ESTRUCTURA DE LAS MICELAS.


A) Las lagunas Se carece an de datos experimentales para asignar a las micelas de fosfocaseinato de calcio una estructura precisa a pesar de los innume rabies trabajo. Los puntos donde an hay incertidumbre se refieren: a) La estructura ntima submicelar, de la que ya hemos hablado; las cuestiones que se plantean son las siguientes: - l8s molculas de las diversas casenas estn ligadas entre ellas nicamente por enlaces secundarios o interviene el calcio a este nivel? - Son homogneas las submicelas?

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Prtldos. Caserna y fenmeno de la coagulacin

159

11

Figuro 30. Modelo mlcetar de estructura laxa, con distribucin regular de ls compo-

nentes. (Fotognollas amablemente cedidas por B. Rlbadeau-Dumas: .., texto.)

b) El enlace entre las submicelas y el papel del fosfato clcico: - Laa aubmicelas ae influyen mutuamente en su comportamiento aaociativo? - El foafato clcico interviene como cemento amorfo? - El foatato clcico se liga directamente en determinad.o s lugarea de la parte proteica? Los resultados fragmentarios, obtenidos por di!erentes mlltodos de estudio, son a veces discordante& y han llevado a numerosos investigadores a establecer su propio modelo de mioela o de submicela. Pero es preciso indicar que algtmas de estas ideas son elucubraciones intelectuales audaces y ... efmeras.
8)

La egrupac:in de las ca. nas

Es Interesante collliderar dos tipos de estructW'U, cada l1llB de eUas deacanundo en ~ vlidas y que, a pesar de b&bene propuesto antes de la puesta en evidencia microgrfica de las submicelas, an se diacuten hoy da. Se esquematizan en la figura 27.
l. E1tructuro compact4 y heterognea Implica sta la localizacin de la casena K en la zona externa (como una capa antignica); en efecto, este componente debe poderse escindir rpidamente por una enzima de masa molecular superior a 30.000 (la quimosina); por otra parte debe poderse ligar con la lllactoglobulina por \ID puente diiWfW'o. Esta localizacin externa de la casena K est apoyada por determinadas experiencias de marcado, pero es

hted 'lla

al

160

Prtldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

negada por otraa! Exilte una posicin intermedia: la casena est repartida regularmente, pero las formas glicoeUadu se encuentran en la capa externa.

,-,
. ,.

Flgura 31. Formacin de las mlcelas medlanre enlaces hldrloDos. Concepcin artJstica. A: submieer de 30 monOmeros. C: mlcela mlnlma de 14 submicelas. La parte as
hidrfoba es la c lara. ( Foto amablemente cedida por C. W. Slattery.)

2. EsiTuctura laxa y regu/4r

Esta concepcin es ms reciente (Ribadeau-Du.mu y Gamier,l970); la sustancia micelar est muy hidratada (70%de agua en peao y 75% en volumen); por este hecho , la eatructura sera esponjosa y origina ra espacios librea donde podran penetrar molculas voluminosas. Efectivamente, la carboxipeptidasa A , cuyo peso molecular es prxi mo al de la ouimoaina (84.000 y 80.600) contacta oon todas las casenas en las micelas; por eUo es plausible una diltribucin uniforme de los tres oomponentes. Loe motivos de la arupacin, regularmente ordenados en una red tridimensional cerrada, ae presentan en la figu ra 30; un trmero de la casena (las molculas estn marcadas con un punto negro en donde seran atacadas por la quimosina) forma el vrtice de un triedro del que parten tres oopolmeros lineales de las casenas o, y /1, a base de tetrmeros (parte A); el diaoo negro (parte B) representa a escala una molcula de quimosina .

Prtidos. Casena y fenmeno de la coagulacin

161

Hay otros argumentos a favor de este tipo de estructura. Una proteasa insoluble (ligada a un polmero) puede alcanzar las tres casenas "' ll y K; la dansi.lacin (reaccin qumica de los grupos - NH,) marca en algunos minutos los aminocidos terminales de estas tres casenas; por lo tanto, las tres son fcilmente accesibles y cerca de la superficie. Sin embargo, en esta hiptesis, no hay factor limitante del tamaflo de las mioalas; pero ain duda debe retenerse a nivel de las submicelas.

Bl Modelos limitados
l. Segn Slattery (1976), la estructura de las micelas constituida de submicelas, que representa sin lugar a dudas unidades polifuncionales, no puede explicarse por modelos que no prevean un factor limitante. El modelo imaginado por este autor (figura 31) se basa en una estructura anistropa de las unidades que forman el conjunto; es decir, en una distribucin inegular de las partes hidrfobas e hidrfilas. Habra un oasquete hidrfilo de superficie reducida (dominara la casena K glicosilada), y el resto tendra carcter hidrfobo. Ahora bien, los enlaces hidrfobos tienen un papel predominante en las asociaciones; el crecimiento debe pararse cuando la parte externa de los agregados ya no permite este enlace, a causa de la extensin de la parte hidrfila. Puede haber una serie de tamaos. La estabilizacin del conjunto se realizara mediante puentes salinos. Esta hiptesis es interesante y seductora, pero la desintegracin de las micelas que se produce en el curso de la dilisis no est a su favor.

mo1l~:uh1S de

casena K

ncleo hidrfobo

agregados de Cag(PO,)o

A Figure 32. Modelo dB submicelas fA) y de mlcelu (8) de la casena, segun Schmidt (1982). (Con ta amable autorizacin de AppHed Sclence Publishers, editores de ..oevelopmets In Oalry Chemlstry-. por P. P. Fox).

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162

Prtldos. Case/na y fenmeno da la coagulacin

2. El modelo m aatia!actorio en la ac:tutlidad pvece eer el propuesto por Schmidt (1982). Lu aubmicelat eatn foJ1!lllllu por un ndeo hidrfobo donde ee encuentran lat pv1a apolarea de todu lat cuenu; eate ndeo eat rodeado de una ca~ polar que aJUpa lu putea fuertemente carpdaa, ricaa en agrupacionea foafri.caa de lu cuenu a. 1 , a.1 y (1. La ca.sena K , muy poco foaforilada, pero con una parte muy polar, ocupara un lugar eapecial en elta capa; de eata forma ae vuelve a en contrar la Idea del cuquete (fi111Jr& 32). El enlace entre lat aubmicelat reaultara de una Interaccin elec troatitlca de loa IJNpa. ~terea foafricoa de lu cuenu carpdos neeatlvamente y el foafato Ca,(P04 h, que eat cupdo ))Oiitivamen te tru la adsorcin de doe ionea de calcio. La detencin del crec miento de lat mioelu reaultara de la ocupacin de la auperficie ex tema por la caaena K; .eguira una reduccin de loa reatos de foafo aerina, puntos de unin del foafato clcico coloidal, que ea la pieza de enlace. El punto dbil de eata conatnlccin ea la detlual dlatribucin de la cuerna , que podra incluso eatar auae.nte de alunu aubmice lu.

XIX ESTABILIDAD DE LAS MICELAS. ACCION DE LOS ACIDOS


A) En.bilidlld 1 pH conmnte Lu micelu son partculat butante eatablea en au forma y en au volu men, cuando el pH no vara. La puterlzacin y la ebullicin de la leche no las modl(ican aenaiblemente. A las temperatur1111 clsicas de eeterUizacln (12oc, 15 mn) se producen dealnteraclones y hay formacin de !ibrillu. La homogeneizacin de la leche b~o preain elevada, lo m.iamo que la concentracin de la leche por evaporacin al vac!o, provoca deformacionea de las micelat y la aparicin de aglo meradoa; adem en la leche completa ae produce un fenmeno im portante: el enlace con loa glbulo grasoa; el complejo prtdo-JpIW que se eatablece en eataa condidonea tiene int.eres en lat quese ru que ut.iliz;an leche concentrada. Para loe bi.ofsicoo, lat micelas de caaena poaeen una apreciable eatabllidad, que lat distinue de loa dem ala temu proteicoa conoci doa. Ea cierto que perai.sten en la leche tru una lara conaervacin y con loa tratamiento. trmicoa habituales. Sin embargo, ea preciao ba cer conatar que el eatado micelar puede deatrulrae fcilmente. Las principales causu de ineatabilidad son: l . El calentamiento bajo presin a temperatura elevada, por ejemplo a 130 C durante 1O 15 minutos. La flaura 33 mueatra la rela cin entre la temperatura y la duracin del calentamiento que provoca

Prtldos. Casefna y fenmeno de fa coagulacin

163

la floculacin de la casena nativa, en la leche de vaca normal. Se trata de valores Indicativos; se pueden oblervar notables variaciones de una leche a otra. Este tema se tratar en el captulo lX.
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130

120

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25
50

110

Minutos

75

Figuro 33. Ftocutacln de ra easelna nallva. en funcin de toa condiciones de calentamiento de la Jeehe (leche de vaca fresca y normal. valores medios).

2. La presencia de iones minerales tiene una concentracin crtica, que provoca un descenso de la curva Indicada ma arriba. Hem06 sealado anteriormente el efecto del aumento de la co. centracin en n iones calcio. Ciert.Q leches pueden contener naturalmente mucho calcio inico; por esta razn no pueden calentarse, ya que floculan, aunque te.ngan un pH y una composicin proteica normal; es una anomala rara. El remedio para este inconveniente es el citrato sdico, aadido a la leche Inestable o Inyectado al animal. Durante la concentracin de la leche puede Uegarse a loa niveles crticos; por esta causa, la leche flocula a las temperaturas de esterilizacin. El "balance" mineral Ca+ Mg y fosfato+ cltrato,lnfluye en la eatabllldad de la casena nativa. Es un punto muy importante sobre el cual tendremos ocasin de insistir.
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Pr61idos. Caaefne y fenmeno de le coagulad6n


En la fue no gellficada de la Jecbe congelada tamblm existe una conatntncin elevada de alea; ya bemol seftl!!do tita cana de ines-

tabWdad. A conatntnciones relativamente dfbllea (heda 0,2 M}, el cloruro edico de.tnlye lu micelas y precipita pucielmeut.e la cuena, sin fraccionamiento, a la temperatura ordinaria. 3. El dee0tn10 de la temperatura mod.Uice la eatructure de las miatlu; el enlace de la ceeena 11 es el m tricD y puede liberarle en el pluma ~-caeeinato de cel soluble , al milmo tiempo que fatoro y celcio lnorgnlcce. De ello ae ligue una dlamlnucin del tamao de las mloelu y una mayor hidratacin. Se aumenta la eat.abllldad de la faae mlcelar de la leche; se manifiesta eapedelment.e por el alargamiento del tiempo de coagulacin por el c~o. en lu condlclonee de la queserie.

Bl 0.1011110 del pH . Accin de los llc:idos


La acidlliceci6n de la leche provoca la deatruccln de las micelu sin rracclonar la ceeena, cuya precipitacin ea total hacia pH 4,7. El foatocuelnato experimenta una degndadn doble , con mJcracin progresiva del celc:io coloide! hacia la aoludn . La cuena Woelctrice es completamente privada de celcio y no contSene m que fsforo proteico . Etta "deamineraliucin" es la carac:teriltk:a principel de la casena precipitada por acidificacin, en comperacln con lu IUitancias preciplt.adu por el cuajo.
1. e.uolnoto.Ca (coloidal) 2. PO,J.Ca 1 (coloidal)

+ 2 CH 1 -<:HOH-coOH = e.uoCna + (CH1 -<:HOH-<:OO )2 Ca


(ieldo lietieo) (l...,lublt) (oolublo)

+ 2 CH1-<:HOH-coOH = (CH 1 -<:UOH-<:OOhCa + (P0 4 )1Ca4


(foofoto
monoc~cico

oolublo)

Al principio de la ecldilicacin,la eolublllzaci6n del celcio se realiza lin de.tnlccln de lu micelas. Un deeatnao del pH de 6,7 e 6,0 se corretponde con aproxlmedamente una ~ del 60' del celcio l.ipdo a la cueine. Si la ecidlflcecin ae dewrolla procral-te en el medio, ae forma un coquJo homogneo, como en el yocwt, caua de la fermentecln tctica. El mi&mo resultado puede tambi6n obtenene por ve qumica, mediante la hidrliaia lenta de cuerpce de tipo lctico, por ejemplo,laglucono-deltalactona, que ea una rull.ancla netural del metabolismo 1lucdlco (producida por deehldrosenacln de la siucosa-6-P en presencia de NADP, y que ee hidroliza en cido 8lucni-

Pr6tldos. Caserna y fenmeno de la coagulacin

165

co ). Este medio ett admitido en la prctica pua la obtencin de cuajadat ain fermentoa lcticos o tambin exentaa de armenea (captulo XXI). Loa efecto de la acidez y del calor ee auman . La floculacin de la caeena ocurre a un pH tanto ma elevado cuanto ma alta ea la temperatura. A lal temperatural de esterilizacin, et au.ficiente un deaoeneo del pH de algunas dcimas de rado para que la leche flocule (hada pH 6,4). Por el contrario, a baja temperatura, entre Oy 6 C, la floculacin no 18 produce. En efecto, si a la leche refrigerada 18 aade cido clorhdrico concentrado en cantidad suficiente para reblllar el pH a 4,5, la leche no 18 coagula; ae observa solamen te un aumento de viacoaldad; si la temperatura se eleva a 20" C, la floculaclbn 18 produce sin demora. Esta propiedad es la base de un nuevo procedimiento para la fabricacin de cuajadas cidas, como el "Cottae cheeee". La caUI& de la estabilidad de la caaena nativa a b~a temperatura 18 debe ala preaencia de calcio. Una solucin de caaeinato edico precipitar a pH 4,6 y 20 C; la precipitacin no ocurrir ai previamente 18 le ha aadido una sal clcica a una concentracin por lo menos 0,05 M. Un hecho a destacar ea cierta persistencia del calcio ligado a la ca.ena a ~ tempemtura y pH 4,6; la solubillz.acln total del calcio ea lenta en eatu condiciones.

XX ACClON DE LAS ENZIMAS COAGULANTES

Al

Alpecto glo bal de los fen menos de coagulacin

Loe doa principalet proceaoa de coagulacin obaervadoe en la naturaleza, el de la leche y el de la sangre, muestran evidentes aimilitudes, y
eu estudio aimultneo ha favorecido el proareeo de nuestros conocimiento : 1. El fenmeno ae inicia por Ull8 proteU.U limitada a la rotura de un 10lo peptdico: Fen-Met en la casena K, Ar.Cli en los fibri nopnoe. 2. Se libera un pptido aoluble: cueinoppdo, fibrinopptido; 10n eustanciu cuyo porcentaje de mutacin ea elevado, pero que nunca contienen alunoe aminocidos, como la clltena y el triptfano. 3. El rupo prosttico alucdico de eatu protenaa no tiene al parecer ninan papel; por el contrario, loa rupoe aminadoe de la liena son Importantes. 4. La coagulacin propiamente dicha ea un fenmeno diatinto.

eru-

166

Prtidos. Casefna y lanmeno de la coagulacin

Bl Bioqu imica de la coagulacin de la leche En los apartados siguientes estudiaremos especialmente la accin de la quimosina*, ya que es la base de la fabricacin del queso; pero la pe peina y las proteaaas bacterianas tienen tambin un inters prctico, que sealaremos en su lugar; pertenecen todas a la misma familia de las "Aspartato-proteinaaas" (captulo XXI). Desde las investigaciones de Hammarsten (1812) se sabe que la coagulacin de la leche por el CWIJo, tal como ocurre en quesera, es consecutiva a una reaccin proteoltica limitada, donde la casena constituye el substrato. El lactosuero separado de la cuajada contiene una sustancia soluble nueva denominada "proteosa de Hammarsten", que representa alrededor del 6 % la casena original. La reaccin se de representa habitualmente de la siguiente manera:
+cuajo fosfoparacaaeinato de Ca (inaoluble :cuajada)

fosfocueinalo de Ca (aoluble)

-+

proteaaa (aoluble)

La casena modificada se ha denominado "paracasena ", y se distingue de la casena completa por su insolubilidad en presencia de pequenas cantidades de calcio. La figura 34 pone de manifiesto la gran diferencia de sensibilidad a los iones calcio de las dos protenas. Hasta que pudo estudiarse la accin del cuajo sobre loa componentes de la casena completa, no se haban observado diferencias notables, desde el punto de vista de su composicin qumica, entre la protena original y la protena modificada; pero actualmente ha podido comprobarse que el complejo fosfo-paracaaeinato de calcio lleva una carga mineral ms fuerte que el complejo original; sobre este ltimo se fijan, a la vez, calcio y fsforo soluble en el curso de la coagulacin de la leche. Si se hace reaccionar la quimosina sobre una solucin de caseinato sdico a pH 6,7, la paracasena formada permanece en solucin. No hay floculacin en ausencia de calcio o de otro ion bivalente.

Cl Las reacciones primaria y tercilwia


La proteasa liberada en ellactosuero no es una sustancia homognea;

Quimolina ea el nomb~ elentffieo de la enzima contenida en la prepara~ cin comercial denominada "cuajo" y que eetudluemoa en el captulo XXI. El trmino quimosina ea preferible al de ''renina", que ae preala a oonfuoi6n (EC.
3.4.2.3.4.).

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Prtldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

167

contiene loe producto. de doe reacciones que es prctico diJti:nguir en razn de aue velocidades diferentes : l . Recrcci6n prinlari4, en la que el auatrato ea la caaefna " , y que deaencadena la coagulacin. Esta reaccin es eld:remadmente rpida hacia loa SO e con cantidades de enzma muy ~u; puede consideran~ como eapecfica en condiciones corrientes. Su mecaniamo ee estudiar m adelante.

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Moles CaCiz por lllro

FigUra 34. Solubillda<l de la ~lna entera y de la parocawlna.., p r -c;a de calcio.

Hay que dettacar el hecho de que la relacin enrimajaubstzato

(eje) en laa condicioDes de accin de la qulmoeina ee una cuac:terstica Importante de la reaccin capital de la qu-a tradicional. La cantidad media de cuajo aadida a 100 litros de leche (SO mi de extracto etiquetado al 1(10.000) OOrretlponde 8,proxlmadmente a 0 ,25 JAi/1 de qulmotina cri&talizada. La relacin ete ae establece hacia 1/100.000 en relacin con la casena entera y hacia l/15.000 res pecto a la casena , mientras que en loe estudios cinticos de 1aa proteaaas este valor se sita corrientemente en la zona l/60 1/600.
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168

Prtidos. caselna y fenmeno de la coagulacin

2. Reocc16n de prote/W. temtral o urc14rlo, no especfica, protelisll lenta en tu condiciones anterloret, con una especificidad companb'- a la de la pepsina (el calificativo de ''lecundaria" .e reaerva a la fue de coaulacin). La Naccln t.erciaria es un fenmeno apet.e ck la coacuJacin; concierne a todu lu casenas. La suaceptibilldad de ataque no depende de la especificidad de la enzima; interviene la conformacin espe cial delaubltrat.o; en efecto, el ataque de lu tret cuenu principales .e reallr.a de forma diferente y algunoa enlaoea aon rot.oa mucbo ms fcilmente q ue otro1. En la cuefna ct, 1 , el enlace Fen-Val(24215) 111 rompe en primer lugor; ee forma una nueva protena ct, 1 1 (26199), do movilidad electroforUca mayor. Se supone que esta etapa primitiva de la protelisia ee produce on el queso reciente, en relacin con un cambio de las propiedades reolglcae. A continuacin se producen otras roturas ct, 1 .Jl (25169, 111 (25-150), etc., framentos en lo cualetla movili dad va en aumento. La cue ina ~ tiene menos puntos de ruptura por la qulmoelna, pero la detfBdacln n iualmente progesiva; ~1 ea el rncmento 1189, 1111, 1165, etc. En la cue{na.t( te produce una rotura muy lenta en la ppsicin Glu Ala ( 137138). Todas enu nociones sern tilet al tratar de la quesera en el captulo XX I.

DI Enudlo analltico
Se puede seguir el curso de estea dos reacciones en funcin del tiem po, mediante la determinacin del nitrgeno no proteico, o (N.P.N.), aolu blo en 2 y 12% de cido tricloroaootico (TCA). La figura 35 muestra las curvaa de protelisis obtenidas con la caaena entera de vaca como tubltrato. Con el12 :; de TCA,Ia reaccin primaria se manlllesta aola; la velo cldad e1 mlma al principio y a continuacin va dbminuyendo y se vuelve prcticamente nula; entonoea ae alcanza un valor fmal de la proporcin de nit.rgeno no proteico; este valor corretponde a la solubiliucin de un 1 ,5 t del nitrgeno de la cue na, en el caso de la leche o en el de aoluciones de casena de vaca, en la que la concentracin et del miamo orden que la de la leche. Si ae aade una nueva candad de qulmoJina a la mezcla en reaccin, no hay formacin de nitrgeno no proteico. En presencia de calcio y a una temperatura favorable, la coagulacin sobreviene al cabo de un tiempo cuya dw:a cin correaponde aproximadamente al trmino de la reaccin, men trat que el NPN12 %no aumenta o lo hace muy poco . Debe sealarse que el conjunto de sustancias nitrogenadas liberadas en el curso de la reaccin prlmorla no es soluble en 12 %de T CA; pero cate contenido

Prtldos. Caaelna y lenmeno de la ~ulacln


~eparado

169

del reactivo desproteinizante permite dlttlnguir laa dos reac-

ciona.

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Figura 35. LlbetaeOn del nitrgeno no proteico (NPN) duranto 11 accin de la quimosina cris talizada (1 :0.42 : 1,63.g/ml) sobre la caselna enlera de vaca (3%). a 25' y con pH

6,7. (Sogun C. Alela y otros. 1953.)

Lu dos reacciones aparecen en la curva de protelliiB con el 2% de TCA. La segunda parte ea una recta cuya pendiente es proporcional a la concentracin de la enzima; reCeja el cuno de la reaccin de protelWJ ge.neral que prosigue tras la coagulacin y que interviene en el cuno de la maduracin. Esta reaccin 1e produce todava a pH 2,0; mientras que la reaccin primaria es Inhibida; de esta manera .e pueden diaociar laa dos reacciones. Con la leche como substrato se obtienen lu milmu curvu que con la ca.eoa entera, excepto para el NPN natu.ral de la leche. La determinacin del nitrgeno soluble a pH 4,6 lleva a resultados oompa rabies a los obtenidos con el 2 %de TCA. La casena completa de cabra se comporta como la de vaca; por el contrario, la de oveja da dos veces ms NPN soluble en el 12% de TCA, en las mismas condiciones. La caaena humana 1e comporta de una manera irregular: determinadas preparaciones no dan lugar a Ji. beracin de NPN, por la accin de la quimosina.
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170

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

Los mtodos de valoracin usuales para determ.inar el nmero de grupos cidos o bsicos aparecidos, no permiten segulr la reaccin primaria. Por el contrario, el mtodo de titulacin a pH constante con el empleo de un pH-metro de gran sensibilidad permite la medi da del nmero de protones H liberados, correspondientes a los gru. pos ionizabies aparecidos tras la ruptura de enlaces en la molcula del substrato; se obtienen de esta manera curvas paralelas a las curvas del NPN.

E) Reaccin de las otras proteesas coegulentas La pepsina da una curva de protelisia semejante a la de la quimosina. Con las otras proteasas,la reaccin primaria apenas es visible, porque la reaccin general es ms intensa; es el caso de la trlpsina, como se muestra en la figura 86. Las proteasaa microbianas utilizadas actual mente en quesera tienen una actividad proteoltica un poco ms fuerte que la quimotrlpsina. Las curvas de la figura 36 ponen en evidencia que, con excepcin del cuajo y la pepsina, las proteasas liberan de forma continua NPN soluble en el12 %de TCA.

XXI MECANISMO DE LA REACCION

Al El sunrato
Si se hace reaccionar la quimosina en las anteriores condiciones sobre loa tres principales componentes de la casena completa de vaca, se comprueba que slo la casena K da lugar a la formacin de sustancias nitrogenadas no proteicas solubles en el12 %de cido trlcloroactico. Las casenas a, y /l no experimentan la reaccin primaria. La casena da unas cinco veces ms NPN que la casena completa de que pro cede, alrededor del 8 al lO %. Por lo tanto, la casena K es el sustrato especfico de la enzima en la reaccin primaria. Por otra parte, cuando se encuentra pura en so lucin es precipitada por la quimosina (como lo es el fihringeno bajo la accin de la trombina), mientras que no pasa nada con las so luciones de las casenas a., y /l. De esta forma se puede medir la actl vidad coagulante por turbidlmetra, con la solucin de casena como substrato. Bl Los productos de la reaccin Constituyen las dos mitades de la molcula de la casena K , que ya se han estudiado anteriormente. Es probable que la quimosina slo rompa un nico enlace Fen-Met, en el curso de la reaccin primaria. La denominacin de " caseinoglicopptido" a la parte soluble pone en evidencia la principal caracterstica de esta sustancia, que es la que
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Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

171

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Quimosina y pepsina

20

40 minutos

Agur 31. Liberacin del nitrgeno no proteico, soluble en al12 % de cicido trlcloro

actico, a partir de la caselna de vaca, por diferentes proteasas. {Las dosis utilizadas dan casi el mismo tiempo de coagulacin en la leche.)

contiene todos los glcidos de la casena K (como trmino medio: 5% de galactosa, 5 %de galactosamina y 9 % cido silico. Pero exiaten de pptidos privados de glcidos; estos ltimos, menos solubles, son probablemente poco abundantes en el filtrado tricloroactico. La electroforesis revela, en efecto, la presencia de pequeas cantidades de pptidos neutros, que no dan la reacc!n de los glcidos, al lado de la fuerte banda cida correspondiente al caaeinoglicopptido propiamente dicho. El peso molecular del caaeinoglicopptido de vaca ea muy elevado para una auatencia tan soluble, alrededor de 7 .000. Por otro lado, a pesar de su gran solubilidad en el agua, esta sustancia es retenida en los sacos de dilsla celulsicos; por lo tanto es fcil de purificar a partir del tricloroactico sobrenadante. Tras la accin de la quimosina, la parte que sobrenada separada del precipitado de paracase na K contiene unas dos veces ms suatencias solubles que el filtrado tricloroactico; a pesar de ello, el caseinoglicopptido forma casi la totalidad de estas suatencias, cerca del 90% (en realidad, los pptidos menores que lo acompaan no proceden de la reacc!n enzimtica). La solubilidad del casenoglicopptido en el cido tricloroactico es limitada, y una parte precipita con la psracaCopynghted r- atonal

172

Prtldos. Cuefna y fenmeno de la coagulacin

sena. En total , el cuelnollcopptldo repre~enta entre el 20 y el 22% de la cuena K . La accin de laa enzlmu oo.,wantet diferente. de la quimosina y la pepsina, ha aido pooo eatudlada. Con una endma microbiana he- moa ~eparado una auatancla oomperable al c:ueinolloopptido, pero es probable que tambin 1e rompan enlacea 111plementaria. en FenMet. C) El,_ilmo hidrol tico El enlace Fen-Met (10~-106) ooneaponde a la e~peclficidad de las Asp-proteinau que rompen el enlace 8dyacenla a un reato hidrfobo voluminoeo ; pero la IUaOI!ptlbWdad eefllac!amente alta de 81\e enlace puticular aD no 1e ha explicado comctamente. Esto. d011 resto. de. beran estar normal.mente oculta. en una rein no polar, pues el decapptido C\U'O enlace fo rma el centro (101-110) ea netamente hidrfobo. Ahora bien, deben ocupar una peticin fcilmente acuclille pera poderae ~uatar e la bola que forma el centro activo de las Alpprotein- que ae comienzan a conocer en el cuo de laa enzimas fngicas.

Con el rtn de aclarar el mecanilmo de la reaccin, ae han rea!izado numeroau experienciaa de hldrlilil de pptida. de anteaia correapondlentea a la aecuencla central de la c:uena K . A ttulo de ejemplo, el cuadro 21 reaume un eatudlo ailtemtlco aolxe loa pptidoa que contienen el enlace Fen-Met. De todoa ettoa trabajo ae pueden l!ll:traer las aiulentea conclualonea: l. Se preclaa un m lnlmo de cinco rettoa de aminocidoa para observar la protelilil. Loe tetrapptldoe no ae rompen, pero el pentapptldo (104-108) an no ea un buen aubetrato. 2. El alargamiento del pentapptldo, comenzando por ,la aerina 104, del lado e-terminal, ee poco eficu. Por el contrario, el alargamiento por el lado N-terminal (a la lsqulerda) ea eficaz. 3. La aecuencla Lau (108)- Ser (104) ea Importante. Si ae la invierte (Ser-Lau) hay una fuerte Nduccln de la velocidad de hldrl.iaia. La eerina 104 debe eata.r Implicada en el enlace enzimHubetrato; si es teemplrada por alanlna ee rec:luoa la hidrllala. 4. Lol reatoe de prollna, por ambat partes del enlace roto, tienen tambin influencia en la intaracci.n enslma..ubatrato . r.to. pptldoe pueden utUizarae como referencia para la medida de la actividad de la qulmoaina, y ee han propuesto variol. Uno de elloa ea un hexapptldo onnespondlent.e al -.mento 103-108, con doa modificadonea; el IJ'Upo niW&do forma un euetrato cromo!co; R .Leu-Ser-Fen(N01 rN.Leu-Aia-Lau.OMe ee puede eecuir la hldrllala por determinacin de la denaidad ptica a

Prtldos. Gasefna y fenmeno de la coagulacin

173

310 nm (Raimond y colab., 1973). En el EOnlace sensible, la metioni na ha sido reempla:r.ada por la norleucina para mejorar la estabilidad (la que da la eapeci!icldad de la rotura ea Fen). Los enaayos de bloqueo de las diferentes cadenaa lataralea de loe IIIIlinocidoa de la casena K han pueato de manifiesto la prdida de aptitud para la protelisia traa la oxidacin de la histidina (trea reatos de Hia se encuentran en las cercanaa de Fen-Met. La dansilacln de la liBina no parece afectar la protelisia pero inhibe la coagulacin; ocurre lo mismo con el bloqueo de la arginina. Hay por consiguiente IIIIlinocldos que eon necesarios para el enlace enzima-cubatrato y otros necesarios para la asociacin de las lnicelaa en la fase secunda ria.

Quulro 21. Hidriii8 thl enlace Fen-Met para la qu11Wsina en diver sos pptidoa 1

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43,3 33,6

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1. Extremo OMe (metUacl6n del carboldlo ), exceptuados los pt!ptidos con una 1isna e terminal; condiciones experimentales: 30 e y pH 4 ,7 (tampn do aJ:otato Na O,OS M). 2. Relacin Kcat(Km; permite comparar la eficacia do ia enzma con respecto a substratos dhersos. 3. Se han estudiado los pt!ptidos que tienen hasta 14 reatos; mientraa laa FenMet (105(106) forman la unidad terminal, no se registra el rompimiento. (Presentacin smplificada y valores redondeados de los resultados obtenidos por Vissier y colab., 1976)

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174

Prtidos. Casena y fenmeno de la coagulacin

XXII EL FENOMENO DE LA COAGULACION


Las fases de la acc:in de la quimiosina Todos Jos trabajos cientficos recientes apoyan la vieja hiptesis de la alteracin enzimtica realizada por la quimosina sobre un componen te de la casena original, que actuara como coloide protector frente a los otros componentes. Tras esta alteracin perdera sus propieda des protectoras y el colijunto, vuelto inestable en presencia de calcio, precipitara. Berridge (1942) ha diterenciado dos fases sucesivas:
a) Fase enzimtica, o "reaccin primaria", en el curso de la cual la

Al

quimosina ataca a la casena y solubiliza una pequea parte. El coeficiente de temperatura, Q 10 , (aumento de la velocidad de reaccin para una elevacin de temperatura de l0C) se acerca a 3; la reaccin no exige la presencia de calcio inico, y a 0 C se produce todava a notable velocidad . b) Fase de coagulacin o fase "secundaria", que ataca a la mayor parte de las sustancias que proceden de la reaccin primaria; po see un coeficiente de temperatura elevado ; alrededor de 1,5 por grado, que ea caracterstico de las reacciones de desnaturaliza cin . A temperaturas inferiores a l5C se vuelve extremadamen te lenta (aparentemente, la leche ya no se cua,ja). Preciaa de la presencia de calcio inico.
A estas dos fases esenciales de la coagulacin es necesario aadir

dos ms para presentar el conjunto de fenmenos consecutivos a la accin de la quimosina o de otras enzimas coagulantes. e) Protelisis general o "reaccin terciaria". d) "Sinresis" del cogulo, es decir, su retraccin con expulsin del lactosuero. Es una fase fisicoqu nica cuyo mecanismo es mal conocido y sobre el cual se tratar en el captulo XXI. La figura 37 es un esquema simplificado de las tres primeras fases. B) Correlacin entre las dos fases Diversas experiencias han demostrado que la fase enzimtica es India pensable para que llegue a realizarse la fase de coagulacin, y que sta no exige la presencia de la enzima. La figura 38 esquematiza loa resultados de una experiencia muy sencilla que pone de manifiesto la correlacin entre las dos fases. Se hace actuar la quimosina sobre la leche a 2 oC, con lo que slo se presenta la fase primaria. A cada toma para la valoracin del nitrgeno no proteico liberado, se toma tambin un pequeo volumen de leche que se lleva bruscamente a 40 C. Los trazos horizontales representan el tiempo de coagulacin, que, segn puede apreciarse, decrece paralela

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Prtld01. Cuerna y fenmeno de la coagulacin

175

1
+ Quimosina

+
C.selnogtlcopptido

C.Mina mlcelar + foofato coloidal

(Formoci<l de la red}

+ Quimosina
Pollpptldos

F~rE~

(Prolelisio -'ono~lical

Figura 37. Las tres,.... de lo eollgulac!On ennm"oc de la leeN.

mente al aumento del NPN y es prcticamente nulo cuando la reaccin primaria ha terminado. Otro mtodo confirma la correlacin entre las dos faaes; consiste en determinar el aumento de la canUdad de caaena preclpltable por el ca.lclo, tras haber inactivado la enzima por medio de formol o por

176

Prtldos. Csselna y fenmeno de la coagulacin

calentamiento a 80-90 C. Se encuentra una correlacin con la liberacin de NPN.

C1Dlsoclecin de las dos tM.


La gran diferencia de loa coeficientes de temperatura tiene como consecuencia que el enfriamiento por debajo de 10 C impide prcticamente la realizacin de la segunda fase. La leche adicionada de cuajo a s e no coagula; calentando haata so e coagula irutantneamente. Una aplicacin importante de loa estudios cinticos sobre la coagulacin es la fabricacin de cuajada en continuo (Cap. XXI). La fase secundaria puede ser en principio separada de la reaccin primaria si esta ltima ocurre en una columna que contenga la enzima insolubilizada por fijacin sobre un soporte, como el vidrio "Corning". La leche coagular tras el paso sobre esta columna, independientemente de la presencia de la enzima. Es la base del procedimiento "Wiaconsin" (Taylor y colab., 1979). De esta forma se han rehecho clculos de Q, 0 ; el valor no sera ma que 12 aproximadamente. Si a la leche que sale de la columna se le aade leche fresca, se observa que el tiempo de coagulacin aumenta proporcionalmente a la cantidad aadida; no es necesario que toda la casena ~ sea atacada para que se realice la coagulacin. Pero se pueden tener reservas sobre los resultados. Es preciso, por una parte, tener en cuenta el tiempo de paso y, por otra, una ulterior y posible accin de la enzima, debida a una inmovilizacin de las molculas en exceso.

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75
Min1.1IQS

Figura 38. Libetacin de nitrgeno no proteico (NPN} a 2 ~y reduccin del Hempo de coagulacin a 40 C, durante J accin de la quimosjna sobre la leche de vaca (NPN a soluble en 12 % de cido tric.loroactico). (G. Atais. 1963)

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Prlldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

177

DI Lot1Ubstr8tos de la ooas.Jiecin. Papel del fosfato de Cilicio


Se puede obeervar la ooagulacin con tret tipoa de wbetrato; pero so lamente con uno ae forma el gel caractertco. 1. La caaefna k pura da un cogulo bomogt\.n eo, pero frigil, que por aitacin ae transforma rpidamente en un precipitado fibroso. El precipitado de paracueina " ae diauelve en wea 6 M. Se trata probablemente de un polmero cuyaa unidadea estn reunldaa mediante enlaces eecundarios, como los enlaoes de hidrgeno. 2. El caeeinato de calcio, obtenido a partir de la casena entera, flocula pero no da un gel regular. S. Tal como exiate en la leche, el complejo foafocaseinato de calcio forma un gel que ocupa todo el volumen inicial. Este gel es baetante estable; ee retrae lentamente (sinresis) a pH 6,7 y a la temperatura ordinaria. La formacin del gel caracterstico depende de la presencia de la caaena ", del caldo inico y del fosfato de calcio coloidal. El papel eaenclal de este ltimo fue detc!lbierto por Pynt (1962). La sensibilidad del paracueinato a los iones calcio, depende d.e la cantidad de foarato preaente. El tie.m po de coagulacin para una concentracin dada en ionet calcio, u como la cantidad de ionet clcicoa necesaria para obtener la coagulacin en un tiempo determinado, son invenamente proporcionales al contenido en fosfato clcloo. Se puede obtener una leche con contenidos variados de fosfato coloidal por acldifi cacin y dlliaia a o e contra una masa de leche. Los caseinatoa a y JJ de caldo fjan muy poco fosfato clcico; por el contrario, la caeena" puede secuestrar cantidades importantes. El complejo formado a partir de la casena K da un gel, bajo la accin de la quimosina, cuya velocidad de formacin ea tanto mayor, y la con aistencla tanto ms fll'llle, cuanto ms elevada ea la proporcin de fosfato .

La participacin de las caaenaa a, y tl en la Case secundaria parece ser paaiVll. XXIII ESTUDIO F ISICO DEL CAMBIO DE ESTAoot J
A) Cin6tiCII de la coeaulecin La reaccin de coagulacin puede repreaentarae mediante la ecua cin: ks iP,---Pi, (1 2, 3...)
Se eot.udian aquf loa upeetoa cientfr>eoa de cambio do eotldo. Loa factorea que lnnuyen en el Uempo de coaculaei6n y en lao propiedadu de la cuQada, ae tudlarfn en lo parte t.ecnol6elea coneemlent.e ala queoerla, capitulo XXI.

pyr

f'"latn ;;1

178

Prtldos. Cuerna y fenmeno de la coagulacin

donde P1 a la puacaaeina formada en el c:uno de la reacci n primaria e i el grado de uociacin. La Yelocidad de colgU)acin de una austancla coloidal depende, como en lu reaccionee qunlc:u ordinvi, de la frecuencia de lu coliaiones entze putculu aptu pea unine. La collltante de velocidad bimolecular k. aparece en la ec:uacln de la velocidad de di.nninucin de la conceotraci.n de todu lu putc:ulas de lu que P ea la auma:
V
a -

ks (P)' (1)

La teora clsica de Von Smoluchowald ha aido adaptada en el caao de la leche por Payena (1976). La situacin a en efecto un poco dlterente de la coagulacin de loe coloide. normalea, porque no es preciao conaiderv aolamente la disminucin del n6mero de partc:ulas que alue a la coagulacin, sno al miamo tiempo la formacin de la paracaaena por el ~o. En la anterior ecuaclon ea neceaa.rlo incorporar la velocidad de la reaccin eMlmtica que produce la paracaseina (an no aglomerada);
V k8 (P)'

V.,.. (2)

Se pueden calcular laa concentncione. de putfculu de diferentes radoa de eaocia.c in Pi, pero a bastante complejo. La utilidad de tala clculoa a doble : l . El bastante fcil relacionar la variacin de 1aa concentraciones en nlimero de partculu con la turbidez y la vilcolidad de la leche y, de hecho, con el peao molecular medio. Elre.ultado del clculo puede expreaarse u :
(n, -

n)ln, -A (tlt) + B (t/1,)' (3)

17 ea la viscosidad o la turbidez (en el momento t o on tiempo cero); A y B aon constantes dadu para la teora completa; t 0 es la "constan

te de coasuJacin",que tiene las dimensiones de un tiempo, dado por la relacin


.. D

V2/kt;.

v.,..

(4)

2. Loa doa parmetros k. y v aon proporcionales a la concentracin de la enzima (E ). Se slue una ffiacioo que tiene la forma de la clsica "reala" de Storch y Seselke, con o tra constante.
t.~KI(CE)

En la ecuacin (3) destaca la diferencia de exponente entre los dos trminoa del segundo miembro. El primero, con la conatante A, refleja el e.f ecto reducido de la proteiWs; el segundo , oon la conatante B y el exponente 3, expresa el aumento exploalvo do la cantidad medida como oonsecuencia de la coasuJacin propiamente dicha. Eltaa predlccionea tericaa ae oonflrman por lu mediciones fsicas

Prtldos. caserna y fenmeno de la coagulacin

179

a que haremos referencia ms adelante (fig. 41). Las curvas de simulacin son comparables a las curvas experimentales en funcin del tiempo.

B1Observaciones visuales
La leche adicionada de cuajo a temperatura media entre 20 y 40 e y abandonada a s misma, se transforma en un gel homogneo al cabo de un tiempo Te, cuya estimacin es aleatoria; el cogulo ocupa el mimo volumen itc:i.al. Si se observa una fina pelcula de leche con CUI\lo deslindose por una pared, se comprobar la aparicin de ficulos tras un tiempo Tt. El tiempo Tt es ms fcil de medir y ms corto que el tiempo Te. Si se suprime toda agitacin, los f!culos se sueldan y forman un col{ulo homogneo . La floculacin, o la coagulacin, parece que surgen bruscamente. De hecho, se trata de dos puntos fijados arbitrariamente segn la agudeza de los sentidos y son indispensables para estudiar el fenmeno.

C) Mtodos fsicos Hay varios mtodos que permiten realizar observaciones o mediciones desde el principio de la reaccin enzimtica basta ms all de la formacin del cogulo; pero, en general, un mtodo slo da informa clones de inters sobre una parte del cambio de estado.
l. El examen al microscopio electrnico demuestra que en la primera fase de la coagulacin no hay deformacin o disolucin de las micelas esfricas de la casena nativa. Las micelas se unen mediante fibrillas de manera irregular y despus se forman cadenas y masas con vacuolas que contienen suero (fgura 39) para constituir fmalmente una red o retcula de tres dimensiones. Otras tcnicas microscpicas han permitido observar Igualmente esta red. Debe aadirse que la coagulacin por acidificacin se produce de manera muy diferente. La estructura micelar se destruye; si se dispersa el cogulo en un lquido, no se encuentran micelas esfricas; mientras que stas se observan cuando se dispersa el cogulo formado por la quimosina.

2 . VIscosidad y fenmenos electrocintlcos Dos factores importantes de estabilidad de la suspensin micelar son el estado de hidratacin de las protenas y el valor de las cargas que llevan las partculas. Cuando se mide la viscosidad de la leche o de una solucin de case!nato, con un instrumento suficientemente prec:i. so, se observa un brusco descenso tras la adicin de la quimosina. Los estudios de Scott-Blair y Oosthuizen (1961) han puesto en evidencia
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180

Prtdos. Casena y fenmeno de la coagulacin

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~

b) Leche de vaca + cuajo en ef momento de J coagulacin (>< 8.000) a

a) Leche de vaca + cuaJO antes de la coagulacin (:x 8.000)

Figura 39. La coagulacin observada al microscopio electrnico. {Forografias amablemente cedidas por H. Hosteltler y K. lmhof.)

e) Leche de vaca. coagulo .cido fresco (X 5.000)

varias etapas: con una pequea dosis de enzima, el de~nso inicial de la viscosidad es lineal en funcin del tiempo; la reaccin es de orden cero. Con una dosis ms fuerte de enzima y tras un mayor tiempo, la ecuacin correspondiente es de primer orden; a continuacin se vuelve ms compleja en la leche, a consecuencia del aumento de la viscosidad debido a la proximidad de la coagulacin.
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Prtldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

181

La velocidad del descenso inicial de la viscotidad depende a la vez de la concentracin en substrato y de la concentracin en enzima.

Por otro lado, se puede medir la actividad de la quimosina por viscosimetra. Este descenso de la viscosidad debe ser consecuencia de una descarga de las partculas o de las micelas. El estado hidratado e hin chado de las casenas se mantiene por las cargas elctricas repartidas a lo largo de las cadenas. Diferentes electrlitos, lo mismo que ocune con los pptidos producidos en el curso de la reaccin primaria, provocan la descarga, brutal en el primer caso, con floculacin si la concentracin es suficiente, y gradual en el caso de la quimosina, con formacin de gel en presencia de calcio. La medida del potencial electrocintico est a favor de esta explicacin: bajo la accin de la quimosina, las micelas se descargan y se deshidratan. La reduccin del agua de hidratacin, que desempea el papel de envoltura protectora en tomo de las micelas, favorece el establecimiento de enlaces secundarios, que ponen en marcha la coagulacin (el agua ligada a las protenas se estudia en el captulo IX). Se han realizado mediciones de viscosidad en paralelo con un re cuento de partculas. Se ha utilizado un viacosfmetro automtico: "Vi.scomatlc M.S." (Fica), tipo Ostwald Il, representado en la figura 40; est dotado de un cronmetro electrnico pilotado por un oscila-

.....
~U.:\

--

:'f'l ... J',, ...

'

(._

'

Figura 40. Viscomattc M. S. (A la izquierda, bao termosltico; a continuacin, el vis cosimetro propiamente dicho; luego, el diluidor. y a la derecha, el impresor.)

Copynghted matenal

182

Prtidos. Caselna v fenmeno de la coagulacin

dor de cuarzo, que mide el tiempo de cada entre las dos seales y se refleja grficamente en un impresor; si se quiere utilizar la viscosidad intrtnseca puede utilizarse un diluldor programado. Se obtienen as curvas como la de la figura 41, en que la forma depende de las condi cionea de la coagulacin. El mnimo aparece aproximadamente a la mitad del tiempo de coagulacin a 35 C; a continuacin, la curva asciende con rapidez, justamente antes del punto de coagulacin vi sible. 3. Recuento de partcula& Un contador electrnico (como el presentado en el captulo XVIII) permite determinar los cambios en la distribucin de las partculas segn su tamao. De esta forma se puede detectar la modificacin del estado de agregacin, antes de que se produzca una modificacin visJ. ble, contando las partculas cuyo dimetro est comprendido entre 2 y 3 .m. Cuando el nmero aumenta, se deduce que se agregan part culas pequeas. En el momento de la coagulacin visible, el nmero ha disminuido a causa de haberse formado agregados mayores. La fi gura 41 presenta las medidas acopladas: viscosidad + recuento. La ele vacin rpida de la viBcosidad por encima del valor inicial est ligada evidentemente a la agregacin de las partculas aptas para la coagula cln.
4. Mtodos pticos Los mtodos pticos (difusin de la luz, turbidimetra en capa fina, fotometra de reflexin difusa, etc.) revelan el carcter progresivo del fenmeno de la coagulacin; las curvas obtenidas no muestran cam bios bruscos; tras la adicin de enzimas hay una parte casi horizontal correspondiente a la reaccin primaria, seguida de una parte en fuerte pendiente, durante la cual se produce la floculacin visible. Estos mtodos tienen gran utilidad para el estudio del fenmeno de la coagulacin y la determinacin de los parmetros que la infiu yen; pero la interpretacin de los resultados es a veces incorrecta.

dio del coiulo.

Nota.- En el OJIPflulo XXI se deocriben len mftodos fsicos aplicablea alestu

XXIV PROTEINAS DEL LACTOSUERO (Protenas solubles)

Al Proporcin y clasificacin
Las protenas del lactoauero forman una fraccin compleja. Son las sustanciall no dalizables contenidas en el "suero isoelctrico" (obte nido tras la precipitacin de la casena a pH 4,7) y en el "suero de la

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Pr6tfdos. c-rna y fenmeno de la coagulacin


nx

183

lo'

- 0.1

t-

- 0.2f-

l'lgura 41. Evoluci n de la viscosidad (VIscomalic Flca) y del nmero de partlcula& (Couller Counler). trae la adicin del cuajo a la lecho 1 35 e (segn Guthy Y Novak.

1977).

CWIJada" (aunque ste contiene tambin caaelno(IUcopptido). Si ae excepta una parte de laa glicoprotenaa,laa prote naa dellactosuero precipitan en au cul totalidad con el cido trlcloractlco all2 %. Eataa protenu repreaentan un 17 %de laa material nitroge.nadaa de la leche de vaca (cuadro 13); una proporcin eemejante ae encuentra en la leche de otrot rumiantes; por el contrario, ea mucho ma elevada en la leche de lo mamero. monogtrico1; en la leche humana ae acerca al 60% (aunque el contenido en valor abloluto aea el miamo, unoa 6 /1). Estu sustancial pueden clasificarse en trea grupoa heterogneos, aen au aolubilldad, o bien en ocho componentes electroforticos, aegn el mtodo de Tiaelius. El cuadro 22 muestra laa proporciones y principales propiedades de estas protenaa. Un mtodo rpido, apropiado para la determinacin de todaa laa fracciones proteicas de la leche, da proporciones un poco diferentes (apartado XXX); con l ae
pyr t f'"latn ;;1

184

Prtldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

han obtenido los datos del cuadro 23, que muestra las variaciones en las leches normales y anormales de vaca. El descenso de la proporcin

de 11-lactoglobulina (la protena ma Importante dellactosuero de los rumiantes) en las leches anormales, no procede de una disminucin de la biosntesis, sino del aumento de la infiltracin de las protenas de la sangre. En el calostro hay una propiedad considerable de globu linas, lo que explica sus propiedades, que veremos ma adelante. La leche de vacas viejas se e.nriqueoe en globullnas y se empobrece en 3-lactoglobulina. Las relaciones Indicadas en los cuadros 13 y 23 cambian mucho cuando se pasa a la leche de no rumiantes. La relacin protenas solu bies/casena es slo de 0,2 en la leche de vaca, mientras que se acerca a 2 en la leche humana. Es una nocin que se debe tener en cuenta cuando se desea conseguir la "maternizacin" de la leche de vaca.

Cuadro 22. Las principales protenas dellactosuero de vaca.


Grupo del total

Carcter de solubDidad

(NH.), so.
1/2 ut. sol. insol. sol.

N~so. 1 %

TCA

Calentamiento

%
sol. insol. in sol.
Moi Jdad

tooc

Proteosa peptona
(PP)

G1obulinas (G) Albminas (A)

19 13 68

in sol. sol. sol.

sol. insol. insol. Orien

Componen tes electrofor,ticoa


(1)

G G A

13,0 4,6 19,7

pp
I'P

8,6
43,7 4,7 5,7

A A

pp

Nm. 1 euglobulina 2 seudoglobulina 3 componente 111 4 a-lactalbmina 5 componente V 6 l4actoglobulina 7 seroalbmina 8 componente VIII

- 1,7 -2,4 - 2,8 - 3 ,6 -4,5 -4,9 -6,5 - 7,8

sanguneo
sanguneo (?)
mamario
(?)

mamario sanguneo
{?)

(1) Segn Larson y Rolleri (1955); movilidad a pH 8,6, fuerza inica 0,1 .

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Cuadro 23. Variaciones de las proporciones de las protenas del lactosuero en las leches de anormales (en g por litro,( .. )% del total) . .
Valores medios Leche de 6 laetaei6n Calostro (alu 24 h) Lhede
mamitis

IIQC48

normales y
Leche de secado

Pro teosas-peptonas Globulinas (inmunes)


o.-lactalbmina + otras albminas Total
~-lactoglobulina

0,55 0,55 2,70 1,60 5,40

(lO) (10) (SO) (30)

0,64 1,01 1,78 1,72 5,15

(lO) (20) (34) (34)

1,78 11,80 4,46 3 ,00 21 ,04

(9)

(56) (21) (14)

3,50 1,98 2,55 7,71 15,74

(22) (13) (16) (49)

1,59 1,78 3,19 3,06 9,62

(17) (19) (33) (32)

Segn Asebaffenburg (1959).

186

Prtidos. Casena y fenmeno de la coagulacin

B) Propiedades generales El estudio de las protenas dellactosuero ha sido estimulado recientemente por la aparicin de nuevaa tcnicas aplicables a nivel industrial que permiten la obtencin del conjunto de estas protenas ain desnaturalizar y su fraccionamiento, tcnicas que se describirn al final de la obra. Pero hay que reconoce tambin el papel que han tenido laa presiones de naturaleza ecolgica y econmicas en la intensificacin de las investigaciones. El gran valor nutritivo de estas protenas se conoce desde hace ya mucho tiempo y se deriva de una composicin en aminocidos muy favorable, especialmente el contenido elevado de cidos sul!urados, liaina y triptfano; por esta causa corrigen laa deficiencias de la casena, sobre todo en lo que se refiere a la ciatena. Las proteosas-peptonas son las nicas que no se desnaturalizan por el calor hacia los 100 . Los otros componentes, o ses, del 80 al 90% del conjunto, precipitan en ellactosuero calentado. En laa leches ricas en casena, como la de vaca, no se observa floculacin visible, ya que se manifiesta un efecto estabilizador, corao conaecuencia de interacciones de las protenas solubles y la casena; pero si la leche calentada se acidifica a pH 4,6, las protenas desnaturalizadas precipitan con la casena entera; ocurre lo mismo si la leche se coagula con el culijo. El lactoauero se empobrece en protenas, en razn directa con el grado de desnaturalizacin. El calentamiento dellactosuero cido es el medio ms antiguo para separar las protenas que contiene, pero la desnaturalizacin es fuerte. Algunos tecnlogos dan el nombre de "lactalbmina" al conjunto de las protenas precipitables que se utilizan en la alimentacin. Aqu estudiaremos separadamente las principales protenas mencionadas en los cuadros precedentes y a continuacin varioa componentes menores, algunos de loa cuales poseen actividades biolgicas.
XXV P-LACTOGLOBULINA Esta protena no se encuentra probablemente en la leche de los mamferos artiodctilos; especialmente no la contiene la leche humana; sera por lo tanto caracterstica de la leche de loa rumiantes y de loa auidoa. En la leche de vaca es la protena del suero ms abundante (2,5 a 3 g/1). Es necesario confirmar loa datos recientes publicados sobre la presencia de 11-lactoglobulina en laa leches de mujer, yegua y
burra. La 11-lactoglobulina es bastante fcil de aislar en estado de pureza

elevada; en 1934 se obtuvo cristalizada y desde hace mucho tiempo se la considera como modelo proteico. Es un substrato comn para loa trabi\OI enzlmticoa, para los estudios referentes al enlace de los
Copyngh!ed rnatcnal

Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

187

iones a las protenas y su desnaturalizacin. Es la primera protena de la leche en la que se ha descubierto el polimorfismo gentico. A pesar del nombre que se le atribuy anteriormente y que ha permanecido en uso a causa de discusiones intiles sobre los conceptos de albmina y de globulina, esta protena se sita fundamentalmente entre las albmina por razn de su bajo peso molecular, de su gran solubilidad, su movilidad electrofortica y su naturaleza holoproteica.
10
20

30

40

SerLe uAla Met AfaAiiSerAsplleSer LeuLeu AsP Ala GInSerAla Pro~let~ Arg
50 60 ValTvr.Val Giu G lu Leu Lis-ProTrePro -GiuGIi Asp Leu G1 1e Leu Leu ~ Lis u 1
(v,uiante C) His

70 80 Trp-Giu AsngGtu Cis Ala GInLis Li slle-lle-Aia..G fuLisTre LisllePro Ala


Gli (variante 8 y C)

90 100 Val-Fen Lis leu AspAia olleAsnGiu AsnLis Val Leu Val LeuAspTreAsp Ti r Lis

110 SH 120 lisTir Leu-leu F en..CitMet Glu AsnSer Aia-Gtu -Pro--G hJ ..Q In -~r Leu {2!!} Cis Gtn.
(variante 8 SH

v C)

Ala

140 Clt L~u ValArgTre -ProGiu VJIA5PAIPGI u Ala L u..G lu l is FenA$Pl.isAialeu.

IJO

180 LJ,.Ala Leu ProMet Hisl feArg Leu Ser Fen Asn..ProTre leu GinG luGiu Gin-c ;s.

1~

162

Hi51fe.OH
Figura 42. Estructura primaria de laP-Iactoglobullna A bovina (hay 2 puentes disulfuro: 66-160 y 106-119 106-121: el grupo - SH est distribuido a partes Iguales ontral 19 y 121).

Copynqhted malenal

Prtldos. Case!na y fenmeno de la coagulacin

La !-lactolobulina es, como la a-lactalbm.na, una pequea protena cuyo peso molecular es prximo a 18.360. &te peso ee de hecho el de un monmero ; en la zona de pH que va de 3 a 7 M encuentra un d mero poco diiOCiado que jllltifica el valor de PM ~ 36.000 establecido anteriormente. A pH bajo, el dmero M d!Jocia y a continuacin ee produce un reequilibrio con formacin de ollgmeroa. Se conocen cuatro variantes genticu de la j!-lactotiJobulna de la leche de vaca. Lu variantes A y B son las ml frecuentes. Muestran diferenclu notables en sua propiedadea fialcoqumicu; la variante B es mucho msoluble en el agua en el punto iaoelctrico (B ~ 3,1 y A ~ 0,6 Jl). La variante A se octamerlza fcilmente entre pH 4 y 5; la variante B, dllcUmente, y la C, nada. El cido aaprtico suplementario en la variante A debe formar parte del centro activo de la poli merizacin . El bloqueo especfico de loa - COOH impide la formacin del octmero a pH 4,65. No es posible la hibridacin entre las dos variantes A y B en estado de polimerizacin. El polimorfiamo de esta protena tiene tambin una significacin biolgica. La 1!-lactolobulina es un inhibidor de la foalataee de la rata actuando sobre substratos de bajo peso molecular; pero la actividad inhlbldora cambia mucho de una variante a otra (en nmero proporcional; 4, 2, 1 para A, B, C). Ea poalble que esta protena tenga un efecto regulador sobre el metabolhmo de los fosfatos de la glndula mamarla. Por otro lado, ae ha 1uerido una relacin entre la forma de la 1!-lactoelobulina y la cantidad total de ca~ena producida, siendo el genotipo A superior al B. La estructura primaria de la 1!-lactolobulina bovina ae conoce completamente (figura 42). La molcula est formada por una sola cadena peptdlca de 162 restos de aminocido. La cadena est replegada sobre s rni.ma, estando asegurada la eatructura terciaria por dos puentes S-8 y queda un grupo sulfhidrilo libre. La 1!-lactolobulina de la leche de otros rumiantes tiene algunas diferencias bioqumicas; las de cabra y oveja tienen una cadena pept!dlca un poco ms corta que la de vaca. Esta protena est organizada ml regularmente en su estructura aecundarla que las ca~enas, pero slo ee dl.lpone de Informes contradictorio: la cadena peptdica tendra del10 al20 t de hlice a y del 20 al 40 t de estructura antparalela. Se ha de.cublerto en escas proporcin en las randes razaa -bovlnu un derivado gllcoeilado de la 1!-lactoelobulina. Ea probable que est fijada a la uparagjna una cadena corta de 9 reatoa glucdicos. Esta variacin de la composicin aumenta la solublidad de la protena y retarda la proteliJia enzimtica. A la temperatura ordinaria de la lecbe,la P-lactoglobulina no perece estar ligada a otras fracciones proteicaa; por el contrario, en el curso del calentamiento, forma un complejo con la casena K. Este complejo es ms estable que sua componentes Mparados; el enlace se reapyr ttE'd fl'atcr di

Prtidos. Caseina y fenmeno de la coagulacin

189

liza mediante un puente dlaulfuro. La lllactoglobulina es el principal portador de grupos sulfhidrilos, que son modificados o separados en el cllt8o de la desnaturalizacin y que intervienen en la formacin del "gusto a cocido" de la leche tratada trmicamente (captulo IX). Recientemente se ha descubierto en el Japn una singular prople dad de la lllactoglobulina: forma un fuerte complejo con el benzopi reno, compuesto cancergeno contenido en el humo de tabaco; se es pera que forme parte de los filtros para cigarrillos.

XXVI LAS ALBUMINAS


A) oclectalbmina Es el componente proteico ms caracterstico del suero lcteo, pues parece estar presente en la leche de todos los mamferos. En la leche de los rumiantes ea el segundo componente, tras la oc-lactoglobulina; en algunas especies monogatricas es con frecuencia el primero. Posee un gran inters cientfico por dos particularidades: 1. Desde el punto de vista funcional, la alactalbmina es el factor de regulacin de un sistema enzimtlco original: la protena A, que es en s misma una enzima que transfiere la galactosa sobre la glucosa mina (para formar la lactosamina u otros derivados); la protena Bes idntica a la oclactalbmina; se enlaza con la protena A por simple adsorcin y tiene el papel de modificador de la especificidad; las dos protenas reunidas transfieren la galactosa sobre la glucosa, aseguran. do as la sntesis de la lactosa. 2. Desde el punto de vista estructural es una protena muy prxi ma a la lisozima de otras especies: pesos moleculares prximos, ami nocidos terminales idnticos, presencia de 4 puentes -s-s-, amplia correspondencia en la secuencia de los aminocidos. Ahora bien, la lisozima es una enzima cuya actividad concierne tambin a los enla ces osdicos y cataliza la hidrlisis de los mucopolisacridos. Estas dos protenas se sintetizan bajo el control de genes que provienen de un gen ancestral comn; posiblemente, en su da, se produjo una du plicacin en el paso de reptiles a mamferos. La aparicin de la oclac talbmina debe estar relacionada con la diferenciacin de la glndula mamaria. Algunas diferencias, en especial la que se refiere al amino cido nm. 32, que corresponde al nm . 35 de la Jlsozima de la clara de huevo de gallina (cido glutmico reemplazado por la histidina), explican que la oclactalbmina no tenga actividad hidroltica. La oc-lactalbmina es una pequea protena de un peso molecular prximo a 14.200; su estructura primaria est representada en la figura 43. Se ha observado la presencia de dos variantes genticas A y B. En
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Prtidos. Caseina y fenmeno de la coagulacin

las razas bovinas europeas no se encuentra ms que la variante B. La variacin no se refiere ms que a un aminocido. Loa 8 restos de cistena de la molcula forman 4 puentes -s-s-. Esta protena es considerablemente rica en triptfano: 4 reatos por mol, o sea, alrededor del S%. Es posible que la a-lactalbmina contenga normalmente un tomo de calcio por molcula. Pero lo que s es cierto es que puede estar ms o menos glicosilada, lo que puede ser causa de heterogeneidad. La forma glicosilada est presente en la leche de vaca en escasa proporcin; por el contrario, predomina en otro tipo de leches: coneja, rata, etc., y no existe en la leche humana.

10 20 H. Glu G1n LeuTte~Us ClsGiu VaiF ent3!j GluLeuLis Asp Leu Ls GilTi rGIIGii
(variante Al Gln

30
Val.$er-Uu-Pro-Giu Trp-Val Ci$ -T re-1re-Ftn-HisTte Sef -Gii TirAsp Tre-GiuAfa

50

60

lfe.Vai-G iu-Ar.n -Asn-Gfn.Sr ThrAsp Tir Gii LeuFen.Qin lleAsnAsn Lis-lle T rp

80 10 Cis LisAsn Asp G1n Asp-Pro His-Ser -Ser. Asn lit CisAshlleSer Cis Asp l is F en
90 100 LeuAsnAsnAsPLeu.Tre As.n Asnlle-Me t CisValLis Lls lle Leu-Asp-l is.Va IGI i .
110 120 lleAsn Tit Trp LeuAla Hit Lis Ala Leu CisSer GiuLisLeu AsnGin TtPLeu Cls

123 Glu LisLtu.OH

Figure 43. Estructura primaria de la crlactalbUmlna B bovina {hay 4 puentes di:Sulluro:

6-120. 28-111. 61-77 y 73-91).

Puesto que la a-lactalbmina no contiene grupos -sH libres no debera poder ligarse a otras protenas por puentes disulfuro; a pesar de ello, ciertos autores admiten que puede tomar parte en la formacin de complejos con la casena , como la a-lactoglobulina,lo que implicara una modicacin estructural.
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Prtldos. Case/na y fenmeno de la coagulacin

191

B) Serollbmina El componente nm. 7, revelado por electroforesis por Tiaeliua, es idntico a la eeroalbmina sangunea: la misma compoaicin en aminocidos, el mismo peao molecUlar (69.000), las mlama propiedadea electroforticu y mgnticu, y la miama cintica de desnaturalizacin trmica. lA eatructura de eata albmina no eat suficientemente aclamda; eat formada por una cadena peptdica nica con numeroaos repliegues eatabillzados por puentea diaulfuro. lA saroalbmina tiene la facultad de ligane reversiblemente a auatanciaa muy variadas.

XXVII INMUNOGLOBULINAS. TRANSMISION DE LA INMUNIDAD


La leche contiene globullnas que preaentan grandes analogas con las inmunoglobulinas (Ig) del suero sanguneo. Su peso molecular es cercano a 180.000; contienen una parte prosttica glucdica y posaen las deatacadas propiedadea inmunolgicas de las gamma.lobulinas, que representan una reunin de anticuerpoa. Son las mayorea molculas que se encuentran en la leche, y, entre las protenas, son las menos cargadas y las ms lentas en los exmenes electroforticos. Por otra parte, las globulinas aon las primeras en desnaturalizarse durante el calentamiento de la leche (captulo IX). Recordemos que los anticuerpos constituyen un sistema de defensa del organismo animal y se fijan selectivamente sobre los aentea reaponsablea de una agresin: los antgenos; de esta manera, las protenas extraas son inaolubilizadas, y lisadas las clulas microbianas. La leche perfecta contiene muy poca cantidad de estas globulinas; un promedio de 0,6 g/1 en la leche de vaca, o sea escasamente el 2 % de las protenas totalea. Por el contrario, en el calostro abundan hasta 12 g{l el primer da y 80 g/1 la primera hora; el descenso es muy rpi do en los das siguientes al parto. Las inmunoglobulinas de la clase G (IgG) predominan en el suero sanguneo de las dversas especes y en el calostro y la leche de vaca (80 a 90% de las Ig totales); son las globulinas ms bsicas y ms lentas en la electroforesis, y contienen pocos glcidos (3 %). En la leche y en el calostro de los no rumiantes, predominan por el contrario las Ig A, que son ms rpidas que las anteriorea y contienen del 8 al10% de glcidos. En el caao del calostro y la leche de vaca representan ms del 5 al 10% de las inmunoglobulinas. Las IgM se encuentran en escasa proporcin (alrededor del 7 %), como en todas las secrecionea. El cuadro 24 reaume las principalea propiedades de estas protenas. A ello hay que aadir que las IgA estn constituidas frecuentemente por dos monmeros relacionados por un segmento glicoproteico es

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Prtldos. Ca.selna y fenmeno de la coagulacin

pecial: el componente secretor, que tambin puede encontrarse en estado libre (FSC) en la leche. El origen sanguneo de las globulinas inmunes de la leche de vaca ha sido admitido en general hasta estos ltimos aos, pero se ha demostrado que la glndula ma.maria puede sintetizar una parte de estas globulinas. La concentracin de tipo neosintetizado depende del esta do hormonal y del perodo de lactacin. El tejido mamario puede producir mucho FSC y un poco de globulinas, principalmente IgG. La inoculacin de vacunas estreptoccicas en un ganglio provoca la formacin de IgG en un solo cuartern de la mama. Por otra parte, se ha tratado de aplicar esta propiedad con fines profilcticos para evitar las mamitis.

Cuadro 24. Las inmunoKlobulinas


laG (1)
Peso molecular Constante do tedimentacin Glcidos (%) Cldena H caracterstica (2) Papel biolgico principal

laA
(160.000)x2 11 S

. 160.000 7S

18111 960.000 19 S
11

..,

8 a
especificidad de grupo

funcin normal de anticuerpos

. soaglu-

tininas

sanguneo

J&G 2 , ampliamente pre dominante en la leche . , (2) Cadena pesada (H) PM = 60.000; cada monmero comprende dos cadenas H y dos cadenas Ueras (l) PM = 20.000; estas ltimas pueden ser las ma mas en las diferentes clases.
(1) Subdivididas en subcla."'s: IG 1 (seudolobulina) e

Sin embargo , un carcter original de la glndula mamaria es su fa. cultad de transferir cantidades elevadas de lgG 1 , que aseguran la transmisin de inmunidad de la madre al animal joven, ya que en al gunas especies el recin nacido carece de anticuerpos. Se ha demostrado, por ejemplo, que el paso de aglutininas de Brucella abortus de la vaca a su ternero, se realiza por intermedio del calostro materno. En la especie humana, la placenta es permeable a las Ig y la transmi sin de la inmunidad se realiza por las dos vas : placentaria y calostral. En la fraccin globulina de la leche se encuentra tambin un inhibidor de la tripsina que quiz tenga influencia en la transmisin de la inmunidad impidiendo la hidrlisis de las globulinas anticuerpos por las proteasas intestinales. Se ha demostrado que la pared intestinal de los bvidos jvenes es permeable a los anticuerpos aportados por
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Prtldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

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el calostro durante loa dos primeros du de vida, y eeta inmundad puede mantenene durante varias semanu. Tambin 118 ha comprobado que Mol anticuerpot son ms reailtentea a la protelisis por las enzimu d.igestivu que loa procedente. del JUerO AJl8Uneo. Lu inmunOSlobulinu del calostro, y luego de la leche, pueden actuar a partir del tercer da, en el intestino impidiendo las poluciones microblanaa. Lu leches enriquecidaa en anticuerpos podran aer un medio prctico paraaaecuraruna mejor reailtencia a dete.nninadu enfermedades. Debe 118alarae aqu otro componente del aiatema Inmunitario. Se trata de la fJ 2 -mlcroglobulina, en la que el tetrmero eat conatitudo por la "lactollna", que precipita a pH 4,6 con la casena de la leche (subttulo XI). Ea una de las subunidlldea del anteno de hlstocompatlbilldlld H.L.A., que est localizlldo en la superficie de las clulas y que ea, entre otros, el responsable del rechazo de injertos.

XXVIII FRACCION PROTEOSA.PEPTONA GLICOPROTEINAS Y METALOPROTEINAS


A ) las Protllot~1Dnes

Se trata de una fraccin pequea, de la manitud de las inmunOSlobulinu (0,6 g/1), eatudillda sobre todo en la leche de vaca (no se han encontrado sustancias parecidas en la leche humana). Eatu sustancias estn lncludaa en el grupo de las protenu porque precipitan en gran parle por el cido tricloractico all2 %y no se dialinn; aunque ae distinguen de las anteriores por el hecho de que no precipitan por calentamiento a 95-100 C. Tambin su composicin es diferente; aJcwu contienen glcidos en proporciones notables y faforo. Se puede aadir a este grupo la protena soluble de la "membrana" de loa p 6buloa ~.que tiene laa mlamu caracteraticaa y probablemente 118 encuentra tambin en el plaama. Se han ialado diferente. sustancias, entre las que podemos destacar: l. "Proteoaa-peptona" (aegn Rowland), parte no dializable del ladoluero lsoelctrlco, procedente de la leche calentilda a 95 C. 2. "Sima-proteoaa", subltrato precipitado por el aulfato amnico a 118miaaturaci6n, en ellactosuero anterior. 8. "COmponente 5"; precipita con la casena cuando ae satura la leche (no calentada) con NaCI; a continuacin ae le separa a pH 4,6; la casena precipita tola de la solucin intermedia. El origen de eatu IUitanciaa no se ha determlnlldo claramente haste hace poco. En realidad, no son complejos producidos por loe tra-

y hted 'lla

al

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Prtldos. Ceelna y fenmeno de la coagulacin

tamientos trmicos, como ae haba supuesto, pues ee lee aisla tanto de la leclle cruda como de la calentada. He aqu un resumen de loa conceptos actuales. Se trata de una fraccin compleja y los exmenes electroforticos ponen de relieve bandas numerosas, pero son cuatro los componentas que dominan y forman un grupo heterogneo. Se han conservado las denomina cionea del cuadro 22 y ae ha deedoblado una de las sustancias: - "Componente 3" (PP-8): parece aer una glicoprotena original, probablemente idntica a la existente en la membrana de loe glbulos grasos y que slo se encuentra en el lactosuero. Su P!ll te prosttica contiene de 16 a 17% de glcidoe (de los cualea el 3% es cido silico). Su peso molecular es prximo a 22.000, pero esta molcula se polimeriza fcilmente. -"Componente 5" (PP5): fragmento de la casena Jl (1105) P.M.: 16.000 -"Componente 8J" (PP-8.1): fragmento de la casena (29-107) P.M .: 9.000 - "Componente 8.r" (PP.S.r): fragmE>nto de la casena fJ (128) P.M.: 3.600 Los componentes 5, 8 lento y 8 rpido no son, puea, protenas originales. Su posicin en la secuencia de la casena fJ se precia& en la fi. gura 25, y su composicin en aminocidoe se deduce de la figura 24. Una parte de estas sustancias se encuentra libre en el lactosuero y otra parte est asociada a la casena. Si se admite el sistema de formacin explicado en el subttulo Xlli-B, las composiciones atribuidas por varios investigadores -recogidas en la reciente revisin de Whlt ney y colab. (1976)- seran falsas, ya que implican gJcidos; adems, la concentracin en fsforo no concuerda con la secuencia dada, salvo para 8.r (2,1 %). A estas sustancias se atribuyen propiedades particulares. El "componente 5" aer a la causa del efecto deprimente en el volumen del pan adicionado de lactoeuero. La "aigma-proteoaa" es la fraccin nitrogenada de la leclle que posee la mayor actividad de superficie (des censo de la tenain superficial, captulo IX). La "protena menor", extrada dellactosuero procedente de la coagulacin por el cuajo, se ra el substrato de la reaccin activada por la luz solar que conduce a la produccin de laborea anormales, del gnero de la oxidacin. Las proteosas-peptonas aon inhibidas por la liplisis en la leclle de vaca. El "componente 3" es el ms eficaz, y probablemente la consecuencia de una interaccin con el substrato.
B) Metaloprotllnas

El Jactosuero contiene protenas que fijan especficamente el cobre y el hierro, con una constante de asociacin elevada y haciendo interve nir puntos de fijacin. La estabilidad del enlace metal-protena es

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Prtldoa. C..lna y l8n6meno de la coagulacin

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butlnte pomde y , lin embargo, es reftnible. Eltu protena& tienen UD papel a.pital en el tmnaporte de los metales en el orpnicmo. a) Lac:u.: enina. Elta prote na ea difuente de la tranaferrina lllllunea y prui ..blemente es idntica a la "protena roja" que precipita con la cuena a pH 4,6 {IUbttulo X). La lac!toferrina bovina tiene un pe.o molecular de 88.000 y fija doa tomoa de hierro por molcula (contenido en hieno: 0,11 %). Lo mismo que todu tu slicoprotenu (7 ,2 %de Jcidoa) tiene una sran aolubWdad . La lactoferrtna humana ea muy parecida,pero no idntica.
Bata protena tiene mayor alinidad por el ion ftlnico que la transfenina IIJliiiDea; interviene en la introduccin del hierro en la leche a partir de la 'lngre.

La p..-ncla de hieno en la molcula hace a eatu protenu ma reailtentea a lo tratamiento deanaturallzantea (calor, 1\lltanciu q: micat) y a tu enzim11 proteolticu. La forma incolora, privada . hierro ("apoprotena", .eparada en medio cido), ea meno,ulid Se ha comprobado una actividad bacterloattlca debida al lilten "becterioataaa ferripriva", que acta contra loa prmenea infeccio8c pellroloe para la. lactantes, especialmente contra Etc'-ch/4 coh Tambitl.n te ha puesto en evidencia una actividad antitxica debida l la lactoferrin.a. &y que tener en cuenta que el contenido en lac:tofe trina te eleva en la lec:be con laa mamitis y podra manlfestarae UD efecto bacteria.ttioo en la mama. La leche de vaca contiene como trmino medio 0,1 111 de lactoferina. Se ha encontrado deaput en otraa aecrecionea intemaa del organiamo ; por lo tanto , au bioanteail no et limitada al tejido mamario.

b) Tran{eiTiM. Procede de la eansre y ae encuentra en cantidad catl Igual a la anterior en la leche de vaca. En la eepecle humana, la tranafenina tiene menor afinidad por el hierro que la lactofenina.
e) C.ruleopkumlnG. &ta protena fija 0!6pec0camente el cobre pero interviene tambin en la movilizacin del bierro por la tnns-

fenina; probablemente ea de origen anuneo.


Nota.- La lecho conU.rw onslmoo do hiena bnlco que capitulo vm (pero1iduo, eatau).
11

ootudlarn on el

- El aapecto biolgico del estudio de laa protenu del euero ha dado lupr a una amplia remin reallnda por Blanc (Aiaia y Blanc, 1974).

196

Prtldoa. Caselna y fenmeno de la coagulacin

C) Protefnas imperfectamente carectarlzada Se han aialado sobre todo de la leche humana y podemos citar entre otras: - Glicoprotenas factores de crecimiento del LactobacUlue blfldue muy ricas en galactosa, frucoaa, glucooamina y cido ailico. - "Galactotermina", probablemente le homloga de la casena 'Y> bovina, tambin termosenaible.

XXIX MATERIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS (NPN)


Se trata de sustancias de molculea pequeas, que pertenecen a varias familias qumicas; atraviesan fcilmente lea membranas de dilisis y se solubilizan en presencia de cido tricloroactico al 12%. En la leche de los rumiantes no representa ms que una pequea parte del nitrgeno total, del 5 al 7%como trmino medio; en la leche humana es una de las fracciones ms importantes (15 a 25% aunque en valor ), absoluto el contenido est prximo al de le leche de vaca (como trmino medio 1,6 g/1). En le leche de vaca, le cantidad de sustancias nitrogenadas no proteicas puede variar bastante; al parecer, la alimentacin tiene la mayor influencia: los valores extremos se encuentran al final del perodo de estabulecin (l,lg/1) y en verano (2,9g/l). Los componentes de esta fraccin protdica son numerosos; cada uno de ellos se encuentra, pues, en cantidades muy pequeas. El ms abundante es un producto de desecho, le urea; su presencia en la leche de vaca se halla en le proporcin media de 0,25g/l, pero con variaciones importantes, en relacin con el nivel de aportes nitrogenados en le racin (20 a 40% del NPN). En le vaca existe una estrecha correlacin entre el contenido de urea de le leche y el de le sangre. Ms adelante veremos que la urea es un factor de estabilizacin de la suspensin micelar en el curso del calentamiento de la leche. Aliado de la urea se encuentran la creatina, la creatinina y el amonaco. Pueden encontrarse adems en la leche sustancias que tienen un papel importante en la biosntesis de los componentes caractersticos de la leche, en especial los nucletidos y lea sustancias que constituyen sus precursores, como las bases nitrogenadas, el cido ortico, etc. En lea leches de diferentes especies no se encuentran los mismos nucletidos; le cantidad de estas sustancias en la leche de vaca es escasa, pero en cambio, sta contiene cido ortlco en una proporcin relativamente elevada. Puede decirse que existe una relacin entre el contenido de nitrgeno no proteico de la leche y la sntesis proteica a nivel de la glndula mamaria. La leche cruda contiene aminocidos libres. En le leche de vaca, el ms abundante es el cido glutmico (30 a 50 mg/1) y la glic.ina. Hay
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Prtldos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

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tambin ariginina, cido uprtico, &erina, lilina y valina en cantidades variables de 2 a 10 mgfl para cada uno; se encuentran tambin presentes otros aminocidoa en Cantidades ma pequeas. Adema,la leche contiene sterea foafrlcoa de eatoa aminocidos y sustancias afines, como foafoaerlna, foafoetanolamina, etc. Uno de eatoa steres abunda especialmente en la leche de vaca; se trata de la foafo.gliceroetanolamina (60 mg/1). En esta fraccin no parecen existir pptidos. La taurina, aminocido de grupo sulfrico, NH2-<::H2 -<::H2 ~03 H, se ha encontrado en el NPN, mientras que nunca est presente en 1ae protenas. Sera esencial para loa nios recin nacidos. Ea un neuromediador. Debido a la presencia de estas sustancias. as como de vitaminas del grupo B, que son sustancias nitrogenadas, la fraccin no proteica tiene un papel importante en la nutricin de 1ae bacterias. Probablemente, el cido glutmlco ea la primera fuente de nitrgeno para ellas, puesto que su proporcin decrece con bastante rapidez en la leche conservada. Sin embargo en las leches fermentadas aparecen otros aminocidos, donde esta fraccin puede representar ell% de nitrgeno total de la leche. El calentamiento de la leche a temperaturas de eeterllizacln provoca un aumento considerable del contenido de materias nitrogenadas no proteicas, como consecuencia de la degradacin de 1ae protenas. Prosigue la recopilacin de sustancias nitrogenadas no proteicas. Algunos componentes, presentes en muy pequea cantidad, pueden tener una intereaante significacin biolgica o prctica. Por ejemplo, recientemente se ha encontrado, en cantidad nfima (0,2 mg/1), la cinurenina o 3-antranililalanina, que es un aminocido resultante de la degradacin del triptfano. Ahora bien, este aminocido es un precursor del sabor desagradable de las leches en polvo o concentradas (sabor a viejo, a pasado, a cerrado ),ligado a la presencia de la 0-aminocetofenona.

XXX PRINCIPIOS DE LA DETERMINACION DE LAS MATERIAS NITROGENADAS


A) Determinacin indirec1ll Es prcticamente imposible determinar directamente 1ae materias nitrogenadas totales o los principales componentes nitrogenados, por aislamiento y pesada. No se dispone, como para 1ae materias grasas, de mtodos que permitan una separacin completa y fcil de las sustancias que se desea valorar y que terminen en una medicin de peso
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Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

o volumen. No obstante, en el caso de la casena, se han realizado algunos intentos de determinacin directa rpida, pero no han tenido xito. Pueden usane mtodos analticos basados en la composicin o en determinadas propiedades de loa componentes protdicos, que ya hemos estudiado en este captulo. Pero, como se trata de una mezcla, a la vez compleja y variable, estos mtodos no pueden dar ms que valores aproximados, no solamente para las materias nitrogenadas totales, sino tambin para las tres grandes fracciones: casenas, protenas del lactosuero y sustancias nitrogenadas no proteicas. Esta esti macin ser tanto ms precisa cuanto menos variables sean las proporciones relativas de loa componentes, y ma general la propiedad considerada.
La reserva anterior es vlida, sobre todo, para los mtodos basados en la presencia de determinados grupos funcionales, como los grupos

- NH 2 , que reaccionan con el formol, o los grupos bsicos y cidos que reaccionan con los colorantes dotados de una carga contraria, y en los mtodos basados en la presencia de alunaa molculas que tie nen propiedades especiales, como los aminocidos de ncleo aromtico causantes de absorcin a la luz ultravioleta y de fluorescencia. Tambin es vlida por la propiedad ms general de los prtidos, que es la de contener nitrgeno. Los diferentes componentes no contienen el mismo nmero de -NH2 librea, de grupos con carga, ni tampoco la misma proporcin de tirosina y triptfano; su contenido de nitrgeno se encuentra entre 12,5 y 15,7% (para las protenas). Si se considera el valor de la leche como alimento o como materia prima para la fabricacin de quesos y productos concentrados o dese cados, no todas las fracciones nitrogenadas poseen el mismo inters. La fraccin nitrogenada no proteica es poco interesante desde este punto de vista, y representa una considerable causa de error, en algunos mtodos; en consecuencia, ser lgico eliminar esta fraccin antes de la determinacin de las protenas, a causa de las interferencias que ocasiona. En la prctica se puede sustraer 1,6 a las materias nitrogenadas totales en gJl; o rebajar el factor del nitrgeno total (Kjeldahl, indicado a continuacin). En quesera tradicional, solamente la casena tiene Importancia entre los prtidos . .La separacin de la casena o de las sustancias nitrogenadas no proteicas es bastante fcil de efectuar; sin embargo, no permite la aplicacin en serie de mtodos rpidos de valoracin. Es preciso observar que, en el caso de la leche de vaca y en las condiciones actuales de cra de ganado,las variacio nes naturales de la distribucin de sustancias nitrogenadas son de una amplitud bastante limitada. No obstante, cuando se aplican los mtodos analticos a las leches Individuales, las anteriores observaciones deben considerarse con mucha atencin.
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Pr6tldoe. CaMina y fan6meno de la coagulacin

199

tqeldlhl) El mtodo m encto y preciso es el de Dum111, utilizado en el anlilia oJ'Inico elemental, que pennite valorar todu 1aa fonDa~ de nitrgeno . Se trata de un mtodo delicado que exle numero- manipulaclona y que ya no ee emplea en loe laboratotloe especlaliuadoa en el estudio y an41ia!a de loe productos alimenticio; hace ya mucho tiempo que el mtodo de Kjeldahllo ha suplantado como mtodo de referencia. El defecto del mtodo de Kjeldahl, que es el de no permitir la determinacin de todas lu fonDa~ de nitrgeno, importa poco en el cuo de la leche, que no contiene ms que muy poco nitrgeno heterocclico (lmldazol de la blstldlna e Indo! del trlptfano). Puede decirse que ea un mtodo seguro y bien conocido despus de una larga experiencia, en sus dos versiones micro y macroanaltica. En este mtodo, la materia orgnica se destruye con cido suUrico; y el nitrgeno pua a la forma de sulfato amnico. Con objeto de elevar el punto de ebulllci6n y acelerar la digestin, ae utlliAn diferente. catalizadores; el ms recomendable es una mezcla de selenio y sulfatos de potasio y hierro (lu sales de mercurio y cobre pueden dar lugar a errores por defecto) . El amonaco se desprende mediante sosa, se destila y se valora con una solucin cida, deci o centinormal. Se han propu. sto numerosas variantes para evitar la destilacin, vae lorando colorimtrlcamente el amonaco; entre ellas pueden citarse el mtodo yodomtrlco, el de Neuler y el de la ninhldrlna. Estos sistemas no se han difundido. El mtodo de Kjeldahl es conveniente para los trab!ljos precisos, reafu.ados con un nmero restringido de muestras, pero no para los anll.sls de rutina aplicable a muestras muy numerosu y cuyo precio ha de ser beJo. Sirve de mtodo de referencia, con el que se comparan los mtodo rpidos. Utilizando un factor que vara de 6,24 a 6,40, se pueden transformar loe resultados en pesos de protena. Un valor butsnte usado es el de N X 6,38, que corresponde a un contenido de nitrgeno de 15,67% , que ea el de las principales protenas de la leche. Para lu gllcoprotenas, el factor se he1Ja comprendido entre 7 y 8; en cambio, para lu SUBtanciu nitrogenadas no proteicas, puede ser muy bajo (para la urea es 2,1 ). Finalmente, hay que observar que el Kjeldahl valora las sales amoniacales eventualmente aadidas a la leche, lo que no ocurre con los mtodos que solamente valoran lu protenu. C) Determineci6n del nitrgeno de los IM'incipeles componentes protldicos de le leche El mtodo de fraccionamiento qumico que da la mejor separacin de loa principales componentes nitrogenados, es el esquematizado en
o r Qrte r a r al

Bl 01181mi11Ki6n del nllr6gano (Mtodo de

200

Prtidos. Casena y fenmeno de la coagulacin

la figura 44 (mtodo de Rowland modificado por A6Chaffenburg y Drewry, 1959). Este mtodo evita el calentamiento de la leche o del

suero isoelctrico, para la separacin de las proteosas-peptonas, valindose de su sensibilidad al sulfato sdico. El nitrgeno se valora

N.P.N.

11
Fi.ltr*'o (1 )

P.P.

12% so.Na,

~
P.P glob.

111

leche + T.c.A.- 1~ ~

IV

Leche .- 20%

so,.~

~~- ~- - -
..IJ, &lelo
o( . alb.

! l
1

V
Flltr.OO (IV)

1 1

~~L..-1
(PmctpilMo)

P.P. Qlob. , . - - - - - - -- ,

HCi an pH
(Filtrado}

Figura 44. Fraccionamiento de las materias nitrogenadas de la feche. (La cr-lactoalb Umina pura no forma ms que 2/3 dala fraccin "' Q'&lb.).

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Prtldos. Caserna y fenmeno de la coagulacin

201

con el KJeld<Jhl en los nitrados, y conociendo el nitrgeno total,Nt, y el nitrgeno de cada filtrado, N,, N,,- (todos los valorea se refieren a 100 g o a llitlo de leche), puede calcularse: Nitrgeno de la caaena ............ .. ..... . Nt-N 1 Nitlgeno de las proteosas-peptonas . . . . . . . . . .. N1 N1 Nitlgeno no proteico .... . .. . . .. . . .. . .. . . N3 (directamente) Nitlgeno de las albminas .................. N. -N, Nitlgeno de la 11-lactoglobulina . . . . . . . . . . . . . . N5 -N 3 Nitlgeno de las inmunogiobullnas ............ N2 -N4 Evidentemente se tlata de una determinacin bastante larga, reservada al anlisis de la leche que no ha sufrido un calentamiento que provoca la desnaturalizacin de las protenas.
O) Mtodos especficos

l. Los mtodos electroforticos corrientes no permiten calcular con exactitud las proporciones de las tracciones separadas. Mediante la "densitometla" de una separacin electrofortica revelada por un colorante apropiado y por medio de un aparato que mide la absorcin de la luz, se puede obtener una escala de valores para cada uno de los componentes, en porcentaje del conjunto de las fracciones. La estandarizacin rigurosa de las condiciones de la electroforess en tubo de gel de poliacrilamida, con la utilizacin de contrastes internos de la preem!gracin, permite un anlisis bastante precso de las protenas del lactosuero y se aplica especialmente a los estudios de la desnaturalizacin trmica (Hiller, 1976).

2. Lo mtodos lnmunoqu micos tienen la ventlija de su gran especificidad y de permitir la dosificacin en serie en medios muy complejos en los que las protenas a determinar pueden encontrarse en conoentracin muy bllja (0,01%). Pero son menos precisos que los mtodos qumicos, cuando stos ellisten, y adems exigen un antisuero, obtenido generalmente por inmunizacin de conejos. Este mtodo se ha aplicado a la determinacin de la 11-lactogiobulina por Larson y Tvarog (1961); se reduoe a la medicin de la altura de una zona de precipitacin en un tubo donde se superpone la solucin de protena y el suero anti-11-lactogiobulina gelosado. 3. Los mtodos inmunoelectro(orticos, combinacin de los anteriores, se utilizan en la prctica analtica corriente. La electlo-inmunodifusin o ''rocket" electroforess, ha dado buenos resultados en la determinacin individual de varias protenas de la leche, utilil'ndose corrientemente la tcnica de Laurel!. Posiblemente pueda resolver el difcil problema de la determinacin de la leche en polvo utilizada en mezclas alimenticias que contienen otras protenas.
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202

Prtidos. Casal na y fenmeno de le coagulacin

E) Detllrminacin qumica de la matarla ni1rogeneda totala

de la leche Un mtodo rpido de determinacin de las materias nitrogenada de la leche, suficientemente preciso y fiel, interesa deade varios pWltos de vista:

- seleccin de Wl ganado lechero productor de leche rica en protenas; - pago de la leche a los productorea segn el contenido de materias nitrogenada, principalmente en las regiones quesera; - experimentacin sobre el ganado lechero (influencia de la alimentacin, etctera); - medida del rendimiento en queao, ya que este producto est esencialmente constituido por la mayor parte de la materia grasa y nitrogenada de la leche. Entre los numerosos mtodos propuestos, solamente tres se utilizan todava en la prctica. l. El mtodo ms rpido y el menos costoso, es el mtodo del formol. Hemos visto que se reduce a Wl8 valoracin acidimtrlca. El vo lumen de la solucin de aosa valorada, necesaria para neutralizar la acidez resultante de la adicin del formol, es proporcional a la cantidad de protenas y de aminocidos libres presentes. El factor de conversin, utilizado para expresar el poreentaje de protenas en la leche, vara sensiblemente para las diferentes regiones, segn los autores. Se ha llegado a la conclusin de que adolece de un defecto de precisin, especialmente cuando se trata de aplicarlo a leches individuales, y ello a pesar de las diferentes mejora que se han aplicado a la tcnica primitiva (en especial la adicin de oxalato potsico, 9:ue precipita el calcio y elimina as la interferencia de los fosfatos clcicos). Por el contrario, puede ser til en la industria lechera propiamente dicha para la medicin de los niveles de protenas en las leches de mezcla en el interior de las fbrica, as como para el estudio de los rendimientos en quesera. 2. El mtodo de Ko(rony ha permitido su aplicacin a la valoracin en serie. El sistema es Wl8 simplificacin del procedimiento de Kje/d4hl, del que solamente se conserva la destilacin alcalina, suprimiendo la mineralizacin cida. No todo el nitrgeno de las protenas se transrorma en amonaco, pero la relacin entre la cantidad total de nitrgeno presente en Wl8 protena y la que se transforma en amonaco es relativamente constante, si las operaciones analticas se realizan de manera Wliforme. Los resultados son buenos, pero los costos de instalacin resultan mayorea que con loa mtodos basados en el empleo de colorantes.
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Pr6tl00.. CeleiM y fenmeno de la coagulacin

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3. El mltodQ oolorimitrico, con ~/ MfNHimldo ee ha recomendado d..tte haoe tiempo para Jaa ~tenninacione. en IJ'&D~ .mes, en oentlol bien equ!J*ioa, oon un oosto comparabM al de loa anlisis butiromtriooe para la INiA!ria ~~- Se haoe raccionu con la leche Wl exoeeo de aolucin colorante en un tampn foafatotcitnto a pH 2,45; loa volmenes de leche y colorante ee fijan de una \'eZ parallempre. Deap~Mi de precipitar Jaa protena~, ee determina el exoeeo ~ colorante por medicin de la densidad ptica delaobrenadante. CUanto mayor es la cantidad de protenaa, m dbU ea la denaldad ptica. La aplicacin del mtodo a un nme.ro ruficlente de muettras de leche y la valoracin simultnea de nitreno total por el !Mtodo Kje/dahl permiten trazar una curva de regresin que ea recta dentro de cierto llmitea. De este modo se puede calcular, para cada valor de demldad ptica ledo en el fotmetro, el correlpondlente contenido de protena en la leche. La capacidad de fijacin del colorante por Jaa protenq ~la leche no ea la mbma para cada una de ellaa. La caeeina fija meno. colorante que w proteinu aolubles: respectivamente 860 y460 me de negro amido por cada sramo de protena. CUando el contenido~ casena vara, ee produce una compensacin con lat proteinat aolubles, que f\ian fuertemente, y la fraccin nitrogeoada no proteica, que no fija prcticamente nada o poco colorante. La varlacl6n de 1at proporciones relativat de lot componentes no altera la relacin exlatente entre el multado de la determinacin de maten.. nltroenadq de la leche por el m41todo Kje/dahl y el resultado obtenido por el mtodo de fijacin del colorante. Eete mtodo puede aplicane a nil'el de pequei'loa laboratorios, pero en oate caao la arantia de exactitud 08 m{nlma. Cualquiera que aea la tcnica a utilizar, es preciso tener en cuenta la necesidad de un claro exceso de colorante. La razn de ello 08 que con un dficit de colorante, antea del punto de equivalencia, se forman combinaciones protena-colorante solubles. Para obtener la precipitacin completa de ettu combinaciones y poder hacer una medicin vida, es necesari.o encontrane m all de este punto. En el cap(~ulo XVDI se pre.ente un aparato para determinaciones automtlc:u.

En el apartado V bemos revisado vario. rMt.odos buados en las propledadet fiJic:u de Jaa protenas, que aon lnteretantes para las determlnaclonea de rutina por las razonea siuientes:
1) medicin dlrecte sobre la leche, sin preparacin (mtodos no deatructom), 2) rapldet de ejecucin, randes series, S) ausencia de reactivos peligrosos, 4) ni pesadas ni mediciones de volumen, 5) manipulador sin formacin.

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Prtidos. Caselna y fenmeno de la coagulacin

Evidentemente, se encuentran en eata categora loa mtodos del porve.nir. El ms prometedor parece ser el basado en la absorcin especfica, debida a loa grupos peptdicos de las protenaa, bajo loara yoa infrarrojos. Este sistema se describir en el captulo IX, con las propiedades pticas. Debe mencionarse la cromatografa HPLC (lquido de altos rendi mientos , o alta precisin), que abre posibilidades analticas interesantes para el porvenir.

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Captulo 7 Materias minerales. cidos orgnicos

1 GENERALIDADES- ASPECTOS BIOLOGICOS


Las materia& minerales se encuentran en todas las leches en una proporcin que vara de a a 12g por litro. Se trata, por lo tanto, de una

fraccin pequea en relacin con laa tres precedentes: lpidos, glci dos y prtidos; pero ya hemos visto, especialmente en el ltimo captulo, la importancia coruiderable de ciertas sales, sobre todo de aquellas que constituyen la originalidad de la leche, por su naturaleza o por su concentracin, y que estn formadas por los cidos fosfrico y ctrico, por el calcio y el magnesio. Ma que como grupo aparte de componentes de la leche, se deben considerar como elementos de un co!Yunto, ya que su estudio separado como sales tiene poco inters. Efectivamente, una relacin de las aales que pueden existir en la leche tiene en realidad poco significado. Las determinaciones qumicas dan valores en aniones o cationes, o bien en metaloides y metales. Ma inters tiene intentar conocer la distribucin de un anin o catin entre las diferentes formaa que puede tomar; tal como se muestra para el calcio y el fsforo en la figura 45. Es preciso insistir en el hecho de que laa materiaa minerales no se encuentran exclusivamente en forma de sales solubles. Una parte importante se encuentra en fase coloidal insoluble. El cuadro 25 da la composicin mineral media de diferentes leches, y los valores extremos para la de vaca en lo que se refiere a los principales elementos o "macroelementos". Las leches de vaca y de cabra tienen una composicin mineral parecida; el potasio es el elemento
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Materias minerales. Acidos orgnicos

dominante, ms que el calcio y el foro. Por el contrario, estos dos ltimos elementos son los ms abundantes en las leches de o-veja y cerda, que muestran similitudes de composicin. La leche humana est poco "mineralizada" en relacin con la leche de vaca. Los contenidos en fsforo y calcio de la leche de una especie animal determinada son tanto ms elevados cuanto ms rpida es la velocidad de crecimiento del animal joven, aunque esta relacin no es fija.

l. Fsforo (P total = 1%-de loc:M)


ORGANICO INORGANICO (Min!WIJ
FOSFATO TRtc:Al.CICO
dfiiiOtiOC.Um.to (+ IJidfUftlt l{bff)

Est.,ltl
to.s./<HICOI

FOSFOSERINA

d ra us-.I"

FOSFATOS.., SOLUCIN

FoltoJphtos

Comp'-JO +
AlbofiVIn
17%-llt (L)O, l l%. 19,.(T) IUO, ti%.
30%(T)
(L)O.:lO%,

1 SOlUSL~ "INSOLUBLE
1 1 , ,
,

~,'

,,

,, ,

INSOUJIJLt

1 1 1

""
1

(L)O......

SOLUBLE

1 1 1

,,

, ' t COLOIDALJ

, ,,

,/

ICOLO/OAl/

1 1

1
1

Ct liQita<l a J a
CASEi NA

FOSFATO TJUc\LCICO
fUI htrx:ue#,.ro

(+UN parte lienJ


2Wo(Tt

..a.... a

CALCIO Ufttllifltable 33 % (fj \

CALCIO

,~

c. .. ,_, .......,
11,5%(T)

lll0.27%. 46'%(1)

(l)0,60%.

21s%m CL)0.2a"'. (l.j0,1$ "

OAaAHICO

INOOWlIOCO , . . . _

11. Calcio (Ce total 1,3%o dei1Che)

Figura 45. Distribucin del fsforo y del calcio en la leche de vaca.

La alimentacin de la hembra durante la lactacin influye poco en el contenido en minerales de la leche, incluso cuando se produce una carencia, cosa frecuente para el fsforo y el calcio en las grandes pro ductoras. Esta carencia influye a la larga en la produccin, que se reduce, pero no en la composicin mineral de la leche. En estos casos
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Qladro 25. Composicwn de divertiiJ81echu en minera/u y cido ctrico (*).


Valor meclo 011 Yariot tipoa de leche Cabra ()yeja Cerda Humaaa
Medlu

En la ledle de aoca
MolaValores
extremos

sanan
%
rielad (media)
(plasma boYiDo)

SUero ()

IOiuble

Potano ...... OC, O) Sodio . . . . . . . .. (Na, O) Oz/cio ... . . . .. . (CeO) Magn esio . . .. . . . . (M&O) F1[oro . . .. . .. . . (P,O,) Cloro . . . .. . ... (NaO)
Azu{rt! . .. . . . . . . .

1,9 (2,3) 0,4 (0,54) 1,3 (1,8) 0,13 (0,25) 1,0 (2,3)

!,S
(2,5) 0,2

1,3 (1,6) 0,45 (0,6) 2,0 (3,2) 0,16 (0,25) 1,5 (3,7) 0,1 (1 ,85)

1,0 (1,2) 0,35 (0,47) 2,1 (3,0) 0,20 (0,32)

1,5
(3,6)

1,15

'<

'O

o o
~

Acido crico . . ... Cenizs .... . .. . .

!,S
8,0 11,0

9,5

0,6 (0,8) 0,17 (0,25) 0,3 (0,42) 0,04 (0,07) 0,16 (0,4) 0,45 (0,75) 0 ,15 0,8 2,5

1,45 (1 ,85) 0,5 (0,7) 1 ,25 (1,75) 0,12 (0,2) 1 ,o (2,3) 1,1 (1,8) 0,35 1,8 8,0

1,2 1,8 0,35 1,1 0,9 1,6

(1,5) (2,2) (0,47) (1,5) (1 ,3) (2,2)

1,68 0,53 0,48 0,09

lOO
100
35

0,04 0,02 0,032 0,005 0,032 0,03

0,2 3,3 0,1 0,25


0,05 3,5

60

0,75 1,25 0,7 1, 15

(1,7) (2,9) (1,1) (2,7)

0,53

so
100

1,17

1 ,22,2

0,01

0,04

<15

[
3
;;

::r

()e p. J.OOOgsal.o: %Soluble y Molaridad.

( ..) Lactosuero proceclente de coaulacin con Cll4jo.

~
~

208

Materias minerales. cidos orgnicos

parece existir una actividad secretora especial, ya que es poco proba ble se trate de una simple filtracin de los minerales de la sangre a la leche. El cuadro 26 muestra, para la vaca, que la composicin mineral de la leche es muy diferente de la de la sangre, con la cual se encuentra en equilibrio en la mama. En el curso de la lactacin, el contenido de la leche en elementos minerales vara poco, excepto para el magnesio. El contenido en potasio desciende regularmente hasta el final de la lactacin; por ejemplo, en la segunda semana se han encontrado valores medios para la leche de vaca de 1,70% de K y, en la cuarenta y cinco, de 1,25%; las variaciones de P y Ca son menos acusadas. El contenido en Na se eleva al final de la lactacin; es un hecho bien conocido que los contenidos en Na y K evolucionan en sentido inverso. La composicin mineral del calostro es diferente de la correspondiente a la leche, pero estas diferencias no son del mismo orden en todas las especies. El calostro de vaca contiene mS P y Ca que la leche; en la cerda ocurre lo contrario. La leche de vaca es, desde Juego, uno de Jos alimentos del hombre cuya composicin mineral es ms estable a pesar de determinadas causas de variacin. La influencia de la raza en los macroelementos ha sido perfectamente establecida. Las leches de gran contenido proteico tienen tambin un elevado contenido de cationes divalentes (Ca, Mg); este hecho se ha observado en la raza normanda comparativamente con la Pa Negra. Si se admite que la composicin mineral de la leche depende poco de la alimentacin (salvo para algunos oligoelementos ); y nada del medio ambiente, es incmodo explicar observaciones que no se pueden aclarar, ya que han sido hechas por tcnicos expert06, que invocan un desequilibrio salino; las grandes explotaciones modernas de vacas lecheras con una gestin racional y con un rgimen controlado estrictamente, suministran una leche difcil de tratar industrialmente, en relacin con la producida en ganaderas al pasto. La hiptesis emitida de cambios en las relaciones entre aniones y cationes, no ha sido respaldada slidamente por cifras. De cualquier modo, es preferible hablar de un nuevo equilibrio, al que deben adaptarse las tcnicas.
Nota.- En la literatura .e encuentran muehoa datos analtico& referentes a la composici6n mineral de la leclle de lu dher.aa especies. y con frecuencia ae aportan resultados diterentea, eobre rodo en lo que ee refiere a loa olioelemen toa, que oe estudian ms adelante. Lu revisiones de Gueuen (1971 y 1977) ouponen una pueota al da del tema, y de ellas hemoo entre...,ado alunoo datos.
Debe teneree en cuenta el cari.der reional de cierto& informet. como el de Ma-

hieu y colab. (1977), hecho en Francia.

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Materias minerales. cidos orgnicos

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11 LAS CENIZAS DE LA LECHE. DETERMINACION DE LOS MINERALES

Al Incineracin
El contenido global de materias minerales de la leche se determina, habitualmente, por incineracin; mediante este procedimiento, en la leche de vaca pueden encontrarse de 7 a 8,5 g de cenizas por litro. Estas cenizas no representan el total de las sales de la leche en su estado natural; la proporcin de sales es un poco 'ms elevada, de 8 a 10 g por litro en la leche de vaca. Mientras que la leche tiene una reaccin ligeramente cida, las cenizas son netamente alcalinas; se ha producido, por tanto, una modificacin importante en el equilibrio cidob sico en el curso de la incineracin. Estas modificaciones son casi constantes. Adems, se producen prdidas de los elementos ms voltiles, que dependen estrechamente de la temperatura alcanzada en el horno. El yodo desaparece siempre; los cloruros alcalinos permanecen fijos hasta 550 C, por encima de estas temperaturas, las prdidas son sensibles; para el fsforo hay prdidas en el rojo vivo; no deben rebasarse loa 550 C en el curso de la calcinacin es decir, antes del rojo sombra. Por otro lado, los citratos se destruyen completamente;se forman carbonatos por accin del C02 (pr<>cedente de la combustin de las materias orgnicas) sobre las bases; en fin, se forman tambin fosfatos y sulfatos, con el fsforo y el azufre incluidos en las molculas proteicas, y que anteriormente no se encontraban, por lo tanto, en estado salino. La determinacin de las cenizas y su alcalinidad es un medio para reconocer una event ual neutralizacin de la leche por un agente alcalino (principalmente en el caso de las leches en polvo), aunque la determinacin de los lactatos aporta datos ms precisos. La incineracin es el medio preferido para la determinacin de los elementos "indicio", sobre todo cuando se emplean mtodos volumtricos. La materia orgnica se destruye por completo y se evita los grandes volmenes de reactivo en la digestin hmeda, que aumentan el "blanco". Cuando existen riesgos de prdidas (caso del Pb, Cd, ... ), es aconsejable elevar progresivamente la temperatura del horno y no rebasar los 500 c.
B) Determinaci6n de los minerales Se pueden emplear: l. Mtodos gravimtricos, mediante pesada de un compuesto insoluble. Son muy precisos, pero largos y pesados. En la actualidad se utilizan raramente.
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Matarlas minerales. cidos orgnicos

2. Mtodos volumtricos, por valoracin. Reemplazan generalmente a los anteriores; por ejemplo,la determinacin de cloruros mediante el nitrato de plata, segn Charpenter y Vohlard, o la determinacin del calcio mediante las complexonaa y la murexida. Estos mtodos a su vez se van auatituyendo paulatinamente por loa siguientes. 8. Mtodos fotomtrico., cuyo Inters se ha incrementado tras la aparicin de los espectrofotmetroa de un precio asequible y de buena precisin dentro del campo de lo viaible. El elemento que con ma frecuencia se determina por este mtodo es el fsforo, en forma de complejo azul con el molibdeno, producido en medio reductor. El cobre todava se determina con alguna frecuencia con diversos reactivos que forman complejos, como el dietilditiocarbamato de sodio. El mtodo ma utilizado para la detennnacin del yodo en los productos lcteos es la reaccin coloreada con una sal de cerio y el cido arsenioso. En general precede a la determina<:in por este mtodo una digestin cida. Los mtodos espectro mtricos de abaorcin molecular, al igual que otros mtodos, han sido perfeccionados en la obtencin y explotacin de los datos. Los proreaos de la microele<:trnica han permitido una mayor automatizacin de los equipos y una explotacin de los resultados a la vez ms completa y ma rpida. Sin embargo, estos mtodos, en lo que se refiere a los minerales, se enfrentan con una gran competencia de loa mtodos fsicos. 4. EspectrometrI de emilin y de abaorcin atmica. Para determinar los elementos minerales en los productos lcteos, la espectrometra de abaorcln atmica se ha convertido en el "mtodo rey". Sin embargo, la eapectrometra de emisin atmica (denominada anteriormente: espectrofotometra de llama), conocida desde haoe tiempo, mantiene su intera para la determinacin de metales alcalinos y del calcio. a) En un npectrmetro de emisin atmica, la fuente de excitacin es, en general, tambin fuente de atomizacin. En la actualidad, los doa tipos de fuente ms utilbadu son la llama y el plasma. Este ltimo, que es un gas altamente Ionizado y elctricamente neutro, acumula las ven~as de la llama y loa de una temperatura ma elevada, y por lo tanto permite, adems de la determinacin de loa elementos alcalinos, la de otroa metelea difciles de excitar con una llama. Las senaibUidadea alcanzadas con un eapectrmetrp de emialn atmica equipado de un plasma, aon, para loa elementoa como el Ca, M, Cu, Fe, Pb, Zn, etc., comparablea y a veces auperiores a laa obtenidu por la eepectrometra de abeorcin atmica claica. Adems, loa equipos eatn conoebldos para poder obtener el resultado limultneo de veinte elementos.
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Materias minerales. cidos orgnicos

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b) La ei{Jtctrometra de ab10rci6n atmica, cuyo princ1pw se enunci en 1955, se basa en la facultad de loa tomos de abtorber la ene111a aportada por fotones de la frecuencia cazacterstica del elemento a doal.ficar. Entre loa mdulos esenciales de un eapectr6metro de abtorcin atmica, ae encuentra un diapotivo qu.e convierte el elemento al estado de tomo. A nivel de este generador de tomos es donde ae aprecia una grao evolucin en lo1 ltimos aos. La Uama sigue siendo la fuente ms utilizada, pero loa aistemu ain llama diseados en la forma de una clula de volatilizacin en grafito o de un generador de vapor o de hidruros, aumentan sin cesar su campo de aplicacin. La utilizacin del generador de hidruro ea limitada en los laboratorios de la industria lechera, ya que concerne a los metales voltiles, como el mercurlo, o los elementos de hldruro voltil: As, Bi, Sb, Se, que pueden determinarse cuidadosamente a concentraciones inferiores al .gfl. Loa hornos de grafito se adaptan bien a Jos mtodos de microanliaia y poaeen , adems de la ventaja de una preparacin de la muestra muy reducida, la de rebajar el lmite de deteccin de todos loa elementos en un factor comprendido entre 30 y lO'.
6. Loa mtodos electromtricos, ofrecen la posibilidad de determinar elemento minerales que no estn suficientemente explotados en loa laboratorios de anliais. Desde hace algunos aos, loa electrodos epecficol despiertan mucho inters. De la misma fo rma que el electrodo de vidrio claico desarrolla un potencial elctrico como respuesta a la actividad de los iones hidrgeno en una aolucin, un electrodo especfico para un ion dado desarroUar un potencial proporcional a la actividad de ese ion. Por ser la actividad, en numerosos ca sos, proporcional a la concentracin se puede calibrar el electrodo y de esta manera realizar mediciones simples y rpidas de la concentra cin. La senaibllldad depende del tipo de ion que interesa medir y de laa interferencias de otros iones, que a veces son bastante grandes. El electrodo de calcio permite realizar intereaantes estudios sobre las modl.ticaclonea del equilibrio de dicho elemento, ya que ste no es aenalble ms que al Ca(ll), pero no se utiliza para la determinacin del calcio propiamente dicha.

6. La deU!rmiiUJCin de loa elemento "ind:io ", a nivel de .g/kg plantea aerioa problemas analticos. La espectrometra de absorcin atmica puede no tener suficiente sensibilidad o estar sujeta a inter ferenciaa, al ter la materia inorgnica de la leche la causa de seales

Nota.- Eo lnte!'HIIIto eonllllltar la reciente publicacin: "T~hique d'analy,. et da conlr6te dan leo lnduotrieo aroalimenta.iru"1 vol. 2 (d. Blbll(lfrltra), uf como la Nonnu de1a Federacin lntemacional de I.Aicher(a (Normu FIL).

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Materias minerales. cidos orgnicos

de absorcin no eapecfica. Se puede compensar por una correccin de fondo con una lmpara de deuterio. La voltametra de banda andica, en corriente alterna (ACASV) o en pulsaciones diterenclales (DPASV) rebaja el lmite de deteccln de los oligoelementos, eapeclalmente del Pb y el Cd (lmites de 0,9 y 1,5 gJkg, reapectlvamente ). La activacin neutrnica es aplicable a la determinacin del conjunto de oligoelementos de la leche. Esta nueva tcnica analtica requiere un equipo coatoso pero permite alcanzar una gran aenalbilidad. Es insustituible para el control de los eatndarea interlaboratorio.

11 1 SALES SO LUBLES

Para el estudio de las sales solubles ae prepara habitualmente el ultrafiltrado de la leche, y ms raramente el producto de la dilisis. Se ha demoatrado que el punto de congelacin y el pH del ultrafiltrado son diferentes de los de la leche original, tal como se indica en el cuadro 26. Esta modificacin resulta de la retencin de sales solubles por la membrana celulsica de la ultrafiltncin; alrededor del 4% de las sales solubles; y ae refiere, sobre todo, al calcio y al cido ctrico. Un

Cuadro 26. Propiedades de la (IW! soluble (1)


Composicin (m8/IOO mi) Punto de conelacin 1) Leche original . . .. Ultrafiltrado. , , .. Leche residual .. , .
2) Leche original. . Lactosuero (al cuajo) .. ... Dializado (2) . . Leche residual (tras dilisis) ..

pB Ca 6,77 6,89 6,74 6,78 6,81 6,93 6,76 111 ,6 17 .S 38,6 10,0 146,5 20,5 113,6 40,8 39,2 15,3 1o,1 10,0

- 0,532 -0,514 -0,540 - 0,533 - 0,532 - 0,516 - 0,516

"''

p A ciclo dtrlco mineral

206 ISO 226 230 169 160

66 32 78 66 33 34

.. .. .. .

(1) S<gn de Man (1962).

(2) 1.000 mi de leche dializada frente a 30 mi de agua dest ilada y a 4 e; se 111 c:anza el equilibrio al cabo de 48 horas.

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efecto parecido, pero menos importante, se observa con la dilisia a travs de las mismas membranaa. El lactoauero obtenido tras la coagulacin de la leche por el cuajo, es ms representativo del suero de la leche que el ult:raflltrado o el dializado, en lo que se refiere a las propiedades fl8iooqumicaa. Loa cloruros constituyen la parte ms importante de las sales aolu bies. Expresados en cloruro sdico, alcanzan el1,8%0 de la leche. En las leches anormales, fisiolgicas o patolgicaa se produce un aumen to de sales solubles. Loa wnea c/Qro y aodw parecen destinados a ase gurar el equilibrio osmtico de la leche. Algunas leches pueden tener un porcentaje de sales superior a los 2,5 g(litro y presentar un sabor francamente aalado. La valoracin de los cloruros, que puede hacene con rapidez, es un medio para descubrir las leches anormales (leches mamticaa, especialmente). Una dP. las constantes que se estudiarn en el captulo IX, la "C.M.S.", ae determina a partir del contenido de cloruros y lactosa. Despus de los cloruros se encuentran loa fosfatos solubles, aunque solamente 1/8 del fsforo se halla en esta forma; en foafato disdico representa 1,5%0 de la leche. La mayor parte del azufre de la leche en tra en la composicin de Jaa molculaa proteicas; slo una pequea parte est en forma de aulfatoa. Loa bromuros, yoduros (ver ms adelante) y fiuoruroa se encuentran como indicios. El citrato clcico ea poco soluble y est muy poco disociado; solamente una parte se en cuentra en solucin verdadera. Es probable que todo el sodio y el po tasio se encuentren en solucin inica, pues no se ha demostrado au presencia en la fase coloidal; en cambio, sabemos que no ocurre lo mismo con el calcio y el magnesio. El pH propio de la leche permite el equilibrio del anhdrido carbnico con loa bicarbonatos. Por ltimo, la leche contiene nitratos, aunque en muy pequea cantidad, del orden del mg{kg. Si la vaca ingiere nitratos, el conteni do de la leche no aumenta ms que dbUmente, pues estas sales son reducidas por la microfiora del rumen a nitritos, Juego a nitrgeno y por ltimo a amonaco.

IV FOSFORO Y CALCIO

Al Aspecto fisicoqu mico Estos doa elementos forman lo esencial de la parte "mineroco/Qidal", que es una de las ms caractersticas de la leche (figura 45). El mag nesio contribuye en pequea proporcin (en molculas, hay 6 veces menos Mg que Ca). Asociado a estos elementos se encuentra el cido ctrico. Dos tercios del calcio y ms de la mitad del fsforo escapan a la solucin y forman parte, principalmente, del complejo fosfocaseiCopynqhted matenal

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nato de calcio. En el caso del fsforo se encuentran tambin en la leche pequeas cantidades de combinaciones orgnico-fosforadas, como son las lectinas, steres hexosafosfricos, nucle6tidos y un complejo vitamnico con riboflavina. Los porcentajes de la figura 46 se refieren a valorea medios; se pueden observar variaciones sensibles de una leche fresca a otra, aun con iguales valorea de pH, hasta cerca de 1/50. La modificacin del equilibrio entre las tres formas (1) ea++ inico Ca complejo (2) + Ca precipitado (3) (Forma soluble) (Formas insolubles)

tiene un papel determinante en la estabilidad de la leche, como se ha indicado en el captulo anterior. El calcio inico se valora en el ultrafiltrado de la leche, gracias a indicadores especiales, como la murexida o purpurato de potasio. El aumento de la forma (1 ) corresponde a una mayor ineatabili dad, que se pone de manifiesto en el curso del calentamiento (coagulacin de leches esterilizadas, concentradas, etc.) o durante la accin del cuajo (tiempo de coagulacin abreviado). El calentamiento tiende a disminuir la forma (1 ), y si se intensifica excesivamente puede provocar una precipitacin de citrato y fosfato de calcio (forma 3). La simple concentracin de la leche, por evaporacin, tiene el mismo efecto. En la leche concentrada, traa la paaterizacin a 7 5 C durante 30 s, el porcentaje de calcio desciende en unos.1 O puntos, tal como se ve en los siguientes ejemplos:
A

Leche natural . ... .. ........ 36,8 Leche concentrada (X 2,6) . . .. 26,7

42,3 31,4

%de Ca soluble %de Ca soluble

El calentamiento moderado de la leche normal no cida, por ejemplo a temperatura& de pasterizacin, aumenta la estabilidad de las protenaa y disminuye la capacidad de coagulacin por el cuajo, segn hemos visto. La proporcin de cido ctrico, agente comple:lnte del calcio, infiuye sobre el equilibrio anterior, reduciendo tambin la forma (1).

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Materlu mineral ea. Acldos orgnicos

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8) Aspectos blol6gicos El contenido en calcio de la leche es un carcter heteditario muy trmam.l.llble, liado al contenido en protena y, lo que e. m curioso, al contenido en materia grua. El dearrollo en Francia de la raza Pa Necra, cuya leche es m pobre en protena, materia grua, calcio y flforo que la de la raza Normanda, contribuye a re~ar el contenido medio de calcio de la leche deade hace alunoe aos; ha evolucionado huta 1,2 /1000. Lu enfermedades de la mama y determlnadu situaciones de estres, que perturben el estado b{d.rico, como ocurre, por ejemplo, en un ambiente demulado caliente, provocan un descenso del contenido en calcio y fsforo, con aumento compensador del contenido en sodio.

El contenido bruto en calcio y fsforo no es suficiente para clasificar con aeurl.dad a loe alimentos segn su valor mineral, puesto que el factor de retencin no ea el mismo para las diferentes leches y para lot diferentes productos lcteos procedentes de una misma leche. Ea Interesante hacer conatar que la leche contiene, en relacin con la anre total, m.u cbo m calcio y ftforo . El hecho de que una parte Importante de estos elementos te encuentre bejo forma coloidal, con poca influencia sobre la presin osmtica., expllca esta aobrecarp.. Lu micelu forman un aiatema ideal para la nutricin de la cra, ya que euminiltran en forma fluida y uimilable P04 , Ca y Mg. La leche contiene m calcio que el agua de cal. De hecho, es una de las m importantes fuentes de calcio de la alimentacin humana, como veremoa en el captulo xxm. La produccin de leche exige del organismo una demanda impor tante de calcio y fsforo. Una vaca que produzca 4.500 litros de leche al afio, pierde por esta va 10 kg de cido fosfrico (P,O,) y 8 kg de cal (CaO).

V LOS MINERALES EN INDICIOS

A) Ollgoals"*ltos Se dlatlnuen habitualmente los ol.ioelementos normales (Zn, Fe, Cu, Mn), de lot olioelementos de polucin (Pb, Cd, Hg, Aa, etc.). Lacreciente IIMllibDidad de loe mtodot de anlloi ha tenido como resultado el incremento del nmero de los elementoa qumicos encontrados en la leche. Debe tenerte en cuenta que un elemento puede ter India penJable para el organiamo por participar en una actividad enzimtica y, sin embargo, a partir de una determinada concentracin puede vol verse txico, conientemente por bloqueo de un eapaclo activo de la enzima.
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A nivel de au contenido natural (ee puede conaiderar que son los valores ma ~os obtenidos analiundo con mucha precaucin la leche recogida en un recipiente de vidrio "pyrex"), loe oligoelementoa encontradoa en la leche son interesante~ deade el punto de vista de la nutricin. CotUideraremos los elementos principalea, con laa variacioma corrientemente en ''partes por milln" (p.p..m. o mg/k), o en ''Partea por billn" (p.p.b. o gfk). No deben ocultarse lu dificultades que ofrece el eatablecimiento de valores medios y de valorea lmite para la mayor parte de los oligoelem. ntos. En la actualidad se trab&\ja para la pueata a punto de lee ches en polvo estndar (Comisin de la F .l.L./l.D.F ., Oficina de Referencias Comunitarias de la C.E.E.-BCR) que permitirn controlar la precisin de los diversos mtodos de anlisis, detectar loa errores sistemticos y orientar a loa laboratorios que se ocupan de dicho tema.

8) Metaloides
1. Yodo Es un el.e mento "indicio" presente normalmente en la leche de vaca, pero ea dlfcU fijar un contenido medio ya que depende muy eatrechamente de la alimentacin. Los contenidos m ~oaaon cercanos a 0,01 y loa m altos a 0,3 mg/k, estos ltimos en ausencia de contaminacin aparente; &in embargo, lu nueve dcimas partea de los tra~os publicados dan un contenido inferior a 0,1 mg/kg. La mayor causa de contaminacin ea la utilizacin de desinfectantes del tipo de los "yodforos". que se utilizan ya 888 para la desinfeccin del pezn o para el material de ordeo. El contenido en yodo de estos productos es muy variable; puede alcanzar 10 gfkg, y a. este nivel se tiene el riesgo de un Importante aumento del contenido en yodo de la leche; pero con productos con un contenido en yodo de 1 a 2g/kg, el efecto sobre la composicin de la leche es despreclabl.e si se aplican correctamente. Otra causa de la elevacin del contenido en yodo de la leche radica en la composicin de los suplementos alimentarios o concentradoa minerales., y la utiliu.cin de la piedra de lamer yodada. En varios pa- se observa en los ltimos aos un aumento del contenido de yodo en la leche. El yodo es un ejemplo interesante de oligoelemento a la vez esencial en la nutricin humana y de loa animalea, y nocivo por encima de cierta cantidad (cap. XXlll). De todas formas, no est inscrito en las listas como contamnante peligroso. El yodo tiene una marcada afinidad por lu prote inu de la leche; cuando ae laa separa ae eliminan con ellu los 2/3 del contenido en yodo inicial.
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2. Selenio Este metaloide tambin es a la ve:r: indispensable y muy txico. Tiene un papel Hencial en las reacciones de oxidacin, papel que se explica por su funcin en la actividad de la glutatin-peroxldasa. La concentracin ptima en los alimentos debe situarse entre 0,1 y 2 p.p.m. Adiciones mnimas de selenita a un rgimen carencial protegen al animal contra la necrosis del hgado; por el contrario, la hierba se vuelve txica en un suelo selenfero. Es un veneno acumulativo. Los contenidos de selenio de la leche de vaca son variables; en U.S.A. se han dado valores medios de 0,027 p.p.m. y en Alemania de 0,011 p.p.m. Estos son valores bajos, adems la casena disminuye la toxicidad de este elemento.

3. La leche contiene por otra parte cantidades apreciables de silicio (de 1 a 6 p.p.m.), pequeas cantidades de bromo y de flor (0,15 p.p.m. para cada uno) e indicios de arsnico (0,04- 0,1 p.p.m.).
C) Metales l. El cinc es el ms abundante de los elementos en calidad de indicios. La leche completa contiene como trmino medio 4 p.p.m., con variaciones normales de 3 a 6. El calostro es ms rico que la leche; el contenido va decreciendo en el curso de la lactacin, lo que prueba que el cinc no es simplemente un elemento de contaminacin. La excrecin lctea, en relacin con el cinc ingerido por el animal, es del orden del 6% . La leche desnatada tiene un poco ms de cinc que la leche completa. Este elemento tiene una distribucin que diere de la de otros metales pesados; casi nunca est ligado a la fase grasa. Tan slo el 12% del cinc es ultrafiltrable. La mayor parte se encuentra asociado a las micelas de casena. Deben existir dos formas de enlace, ya que la mitad del cinc de las micelas se puede separar por simple dilisis; el resto solamente se separa por completo cuando se trata la casena en medio cido, a pH 2. El cinc no es txico a dosis que rebasan ampliamente las necesidades del organismo. Enzimas importantes como las exopeptidaaas son cinc-proteidos.

2. El plomo es un metal txico poco abundante en la leche (alrededor de 0,05 p.p.m.), en condiciones normales de alimentacin y recogida. Diversas causas de contaminacin pueden hacer que se eleve el contenido por encima de 1 p.p.m. El plomo es un metal muy utiliza do y la biosfera se enriquece en este elemento; adems se utiliza en medicina veterinaria. Actualmente hay una preocupacin por la contaminacin plumbfera a causa del tetraetil-plomo que se utiliza como antidetonante en la gasolina para automviles, con lo que las parCopynghted matenal

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tes areas de los vegetales que crecen al borde de las grandes caneteras estn ma o menos contaminadas. Se ha demostrado que las vacaa que reciben heno rico en plomo transfieren una parte de este elemento a la leche, que contiene entonces valores U&s veces mayores que
las muestras testigo (0,064 contra 0,024 p.p.m.) (Blanc y colab., 1971).

Cuadro 27. Hierro, cobre y manganeBO en los productos cteoi

(p.p.m).
Bieno Leche (recosida en vidrio pirex) Leche (recosida de forma corriente) Lecho en polvo Mantequilla normal Mantequilla alterada Nata obtenida en vidrio Nata lndUBtrlal Nata de suero de Gruy~re Queso Camembert Queso Emmental Cobre
MlDPIIOIO

0,6- 1,2 1,5 - 2,4 6,0-15,0 0,3- 1,o .. 1,2 0,2 - 1,3 1,5- 2,5 8
S

0,2 -0,4 0,2 -0,8 2,0 -8,0 o,os -0,2 .. 0,5 0,1 - O .S 0,1 I,S 1,0 -4 o 1,2 14,0

0,01 -0,03 0,20

8. El cadmio y el mercurio aon otros dos metales muy txicos, presentes normalmente en muy eacaaa cantidad en la leche. Las estimaciones varan segn el mtodo analtico utilizado. Para el cadmio , se encuentran en la leche de 0 ,02 a 0,03 p.p.m. con la espectrometra de abaorcin atmica y 0,06 a 10 con la voltametra. Para el mercurio los valores son an ma bajos, de O (no detectable) a 1 p .p.m. El cadmio llega a la leche aobre todo como impureza del cinc. El paao del organismo de la vaca a la leche es muy limitado. El cadmio aadido a In. leche se encuentra caai enteramente ligado a las protenas del lactosuero por los grupos -sH. El mercurio se liga tambin a las protenas, pero una parte (16 20%) se encuentra en la membrana de los glbulos grasos. No se conoce la funcin biolgica de estos metales. 4. Tambin encontramos en la leche aluminio (1 p.p.m.), cromo (0,08 p.p.m.) y molibdeno (0,07 p.p.m.). Este ltimo metal es un componente de la xantina-oxidasa.
Copyngh!ed rnatcnal

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VI HIERRO, COBRE Y MANGANESO


&toe trea metal. a tienen actividades cataltlcu parecidu y tambin e aon oligoelementos indilpensables. Contrariamente a lo. elementos anteriores, aon peligro108 desde el punto de viata tecnolgico cuando su contenido rebua cierto lmite en la leclle y en los productos gra101. En el captulo V se han indicado las variaciones accidentales del contenido en cobre y en hierro de la leche, y sus coneecuencias en lo que se refiere a la oxidacin de la materia grasa que estos metales catallu.n. Se han puesto a punto bastantea mtodos colorimtricos para las determinaciones de rutina. El de AUfax y Bejambes (1956 ), basados en la reaccin del dietditiocarbamato para el cobre y del 2-2'-c:lipiridil para el hierro, hacen posible la determinacin simultnea de lo dos metalea en una misma muestra, tru digestin cida. La concentraciones que constan en el cuadro 27 (para el Fe y el Cu) se han obtenido con dicho mtodo. Las condiciones de recogida y tratamiento de la leche influyen aobre el contenido en cobre y hierro. Los valores del cuadro 27 para los productos elaborados en cubas de cobre (Gruyere, Em.mentel) muestran un elevado nivel de contaminacin. Tambin el agua puede aportar hierro, cobre y manganeso a los productos lcteos. Ea difcil fijar valores para el hierro y cobre ''naturales" de la leche. Se han publicado ci!raa ms bajas que las lndicadu en la primera lnea del cuadro 27, (0,2 para el Fe y 0,08 para el Cu). Se han observado nota.blea diferencias individuales en las vacas, diferencias que pueden explicar quiz las variaciones en la aptitud para la oxidacin. El porcentl\ie de cobre vara tambin en el cuno de una lactacin; el mximo contenido se alcanza poco despus del perodo caloatral y puede ser 2 a 6 veces ms elevado que en plena lactacin. Se discute la influencia de la alimentacin; algunos autorea admiten el paso del cobre de la racin a la leclle. Tambin se han observado variaciones estacionales (mayor contenido en primavera). El cobre "natural" de la leche se encuentra llado a las protenas y no exiate en forma tnica o dializable. La afinidad de las membranas de los sJbulos gr1li08 por el cobre es muy elevada a diferentes valores del pH; en la leclle fresca, as como en la nata icida, una notable parte del cobre ' 'natural" se halla fijado a la auperficie de los glbulos grasos. Por el contrario, el cobre de contaminacin se une a las protenas de la fase hdrica. Tras el batido,la rnantequlila retiene de 1/4 a 1/2 del cobre existente en la nata. El hierro ''natural" contenido en la leche de consumo, es inauficiente para satisfacer las necesidades del organismo animal. No parece posible aumentar el contenido en hierro de la leche por la va alimentaria. En cuanto al hierro introducido despus del ordeo, no se comporta como el hierro "natural".

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El manganeso se halla normalmente en pequea cantidad, pero con variaciones estacionales relativamente fuertee; hay menos manganeso en primavera que en verano. Este metal participa en numerosas actividades enzimticas. De esta forma se explican las variaciones estacionales comprobadas en la actividad de ciertos fenmenos lcticos. Un problema importante en mantequera es el de la pureza de las aguas de lavado de la mantequllla, que pueden aportar hierro y manganeso. Las aguas se consideran peligrosas cuando contienen ms de 0,4 mg de hierro y de 0,1 mg de manganeso por litro. Puede darse el caso de que se deba "deferr!zar" el agua mediante oxidacin (aireacin y borboteo) y filtracin para retener los ficulos de hidrxido frrico que se forman.

VIl ELEMENTOS RADIOACTIVOS


La leche se considera como un "integrador" de la contaminacin radioactiva. Es ms fcil encontrar radioelementos en la leche de los herbvoros que en las muesU&S vegetales. La leche es un vector esencial de nucleidos radioactivos que transfieren rpidamente la polucin del medio ambiente al hombre. Teniendo en cuenta las poluciones generales del suelo, se investigan actualmente datos precisos sobre el contenido de la leche en cesio ( 137Cs) y estroncio {" 0 Sr), para los "radionucleidos" de ~a vida (perodos de 27 y 28 aos), y en estroncio {" 0Sr) y yodo ( 1 11) as como para los de vida media y corta (perodo de 55 a 8 das, respectivamente). La investigacin de sustancias emisoras de raciadionea .., puede ha cerae de una manera cmoda ya sea por contador de destellos o por el ms reciente mtodo del detector de semiconductor directamente sobre la leche lquida o en polvo. Para los rayos /J, de poco nivel energtico, la muestra debe mineralizarse previamente; en algunos casos debe extraerse el radioelemento. La radioactividad del precipitado de oxalato indica la cantidad de 90 Sr. La radioactividad se expresa en submltiplos de "curie"; se emplea corrientemente el "picocurie" (10 " 1 2 curies). El estroncio (90Sr) se encuentra en la leche desnatada; se comporta corno el calcio. Tras coagulacin de la leche por el cuajo, el 90%se localizan en el cogulo de casena; por el contrario, la casena cida retiene muy poco, del 5 al10%. El desarrollo de la utilizacin de la energa nuclear presenta un nuevo problema en la higiene de la leche y sus derivados, como veremos en el captulo XXIII, pero se comprueba que el funcionamiento norrnal de los centros nucleares solamente influye en una mnima parte en el aumento de la radioactividad ambiental.
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La cantidad de radloelementos que pueda contener la leche de va-

ca depende de varios factorea: - perodo de deainteracin del radioelemento conaiderado, - lugar y poca de los accidentes nuclearea, - lugar de la produccin de leche. E:r.iste una estrecha relacin entre los datos relativos a la contami nacin de la leche y la del agua de lluvia. El contenido de la leche en radioelementos permanece, basta el momento, dentro de unos lmites radiolgicamente aceptables.

VIII MODIFICACIONES DE LA COMPOSICION SALINA.


A) Lotfines En la prctica se pueden peneguir varios fines: l. Disminucin del ea++ inico con miru a la estabilizacin de la leche durante el calentamiento. 2. Dieminucin del contenido de sodio para determinadas leches de rgimen. 3. Desalinizacin del lactoauero para wsoa alimenticios y preparaciones proteicas. 4. Preparacin de leches "sintticas" para investigaciones funda mentales. 5. Desacidificacin de la leche. 6. Detcontaminacin radioactiva.

Notll.- La q,..l4ci6n un modio do recluclr la formo ionbeda do un metal, aunque ello Implica la adicin de un producto qu(mlc:o, hecho que puede cono! d..-llolal. Por- medio puedo redueino oJ contenido do calcio i6nlc:o. En la eolarillaaei6n do la leebe evaporada, loa reoulladoa aon aleatorloa d no ae adicio Dan roatatoe, cltratoa o, mejor aW., pollfoatatoa, antes del calanllmlonto, upeeto que ae tratad en el cap(tillo XXII. E:aten apntoa oomplejantoa m eficaces que loo quelatoa, uti.lizadoe aoJa mente en lo. labon.toriCM, que pueden .eeutra.r uo catl6n de rorma Mlectha. Se utili&an mucho con ftuu anal(ticoa loe: nraanatoa o "complexonu" (apeclal monto el EDTA).

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B) Intercambio de iones

El intercambio de iones se obtiene mediante sustancias granulares S lidas e insolubles y, no obstante, inicas en medio acuoso. Tienen esta propiedad los silicatos naturales (zeolitas), pero se utilizan poco. Actualmente se dispone de intercambladcres de Iones de capacidades bien definidas en los cuales el grupo reactivo se fija sobre matrices variadas: resinas sintticas, celulosa, slice porosa, etc. Unas pueden considerarse como cidos insolubles y otras como bases asimismo insolubles, por ejemplo : - Intercambiador de catin sulfnico: R.-S03 W (cido fuerte} carboxflico: R -coo W (cido dbil} - Intercambiador de anin aminado : R - NH3 oH (base dbil) amonio cuaternario: R- (RRR.)N OH" (base fuerte) Para intercambiar el sodio por otros iones, se haoe pasar el lquido por una columna de resina sulfnica en forma de aal. Si la resna se ha neutralizado previamente con una mezcla de K, Ca y Mg, el sodio quedar retenido y los iones K', Mg .. y Ca" liberados en la proporcin original de la leche. Se puede as reducir unas 10 veces el contenido en sodio (0,06 g{l). El intercambio de calcio por un metal alcalino debe hacerse con precaucin para evitar la elevacin del pH; para ello, se emplean mezclas de resinas. Se puede desonizar sin intercambio, empleando una mezcla de un resina en forma bsica OH- y otra en forma cida H'. Los iones residuales forman H, O; pero la regeneracin de las resinas en capas mezcladas no es cmoda. Para la desmineralizacin dellactosuero se utilizan necesariamente una resina cida fuerte y una resina bsica dbil; con ellas se pueden eliminar del 80 al 90% de las aales, con una prdida de nitrgeno del 6 al 9% sin que se elimine la lactosa, al no estar disociada.
O) Descontaminacin radioactiva de la leche

Los elementos radioactivos que pueden contaminar la leche tras los accidentes nucleares, especialmente el radioestroncio, se pueden eliminar parcial o totalmente. El estroncio, al igual que el calcio, est ligado en gran parte a la casena en el fosfocaseinato. Al pH normal de la leche de vaca, la proCopy nghlC'd m aten al

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porcin de estroncio soluble (20%) ea ma baJa que la del calcio soluble (20 a 86%); en estas condiciones, el intercambio sobre la resina sera limitado, mientn, que a pH 5,2 el intercambio ea cui total. Cuanto ma bajo ea el pH, mayor ea el rieago de precipitacin de la columna de resina y mayor deber ser la presin ejercida. El cido c trico permite un mejor desplazamiento del estroncio que el cido clorhdrico. Al final de la operacin, el pH se lleva al valor normal por adicin de potasa, antes de la pasterizacin. La figura 46 muestra el esquema de una instalacin de este tlpo. La resina se equilibra con solucin regeneradora que contiene los principales cationes de la le che en forma de cloruros (Ca; K, Na, Mg); el ciclo de funcionamiento ea de 25 volmenes de leche por un volumen de resina.

R,

L ...........L ..... _______.,


AGUA caliente

Ii

KOH

Leche
(pH 67)

ht

Escurtido

Pasterizacin
LECHE saneada

Figura 48.. Esquema simplificado de una instalacin de intercambio de iones que puede utilizarse especialmente para la descontaminacin de feche acidificada, medi.ante un solo paso por resina (ver texto).

R1 : resina activa; ~: resina para regenerar; S1 : solucin de lavado no inica; cin salina de regeneracin.

~:

sol u

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Recientemente se ha preconizado un procedimiento de doble lecho de resina carboxlica y sulfnica, en el que el pH de la leche no desciende por debajo de 6,2, lo que reduce las prdidas de vitamina B.

IX METODOS QUE UTILIZAN MEMBRANAS Y GELES FILTRANTES

Las membranas y los geles permiten una separacin molecular y constituyen un perfeccionamiento de los filtros ordinarios que separan las partculas que se encuentran en un lquido. En el campo de las membranas se han realizado progresos muy importantes en los ltimos aos: a) Fabricacin de membranas con porosidad regular y bien defin das, ya sea en forma de pelcula o en forma tubular. b) Establecimiento de "lmites de parada" bastante prximos para permitir la separacin de sustancias que tienen pesos molecula res que difieren muy poco (algunas membranas permiten separar la glucosa de la sacarosa). e) Eleccin de materiales variados que ofrecen una buena resistencia al calentamiento (con vistas a la esterilizacin) y a los agentes qumicos (disolventes, cidos y bases). Se utilizan tambin, aparte de los habituales steres de la celulosa diversos polmeros: cloruro de polivinilo, niln, tefin, acetonitrilo, etc., y hoy da membranas minerales (cap. XXI). d) Obtencin de estructuras resistentes a las presiones elevadas para eliminar la saturacin, por superposicin de capas de porosidad diferente. e) Obtencin de membranas no neutras con cargas permeables tan slo a los cationes (membranas catinicas de polaridad negativa) o a los aniones (membranas aninicas de polaridad positiva). Las membranas y los geles se utilizan en diferentes procesos: l. Las membranas celulsicas de dili$is, utilizadas siempre en el laboratorio, no tienen una porosidad regular, pero permiten separar cuidadosamente las sales solubles, la lactosa y las sustancias nitroge nadas no proteicas, de las sustancias de alto peso molecular, como las protenas. 2. La tcnica de electrodilisis basada en la permeabilidad de las membranas a ciertos cationes o determinados aniones, bajo la accin de la corriente continua, tiene desde hace unos aos numerosas aplicaciones Industriales, especialmente en el campo de los productos lcteos. Permite no solamente des8linizar ellactosuero sino al mismo tiempo reducir su contenido en lactosa, es decir, obtener productos de elevado contenido proteico. En el curso de la electrodilisis, Jos
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Figura 47. Esquema del principio de una clula de oleCirodtallsls (segn ltnde y colab . ( 1970).
A: Membrana aninlea. C : Membrana catinica.

cationes y loa aniones se transfieren de una solucin a otra (efluentes, salmuera liaeramente cida, etc.), a travs de una membrana catinica o aninlca, bl,jo la accin de una corriente continua (fa. 47). En el cuo de una delmine.ralizacin acUJilda (ms de 90%), este procedimiento pareoe ms costoeo que el de los intercambiadorea de iones. 3. En la amo1il inversa se ejerce sobre la auperficie de la solucin a desallnzar una presin superior a la presin oemtica y el agua pasa a travt!s de una membrana del tipo de las "semipermeables". Segn la porosidad de esta membrana, el agua arrastra ms o menos sales y sustancias de molcula pequea. Se puede a la vez concentrar y desalinizar una solucin que contenga prote nas. Esta tcnica se encuen
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tra desarrollada e.pecialmente para la deaallnlz.acln del agua de mar y dellact.oauero (cap. XXll). 4. La ultrafi/ITdcin utiliza membranu del mlamo tipo que para la smosis invena, pero se emplea para ~eparar auatancfas de peso molecular elevado y no exige fuertes presiones. La ulttaflltracin de la leche lleva a la separacin de un suero exento de materiaa nitrogenadas proteicas, que se viene denominando ~rmeadQ, y el lquido que se encuentra por encima de la membrana ae enriquece en protenas y 1e designa como el retenido . En el cap tulo XXI ae ver la aplicacin en quesera de la ultrafiltracin de la leche. Debe sef\alarse que este mtodo no permite la eliminacin total de molculas peqeaa, a menos que se diluya de una forma continua el lquido por encima de la membrana, en el curao de la operacin. 6. La {lltraci6n por gel, llamada tambin "tamizado molecular", se ha convertido en una tcnica corriente en el campo de la bioqumica, donde la desalinizacin ha sido una de aua primeras aplicaciones. De hecho 1e trata de un mtodo de fraccionamiento que permite separar las sustancias disueltas segn su peso moleculsr, tanto ai se encuentan disociadas como no. Las sustancias de elevado peso molecular son eluidaa las primeras, ya que atraviesan el espacio vaco entre las partculas de gel, en las que, por el contrario, penetran las pequeas partculas (sales, lactosa, etc.), que de esta forma son ralentizadas en su migracin. Pueden utilizarse diferentes soportes: polidextranos (Sephadex), poliacrilamida, aluminio-sllcatoa sintticos, etc. La operacin puede efectuarse en columnas o en cubas, o tambin por centrifugacin. La utilizacin de las columnas puede verse limitada por la viscosidad relativa de la muestra. A veces es preferible utilizar el mtodo de la centrifugacin, que posee adems la ventaja de no causar prcticamente ninguna dilucin.
Noto . - Al parecer tJ pueden u til4ar indltlntament.e los tfrmlnoa 11deaaladon y "deaallnizac16n", reae"indooo este ltimo mb para el laboratorio.

X AClDOS ORGANICOS

A) El cido ctrico se encuentra en notable proporcin en la leche de vaca (1,8 "loo ); no se halla en cantidad apreciable en la sangre y otros humores, pero es abundante en los huesos; 11e forma en la mams a partir del cdo pirvico.
CH, 1

COOH

HO -

C
1

COOH

C, H,O,, P.M.

&

192

CH,- COOH

yr hted 'llale

Materias minerales. cidos orgnicos

227

Hemos visto que este cido interviene en el estado de equilibrio del calcio. Probablemente est ligado a este metal en un complejo poco disociado, en solucin saturada (solubiidad en el agua: 0,85 g/1 a 20 "C). Una parte se encuentra 'en estado coloidal (alrededor de 10% del citrato total). Se ha observado una fuerte correlacin entre el contenido en cido ctrico y de calcio soluble, independientemente de las variaciones estacionales. En la leche de mamitis se produce una disminucin del contenido de cido ctrico que es proporcional al aumento en NaCI. Es utilizado por Jos microorganismos, especialmente por los que intervienen en la fermentacin lctica aromtica de las natas y mantequillas (captulo XII}; es un precursor del aroma de Jos productos fermentados. Se admite que el cido ctrico favorece la absorcin del calcio por la mucosa intestinal cuando se halla en presencia de vitamina D , que inhibe su oxidacin. B) La leche contiene normalmente otros cidos orgnicos en muy pequeas cantidades. - Hemos mencionado el cido neuramnico, Jos cidos grasos libres y Jos aminocidos libres. - Acidos alifticos de bajo peso molecular, especialmente los cidos frmico, actico y lctico en proporciones aproximadas al 0,040, 0,038 y 0,055% 0 , respectivamente. El calentamiento a lOO"C o ms, provoca un aumento del cido frmico, como consecuencia de la degradacin de la lactosa (captulo IV).. - Acidos cclicos diversos: cido hiprico, forma de eliminacin del cido benzoico conjugado con la glicocola (0,05%0 ); cido ortico, intermediario en el sistema de los nucletldos, etc.

XI GASES EN LA LECHE. GAS CARBONICO

Tras el ordeo, la leche puede contener hasta un 8% en volumen de

gas, del cual el 6,5% es carbnico. Esta cantidad se reduce en contac to con la atmsfera; la proporcin de CO, disminuye (hasta el 4 %). pero la de los gases del aire, nitrgeno y oxgeno, se eleva sensiblemente (0 2 : 0,5 %; N,: 1,3%); este equilibrio corresponde a la solubilidad de N2 y 0 2 en el agua. Una parte del C02 se equilibra con la forma bicarbonato, que puede existir en los complejos no inicos con el calcio. La leche se satura normalmente de oxgeno entre el ordeo y el tratamiento trmico. El contenido en oxgeno, que es un cuerpo per. judicial en Jo que a las grasas y vitaminas se refiere, puede rebajarse a
Copyngh :xlr1atenal

228

Materias minerales. cidos orgnicos

valores despreciables combinando el calor con el vaco. Pero la leche tratada puede volverse a 88turar de oxgeno si el envase es permeeble a los gues. El cido sulfhdrico y otros derivados sulfurados voltiles, se en cuentran presentes en la leche calentada, como consecuencia de la descomposicin de las protenas solubles; son responsables del "88bor a cocido". Los productos voltiles de olor fuerte procedentes de loa alimentos (coles, ensilados, etc.) y que se encuentran en la leche o en la nata, pueden eliminarse por arrastre con vapor de agua al vaco.
Nota.- El eroeto del C02 aobro ol eroelmlanto do 1.. bactorl.. ao eatudlar m odolante.

Copynghted r1atenal

Caprtulo 8 Componentes de actividad biolgica

1 ENZIMAS DE LA LECHE; SU ORIGEN E IMPORTANCIA


La leche contiene numerosas enzimas relacionadas con el grupo de laa albminas, con las cuales generalmente precipiten. Algunas se encuentran ooncentrlldu en la membrana superficial de los glbulos gruoa y son arrastradas por la nata (reductaaa aldehdica, fosfataaa); otras precipiten con la casena a pH 4,6 (proteasa, catalasa, etc.). La distribucin de laa enzimas de 18 leche ha dado lugar a numerosos es-

tudios en loa que loa resultados a veces son diacordantes, lo que puede explicar el ~todo de fraccionamiento. Por ejemplo,la catalaae se encuentra en ll'8Jl parte con la casena separada por precipitacin, mientras que queda muy poca en la casena obtenida por ultrafiltracin. Por otra parte, en la leche se encuentren activadores e inhibidores de la ~>nz.ima euya accin depende de su concentracin en la fraccin considerada. El origen de la leche explica la presencie de estas enzimas, existentea en numerosas clulas y especialmente en loa leucocitos de la sangre, que emigran a trave del tejido mamario. A algunas se laa puede considerar, por lo tanto, como productos de excrecin, pero no se excluye que otras sean secretadas por el tejido glandular mamario. A veces es difcil determinar su origen, ya que laa bacterias, que frecuentemente se encuentran en la leche, producen enzimas del mismo tipo; el deaarrollo de estas bacterias aumenta, por consiguiente, la cantidad de e.nzimaa presentas o aportan otras nuevas.
Copyngh!ed rnatcnal

230

Componentes de actividad biolgica

No ea oportuno estudiar aqu las ms de eesenta enzimas descubierta en las leches de vaca y de mujer, puesto que an exilten di&Cllsionea sobre la identidad de algunas de ellas. En una reciente puesta al da de Blanc (1982) se pueden encontrar datos detallados sobre el tema . El cuadro 28 muestra las treoe enzimu ms importantes que se estudiarn en este captulo. Se distribuyen en varias~ y, de acuerdo con las normas internacionales, ae las designa con un nmero de identificacin compuesto de cuatro partes. Se ban utilizado los nombres comunes, porque los nombres sistemticoa que indican a la vez su modo de actuacin y el substrato son demasiado largoa. Laa enzimas ms importantes de la leche perteneoen a las tres primeras clases, cuyo ttulo expresa claramente 11u actividad. Laa trea ltimas clases (liuas, lsomeraaaa y Jigasas) no tienen un repreaentante de Importan cia en la leche de vaca. Existe poca informacin sobre el papel y la alnificacin de las en zimas en la leche. Para la mayor parte de ellas no se encuentran subatratos sobre los que poder desarrollar su actividad en este medio, ~~elvo la lipua y la prote8118. En el caso de enfermedades de la mama, ciertas enzimas ae hallan con mayor abundancia (catalaaa) o apareoen en la leche (A.estearalll). La cantidad de estas enzimas en la leche es escaaa; pero su actividad como catalizadores bioqumicos ea tal que provocan importantes modificaciones a muy baja concentracin. Eata actividad depende estrechamente del pH y la temperatura; la elevacin de esta ltima provoca su destruccin que, en general, ea rpida por encima de los 70 e, ain embargo, hay otras que slo se destruyen por encima de go; entre estas tenemos la lisozima y la ribonuclesaa. La importancia de las enzimas de la leche deriva de cinco propiedadea principales: 1. Algunas son factores de degradacin que tienen Importancia tecnoll!ica; tales son la lip8118, factor de rancidez; la prote8118, que provoca la hidrlisis de la casena, y, puede ser, que laa oxidasas, con influencia sobre el~~&bor. 2. Su aenlibilidad al calor permite el control del calentamiento de la leche en la zona de laa temperatura~! de pasterizacin. 8. La cantidad de enzima depende, para algunaa de ellas, del nmero de leucocltoa o bacterias que se encuentran en la leche; de eata manera se pueden obtener datos sobre la calidad higinica de la leche. 4. El contenido de enzimas no es el mismo para todaa laa leches; esta caracteratica puede ser un medio para distlngulrlaa, pero en la actualidad se utUiza poco. 5. Algunas enzimas tienen actividad bactericida, y constituyen por ello una proteccin, desde luego limitada, de la leche; es el caso de la

pyr

rtcd m

ter

Uiadro 28. Principales enzimas de la leche


Nombre Cdigo uE.C." Dblrlbuclbn pH/temperatun ptimos 6,5/20 7 /37 7 1 ?

,_
moleculu 82000

Substrato

COOilZima

l. Oxldoredoctaaa Peroxidasa
Xantina~xidasa

1.11.1.?
1.2.3.2 1.11.1.6

Lactosuero

Catalasa

Membrana glob. Casena y membrana glob. Super6xido dismutasa 1.1 S.1.1.1 Lactosuero Su1fhldrlloxidasa 1.8.4.2 Lacto suero 2.4.1.22 2.7,7.16 Lactosuero Lactosuero

Hematina (Fe) HaO.+ aceptor 27S 000 Aldchidos, etc. Flavlna, M, Fe 240000 (?) Remo (Fe) HaO,

n. Tranaferasu

7,2/37 7.S/37

o,
90000 42000 13000 - SH UDP-sal + g1uc. Aeldos ribonucleicos Glic<!rldos Esteres fosfricos Protenas Proteinu Almidn, etc. Paredea mi<:robianu

Cu/Zn

Lactoss sintetasa Ribonuc1easa

Zn+Mg

DI. Bidro1asas Upasa Fosfatasa alcalina Proteasa (plasmina) Proteasa cida Amilasa
Usozima

3.1.1.3 3,1.3.1 3.4.21.7 X 3.2.1.1 3.2.1.17

Leche descrem. Membrana glob. Casena Casena Lactosuero


Lactosuero

9 /37 9,8/37
8 /37 4 1 ? 7,4/34 8 /37

so 000 170000
48000 16000 18000

Ca

232

Componentes de actividad biolgica

lactoperoxidaaa y la lisozima. Son importantes en la alimentacin del recin nacido. La medida de las actividades enzimtlcaa se cita en varios captulos del libro. Desde un punto de vista general, se puede anotar una reciente tcnica que simplifica mucho las mediciones. La extrema tur bidez de la leche hac (a necesario un tratamiento preliminar de la muestra para las determinaciones por espectrometra de absorcin molecular (espectrofotometra). Es posible lorar la disolucin integral de todos los componentes de la leche (esta tcnica ya se aplicaba por Bosset y Blanc en 1977 para la determinacin de las protenas totales). Recientemente, Linden y colab. (1982) han puesto a punto la mezcla disolvente B.e.T. (butilamina/ciclohexanona/triton X-100), que permite la determinacin directa tras la "tranaparentizacin", de las actividades foafatslca, proteinsica, li1!alactosldsica y peroxidsica en buenas condiciones de sensibilidad y precisin.

11 OXIDORREOUeTASAS
Al lac1Dparoxidasa La lactoperoxidasa es la primera enzima descubierta en la leche. Ha sido purificada y cristalizada y constituye un ejemplo de obtencin bioqumica laboriosa y de muy bajo rendimiento: es preciso tratar 100 litros de leche para obtener 0,2 g de enzima cristalizada. La leche de vaca contiene alrededor de 0,07 g de peroxidasa por litro,lo que representa el 0,2 %del total proteico. Se trata de una protena hrnica que contiene un tomo de hierro por molcula. Parece ser diferente de la peroxldasa de loa leucocitos. Resiste relativamente bien el calentamiento, pues es preciso mantener los 70 o e durante 16 minutos o los 80 o e durante 30 segundos, para conseguir su destruccin. Se encuentra asociada con las protenas del suero. Es tambin una enzima de oxidacin indirecta, porque libera oxgeno de los perxidos como el agua oxigenada, pero se trata de oxgeno atmico, que es aceptado por una sustancia presente en el medio. Por este motivo, puede ponerse de manifiesto en la leche aadiendo un poco de agua oxigenada y un cuerpo aceptador de oxgeno, que pueda actuar como indicador. En la reaccin de Dupoy, se utiliza el guayaco! por dar una coloracin rojo-salmn si la reaccin es positi va. En la reaccin de Storch, la parafenilen-diamina da una colora cin azul oscuro. Estas reacciones se han utilizado mucho para controlar la pasteri zacin alta de la leche (80 C durante 1 a 2 minutos); la enzima se destruye cuando la operacin se ha realizado bien. La l~toieroxidasa catali.~ la oxidacin del tiocianato (N e-s ); la reacc10n lleva a la formacton de sustancias antibacterianas que proCopynght~

matenal

Componen t.. de actividad biolgica

233

vacan la Inhibicin rewnible de n IUIIet'OPI bacteriu ram + y una inhibicin trrevem"ble (efecto bactericida) de bacterias ~~J&~~~ -, entre ellaa Pa. (luoram y Btch. colL Por el contrario, ee muestra iDaaiva frente a 1aa eeporu de &cillua. Al parecer, la l\lltancia activa es el ion blpotioclanato (OSeN"). El agua o:dpruda que ee precisa para 8lla 8Ctlvlclad puede prooeder de la enma que"~ a continuacin. La leche contiene entre 0,017 y 0,25 mM de SCN -. La anterior reaccin explica que la Jactopero:ddua tenp una actividad blolcica lntereaante en la ciencia lechera, ya que ea un inhibidor de alunu bacteria Jcticaa. Ha sido id en tlficada con la lactenlna L,, y, en esta actividad, ae distingue de 1aa peroxiduaa vegetales. Obaeruacl6n : La leche y el c:aloatro de vaca contienen una protena que tija el cobre, comparable a la ceruleoplaamlna de la sangre; est provista de actividad oxidaica frente a diver... auatanc:iu orgnicas, entre eUu el 'cldo ucrbico. Su p~ncla contribuye a explicar loa fen menoa de ollldorreduccin de la leche. DI Xentlne oxldlsl IReduetasa eldehda) La leche ea butante rica en xantina oxldan; contiene ahededor de 0,12 1/1. Ea la llamada enzima de Sc:bardlnler que realiza variadas reacclonea de oxidorredoccin, especialmente la oxidacin de la untina a 'cldo Cuico con produccin de 11C111 oxipnada. Puede 1er piii!Sta en evidencia mediante la reduccin del azul de metileno en pretencia de un aldeb!do, el formol por ejemplo. El colo rante M reduce a la forma de un leucoderivado incoloro, y es oxidado el aldehdo. La leche contiene pocos aubatratos de esta enzima; aln embaro,laa pequeiiu cantidades de agua oxigenada producldu podran provocar la inhibicin de determlnadoa microo11anilmoa. Tambin ee aupone que Interviene en el dqarroUo del sabor ollldado, ya que utiliza el oxge no molec:ular. No debe confundine esta enzima con la llamatla reductasa de la leclie, que representa un sistema complejo de propiedades reductoru, comprendiendo, entre otra, las de laa bac:terlaa y de loe leucocitos (captulo IX). La xantlna oxldu es una llavoprotena, y la molkula de la enzima IIIJU.~ doe molculaade FAD, doetoiDOI de molibdeno y 8 toIDOI de hierro. El pao molecular habihhn.tnte Minado ea 275.000, pero recientemente la cifra dada es m ~. 163.000,obtenida con una lllltancia elecbofottieamente homoc6nea. El punto lloelklzico ae ta en pH 6,2. Bata osidaaa es bastante resistente al calentamiento pero menoa que la anterior; ee destruye a 80 e durante 10 segundos. Tiene una curloea propiedad, la de aumentar au actividad tras un t ratamiento ~rmico no desnaturalizante . Este hecho puede Mr con .ecuencla de la liberacin de la enzima de un complejo poco activo, o de la deanaturallucin de un inhibldor.

234

Componentes de actividad biolgica

La :untina oxidap eat fuertemente aaoclada a la membrana de los glbulos grasos. La leche desnatada tiene una capacidad de reduccin dbil. Se discute la presencia de dicha oxidase en otro tipo de leches. Se pensaba que no exista en la leche humana y se haba ideado una prueba de oxidorreduccin para distinguirla de la de vaca. En realidad, en el momento actual se cree que todas las leches examinadas contienen esta enzima aunque en cantidades muy diferentes; por ejemplo, la leche de cabra contiene de 100 a 200 veces ms que la de vaca. La xantina oxidase ha sido acU58da de producir arteriosclerosis y se ha pretendido que la homogeneizacin de la leche hace que aumenten las disponlbilldadea de esta enzima, por lo que este tipo de leche constituira un factor predisponente. Contrariamente a estas opiniones, investigaciones aiatemticas han demostrado que el paso por el homogeneizador provoca una fuerte inactivacin de la xantina o:r.idasa, llegando esta reduccin hasta unos 2/3. Catalasa Esta enzima descompone el agua oxigenada en oxgeno molecular, que se desprende. Ea un componente nativo de la leche, pero cuando el contenido de sta en leucocitos o en bacterias aumenta, invariablemente se produce una elevacin del contenido en catalaaa. La determinacin del ndice de catalasa es un mtodo de apreciacin indirecta de la calidad higinica de la leche. Las leches patolgicas (mamitis) y las leches anormales (calostro) tienen una actividad catalaica elevada. Pero hay que tener en cuenta el hecho de que la cantidad de cata lasa en la leche vara notablemente con la raza, el individuo, la alimentacin y el momento del ordeo. El prestigio de esta prueba ha descendido mucho. El catalasmetro es un pequeo gasmetro especialmente concebido para medir la cantidad de oxgeno desprendido a partir de un pequei\o volumen de leche adicionada de agua oxigenada. Para la determinacin de la actividad catalaica se ha adoptado un analizador automtico . La actividad catalsica resulta precipitada con la casena, aunque tambin se encuentra concentrada en la nata. El ndice de catalaaa se puede medir en la mantequilla. Al parecer, la enzima se encuentra en elevada proporcin en las partculas lipoproteicaa de la membrana de los glbulos grasos. El sedimento obtenido por centrifugacin del babeurre es 100 veces ms activo que la leche. La catalasa no ha sido aislada y purificada a partir de la leche. La catalasa de la sangre contiene 4 grupos hmicos por molcula. Se supone que la catalasa de la leche puede oxidar los cidos grasos insaturados gracias a su actividad no-enzimtica de su grupo hmico. La mxima actividad se obeerva en medio neutro hacia pH 6,87 ,0. La actividad desaparece mediante calentamiento durante SO minutos

Cl

a 65c.

Copynghted matenal

Componentes de actividad biolgica

235

Hacia el final de la lactacin de las vacas, el contenido de catalasa en la leche aumenta fuertemente. La presencia de catalasa enla leche de mujer es poco constante. Para aaegurar la conservacin de la leche destinada a quesera, has ta el momento de su utilizacin, se permite en algunoe pases la adi cin de agua oxigenada. Este agente antisptico se descompone por la catalasa natural o aadida a la leche (mtodo peroxi-catalaico ). O) Otras oxldomKiu~ l. Se ha observado la presencia en la leche de vaca de una superxido di8muta.a (eritrocuprina; S.O.D.), qae acta catalizando la transformacin del anin superxido, cuya existencia ha sido demos trada en la leche expuesta a .la luz fluorescente y que tambin puede ser engendrada por la xantino oxidasa. La reaccin global es:
20; + 2H' -+O, + H,O,

La enzima funciona con el cinc o con el cobre (Cu 2 ' ) . Si se admite que el anin superxido y H1 0 1 (que reaccionan lentamente para producir el radical hidroxilo libre OH. ) son necesarios para una oxi dacin rpida de los lpidos, se concluir que la reactivacin de este sistema por la S.O.D. y la catalasa es esencial para prevenir Jos problemas de oxidacin. Existen variaciones individuales y raciales en el contenido de S.O.D., pero stas no parecen tener influencia en las grandes variaciones Individuales de la susceptibilidad de la leche a la oxidacin. La S.O.D. es bastante termorresistente, pues sobrevive a la pasteri zacin corriente (70 oc, 16-20 segundos). 2. Se ha aislado de la leche. una sulfhidriloxid<J$4 cuya molcula debe de tener un peso molecular de 80 a 90.000, pero en su estado nativo est muy agregada. Cataliza la formacin de puentes disulfuro:
2-SH -+--6- 8-

La reaccin se produce con diferentes tioles, entre ellos la cistena incluida en las molculas proteicas, y en presencia del oxgeno, con formacin, nuevamente, de agua oxigenada. Esta enzima podra tener una aplicacin industrial, bajo forma in movilizada, para mejorar el sabor de la leche UHT. Es necesaria y su .ficiente la ox. dacin de los 2/3 de loa grupos -6H para impedir la i aparicin del sabor a cocido.
Copynqhted malenal

236

Componentes de ac11vlded biolgica

111 ENZIMAS HIDROLITICAS


A)
Li~

l. Lo llpoprote(M /paa

Hemos visto, a propsito de la hidrlillia de la materia rua, que la leche cont.iene una enzima lipoltica que hidrollu. loa sJ.ichidos inaolublea a glioerol y cidoa grasos. Es por lo tanto un factor de rancidez. Ha habido mucbaa dlacullionea aobre la existencia de varias lipuas diferenciadu en la lecbe y se ha habllldo de "llpua membrnica" y de "lipaaa plaamtica". Pero en la actualidad se admite que la lecbe de vaca normal contiene aolamente una enzima llpolftlca, que ea la reaponaable a la vez de la llpliaia espontnea y de la llplisla Inducida. La llpua de la leche ea ms exactamente una lipoprotena lipaaa, ya que exige la presencia de componente del suero eaniiUneo que se han Identificado como lipoprotenu HDL (de alta delllidad). Eataa ltimu 111 encuentran en la leche en pequea cantidad,lo que explica que la enzima- activa aun en auaeJI.cia de suero eanuneo, pero entonoea la actividad ea bllja. FA posible que la rancidez espontnea de la leche dependa de la cantidad de HDL procedente de la ungre. Por otra parte, se precia& una albmina como aoeptor de loa cidoa grasos librea. La leche de vaca es una de laa ma ricu fuentea de lipoprotena lipaaa. El origen de ata es la glndula mamaria, donde au funcin debe ser la de favorecer el tranaporte de los cldoa graaoe de laa lipoprotenea sanuneaa para la incorporacin de loe trigllcridoe de la leche. El contenido de la leche de vaca en lipua vara entre 1 y 2 ml, y se encuentra en ran parte en la leche deanatllda, donde est fuertemente ligada a la cuena. La lipua de la leche se parece, debido a determinadas propiedades, a la Upaaa pancretica, pues tiene la miama especificidad para lu funciones prlmariaa de loa sJ.icridoa (poalcln 1 y 8). Hidroliza preferentemente loa enlaces con loa cidoe graaoe de cadena corta. Es muy sensible a loe Ouoruros, los metales pesados y eii(Ua oxgenada. Es una gllcoprotena de peao molecular cercano a 60.000, pero en estado nativo ae encuentra un dmero. Su punto iaoelctrico ea przimo a pH 9,0, aitundose el pH del mrimo de estabilidad y de actividad entre 7 y 8. En medio cido ee inestable. La eatabilldad trmica de esta enzima ee eecua, ya que por encima de !01 60 e IU destruccin es rpida. Tambin se destruye por la luz. Aun a 37 e, la lipua lctea se inactiva lentamente. Esta senlibilldad al calor la distingue de lu lipaaas de Jaa bacterlaa plcrotrofaa presentes en la leche, talea como laa PaeudomonOJ, que a vecea tienen una marcada termorresiatencia.
o r Qrte r a r al

Componentes de actividad biolgica

237

2.

Otnul~

La materia grua de la leche del final de la lactacin eat predispuesta a la l'lllddez lo mismo que la& Jecllea mam ticu, lo que parece ser cuestin del nivel de actividad de la lipua normal y no de la en-

trada en accin de otra lipua. Por el contrario, en loa cuos siguientes deben intervenir otru lipuaa: - Parece ex.stir una "caloatrolipasa" diferente de la anterior porque no ea inactivada por el suero sanuneo, no est ligada a la cqe{na (ae encuentra en el lactoauero iaoelctrico) y ea estable a pH 4,6 y 37 c. Es efmera y desaparece alunos das despus del parto, ocupando su lugar la llpasa normal; por ello cabe preguntarle s no es una forma inmadura, pues no se han detectado en nlnrn cuo la& doalipaaas juntas. - En la leche humana, al lado de la lipoprotena llpasa, ae encuen tra otra llpasa activada por las sales biliarea y resistente a loa rayoa ultravioleta . No parece extir en otroa mamferos. - La leche de vacu con trastornos ovricos contiene una lipasa di ferente.

dtoliav lu lec:itmu, pero la loeho eruda conaarqda to.1o rtfrirtncl6n ..U con tunbt..t. con &eoaencla por bactedu qut produoaa una focfoUp- que puede proYOCU detecte. en el ubor, que puedo - putlcularmt nte om.,.o. La lecbt
de m\lltr u enrancia mucho m lipidamenle que la de vaca, lo que de llllar a un deecen10 lipldo del pH cuando u conoerva 011 frlo.

Noto.-

Al -

DO

mlltell ..... leche do nca fotfotlp. . . -

de hi-

B) Folfatalls La leche contiene dos enzimas que hidrollzan loa ateres fosfricos: - fosfatasa alcalina, con un mximo de actividad a pH 9,6 (para loa auatratos de bajo P.M.) - toafatasa cida, con un mximo de actividad a pH 4,5. a) L4 (ol(otGMJ aiC11/J114 es una forfomonoeaterua cuyo pH ptimo depende de la naturaleza del 1\atrato. Con tuatanciu de bajo pero molecular el pH eat comprendido entre 9 y 10, por ejemplo con la fotloserina; por el contrario, la detlotlorizacin de la c:aaena ea ma rpida a pH cercano a 7 ,0. Ea una metalo~co-protena que exige dos t lpor de metales para que re produzca au actividad mxima: - el cinc, que es esencial (pero se puede reemplazar artificialmente por el cobalto) - el magnesio, que ea un ion estimulante. El magnesio solo no puede regenerar la actividad a partir del apoenzlma deametallzado, pues tiene acceso al lugar del Zn. Por el con-

y hted 'lla

al

238

Componentes de actividad biolgica

trario, el cinc se puede fijar aobl"e los sitios del Mg pero provocando una inhibicin. El peso molecular es prximo a170.000. La fosfatua alcalina est ligada a la materia gnsa y desaparece en gran parte en la leche com pletament.e desnatada, concentrndose en la nata. Se la encuentra en el suero de mantequllla tras el batido. Constituye desde luego una parte importante de la capa ad&Orbida sobre los glbuloa gruos a nivel de la "membrana" externa. Las fosfataaas alcalinas de las leches de mujer y ovina son muy parecidas si no idnticas a las de la leche de vaca. Todas estu foafata sas estn caracterizadas por la ausencia de especificidad de sustrato. Tanto en 1aa pequeas molculas como en las grandes de laa fosfopro tanas, rompen los enlaces steres fosfricos (Linden y Altlls, 1978). La actividad fosfatslca aumenta al final del perodo de lactacin y decrece con la edad de la vaca; existe una determinada correlacin con el aumento del porcentaje de materia grua. Esta enzima tiene una resistencia al calor lleramente superior a la de las bacterlaa patgenaa que pueden exiatlr en la leche. &te hecho permite el control de la ~rizacin cualquiera que sea el mtodo utilizado , alt o baja (capitulo XIV). Cuando la foslatua se destruye, tambin son destruidas las bacterias peli:r01aa. La prueba claica de la foafatua conaiste en determinar colorlmtricamente el fenol que se libera del enilfosfato diadico o de uno de aua derivados:

e, H1 -o-P01 Na1

+ H1 O

e, H, OH

P04 Na1 H

La utilizacin de un derivado nitrado (paranitrofenilfoafato) sim plifica la tcnica. Esta puede aplicarse a la mantequilla y a los quesos, pero en este ltimo caso hay que tener en cuenta que alunoa micro organlamoa, presentes normalmente en el cuno de la maduracin, segregan fosfatos, en especial las levaduras y los mohos. La prueba puede, por lo tanto, ser al principio negativa y luego poaitlva, aobre todo en los quesoa pequeos. Independientemente de la anterior eventualidad, puede obeervarse una reactivacin de la foafataaa alcalina. La prueba ea neptlva tras el tratamiento trmico; pero despus de cierto tiempo de almaoenamiento, sobre todo si la temperatura ea elevada , la prueba ae vuelve positiva. Eata desnaturalizacin percial revenible ae examinar en el captulo lllulente a propsito de loa efectos del calentamiento en las protenas. En la leche de mujer, la concentraci6n de la foafatua alcalina ea unaa 40 veces ms ~ que en la leche de vaca. La gran similitud de la foafatua alcalina con la enzima heptica permite aoapechar un ori gen comn exterior a la glndula mamaria.

b)LG (oefataatJ cida ea ms e:uctamente una foafoprotena foafataaa. Puede hldrollzar la eerlna-fosfrica en la caaena cuando el pH.es
o r Qrte r a r al

Componen!" de actividad biolgica


~o.

239

oon 11\1 ptimo a pB 4,5, pero tambi6n puede hldrollsar el feniJ. foetato, alllual que la anterior. No e1 una metaloprotena y ee pereee mucbo a la foefoprotena foefeta de la rata. Son protenaa bicu, actlftdu fllerttmente por el cido ucrbloo. La foefate idda ee encuentra a la ves en la leche dematada y en la nata. Ee una de !u enzimu ma termomllatentee de la leche, con eemlll\l ac:tlvidad haeta loa ssc.

C)Pro
De una manera comtante ae encuentra en la leche una enzima proteoltica que no procede de las bacterias. Se la ha comparado a la trlpaina porque la eapeclficldad de ruptura de loa enlacea peptdicoa impll ca efectivamente a loa carboxiloa de la IU'IInlna y de la Uaina. La degradacin de lu protenas ea acusada y llesa m a1U de laa peptonas. El pH ptlmQ de ac:tlvidad e1 prximo a 8,0, pero pera determinadoa autoree ex.iltlra una amplia zona ptima entre pH 6,5 y pH 9,0, lo que perute penAr en la presencia de varita enzfmee , hecho que ee ha oomprot.do. Se trata, por lo tanto, de un liltema endmtioo aobre el que ee ha hecho una revisin por parte de Hum~rt y Alall (1979). Cul toda la actmdad proteoltica eat llpda ala cuena y precipita a pH 4,8; loe mtodoa Ulualel de puriflcedn de la cuena no la ellmi!llll por oompleto; el preciso calentar haeta soe durante 10 minutoe pera uecwv la deaapuicin de esta proteaaa. Se eepe.n. de la caeefna por fraccionamiento con aloohol a pH 8,0 o por lavado con aguaacldWcada a pH 4 ,0. La enzima ee puede extr.er delaa agua de lavado . Eate a.llteme enzimtico es bastante reeiatente al calentamiento, pero tu eatabUidad depende del pH. Cabe pr4!1Untane alaobrevive a loa tratamiento t6rmlcoa que llevan la leche a temperaturaa muy 11\1 perlorea a durante un corto tiempo; a menoa que aufra una reactivacin, ya que~ puede observar una protellala lenta pero no de~ ~ble en 1aa lechea eatrilea conaervadu a aoc. La aterlllzacin U.H.T . (ultra..tte-temperatura) a 140-150 C durante 1 a 2 aegundoa, e61o dl:fUY pe.rclalmente la actividad prot.ica y la actividad ra dual puede aplicar la aelificacin de clert&a lecbelllt6rllea. Elliltema enlrimtico eat conmtui.do como mnimo por doa pro-

soe

tH:
l. Lo pror- "olcG/iM", que predomina (probablemente el 80% de la ac:tlvldad total). Su pe.o molecular 48.000 y au pH ptimo 8,0 . El una proteua con aerina, como laa prote- pancretlcu y la plaauna. Su aemejanza bioqumica con esta ltima Ueva a creer que aon id6ntlcu. Un eatudlo completo de la eatructura primaria permi tiria confirmar eata hlpteaia. Recientemente ee ha altlado de la leche la forma nativa inactiva (zimgena) de la proteua alcalina, que se activa como el plumlngeno.

240

Componentes de actividad biolgica

La accin proteoltica se reaHza preferentemente aobre la casena /J y liberan loe framentoe Indicados en la flwa 25 (cap. VI). La leche contiene un inhbidor eapecflco de eeta proteua, que se aaemeja allnhibidor de la mpsina. Para algunos autores emtiran dos prote&lla alcaHn'l que no ten dran exactamente la misma especificidad de auatrato. 2. Lo prot- 6cid4, cuyo pH ptimo ea 4,0 y su peeo molecular 36.000. No ee una proteasa con serina. Se activa sobre todo por la casena cr11, que transforma en derivado cr, 1 - 1 (como hace la quimoai na). Se piensa que tiene un papel en la maduracin de loa queaoa, ms marcada que la anterior, dado su pH O. En comparacin con loa ante riores ea un componente menor.

DI cr-emllasa
Es la enzi. a ms constante en proporcin en la leche. Sacarifica el m almidn y ae puede seguir la reaccin mediante el yodo; 100 mi de leche non:oal, a 25 C, bidrolizan 22,5 1 de almidn aoluble en una hora. El pH ptimo se situa, a aoC, cerca de 7. El calentamiento durante una hom a so e o de 30 minutoo a 65 e, la dfllltruye. La propoJ'Cin de amilu ae eleva en el caloatro y en las lechee patolgi caa (mamltis), pero disminuye en laa lechee vieju. Eata enzima se ptecipita en gran parte con la casena. La leche de vaca contiene menos amilua que la de loa otros ru miantes (oveja y cabra) y an menos que la de buxra y que la leche de mujer. Al lado de la a-amilasa, que predomina, ae encuentra tambin una jl-amilasa.

El Llaozlma
Las llsozlmas son J.glucoaaminidasas o "muramidasaa", que provocan la hldzllsls del polisacrido que conatltuye la pared de ciertas bacte riaa, conducindolas a su destruccin (loa pollaacridos estn conoti tudos po.r un encadenamiento de glucoaamlna y cido murmico, al cual eatin lipdos pptidoa). Estas enximu eatin muy difundidas en loa dos reinos. nade el punto de vista qumico aon pptldos bicoa de poco peso molecular (14.000 a 18.000), muy eetablea al calor. En la leche humana se ba aislado un componente proteico que presenta eatu propiedadee; ee idntico a la llaozlma de la saliva o de la pla centa, y probablemente tiene un origen ieucocitario. La leche huma na contiene cantidadee muy va:riablee, de 40 a 600 mgfl de lieozimas. La leche de vaca normal ee pobre en leucocito y no contiene liaozi ma en cantidad apreciable; por el contrario, s lo contiene cuando hay abundancia de leucocitos. La liaozima de la leche se encuentra enteramente en ellactosuero, de donde se la puede aislar. La estructura de la lisozima de la leche de mujer ha aido establecida y muestra analogaa con la de la clara de
pyr ttE'd fl'atcr di

Compon~tes de

actividad biolgica

241

huevo de pl.llna. que line de referencia, pero au ac:tlvlcbd eapeefica et 3,6 m elomda. Algunas propiedad'!t moleculares de la IDolima hall Indicado a proplito de la o-lac:talbmlna, que ea muy pmeclda (cap. VI, a. t. XXVI). La U.Odma tiene imporlancia, aobre todo deade el punto de risia de la nutricin. En el hombre. ea una de laa cawu m evidentes de la auperioridad de la leche humana para la allmenlkln de loe recin nacldoe por 1aa lluientea propiedadea.
1. La lllozlma facilita la forracin de un preciplt.ado en forma de flculoa de caaefna, mejorando la dicestlbilldad de la caaena de vaca. Su efecto ea deatacado cuando se aftade a la leche de vaca al mismo tiempo que el cuaJo: no ae forma el cogulo fume. Se desconoce la causa de este electo; poaiblemente ae forma un complejo, dado el carcter cido de la cuena y el b.aico de la Uaozlma. (Loa puntos iaoel6ctricoe IOn retpeetiVIImente 4,6 Y 11,0.) 2. La Uaodma Ubera en el intestino ucaret amlnadoe que collltituyen r.ctoret de aeclmiento para el L<u:tobocUlua blfltbu (factorea "hlfl~oa", vue m adelante). 3. La U.Odma tiene una actmdad bacterioatiUcaaobre numeroeapeciel becterianu. Ecta accin antibitica ea, ciertamente. una de 1aa fundonea de eata enr:ima Contribuye a la proteccin de la lecbe y a la defe1111 del orpni!II!!O jo?en. 4. La Uaodma Interviene en el tumowr de laa cUcoprotenaa y pro teolillcanoa, y quiz - eata su funcin principal en el orpniamo animal.

IV TRANSFERASAS A) Rlbonuc'-1 La leche de vaca contiene unos 25 mgJl de eata enzima; ea la ma rica y por eUo puede utillluee como fuente para preparaclo.-lnduatn.lel. La leche de lot otro. rumiantes y la leche de mf.IJer contienen aenllblemente menoe cantidad. ()atoHza la bldrllala de lot cid011 ribonudeiOOII, pero de hecbo ea una IDm!oe!orllaae. r.t 8IOciada a las prol.enaa del *'*-WTO y en la nata Ilo es encueoll'an cantidades mnlmu . La ribonucleera A ha lldo illada de la leche de vaca y purificada; probablemente ea Idntica a la del Mncreu, que ee una pequea protena de peao moleeular cercano a 13.000 y cuya eatructura balido completamente determinada. Al igual que la anterior enzima, ea una protena blca muy reailt.ente al calentamiento y no 118 destruye por loa tratamiento tipo U.H.T. (ultra-altatemperatura); tambin ea resistente a clertoa aaentea desnaturalizantes como lo. urea o el EDTA.

242

Component" de actividad biolgica

S. ha planteado la cuoa.tin de aaber 11 la rlbonucl de la leche


puede actuar 10bre la. 'cida. nuclelcoe de loe mlcroorpn!cmoa y de esta IIWiera tener int1uenc:ia 10m IU Ntabllidld.

el tejido de .eaedn mamaria. ()a~lq la bla.ntetia de la lactou .egn la raaocl6n : UDP11alacto1a + glucol& lactol& + UDP Hamoa hecho referencia a ello anteriormente a propalto de la aecrecln de la leche y de la a..Jactalbmina. La enzima propiamente dicha, la flalactoaU-traneferua, ea una flllcoprote!na de PM a 42.000 que exlfle do 'tomoa de manganeso.

Bl LJ~ctose.llntatlll Ee una allOOIIlb'anlfena que oolamente encuentra en la leche y en

V OTRAS ENZIMAS E INHIBIDORES


l . La prennc:ia de una lacmc ~..,uactox:ldMa), endme b.ldzoiizante de la lactoA en glueo~& + p1actou, llt oontro-w&. Para cierto. autora, ea encuentra en la leche de f~ normal. Lal peqne candada. de glueo~& y plactou que ee hallan Ubre. en la leche, induiO deepuh de au coDI8lY'Icin, 10n un dato a favor de alta punto de vilta. 2 . La leche conene tambin aldola< (E.e .4 .1 .2.18), comparable a la enzima del maculo que acta aobre la truct011-dlfoafato. Su porcentl,je au(re una fuerte elevacin en 1 lechea mamt1c&~. Ea la I!Jl zlma me frigil de la leche; ya ee manlfla.ta IU lna.tabllldad a 45 e y ee deatl'l!ye en 20 mn. 3. Al lado de la lipaaa eetudiada anteriormente ee encuentran en la leche IIICI'IIIIU A, B Y e que b.ldzoli&an loa etern IOiubla. y DO loe trlallcrldoa. Al perecer, la aparicin de a.taa enzlmaa coincide con la ln!ecc16n de la mama. Tambn ee ha oblervado una acvldad colinestarlca alflo dfbU en la leche y m manifiesta en el caloetro. 4 . Un factor tripiID-inhtbidor ea encuentra tn ti caloetro y en muy pequefta cantldld en la leche ; predpita con 1M fllobuJ!nas. FA muy puec:ldo al ~t~~epdo por el pnCNM. S. 1upona que au funcin ee la de prevenir la hidrlisi& de lal protenat antlcuerpoe en el intestino. El pt10 moleculat de ate inbibidor a.13.000 . En la leche mamtica eparece otro inhibldor (PM = 70.000). No 10n muy a.peeficoe, puetto que tambifn inhiben lal proteaaaa de la leche y 1&1 de los leucocito.. Probablemente existen en la leche otras enzlmae lnhlbldoraa eaperra

Componentes de actividad biolgica

243

cficas, especialmente de la xantina-oxidasa, la lipasa y las proteasas microbianas.

VI LAS V ITAMINAS EN LA LECHE

Las vitaminas son pequeas molculas de estructuras variadas, a veces


muy complejas. Tienen una estrecha relacin con las enzimas, pues la mayor parte de ellas actan como coenzima y estn asociados a una apoenzima proteica en su actividad biocatal(tica. Se sabe que las vitaminas son necesarias para el funcionamiento de los procesos vitales y que el organismo es Incapaz de sintetizarlas. Los alimentos deben aportar una cantidad suficiente de vitaminas de acuerdo con la edad del individuo . Segn puede verse en el cuadro 29 la leche contiene casi todas las vitaminas pertenecientes a los dos grandes grupos: 1. Vitaminas lposolubks (A, D y E). asociadas a la materia grasa; por esta razn se encuentran en la nata y en la mantequilla tras el desnatado, y no se hallan en leche desnatada ni en el lactosuero. Su contenido obedece a la influencia de factores e.xgenos: alimentacin y radiaciones solares; por lo tanto, es muy variable. 2. Vitaminas hidrosolubles (B 1 , B2 , e, etc.). Se encuentran en la fase acuosa: leche desnatada y lactosuero (la mantequilla no las con tiene). La riqueza de la leche en estas vitaminas depende poco de las influencias exteriores; por ello su contenido vara relativamente poco. Las vitaminas del grupo B que se encuentran en la leche de los ru miantes, proceden de los forrajes solamente en parte; su origen prln clpal se encuentra en la biosntesis de las bacterias del rumen. Pero como el metabolismo microbiano en el rumen estn condicio nado por la naturaleza de los glcidos Ingeridos, la alimentacin tiene por lo menos una Influencia sobre la cantidad de vitaminas que pasan a la leche. El calostro es ms rico en vitaminas que la leche. Las diferencias en la composicin vitamnica de las leches de los diversos rumiantes son poco importantes, pero no ocurre as cuando se comparan con la leche humana; esta ltima es ms rica 9ue la de vaca en vitaminas E y e principalmente, pero el grupo B est mejor representado en la leche de vaca. Algunas vitaminas se inactivan por el calor, la oxidacin o la foto lisis (efecto de la luz solar y las radiaciones). La actividad vitamnica de la leche puede por ello reducirse en el curso de los tratamientos lndustrialea, pero estas modificaciones se limitan a algunas vitaminas, como puede apreciarse en el cuadro 29. Volveremos sobre esta cues tin en el captulo XXIII, dedicado a los problemas de la alimenta
Copynqhted matenal

244

Componentes de actividad biolgica

cin; en este mismo captulo veremos la parte que corresponde a las vtaminaa en el valor nutritivo de la leche. Se han consagrado numerosos trabajos al llamado "valor vtamnico" de la leche de vaca. La documentacin baca se encuentra especialmente en las publicaciones de Kon (1962), de las que se ha extrado parte de los datos del cuadro 29. Las otraa leches han sido mucho menos estudiadas. Los valores referentes a la leche de mujer, anotados en dicho cuadro, se han extrado de una reciente revisin de Causeret (1971). Este autor ha subrayado el hecho de las numerosas divergencias que existen entre los diversos autores y ha dado variaa explicaciones, la principal de ellas que la determinacin de las vitaminas en la leche es muy delicada y que los mtodos son cada vez ms precisos y especficos. En los productos derivados de la leche se producen modificaciones de la composicin vtamnica en relacin con los tratamiento sufridos y tambin en relacin con el crecimiento de algunos microoranjsmos en los productos fermentados. Se volver sobre el tema en el captulo XXII.

VII VITAMINAS LIPOSOLUBLES

Desde el punto de vsta qumico las hemos estudiado en el captulo V, ya que acompaan a la materia grua con su precursor.
l. Vitamina A

Es el retino! o axeroftol. Se sabe que esta sustancia es indispensable para la vsin y el buen estado de las mucosas, y tiene una accin antiinfecciosa. Es importante sobre todo para los jvenes, pero debe igualmente administrarse a los adultos. La leche y particularmente la mantequllla son una de las principales fuentes de vitamina A para el hombre. Esta vitamina tiene como precursores los csrotenoa; se encuentra en forma esterificada con el cido palmtico. El organismo animal no puede sintetizar el csroteno, pero el hgado lo puede hidrolizar en vitamina A. Por tanto, el contenido de la leche en vtamina A vara mucho, ya que existe una gran diferencia entre la alimentacin de verano (hierba rica en caroteno) y la de invemo (heno y races, muy pobres en caroteno). Ya hemos visto como se puede regular el nivel de csrotenos mediante una alimentacin adecuada y evtar la caida invernal que puede alcanzar un factor 5(0,1-0,5 mg/1). El calostro contiene unas diez veces ms vtamina A que la leche. El manteniminento de un nivel constante y elevado de caroteno en la leche y la mantequilla, es un problema importante. La margarina es deficitaria en vtamna A y carotenoa, sobre todo la que prooede de
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Cuadro 29. Composicin vitamnica de la leche y efectos de los tratamiento indu.trialea (1) (para 100 g)
Leche de vaca (ao deteremllla)

Esterilizada
Cruda Pasteurizada (2) HTST

Coaceatrada (S)

Deoccoda "(Spray)"

Leche
hum1a1

en
boteUa

UHT (3)

sin

con

az6car
ISO 2 42 (7) ISO 3SO 100 37S S 67 (40) 37S 87S 250 3,4 (JO) 3S (60) 0,'0 (90) 2.000 (60)

u4car
37S !.ISO 270 0,4 560 16 42,6 200 170 0,4 11 0,1

Vitamina A, U .l. (4) (actividad total) Vitamina O, U.l. Vitamina E,IJI Tiamina (B 1 ) , tg RJboflavioa (B2 ), .g Ac. pantottnico, g Ac. nicotnico (PP),tg Biotina, IJC Vitamina B6 ,.g
Vitamina 8 12 , iJ8

ISO 2 80 4S ISO 3SO 100

ISO 2 42 (7) ISO 3SO 100 !,S 3S 0,3 1.800 (10)

!SO

2
30 (35) ISO 3SO 100

S
103 (10) 37S 87S 2SO 3,4 (10) 88 0,53 (30)

1S
310 (lO) l.ISO 2.700 760 10 (10) 26S 1,6 (30)

!,S
3S 0,3 2.000

!,S
18 (SO) (90 a 100) 1.000 (SO)

!,S
3S 0,24 (20) 1.800 (10)

Vitamina C,.g (1) (2) (3) (4) (S)

4.300 (IS) 13.000 (20) 4.300

Ver el texto; los nmeros entre partntesls indican las p~rdidas en %durante los tratamientos t6rmicos. 72/l S segundos. 130-140" durante menos de un segundo. U.t.: unidad internacional (0,3tg de retino!; 0,02S Jg de vitamina O). Tasa de concentracin X 2,S.

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Componentes de actividad biolgica

aceites de ~emi!las; en algunos pases, loa fabricantes aaden concentlados de vitamina A a la margarina. En lo que ae refiete a la mantequllla, se pueden tomar loa siuientea valorea medloa de actividad vitamnica A total: en veran.o , 4 .000 UJ.t , y en nviemo, 2.400 UJ. t.

2 . Vitamlno D La leche contiene poca vitamina antmaqutica, o factor de retencin de calcio y fs!oro. Su formacin se debe a la irradiacin ultravioleta de clerlos eateroles que tienen los doblea enlaces en posicin !>-6 y 7-8 (fig. 11, cap. V). Por lo tanto, el contenido de la leche de vaca vara con la duracin de la exposicin del animal (y tambin de los alimentos) a la luz solar. En verano, la leche contiene 4 a 5 veces ms vitamna D que en nviemo. No exUlte una buena fuente de vitamina D en la alimentacin habitual del hombre, y por eso no debe olvidarse la leche deade este punto de vista. La leche puede enriquecerse de tres formas: - Ad.miniJtracin de ciertoa alimentos irradiados a las vacu, como la levadura de cerveza, por ejemplo. - Adicin a la leche de vitaminas D antticu; ea una prctica que se realiza en ciertos pases. - Irradiscln de la leche con rayoa ultravioleta que provocan al mismo tiempo la destruccin de microoJ1anismos. El mayor nconveniente de este procedimiento es que no permite un control preciso de la actividad vitamnica D en la leche tratada; lo que es un punto importante para los nutrlogos y pediatras. Se han IMlalado tu consecuencias nocivas de la absorcin de cantldadea excesivas de vitamina D en el nlllo. Por otra parte, si la irradiacin est mal dosificada, la leche puede adquirir un sabor "oxidado". En condiciones extremas se pierde la actividad vitamnica y se forman eateroles txicos. La actividad antirraqutica de la leche ea tan variable como su actividad vitamnica A. Se encuentran valores que varan de 1 a ms de 50 U.l. por litro. Se toman habitualmente como valor medio, de 15 a 20 U .l. 3. V itam/110 E Loa tocoferoles estn presentes en numerosoa alimentoa. La leche de vaca con. iene muy poca cantidad en relacin con la leche humana, t alrededor de 5 a 10 veces menoa, pero laa variaclonea parecen ser considerables. El tocoferol es una sustancia fcilmente oxidable. Hemos sealado anteriormente au funcin antio:ridante. Con menos de 2,5 mg/100 g de grua, tiene una tendencia marcada a la oxidacin.
Noto:- La ultamina K. que es un factor eoqulmt6 de la aanpe, .. enouentra en la leche en muy pequeu cantidadH.

yr Qhtee r1a r al

Componentes de actividad biolgica

247

4. Acido lipolco
En la leche se encuentrae l cido lipoico o tictico, que es indJspensable para ciertos microorganismos, pero que quiz puede ser sintetiza do por el hombre. Sea como sea, esta sustancia es importante porque constituye la coenzima que interviene en el transporte de hidrgeno. Acta en las diversas oxidaciones y probablemente en la de los grupot sulfhidrllos activados, en relacin con la formacin del sabor a cocido. El cido llpo!co ha sido aislado de la leche, en la que se encuentra ligado a la fraccin proteica de la membrana de los glbulos grasos . El suero de mantequera desecado tiene una elevada actividad.
00
H
CH1-

OH

OH

CH -

C'J.t - CH -

Ctf)OH

/v\J\co CH, -c e e
CH,-C

e
HC

11

.NH

.( '\-""'"
11

HC

/~

C--(."()fflH

'

/'\ , . , 1 e
0

"H-~'

Ctl

11 HC

Ctl

"# H

Lactotlavina

cido nicotinico y amida del cido

o
Rlboflavlna

nicotnico (provitamina)

VITAMINA PP
~

Otl

oo- e

/'\C-ai,OH
1
CH

cw.-e

JI

Pitidoxina 1

'/
=
VITAMINA flt

Adermina

o 1 1

n:..
L !:"
!1....
CH,Oif

reduccin oxidacin

O l

~~
L~
c....
1
1

CH,oH

cido ascrbico

cido dehldroascrblco
<C.t\0.1

Figura 48. Vitaminas hidrosolubles,

Copynqhted malenal

248

Componentes de actividad biolgica

VIl LAS VITAMINAS HIDROSOLUBLES

A) Vitaminas B
Forman un grupo importante por su actividad bi.:>qumica. Todas se encuenttan presentes en la leche. La t1ura 48 muestra au estructura qumica, que es muy diferente de la que COITI!Bponde a las vitaminu liposolublea. Anteriormente las principales vitaminas hidrosolubles eran la B 1 , B2 y C. Al revelarse muy complejos los fenmenos carenciales imputables a la vitamina B. se separaron varias sustancias activas: la riboflavina (vitamina B, propiamente dicha), la nicotinamida, el cido pantotnco y el cido flico.
l. Vitamina B, (tiomina o aneurina)

Se deriva de la pirimidina y del tiazol. La leche contiene normalmente una cantidad considerable. El porcentaje es mximo en el calostro: 1 mgfl, y va disminuyendo hasta desaparecer (primera leche : 0,6 mg; ltima: 0,3 mg). La estacin y la alimentacin no parecen influir . La tiamina existe en la leche bajo formas diferentes: libre, combinada con el cido fosfrico o ligada a las protenas. Es el llamado factor antineurtico, pero PQSee otras actividades fisiolgicas: activacin del crecimiento, utilizacin de glcidos, etc. Las necesidades del hombre en tiamina dependen del aporte calrico.
2. Vltamill4 8 2 (ribo(laui114) La riboflavina pura es un cuerpo cristalizado; sus soluciones son amarillas y brillantes, con fluorescencia verde. Es la que comunca allactosuero su color verdoso. La rivoflavina es un polialcohol nitrogenado derivado de la isoaloxazina. Se encuentra, ya sea libre o asociada a las protenas y al cido fosfrico en un complejo enzimtico en la superficie de los glbulos grasos. La leche de vaca contiene como trmino medio 1,5 mg de riboflavina por litro. El calostro contiene mucha ms: 4 a 5 mg') . Es de resaltar que la leche humana es pobre en riboflavina: 0,4 mgl. El porcentaje de esta vitamina es menos variable que el de las precedentes, sin embargo, se eleva un poco con la alimentacin de verano. Como algunas otras vitaminas hidroaolubles,la riboflavina es sintetizada por la microflora del rumen. Esta vitamina tiene funciones mltiples: ejerce una accin sobre el crecimiento; es un cuerpo importante en el metabolismo animal y vegetal por su intervencin en los fenmenos de xido-reduccin celular ya que es el componente esencial de las flavinas-nucleotidas (FAD, FMN) que son coenzimas. Interviene en los fenmenos de oxidacin que se producen en la leche, particulsrmente en la destruccin de la

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Componentes de actividad biolgica

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vitamina C; interviene tambin en la formacin de saborea anormales (sabor "solar"). Es la vitalllina ms sensible a la accin destructora de la luz solar. 3. Vlmmlna PP (nlcotlnamlda, nlacina) La amida nicotnica es el componente de nucletidos asociados a enzimas de xido-reduccin . La leche contiene poca cantidad; se la considera, a pesar de ello, como un alimento interesante para la prevencin de la pelagra. Adems, el triptfano es un precursor de esta vitamina, y la leche contiene este aminocido en cantidades notables: 60 mg de triptfano tienen el mismo efecto que 1 mg de nicotinamida. 4. Acldo pantotnico Es un dipptido particular que constituye la coenzima A, la cual tie ne una accin de primer plano en el metabolismo, activando el cido ctrico y los cidos grasos. La carencia en el animal de experimentacin provoca dermatitis. Tambin es un factor de crecimiento para numerosos microorganismos exigentes, entre los que se encuentran los LactobaciUus. La leche es una buena fuente de cido pantotnico (3,5 mgJl, o -las necesidades diaria& del hombre). 6. Vimmina B 6 La piridoxina y sus derivados constituyen una importante coenzima del metabolismo de los aminocidos: descarboxilacin, transamlnacin, modificacin de la cadena lateral. La leche c<intiene pequeas cantidades; hay de 5 a 10 veces ms en la leche de vaca que en la de mujer, pero es una sustancia termolbil.

6. Acldo flico El cido flico es un derivado de la pterldlna, que funciona como una coenzima en el transporte de formiato, bajo forma de tetrahidrofolato. Es tambin un factor de crecimiento de 106 microorganismos. La leche de vaca contiene como trmino medio 3,5 1'1/100 1; en ciertos quesos se encuentran cantidades relativamente elevadas (azul: 40 1'1/100 g). 7. Biotina Tambin denominada vitamina H. Participa en la transferencia del grupo carboxllco y es inhibida por una protena de la clara de bue vo, la avidina. En la leche slo se encuentran pequeas cantidades. Es un factor de crecimiento de las levaduras.
Copynqhted malenal

250

Componentes de actividad biolgica

8. VI/Qmlna B 12 (colla/omina) No est presente ms que en pequeas cantidades en la leche, pero dada la actividad conaiderable de esta vitamina, conatltuye un aporte interesante en ciertas deficiencias (anemias pemicioaaa). Sin embargo hay que reaaltar el hecho de que esta vitamina ee la ms aenaible a loa efectos del calor.

B) Vitamina C (Acido L -esc6rbico1

Es la ms sencilla de las vitaminas: ea una Iactona. Es tambin la ms frgl de las vitaminas de la leche, aenaible a la vez a la oxidacin y a las radiaciones, as como al calentamiento. Numerosos mamferos sintetizan el cido L-ascrbico, el hombre y los primates no la pueden sintetizar. Las necesidades del hombre son mucho ms elevadas (76 mg/da) que para las otras vitaminas. La leche contiene relativamente poco cido ascrbico (20 mg/1 ), en comparacin con numerosos frutos y legumbres, que pueden con tener 100 veces ms. Esta cantidad mediocre ee disminuida por las manipulaciones al aire y los tratamientos trmicos. La deetruccin de la vitamina e se acelera en presencia de riboflavina o de cobre. La leche de recogidas de gran volumen con frecuencia no posee poder an tiescorbtico. El cido ascrbico tiene una estructura qumica especial, con el grupo dienlico, que ae transforma fcilmente en a-dicetona en pre aencia de oxgeno, con ayuda de una oxidaaa con cobre. Esta reaccin es reversible. El cido ascrbico interviene en numerosas reaccio nea biolgicas de xido-reduccin. Estos siltemas de cuerpos dienoles dicetonas participan tambin en numerosas modificaciones de productos alimenticios, y se les ha dado el nombre genrico de reductoruu. Hemos visto en el captulo V que el cido ascrbico acta en los fenmenos de oxidacin de la materia grua de la leche. Es probable que intervenga bajo forma dicetnica en las reacciones con loa amino cidos, del gnero de la reaccin de Maillard, originando pimentos oscuros. La vitamina e, o factor antiescorbtico. se obtiene industrialmente por antesiJ y se ha convertido en un medicamento de la teraputica general. El cido ascrbico y el cido dehidroascrbico son los dos iual mente activos, pero el segundo ea ms estable. La apertura del ciclo lactona hace desaparecer la actividad vitamnica.

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Componentes ele actividad biolgica

251

IX FACTORES BIO LOG ICOS DIVERSOS


l. Acldo orttco Es el precunor clave de los nucletidos pirimidnie01; abunda bastan te en la leche de vaca (100 mg/)) y menos en la leche de mujer. Puede suatituir parcialmente a la vi.tamina B 12 La casena cuidadoaamente lavada provoca en la rata una gJaD mortalidad, que desaparece por adicin de cido ortico. No se le considera como una vitamina para el hombre (a pesar de llevar el nombre de vitamina B, ,).

2. Colino Es exigida por loa animales y algunos microoranismos, pero en tal cantidad que se duda incluirla entre las vitaminas. La leche de vaca contiene como trmino medio 120 mg/), de loa que 1/3 es soluble en qua y el reato est ligada a loalpidoa (lecitinas, eafingomielinas). El calostro contiene 6 veces ms. La colina ea termoeatable.
3. /no.ttol

Es un alcohol cclico de 6 grupos OH y se precisa para el buen crecl miento de loa animales. Las necesidades del hombre, si no hay sntea.a en el intestino, son muy elevadas: lg(2.600 caloras. La leche de vaca contiene como trmino medio 110 mg/1, de loa que 3/4 se en-

cuentran Ubres.
4. Pptldoa factores de crecimiento Loa pptldos forman una categora an mal conocida de factores de crecimiento para bacterias muy diversas. Anteriormente se ha visto que no parece que existan polipptldos en la leche a la aallda de la mama. Loa que se encuentran en la leche conservada provienen de una proteoliala limitada de las protenas. Las eetrepto(Jeni~ son sustanelas que favorecen el crecimiento de las bacterias lcticas. Estos pptldoa proceden de la caseina. Loe factores bifidgenos B. son tamb. de natw'aleza peptdica n y existen en la leche humana al lado de loa factoes B 1 de naturaleza glucdica. Estos factores permiten el crecimiento del L4ctobacUlus bifidlu, husped del inteatlno de los nios alimentados con leche materna (cap. XII). 5. Hormontu La leche contiene pocas hormonas. La mama no las produce y por ella se eliminan del 1 al 2% de las hormonas exgenaa. La leche de ciertas especies y en determinados estados de lactacin ea un vehculo para la transmlain de algunas hormonas al animal joven, en el que ejercen su actividad. Esta actividad es probablemente

252

Componentes de

actlvldlld blolgiCI

mayor en la. animal<s que nacen en UD eatlldo de marcroda lnnwdurer.. En la eapecie bovina, el contenido en eatifeDOI ee ~ en la leche y elevwdo en el caiCMbo, hecbo que no .e ha demo.lndo quelmportantA! pera el recin nacido. La hormona que tiene mayor lmportancil en la leche la proeesteroDI . El contenido de la ledle depende de la riquea en materia m... del litado de lactadn y de la proporcin de VIC:U en gettacln del rebll'lo . En la leche de mezcla .e han dlldo valoree que van de 10 a 20 nanocramCM/ml en la leche completa, de 1,6 a 2,6 en la leche desnatada y del orden de 300 en la materia mea. La cantidad de progesterona lnceridll por ICM humanCM CODIUmidoree de leche de VICI ea realmentA! mllY pequea. Tambin ae han loe~lizado en la leche protA!hormoDII, y hormonu peptfdlcu, u como protllil&ndIIIII, pero en nllma proporcin del orden de nano o de piCOIJ"&IDoa/ ml.

Captulo 9 Fsica y fisicoqumica de la leche. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

1 PROPIEDADES FISICAS EN GENERAL

De cada uno de 101 componentes de la leche eetudiados en los anterloret c:aptuloa, 111 ha preciado el eetado f sico en el que se encuentzan y ee han de.crito las modificaciones de que pueden ser objeto, ineiatlendo eepecialmente en las causaa de ineltabllldad. En este captulo no ae volver a tratar del estado globular, ni del coloidal, pero s .e estudiarn las propiedades ms generales, considerando la leche en su col\lunto o en sus partes esenciales. Alww propiedades faicas dependen del total de los componentes : densidad , tensin superficial y calor especfico; otras dependen de las sustancias disueltas: ndice de refraccin y punto de con11elacin; finalmente, bey otras que alo dependen de los iones (pH, conductibWdad ) o de loa electrones (poten. lal Redox). c Lo1 nloreJ ralativoe a la aolucin verdadera pueden considerarte, con cierta aproximacin, como constantes. Lol otroe nloreJ ton ms o menos variables, ya que dependen de las proporciona relativas de sustancias que tienen Influencias diversas eobre las propiedades colllideradu. El fiUa e. un componente de la leche, de tanta lmpo.rtancia como los que bemoa estudiado anteriormente; a pesar de su extrema almplicidad, plantea problemas desde el punto de vilta fWco, y por eUo su lugar 111 encuentra en eete captulo. Por otra parte, puaremos revista a loe efectos de !01 agentes faicos: calor y luz. Por ltimo, estudiaremos un gtUpo de propiedades que habitualmente no se traducen en
opyr orted r1a1er al

254

Flsica y flsicoqumica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

cifras, como son las propiedades organolpticas, es decir, color, olor y sabor.
11 DENSIDAD DE LA LECHE

por estar determinada por dos factores opuestos y variables: l. Concentracin de los elementos disueltos y en suspensin (Sli dos no grasos); la densidad vara proporcionalmente a esta concen tracin. 2. Proporcin de materia grasa; teniendo sta una densidad inferior a 1, la densidad global de la leche vara de manera inversa al conteni do graso. Como consecuencia, la leche desnatada es ms densa que la leche entera. La densidad de las leches individuales ea variable; los valorea medios se encuentran entre 1,080 y 1,038 a la temperatura de 20 C y para la leche de vaca de nuestras zonas. La densidad de la leche de mezcla ea ms significativa; se encuentra prxima a 1,032. La densidad de las leches desnatadas se eleva por encima de 1,035. La adicin de agua a la leche (aguado) disminuye evidentemente su densidad. Una leche a la vez desnatada y aguada puede tener una densidad nor mal; por esta razn, la medida de la densidad no puede revelar el frau de por s sola. La densidad vara tambin con la temperatura; hoy da se detenni na a 20 C. Existen aparatos especiales (termo.tactodensmetros) pa ra esta medicin, as como tablas de correccin para la temperatura. Estos aparatos suelen estar graduados en milsimas de peso especfi co, por encima de 1.000, de 15 a 40 (d = 1.015 a d = 1.040). En la actualidad, la nocin de densidad se sustituye por la de maao uolmica, que no hace referencia al agua; es el cociente de la masa de un determinado volumen de leche a 20 e, por este volumen. Se ha normalizado un aremetro de masa volmica para productos lcteos lquidos. Dada la opacidad de la leche la lectura debe realizarse por la parte superior del menisco. Pese a todo, el mtodo de preferencia al gue siendo el plcnmetro de enrase, cuya precisin ea casi 20 veces superior a la de la areometra. Las condiciones f sicas constituyen un factor importante que afee. ta a la lectura de la densidad. Cuando la temperatura vara en las proximidades del punto de fusin de la materia grasa, la densidad vara no se estabiliza hasta varias horas despus del cambio de temperatu ra, debido a la lenta modificacin del estado fsico, de la materia gra. sa. Pero desde luego existe otra causa, ya que se comprueba el mismo fenmeno en la leche descremada; dicha causa puede encontrarse en
Copynght~

La densidad de la leche de una especie dada no es un valor constante,

matenal

Flslca y llalcoqulmlca.

Electoe ~ los tratamientos tecnolgicos

255

laa variaclone. de la cantidad de agua lipt!a a laa protenu (efecto Recknacel). Ea intere.ante citar aJcn ejemplo: SI UD& muestn de leche 1e divide en doe ~ enftlando UD& por de~o de 15 e y calentando la otra a 4j) e, y llevando lnmediatemente lu dos partes a 15 e, la que primeramente fue calentada y a continuacin enfriada p~ntar una denlidad Interior a la de la otra parte de 0,001 a 0,003. Al cabo de alguna horu, la denlldad volver a aer la mma, como consecuencia de la elevacin de la ma bija. La delllidad de la leche recin ordeada ea ineateble y 1e eleva un poco con el tiempo. El aumento e. del orden de 0,001, pero en este

cuo

debe tembin tener au parte el deaprendlmlento de loe gues

contenidos.
111 EL EXTRACTO SECO Y LAS "CONSTANTES" A) EKtriiCID .ca total (EST) El contenido en extracto aeco de la leche de laa diferente. eapecea de mamCeroa ae sita entre valorea extremoa muy elejadoa: de 100 a 600 efl. La causa de eatu diferencu radica eaenclalmente en el con tenido de materia grua.; si ae la aepara, ae comprueban diferencias mucho menoe lmportantea: de 80 a 170 lfl. La leche de vaca tiene un eracto aeco total medio de 125 a 130 fl. Para dealcnarlo 11! han utilirado diversa expre.lonea: Extracto seco, Residuo aeco y Materia aeca; la primera ea la ma corriente. En eeneral, cuando ee habla de extracto aeco ae aobreentiende el conjunto de auatancu que componen la leche con exclusin del agua. Eeta acepcin no ea vlida ma que cuando el extracto aeco ae calcula por diferencia, tras la determinacin de la cantidad de agua por un mtodo eapecflco. Lo ma corriente ea obtener el extracto eeco por petada del reaiduo, tras de~ecacin a una temperatura lual o Ueramente superior a 100 C. Pero la desecacin no ea un m~todo especfico; el extracto aeco obtenido represente la ruma de laa ruatancias no volW.. en condiciones determinadu. La leche !reiiCa no contiene ma que indicios de sustancias voltilea hacia loll00-105 e; pero en cambio contiene, en proporcin relativamente alta, un producto, la lactoaa, que a eataa temperaturaa comienza a deacomponene, dando auatanclu voltilea; efectivamente, ae obeerva que e.lmpoaible obtener un peao conatante por peaedas sucesivu, hecbu a lntervaloe de 30 minutos, cuando ae prolonga la permanencia en la eatula a toa o al bao mara hirviente; el cabo de 25 daa ea an aenllible la prdi da de peao. En la prictica ae obtiene un e:rtracto seco convencional determinado en condiciones perfectamente detinidu: deaec:acln de 10 mi de leche en una cpsula de material inalterable, de 55 X 25 mm, du

256

Flslca y lisicoqulmlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

rante 7 horas en bao mara hirviente. La desecacin en estufa ordinaria a 100-105 y la desecacin por medio de un radiador de rayos infrarrojos, se emplean igualmente, sobre todo para los productos lcteos menos acuosos que la leche. Se volver a hablar de la determinacin del agua en el apartado XIV. Exlsten frmulas que permiten calcular el contenido en extracto seco conociendo: G, materia grasa por kg de leche y D, demidad a 1 5. Las ms conocidas son:

l. Frmula de Fleischman: ES%0 = 1,2 G + 2 665 D D 2. Frmula de Richmond:

Estas frmulas evitan la determinacin directa del extracto seco de la leche; se han utilizado como base para el establecimiento de bacos y reglas de clculo diversas (discos de Ackermann, etc.). Loe resultados no pueden comiderarse de gran preciain. Bl Extractos secos reducidos. "Conltlln111S" Frecuentemente es til considerar el e:%tracto seco desengra&ado de lo
leche (o extracto seco no graso):

ESD = EST-G Se trata de un valor ms regular que el extracto seco total, por razn de haberse eliminado el componente ms variable. En la industria, las regulaciones y normalizaciones se hacen frecuentemente sobre el ESD. Antes se design como "Constante de Gros" . Este autor observ que en el 95% de los casoa el ESD de la leche de vaca se encontraba comprendido entre 90 y 120 g/1, por lo que un valor inferior a 87 autoriza a sospechar el aguado. Se han propuesto otras "oonstantes" oon el mismo !in basndose en los resultados del anlisis qumioo, en luga de hacerlo sobre el extracto seco, que es difcil de medir con precisio". La ms conocida es la constante moleculor slmpllflcGdD o CMS, de M'lthieu y Ferr, que
CopynghtC'd rnatenal

Flslca y llslcoqulmica.

Efe<:tos de los tratamientos tecnolgicos

257

no hace intervenir ms que la lactosa y los cloruro en equivalente iaotnico: CMS % 1.~ (L + 11,9 NaCI) L lactosa hidratadaflltro NaCI cloruros/litro S volumen de suero proporcionado por litro de leche desnatada (como media 943 mi) La CMS e~t comprendida entre 74 y 79, incluso en laa leches anonnale~. Un valor inferior a 70 pennite afirmar que la leche ha sido aguada.

IV TENSION SUPERFICIAL
La pre.encia de sustanciaa orginicaa en la leche explica el descenso de au tensin euperficial en relacin con la del aua pura. Esta "fuerza de uperflcle" se expresa habitualmente en dlnufcm y dbminuye cuando se eleva la temperatura. Los valores dadoe a continuacin para la leche y ellactosuero. aon medias:
Nmero de 60itU

(5 ml en cuentqotas normal) completa .... 47 - 53 Leche deltllltada.... 52 57 Lact.osuero de cu~ada . 52 55 Agua .............. 76

130
100

La leche el, por lo tanto, un sbtema moderadamente activo (valor relativo respecto al aua : 2/3). Una propiedad intereaante e1 que la dilucin de la leche, huta unas 10 veces, no moditica .ensiblemente la tensin 1uperficial; sta no aumenta bruscarnente ml que tzu gran. de diluciones (1/60). Como se Abe, w sustanciaa tentoactivu forman una pelcula en la superficie de los lquidoa; en la leche eaas sust.t.nciaa se encuentnn a una concentracin muy auperior a la que se nece.lta para formar la capa "aaturada" de superficie. Estas austancias son principalmente, la casena y la sigma-proteosa. Las proiA!fnu del lact.oauero de la cuajada tienen una tensin superfi cial muy prxima a la de la leche, a pesar de la eparacln de la caaena; pero el efecto de la dilucin es mucho m acusado que en el caso de la leche, pues el contenido en proteosa e1 bajo. La materia grasa de~empea escaso papel, porque la leche desnatada tiene una tensin &uperficial poco m elevada que la de la leche

258

Ffsica y flslcoqufmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

completa. Es suficiente un 0,2 %de materia grasa para que el efecto alcance su mximo. Cuando se calienta la leche se produce una evaporacin en la superficie; la casena y la proteosa se concentran, aprisionando la grasa y las materias minerales bajo la !orma de una "capa" o "piel". Esta no est compuesta por las protenas dellactosuero coaguladas, como se crea antes (tampoco es, ni mucho menos, nata!). Si la leche se agita violentamente, se realiza una precipitacin semejante en tomo a las burbujas de aire; como resultado se produce espuma. El calentamiento por encima de 30 C provoca un descenso de la tensin superficial y aumenta la tendencia a la formacin de espuma, ya que la concentracin de las partculas de protenas en tomo a las burbujas es ms activa; de esta manera se forma una pelcula proteica elstica en tomo al aire aprisionado, que le confiere una relativa estabilidad. Por debajo de 20 C se forma una espuma de naturaleza fsica diferente, poco estable. La intensidad de la formacin de espuma es una propiedad variable en las diferentes leches, e igualmente en la leche de una sola vaca en los diferentes ordeos. Hemos visto que la alteracin de la materia grasa (lipolisis) provoca una reduccin de la tensin superficial y una tendencia mayor a la formacin de espuma. Cuando se realiza una emulsin de aceite en leche desnatada dividida, se observa que es la casena fundamentalmente la que forma la capa interfacial aceite/agua. La concentracin interfacial depende ms de la forma de homogeneizacin que de la concentracin en protena de la fase acuosa.
V V ISCOSIDAD
La viscosidad es la resultante del frotamiento de las molculas y se

traduce por la resistencia ms o menos grande de los lquidos a fltr. La viscosidad absoluta, fl, se expresa corrientemente en centipoises (1 poise : 1 dina/cm' ); en los medioa acuosos se utiliza en ocasiones la viacosidad relativa respecto al agua. La viscosidad disminuye con el aumento de la temperatura, lo mismo que la tensin superficial, pero de una forma ms acusada. La viacosidad depende asimismo de la presin; en un lquido newtoniano,la velocidad de flujo es proporcional a la presin; la leche normal se comporta de esta forma pero no ocurre lo mismo con la nata espesada, la leche concentrada, la nata helada, etc., que no son sustancias newtonianas. La viscosidad se mide fcilmente por el tiempo de flujo en un capilar (pipeta de Ostwald) o por el tiempo de cada de una pequea bola en una columna (viscosmetro de Hoppler). Cuando se desea mayor precisin estn indicados los viacosmetros de rotacin y de cilindros coaxiales (tipo Couette o Brookfield). En el captulo XXI y a prop
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Fsica y fslcoqufmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

259

sito de la coagulacin de la leche podremos ver una aplicacin. La leche es mucho ms viscosa que el agua. La causa de este aumento de la viscosidad se debe sobre todo a la materia grasa en estado globular y a las macromolculas proteicas, rrliEmtras que las sustancias disueltas influyen slo en pequea parte. Por Jo tanto, el lactosuero es menos viscoso que la leche desnatada, y sta menos que la leche completa. La solucin de lactosa al 5%, que se parece allactosuero, tiene una viscosidad un poco superior a la del agua. La viscosidad de la leche es la causa de la resistencia a la subida de los glbulos grasos para formar la nata. La viscosidad disminuye con la elevacin de la temperatura; a 20C no es ms que la mitad, y a 40 C el tercio de la que tiene a 0C (cuadro 30). Cuadro 30. Viscosdad de la leche ( centipoies).
Temperatura

Leche completa Loche desnatada 3,2 2,8 2,2 1,65 3,9 2,5 1 ,9 1,35 0,6

Solucin de Agua lactosa al S% 1,8 1,5 1,2 0,9 0,4 1,53 1,30 1,006 0,80 0,55

S
10 20 30 50

Otro parmetro importante lo constituye el pH del medio. La viscosidad de la leche aumenta cuando el pH desciende por debllio de 6,0. Ellactosuero se comporta de manera diferente, pues en l se produoen pocos cambios por debajo de pH 6,0; por el contrario,la viscosidad aumenta cuando el pH se eleva hasta 12,0. Toda modificacin o alteracin que acte sobre la grasa o las protenas tendr un efecto sobre la viscosidad : l. La homogeneizacin eleva la viscosidad de la leche; el factor de multiplicacin est comprendido entre 1,2 y 1,4. 2. Se han descrito varios prooedimientos para el tratamiento trmico de la nata mediante calentamiento seguido de enfriamiento, que permiten obtenerla ms viscosa, cualidad importante desde el punto de vista comercial. 3. Al principio de la accin del cuajo sobre la leche, la viscosidad disminuye antes de elevarse muy bruscamente en el momento de la coagulacin. 4. Los factores que producen variaciones en el estado de hidratacin de las protenas son tambin causa de cambios en la viscosidad. Estos factores se examinan ms adelante.
Copynqhled malenal

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Flsica y tisicoqulmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

La contaminacin con ciertos microbios aumenta la viscosidad de

la leche, especialmente por los estreptococos lcticos de la llamada "leche fiJante" (cap. XII) . VI CALOR ESPECIFICO Es un valor cuyo conocimiento tiene gran importancia para laindustria lctea. El de la leche es un poco ms bajo que el del agua; los valorea encontrados corresponden a los que se pueden calcular de acuerdo con la composicin de la leche y tomando como valores el nmero de caloras por grado y gramo: agua: 1 grasas: 0,5 lactosa: 0,3 cenizas: 0,7 protenas: 0,5 Es preciso tener en cuenta que la grasa funde hacia Jos 20-25 C, y a este valor es necesario aadir el calor latente de fwin al calentar la leche. El cuadro 31 muestra que el calor especfico de la leche completa o descremada vara poco de O a 100 C: por el contrario, el de la nata vara mucho. A las temperaturas de pasterizacin, la nata se calienta y se enfra ms rpidamente que la leche. El calor especfico de los productos desecados y desnatados (leche en polvo desnatada, suero en polvo) es prximo a 0,3. VIl CONSTANTES FISICAS RELATIVAS A LA SOLUCION

Al Punto de congelacin
La leche se congela por debajo de

o; porque las sustancias disueltas

rebajan el punto de congelacin de los disolventes puros (crioscopia).

Cuadro 31. Calor especfico a diferentes temperaturas (1 ).

o
Leche entera Leche desnatada Nata con 30% de
materia pasa

1s 0,94 0,945 0,98

40 0,93 0,95 0,85 0,72 0,56 0,974

60 0,92 0,96 0,86 0,74 0,58 0,97

0,92 0,94 0,67 0,56 O,SI 0,98

Nata con 60% de materia ansa Mantequilla Lactosuero

1,os 0,53 0,976

(1) Segn Eckles, Combs y Macy (Ung. 1956).

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Flsica y llslcoqulmlca. Efec1os de los tratamientos tecnolgicos

261

La frmula liufente relaciona el detce1110 A con la concentracin molecular de lu auatanclu d.IJueltu en una aoluctn acuou (P: peso de lu lllltanciu dilueltu en a/1; M: peao moleculu medio);
p

6 - 1,8 5 -

El punto de conaelacln de la leche ftra muy poco; esde-(1,555 eate valor es el miamo que el del auero sanguneo. Ea una de las c:aracterit.icu m conatantes de la leche y su determinacin ae utillu para revelar el (mude, ain embazo se han sealado variaciones normales entre 0 ,530 y 0,575; esta diferencia de 0 ,045 ae explica por laa vvlaclonet est.cionales (el descenso es mayor en loa me- fros) y la iDOuencla del contenido en sales de la racin. El ICUI eleva, evidentemente, el punto de congelacin hacia oc. Para medirlo ae utWu un bailo refrigerante (hielo + ul) y uo termmetro de una precl6n de una cent.ima de ll!'ado. Un valor igual o Inferior a -(1,53 C, en valor abeoluto, permite aospecbar una .rocin de 11\11 ExiJten inatrument.ol muy preciaoa, tipo Olmmelro, que permiten apreciar la mlltlma de grado. Esta medicin ae aplica Lambln a la leche desnatada, ya que el desnatado no cambia el punto de conelacin. Por el contrario,la alteracin por fermentacin lktlca y la adicin de uleaaolublea rebajan dicho punto. Una mol6cula de lacto.a da 4 molculu de cido lctico; una leche aullclentemente 'clda para c~ar en el cuno del calentamiento huta ebullicin, ae congela a -{) L58 C. Se puede realizar una correccin aproximada restando O,005 C de la temperatura leda por cada grado de acidez Dorn.lc (ver mis adelante) por encima de 16. Para el blcromato potalco, utllizado corrientemente como conservador de lu muestras, es necesario reatar O,Olac por gramo en un litro. Sobre el punto crioaoploo tienen lnfiuencla dlvenoe tratamientos lnduatrialea. El tratamiento ~rmlco de puterlzacin de tipo clsico o de tipo UHT,Io mlamo que el tratamiento en vaco, con el fm de desodorizar la leche, reduoen el desoenao crioeoplco y el punto de congelacin se eleva (ae aproxima un poco a oC), lo miamo que ocurre con el auldo. La cauaa ae debe, en el caso del calentamiento, a una modi.ticacin de loa equllibrioa ullnoa y a la hidratacin de 1u protenu, y en el caso del tntam.lento al vaco, a la aeparacin del gas carbnico. A e.to hay que aldlr que a difcil apreciar un ligero "aguado tecnol6gico" (una elencin del punto de conaeJacin de 0,005"C ee equivalente a un ICUido de al.rededor dellt)Eataa ot.ervaclonea tleuan una 1f111 Importancia prctica en los paiaes en donde a oficial la determinacin del punto aiosopico. Por ejemplo, en loe Eatadoe Un.ldoe de Amrica, ae comidem que la leche cruda est ecuada cuando el punto de congelacin ae encuentra
para la leche de vaca, y

Fsica y tisicoqumica. 262

Electos de los tratamientos tecnolgicos

por encima de -o,ssoc, y se admite que el tratamiento al vaco lo eleva en aproximadamente o,ooac. El punto de congelacin de la leche de otraa especie& puede ser muy diferente del que se acaba de considerar. Para laa leches de cabra y oveja se toma como media -o,saoc.

Bl Punto de ebullicin
Por la misma causa que en el caao anterior,la leche hierve por encima de los 100 e, entre 100,17 y 100,15C. Pero en el cuno del calentamiento se producen cambios enel equilibrio de loe estados: Iones "" molculas .,. micelas que infiuyen en el resultado. Este valor no se determina en la prctica. C) Conductividad elctrica Como se sabe, el agua ofrece una resistencia sonelderable al paso de la corriente elctrica; su conductividad especfica es pequea : 0,5 X X 10 6 mho (inversa del ohm/cm). La presencia de electrolitos minerales en la leche (cloruros, fosfatos y citratos), principalmente, y de iones coloidales, secundariamente, disminuyen la resistencia al paso de la corriente. La conductividad de la leche vara con la temperatura; normalmente se determina a 25. Sus valores medios se sitan entre 40 X lo- y 50 X 10 . El aguado de la leche rebaja la conductividad, y su alteracin por acidificacin la eleva; las leches patolgicaa muestran frecuentemente una conductividad superior a 50 X lo- por razn de su alto contenido en cloruros. Existe una correlacin positiva entre el recuento de clulas somticas y la conductividad, pero tan slo cuando el nmero de leucocitos rebasa Jos 500.000/ml. Los agentes antispticos y los conservadores alcalinos elevan igualmente la conductividad. Se ha propuesto la medicin de la conductividad para la investigacin del aguado o para descubrir las leches mamticas; el mtodo parece que ha sido abandonado. Sin embargo, est prevista en la reglamentacin suiza, que prohibe la venta de la leche con una conductividad superior a 60 x lo- a 25c. Al estudiar la leche producida por cada cuarto de la mama, se ha observado que cuanto ms abundante es la produccin, ms dbil es la conductividad.

VIII pH Y ACIDEZ DE LA LECHE


La figura 49 muestra las zonas de disociacin de los principales com-

ponentes ionizables que se encuentran en la leche, en relacin con tres valores caractersticos: pH normal de la leche, pH de valoracin
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Ffsica y lisicoqufmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

263

en presencia de fenolftalena y pH de precipitacin de la casena. Betos datos ayudarn a comprender los conceptos siguientes.
A) pH de la leche Las diferentes leches tienen una reaccin inica cercana a la neutralidad. La leche de vaca tiene una relacin dbilmente cida, con un pH

comprendido entre 6,6 y 6,8, como consecuencia de la presencia de casena y de los aniones fosfrico y ctrico, principalmente.

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BASES

Figura 49. Escala de disociacin de lOS cidos y de las bases que pueden Intervenir en la leche con indicacin del valor del pK (pH en torno al cual se manifiesta el efecto tampn).

Copyrighted rPatorial

264

Flslca y flsfcoqulmica. Electos de los tratamientos tecnolgicos

ciclos orgnicos

...--,-:--------1Acldot orgnlc:os 1---t- ------- -+- --t


M~otetiu

mineraJes

(Fosfatos.

CO,. eu:.)

1--_, --------+--.,
C.selno

----- - Over n,.tn

-------LECHE FRESCA LECHE CIDA

Foguro 50. Acidez de valoracin.

Ffsfca y flsfcoqufmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

265

El pH no es un valor constante, sino que puede variar en el CW'IO


del ciclo de la lactacin y bajo la influencia de la alimentacin. Con todo, la ampltud de las variaciones es pequea dentro de una misma etpecie. En lo que ae refiere a la led\e de vaca, deben considerarse como ano~ loa valores de pH inferiores a 6,6 o auperlores a 6,9. El caloltro de vaca tiene un pH ma bajo a caUJa de au elevado conte nido en protenu. El pH de la leche cambia de una especie a otra, dadaa laa diferen ciaa de au composicin qumica, especialmente en caaefna y fodatos. El pH medio de la leche de oveja (rica en caaena) es 6,6; la leche hu mana et neutra o ligeramente alcalina, variando au pH de 7 a 7 ,5. El pH repreaenta la acidez actual de la leche; de l dependen pro piedades l4n importantes oomo la estabilidad de la caaena.

B1ACidez de la leche Lo que habitualmente ae oonoce como acidez de la leche ea el resulta do de una valoracin; ae aade a la leche el volumen neceaario de so lucin alcalina valorada para alcanzar el punto de viraje de un indica dor, 1eneralmente la fenolftalena, que vira del incoloro al rosa hacia pH 8,4. Se trata de un nivel arbitrario. En la aerie de Clark y Lubs se encuentn.n lndicedoret cuyo vinje ae acerca ma al pH de la leche, .obre todo el prpura de bromocreaol; pero el punto de vinlje de estoa lndicadoret bi o triooloret es menos claro que el de la fenolftalena. La acidez de valoracin es la suma de cuatro reaccionea, como ae muestra eaquemticamente en la figura 50. Lila trea primeras repre sentan la acidez "natural" de la leche, que equivale como trmino medio a 18 c.c. de aolucln normal (N/1) por litro de leche.
l . Acidez debida a la caaena; alrededor de 2/5 de la acidez natu ral. 2. Acidez debida a laa tultanciaa mineralea y a loe indicloa de cidoe or~nlooa; igualmente una. 2/ 5 de la acidet natural. 3. Reacciones ~eCUDdarias debidas a loa toaratoa; .obre 1/ 5 de la acidez natural. &tu reacciones ae han designado con el trmino "over ru.n". 4 . Acidez "duarrolliJda ", debida al cido lctico y a otroa cidos procedentes de la degradacin microbiana de la lactoaa, y eventual mente de loelpidoe, en laalechea en vaa de alteracin. La fiiUrB 49 muestra loa componentes de la leche que intervienen en la valoracin, entre el pH normal de la leche y el punto de viraje de la fenotrtalena. Estas auatanciaa, cidos o baae1 dbllea, son tampone de pH; alrededor del punto de aemineutrallucfn, que corres pondo al valor pK, eataa auetanciaa frenan laa variaciones del pH. In

266

Flllca y llalcoqulmlca. Efectos de loe tratunlentos tecnolgicos

tervienen principalmente la caena, por -IJ'\Ipoe &tete. folfri.coa, y el cido loelrico por 111 funcin teelllldarla; en MJUDdo lupr intervienen : el cido ctrico, que casi neuvallu a pH 6,6, el cido carbnico (bicarbonato) y loa grupoe amirwloe Ubne. De hecho, la valoracin acittimtrica de la leche fre.ca ea una medida Indirecta de 111 rlquuo en ct~~ellll y (ol/atoa. La acidez del&lTOIIada por la fermentacin lic:tica hace ~el pH,

entre 4 y 6. A ette nivel, todoe loa cidoe ornlcoe preeentet intervienen en la valoracin.

IX MEDICION DEL pH Y DE LA ACIDEZ A) Mtdlcln del pH


ci.u; el lllatema de electrodos ms generalmente utllludo est formado por el par: - electrodo de referencia de calomelanoe con cloruro potaico atundo - electrodo de vidrio. ExlaUn dlveno. modeloe de electlodoe, aeparadoa o combinados en un slo Instrumento; desde pequeu unidades para mediciones en un centmetro cbico, basta electrodoe inclu(doa en un tubo metlico que se Introduce en bidones, cubas, etc. Hay pH-metroe e.peciales para la aeleccln de las leches en loa muelles de recepcin de las fbriLa regulacin de estos aparato se hace con soluciones tampn de pH conocido; para la leche y sus derivado te emplea el tampn de fosfato M/16 de pH 7 ,O para la zona neutra, y el tampn de ftalato cido de potasio M/20 de pH 4,0 para la zona cida. La determinacin del pH en la induttrla plantea problemas especialea. Por ejemplo, la medicin rpida del pH de loa tuml.nlatroe de leche en bidones, al ritmo de recepcin en la fbrica, pJtaenta dificultades, sobre todo en ~o. & frecuente que encuentren en la superficie partoulaa de materia &JUa. a can de la qitacin durante el tranaporte, que en ocasiones forman una capa oleola que sobrenada. La IRA forma sobre loa electrodo. una pelcula que loe aala del medio Ionizado, y el aparato no da reapiWtt. En eataa clrcunRancias ea preclao lavar loa electrodos con una solucin deteflente. &Ita manipulacin constituye un obltculo para la buena marcha de la recepcin de la leche.

l. La medicin potenciomtrica con el "pH-metro" ea la nica pre-

cas.

2. La modlcln colorimtrica ea mucho ma rpida , limpie y menos coatota, pero sus Indicaciones son solamente aproxlmadu. Se emplean para la seleccin de leches Indicadores coloreados que viran

Flslca y fislcoqulmlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

267

en la zona conveniente: para la leche se emplean los trea colorantes del cuadro 32. La medicin se realiza por medio de papel indicador, o mediante una solucin de colorante aiiadida a la leche.

CUadro 32. Determinacin calorimtrica del pH de


pH 6,6 6,8 (leche normal) grlszul

mleche
p86,9 y por encima (leche alcalina)

Colores por reflexl6n Indicadores de pH pH 6,4 y por debajo (leche ic.)


gris, luego
amar.~verd.

rr..,.

Papura de bromoc:resol: (sol. acuosa 0,2%)

azul,
Jueso violeta

Azul de bromotimol: (sol. O,S% en aloohol de 60) amarillo Alizarln$ulfonato de aoctio: (sol. saturada en alcohol de 68) rosado, luego pudomar.

verd .... marillento

verde-e.z. l u

lila

rojo obscuro violeta

B) Medici6n de la ecidu Existen diferentes medios de expresin, especialmente los siguientes: 1. El "grado Domlc" \D), empleado siempre en Francia y tam bin en Eepaa, expresa el contenido en cido lctico. La acidez Dor nlc es el nmero de dcimas de mililitros de sosa N/9 utilizada para valorar 10 mi de leche en presencia de fenolftalena (N/9 porque el cido lctico tiene un peso molecular de 90). Es evidente que:
1 D .., 1 mg de cido lctico en 10 mi de leche, o sea 0,1 gjlitro, o 0,01 %de cido lctico 2. La expresin en gramos de cido lctico por litro o por kiJogra. mo tiende a imponerse. Si se utiliza sosa N/9 ( 0,111 N) con 10 mi de leche, el volumen de reactivo en mi da directamente el resultado
CopynghtC'd rnalenal

268
Fig ura 51. Electrodos para la determinacin del pH en la industria.

a)

PoqvoAa sonda manual de

pollciOruro ele vlnllo, tacil de limpiar, acleeullda para medlclonu corrientes en 16bri ca, en todos los medios, ele o a 50'C. Montada en un flota dor. permita efectuar eleter

b) Sot>da fUpeclaJ para el control d lreclo del pH en los bi

dones de leche, con cadencia rapida, en el andn de .... capcin.

mlnaclones, en un punto fi jado de un liquido, a nivel variable.

e) Sonda prosurlzab/o, estarillzablo al vapor directo, desti nada a determinaciones en los medios lermentosclbiea. Aplicable e las nuevas t6cnicas de extracciOn continua de

la caselna por acidificacin provocada. (Produccin de W. lngold)

pyr t te'<' !""ate r di

Flslca y flslcoqulmlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

269

(que de hecho ea el 1/10 de la acidez Domic); si ae utiliza sosa N/10, hay que multiplicar el volumen por 0,9. 8. El "grado Soxhlet-Henkel" (S.H.), no tiene el i.do lctico como referencia. Equivale a 1 mi de sosa N/4 utilizado para valorar 100 mi de leche (la valoracin se hace habitualmente sobre 50 mi); se comprueba que: l 0 SH = 2,26Domic. Este concepto es ms lgico

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pH

9
pH 6.3 acidez 22 pH 6.7 acidez 22 pH 6.7 acidez 18 pH 6,7 acidez 14 pH 7.2 acidez 14

Rgura 52. Significado del pH y de la acidez. f) leche en vras de alteracin. con acidez desarrollada: 2) Leche rica, sin acidez desarrollada: 3) Leche de tipo medio, sin acidez desarrollada: 4) Le<:he pobre. si n acldez desarrollada: 5) Lecha alcalina (mamitis):

Copynqhted matenal

270

Ffsica y fislcoqufmlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

que el precedente porque la leche fresca no contiene cido lctico. La medicin de la acidez parece muy fcil, pero tambin puede adolecer de cierta imprecisin, por razn de varias cawras de error debidas a la opacidad de la leche: a) la cantidad de indicador influye mucho se puede comprobar una diferencia de an (0,8 mi de NaOH N/9) empleando una gota solamente (19.D) o 10 gotas (16.D) de solucin de indicador. Es preciso utilizar siempre la misma cantidad 0,1 mi de solucin de fenolftalena al 1% en alcohol de 95 G.L., en general 4 gotas. b)el punto final de la valoracin no es claro, porque depende de la agudeza visual del operador; se recomienda hacer una comparacin de tanteo con leche no valorada o con un mismo volumen de leche adicionada de cierta cantidad de solucin coloreada estndar: fucslna, sulfato de oobalto, etctera. e) La coloracin rosa desaparece progresivamente
X SIGNIFICADO COMPARADO DEL pH

Y DE LA ACIDEZ VALORADA

Por lo que hemos visto anteriormente, los valores de pH representan un estado, y son ms significativos que los valores de la acidez, especialmente en lo que a la estabilidad de la leche se refiere, porque estos ltimos son el resultado de varias reacciones que han modificado el estado original. Diferentes muestras de leche pueden tener el mismo pH y por tan to presentar la misma estabilidad frente a los tratamientos industriales dentro del mismo estado de "frescura" y, sin embargo, mostrar acideces sensiblemente diferentes. Inversamente, leches con la misma acidez pueden tener diferente pH. La figura 52 ilustra estos hechos; en una planta de esterilizacin o de concentracin, que realizase una seleccin rigurosa basndose en la acidez, se habran liminado las leches nm. 1 y nm. 2; para la primera sera lgico, ya que realmente est acidificada, pero en el caso de la segunda constituira un error, porque se trata de una leche de alto contenido en extracto seco. Adems, por el hecho de ser una leche fuertemente tamponada, su pH variar menos rpidamente que el de las leches nm. 3 o nm. 4 blljo la influencia del cido lctico de fermentacin. Es sabido que las leches de fuerte acidez natural se conservan ms tiempo que las leches de la misma calidad higinica, pero de dbil acidez natural. Los datos reunidos en el cuadro 33 muestran que los valores del pH y la acidez de valoracin no estn ligados estrachamente entre s. Puede presentarse una discrepancia completa; por ejemplo, en el caso del suero de quesera (en el corte de la culljada),la acidez es escaCopynghled matenal

Fislca y flslcoquimlca. Electos de los tratamientos tecnolgicos

271

ea, mlentru que el pH ea poco derente del de la cuajada y de la leche de que procede el suero. Loa valorea de la acidez de la leche comprendida entre 15 y 22 D no dan Indicaciones aeguru sobre su estado flalcoqunlco. El valor lntereante, aparte del pH, eera el de la acidez deearrollada; pero no exiate una tcnica de determinacin rpida y precisa del cido lctico que pueda 1uattuir o completar la valoracin acidimtrica. En la prctica, lo m corriente ea contentarse con la ltima, salvo cuando la medicin del pH es Inevitable (esterilizacin, mantequilla de almscenamiento, queso fundido, etc.).

XI POTENCIAL DE OXIDO-RE DUCC ION


Al Propiedadll xido-reductoras de la leche La leche fretca normal tiene un potencial "redox" (Eh) positivo comprenddo entre + 0,20 y + 0,30 vol t. Su determinacin se realiza de una manera parecida ala del pH; la derencia de potencial creada por un electrodo de platino colocado en una solucin se mide con referencia a un electrodo de calomelanos tomado como patrn. Un valor positivo (~rdda de electrones por el platino) indica las propiedades oxidantes de la aolucin; un valor ne;ativo (pnancia de electrones) Indica las propiedades reductoras. En las propiedades xido-reductoras de la leche Intervienen los factores aluientea: l. El oxgeno disuelto ea responsable, en aran parte, del Eh positivo de la leche fresca cruda; desairendola mediante burblijeo de nitrgeno, el valor de Eh baja rpidamente a + 0,05 V. 2. La leche contiene un sistema reductor natural, formado por la xantlna oxidua o reductasa aldehdca, que no se manifiesta en las condiciones de aeroblosia, en ausencia de un auatrato conveniente; 1e la pone de manifieato en atmsfera Inerte, mediante la determinacin del Eh, o en presencia de un aceptar de hidr6geno, de preferencia un aldehdo, por reduccin del azul de metlleno, que 1e decolora. Se deatruye durante el calentamiento hacia so. En la leche hervida el Eh no vara prcticamente en funcin del tiempo, como se muestra en la flura 53. 3. A temperaturas m. elevadas, en la zona de esterilizacin, aparece un nuevo Wtema reductor. El descenso del Eh ea paralelo al aumento del sabor a cocido, del que ya hablamos al tratar de las protenas del lactosuero, porque estos fenmenos aon consecuencia de su desnaturalizacin, con aparicin de sulfuros. La activacin de los grupos - SH no explica por completo la actividad antioxidante de la leche calentada, que se puede poner en eviden.
11

272

Fsica y lisicoqulmlca. Electos de los tratamientos tecnolgicos

cia, por ejemplo, frente a los cidos grasos poliinsaturados, cuya oxidacin se frena. Algunos ndices hacen pensar que la casena tambin interviene en esta propiedad, por determinadas razones que permanecen an oscuras. 4. Varios componentes de la leche influyen en los cambios del potencial redox. Algunos tienen un papel comparable a los tampones de pH; por ejemplo, el cido ascrbico, con su estructura de reductona, en el equilibrio siguiente, cuyo potencial normal es+ 0,06 V (a pH 7).
- C C-.,t-C-C+2H 1 1 n n
OH OH O O

CUadro 38. Valores del pH y de la acidez.


Acidez ( ) pH 6,6 6,8 Dornle (D) Leche fresca normal de vaca 16- 19 Leches de tipo "alcalino"; leches patolgicas (leches de mamitis), leches del final de lactacin, alunaa 15 y menos loches de retencin, leches fuerteS . H. 7-8,5

6 ,9 y ms

6,5 y

menos
8,5 - JO

mente "aguadas ..
6,5 - 6,6 6,4 6,35
6,3

6,25 6,1 5,2

Leches ligeramente leidas: leches del principio de lactacin, calostro , leches transportadas en masa Leche que no soporta la esterilizaci6na llO"e Leche concentrada al 20% ESO Leche ~ue no soporta la coccin 100 e Leche concentrada al 30% ESO Leche que no soporta la pasterizacin a 72 e

19-20

unos 20 unos 21 unos 22 unos 22 unos24 y ms

( 0)

Leche que comienza a flocular a temperatura ordinaria 6,5 Lactosuero fresco de que!era 4,5 Cultivo de estreptococos lcticos, al mximo 3 ,9 Cultivo de lactobacilos lcticos, al mximo Orden creciente.

SS- 60
9 - 13 120 250

25-27 5-6 54 90

Copy nghtC'd m aten al

Fsica y fisicoquimica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

273

Las variaciones estacionales en el valor Eh de la leche deben atriburse, en parte, al contenido en cido aacrbico. En invierno, este contenido es bajo y el Eh elevado. La riboflavina, la cistina y proba blemente la lactosa, forman otros sistemas. La oxidacin impca la destruccin de estos sistemas y la formacin de productos con potenciales ms altos; como consecuencia se eleva el Eh.
5. El cobre ionizado es un activo aceptor de electrones; cuando contamina la leche, tiende a elevar el Eh. Es un agente de oxidacin, como se ha indicado al tratar de la materia grasa. La fase inicial es la destruccin del cido ascrbico. Todo aquello que reduce la ionizacin del cobre y tambin del hierro, por ejemplo, por formacin de un complejo, retarda la oxidacin del cido ascrbico y los otros fe. nmenos de oxidacin. 6. Las bacterias que proliferan en la leche tienen una actividad n! ductora, como consecuencia de dos fenmenos: a) desaparicin del oxgeno disuelto, a causa de la respiracin que provoca un descenso del Eh favorable al sistema reductor natural de la leche; b) produccin de un sistema reductor propio de las bacterias.

' O. Li=:-::------__;;.;.;. . .;,_hervida ___ ;;_.....;_


~eche

0,1

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Formol

-........, ''er,e - ............. ....... sea

Lec..

.o.1

---2h.

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o
.0,1

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1h
TIEMPO

Figure 53. Variacin del potencial redox en la lecha.

Copynghted r- atonal

274

Ffsica y fisicoqulmica. Efectos de los tratamientos tecnolglcoa

La actividad reductora depende del nmero de bacterias y tambin de las especies presentes. Algunas son muy activas, como las colifor mes (EscherlchiiJ co/1, Aerobacter). Otlaa intluyen poco en el poten cial redox, como las bacterias termorreaistentes y las esporuladas (fio ra de las leches calentadas). 7. El pH influye en el Eh; frecuentemente, las sustancias reductoras existen en estado de aniones que pueden aceptar H' y de esta manera no contribuir mucho al valor de Eh. Cuando el pH cambia, se debe corregir el valor de Eh. En la leche cuyo pH es prximo a 7 ,O no se hacen correcciones. 8. Los leucocitos tie.n en una dbil accin reductora en la leche normal.

B) Medicin del potencial redox . Pruebes de reduccin El potencial redox slo se determina en loa laboratorios de investiga cin; ea una operacin bastante delicada, que precisa eliminar la in fluencia del oxgeno del aire. Las lecturas son difciles de corregir en funcin del pH cuando ste vara, porque se carece de datos sobre loa sistemas existentes en la leche. Sin embargo, estas determinaciones tienen un gran inters, dada la importancia de los fenmenos a los cuales estn ligadas; principalmente, la contaminacin bacteriana y la formacin de los sabores a oxidado y del "gusto a cocido". En la prctica, se determina el nivel de potencial redox mediante indicadores coloreados q ue cambian de color o se decoloran en una determinada zona del Eh, caracterizada por el valor E'o (potencial en que la mitad del colorante se encuentra en forma reducida). El azul de metileno (E'o + 0,05 V) se utiliza con frecuencia para determinar la calidad bacteriolgica de la leche en la prueba de la "Reducta110". En las leches fuertemente contaminadas, el descenso del Eh es rpido (figura 53), al igual que la decoloracin del Indica dor que se ha aadido (aplicacin captulo XVlll). La resazurina es otro indicador que se reduce entre + 0,18 y + 0,09 V, o sea, antes que el azul de metileno; es m. sensible a los factores no microbianos, por ejemplo, a la presencia de clulas (leucocito&). Tambin es indicador de pH. La forma oxidada ea azul en la leche normal y roja a pH 5,3. La forma reducida, resoruflna, es rosa a pH 6,6 y amarilla a pH 4,8. Existe una tercera forma, la dlhidro resorufina, ms reducida e incolora. Estas pruebas miden sobre todo la actividad de las deshldrogenasas, principalmente de las flavoenzimas que transfieren el hidrgeno del sustrato al colorante aceptor, con Intervencin del agua. Otras pruebas de reduccin pueden tener Inters para la apreciacin indirecta de la calidad bacteriolgica de la leche, en forma de pruebas econmicas y simples, especialmente la reduccin de los ni tratos a nitritos.
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Flslca y flslcoqulmlca.
EfectO$ de los tratamientos tecnolgicos

275

.me

Cl Conwnldo 1n oxgiNlO La medicin del contenido en oxgeno de la leche forma parte de la

de nuevo. mtodos de apreciacin de la "'lidad higinica de la m!Jma. No te tlata de una pruebe. ample, aino de mediciones que pueden ser realizada en grandes series, y ain reactivot. Se pueden utilizar divenoa anali:radores polarogrficoa de electrodos metlicos, protegidos de la contaminacin por la lec.lle mediante una membrana permeable a loa gases. Se determina el porcentaje de saturacin de oxgeno de la leche satlllllda por el aire, tras diferentes tiempos de conservacin a 25 C. De esta forma ae tiene una medida del consumo de oxgeno en las cadenas respiratorias de las bacterias. La correlacin con loa resultados obtenidos por reduccin de Jos colorantes en las leches de calidad mediocre ea buena. Por el contrario, esta determinacin no permite clasificar las leches de calidad bastante buena o simplemente buena.

XII PROPIEDADES OPTICAS

A) Tl'lf'llmisin de la luz La leche no preaenta una absorcin caracterstica en la parte del espectro que correaponde a la luz vi&ible, ea decir para longitudes de onda entre 400 y 700 nm; es un lquido no coloreado; loa pigmentos que contiene se encuentlan a concentracin demasiado baja para poder intervenir. Por el contrario, la leche contiene auatanciaa orgnicas que son la causa de bandas de absorcin caractersticas por debajo de 800 nm (zona ultravioleta) y por encima de loa 750 nm (zona infraroja). El cuadro 34 indica longitudes de onda para el mximo de abaorcin, de. ciertos grupos o estructuras qumicas. Loa fotmetros permiten medir la absorcin en tanto por ciento de tlanam!Jin o en densidad ptica. Segn la ley de Beer y Lambert, la denaidad ptica es proporcional al espesor atravesado y a la concentlacin de la auatancia considerada en la solucin. Ea el principio de los mtodos rpidos de dosificacin que hemos mencionado en los captulos aniA!rlores. Ea neoeaario IA!ner en cuenta la diapenin de la luz, puesto que la leche contiene partculas, y por ser variable la dlmenaln de stas, la prdida de energa luminosa, que ae aade a la energa absorbida, tambin ea variable. El efecto ae reduce cuando la longitud de onda de loa rayos luminosos ea muY superior al dimetro de- las partculas: micelaa de cue{na hasta 800 nm; glbulos graaoa, hasta 10.000 nm. Se puede tambin dlaminuir y uniformar el dimetro de loa glbulos grasos por homogeneizacin bajo presin: por eaiAI procedimiento el dimetro medio se reduce a menos de 2.000 nm. Pero tambin ae
opyr orted r1a11lr al

276

Fisica y lislcoquimlca. Electos de los tratamientos tecnolgicos

Cuadro 34. Abwrcin de laa radiaciones.


Lonaitud de onda (nm) Cau de la "-Jlm EDlace pept!dlco (- CONH-) Emuctura cclica (amlnocl dos aromticos) Grupo carbonllo de los slic6 rldos ( - CO-) AgUa (2) EDiaoe peptdico Grupo hidroxilo (-OH-) Componenteo de lalecbe (1) ProteiDu Protenas Materia grasa

200 280 3.450 y S .800 6.300 6.500 9.600

ProteDII Lactoa

(1) Con influencia dominante.

(2) En el campo de los componentes de la leche.

puede "transparentlzar" la leche, como se ha indicado en el captulo anterior. B) Color. Turbidez La leche es un lquido opalescente que parece blanco si el espesor es suficiente. Este aspecto caracterstico resulta principalmente de la dispersin de la luz por las micelas de foafocaaeinato de calcio. Los glbulos grasos dispersan igualmente la luz, pero intervienen poco en la opalesoencia blanca, porque su dimensin es muy superior a la longitud de onda media de la luz solar. La leche sirve frecuentemente de punto de comparacin, y as se habla de "aspecto lcteo", de lquido
'1echoso", etc.
La leche contiene dos pigmentos principales:

a) El caroteno, colorante amarillo, que existe bajo varias formas (captulo V). Colorea la fase grasa. La leche completa rica en nata presenta una ligera coloracin cuando loa forrllies contienen una cantidad collllderable de caroteno, como ocurre con la hierba verde, so bre todo en primavera; la mantequilla fabricada a partir de esta leche es francamente amarilla. La ausencia de este pigmento en la leche desnatada la hace aparecer de un tono blanco-azulado. b) La riboflavina es un pigmento amarilloverdoso fluorescente, que no se pone de manifiesto ma que en ellactosuero. El aspecto caracterstico de la leche, que se ha descrito anteriormente, es el de la leche perfecta, en la que casi toda la casena ae encuentra bl\jo forma micelar. Cuando disminuye la proporcin de casena de esta forma, el lquido toma un aspecto ms grisceo, ms
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Flslca y ll1looqulmlca. Electos de loe tratamientos tecnolgicos

277

o menot tranlldd.o ; ea el cuo eapedal del c:aloetro del primer da, ! como el de la lec:he de fuerte retencin y da aJcunu lecha pato-

En la lac:he pueden o~ coloradonet aoddenta!M, talea como la colo~n rota debida ala peeenc:la de ncre. y ouu diveuu debldu ala contaminacin de microorpnilmot. r.to. CMotton C8da
Ye&lDlVOI.

lslcN.

C) R.tt-16n
La refraccin una propiedad aditiva; el aumento del ndice de re frac:d6n en la lac:he la 8UIIIIl de lo aumentot debido a cada compo'nente. La contribudn de las lalet ea deepreolable, y la materia grua que ae encuentra fuera de la fue continua, no Interviene.
Alunot aparatol 10lamente pueden empleane con un Jquido lm pido, por lo que ee predaa la preperadn da auero . La pua y la caaena ae eliminan con ic:ido actico o cloruro dldco, calentmdo hacia 80100 c. En aJcuno- pe.. ae ba fijado un valo r mnimo reglamentario para el ndice de refracc:l n delauero cloromercrico. Anteriormente conalderabe que el ndice de refraccl6n del auero era relatl-nte coDitante. El refradmetro tipo Zelll delnmenin, pdwdo conwndonaltre~te, da valore. de 38 a 40 para el auero de la leche puza, Jo que con811ponde a loe ndlcea 1,84199 y 1,34275 a 20 C; loa valore. Inferiores a 38 hacen -pechar el acuado de la leche. En realidad, ae trata de una aeudoconatente, cuyu variaciones naturalea 10n m lntenau que lo que ante. ae ere fa para 1u lec:bea indlvidualea. Como de hecho ae trata de la valoracin Indirecta de la lactoaa, no ae puede aplicar este mtodo a 1u lechal en proce10 de acldltlcad6n. Actualmente exlaten en el mercado refraot6metro1 dlferendales de alta predlln; au empleo ae ba propue1to para el control del exkacto aec:o deaenruado de la leclle concentrada, por medicin cfuec:ta 10 bre la lecbe. La prec:laln depende de la relacin lactoaa/protenu, que no ee conatmte; aln embero , el coelidente de varlac:in ealimi lar al de otroe .Mtodoe fiicos.

XII NUEVOS METODOS FISICOS DE ANALISIS DE LECHE

A) V.,._ elnc:ocwalientes de 1ot mtiDcloc fllicol


Tericamente ukten numerwa poalbidadee de an'li por va fsica, balladu en la medicin de una propiedad perticular de uno o varlot componente~ de la leche. Se han experimentado butantea, pero en mucbot ca101 loa mtodos propueatoa tienen alrn Inconveniente que llmlt.a au vulprlzadn: falta de precllln, mala reproductlbilidad, poca rapidez, dificultad de ejecucin por per10nal no especiali-

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Flsica y fisicoqulmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

zado, etc. Este ea el caso, en el estado actual de nuestros conocimientos, de los mtodos estudiados para la determinacin de las materias nitrogenadas: refractometra, fluorimetra, eapectrofotometra en el U.V. Por el contrario, la propagacin de las ondas ultrasnicas y la fotometra infrarroja constituyen la base de los aparatos ms utilizados en la prctica. Se ha indicado, al hablar de la determinacin de las protenas (captulo VI), algunas ventajas de los mtodos fsicos: medicin directa sobre la leche, sin preparacin ni destruccin de la muestra, rapidez de ejecucin, no precisar manipulador experimentado, etc. Es interesante insistir en los siguientes puntos: 1. La determinacin ea muy rpida y se pueden organizar grandes series de determinaciones, por ejemplo 100 a 250 por hora. 2. Las operaciones son de una gran simplicidad. Lo ms corriente es que se disponga de aparatos automticos con dispositivo de registro de los resultados, lo que elimina una buena fuente de errores. Tambin se puede aadir una perforadora de banda que almacena los resultados y permite el tratamiento posterior en una calculadora. 3. Dado que se mide una propiedad fsica del producto, no es necesario pesar ni medir el volumen de las muestras. Otro hecho importante es la eliminacin de reactivos, lo que reduce el coste del anlisis y una serie de inconvenientes ms o menos graves, perfectamente conocidos por los jefes de laboratorio. 4. Los aparatos modernos permiten una gran economa de espacio en relacin con las instalaciones convencionales. Los problemas que pueden presentarse con este tipo de aparatos son los siguientes: a) El precio puede considerarse, a primera vista, como un inconveniente, pero debe tenerse en cuenta que aun siendo la inversin inicial fuerte, los costes de funcionamiento son bajos, el coste de un anlisis realizado en continuo generalmente es menor que utilizando los mtodos qumicos. b) Debe realizarse con regularidad un cuidadoso contraste, mediante anlisis qumicos o por laboratorios oficiales. e) Estos aparatos tienen una parte electrnica destinada a amplificar una seal, convertir una energa en porcentaje o asegurar el automatismo. Todos los sistemas electrnicos pueden tener fallos, pero stos son cada vez ms raros, dado el perfeccionamiento continuo de este tipo de material. Los constructores han puesto mucha atencin en el problema de las averas imprevisibles y han incluido puntos de control; piensan que una persona calificada, por ejemplo, como un jefe de laboratorio, puede garantizar el control peridico y descubrir las posibles anomalas.
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Ffsfca y flslooqufmlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

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d) Eatoa apuatoa aon ms intereaantea pera loalaboratorioa de laa indurlriu importantes o para los laboratorioa centzalea, que para loa laboratorioa de laa fbricu de tipo medio o pequeo.
C) M6todo ecltlco La velocidad de loa ult.raaonidoa, en medio homo4!neo, depende de la denaldad (D, en i /ml) y de la compresibilidad (K, en cm 2 /dina) aecn la llulente frm.ula, donde V ee u presa en cmfeeundo:
V=

v D.K

60 e, en la materia grasa y en el agua (o en aolucionea acuoaaa). Exilte una temperatura crtica para la cual la velocidad ea lual en eatos doa medloa. Adems, a una temperatura dada, la velocidad de los ultraaonidoa vara como el contenido en extracto aeco deeengraaado. Finalmente, el efecto del extncto aeco desenruado ea independiente de laa proporcionea relativas de aus componentes. Sobre eate principio ae ha concebido por Wlnder (1961) un aparato pan. la determinacin npida de la materia eraaa y del utn.cto aeco d-fli1U8do: el "Dariaon M-103" (fiura 64 B). Eate aparato comprende doa ~lulaa wneridas a 41 y 65 C; el lquido ea atraveaado por un hu de ultruonidoa entre doa tranlductorea que traluforman la enera. La determinacin ea muy aimple y el aparato fuerte. No ae preciaa homoeeneizacin previa; por el contrario, la leche homogeneizada exlee un calibrado especial. El aparato no eat introducido en Europa.
B) Mtodo e.pectrom6trico Loa trea princlpalea componentes de la leche preaentan bandaa diferencladu, lo que permite determinar la concentracin de cada uno de elloa. Dichu b&ndu corresponden a la abllorcin debida a loa rupos hldroll.lloa de la lactoea. En el cuo de la leche hay que aalvar doa dificultadea: l. El aua preaenta bandas de ab&orcin muY inteliiU en la regin intereaante de 5.000 a 10.000 nm. Aun obaervando la leche en capa muy fina (0,05 nm) ea difcil diacernir los "picoa" de los componentea del extracto aeco. Pero si ee utiliza un eapectrofotmetro muY eenaible de doble haz, la absorcin del aua se elimina y entonces ee ven laa bandas caractersticu de loa otros componentes.

Loa valoree de D y aobre todo de K varan con la temperatura. La velocidad de loa ultrasonidoa vara en eentldo lnverao entre O y

2 . La dllualn de la luz contribuye a la atenuacin del haz; sta depende de la relacin: dimetro de laa partculas/lonltud de onda. Es conveniente reducir el 'dimetro de los glbulos grasos mediante la

y h !d 'Tlatenal

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Flslca y flslcoqulmlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

Figura 54. Dos aparatos automticos modernos para el anlisis rpido de la leche.

A) ANAL.IlAOOR ~Mti.KO$CAN300" OE

RAYOS INFRARROJOS
ComprecnQtt un 9s.{)9Cirofol metro (en DI

lro) que es la unklad oe me<~Jcton propi.arnentt diCha. \<1 DOmbf de al~ l)rt$101\ tal,. dertr.ha)y

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Flslca y fi!llcoqulmlca. Efectos de los trahlmlentoa tecnolgicos

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homopnelzacln y elecir lu bandu hacia lu IIJ&Ildea lonc!tudell de onda. De eata forma, en el cuo de la materia rus, M realiza la Jectu. ra a 5.730 nm y no a 3.450 nm, donde 18 encuentra otro pico lmpor tante. La eleccin de lu otru lougitudea de onda a eeleccionar elt guia da por la neceaidad de evitar intnferenc:laa. Para laa protenas, la lec tura ee realizar a 6.460 nm, y para la lactoaa, a 9.600 nm. En lo que ee refiere a laa protenas, existe una lilera interferencia debida a la materia rus, pero puede realizaree una correccin aatidactoria. Ooulden y colab. (1964) han pueato a punto un eapectrofotmetro denominado "lRMA" (lnfra red milk analyter) que permite deter minar la materia sraaa. lu protenas y la lacto.a. Ma recientemente ae ha lanzado al mercado otro analizador de eate tipo, el "MILKO SCAN600" (Foaa Electric), <&tribuido en Europa y que permite ana llsar 200 a 300 muettrac de leche al dia, determinado el porcentaje de materia ~ y el contenido de materiaa nitroenadu totales, con una preclalon del orden de 0,06% en relacin con loa mtodos de referencia, y una repetibilidad de 0,02 t. La leche natural pasa al aparato sin necesidad de aadir ningn reactivo. Ultimamente ha apa recido un tercer aparato, el "Multispec M" (Be.r wind). Loe listemaa util!adoa son diferentez pero liguen siendo !cuales las longitudes de onda teleccionadas (figura 54 A).

XIV ESTADO DEL AGUA. DESECACION


La leche contiene como trmino medio 87,5 t de agua (alrededor de 900 g por litro), que se encuentra en dos estados: 1. Agua libre. La mayor parte del agua conatituye el diaolvente de la Jacto.a y las sales; ea independiente de lu auatanciaa Insolubles. 2. Agua ll.fad4. Una pequea parte del agua ae encuentra enrgicamente retenida por lu auatenciu en emulain y en auspensin. No forma parte de la fue hdrica verdadera y no diauelve, como stas, la lactoa. Se encuentra ligada principalmente a laa protenas.
A) El~~g~~eliglda e liS promnas No ae conocen con precisin loa mecaniaiDOI que intervienen en la fi. jacin del egua por laa protenas, ni si eata agua conatituye una fue homognea. Se cree que loe grupos no polarea tienden a oriental'88 hacia el interior de la molcula, para aeparane de la fate acuosa, mien tru que loa grupoa polares ae presenten en la auperficie, en contacto directo con lu molculaa de agua. En la leche, el problema es lDII complejo como oonaecuencia de la existencia de "mlcelaa" constitul du por laa caaenaa y los mineralea, principalmente el calcio y el ci

opyr orled r1a1er al

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Flslca y tlslcoqulmlca. Efectoa de los tratamientos tecnolgicos

do fosfrico. La micela representa una estructura muy 1a:u que contiene alrededor del 70% de aua. Puede admitirse que Jaa zonu intramoleculares hidrfobu retienen poca aua y que, por el contrario, Jos vacos intramicelares, limitados por Jaa superficies hidrfilaa de lu molculaa protelcu, retienen mucha. Segn loa datoe recientemente adquiridos, se puede considerar la existencia de dos formu de aua en presencia de Jaa protenu. El aua llpda propiamente dicha no tiene un papel de disolvente y no se congela a -1sc; debe constituir la primera capa de molculaa de aua adyacentes a la cadena peptdlca, perfectamente orientadu y ligadas por enlaces de hidrgeno. Entre el aua ligada y el aua realmente Ji. bre existe una capa intermediaria formada por un nmero reducido de enlaces de hidrgeno: tres, dos o uno por cada molcula de agua (la molcula de aua puede admitir como mximo cuatro enlaces de hidrgeno). El conjunto del aua ligada y de esta capa intermediaria constituye el ~a de hidratacin de Jaa protenu, que ea el aua retenida por el sedimento de la ultracentrifugacin, en un campo centrfugo de 68.000 X g, a 37 e, durante 85 minutos, en el caso de la leche normal. En estu condiciones y con una solucin de cueinato sdico no se obtendra sedimento y sera necesario aplicar un campo mucho ms elevado.
B) El agua ligada en la leche

El aua ligada es mucho ma difcil de eliminar que el aua libre, cuando se trata de obtener un producto deshidratado. Se la puede comparar, desde este punto de vista, al aua de cristalizacin de cier tu sales minerales. La proporcin de aua ligada no es fija y exist. un equilibrio: aua ligada - aua libre que depende de condiciones exteriores: temperatura, pH, concentracin salina, etc. Conservando la leche de ordeo reciente a 15 C el contenido de aua ligada aumenta lentamente, as como la densidad. El aumento prosigue durante 24 horu. Si se calienta la leche, el equilibrio se destruye, y despus del enfriamiento disminuye la proporcin de aua ligada. La proporcin de agua ligada se mide, habitualmente, por el mtodo crloacpico. Se basa en la propiedad del aua ligada de no disolver las suatanciaa que normalmente son hidrosolublaa. El descenso del punto de congelacin de una solucin de sacarosa en la leche ea siempre superior, para una cantidad equivalente de disolvente total, a la suma de loa descensos correspondientes a la leche y a la solucin de sacarosa hallados individualmente. La sacarosa, por lo tanto, no se di suelve ms que en una parte del agua total de la leche; la diferencia represente el agua ligada.
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Ffslca y flslcoqulmlca.

Efectos de los tratamientos tecnolgicos

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Tambin puede determinarte el agua Hpda por va qumica, por ejemplo, mediante el a~~liia de la cuajada que ba sido sumergida en la solucin del azcar Indicador. Loa resultados no son loa miamos con diferentes sustancias indicadoras; cuanto mayor e su peso molecular, ma grande resulta la proporcin de agua ligada. En el caso de los productos lcteos, los valores que deben tomarse en colllideracin son loa que se obtienen utilizando un azcar C 11 , como la lactosa o la sacarosa. Loa datos procedentes de varios autores no son aiempre concordante&. El cuadro 35 muestra valores relativo a la leche natural y a leche que ba sufrido diversos tratamientos. El contenido de agua ligada ae ha obtenido por medio de un aparato muy perfeccionado, que reduce las cauaaa de error de la medicin termomtrica claica. Eato puede explicar loa desacuerdos entre ciertos valores de loa cuadros S5 y S6; pero cada serie es interesante por las comparaciones a que puede dar lugar. El cuadro S5 indica que el agua de hidratacin, por gramo de protenas sedimentadas (constituidas por casena en au 95 %), vara poco en el curso de los tratamientos que sufre la leche; tiende a elevarse con la concentracin y tras el calentamiento. El agua ligada aumenta ms fuertemente en estas condiciones. La privacin de fosfato coloidal, por dillais de la leche acidificada contra leche no acidificada, tiene poca influencia en la hidratacin de la casena.

Cuadro S5. Agua ligad4 y t11U4 de hidratacin tk la leche (1).


Atua U,ada (l) Apa de bidratacl6n (3)

Loche
Desnatado normal

de leche

pfa protenas
totalq

do leche

p/a protenu aedirnentad .

4,8 7,2S
9/}

1,4S 2,1S 3,0 2,5 1,55

6,8 7,1 7,5


16,5

2,5 2,6 2,7 2,7 2,7

Pasterizada (72C, 30 s) Calentada

(9oc. 10 min) Concentrada


(22% ESD) Privada do fosfato coloidal

19,8 S,4

3,8

(1) Sen Tarado de la Fuente y Alais (1 973). (2) Por el cri~plo Ad vanced

(3) Por ultracenlrifuaacin .

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Flsica y flsicoqulmlca. Electos de los tratamientos tecnolgicos

En el cuadro 36 puede observane que loe resultados expresados en tanto por ciento de extracto seco son muy diferentes entre s: en la nata hay poca agua ligada, y menee en el queao graso que en el desnatado. En efecto, los divenos componentas insolubles del extracto seco no intervienen de la misma forma; la matarla 11f88a retiene poca agua, mientras que loe fosfolpldos de la seudomembrana de loe glbulos grasos tienen una tuerta cpec:idad de ligazn con ella ( 600 %de agua ligada), pero por encontrarse en cantidades muy pequeas, no retienen ma que alrededor del 15 %del agua ligada de la leche. Son las protenas las que tienen el papel dominante; la casena retiene alrededor del 55% y las protenas solubles el 30% de dicha agua. La afinidad ma o menoe grande que para el agua tienen loe diversos componentes de la leche es una caracteratica importante desde el punto de vista tecnolgco, espec:ialmente en lo que se refiere a loe quesos y leches desecadas.

Cuadro 36. Contenido en "agua ligada" de los productos lcteos (1).


"Aeuallaada" en 1001 de Productos

%dOliUl
(total)

producto fraaco

...tanela
IICl

A. LECHE yNATA(I) Leche completa (de un dla) Leche descremada (de un dla) Nata (con 40% de mat. grua) Calostro (un da) B. QUESO (2) Queso prensado graso (45 M.G. % ES) Queso prensado magro Experiencias con una cuajada mara: - antes salado - despu6$ salado 37,5 S 1,5 65,5 64,5 14,5 20,9 15,8 10,8 23 ,2 43 ,3 45 ,6 30,5 87 90,5 57 81,9 3,18 2,13 3,42 4,65 23,9 22,6 7,9 24,2

(1) Segn Pyenson y Dahle (1938). Medida termomttrica. (2) SeBn Mocquot (1947). O..terminaci6n qumica.

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Ffsica y fisicoqufmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

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La proporcin de agua ligada a la casena ha tenido divenaa estimaciones. Loa viejos valorea del cuadro 36 llevan a admitir que la ca aena retiene ahededor de la mitad de su peao de agua ligada. Esta apreciacin tiene poca base. Hoy da ae admite que la retenclri es de una parte a parte y media de su peso. Esta propiedad permanece inva riable despua de la accin del c~o. En la prctica quesera este valor vara bajo la influencia de la temperatura y el pH, pero tambin aegn las tcnicas empleadas; el trabajo de la c~ada, y sobre todo la accin de la sal, lo disminuyen sensiblemente. Eete ea un punto im portante a estudiar, sobre todo en la fabricacin de loa quesos de pasta dura, donde se busca ellminar rpidamente la mayor cantidad posible de agua de la c~ada, hasta la obtencin de una humedad ptima (40 %). Lu cuajadas descremadas son difcllea de desuerar; en las mit mas condiciones de trabajo que las c~adas grasas, retienen del12 al 15% menos de agua y no tienen las mitmat caractersticas de con servacln. La retencin de agua por la casena es tambin un hecho importante para la consezvacln de las leches en polvo: la descomposicin es rpida para un determinado porcentaje de humedad, que permite que la reaccin de la 1actoaa sobre las materias nitrogenadas tenga una velO!)idad apreciable.
Cl Actividld daiiQUI Ei la forma ma conveniente de representar la disponibilidad de agua en un producto alimentario, puea permite fijar los lmites por debajo de los cuales se hace imposible la prollferacln de loa microorganismos, y delimitar la categora denominada hoy en da alimento de humedad intermedillrill. La actividad del agua, llw, est definida por el descenao de la tensin parcial del vapor de agua por los componentes del medio: Pw llw = P!!, donde Pw es la tensin parcial a cierta temperatura y en equilibrio y P::, la tensin parcial del vapor de agua pura en las mismas condiciones; 11w es siempre inferior a l. Loa alimentos movilizan parcialmente el agua y disminuyen tu vaporizacin. Para eatimar la actividad del agua, se mide la humedad relativa (HR) mediante aparatos que pueden ser muy simples, por ejemplo: el higrmetro LUFFT (Stuggart). En equilibrio existe una equivalencia entre llw y HR/100 para los alimentos situados en esa atmsfera. A ttulo comparativo se dispone de datos sobre soluciones de compueatos corrientes; el descenso de aw con el aumento de la concentracin depende de la naturaleza del compuesto.
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Flslca y flsicoqulmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

M olaridades

a.,
0,995 0,900 0,800 0,700

NaCI
0,15 2,83 5,15

CaCI,
0,1 1,6 2,6 3,4

Sacarosa
0,27 4,1

La detencin del crecimiento de los microorganismos se produce en las zonas siguientes: a,.: 0,91 (especies no halfilas) - bacterias - levaduras a.,: 0,88 - mohos a,.: 0,80 - especies halfilas a., : O,7 5 Los productos lcteos, como la leche, la nata y el queso fresco, presentan un fuerte valor de a., . Se puede rebajar el a., por la adicin de sustancias diversas, como la sal comn, la glicerina, la sacarosa y la carboximetilcelulosa.
un tnnino licnlco que .. utiliza en ciertu lnduotrlaa &limentarlaa pan duilltllr la aptitud de una ouetancia pan rtollllr loo cambio de humedad.
hJ.lm~ctanclo ~

Nota.- La

DI Determinacin del contenido en agua. Procedimientos da deshidratacin


a) Deseoocin trmica

Es el mtodo usual, que ya hemos mencionado al tratar del extracto seco de la leche; puede aplicarse a otros productos lcteos, pero es preciso considerar los siguientes hechos: - La desecacin a 100105 no ejerce exclusivamente su accin sobre el agua, por lo que debe tenerse en cuenta la presencia eventual de productos voltiles, especialmente de cidos orgnicos y de sustancias nitrogenadas de molcula pequea (amonaco y aminas). Estos productos voltiles pueden ser relativamente abundantes, por ejemplo, en las leches alteradas, quesos, etc. La prdida de peso debe corregirse si se poseen elementos de clculo. - La desecacin al vaco y a baja temperatura da resultados ms exactos del contenido real en agua; con este procedimiento se reduce el riesgo de descomposicin de la lactosa con formacin de productos voltiles.
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Frsrca y llslcoqulmlca. Electos de loe tratamientos tecnolgicos

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- Cuando el producto contiene lactosa a-hidratada, el aua de crltalizacin slo se elimina parcialmente durante la desecacin (caao de ciertu leches en polvo).
b) MI todos etpecflcoa Son loa nicos que permiten determinar exclUIvamente la totalidad del agua pretente en un producto lcteo. El mtodo de Karl Fiacher

ea muy preciso, pero slo da buenos resultado cuando el producto es pobre en asua. Va bien con las leches en polvo y loa quesos, tras une desecacin previa parcial, por ejemplo, a temperatura ambiente. Puede conaideraree como un mtodo delicado que exige una definicin muy precisa de las condiciones experimentales; pero se presta a los anlisis en serie. El aua ae determina por el mtodo de Karl FiaCher, segn esta reaccin :

H~ O + 1 + SO1 + 3 C,H,N + CH, OH 1

-+

2 C,H,N Hl + C,H,NSO,HC H,

La determinacin se efecta mediante reaccin directa del produc to hmedo con el licor de Fiacher (solucin yodo-anhdrido sulfuro-

so-pirldlna-alcohol metlico), o bien por valorac16n a la inverss,introduclendo primero une cantidad conocida en exceso de licor de Fscher, y valorando luego dicho exceso por medio de una solucin alcohlica de conocido contenido en agua. La determinacin potenciomtrica, por aplicacin del mtodo de "dead-etop~nd-point", con lectura mediante ojo mgico, es la ms empleada.

e) Mltodos/slcoa 1. Estos mtodos se basan en una propiedad particular, que, en las condiciones dadas de medicin, slo depende del contenido en aua del producto; no se exige peaada alguna, y el retultado se lee en un potencimetro cuya eacala est graduada directamente en porcentl\e de aua. El procedimiento ae basa en las propiedades dielctrrea. de hllja frecuencia, que han sido objeto de interesantes estudioe para cuJ. minar en la plida al mercado de divenos aparatos ("DK-meter"); sin embaqo , algunas dificultades de realiuci6n material, que afectan especialmente a la exactitud de los resultados, han hecho preferible, ms recientemente, aprovechar las propiedades de loa cuerpos en biperfrecuencia. 2. En el procedimiento de lo$ hiper{recuenc/4$ ae utilizan ondas electromagnticas muy cortas (tcnica empleada en el radar) y de potencial dbil, unos 3 cm y 20 mW. La clula de medicin est consti tulda principalmente por una bocina emisora y otra receptora coloca
o r Qrte r a r al

Flsica y fisicoqulmlca.
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Efectos de los tratamientos tecnolgicos

das a cada lado del producto a anali7J8r. La atenuacin de la seal de hiperfrecuencla es ms o menos grande segn el contenido de agua y se mide por un sistema de deteccin y un potencimetro electrnico. La medicin puede reali"8l"&e sobre un producto slido, como el queso, o sobre un producto pastoso, en circulacin, como la mantequilla a la salida de la mantequera de fabricacin continua, 8. El sistema de CGlentamiento por microondaa emplea tambin ondas centimtricas. Slo el agua e.t sometida al movimiento vibratorio y se calienta por influencia del campo electromagntico, aunque estas molculas polares tambin absorban energa. En los medioa como los productos lcteos, el calentamiento es casi selectivo y el soporte no absorbe energa. La irradiacin provoca una desecacin rpida en toda la mua, ain destruir la capa superficial. Hay aparatos de secado industrial, an poco uaados, y aparatos de laboratorio. 4. La fotometra de absorcin infrarroja permite no slo la deter minacin de diversos componentes del extracto seco (ver ms arriba), sino tambin el contenido en agua. El espectro del agua posee varias bandas de absorcin; en general, se elige 1.940 nm, tomando como banda de referencia 1.800 nm. En varias Industrias alimentarias se realiza un control continuo de la humedad de los productos slidos mediante aparatos basados en este principio. 5. Otros mtodos ms modernos permiten medir la cantidad de agua, en sustancias poco hidratadas. Entre ellos podemos citar la resonancia magntica nuclear (RMN), que se determina mediante espectrmetros que son asequibles a los laboratorios industriales y que miden la "relajacin de espn" (recientemente se han concebido analiza. dores de protenas basados en este mismo principio).
XV EFECTOS GENERALES DEL CALENTAMIENTO

El calentamiento es el ms Importante de los tratamientos a que se someten la leche y los productos lcteos en las tcnicas modernas, como veremos en la quinta parte; tiene varias finalidades: l. Mejora de la calidad higinica y de la calidad de conservacin, por destruccin de bacterias y enzimas: esterilizacin de la leche, pasterizacin de la leche, de la nata, de las mezclas para helados, etc. 2. Eliminacin del agua: concentracin o desecacin de la leche, del lactoauero, etc. 8. Fines tecnolgicos diversos: "coccin" de la c~ada a temperaturas moderadas, en la fabricacin de quesos de "pasta dura"; fusin del queso con sales emulsionante& (fundentes) ; preparacin del aceite de mantequilla (butter-oil); modificaciones de las propiedades fsi cas (viscosidad y color) de las leches concentradas, etc.
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Flsica y fisicoqulmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

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Conocemos la gran complejidad qumica y fsica de la leche, y podemos prever que el calentamiento podr romper en diversos puntos este edificio relativamente frgil: modificacin de sustancias lbiles, deaplar.amiento de los equilibrios fiaicoqumicoa, etc. Es importante conocer la naturaleza y el alcance de estas modificaciones. El cuadro 37 resume las ms importantes, que ya hemos citado anteriormente en buen nmero. M adelante insistiremos en aquellaa que no han sido desarrolladas IU!icientemente en los primeros captulos. En el cuadJo mencionado se exponen los fenmenos de fonna analtica, lo que no significa que sean Independientes unos de otros, ni que se realicen de la misma forma (a la misma velocidad, por ejemplo). En general, los efectos aparentes del calentamiento son conse cuencia de procesos bioqumicos complejos, cuyos trminos Intermedios raramente se conocen con precisin. Las reacciones qumicas que intervienen son de diferentes tipos, con diveraaa caractersticas
fisi~umicaa.

La destruccin de las bacteri.u puede considerarse como una suma de reacciones qumicas, entre las que tienen un papel predominante la desnaturalizacin y la degradacin de las protenas simples o complejas, componentes de las enzimas esenciales.
Cuadro 37. E(ecro del calentamiento en los componentes de la leche
Sustanclu modlflcadu Lactosa Modificaciones posibles Principales

co,_.,eociu

Descomposicin con for Influencia en el creci miento de lu bacteriu macl6n de cidos ors nicos lcticu. Descenso del pH. Sustanciu extraibles con

tter.
canmelizacin. Lactosa + Protenas Reaccin entre los gru. pos aldehdcos y ami nados; productos de condeDSlc6n colorea dos (reacci6n de Mai Uard). Aparicin do grupos SH activos y de compuestos sulfurados Ubres. Desnaturalizacin. Disminucin del valor nutritivo delu protenas Formacin de compuestos reductores, dificultad para la oxidacin de las Oscureclmento.

.......

Protenas solubles (principalmente, jj.lactoalobulina}

"Sabor a cocido".
Siltema reductor. Floculacin. Dificultades para la rormocin de la nata.

Copynqhled malenal

~90

Flslca y flaiooqulmlca. Electoe de loe tnltamlentoe tecnolgicos

Cuadro 37. (Continuacin)


Suatmclu mocllficUu Protoinaa solubles y caaoina Modlflcocioaq
poolble8

Prillclpalet
COJIIOCQOD.Ciat

Formacl6n de amoniaco. Concentraci6n e IIOiubilidad en la intenona lquido/aire. Formacin de complejos caaoina K + jl-kctoglobulina. Oesradacin de las cade nas laterales. Formacin de enlacea isopeptdlcos. Deradacin de la mol6 cula (defosforilizocin y ruptura do enlacea peptdicos) acompa.ilada do modificacin del estado mlcelar de la llcbe. Desplazamiento del equilibrio C.{P soluble C.{P Insoluble. Modificacin de la capa superficial de las micelu.

Influencia en el sabor. Formacln de la llamada "capa de la leclle'". Una do las cau.a de esta bilizacln por precalontamiento. Descenso del valor nutri-

tlvo.

C.selna

Floculacin de las auspenaiones de case !na alta temperatun. Floeulacin y allflca de la leche. Precalentamiento estabi litador. Insolubilizacln de las sales de calcio y descenso del pH. Retraso en la coagulacin por el ~o. Influencia en la ostabili zacl6n de las mlceiu. Uberacin de Acldos

Materias minerales

Materia arasa

Hidrllsis. Formacin de las lacto nas.

Vitaminas
Entimu

De~cci6n:prlncipal -

mente B1 , C y B12.
lnactivacin a temperaturas tiastante bllias (60100 C)

Sabor desaaradablo (en las leches concentradas y en polw). Disminucin del valor nutritivo. Detencin de las actm dados onzimAticas, especialmente la UpAsica y proteAsica. Control de la pasterizacin. Elevacin lisera del pH y del punto do conae !acin.

arasos.

Gases

P6rdida de C01 .

Copynghted matenal

Fsica y flslcoqumlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

291

XVI VE LOCIDAD DE LAS REACCIONES


A) Coeficiente de temperatura Los efectos del calentamiento obedecen al aumento de la velocidad de algunas reacciones. La velocidad puede alcanzar UD valor tal, que eatas reacciones, muy lentas a la temperatura ordinaria, se realicen, al menos parcialmente, en UD tiempo relativamente corto, en las condiciones del tratamiento trmico. La frm$ emprica de Vant'Hoff indica que la velocidad de la reaccin se multiplica por UD factor casi constante (a), cuando la temperatura aumenta en 10 C:
V, = V, . aO.l(t2 U)

El factor a se denomina "coeficiente de temperatura", y se expresa tambin por Q,o. Si la velocidad de una reaccin con UD coeficiente igual a 2 (por ejemplo, la velocidad de desaparicin de la lactosa y de UD a~oci do al reaccionar entre s) se toma por u. idad a o , a 1 O C la reaccin n ser dosvecesmarpida;a20"C cuatro veces ms y a 120"C, aproximadamente cuatro mil veces ms. En consecuencia, si una modificacin (correspondiente a una o varias reacciones con el coeficiente de temperatura anterior) no aparece ms que al cabo de 40 das a Oe, o de 10 das a la temperatura ambiente, aparecer ya a los quince minutos a la temperatura de esterilizacin (120 C). La influencia de una elevacin de la temperatura es, por lo tanto, considerable en una determinada zona. El coeficiente de temperatura no es el mismo para todos los tipos de reacciones; he aqu algunos valores caractersticos: 1, para las transformaciones radiactivas (son !dependientes de la temperatura); 2 a 3, para gran nmero de reacciones qumicas y en:tlmticas; aa 6. para algunas reacciones de oxidacin; 5 a 10, para la destruccin de las esporas bacterianas; 10 a 25, para la destruccin de las bacterias. El aumento de la velocidad de reaccin e coDJecuencia del aumento del nmero de molcula8 "actlV88", es decir, con una energa por lo menos igual al nivel mnimo llamado "energa de activacin", y capaces de entrar en reaccin. Existe una relacin matemtica entre la velocidad de la reaccin y la temperatura (ecuacin de Arrhenlus). Por encima del cero ab8oluto (~73 C),la reaccin es siempre posible en teora; sin embargo, para grandes intervalos de temperatura,la velocidad es tan pequea que puede considerarse prcticamente nula.
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.292

Flslca y flslcoqulmlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

Puede admitirse corrientemente que emte una eapecie de umbral de temperatura, a partir del cual la reaccin se efecta a una velocidad apreciable. Para ciertas reaccione., eate umbral parece aer butante elevado; por ejemplo, slo puede observarse la degradacin y la coagulacin del fosfocaaeinato nativo por encima de loa 100 C. Otras reaccione. pueden observarse lo mlamo a temperatura ordinaria que a 1ooc; por ejemplo, la caramellzacin y el eapeaamlento de la leche condensada azucarada se producen en unos treinta minutos a1ooc, pero se puede obtener el mamo reaultado en dos aos a 20 C.

Bl Rapr8Mr11l1Cin grjfica da los afectos trmicos


Para representar los efectos del calentamiento en la prctica de la qumica de la alimentacin y de la bacteriologa, se utilizan dlagra mas en los que las coordenadas son la temperatura y ellopritmo del tiempo de calentamiento. Estos diagramas constituyen tan slo una aproximacin de la regla de Arrheniw. Las grficas obtenidas son rec. tas en un Intervalo de temperatura y de tiempo limitados, su pendien te ea negativa y representa el coeficiente de temperatura. I.;a figura 65 ofrece un ejemplo de esta repreaentacin grfica, en el que la modificacin "x" tiene un coeficiente de temperatura de 2,6 (se trata en eate caso de un oscurecimiento de la leche calentada). En todas las condicione. tiempo-temperatura representadas por un punto que se encuentre por encima de la recta "x ", aparecer la modificacin considerada. La curva de eaterilizacin tiene una pendiente mucho ms elevada (coeficiente 10); por eata razn, existe una zona en la que todos loa puntos correaponden a condiciones en que la e.s te rilizacin es efectiva, sin apareoer modificacin alguna. En el ejemplo de la figura 66, esta zona eat delimitada por el ngulo (a) que forman las dos rectas, y por tanto para temperaturas superiores a 105 C. Loa estudios de Jos efectos trmicos jwtifican la tendencia general a la aplicacin de temperaturas elevadas durante un tiempo muy corto, siempre que se pretenda conservar los productos lcteos sin modificacin de color ni sab n. Esta tendencia se concreta en el prooedimiento U.H.T. (ultra-alta-temperatura), que estudiaremos en el captulo XIX, para el cual ae preaentar otro diagrama con parmetros diferentas. Ea preciso hacer una observacin importante referente a la Interpretacin de eatos di'1graD188: su validez se limita a la zona de loa puntos establecidos experimentalmente; no ae puede extrapolar bien ms all de estos puntos, con miras a encontrar condiciones equivalentas, porque podra caerse en una zona donde la grfica ya no sera una recta. Otra observacin tiene asimismo gran importancia: los efectos qumicos o fsicos de los tratamientos trmicos son acumulativos. Mencionando simplemente el mximo de temperatura alcanzada y la
Co!Jyright:"d rPatorial

Ftalca y flalcoqutmlca. Efe<rtos de loa tratamientos tecnolgicos

293

duracin del tiempo de mantenimiento de etta temperatura, ee come te un error. El tiempo empleado para alcanzar etta temperatura y el tiempo qdo para el enfriamiento deben entrar en coJUideracln, u como cualquier tntamiento previo, por ejemplo, una pasteriza. cin anterior a la conoentn.cin. El procedlmlento U.H.T. tiene la gran ven~a de reducir mucho la duracin de la permanencia a tem peraturu lntermedlu.

XVII DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINAS. FORMACION DE COMPLEJOS


La desnaturalizacin pura y simple se ha definido en el captulo VI. Se reflere a lu protenu del lactoauero (aelvo lu proteoau-peptonu)

1000 500

i
E

100

50

10

5
2
160
30
12

: ' ''
100

0.1.,.__ _ _ _..__
90

_!_,-----------~

l1os

11 O

120 ttmperatura t'C 130

f19ur 55. Diagrama de tratamientos trmicos (segn Wabb y Holm. 1932).

,d

'Tlatenal

294

Flslca y llslcoqulmlca. Etectoa de loe tratamlentoa tacnol6gicos

y las enlimas. La cuena no sufre perturbacione. vilibles en el cuno del calent.amlent.o a 100 e; se ha dicho que era "desnaturalizada natunlment.e" . Bl estudio de la desnatwatizacin trmica rev1e una eran importancia en lo que M refiere a la estebilldad de la leche y de productos derivadoc, por una parte, y la recuperacin y utillucin de 1at protenas dellact.oJuero, por otra. Debe aubrayarM que la simple desnatunlizacin no tiene efectos dedavorablea deade el punto de villa de la nutricin, contrariamente a lo que ocurre con otraa modificaclonea y de(lradaclonea que se estudiarn ms adelante. La digestin de laa protenas del tipo 'slobulnico se mejora, con frecuencia, despus de la deanaturallzacln , a pesar de que aparezca una forma insoluble. La destruccin de la eJtructura eapacial ordenada favorece el acceao de lat proteuas a loa enlaces auaoeptiblea de aer roto&.

A) Medlc16n de la desnaturafizaci6n Exwn varloc medioc pare apreciar el alcance de la dematuraliz.acin o determinar el limite tiempo/temperatura en el que aparece una desnaturallucin no table de una protena concreta.
l . Determlnocl6n de /tu diferente (omuu d nltro,.no La deanaturallucin ae mide fzecuent.ement.e por la proporcin de nltreno proteico que permanece en solucin a pH 4 ,6. El clculo puede hacerte aobre el nitrgeno proteico total : Na - NPN, o bien sobre lu albminas y globullna.s (estando excluldu lu proteosaspeptonaa): Ns - N 95 (siendo N9 , el nltreno solu ble tru calentamiento de la leche a 95 " C). Se calcula:

t de d eanaturalizacln = :...;...,_____,;_...;.,_ ___;,;'---Nao - NPN o

[(Nso - NPN)- (Nst - NPN)] X 100

[(Nao - N,.) - (Nat - N u)) X 100

Nao - Nu

En estas f rmulas, Nao es el nitrgeno aoluble i.nlcial, y Nat, el nitr,eno aoluble trae el calentamiento. De esta forma ae puede expreIIIJ' el resultado en porcentaje de prote nas desnaturallzadaa (PND) : PNO t

:..._ _ _ X_l O~ -(Nst_- NP_N:)_ ...: O


Nso - NPN

Por ltimo ae pueden manejar valores absolutoa , por ejemplo, para el ndice de protenas o "WPNI" (Whey proteln nltroen lndex ), que alrven para la clulficacin de las leches en polvo (captulo XXD).

Ffslca y fisicoqufmlc8.
Efectos de los tratamientos tecnolgicos

295

2. Mtodo electro(ortico e inmunoqu mico Se han mencionado al final del captulo VI. Una rigurosa estandarizacin y la utilizacin de contrastes que permitan la correccin de las variaciones de calidad de los geles, dan una precisin butante grande a la medicin de lu concentraciones. Eataa tcnicu permiten realizar serlea analticu y pueden aplicarse a cantidade. muy pequeu (0,1 mi) de productos variados, calentados en tubos capilareJ.
3. Calorimetra diferencial Este mtodo, utilizado fundamentalmente por Ruegg y otros autores (1977) para las protenas aisladas dellactosuero, consiste en la medicin de transmisiones trmicu. Los "termogramu" (flujo de calor en Julios/a en funcin de la temperatura) muestran un pico que se corresponde con la temperatura de desnaturalizacin, conaiderada como un cambio de conformacin. Los resultados no concuerdan con los obtenidos por los mtodos anteriores en lo que se refiere a los componentes proteiCOJ ms establea.
4. Pnu bos rpida~ Estn destinadu no a loa estudios sobre la desnaturalizacin sino a la diferenciacin de las distintas calidades de la leche de consumo o de las leches en polvo, segn la Intensidad del tratamiento trmico, tema que volveremos a tratar ms adelante. La ms conocida es la "prueba de la turbidez", que permite la diatincin entre las leches U.H.T. y las leches esterilizadu (captulo XIX).

Bl Cintica y mecanismo de la desnaturalizacin


Es un tema que ha dado lugar a un gran nmero de investigaciones, cuyos resultados son difciles de relacionar entre s, ya que, por una parte, la utilizacin de mtodos diferentes no permite la medicin exacta de una misma cosa, y por otra, porque los estudios se han realizado sea sobre protenas aisladas disueltas en un lquido, que puede ser el ultrafiltrado de leche, o bien sobre la leche o ellactosuero. Antes de la desnaturalizacin irreversible se producen transformaciones de carcter reversible, segn una reaccin de primer orden, que se pone en evidencia especialmente por la calorimetra diferencial. Se discute la cintica de la desnaturalizacin de las dos principales protenas del lactosuero. Para la 11-lactoglobulina en la leche,la cintica est perfectamente descrita por la ecuacin de segundo orden y se observa una diferencia entre las variantes; " A" es un poco ms termoestable que "B" a temperaturas inferiores a 95 oc, pero por encima de los 100 C se produce un efecto inverso. En el lactosuero se observa lo mismo en la z.ona de pH neutro; por el contrario, en meCopynqhted matenai

296

Flelca y flslcoquimica. Efectos de lostrat.,-nlent os tecnolgicos

dio cido o alcallno, "A" ee vuelve meno. ._table que " B" (experiencia rullzeda con el mtodo electrofotitlco de H!Uier, 1976). La a-lac:talbmina &e dematuraliu .ecn otra dn'tica, probablemente de MUdo primer orden. La d-tunlizacin ineveuible de 8lt.ea do. protena& implica probablemenc. cambios en 108 puentes s--6, con reacciona entre un enlace s--6 y un crupo -5H pua forDW' un nuno enlace. Se han obaerwdo complejo entre la ll-lactotl1obulina y la a -lactalbmina, a pear de que eata ltima no tiene grupo -8H Ubre. La explicacin de las experienciu viene complicada por el hecho de que en las mezclas o en los medios oomplejoa, loe retultadoa no van alempre en la misma direccin que ae obterva en las aolucionee purae. Por eeta razn, el grado de deenaturallzacln de la a -lactalbmina e mt elevado en preaencia de tl-lactolobulina que en tu aueencia. El efecto de la preaencia o ausencia de la cate {na en la cintica de la deanaturallzacln de lat protenae deleue:l.podr{a depender de la temperatura. Lat protenas anteriorea ton ..tablea, en tneencia de caeena, balta los 95 "C; por encima de etta temperatura ya no oc:un-e lo mltmo reopecto a la 11-lac:toalobuliDa. Varioa autoft!l pi.enan que las micelas estabili:ran la eeroprotenaa mediante la formacin de complejos con la casena , por medio de crupoa -5H; sin embaro , las pequeas micela (que ton las m ricae en cuena ) tienen una menor capacidad de estabilizacin que laa randa. El aumento de la concentracin en prote011 o en extracto teoo inOuye en la velocidad de desnaturalizacin. En el retenido de la ultrafiltracin de la leche, la concentracin de prote011te aumenta, pero la relacin entre laa derentee protenas permanece Invariable, como lo ea la compoelcin dellactoauero preaente. Se obterva, ein embargo, que la deanaturalizacln ee mayor en eete medio que en la leche de origen, En el lactoauero concentrado en extracto aeoo, ae obterva un efecto dllerente tobre las doa princlpalea prot.enu; la deanaturallzacln de la ~-lactolobulina eat ralentizada y la de la or-lactalbmina te acelera. El efecto no ae debe solamente al aumento de la concentlacln en lactota o de calcio, pues en un medio enriquecido en eetaa dotiUItanciu, te obeerva una ralentiucin de la dt!IDitu.ralizacin de laa doa prote011, y por lo tanto un efecto protector. t.o. medloa cido. aportan una proteccin contra la d-tunalizacin (pH 4 ,0 o inferior}.

Cl lntolublllzacl6n de las protllnas del llctoauero


En la leche calentada, a partir de los 60 "C,Iu protelnu aolublea comienzan a precipitar con la caaena. Loe valoree alulentea (eegn Lar-

son y Rollerl, 1955} representan la proporcin de protenaetolubles

Fisica y flsicoquimica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

297

que quedan en solucin a pH 4,6 tras un calentamiento de 30 mi nutos: - leche cruda (protenas solubles 0,546 g/100 ml) .... = lOO - leche calentada a 40 o e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . = lOO - leche calentada a 66 o e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . = 98,2 84,2 - leche calentada a 66 o e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - leche calentada a 70 C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . = 71 50,7 -leche calentada a 74 e.: .... . ... . . ... .. . .. . .. = - leche calentada a 77 o e . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . = 43,9 - leche calentada a 82 o e . . . . . .. . . .. . . . . . . .. . . . . = 23,6 - leche calentada a 96 o e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . = 18,7 A 96 C no quedan en solucin ms que las proteosas-peptonas. Considerando cada uno de loe componentes por separado, lu velo cidades de desnaturalizacin son diferentes. Laa inmunoglobulinas son las ms sensibles al calentamiento; u, a 70 e se desnaturaliza el 89%; la <t-lactalbmins es la ms resistente (a 70 e se dematuraliza el 32 %). . Laa protenas desnaturalizadas precipitan con la paracasena, tras la accin del cu~o sobre la leche. En quesera, la pasterizacin de la leche aumenta el rendimiento quesero y empobrece el suero en mate ria8 nitrogenadas. A las temperaturas de una puterizacin razonable, la desnaturalizacin insolubilizante es dbil, alcanzando el 5-10% de las protenas solubles. Debe tenerse en cuenta la duracin del calentamiento; a 72 C (temperatura pasterizacin), al cabo de 5 min la desnaturalizacin slo es del 6 %; despus de SO mio alcanza el 25% y al cabo de 1 hora llega ya al 40 % . O) Aparicin de grupos sulfhidrilos reductores y del "sabor a cocido" En las protenas nativas, los grupos -8H se encuentran enmascarados y reaccionan poco; sin embargo, pueden determinarse por reaccin con el yodo. Tras calentamiento, se vuelven accesibles a reactivos co mo el nitroprusiato o el d.isulfuro de tiamina. Esta activacin sigue aproximadamente la curva de insolubilizacin; lenta a 6(}.70 e y muy rpidamente a 96 C. Estos grupos activados son oxidables por el oxgeno atmosfrico, de modo que desaparecen si la leclle se calienta en contacto con el aire, y persisten si se desairea la leche; con fieren propiedades reductoras a la leche calentada (subttulo XI). Hay que anotar que el aumento de los grupos -8H reactivos puede acompaarse de un descenso total de los grupos -8H (reactivos y en mascaradas) como consecuencia de una degradacin si el calentamiento es butante intenso. Por consiguiente, nos encontramos aqu
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298

Ffslca y flslcoqufmlca. El ectos de loa tratamientos tecnolgicos

en el lmite de loa fenmeno de detnaturalizacin y de descompo alcin. La aparicin del aabor a cocido te desarrolla paralelamente a laa anteriores modificaclonet. El cido tulfhdrico es reaponaable en parte de este defecto , y puede determ.inarae por cromatorafa en fue gueoaa del u que te encuentra por encima del lquido en un recl piente cerrado. Se halla en cantidades apreclablea, tru un corto calentamiento hacia loa 80 C, y tambin al cabo de laro rato a 70 C. El origen del cido IUltbdrlco y de otroa compueatoa llllfuradoa te debe a la descomposicin de la ciatena.

El El complejo -rne ,-lec1oglobullne Entre los complejoa que ae ban citado anteriormente, ste ea el ms
intereaante. Un destacado efecto del calentamiento. cuando la cuena se en cuentra en presencia de la 11-lactolobulina, es la formacin de un complejo que te comporta como una auttancia homognea y en el cual aparecen modificada las propiedades de la cuena ; el poder estabiti:rante frente a laa cuenu sensibles al calcio te teduce considerablemente y el tiempo de coagulacin por el cuajo aumenta. El complejo 111 forma nciu a loa rupoa tulfhidriloa librea de la tl-lactoglobulina desnaturalizada, que enlazan con loa de la casena. Si se adiciona, antes del calentamiento, un reactivo como la N~tilmalei mida (N .E.M.) que bloquee loa grupos """\9H, el complejo no se forma. Este complejo tiene un efecto protector sobre las micelaa y se for ma en la leche lo miamo que en las soluciones de protenaa puras. Es posible que la reaccin de formacin del complejo sea incompleta e irrevenible cuando la cantidad de calor auminlatrada sea insuficiente. Esta condicin podra existir en la esterilizacin U.H.T., lo que explicara un fenmeno de deteatabUizacin lenta, del que hablaremos ms adelante.

XVIII DEGRADACION TERMICA DE LAS PROTEINAS


Aspecto gloiMII Las degradaciones, que explicaremos ms adelante, tienen conaecuen ciaa sobre las propiedades de laa cueilal. Loa siguientes efectos po nen en evidencia modificaciones en el estado de las cadenaa latezalea de loa aminocidos, que inte.rvienen como puntos de fijacin (Lorient y Alaia, 1974).
l. Disminucin de la sensibilidad a loa iones calcio de las casenas n, y p. La proporcin de nitrgeno soluble (no aedimentable ) en fun. cin de la concentracin de Ca., ea m$s elevado tras calentamiento a

Al

Fisica y fisicoqulmlca.
Efectos de los tratamientos tecnolgicos

299

120 e que antes. Con la casena ll calentada se observa una irregula ridad en las curvas, es decir, un mnimo hacia 15 mM de Ca. 2. La capacidad de fijacin del calcio se reduce, tras calentamiento a 120 C; de una forma regular con la casena a , e irregularmente con la casena . 3. La capacidad de fijacin de un colorante cido, como el negro amido, se reduce para la casena ll y no para la casena a,. Anteriores experiencias haban mostrado el descenso global de la capacidad de fijacin de las protenas de la leche calentada (lo que hace aleatoria la aplicacin a la leche esterilizada del mtodo de determinacin de protenas por el negro amido ). La prdida de puntos cidos, principalmente fosfricos, y la modi ficacin de puntos cargados positivamente, explican los apartados 1, 2 y 3. 4. La electroforesis en gel revela una debilitacin progresiva de la coloracin de los componentes de la casena y la aparicin de fraccio nes poco mviles. La banda de la casena desaparece completamen te tcaa un calentamiento durante 80 mln a 120 C. 6. El poder estabilizante de la casena disminuye tras el calenta miento; se vuelve cada vez menos capaz de impedir la precipitacin de las otras casenas por el calcio. 6. Las determinaciones por titulacin, antes y despus del calenta miento, ponen de manifiesto un aumento de los grupos ionizados (cidos y bsicos). Ms adelante se ver una explicacin de este fe

n6meno.
8) Degradacin de las cadei18S peptdicas

Un medio para apreciar el alcance de la degradacin es la determina cin de las sustancias solubles en el cido tricloractico (o en oteo reactivo de las protenas); pero, desde luego, de esta forma slo se tienen en cuenta una parte de Jos fenmenos de la degradacin. El cuadro 38 muestra los resultad011 de experiencias exploratorias sobre el nivel de liberacin de nitrgeno (NPN) y de fsforo (NPP) no proteicos en diferentes condiciones de calentamiento de las pro tenaa de la leche. A partir de los 100 e, si la duracin del calenta miento es bastante prolongada, puede apreciarse analticamente una degradacin. Lot valorea de NPP son siempre superiores a los de NPN. En las condiciones (1 h a 135 C 3 h a 120 C) en que solamente se libera del 15 al 26% del nitrgeno, se aprecia una desfosforilizacin total de la casena entera. Tambin se libera una gran parte del cido silico. Estudios sistemticos realizados sobre laa casenas a, y 11, y com prendiendo, adems de las mediciones de NPN y NPP, la del nitrge.
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300

Flslca y flslcoqulmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

Cuadro 38. Liberacin de nllr61eno y de f6tforo en el curao del ca


lent4mlento de lae prote(noe (1 ).
Protelnu (2) Telllao

AumoDto tru el calentamiento


1 h/100 lOmiD/Jl0 1,26 9,00 1,14 14,35 2,7 9 ,5 0,9 7,5 1,45 2 miD/140

Cuelno entera Cuolnu Clllonoa, Cuoinajl


Protonu solubles (totales)

0,60 1,80 0,90 2,95 0 ,7 2,1 0,8 1,8 3 ,7

1,35 8,60 1,11 9,15 0,.90 S,SS

O .S -

0,32

0,67

0,4S

0,83

0,72

(1) Nitrpno y fsforo (en nearita) 10lublos en el 12% de icido triclorac:6tico, en porcent.es del nitr6aeno y del fsforo proteico. (2) Solucin al 1% y pH 6,7 . Sean Allis y colab. (1966), y L<n1ent y Alais (1970).

no (NCN) y el faforo (NCP) no cuenico (aolublee a pH 4,6), han dado loe eiguientee reaultadoe: l. La d~adacln vara exponencialmente wn la temperatura de 100 a 140 C plll1l tiempos comprendldoe entre 10 y 80 mln; el Q10 de la liberacin de NPN ee cercano a 2,8. L1i caaena a, ea claramente ms frgil que la cuena ji, ya ae trate del nitrgeno o del f61foro. 2. La liberacin del nitreno (NPN y NCN), a una temperatura fi jada (120 C), 81 cut proporcional al tiempo de calentamiento, mien traa que la liberacin de flforo ae realiza a una velocidad que no 81 coDitante, ya que 81 rpida al principio y lueco decrece reularmente (figura 66 ). 3. El fsforo liberado de la8 doe cuew no ee encuentra completamente en forma mineral (ortofoefato), pu81 NCP ea 1iempre IUp&rior a NPP; probablemente ee libera rpidamente al principio, en forma de grue101 pptidoe aolublea a pH 4,8, que d81pua aon dea foatorilizados ms lentamente. 4. La liberacin de NPN, en funcin del tiempo, ea una reaccin de primer orden. Laa conatantea termodinmicu aon prxlmu para las dos caeew. La variacin de entropa ea pequea en relacin con la

Flslca y flslcoqulmlca Efectoe de toe tmamientoe tecnolglcoe

301

que 18 produce en lu reaccione~ de dematur.l.lzacln de lullobulinu, pero no detpusvble. Lee molculu de 1M CMenu cr, y 11 parece IUfrir modificaciones en au conlonDKin. 6. CUando ee deva d pH ee Incrementa la d.ecr-<!acl6n, pero existe una zona de mayor eltabilldad bada pH 6,7 (pH normal de la leche). 6. La cifra media de rupturu de enlacet peptdlcoe es butante be ja, dd orden de 2 por moWcula en la caeen.a cr, y de 1 en la caeefna ll aunque ee debe tratar de rupturu de etcaeo rendimiento, porque d nmero de pptldoe libe.r .doe (aepa-'oe por CtOmatop-afa) et elevado. ' La caeena et un cuo ..pecial; antes de que ae produzca una depoadacln marcada ee obeerva la ptWencia, en latolucln calentada a 120 e durante 20 mln, de un pptldo parecido al cuelnopicopptldo Hbenldo por la qulmoeina. El enlace que relaciona ..te pptldo con la puacaeena debe aer tan aenalble al calentamiento como a la accin de lu proteaiu co.,w.ntee.

o,

30

20

----10

.---.. - ......---~

--- -(NPN) ~

..

'

20

40

Mlnutoe

120

,..,. M. liberacin del nllrgeno (NPN) y del fsforo (NPP) t n funcin do lot llempos do colantomltnto de las C~Minas a, y ' (aoluclonos ol 2%. pH 8.8) (lorltl y Attls. 1974).

302

Flsica y fisicoqulmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

Cl Modificacin de las cadenas 18181'ales de los eminocidos Solamente hay rupturas de los enlaoes peptdicos o de los ste- fos fricos que intervienen. En el curso del celi!Jitemiento de las protenas en solucin, se producen divel'888 modificaciones ms o menos degradantes. Felizmente, en las condiciones habituales de los tratamientos trmicos aplicados a la leche, y a un valor de pH tm poco In ferior a 7, estas modificaciones son en su mayor parte bastante Jimi. tadas. Sin embargo, es interesante conocer su naturaleza.
l. Desamidacin, desamlnacin, descarbo:cilacin La desamidacin de la glutamina y de la asparagina se origina a temperaturas no muy elevadas (120 oC y superiores); al mismo tiempo

se produce un aumento de grupos caig&dos: -<:00- y NH: , lo que explica, con la rotura de los enlaces peptdicoa, la modificacin de las curvas de valoracin antes sealada. Con tratamientos trmicos ms enrgicos es posible la prdida de grupos - NH2 laterales, y lo mismo la descarboxilacin de loa dicidos, pero es poco prohable o de escaaa entidad en el caso de los tra temientos de los productos lcteos. Sin embargo, el triptfano, en posicin terminal o en estado libre, es frgil, y en medio cido da origen a la triptemina tras descarboxilacin.
2. Desulfuracin y des{os{orillzacln. Formacin de lisino-alllnina El fenmeno de ~-eliminacin, con formacin de dehidroalanina (DHA) -NH-c-o-

CH, se produce a expensas de la serina-fosfrica y de la cistena (con liberacin de H, S). Un medio alcalino favorece la degradacin, sobre to do en el caso de la ciste na. La molcula de DHA es lbil y permite el establecimiento de puen tes covalentes. La lisino-alanina (LAL) se forma de esta manera por condensacin espontnea con la Iisina. El nuevo enlace constituye un bloqueo de la lisina, aminocido esencial, y es muy resistente, aun en las condiciones de hidrlisis cida, que libera LAL, sin romper este enlace. Calentando a 120 oC la casena a, se observa la formacin de la LAL incluso en medio neutro. Se trata, sobre todo, de una ligazn in tramolecular. El enlace entre dos molculas diferentes se establece di f cilmente. Aparte de la indisponibilidad de la lisina y de la cistena, que en ocasiones son factores limitantes desde el punto de vista nutritivo, se
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Ffsfca y ffslcoqufmfca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos


o~

303

que la LAL tiene un efecto txico en la rata a nivel del rin, pero loa rlelgoa para el hombre parecen eer d'bilet.
Enlo~

S.

llopeptdlco

Se ettablecen entre el grupo lateral aminado de la lisina y loa grupos


amida de la sJutamlna y de la asparagina, en medio neutro y en el curiO de un enrpco tratamiento trmico (120 C O ms). Aunque son de la mlama naturaleza que el enlace peptdico normal (--<:0-NH-), loa enlace. laopeptdicos resisten a la ma,yor parte de lu pro teuas, quedando bloqueada la lisina.
Nota.- S. ban ob10rvado ouu modlficacloneo, pero on condiclonoo que atln no 11 encuentran actualmente en 1u induatriu licteu 1 como el tratamiento tr~ mico on modio alcalino: oxldocl6n de la metloollla, loomerizaci6n dolo Lloucllla (en alo-loolouclna) y do la Llioina en O.lioina, otc. - En ta l~he calentada. y lo miano en el Jacto.uero ... producen reaccione& do coodo-16n ont.o loo III'\IPOO amln&doo do loo protefnu y do loo lfOcidoo roduclorw, quo DOY&D o rucdoneo de Maillanl, deocrltu on el captulo dedicado ola !ocio&

XIX EFECTOS DEL CALENTAMIENTO EN LA SUSPENSION MlCELAR


Modlflceclones entas de la floculaci6n Antes de producirse la floculacin se pueden obtervar modificaciones en la suspensin mloelar. Un calentamiento de la leche limitado a 100 e, pero prolongado durante SO a 60 mln, provoca la formacin de agregados de elevadas masas moleculares. La aparicin de apndl oes filamentoeos, visibles al microscopio electrnico, se obterva a temperaturas ptximu a 100 C durante 10 a 20 mln; como los reac tivoa de los puentes diaulfuro impiden la formacin de estos apndi cea, ea posible que estn constituidos por lllactollobulina. Paralelamente a eate fenmeno de agregacin, debe existir tambin una diepersin de una parte de las mioe.las, porque la proporcin de casefna "aoluble" (no sedimentable) aumenta tras un calentamiento a ms de 100 c. Esta casena soluble parece aer ms rica en casena" que la que permaneee en forma mloelar. Para algun01 autores, la agregacin precedera en el tiempo a la desagregacin . 8) Floculaci6n Constituye un problema de gran importancia desde el punto de vista tecnolgico y adems misterioso desde el punto de vista cientfico; porque si bien todas las protenas de todas las leches pueden sufrir las modificaciones que hemos descrito, se observa, sin embargo, que to-

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304

Flsica y fisicoqulmlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

das las leches de una IDBma raza no tienen eliDBmo comportamiento, que las leches de razas diferentes son menos homogneas y que las de especies diferentes lo son an mucho menos. Las leches de cabra, de oveja y de burra son ms inestables que la leche de vaca en el cuno del calentamiento. Esto puede concebiue en razn de las diferencias de compo.slcin conocidas. Por el contrario, ea difcil explicar por qu la leche de vaca se distribuye en varios tipos cuando se estudia la evolucin del tiempo de floculacin en fun. cin del pH. De hecho, la existencia de tipos bien definidos, en !uncin del criterio anterior, an se discute. Sin embargo, varios autores, entre loa numerosos que han tratado el difcil problema, admiten la existencia de dos tipos. En el tipo A se observa un mnimo de estabilidad hacia pH 6,8; en el tipo B, la curva t!/pH ea continua; cuanto ms se eleva el pH (lo que se acompaa de un aumento de las caras ), ms se alarga el tiempo de floculacin de la leche Cllientada a 130-140 C. Es lo que se muestra en la figura 57.

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40

30

20

6,8

7,0

pH

F!gu111 S7.,:volucin del l iempo de tloculacin {ti) de la leche a140 'Cen funcin del pH {segun Sweetsur y White. 1974).

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Electos de loe tratamientos tecnolgicos
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Otroa ttabaj01 indican que la curva continua (B) slo ae obaerva en el cuo de la caaena micelar aislada , en a111encla de protenu del suero y de !Olfato de calcio. En la leche completa habra rerularmente UD mblmo de eatabilided hacia pB 6,5-6,7 y UD mnimo hacia pB 6,75-6,85. El mnimo correspondera a la formacin de un depsito de fosfato clcico aobre las grandes micelu, que flocularan ms r pidamente, pero no ea correcto relacionar eate aapecto con el hecho de que la adicin de casena K a la leche auprlme eate mnimo y que la reduccin del porcenteje de casena K lo acenta. La deafoaforiliza cin de la c:aaena a,, que la vuelve ms termolbll, interviene proba blemente en el descenso de estabilidad hacia pH 6,8. Un punto importante es que existe una zona muy aensible, entre pH 6,5 y 7 ,0. La grfica de la figura 58, con un mximo y un mini mo muy pronunciados, no representa, sin duda aluna, a todo el con junto de lu leches, pero ea interesante porque el razonamiento que ha llevado al autor a esta representacin parte del postulado de que Jos valores del pH al mximo y al mnimo de eatabUidad aon caractersticu de una leche, y de que estos valorea son deapluadoa por determinadot ttatamientos.
C) El problema de la esrabilidad de las leches Clllenueles La determinacin directa del pH o de la acidez no dan una indicacin eucta aobre la estabilidad de la leche, por lo menoa en la zona no~ mal de pH. Segn hemos visto, una leche con un pH 6,75 parece ser

menos estable que una leche con un pH 6,5. El ajuate del pH puede ser necesario para asegurar el mximo de estabilidad. En ciertos casos, para estabilizar la leche es suficiente una J.lgera adicin de cido; el miBmo efecto se obtendra mediante adicin de cloruro clcico, porque esta &al acta, sobre todo, rebajando el pH. El ion Ca no tiene por s solo ms que un efecto mnimo; desplaza J.lgeramente el pH de la mxima eatabilidad hacia el lado alcalino, mientru que loa fosfatos tienen un efecto opuesto. El "p~entamiento" es un ttatamiento trmico destinado a eatablllur la leche, antea de aplicar otroa tratamientoa , como la concentracin y la esterilizacin; &U efecto ea doble : l. Favorece la formacin del complejo c:aaena K /1!-lactoglobulina. 2. Provoca un descenso del pH de mxima estabilidad y del pH de la leche milma, porque varias modificaciones se aoompailan de la liberacin de Iones H". S se impide la formacin del complejo precedente por adicin de N.E.M., la curva pierde su mximo y mnimo caracterstioos; ae obtiene la curva bale, en la que la estabilidad es constante y dbil, desde pH 6,5 a pH 6,8.
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Electos de los tratamientos tecnolgicos

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pH
~Url 58. Curvas de 11oculacin durante el calentamiento en funcin del pH de la leche.

Leche cruda de concentracin media Leche precalentada durante 10 minutos a 120 N.E.M .: leche tratada por la N-elllmalelmida (3m M).
(Segn Dyson y Rose. 1963)

En el CUlSO de la concentracin de la leche, que se efecta a temperatura relativamente bsJa (60 e y menos), es muy posible que no se forme el complejo. Por este motivo, el precalentamiento tiene un efecto estabilizador sobre la mayor parte de las leches concentradas. La curva de estabilidad se modifica igualmente cuando se elimina parcial o totalmente el fosfato de calcio coloidal (ligado a las micelas de casena); el mnimo desaparece y la ettabilidad aumenta considerablemente. Este componente mineral de las mlcelas tiene, por tanto, un papel en la estabilidad. El contenido en extracto seco total influye en la estabilidad. Las leches concentradas por calentamiento al vaco muestran una estabilidad reducida (figura 55); pero a la influencia de la concentracin se
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Fsica y fisicoqulmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

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aade la del deacenso del pH. Parece que las proporciones relativas de los derentes componentes no tienen efecto notable sobre la estabi lidad, y existen pruebas de que una pequea proporcin de casena en el extracto seco total sea la causante de una disminucin de la es labilidad. Esta observacin es vlida igualmente para las sales solubles y para los iones. La teora del "equilibrio salino", segn la cual la concentracin relativa de derentes iones determina la estabilidad de la leche, ha servido de base para un sistema de regularizacin de la fa bricacin de leche concentrada; sin embargo, siempre ha sido discuti da. La adicin de diversas sales a la leche antes del calentamiento (fosfatos, citratos y sales de Ca) tiene efectos variables en los lmites del pH de la leche normal. Finalmente podemos concluir que existen dos puntos fundamen tales: - El pH influye en la formacin y eficacia del complejo casena K /lllactoglobulina, el cual asegura una proteccin a las micelas, aunque solamente dentro de lmites reducidos de pH. - El estado de la superficie micelar parece tener un papel impor tante, a causa, por una parte, de la formacin del complejo y, por otra, de la absorcin de iones calcio y fosfato, o de fosfato de calcio y otros iones en proporciones convenientes. La natura leza de la capa superficial, que determina la carga e hidratacin de las micelas, parece influir directamente en la estabilidad. La influencia de las sales solubles aadidas a la leche se reduce so bre todo a un cambio del pH; la influencia de ste se debe a que determina la formacin del complejo y afecta al equilibrio de los iones e, indirectamente, a las propiedades de la superficie micelar.
D1 La gelificacin de las leches esterilizadas mediante tratamientos ulrmicos rpidos a alta temperatura

Se produce sobre todo en las leches concentradas, pero es un acciden te que se observa tambin en las leches normales esterilizadas por el procedimiento UHT (140150 e, 1 a 3 segundos), por lo menos cuando no se ha aplicado un tratamiento trmico previo suficiente para favorecer la formacin de los complejos protenicos. El espesa miento y luego la gelificacin se desarrollan lentamente en el curso de la conservacin; en las leches UHT pueden no aparecer hasta pasados 2 6 3 meses. Se han invocado varias causas:

l. Protelisis limitada originada por la proteasa nativa de la leche, que llevara a una coagulacin comparable a la provocada por el cua jo; sera preciso evidentemente q ue esta proteasa no fuese inactivada completamente por el tratamiento trmico, como se ha demostrado (captulo VUI) o que hubiera una reactivacin.
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Efectos de los tratamientos tecnolgicos

2. El mismo fenmeno pero con las proteasas microbianu. Se ha demostrado que microorganismos aicrtrofos, caractersticos de la flora de las leches conservadas en depsitos a beja temperatura, producen una proteasa termorresistente que sobrevive a loa tratamientos UHT y puede provocar en la leche la l{elificacin y la aparicin de sabor amargo. Todas las cepas de bacteriallicrtro{tU aialadas de loa productos lcteos tienen la curiosa propiedad de producir proteaaas resistentes al calor, aun por encima de los 10 s a 140 c. Estas proteasas son activas a temperatura ambiente sobre la casena, y loa componentes K y {J son los ms atacados, segn las cepaa; las protenas del suero son poco o nada hidrollzadas. Aun con pocos grmenes productores de proteasas (10.000), la protellsis ea notable. Un hecho que resalta es que el mantenimiento prolongado a una temperatura ms baja que la anterior, por ejemplo 60 min a 60-66 e, provoca su inactivacin . Se ha demostrado que hacia 66 e existe una tranacin de conformacin, con prdida de la actividad proteoltlca. 3. Proceso puramente fiSicoqumico inducido por el calentamiento: formacin de puentes covalentes entre las cadenas peptdicas de las protenas, o modificaciones variedas de conformacin molecular (en especial por reacciones comparables a las de Malllard, con los azcares) que permiten la unin de las micelas. La microscopia electrnica muestra que los tratamientos trmicos enrgicos deforman las micelas, y algunas imgenes pueden ser Interpretadas como una fibrilacin. Sin embargo, en lo que ae refiere a la gellficacin l<>'lta de las leches esterilizadas UHT, la expllcacin bioqumica es la ms aceptable.

XX EFECTOS DEL CALENTAMIENTO SOBRE LAS ENZIMAS


A) Temperatura ptima Es preciso tener en cuenta dos nociones: l. La velocidad Inicial de la reaccin enzimtica aumenta con la elevacin !le la temperatura, como en la mayor parte de las reacciones qumicas. Se puede trazar una curva de activacin velocidad/temperatura, de forma parablica, en la que la parte correspondiente a las ms altas temperaturas es hipottica a causa de la ampllficacin del segundo fenmeno. 2. La elevacin de la temperatura provoca 1a dematuralizacin de la protena correspondiente de la enzima, y ae vuelve notable a partir de los 46 o e para muchas enzimas. La temperatura ptima de actividad de una enzima es aquella en que loa dos efectos se equilibran. La actividad propia de la enzima no disminuye ms all de esta temperatura; lo que disminuye es la cantiCopyngh ed r atonal

Flsica y fislcoqulmlca.

Electos de loa tratamientos tecnolgicos

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dad de la enzima activa. La temperatura ptima vara con el pH y la compoocin del medio. Para un f1nU1 nmero de enzimaa, la tempe ratura ptima se sita hacia 80-40 C. Ea una caracterstica menos significativa y menos preclaa que el pH ptimo. B) lnac:tivaci6n y reactivacin de enzimas En el captulo vm se han dado dato. partlcularea aobre cada enzima , en lo que ae refJere a au desnaturalizacin en la leche por el calor. Por orden de reaiatencia creciente se pueden clasificar u :
l. Enzlmoa termo/4blk (deatruccin por debajo de 60 30 min)

e durante

- aldolaaa 45 cao min -o..amilaaa 50 - Llpoprotenalipaaa 55 2. Enzima. poco termorre1t.tentes (deatruccin por encima de 60 e durante 30 min)

62 cao min (72 " C{l5 s) 70 70 (80 " C/15s) 70 70 3. Enzima termorre1tente (destruccin por encima de 90 "C)
foe!ataaa alcalina catalasa peroxidua proteua (plaamina) xanti.n a oxidaaa - fosfataaa cida - ribonucleaaa -lisozima

Las diferenciaa de sensibilidad al calor aon por lo tanto muy consi derablea de una enzima a otra, pero hay que subrayar que la sensibili dad depende de las condlcionea del medio:
a) El pH puede constituir un parmetro importante ; aa, la ribonu cleaaa conserva su actividad a pH 3,5, trae un calentamiento de 20 min a 90 C, mientras que a pH 7 ,O y a esa temperatura se des naturaliza rpidamente. b) La concentracin de loa ionea. Por ejemplo, la termorreaistencia de la fosfataaa alcalina aumenta en la leche privada de sus iones (por di.liais contra el agua). e) Las protenas del medio tienen un papel protector. d) Las enzimas desecadas reaiaten , en general, muy bien el calenta miento a 1()().150 c.

310

Flsloa y fiscoqulmica. Et~s de los tratamientos tecnolgicos

En la leche esterilizada clsica han desaparecido todas las actividades enzimticas. No ocurre lo mismo en lo que se refiere a la leche UHT (140-150 c0,5 a 2 s), en la que pueden apreciarse varias actividades correspondientes a estos dos fenmenos: - actividad residual notable; a pesar de las elevadas temperaturas de tratamiento, la enzima slo ha sido parcialmente destruida. Por ello, en una leche esterilizada, tras un calentamiento de 0,7 s a 145 e, se encuentra an en la leche una actividad protesica del 50%, y el 100% de la actividad ribonuclesica iniciaL - Reactivacin de la enzima: tras el tratamiento, la actividad enzimtica es nula; en el curso de la conservacin reaparece la actividad, aunque lo corriente es que sta no rebase ellO%. El mecanismo de la reactivacin an no est bien aclarado para todas las enzimas que presentan este fenmeno de reversibilidad limitada. Los grupos -t>H deben con frecuencia tener su papel, ya que en el curso. de la desnaturalizacin trmica son desenmascarados, y los reactivos de estos grupos, en especial los metales pesados que los bloquean, impiden la reactivacin, es decir, el retomo a una estructura espacial compatible con la actividad. El caso de la fosfatasa alcalina ha sido bien estudiado en lo que se refiere al papel de los metales. El calentamiento provoca una migracin de los iones indispensables: Mg y Zn. La adicin de ion Zn tras el calentamiento remetaliza la enzima, y el ion Mg estimula la enzima renaturalizada. La presencia de sustrato parece esencial en el proceso de renaturalizacin. Cuando la energa es suficiente (temperatura bastante elevada durante cierto tiempo), la destruccin de las estructuras espaciales es demasiado seria para que pueda producirse la reactivacin.

XXI EFECTOS DE LAS RADIACIONES


Se pueden distinguir dos tipos de efectos:

l. Efectos totoqumicos: La energa de activacin de las molculas, que hace posible las reacciones qumicas, puede proceder de la energa aportada por las radiaciones luminosas. Segn las teoras modernas, la energa radiante se reparte sobre la onda luminosa en partculas sin masa,llamadas "fotones", que transportan una cantidad de energa proporcional a la frecuencia de la radiacin. En la prctica, suele emplearse la longitud de onda para definir una determinada radiacin; la energa es tanto mayor cuanto menor es la longitud de onda. En la luz solar, las radiaciones violeta y ultravioleta son las ms eficaces; las radiaciones rojas e infrarrojas no
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Flalca y flslcoqulmlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

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aportan auflclente enet~a para provocar reacciones fotoqumicas. Exilte un umbral fotoqumico por el cual una reaccin dada no se produce m que por debajo de una longitud de onda defmida. Igualmente ea necetar:io, para que la reaccin se produzca, que la molcula pote& un apreciable poder de absorcin de la radiacin conaiderada.
2. Efector loni%ante1 Lu radiaciones perticulares o electrnicas (rsyoa ~.rayos catdcoa, etc.), ul como tu electromanticaa de ml.l)' corta lonitud de onda (rayos ., , an m ricos en energa que los ultravioleta) provocan la Ionizacin, es decir, la formacin de Iones por arrancamiento de electronee a loa tomos de tu molculas que son toeadu como 11 fuesen blancos. Sluen a esto modificaciones moleculare1 diversas; tu m importante&, en la prctica, afectan a las grandes molkulaa de tu nucleoprotenas, que constituyen lu partes esencialea de las bacte.rias presente& en el medio irradado. Volveremos sobre esta cuestin cuando se estude el saneamiento de la leche. Pero 1aa radiaciones lonlzantes tienen tambin una accin aobre el medio, cuya intensidad depende de au energa. Esta accin es comparable a la de los ultravioleta. Loa efectoa de la luz solar y de los rayos ultravioleta son los mejor conocidos en el caso de la leche, y pueden resumirae uf: a) Activacin de !u reacciones de oxida. in (que pueden ocunir c en la oscuridad): oxidacin de lipidos y de 1aa vltaminu A, C, D y E; b) Destruccin de las vitaminas poco senaiblea a la oxidacin, como la vitamina B, (ribofiavina); e) Traneformacin de esteroles biolgicamente Inactivos, en vitamtna O; d) Catllsle de las reacciones entre molculu nitrogenadas que no constituyen reacciones clicu de oxidacin. Lo que se denomina en ingls 80/ar-octluated {lavour (que podra traducirse por "ubor 10lar"), es la consecuencia de es1aa reacclona. La sustancia responaable es el metional formado a partir de la metionina, aminocido que puede prooeder de diversas protenas de la leche, con intervencin de la n'bollavlna. El bor caracterstico aparece con 0,1 p.p.m. (parte& por milln, ma/1) de metional . La glicoprotena mencionada en el captulo VI (protena menor) ea la sensible a la luz y da el mlamo aabor caracterstico.

El erecto e) es el nico beneficioso, pero como no se produce aisladamente, en la prctica debe siempre evitarse la expoelcl6n de la leche y de loa productos derivados a la luz; ll!icamenta, el criatal claro debera eatar proscrito para el envasado de la leche.

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Flsica y fislcoqulmica. Efec1os de los tratamientos tecnolgicos

La destruccin de las vitaminas B, y C es rpida en la leche envasada en vidrio claro, expuesto a la luz solar dlrecta al medioda; al cabo de una hora, la prdida se acerca al 40% para la B, y al 95% para la C. En envase opaco, en las mismas condiciones, no hay deslruccin. La vitamina A ea menos sensible que las anteriores, pero en la leche esterilizada. que sufre una larga conservacin y que no se mantiene en completa oscuridad, las prdidas son considerables a las dos semanas. La radiaciones ionizantes ejercen, asimismo, una accin oxidante, que tiene como consecuencia una modificacin del sabor y una accin destructora sobre las enzimas y vitaminas, especialmente las vitaminas E y H.

XXII LOS EFECTOS DE LA HOMOGENEIZACION La homogeneizacin industrial es un tratamiento que se utiliza fundamentalmente con dos finalidades: - Estabilizacin de la emulsin de la materia grasa de la leche para evitar la separacin de la nata por la accin de la gravedad. La fase dispersante es la leche desnatada. - Estabilizacin de la cuajada lctea, muy hidratada, para obtener una pasta fina y homognea. La fase dispersante es el suero . Los efectos de la homogeneizacin son mltiples cuando la presin es elevada; sta acta solamente sobre los glbulos grasos. Debe tenerse en cuenta la e.nerga de frotamiento que se desarrolla y la elevacin de temperatura que se produce, muY sensible a nivel de las vlvulas del homogeneizador. l. La reduccin del dimetro de los glbulos gra&os constituye el principal efecto. Los glbulos grasos se rompen y una parte de su membrana se dispersa. Una homogeneizacin eficaz reduce su dimetro medio de 4-5 a 1 micra. El aumento de la superficie interfacial es una de las causas de la modificacin de las propiedades de la leche homogeneizada. Si la concentracin de la materia grasa no es muy elevada, la emulsin se vuelve muY estable, no se producen capas ni tapones de nata. La influencia del contenido de materia grasa es factor fundamental, hecho que ya se ha indicado en el estudio del desnatado (cap. V, ap. XV). Pero tambin influye el estado fsico de los lpidos. La homogeneizacin de la leche fra, en la que los lpidos se encuentras cristalizados, es poco eficaz; por esta razn, la operacin debe realizarse a so c.
2. La modificacin de la membrana es una consecuencia de la multiplicacin de los glbulos grasos; tericamente un glbulo de 5 micras se subdivide en 125 glbulos de 1 micra. Los nuevos glbulos no Copy nghtC'd m aten al

Fsica y fisicoqumica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

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pueden estar recubiertos completamente por los componentes de la membrana original; por ello se forma una pelcula de absorcin a partir de laa protenaa plaamticaa, sobre todo de la casena. La fraccin proteica de la membrana aumenta uns 4 veces y se eleva del 0,6 al 2,4% la materia grasa. Probablemente se produce un desplazamiento parcial, en sentido inverso, de loa foafolpidos que pasan al plaama. Esta puede ser la causa de la disminucin de la susceptibilidad de la grasa a la oxida cin, inducida por el cobre, al reducirse el nmero de puntos activos. 3. La estructura de las proteMs se altera durante la homogeneizacin a alta presin. Puede tener dos efectos: uno, el frotamiento, que acta principalmente sobre las micelas, y un efecto de desnaturalizacin comparable al del calentamiento. Tras la homogeneizacin de la leche se observa una reduccin del nitrgeno casenico y un aumento de la fraccin separada con las proteo888-peptonaa. El descenso de la tensin de la cuajada, formada por accin del cuajo, que se observa en la leche homogeneizada, probablemente se debera a una modificacin de las micelas. El aumento del nmero de glbulos graaos, que dan origen a "puntos dbiles" en la estructura gelificada, no puede explicar por s solo este fenmeno, sobre todo cuando la falta de consistencia de la cuajada va acampa ada de una mayor humedad. Posiblemente, la alteracin de las micelaa debe provocar un aumento de la hidratacin de la caaena. Debe sealarse que se han obtenido resultados diferentes traa la homogeneizacin a alta presin utilizando una vlvula especial (cap. XXI). Probablemente, en el curso de la homogeneizacin se forma un complejo entre la caaena y el glbulo graso, por medio de fuerzas no polares, que originara una activacin de la casena micelar. Se ha observado que la retencin de la materia grasa es mejor en la cuajada obtenida por coagulacin mediante el cuajo cuando la leche ha sido homogeneizada, al igual que ocurre con la leche concentrada. En este ltimo caso se ha demostrado la unin micela-glbulo con el enlace de la casena K y de un componente de la membrana globular. Puede pensarse que la desnaturalizacin del factor aglutinante es la causa real de la prdida de aptitud para el "desnatado", y por consiguiente de la estabilidad de la emulsin. La adicin a la leche homo geneizada de una aglutinina fresca induce de nuevo la formacin de masas de glbulos grasos que se separan por gravedad. 4. Efectos secund4rtos. A veces son de difcil expUcacin; por ejemplo, el aumento de la viscosidad, hecho al que ya nos hemos referido, aunque no ha sido observado por todos los autores, probable mente a causa de diferencias en las condiciones experimentales, ya que dependen de la presin. Como consecuencia se modifica el sabor de la leche, que parece ms dulce, tiene ms "cuerpo".
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Flslca y fislcoqulmica. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

Por el contrario, la mayor opacidad de la leche se explica por la multiplicacin de las partculas que provocan la reflexin de la luz incidente. La mayor fragilidad de la leche homogeneizada, en lo que se refiere a la liplisis y a la pululacin de las bacterias contaminantes, se produce, por una parte, por la activacin de la lipasa por efectos de la agitacin y, por otra, a causa de la destruccin de las aglutininas . Es un hecho comprobado que la leche homogeneizada tiene una "calidad de conservacin" inferior a la de la leche sin homogeneizar, pero en el caso de la liplisis se puede impedir esta alteracin mediante una pasterizacin conveniente.

XX II I PROPIEDADES ORGANOLEPTICAS
A) Generalidades La definicin del olor y sabor de un producto natural complejo, como la leche, es muy difcil, ya se trate del olor y del sabor normales o de olores y sabores anormales. En el lenguaje corriente, la palabra "sabor" se emplea corrientemente para designar las dos sensaciones simultneas, como la palabra inglesa "flaoour" (1). La apreciacin de estas sensaciones vara grandemente segn los individuos, a causa de diferencias importantes en la agudeza de los sentidos. En los ltimos aos se han realizado notables progresos en la qumica de los olores y sabores, en especial gracias a la cromatografa en fase gaseosa completada por la espectrometra de masa. De esta forma se han identificado sustancias spidas muy numerosas, presentes en pequeas cantidades. Muchos de los componentes importantes (desde el punto de vista del sabor) de los productos lcteos tienen un punto de ebullicin comprendido entre 100 y 200 C y su aislamiento es bastante fcil. Entre ellos se encuentran los compuestos carbonlicos, responsables de los sabores oxidados. Desde hace algunos aos se intenta completar el inventario de las sustancias olorosas de la leche y de sus derivados, estudiando la fraccin ms voltil, hecho que plantea problemas, ya que no se pueden utilizar los disolventes orgnicos ligeros. Los trabllios ms slidos en esa direccin se han orientado principalmente al estudio de la mantequilla y del queso Cheddar. Hay que tener en cuenta, ain embargo, que las sensaciones producidas por la leche normal o las leches con sabores defectuosos no se traducen simple y claramente mediante los picos de los diagramas cromatogr-

(1) El Uinnlno "flavour" "*utilizado, en la actualidad, por loaespeclallolu franceaea para det'anar el conjunto de een.ueionea eonespondientea al guato, decir, lu producidu por t:l sabor y olor.

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Ffslca y fisfcoqumlca. Efectos de los tratamientos tecnolgicos

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ficos. El sabor es una "respuesta integrada" y loa integradores se encuentran en la nariz y en la boca. La evaluacin de las propiedades sensoriales exige a la vez el desarrollo de mtodos microanalticos y el de tcnicas de apreciacin seguras y reproducibles. En la actualidad son precisamente las ltimas las que faltan. La naturaleza altamente subjetiva de la valoracin de los sabores por los hombres es causa de desnimo para muchos investigadores. Sin embargo, no podemos pasar por alto las pruebas sensoriales presentadas por Panghom y Dunkley (1964), dado su inters, y que no es posible desarrollar aqu. En Francia, donde el consumo de leche natural es muy limitado, no se preocupan del problema de la obtencin de leches de buena calidad organolptica. Por el contrario, es una preocupacin esencial en los pases donde la leche suele consumirse pura y fra, y donde se aplica a la leche cruda una pasterizacin a temperatura relativamente baja, lo que permite conservar su sabor natural; as ocurre en los pases anglosajones y escandinavos.

Bl La leche fresca y "normal"


Entre los principalescomponentes de la leche, los sabores ma carac tersticos son los proporcionados por la lactosa y las sales, con sus sabores azucarado y salado, respectivamente. Pero no hay que olvidar los de otros componentes menores de sabor fuerte, como la lecitina o las sustancias de bajo peso molecular que se encuentran presentes como indicios. Estas ltimas son las causantes de las variaciones de los caracteres olfativos de la leche fresca y se atenan con bastante rapidez en el curso de las manipulaciones y los tratamientos. Estas sustancias se pueden clasificar de la siguiente forma:
l. Compuestos carbonlicos: acetona, acetaldehido, metilcetonas.

2. Acidos grasos de 4 a 10 tomos de carbono y delta-lactonas de 10 y 12 carbonos principalmente; el lmite de sabor de esta ltimas es muy bajo, 1 a 2 ppm, en proporciones ma elevadas comunican un sabor poco agradable parecido al de coco. 3. Compuestos sulfurados; en los ltimos aos se ha puesto mucho inters, sobre todo en los Estados Unidos de Amrica en el "dimetilsulfido" (metilsulfona CH 3-8-CH,), que se forma a partir de un precursor sulfurado que se encuentra en los forrajes.
De hecho, la mejor sensacin que proporciona la ingestin de leche es un efecto tctil agradable en la boca, cuyo origen no se debe a un componente en particular, sino a un estado fmcoqumico: la emulsin de la materia grasa y la suspensin coloidal. Las protenas son inspidas, pero, sin embargo, tienen un importante papel en la formacin de una masa que atena y equilibra los sabores. El suero de quesera, privado de la casena en estado coloidal, contiene una gran parCopynqhled malenal

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Flslca y llslcoqulmlca. Electos de los tratamientos tecnolgicos

te de los elementos spidos y olorosos de la leche, y sin embargo tle ne un gusto diferente, claramente dulce. Cl Defectos del sabor
l. Frecuencia de los tk(ectos La frecuencia de los defectos del sabor de la leche de cusumo vara

mucho de un pas a otro, no solamente en razn de la calidad propis de la leche, sino tambin a consecuencia de las tcnicas de tratamien to, que no son siempre las mismas, y adems porque el paladar del consumidor no es uniforme. A modo de ejemplo presentamos el cuadro 39 con algunos resulta dos de las pruebas realizadas en Francia por KuzdzalSavoie y Moc quot (1960), durante dos aos, sobre la produccin lechera de cin cuenta vacas del Centro Nacional de Investigaciones Zootcnicas. Al go ms de un millar de muestras de leches crudas y pasterizadas fueron sometidas a la degustacin de 1 a 6 expertos, a la temperatura de 35"C tras 48 horas de conservacin a 4C (condiciones bastante generalizadas segn observaciones de loa especialistas). Se trata, por con siguiente, de una investigacin limitada, que a pesar de ello permite comprobar que la proporcin de "leches buenas" nunca es del100%; sin embargo, la proporcin de leches muy malas, segn los meses, permanece baja, de Oa 9%. El cuadro 39 indica que el perodo de mayo a septiembre es el ms favorable para una buena calidad organolptica y que en invierno la proporcin de leches buenas disminuye considerablemente. El sabor a rancio es el defecto que aparece con ms frecuencia a lo largo del ao. Los otros sabores defectuosos: oxidado, de pasto, a cocido, etc., aparecen muy irregularmente y en menor proporcin. Cuadro 39. Calidad organolptlco de la leche (proporc., por mesW)
Lethe crudA 1) Lethe de buen sabor: - m4ximo
- mnimo

Lethe pasterizada (VIII)


(1)

(VII) (XII)

- primavera-verano (VIX) - otoo-invierno (X-IV) 2) Lethe con sabor a rancio:

90 % 41 80 50

96 %
57

83 63
(1)

- miximo
- mnimo

(XII) (VIl)

46
2 12 27

17

(VIVII)

o
3

- primavera-verano (VIX) - otoo-invierno (X-IV)

10

O) Condiciones y referencias, ver texto; entre parintcsis, la cifra del mes.

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Fislca y tislcoqulmica.
Electos de los tratamientos tecnolgicos
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2. Sobo,.., proced.enta tk la lllmentDCin Apueoen en el ordeo , y tanto ma fuertemente cuanto ma reciente baya lldo la dlltribucin de los alimento&; elta Influencia de la ali mentacin 118 leduce o elimina cuando 118 diatribuye el forraje varias boru anta del ordeo. Eetoa defectos a~cen ma frecuentemente que antes, probeblemente porque lo. mtodo. de alimentacin del pnado han evolucionado; el animal come meno hierba fresca o teca (heno) y m vegetales enlilado., remolecba, aubproductos de las f'bricas de ucar, destllerfu y oeM!Oeraa; eatoa al.lmentoa, sobre todo loa enlilado. de calidad dudosa y las pulpas (remolecha azucarera traa la extraccin) aon la cauaa de laborea desagradable.. Su trantmla!n ale leche ae hace probablemente por medio de lo. sistemas dileatlvo y circulatorio. AJcunos punto 118 encuentran an en dlscualn. Et cierto que la tranamilln de u.boree ocurre tambin por va respiratoria? E cierto que el eoNilado de buena cal.idad puede comunicar a le leche un sabor puticular? )la Indiferente la hora de le Inaeatln de los allmen to1 para el puo de c:lertot laborea a la lecbe? La velocidad de tran.amin vara con el alimento y con au forma. Tru una dlatribucln de alfalfa verde, apereoe el labor al cabo de una hora o dos; tras la lneatin de juao. de alfalfa como bebida, el pluo ea de tralnta mlnutoa. Exllte tambin un problema cuantitativo; por debljo de cierta pro porcin de alimental, como la rem.o lacba, es poalble que no aparezca nlnn aabor, mientru que una proporcin mayor del mlamo alimento en la racin comunican un aabor desagradable a le leche. La tltabulacin y le alimentacin de Invierno favorecen la cetoais, con puo de cuerpoa cetnlcoa de la Santfe a la leche. M raramente, y en clertaa pocas del afio, et poalble que la leche tena el aabor comunicado por las eaenciu de plantu aromtlcas, en putlcular labiN'I11 y aucteraa.
8. Sobo,.., d~ durante la COIUmiCICI6n Son los ms temiblet pera los productores de leche de comumo; pueden apueoar en 1M condlcionel que permiten una buena COneerft cln de la leche deade el punto de vilta becteriolcfco; ea decir,a temperaturu relativamente blj11. Son conaecuencla de lu reacciones qumlcu y enzlmticas que hemos eetudiado anteriormente . a) &bor rancio. Eet provocado por la hidr6llala de la 111"&1& bajo la Influencia de laa lipaaaa, que liberan 'cidos puoe de fuerta olor y ... bor &.IIWIO; el sabor de jabn tiene el miamo oripn. Se conaldera que la llpua natural de la leche ea Inactiva en la mama; aln embargo eate punto ee encuentn en controveraia. La altacl6n, la homoe.n ei aacln y 1aa varlaclonea de temperatura activan la Upua; eatu varia-

Ffsfca y flslcoqulmica.
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Efectos de 10t tratamlentoa t8CI'101gicos

clones de Umperatura interrienen especialmenU en el tratamiento de 1u natN p&ra aumentar IU 'rSCOiidad. El entriamiento de la lecbe favorece la tctividad lipqca.. El pino de aparicin del abor rancio, en la lecbe rernpr.da, es my variable ; corrientemente es de vvioa das, pero puede re"-iane a alguna horu, en este cuo la leche ae vuelve incoiiiUmlble durante el periodo habitual de cooaetVaC!oo y man pu.lacln. El aabor rancio puede aer ms frecuenU en invierno y en 1aa leches de final de la lactecin, sobre todo cuando coincide con el perodo de eatabulacln; pero hay notables variacionealndlvldualea. h)Sabor o oxidado. Se debe a la oxidacin de laa rqq y a cie.rtas tranalormaciones en la parte nitrogenada, pero estN ltimu parecen correaponder ms al "aabor a cartn". De hecho, exlate toda una gama de aenaaciones diversas que se contunden ~o el tftmino "aabor a oxidado'~ aabor metlico, sabor a papel, aabor oleolo, aabor aebceo, etc., y probablemente ton debidoa a caUSM diverau; por e~mplo,los laborea que pueden apuecer en la leche con un potencial redox bastan te 1>41Jo. El aabor a oxidado apueoe ms trecuenumente en 1u leches de principio de lactacin. Pueden existir variaciones aecn la rua y tambin Individuales. Recordemos que en estas tranalormaciones actan doa cataliadorea: - el cobre para lu grasas, - la luz para las gruu (sabor a oxidado ) y para las protenas (sabor llamado "activado"). En lo que ae refiere a loa tratamientos &f.Uoados a la leche, ae comprueba una Incompatibilidad entre la lipolia!J y la oxidacin. Mien tras que la homogeneizacin, la agitacin a ~a Umperatura y la refrigeracin aeeulda de un recalentamiento, favorecen la aparicin del sabor a rancio, eatoa mismos tratamiento. protegen, por el contrario, contra la aparicin del aabor oxidado.
e) El

cbor Ofrlo, el olor cido, 100 el resultado de la apcicin de

dlvereoa 6cldos en el cuno de la fermentacin de la lactoaa. Debe tenerse en cuenta que el cido lctico, no voltil a la Umperatura ordinaria, no puede percibir por el olato, por lo tanto 100 otros cidos, especialmenU el cido ctrico, los que Intervienen. La apreciacin de la acldlticacin por medio del oltato no ae realiza aiempre a la m!Jma acidez, lo que demuestra la exiiUncla de eaquemu fermentativo diferente. A veces es suficiente una elevacin de la acidez en 2 O, pero lo ms corriente es que el olor no ae perciba haata que no alcanza lo 6-loo.
rra

Fsica y fscoqumca.

Efectos de los tratamientos tecnolgicos

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d) El 10bor aajo (sabor a viejo, aireado, etc.), que aparece en las leches concentradaa y sobre todo en 1aa leches en polvo, se cree que est originado principalmente por compuestos cetnicoa, algunos de loa cuales se derivan de laa protenas de la leche. De sta se han aisla do la o-aminoacetofenona (o-acetilanilina), que es la responsable de este defecto del sabor, aa como sus precursores metablicos: la cinu renina y el triptfano. Cuando se aade a la leche evaporada, recien temente esterilizada, 0,005 ppm de o-aminoacetofenona, adquiere el sabor a viejo caracterstico.

Noto.- En el c~tulo XI eotudi...,moe lo divereoo aabore1 que resultan del desanono de b""teriu en la lecbe. y en lo1 c~ltulo1 XX (nata y mantequilla) y XXI (quoao),la fotmaci6n do loa compueotoo pidoe de loo productos !Acteoe.

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TERCERA PARTE

Microbiologa e higiene de la leche y de los productos lcteos

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Captulo 10 Microflora de la leche y de los productos lcteos

1 MIC ROORGANISMOS
Vamos a ocupamos de los microorganismos pertenecientes a los si guientes grupos, cuyos caracteres determinantes resumiremos:

1. Bacterias (Procarlotes) Organismos monocelulares microscpicos (0,3 a 10 .m); no hay for macin de organismos que comprendan varias clulas diferenciadas. Forma exterior de apariencia sencilla. La clula no contiene un n cleo diferenciado y est limitada por una pared rgida de composi cin glicopeptdica. Multiplicacin habitualmente asexual, por esc!siparidad (divisin simtrica de la clula). La duracin de una generacin puede ser muy breve, hasta de quince minutos; de aqu la gran proliferacin y tendencia a la ubicuidad. Algunas bacterias se reproducen mediante for macin de una espora por clula; es una "forma de resistencia". Existen tipos fisiolgicos diversos. Las bacterias que viven en los medios que contienen materias orgnicas, tales como la leche, son he tertrofas; son m& o menos exigentes en lo que se refiere a las sus tancias nutritivas. En la microfiora de la leche se encuentran todos los tipos respiratorios: aeroblosis (vida en presencia de oxfgeno), anaerobiosis (vida en ausencia de oxgeno) y tiPos facultativos.
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Microflora de la leche y de los productos lcteos

2. Virus Microorganismos inframlcroacpioos, demaaido pequeos para que puedan eer v!Jibles al microscopio ptico (menos de 0,2 micru). Son peritos intracelularea obligados de los animalea y de loa veetales. Estn formados por una membrana proteica que contiene cido nu cleico; su forma de reproduccin ea poco conocida; ae trata de una replicacin. Loa virus paritoa de las bacterlaa se llaman "bacterifagos" o simplemente "!agos". Son loa ultragrmenea mejor conocidos; tienen forma de renacuajo y ae unen a la clula por la cola perforando su pared, inyectando, como con una jerinuilla, su cido ribonucleico . Los fagoa tienen una gran importancia en las induatrlaa que utilizan fermentos lcticos, como se ver en loa captulos XI y XII. Entre iaa bacterias y los virus se sita elllf\lpo de las Rtc/cettsla , que se asemejan a los grandes virus; algunas de aue especies tienen significacin higinica en la leche.
3. Levadura y mohos (Eucariotes)

Mcrooraniamos pertenecientes al reino vetetal por au estructura ce lular; le clula est rodeada de celulosa y contiene un ncleo bien diferenciado. Las levaduras aon generalmente unicelulares. Lu levaduras imper feotas (Cryptococcoceoe) no tienen ma que una forma de multiplicacin asexual: la gemacin. Las levaduras perfectas ae reproducen tambit!n formando ucas tzas la conjugacin; lea aacaa contienen va riaa ascoaporas (EndomycetGCi!oe). Lu actividadea bioqumicaa de las levaduras 110n similares a las de ciertas bacteria& hetertrofas, a lea cuales ae encuentran a veces asociadas. Los mohos 110n, en general, ma complejos en su morfologa y en su modo de reproduccin. Levaduras y mohos son facultativamente aerobios; crecen ma fcilmente en preaencla de aire . La aenaibilidad de esto microorganismos a loa agente antlbacterianos, y ma especialmente a los antibiticos, es diferente a la de lea bacterias. Por el contrario, au aenaibilidad al calor ea del mlamo orden que la de las bacterlaa no eaporuladas (las asoosporu no aon termorreaiatentes).

11 NOMENCLATURA Y CLASlFICACION DE LAS BACTE RIAS Cada bacteria ae designa por dos nombre que tienen una terminacin latina: el del gnero, en mayscula, y el de la especie a continuacin; eventualmente se Indica le variedad y algunos pormenores abreviadamente, en especial el tipo antignico o aerolgico ae recomienda men-

........,,r

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1a

Microflora de la leche y de los productos lcteos

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clonar, entre parntesis, el autor que ha definido la especie. Ejemplos: -Mycobacterium tubereulosls (Lehmann y Neumann) var. hominls (bacilo tuberculoso humano). - Streprococcua/4ctls, gr. N (Lancefield) (eatreptoooco lctico del grupo serolgico N). - E6Cherichia coll K 12 (colibacilo del tipo K 12 ).
La claai.ficacin de los microoranismos es una empreA ardua a la que es difcil dar una solucin satisfactoria. Lal diferentes tentativas de clasificacin han utilizado diversas propiedades:

-Propiedades fisiolgicas: aerobiosis(anaeroblosis, utilizacin de azcares, tipo fermentativo, ptimo de temperatura (eicrotrofas, mesfllaa, termfllas ), resistencia a determinados agentes antibiticos (NaCl), presencia de endosporas, etc. -Propiedades bioqumicas: produccin de enzimas (catalasa, coagulasa, lactato deshidrogenasa, O Nasa, etc.), composicin de bases nitrogenadas (relacin guanosina + citoeina, en moles%). ComPosicin antignica, estructura de los pptidos de la pared, etc. - Poder patgeno, toxgeno. - Ecologa: hbitat comn, fuentes de aislamiento, etc. Todas estes propiedades se han tenido en cuenta, a un nivel ms o menos elevado, en la ciaeificacin presentada en la ocatava edicin del " Bergey's Manual of Determinativa Bacteriology" (1974), que es a la que se refieren actualmente la mayor parte de los microbilogos. El perfeccionamiento de los mtodos de determinacin hace que, en muchos caaos, los sistemas establecidos se vuelvan isuficientes o incmodos para loa especialistas de un grupo determinado, por lo que abandonan la nomenclatura binaria, reemplazndola por un nmero de grupo que define una poblacin ms homognea. En la prctica, a veces es interesante considerar grupos restringidos de individuos, que constituyen la descendencia de un cultivo que posee una ficha de Identidad bien determinada por un laboratQrio especializado y provisto de una sigla o de un nmero de orden; es la "cepa" Frecuentemente es difcil relacionar entre s trabajos de poeaa diferentes, sobre especies definidas segn criterios hoy da abandonados o sobre especies descritas insuficientemente. Con todo, es preciso considerar que la microbiologa no naci ayer; no pueden olvidarse Jos trabe,jos valiosos realiudos en el pesado por el solo motivo de su terminologa; por otre lado, es pro bable que las designaciones actuales sean abolidas el da de maana. En esta obra no dejaremos de utilizar antiguas denominaciones y citar nombres vulgarea.
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Microflora de la leche y de los productos lcteos

111 PRINC IPALES GRUPOS DE BACTERIAS QU E SE ENCUENTRAN EN LA LECHE

Se pueden distinguir dos grandes categoras de bacterias gracias al

mtodo especial de coloracin de Gram. Las bacterias "Gram +" se caracterizan por mayores exigencias nutritivas y una eenaibidad ms elevada a los agentes bactericidas, que las bacterias "Gram - ". Estas ltimas son, sin embargo, ms senalbles que las bacterias "Gram +"a ciertas substancias inhibidoras. Recordemos que las substancias inhi bidoras detienen el crecimiento sin destruir los grmenes, por ejem plo, la azida de sodio, las teluritas y el acetato de tallo. Estas propie dades permiten componer medios selectivos, que facilitan el aiala miento de las bacterias que pertenecen a una de estas categoras.

Al Bacterias "Gram +"


l. Bacterias lcticos

Las bacterias ms importantes, en los productos lcteos, tanto por aus actividades bioqumicas como por su nmero (proporcin en la microflora total y freeuencia de los exmenes), son aquellas que fer. mentan la lactosa dando una proporcin elevada de cido lctico en los productos de degradacin y que slo son dbilmente proteolti cas. Pertenecen a la familia de las LactobacUiaceae y Streptococcaceae, que se estudiarn en un captulo especial.
2. Micrococos y estafilococos Dadas sus caractersticas morfolgicas tan particulares, se llan agru. pado las bacterias eafricas en una sola unidad de clasificacin; con este criterio se realiz la parte 14 del Bergey's Manual a pesar de que existen diferencias importantes en los caracteres fisiolgicos. La familia de las Mtococcaceae agrupa especies interesantes en lechera; todas son catalaaa + y resistentes a la sal (5%de NaCI). He aqu los principales caracteres distintivos: a) Mcrococos Estas bacterias son aeroblas estrictas (metabolismo respiratorio); no fermentan la glucosa, sino que la degradan sin provocar ms que un dbil descenso del pH (mnimo entre 5,0 y 5,5 ). Utilizan tanto el acetato como el lactato como fu.e nte de carbono. Los micrococos no son patgenos; estn desprovistos de coagulaaa y de hemollalna; se ha llan con frecuencia sobre la piel del nombre y de los animales. Los micrococos forman parte de la flora inociUJ que contamina la leche, y se encuentran frecuentemente despus del ordeo. Por pre. sentar una temperatura ptima bastante elevada (hacia 37 C), y por
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Microllora de la leche y de los productos ltcteos

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sus actividades enzimticaa reducidas, tienen poca Importancia en los problemas referentes a la consenacin y tratamiento de la leche. Se han aielado micrococos que no atacan la lactosa. Otru especies tienen una actividad proteoltica limitada y pueden aJca!inizar el medio; esta actividad ea interesante desde el punto de vista de la "mad.u ra cin" de la leche en quesera. Los micrococoe influyen en el resultado de las pruebas de aprecia cin de la calidad bacteriolgica de la leche, que habitualmente se efectan a 37 c.
Nota.- Lot nombres ant.lguot del01 micrococo ya cul no 11 emplean: M. lu teu1, M. (rtudenrwlchli, etc. Loa microeoeoa forman parte, con otr01 <&menes, de un rrupo al que en otra poca ae dio mucha Importancia: la "micronora ki do-prot<toiiUca" de la lecha.

b) Bsta(llococol

Esto. grmenes son uro-anaerobios facultativos; provocan una fermentacin acidificante de la glucosa con un deaceruo acusado del pH (lacia 4,3 y 4,5); producen acetona (reaccin de Vogea-Proskauer positiva), contrariamente a los micrococos. Actan en una amplia zona de pH, de 4,2 a 9,3. Los especialistas en microbiologa alimentaria distinguen dos grupos: - Esta!Uococoa patgenos, que poseen con Crecuencia una coagu lasa; se consideran patgenos si tienen los dos caracteres: DNaaa y fosfataaa, que estn ligados a la produccin de enterotoxinaa (de las que hablaremos ma adelante). Hoy da se reconoce una sola especie: Staphy/ococcus aureus, que se parece a la vez a los estafilococos "do rados" y a loa estafilococos no pigmentados (anteriormente llamados S. albus).

- Esta!ilococos no patgenos, siempre coagulasa-negativoa y sin toxinas (en bacteriologa m~ca. S. epldermitil est coNiderado como agente de segunda contaminacin.

3. Bact.uiu etp()ru/odas (Ba,llaceae) Estas bacterias son las nicas que forman una endotpora, que tiene la
importante propiedad de resistir tempereturas elevadaa. Mientras las otras bacterias se destruyen generalmente por debajo de so c. las esporuladaa slo mueren por encima de 100 C; tienen por ello una enorme importancia tecnolgica en lo que ae refiere a laa conaervaa de productos alimenticios no adicionadaa de agentes conservadores. A pesar de au termorreaistencia, debida a laa esporaa, muchas de estas bacterias son mesfilas; es decir, se desarrollan a unos so e y se
opyr

r ed f'la11lr al

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Microflora de la leche y de los productos lcteos

inhiben a temperaturas superiores a 46"C. Sin embargo, existen espe ces termfi!as, que se desarrollan bien por encima de los so c. Las bacterias esporuladas no suelen manestarse en la leche cruda y en los productos lcteos que no se han calentado. Por el contrario, son responsables de la alteracin de las leches hervidas o insuficiente mente esterilizadas, de los quesos fundidos, de los quesos de pasta co cida, de las leches concentradas, etc. El calentamiento tiene como resultado una seleccin de estos grmenes cuando se hallan inicial mente presentes en cantidad considerable. Las bacterias lcticas las Inhiben rpidamente. En los productos lcteos se encuentran representados dos de los cinco gneros (segn el Bergey 's Manual): - Bacillus: bacterias esporuladas aerobias estrictas o anaerobias facultativas con actividades enzimticas variadas: acidificacin, coagulacin y proteolisis. - Clostridi4: bacterias esporuladas anaerobias estrictas (que no se desarrollan ms que en medios exentos de oxgeno); son perjudicia les en quesera, sobre todo por la produccin de gas; algunas son pe ligrosas por sus toxinas, en especial el Clostridium perfringens.
4. Bacteri4s ''Gram +"diversas a) La leche fresca puede contener muchas bacterias del gnero Co rynebacterium; son bastoncitos finos, que se presentan en agrupado nes caractersticas. Estas bacterias tienen poca importancia prctica por sus actividades poco acusadas y por su temperatura ptima bas tante elevada: 37c. b)Propionibacterium. Bacterias propinicas, que tienen importan cia en la maduracin de los quesos de pasta dura. e) Brevibacterium. Bacterias de bastoncitos cortos (cocoides), que se encuentran corrientemente en las materias animales o vegetales en descomposicin. No fermentan la lactosa. La B. linens abunda en las cortezas rojas pegl\iosas de la superficie de los quesos madurados en atmsfera hmeda.
B) Bacterias "Gram -" Anaerobias facultativas

l. Enterobacterias La familia de las Enterobacteri4ceae es una de las ms vastas y de las

ms dcles de subdividir. En el cuadro 40 hemos reseado los prin cipales caracteres distintivos de 8 gneros sobre los 12 actualmen te reconocidos. Las especies ms frecuentes en los productos lcteos son las que fermentan la lactosa; pero tambin se encuentran las otras. La mayor parte de las enterobacterias son huspedes normales del intestino de los mamferos; su presencia en el agua o la leche puede
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Cuadro 40. Enterobacterlaceae (principales gneros)


G~neros

() A. Lactosa fermentada : l. Escherlchla coli 3. Cl rrobacter 7. Enttrobacter

lndol (1)

Rojo de metilo (2)

Acetof. na ( 1)

Citrato s6dico (3)

Lactosa (3)

Glucosa (4)

Ureasa
( 1)

H:S (1)

Gelatina (S)

MoYilldad
(

...)

+(-) -(+)

6. Klebiella
B. Lactosa no (o pooo) fermentada:

+(- )

+
+

+ +

+ + +

+ +

+ +(+) ++ (+) ++(+) ++ (+)

+ + + +

+/-

+/- (+) -(+) - (+) +(-) +(- ) ++ +(- ) - (+)

+ (- ) + +

9. Serratia 10. Proteus 4. Salmonella S. Shigel/a

+(- ) - (+)

+ +(- ) +(- )

- (+) - (+)

+ +

-(+) +

+ + + (-) +

( ... )Carcter enoontrado raramente. (1) Produccin. (2) Vinje.

(3) Utilitacln. (4) Produccin de sas.

(S) Licuefaccin . ( ) Los nmezos son los de Bergey~ Manual.

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Mlcroflora de la leche y de los productos lcteos

atribuirse a una contaminacin de origen fecal. Muchas de estas especies tienen una faae de vida Ubre en el suelo y en las aguas. Alunas se encuentran en los productos vegetales. Las enterobacterias suelen ser menos abundantes en la leche que otras bacterias Gram -; sin embargo, tienen una gran importancia desde dos puntos de vista: - Higinico: varias especies de esta familia son responsables de enfermedades infeccio888, que pueden adquirir carcter epidmico; en el caso de los productos lcteos, las salmonelas son las ms temibles; a otras especies se atribuyen infecciones gastrointestinales benignas, salvo en los nios. - Tecnolgico : una propiedad bioqumica de las enterobacterias es la fermentacin de los azcares con formacin de gas (gas carbnico e hidrgeno) y cidos. Algunas especies producen sustancias viscosas o de sabor desagradable. Esta importancia aumenta por la facultad de desarrollarse a muy diferentes temperaturas (algunas especies se desarrollan de 1oc a 40c, y elEscherichw coli puede crecer hasta a 44 e, y por su resistencia a los antibiticos que se encuentran ocasionalmente en la leche. En estas condiciones las enterobacterias pueden suplantar a las bacterias tcticas e invadir el medio. El trmino "bacterias coliformes" se ha utilizado para designar a las entero bacterias ms frecuentemente encontradiiJI en los productos lcteos y pertenecientes a los cuatro primeros gneros del cuadro 40. El recuento de estas bacterias (colimetra) es uno de los medios ms significativos para la apreciacin de la calidad higinica de la leche y de la eficacia del saneamiento a que se la somete. Para este fin se utilizan medios de cultivo que se han hecho select ivos por adicin de sustancias que inhibe.n la mayor parte de Las otras especies (verde brillante, bilis, desoxicolato sdico, etc.). a) Escherichia. Este gnero no comprende ms que una especie bien definida: el E . coli, con algunas variedades de caracteres antignicos diferentes. Es el nico productor de indo! del grupo, y por ser fcil poner de manifiesto este cuerpo, constituye el principio de una reaccin de caracterizacin; no obstante, su significado es reducido, ya que otras bacterias netamente diferenciadas (Proteus, Enterobacter) son tambin indolgenas. Produce mucho gas y cidos orgnicos (lctico, actico, succnico, etc.). Sin embargo, es menos "acidificante" que las bacterias tcticas, que lo inhiben cuando el pH desciende por debajo de 5,0-5,2. Como todas las enterobacterias, el E. coli reduce los nitratos a nitritos; en presencia de nitratos, la produccin de gas es limitada. b) Enterobacter. Este gnero se designaba anteriormente por Aerobacter y luego como Cloaca. El E. aerogenes es igualmente un gran
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productor de gas en los productos lcteos, pero no origina ms que una dbil acidificacin; por el contrario, produce una sustancia neutra, la acetona. Estas bacterias no son patgenas. e) Klebsiella. Gnero muy prximo al anterior pero, en oposicin a las otras bacterias coliformes, las clulas son inmviles y capsuladas; comprende cepas saprofitas y cepas patgenas (neumobacilo ). d) Citrobacter. Grmenes que antes se clasificaban como Escherichia (E. (reundll); son especies innocuas presentes en las materias Cecales, caracterizadas por la produccin de H2 S (no todas las cepas). Aparte las coliformes, pueden encontrarse en la leche enterobacterias que no fermentan la lactosa y que son especies innocuas, como las Serratia y Proteus, que son proteolticas; pero tambin pueden hallarae especies patgenas temibles, como Salmonella (bacilo tfico) y ms raramente Shigella (bacilo disentrico). Un nuevo gnero, Yersinia, comprende bacterias cuya patogenlcidad parece muy variable segn las cepas; se reproducen bien en las cmaras frigorficas. Y . enterocolitica se encuentra freeuentemente en la leche y en los helados. 2. Gneros afiliados El gnero Flauobacterium comprende especies que se cultivan preferentemente a baja temperatura y no se desarrollan por encima de los 30 e; son comunes en las aguas, en los productos vegetales y en los productos lcteos. Tienen metabolismo respiratorio y por lo tanto no fermentan la lactosa. Sobre medios slidos dan colonias amarillas o rojas, y de ah su nombre. El gnero Aeromonas engloba especies acuticas que en ocasiones se encuentran en la leche; fermentan los azcares y producen indo!, como las del gnero Escherichia, lo que puede dar lugar a confusiones en los anlisis de leches pasterizadas. Su temperatura ptima se sita hacia los 30 o e.
C) Bacterias "G111m -" Aobias estrictas

l. Alcaligenes (ex-Achromobacteriaceae) Son bastante frecuentes en la leche cruda, la que no modifican mucho, porque no fermentan los azcares; la leche no se coagula y puede volverse alcalina. Ninguna especie es sospechosa desde el punto de vista higinico. Estas bacterias presentan inters porque forman la parte de la microfiora sicrotrofa que prolifera en la leche conservada a baja temperatura. Algunas especies producen sustancias viscosas o coloreadas.
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2. Pseudamo1UJ8
La leche contiene frecuentemente grmenes pertenecientes a este gnero, transportados principalmente por las aguaa impura&; constituyen la parte esencial de la mcroflora sicrotrofa y son nocivos a causa de sus actividades proteoltlcas y lipolfticas. Las especies ms representadas en la leche son: P. fluoreBCena y P. putrida.

3. Brucella Bacterias patgenas para el hombre y los animales, agentes causales de la "brucelosis", que pueden contaminar la leche.
Nota.- En oe:aaionea, te encuentran en la leche baeteriu perteneclente1 a famm., muy dflereote1 de lu que anteceden. A Ju Mycobaetriac<Jt pertenece una de lu que ene mayor importancia hfMnlea M. rubcrculott ("bacilo tuber culoao .. ); oe trata de b&e:Urlu que presentan corrientemente un upeeto filamen toao y tienen afinidades con loa hono, .

IV LEVADURAS Y MOHOS
Estos microorganismos son menos importantes que las bacterias en el conjunto de los problemas microbianos referentes a la leche y a los productos lcteos (con excepcin de los quesos) . Los consideramos aqu sin extendemos innecesariamente.

Al Levaduras
En la leche cruda suelen encontrarse frecuentemente clulas volumnosas, esfricas u ovaladas, de levadura& no esporulantes que pertenecen al gnero Gandida (antes denomnadas: Torula laclosa y T . eremora). Estas levaduras producen gas y poco o nada de alcohol. En las condiciones habituales no se manifiestan en la leche: excepcionalmente son causa de la "leche espumosa". Tambin pueden enrontrarse en la leche levaduras esporulantes, romo el K/uyveromyces fragflt. y el K . lactis que fermentan la lactosa, ron produccin de alrohol. En el kefir, leche fermentada oriental, se encuentra una variedad del K. fralilia llamada Torula kefir, asociada a un estreptococo lctico, en zoogleas caractersticas (captulo XXU). En diversos productos lcteos, las levaduras pueden provocar fermentaciones gaseosas y sabores indeseables; estas alteraciones se producen frecuentemente en las "natas de granja" y en las CWiiadas frescas de quesera; como causa se encuentm conientemente la Torulopm sphaerica. En la leche condensada azucarada pueden producirse accidentes anlogos ron la Torulopsialactls condenai.
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Lu levaduru forman parte tambin de laa noraa pepjoau de los


queeo. de corteza hmeda, especialmente en los de corteza roja, con bacteriaa proteolticas, como Bl'lwiboderium liMn y micrococos.
8) Mohos

No tienen .mf'Ortancia prctica en la lech.e lqulda; por el contrario la tienen, y en .Jto grado, en la mayor parte de productos lcteos; se de118R0llan en la superficie y en las partes en contacto con el aire. - Penlclllium. Varias especies intervienen en el afinado de divenoa tipos de quesos, principalmente: P. comenbertl y sua variedades, P. coselcolum y P. olbum en los quesos de corteza blanca con mohos, como el Camembert, y P. roqueforti en los quesos azules, con mohos intemoa. - Geotrichum candidum (anteriormente llamado Oidium /actia) es un moho que invade las CUI,jadaa frescaa de queaerfa; es seDiible a la sal, que retarda au desarrollo. - Aparte los anteriores, se encuentnn divenoa mohos sobre las mantequlllaa enmohecidas y sobre las nataa vieju y mal collll!rvadas. Como lu lev.duru, los mohos se dettruyen fcilmente durante la puteriucln; aua esporas no son termorresistentea.

Observacin
La presencia de un ran nmero de especies microblanaa en la leche es un hecho comprobado, pero ello no significa que todas puedan desarrollarse en dicho medio. Para cierto nmero de especies innocuaa o pstsenu, la leche es un vehculo ocaaional; no se desarrollan mejor en este lquido que en el agua, la cual puede igualmente servir de medio de trenaporte.

V MICROORGANISMOS DE ORIGEN MAMAR IO


A la aalida de la mama sana, aun tomndOle riuro588 precauciones de asepela , es dilcil obtener una lecb.e estril, por lo menos de las vacas. En el interior de la mama existen casi aiempre srmenes innocuos que contaminan la leche en el momento de au obtencin. Esta poblacin oriinaria de la mama sana es, en general, poco numerosa. Re!"trindose a un conjunto de datos sobre un total de ms de 600 animales, se comprueba que la proporcin de vacas con menos de 1.000 srm.enesml (micro nora aerobla mestila) se encuentra entre el 60 y el 80 % solamente el 4 %de las vacas daban leche con ; ms de 5.000 grmenes/mi, tras un ordeo asptico . Cuando el conte nido de srmenes es muy elevado, suele deberse a una proliferacin

y 1 h !d 'Tiarenal

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de loe c'rmenes tpicos de la mamitil contaclota: estreptococos y est.a!Uococoe. Sin embargo, hay animales que dan, a la llda de la mama, una leche de contenido microbiano elevldo: 10.000 gbmenesfml y ms, aunque la llndula p81'1!ZCl ADa; es un defecto persistente, con ampllu variaciones. Se ha aucerido la uistencia de una relacin entre la praencia de 11hmenes en la mama y su anatoma; uf, un eafnter del pezn en buen estado constituir una barrera contra la Infeccin. Pua algunos autores, cuanto m rpido ea el ordeo, m6a auaoeptlble a la infeccin ea la mama. La primera leche que ae extrae de la mama ee alempre la ms ifectada. El nmero de gr menes decrece a lo lat~~o del orde'lo. Al prin ciplo de sta, la leche lava y expulsa de loe uond uctos loe 11rmenee m fcilmente deaplazablea. Lu varlaclonee son grandes de una vaca a otra; ain embargo, se pueden admitir, a la vista de un gran nmero de edmenea, los nmeros proporclonalea de 100, 5 a 10 y 1 a 2 pua la microfiora de los primero chor:rot, de la mitad y del rul&l del ordelto, respectivamente. J\14unoe auto,_ han o'-rvado un increrMnto Inexplicable del nmero de c&menes al final del ordeo. A pesar de que el volumen de la pmerr leche, ms rica en llrmenes, - tacaiO y no tenga ms que poca influencia aobN el contenido microbiano del conjunto del ordeo,~~e~~erslmente recomienda eliminarlo . Se ha aeilalado que las leches de cabra y oveja aon m frecuentemente eltriles a la aalida de la mama que la leche de vaca. La penetncln de t~rmenes en la mama ocurre de doe modos: 1 . Por va ascendente, a tzava del canal del pezn; ea el camino ms frecuentemente seguido por loa grmenes Innocuos y algunos patgeno . 2. Por va "endpna"; algunos 11rmenea patgeno pueden llegar a la mama por la circulacin sangunea, por ejemplo los de la tuberculoail (Mycobocterium tuberculoail) y de la bruceloaia (Brue>~/JG abortu1); loe estreptococos no pueden Uepr a la mama por eata va.
Loa srmenes inofensiVO& de la mama pertenecen princlpalme<Jte a loa a~eroa CoryrutbocUrium y Mi.crocou: 6stu aon becterias "comenaales" que te encuentran frecuentemente aobre la piel y las Clndulaa; 1U actividad enzimtica es limitada. Loa patge-

noe ton principalmente estreptococos y ett.elllococos hemoticos, pero oc:uionalmente tambin pueden intervenir otru numerosas especies (captulo XIIl). Algunoe grmenet que se detarrollan bien en la teche, aon incapaces de v!vl.r o de mantenerse en la mama; por ejemplo, algunos estrept.ocoooa y grmenes del gnero Enterobacter, Serralla, etc.

emnenea

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VI CONTAMINACION DE LA LECHE EN El EXTERIOR DE LA MAMA Esta forma de contaminacin suele ser masiva en relacin con la de origen mamario; su importancia es extremadamente variable segn las condiciones de produccin y conservacin de la leche. Los principales orgenes de contaminacin son:
l. La piel de la mama es causa frecuente de contaminaciones importantes cuando no se efecta un lavado preliminar o se realiza mal. Aporta sobre todo grmenes sicrotrofos y microorganismos termorresistentes, pero no coliformes. 2. El ambiente. La atmsfera de los establos est siempre ms o menos cargada de grmenes procedentes de los excrementos, de la paja y de los alimentos. La atmsfera de las salas de ordeo especializadas es siempre ms sana que la de Jos establos. Los alimentos groseros (heno) y la paja aportan sobre todo grme nes esporulados: bacilos y clostridios. Los ensilados aportan bacterias butricas perjudiciales para la quesera . Los excrementos son ricos en grmenes variados, y constituyen la principal fuente de entero bacterias nocivas, como el Escherichia coli y otras especies de coliformes. 3. El estado del animal. Era anteriormente una de las causas de posible contaminacin cuando se ordeaba a mano con recipientes abiertos. En las instalaciones modernas constituye un punto secundario. 4. El estado del ordeizdor. No es Indiferente; el ordeador no aseado, con ropas cargadas de polvo y suciedad, es ul\a causa ms de contaminacin, cuya naturaleza es semejante a las precedentes. Ea preciso tambin tener en cuenta la salud del ordeador. Se ha comprobado frecuentemente en la leche la presencia de grmenes patgenos de origen humano, como veremos ms adelante. 5. Los utensilios y las mquinas son habitualmente la fuente de contaminacin ms importante. Son millares los grmenes que pueden existir sobre las paredes de los utensilios lecheros mal lavados. Se trata sobre todo de grmenes del grupo Escherichia-Aerobacter, etc. de especies termorresistentea. 6. La calidad del agua tiene una gran importancia; las aguas impuras empleadas en el lavado de los r.ecipientes y de las mquinas pueden ser la causa de contaminaciones muy perjudiciales, sobre todo para la nata y la mantequilla. Las aguas pueden estar contaminadas por microorganismos muy diversos : pero sobre todo deben recha2arse las bacterias grarnnegativas (Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Alcaligenes), que constituyen la flora sicrotrofa, ya que puede provocar defctos en la
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leche y en los productos lcteos conservados a blija temperatura (de Oa15.C). Conocidas las circunstancias que intervienen en la contaminacin de la leche, es fcil deducir las reglas para la produccin de una leche de buena calidad bacteriolgica; esta. regias se expondrn en la cuarta parte.

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Captulo 11 Desarrollo y accin de los microorganismos de la leche

1 LA LECHE CONSIDERADA COMO MEDIO DE CULTIVO

Al Composicin del medio


La leche de vaca es una solucin neutra, fuertemente tamponada, rica

en sustancias nutritivas de los cuatro grupos: glcidos, prtidos, lpidos y sales; contiene factores de crecimiento, especialmente vitaminas del grupo B; constituye un buen medio de cultivo para los organismos hetertrofos aptos para asimilar la lactosa y las protenas. Pero no es un medio de cultivo universal, por diversas razones: l. La fuente glucdica (energtica) est constituida solamente por lactosa; un azcar que las bacterias y levaduras metabolizan menos fcilmente que la glucosa. Algunas bacterias que constituyen fermen tos lcticos muy activos, como el Lactobacillus delbruckii, no degra dan la lactosa. En las levaduras es rara la produccin de llialaCtosidasa que permita hidrolizar la lactosa. 2. Si bien el contenido en sustancitls nitrogenadas es elevado (ms ), del 3 % la cantidad de aminocidos libres y pptidos es dbil,lo que constituye un factor !imitador para numerosas especies bacterianas. La adicin de hidrolizados proteicos a la leche permite un desarrollo mucho ms fcil de estas especies. Por otra parte,la leche prevamen te tratada por enzimas proteolticas constituye un buen medio de cultivo en el laboratorio.
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Desarrollo y accin de microorgenlsmos en laleclle

3. En el ordeo, la lecbe contiene IUIIGnciae GlltlbocterIIIa que la protecen contra la invuin de cierto. gt~net eerudblel, y que explican en perle la rue de latencie que obeerva al principio del desarroUo de w becteriaa en la ledte crude. Existen lfrmeneelelllibles y ~rmen81 resistentes a la accin de esta& JUIWic:ial bacterloltticas. Lu austancias .obre lu que .e trata en eau captulo exlaten en la leche de forma natural. M adelante ae har referencia a la p re.encia de antlbiticoe eliminada. por la mam tru tratamiento medicamentolot, o producid011 en el cur10 del de.arrollo de bacterlu tcticas.
Bl Vlaclones de les propied8des dala leche La aptitud de la leche para permitir el deaarroUo de bacterlu vara .esn el origen de la leche y la 81pecie bacteriana. En efecto, el con tenido de la ledte en !acto- de crecimiento o en u.tancw antibecterlanu no 81 coDitante, y la sensibilidad de 1aa bacterlu a una emmulacln o a una inhibicin puede diferir grandemente de una 81pecle bacteriana a otra. El 81tudio de esta aptitud tiene importancia de.de varios puntos de vlata : a) Punto de vista higinico. Concierne al desarrollo en la leche de mlcrooflanilmos patge.n011, y en 81pec1aJ de los 11entes productores de mamltiJ contagiosu. b) Punto de vista tecno!jico, referente a : - La calidad de conservacin de la leche cruda y de la leche pasterizada. - El cultivo de hacterlu lctlcu utilizadu en la preparacin de fermento d&atinadoa a d!vel'll8& tranaformaclonea de la leche. Ette punto de vista 81 el ms 81tudiado. Se han reco81do observaclone aparentemente contradlctorlu: la cauaa estriba en la compJe.. jidad de la leche colliderada como medio de euiUvo. Debido a las interferencia& exiatentes dentro de la actividad de lu bac:teriu, es muy difcil hacer una diatindn entre w accionee debidu a ustan ciu lnhlbldoru y a JUIWiciu estimulante.. t.o. tratom~nro. a que puede .ametene la ledte: calf!ntamieoto, oonservaclo por el fro , homoeeneiracln, etc., moditlcan IUJ propiedades biolgicas. La influencie del calentamiento es la ms acuaade y le estudiar en particular.

11 SUSTANC IAS ANTIBACTER IANAS DE LA LECHE CRUDA Se trata de un complejo napo de austanciu que ae deslnaban con el
nombre de /octenna.. Se pueden dividiz en doa gnapoa de acuerdo con el tipo de inhlbicln:

Desarrollo y accin de microorganismos en la teche

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Al Inhibicin especfica Se debe a las inmunoglobulinas. Estas sustancias han sido descritas en el captlo VI; son anticuerpos que se producen, en parte, en la glndula mamaria, como respuesta a la preaencia en el organismo de antgenos y especialmente de componentes de las bacterias comensales o productoras de infeccin. En el caso de la leche es importante la reaccin de aglutinacin de las bacterias, y ms adelante expondremos el modo de accin de las "aglutininas". Las sustancias anteriormente denominadas "lacteninas" L 1 y L, pertenecen probablemente a este grupo. Bl Inhibicin inespecfica Se produce por la accin de sistemas enzimticos o de protenas que tienen propiedades acomplexantes o ligantes. a) Lactoperoxid0$tl (L.P.). Esta enzima, ya descrita en el capitulo VIII, es bastante abundante en la leche de vaca y por ello t iene un inters predoonante en este grupo. Se sabe que se trata de un sistema con tres componentes: L.P. + tiocianato + agua oxigenada, siendo este ltimo producto el factor limitante de la actividad en la leche ftesca. El sistema es activo sobre todo contra los estreptococos pigenos (grupos A y B). Algunos estreptococos lcticos (grupo N) son muy sensibles y otros no lo son nada. Es ms termorresistente que las inmunoglobulinas y permanece activo en medio ligeramente cido. La adicin de agua oxigenada, a baja concentracin, vuelve el sistema activo contra las especies gram-negativas, tanto las catalasa +, como E. coli, Ps. fluorescens, Salmonella, etc. Los agentes reductores anulan la actividad del sistema.

b) La lisozima est dotada tambin de accin bactericida, pero la leche de vaca la contiene en cantidad insuficiente para que pueda tener un papel apreciable. En otro tipo de leches, la situacin es diferente. En la leche de mujer se encuentran cantidades apreciables (frecuentemente ms de 100 rng/1) y su actividad es mucho mayor que la de la Usozima comercial, extrada de la clara de huevo de gallina. La lisozima humana es adems activa contra bacterias que son completamente resistentes a la lisozirna comercial. e) La lacto{errna (L.F.) acta como agente quelante del hierro, tal como se ha indicado en el captulo VI. El enlace del hierro con la protena exige la presencia del ion bicarbonato. El C0 2 a pH 7 desarrolla la actividad bacteriolgica. La leche de vaca es pobre en lactoferrina; contiene unas lOO veces menos que la leche humana; por ello, su actividad slo puede ser muy limitada. En el calostro de vaca hay suficiente cantidad para que se ejerza la actividad, pero la presencia de citrato provoca una competencia para el hierro. Despus de la
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Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

dilisis, el calostro se vuelve bacteriosttico. El aporte de hierro, por ejemplo en forma de hematlna satura la L.F. y anula su actividad. d) Otras sustancias inhibidoras han sido sealadas en la leche o el calostro, pero en muy pequea cantidad: properdina, conglutinina, protena que liga la vitamina B 12 y el cido flico, etc. En la leche humana se aprecia una actividad bacterlosttica ligada a la presencia de cido silico, que desaparece tras el tratamiento con sialidasa. Esta actividad se pone de manifiesto sobre bacterias peligrosas para los lactantes: E. coli, Staph. aureus, etc. Tambin en la leche humana se ha descubierto un factor antiestaf'uoccico, que podra ser un cido insaturado de alto peso molecular.

Observaciones pr6ctices a) En lo que se refiere a las industrias lcteas, la lactoperoxldasa y las aglutininas son las que tienen mayor importancia. Es preciso sea lar dos caractersticas esenciales de estas sustancias: - Su concentracin vara poco en las diferentes leches y en el cur so de la lactacin. - No se destruyen por la pasterizacin clsica. b) No parece que la leche de los pases tropicales, que generalmen te tiene una buena calidad de conservacin, goce de propiedades bactericidas especiales; lo que influye sobre todo son las condiciones de recogida.
111 AGLUTININAS

Las aglutininas inmovilizan las bacterias sensibles, formando aglome raciones que son arrastradas a la supedicie con los glbulos grasos (for macin de la nata) o bien se depositan en el fondo de los recipientes, en la leche desnatada (apelotonamientos bacterianos aprisionados en la casena coagulada); el resultado es una verdadera inhibicin de estas bacterias. Por el contrario,las bacterias "resistentes" no son aglu tinadas, permanecen repartidas en la masa de la leche y ni su prolife. racin ni su actividad se detienen. Con las bacterias sensibles, si se impide la separacin de los grupos aglutinados gelificando el medio {con gelosa o por accin del cuajo), la acidificacin prosigue en toda la masa. Si se inmuniza una vaca con una cepa de estreptococo sensible, la concentracin en aglutininas aumenta fuertemente en la sangre y en la leche. La inmunizacin (o vacunacin) con una cepa resistente pro voca igualmente la aparicin de anticuerpos agluti.n antes en la sangre, pero no en la leche; la mama ejerce probablemente una accin selectiva. La inmunizacin se realiza por va subcutnea . La inyeccin de Copynghted r1atenal

Desarrollo y accin de mlcroorganlamoa en la leche

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olulu microblanu en la mama no modifica el contenido en anticuerpo&. La actividad natural de la leche, en lo que 18 refiere a esta forma de lnhlbicln, debe con.lderane como el resultado del PMO a la leche de anticuerpo& apuedd01 en la aanpe a continuacin de inmunir.acione. oaturalea por a4r"meoee con una collllitucin anticnica perecida a la de 101 rmenee een.lblee. Loe 16rmeDes inmunmntea pertenecen probablemente a la mic:Jofiora inteetlnal del animal o a la del rumen. Se ha demomado, por ejemplo, que el S. b011il (eetzeptococo intestinal) tiene un anteno comn con el S. crcmor (emeptooo.. co lctico). La leche contiene acJutlninu eapec(ficu de diwnu eapeciea de bacteriaa lcticu (Strtptococ~ LoctobocUllu) y de enterobllcteriu {EtcMricllla co/1, etc.). EiUII acJutininu aon mucho m abundantes en el calotUo que m la leche. La actividad inhibldora de la leche desnatada 18 debe en eran puta a la preMDcia de anticue!"JIOS eapecficoc. Inmun!r.ando un animal con E. col/, por inyecclonea intzavenoaas de un cultivo formolldo, 11 puede obtener en la aanre una concentracin elevlda de anticuerpo aclutinantee e lnbibidorea de la eaciein de lal clulu, que retardan el crecimiento de eete germen en la leche. Cuando 11 cultiva E. co/1 en preeencla de una cepa Jctica de fermento. (S. 14ctll), eu deearroUo ee detlene a un nivel beatente bajo (cuando el pH Uea a &), lo que petmite ala eepede lctica dominar e impedir el deaarrollo ulterior del coUbacllo como han demolltrado loa trabaj01 de Portmann (1962 ). Nuevu y muy importante. penpectlvu ee abren en la tecnologa lechera y en la patolofa de la mama, ante la poaibllidad de aumentar la concentracin de la leche en antlcuerpoe (alutininu) que retarden o detenpn la proliferacin de bacteriu indeaeablea.
Norv.- S. con- la a!Mncla do IIDa "luUniAa oooclada a loo tJ6buloo era - : oolamoate dmnpo&a liD popoiiiCIIDdarlo oD la 1Dh!bld6D oboerYoda oobn loo ooaoptococoo16cUooo.

IV INFLUENCIA DE LAS SUSTANCIAS ANTIBACTERIANAS SOBRE LA MICROFLORA DE LA LECHE Y SOBRE LAS BACTE RIAS LACTICAS
A ) l.llche cruda

La microfiora que contamina la leche tru el ordeo, no suele desa rmllarae sino al cabo de un detennlnldo tiempo de conaerndn de la leche a la temperatura ambiente; ea la e- " bact.eri.c ida" o de

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Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

"adaptacin". Esta fase tiene una duracin muy variable, segn las muestras de leche de vaca; a veces dura varias horas y en ocasiones es muy corta. En determinados casos se ob6erva una disminucin aparente del nmero de grmenes durante las horas que siguen al ordefto; probablemente es una consecuencia de la aglutinacin, por cuya causa muchos grmenes escapan al recuento.
B) Leche pasterizada Hemos visto que los inhibidores naturales de la leche de vaca no se destruyen por la pasterizacin clsica (72 e, 15 segundos). La leche pasterizada de esta manera tiene generalmente una mejor conservacin que la calentada a temperatura un poco ms alta. Muchas de las bacterias que contaminan la leche pasterizada se desarrollan francamente mejor en la leche que ha experimentado un tratamiento trmico suficiente para destruir la lactoperoxidasa (pasterizacin alta).que en la leche donde solamente se ha destruido la fosfatasa. La homogeneizacin impide la ascen. in de los glbulos grasos y s provoca la destruccin de las aglutlninas. EUo explica que en condiciones idnticas de recontaminacin, la leche homogeneizada muestra una calidad de conservacin inferior a la de la leche pasterizada sin homogeneizar.

C) Bacterias lcticas de los fermentos Pocas de las cepas mesfllas utilizadas en mantequera y quesera son sensibles a la lactoperoxidasa; por el contrario, muchas son sensibles a las aglutininas. En lo que se refiere a las cepas termfilas,los estreptococos son insensibles a estos dos inhibidores, mientras que los lactobacilos son frecuentemente sensibles. La resiembra continua en el laboratorio, en leche esterilizada en autoclave, puede modificar las propiedades de ciertas cepas resistentes y volverlas sensibles, ya sea a la peroxidasa o a las aglutininas. EUo explica la sensibilidad de las cepas mantenidas en el laboratorio mediante resiembras frecuentes. Volveremos sobre este importante punto en el apartado VII. Se ha observado con frecuencia que la actividad de los fermentos lcticos vara segn el origen de la leche utilizada. Igualmente se han sealado, en determinadas regiones, variaciones estacionarias. Parece que ni la lactoperoxidasa ni las aglutininas intervienen en este tipo de variaciones, ya que su contenido en la leche es bastante regular, y parece no depender del individuo, de la raza, de la edad o del estado de lactacin (exceptuando el calostro). Las sustancias estimulantes tie neo probablemente un papel muy importante en estos fenmenos. En las industrias lecheras, se considera que el calostro, la leche del final de la lactacin y la leche de mamitis, son desfavorables al cultivo de bacterias lcticas. Estas leches son ricas en aglutininas o en inCopynghled r1atenal

Desarrollo y eccln de microorganismos en la leche

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hbidoru putlculares, q ue pueden aer responAblee de este inconveniente. Pero vere11101 ms adelante que estas leches contienen tambi& austandu eatlmu.l.antes.
V SUSTANCIAS ESTIMULANTES EN LA LECHE CRUDA
A) FICtortl de cnc:imlento

La leche contiene los factores de crecimiento neoe.ario1 a la mayor

parte de lu bacterial lcticas; se trata fundamentalmente de vitaminu del grupo B,. Lat variaciones en hu concentraciones pueden ser causantes de cambios en la actividad de estas bacterias en lu diferentes muestru de leche. Sin embargo , algunos rmenea no se muestran sensible a la adicin a la leche de e&tol ractorea en forma purificada. El extracto de levadura estimula a diverau bacterias tcticas, pero ea una auatancle muy compleja, que, adem de laa vitaminas del grupo 8, ea rica en pptidoa y aminocid08. Tambin aon eatlmu.l.antea unu IUitanclu diaUntu de loa cofactoree vltamfnlcol y de 101 prtidos: - laa bues nitrocenadas (purinas y pirimidinu), componentes de 101 nudetid01. -el u carbnico, que facilita la bioainteeb de determinadas especi@S. - alunoa metales, como el manganeso, que estimula selectivamente a determinadas cepas lcticas.

B) Amlno6oldoa, pptidos y proteosa-peptona Entre loa compueetoa nitrogenados de b~o peso molecular, loa aminocidoa y ppUdoa son los ms eficaces para estimular el crecimiento; el contenido de la leche en aminocidos Ubres ae alta normalmente alrededor de 0 ,05 %, o aea un valor aproximada.m ente 10 vecea menor que la concentracin prevista para un buen cultivo de bacterias lcticu en un medio ainttico. Las protenas y cierto componentes no protelcoa (urea y kido rico) ron desfavorables para el deaarrollo de laa bacterias lcticu. Se ha observado una relacin directa entre la ectividad de las bacterlea )jctlcu meeftlas y el contenido en pptldos de la leche en que &e cultivan. Numeroaoa aminocidos y pptidos pueden estimular el crecmie.nto de las bacterias; en particular las estreptogenina1, que aon polipp tldoa formadoa en el curso de la hidrliaie dirigida de la cuena; con tienen de 11 a 12 aminocidos, siendo loa ms importantes la valina y la prollnn. Un aporte de peptonas o do hldroli~oc;lo de casena me-

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Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

jora muy a menudo el crecimiento y la actividad fermentativa de las bacterias lcticas en la leche, como 7el'emos en el captulo XII. Bajo la accin del calor o tras la reaccin de la quimosina, se for man pptidos que tienen actividad estimulante. En el lactosuero, el desarrollo de algunas bacterias es ms rpido que en la leche y se fa vorecen algunas actividades, como la formacin de dlacetilo por los estreptococos lcticos. El efecto favorable de un previo desarrollo de diversos grmenes en la leche, antes de la siembra de bacterias lcticas, puede atribuirse a actividades proteolticas limitadas que conducen a la formacin de pptidos. Este fenmeno interesa especialmente a la "maduracin" de la leche de quesera. A pesar de la presencia de sustancias bacteriostticas, puede obser varse que determinadas leches estimulan el crecimiento de algunas bacterias, como el S. a,rafactUJe y el S. lacti$. El calostro segregado por la mama antes del parto tiene un efecto estimulante bastante ele vado. Se sabe que durante el perodo en que las vacas se encuentran secas son ms susceptibles a la infeccin de la mama que durante el perodo de lactacin. De la miama forma, la leche que prooede de cuartos infectados de la mama es ms estimulante que la que procede de cuartos sanos frente al S. a,rafacti4e (agente de la mamitis conta glosa). Estos efectos estimulantes pueden deberse a una concentracin ms elevada de compuestos sulfurados en la leche, como la cistena. Las sustancias estimulantes de la leche cruda son poco conocidas. Sin embargo, el desarrollo de las bacterias lcticas est ms condicio nado por el contenido de la leche en sustancias estimulantes que por el contenido en sustancias inhibidoras.

VI EFECTOS DEL TRATAMIENTO TERMICO Y DE LA IRRADIACION DE LA LECHE

Al Tratamiento trmico
En el curso del calentamiento intervienen varios fenmenos, los cuales son responsables de las modificaciones que experimenta la leche respecto a su aptitud para el desarrollo de bacterias, en especial de las lcticas: l. Destruccin de inhibidores naturales. Las aglutininas y la lactoperoxidasa se destruyen en las condiciones de calentamiento ligera mente superiores a las de pasterizacin de la leche de consumo. 2. Desaparicin de sustancias estimulantes naturales, tales como aminocidos y factores de crecimiento, que puede deberse a descomposicin, o en el caso de los aminocidos, a la combinacin con la lactosa o sus productos de descomposicin. Este fenmeno no se
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Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

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observa ms que a temperaturas bastante elevadas; por ejemplo, en el c11r110 de la esterilizacin en autoclave (120C/15 minutos). 3. Aparicin de sustancias estimulantes o inhibidoras, como consecuencia de la descomposicin de ciertos constituyentes de la leche, en particular de: a) La tl-iactoglobulina, que hacia 80-90C da origen a sulfuros voltiles con propiedades inhibidoras. b) La lactosa, que en el transcurso de la esterilizacin en el autoclave o a temperaturas un poco inferiores origina sustancias estimulantes, especialmente cido frmico . e) La casena, que en las mismas condiciones da origen a sustancias estimulantes, pptidos y aminocidos.

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(durante 20 minutos)

Temperatura de caJentamionto de la leche

Figure 59. Efecto del calentamiento de la leche sobre el crecimiento de LBctobacillus laclis (0,37). 1) Estlmulacln debida a la deslrucciOn de las laclenlnas.
2)
3)

Estimulacin debida a la aparicin de cido frmico.


Retardacin debida a la destruccin de suslancas estimulantes. (SegUn Auclair y Portmann, 1958)

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Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

La respuesta de Jos diferentes grmenes es evidentemente muy variable segn su sensibilidad a estas diversas s114tancias, aparecidas o eliminadas. La figura 59 ofrece un ejemplo caracterstico, con un Jactobacilo sensible a la vez a las lacteninas y al cido frmico. Con otras bacterias se podra haber obtenido otra curva muy diferente. Por ejemplo, con la cepa RM-110 de Streptccoccus lactls se obse:rva la misma actividad, cualquiera que sea la intensidad del calentamiento (la curva habra sido una recta horizontal).
B)

La irradiaci6n

En un producto como la leche, la irradiacin puede producir dos efectos opuestos. Las dosis pequeas favorecen el desarrollo microbiano, punto este poco estudiado hasta el presente. El efecto ms importante, sin embargo, es la inhibicin que aparece con dosis superio res a los 400 krad. Se sabe que las radiaciones ionizantes son susceptibles de destruir numerosas vitaminas que actan como factores de crecimiento, por ejemplo la tiamina y la riboflavina. Los resultados de unas recientes investigaciones indican que este fenmeno no puede ser el nico causante del efecto del lactosuero irradiado sobre el crecimiento del L. lactls. Es preciso admitir que el lactosuero irradiado contiene tambin inhibidores; la tendencia es concentrarlos, porque la inhibicin aumenta cuando se someten a esta operacin. Estas sustancias se forman durante la irradiacin del lactosuero, y el fenmeno observado es diferente del que podra resultar de la destruccin de los factores de crecimiento. La irradiacin de la lactosa, de la casena y de la materia grasa, no produce compuestos inhibidores. Posiblemente, las tcnicas microbiolgicas constituyen un medio apropiado para el estudio de las sustancias biolgicamente activas que se forman en los productos irradiados.

VIl PROPIEDADES DE LAS BACTERIAS ASOCIACIONES Y ANTAGONISMOS

Al Propiedades
Es preciso insistir en que las causas de Inhibicin y estimulacin que hemos estudiado anteriormente tienen efectos diferentes segn las es pecies, e igualmente segn las cepas de bacterias presentes en la leche. Las propiedades de las cepas de bacterias lcticas pueden variar . sobre todo cuando se cultivan durante largo tiempo en el laboratorio. Se ha dicho, en el caso de los estreptococos, que las cepas "aalVllles" (aisladas en la naturaleza) son siempre resistentes a los inhibidores, y que la sensibilidad es una caracterstica de las cepas de laboratorio. Copynghted matenal

Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

347

Pero se precisa prudencia al interpretar las variaciones de actividad y distinguir bien entre la sensibilidad a los inhibidores y la prdida del poder acidificante. Con frecuencia se observa en el laboratorio, tras largas series de resiembras en leches sometidas a la accin del autoclave o en los medios de cultivo, que determinadas cepas de bacterias lcticas, resistentes a las acciones inhibidoras, pierden progresivamente su aptitud para fermentar la lact;;.., y para producir cido lctico; por otra parte, pude observarse tarnb.r. en las mismas condiciones, que otras cepas desarrollan sensibilidad _ los inhibidores, sin prdida del poder acidificante. Estos dos tipos de cepas, sembradas en una leche que contenga inhibidores, no producirn prcticamente cido por dos razones diferentes: las primeras cepas, insensibles a las lacteninas, proliferarn en la leche, pero sin fermentar la lactosa; las segundas no se desarro Darn por el hecho de la inhibicin. Las cepas "lentas" son aquellas que han perdido parcial o enteramente su poder acidificante, por oposicin a las cepas "rpidas", que provocan una fermentacin lctica enrgica. Sin embargo, las cepas lentas tienen un ndice de crecimiento comparable al de las cepas rpidas; son ms sensibles a la accin estimulante de los compuestos nitrogenados, mencionada ms arriba, que provoca un aumento del nivel de utilizacin de la lactosa y, por tanto , un aumento en la produccin de cido, sin acelerar el crecimiento. Estos ejemplos ponen de manifiesto lo que se designa con el nombre de "plasticidad" de las bacterias, debido, tal vez a mutaciones irreversibles. Nos encontramos entonces en presencia de un mutante "Lac"". Tambin puede tratarse de modificaciones lentas y reversi bies; en este caso, la aptitud perdida puede recuperarse por un CBDI bio de las condiciones de cultivo. Los recientes estudios sobre las variaciones de las bacterias lcticas han demostrado que existe una relacin entre la produccin de proteinasas por les estreptOcocos y la aptitud acidicante. Las cepas "lentas" son aquellas en que es elevadala proporcin de variantes desprovistas de proteinasa.
B) Asociaciones Existen numerosos ejemplos de la influencia favorable de ciertas aso elaciones bacterianas, sobre el desarrollo o la actividad de uno oam bos componentes asociados. Una determinada cepa de bacterias puede tener una actividad fermentativa dbil o un nivel de crecimiento bajo, por el hecho de depender, en cultivo puro, de su propia actividad proteoltica. Si esta cepa se asocia con otra ms fuertemente proteoltica, sta ltima provocar una estimulacin debida al aumento del contenido en pptidos y aminocidos libres. Es el caso de la asociacin S. thennophilus + Lactobacillus bulgaricus, utilizada en la fabricacin de yogur.

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Desarrollo y accin de mlcroorganlamosen la leche

El eatreptococo se encuentra fuertemente e.tlmulldo por loe mino-

cidOI reaultantea de la dl!l'&dacin de l.u protenaa de la leche por el lactobacilo. Pero tambin se ha delDOitrado que S. thtrmophihu tiene una accin estimulante propia, debida a un factor deaconocido auatltulble por el 6cido frmico. En wlecbea individualea y en loa q ueao. se encuentran eatreptococos lctlcoe que estimulan el crecimiento de loa lactobac:Uoa, como se muestra en la figura 60.

Figure to. E.stimu:laein de-l erecimfenro el un ..ctoaaclto por loa Hlteptococos lc tiCOI
(El I..Kto&.clllu$ loct~ M mis , _ , . al r - c10 "treptocoeos. formando zonas opacos -.a pl.lca de~)

-e.

colonias <le

tFoto R a....tier. t N.RAJ

C) Ant~ganiamoa

Loa fenmenos de antibiosis aon sumamente frecuentes. Diversos antaonilmoa explican el dominio de ciertos grmenea que tienden a ocupar el terreno entre una poblacin compleja: a) Exllte un antagonismo general entre las bacterias acidific:antes que reailten pH bastante bajos (4 a 5 ), y las bacterias que no tienen

Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

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eata aptitud, especialmente las proteolticas de los medios neutros y alcalinos. La evolucin de la microflora en las cuajadss de quesera y en la pasta de los quesos eat en relacin con el pH. Las bacterias de los fermentos lcticos detienen el desarrollo del E. colt cuando el pH desciende a 6. b) Algunos antagonismos se ejercen por intermedio de una sustancia t6xica, resultante del metabolismo de una especie determinada. Por ejemplo, la produccin de CI8U4 oxigenada por ciertos lactobaci los es la causa de inhibicin de otrss especies, en particular de Clostri dia, bacterias colltormes, estafilococos, etc. La proteccin de los quesos de pasta cocida (por ejemplo, gruyere) contra los agentes del hin chamiento, procede probablemente de este tipo de antagonismo . e) Antagonismo directo, por la produccin de antibiticos. Este fenmeno se conoce de antiguo en el mundo microbiano; probablemente es general, pero no se conoce bien ms que para un nmero limitado de antibiticos. Los antibiticos son sustancias elaboradas por unos microorganismos y poseen una actividad inhibidora sobre otros microorganismos. Entre las bacterias que interesan ms especialmente a los microbilo gos que estudian la leche, existe un importante ejemplo de este tipo de ant!b!osis en la elaboracin de nisina por Streptococcus lactis, que se ver en el captulo siguiente.

VIII BACTERIOFAGOS
El bacterifago ataca especficamente a las bacterias de una cepa determinada y las destruye. Cuando la leche contiene "fagos", el culti vo de bacterias de esa cepa ea imposible. Es un fenmeno Importante para los "fermentos lcticos". Cuando el bacterifago penetra en una bacteria sensible, sta deja de crecer y tras cierto perodo, 20 minutos en medio favorable, la bacteria se diqrega (lisis microbiana) y libera un centenar de bacterifagos. Los cultivos en medio lquido se aclaran y vuelven lmpidos; las colonias atacadas por el bacteriflll!o se disuelven. La especifici dad es muy acusada; no solamente llega a la especie, sino tambin a la variedad. Se conocen f1111os que pueden contaminar bacterias que pertenecen a variss especies de un mismo gnero, pero, en todos los ca sos, stas no s n ms que algunas cepas sensibles. Existen cepas lisgenas, contaminadas simbiticamente por el bacterifiii!O, bl\jo una forma no infecciosa: el probacterifago; de este modo se perpeta el bacterifago hasta el momento en que interviene la lisis. El desencadenamiento de la transformacin del probacterlfago en bacterifago depende de factores externos (rayos U. V., agentes qumicos, etctera).
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Desarrono y accin de microorganismos en la leche

El estado de la bacteria tiene importancia; la lisis no ocurre ms que en bacterias jvenes y en vas de crecimiento. En general, el medio favorable a la bacteria conviene tambin al fago, a condicin de que contenga calcio, triptfano y tal vez otras sustancias Indispensables. Puede elaborarse un medio "resistente a los fagos" utilizando componentes exentos de calcio o aadiendo al medio (ala leche, por ejemplo) fosfatos o citratos que precipitan o complexan el calcio. Debe sealarse que los bacterlfagos se vuelven Inactivos cuando la leche se coagula por el cuajo, posiblemente porque las bacterias quedan protegidas por el gel de casena. La produccin de una cubierta mucosa (cpsula), por ciertas cepas de bacterias, las vuelve poco sensibles a los fagos. En Jos tubos de cultivos liaados aparecen frecuentemente "cultivos secundarlos" al final de un tiempo ms o menos largo; este nuevo punto de partida se debe a las clulas resistentes al fago. Se ha Invocado la existencia de fagos en "estado naciente" para explicar el fenmeno siguiente: si se ponen juntos 1 fago + 1 cepa sensible + 1 cepa Insensible, llega un momento en que esta ltima (que por s sola habra resistido) es igualmente lisada. En realidad, la causa es la produccin de una bacteriolisina por el sistema lago-bacteria sensible. Este fenmeno afecta al caso de los fermentos constituidos por una mezcla de dos cepas bacterianas. Se han podido inmunizar vacas mediante una preparacin bacterifaga; la leche produce entonces un alto nivel de anticuerpos capaces de neutralizar a los fagos correspondientes, en cuya presencia se hace posible el cultivo de bacterias Jcticas. Esta puede ser la solucin del porvenir pero son de esperar muchas dficultades. Los fagos son, en general, bastante resistentes a los agentes fsicos. Los de los estreptococos lcticos mesfilos utilizados en la industria, conservan toda su actividad tras varios aos de conservacin en frigorfico a +4c. La resistencia al calentamiento es mayor en la leche que en ellactosuero o en un caldo de cultivo, y probablemente se debe a que los fagos pueden fijarse sobre la casena micelar. En lo que se refiere a los agentes qumicos, se sabe que los fagos son destruidos fcilmente por los h.ipocloritos y por los "yodforos". Los aspectos prcticos de la lucha contra los fagos se vern en el captulo siguiente.

IX INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA
PROLIFERACION DE LAS BACTERIAS EN LA LECHE

La infiuencia de la temperatura es considerable. Anotaremos los da tos esenciales con vistas a futuros desarrollos.
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Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

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Al Efecto cuantitativo Cualquiera que sea la composicin de la microflora original de la leche o de otros productos lcteos lquidos, se observa una aceleracin del desarrollo microbiano, y por lo tanto un crecimiento de la micro flora total cuando se eleva la temperatura de conaervacin basta 3540 C. Por el contrario, ms all de dicha temperatura , se observa un retardo. Cuanto ms baJa es la temperatura, ms se retarda la proliferacin microbiana en la leche; este conocimiento es de importancia primor dial para la produccin de leche; en el captulo XVll presentaremos datos ms precisos.

Bl Efecto cualitativo
No son las mismas especies las que predominan a las diferentes temperaturas de conservacin o de tratamiento. La temperatura tiene un papel selectivo importante, que se aprovecha en las industrias lcteas. 1. A temperaturas medias de 20 a 37 C, es en general la flora lctica "mesfila" la que invade Ja leche y provoca su coagulacin por acidificacin, sobre todo los estreptococos; las bacterias coliformes, que son muy tolerantes a las variaciones de temperatura, tambin pueden intervenir. 2. A temperaturas relativamente bajas, entre 5 y 15 e, predomina una microflora sicrotrofa constituida por bacterias Gram - muy di versas de las que se ha tratado anteriormente, entre las cuales se encuentran grmenes proteolticos y Jipolticos. La leche se altera entonces muy lentamente. 3. A temperaturas superiores a 40 C, se seleccionan las especies termfilas; en la leche cuajada para la fabricacin de gruyere, se favorece el desarrollo de lactobacilos hacia Jos 50 c. En las leches pasterizadas se encuentran a veces micrococos resistentes. En las leches hervidas o insuficientemente esterilizadas, las especies esporuiadas (BacUlus y Clostridia) forman la parte esencial de la flora. Hay que hacer una reserva en lo que se refiere a la tolerancia a las variaciones de temperatura de determinadas especies, especialmente de bacterias perjudiciales en la leche, como las del gnero Alcali8enes, cuyo desarrollo es an notable a 10 y a 37c, o de E. colla 20 y 40 C. Otras especies son ms exigentes y slo se desarrolian bien dentro de un margen muy estrecho, en tomo a su temperatura ptima, con variaciones en ms o menos no superiores a 5 C; es el caso de las bacterias lcticas industriales. En lo que se refiere a las actividades bacterianas, es preciso consi derar el efecto de las variaciones de temperatura sobre la velocidad de
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Desarrollo y accin de mlcroorganltmoa en la leche

lu reacciones enz:imtic:u. Loe ailtemaa enz:imtlc:oa microbianoa tienen a veces una actividad ptima en una zona de temperatura que no ea la de la multiplicacin activa; eapedalmente eo el caao de laa prot e - de loa &ci!U y ProWi6, que aon m activas a una temperatura Inferior a la de su deaarroUo mximo . Elliate tambin la situacin inversa; lu proteasaa de ciertas bacteriaasicrotrof11 aon m activas a oo e que a 20 e, y a vecea aon incluao termorrealatentes.

X DEGRAOACION MICROBIANA DE LA LACTOSA V SUS CONSECUENCIAS


La modllicacln ms notable de loe componentes de la leche es la acidificacin originada por el metabolismo fermentativo de loa microor ganitmoa. Los productoa de la fermentacin varan, por una parte, con la eapede que se conaidere y, por otra, con 111 condiciones del cultivo. El cuadro 41 aporta valores indicativos. Independientemente de la fermentacin alcohlica debida a las levaduraa, la fermentacin de la lactoaa por Jaa bacteri11 va acompailada alempre de la produccin de cldoe orgnicos y por lo tanto de un descenao del pH del medlo . CUando predomina la formacin de gu y de austanciu neutral, alcoholea y cetonas. la produccin de cido. orgnico~ puede estar bastante limitada. Laa col\leCUenciu de Jaa fermentecionea de la lactoaa IOn las liguientea:
1. CCXIfUIDcin de la ~che por tJCidi(il:acin. Se puede producir, al cabo de algunas horu, a la temperatura ordinaria, pero ae puede ob aervar antes calentando la leche. La coagulacin tiene por origen, en primer lugar, la accin de los fermentos lcticos y la de otras bacte rlas variadas, en especial las enterobacterias. Es una tranaformacin de Importancia capital que consideraremos frecuentemente . Es necesaria una mencin eapeclal respecto a cleroa mlcroo.rganismoa eapoNladoa, del gnero &c.lllua, que degradan tardamente la lactosa produciendo una mezcla de ddoa traa haber coeculado la leche por la acc:in de una proteaaa. 8acteriaa de ene tipo, designadas con el nombre B. coa,rulana, son la causa de la altendn de la lecbe concenuada esterilizada (inauficientemente) en botea. Ene tipo de grmenes aon !acultativoa y pueden deaarrollarae con una tensin de ox Eeno muy reducida. Su temperatura ptlma ae baila hacia los 45 C. Tambin pueden encontrarse &ciUu .teorothermophllua cali dolactt. en 111 leches paate.rizadas, con un metaboUamo anlogo.

2. Produccin de'" Domina siempre el 1111 carbnico, pero pue de eatar acompaado por el hidrseno. &ta "fermentacin gaseosa" suele aer perjudicial porque produce eapuma en 101 productos Jqui doa o bolsu de gas en los productos paatoaoa o en loa cuajadoa (aalvo,

Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

353

en el ultimo C810, cuando se buaal precisamente la formacin de "ojos"). El cuadro 41 muestra los productores de gas. Laa levaduras que produoen espuma en .las nates crudas y qe hinchan las cuaJadas frescas en cmare caliente no son del gnero SaccJUJromyces; producen poco alcohol y el gas es C02 puro. Laa enterobecterias producen tambin hidrgeno, que por ser poco soluble en el agua se desprende precozmente. Estos grmenes son, con ms frecuencia que los anteriores, los causantes de la hinchazn precoz de los quesos elaborados con leche sin pasterizar. Laa bacterias coliformes son poco sensibles a las variaciones de temperatura, tienen un crecimiento rpido a los 20 e y se desarrollan bien huta loa 40 C; adems, son poco sensible~ a los antibiticos utilizados normalmente en el tratamiento de la mamitla, sustancias que reallmn una verdadera seleccin a su favor. 3. Produccin de aust4ncalui8colltl8. Existen varios tipos de microorganismos que al desarrollarse en la leche o en loa productos lcteos, son capaces de realizar, graciu a la actividad de una tranaferaaa,la sntesis de poliBacridos, mediante la condensacin de uno o dos reatos de las monosaa que constituyen la lactosa. De este forma, loa Leuconostoc muenteroide8 y dextronicum producen dextranos cuya malla elemental es la glucosa. Otros grmenes pueden producir molculas glcido-nitrogenadas: las mucinas. Todas estes sustenclas se incluyen en el grupo de los hidrocoloidea gelificantes. El resultado de esta actividad (que se ha denominado "fermentacin viscosa") cuando ea paralela a la fermentacin lctica, es el aumento de la viscosidad. La leche se vuelve "filante" y se vierte del mismo modo que un jarebe, pudiendo formarse masas viscoaaa parecidas a una gelatina. Los grmenes causantes son inofensivos, pero, en el caso de la leche de consumo, la viscosidad producida constituye un defecto, Esta alteracin se evita fcilmente por medio de la pasterizacin, porque bacterias tales como Alcaltgenes ul8cosua, que ea la que ae encuentra con mayor frecuencia en la leche cruda, no resiste un calentamiento a 72 C. Se treta de una especie propia de los medios neutros o poco cidos, muy capaulada y aerobia; cuando crece en la leche, la capa superficial se vuelve viscosa, sin alteracin de la perta profundL La produccin de sustancias viscosas puede ester asociada a la fermentacin lctiCL Varias especies de estreptococos y de lactobacilos que se estudiarn en el prximo captulo, tienen variedades que son cepiJ8 filantes, las cuales slo conservan esta propiedad en condiciones fisicoqumicas muy bien determinadaa. La viscosidad es tanto ms pronunciada cuanto ms baa es la temperatura de cultivo (20 e e Interiores). La viscosidad disminuye cuando la acidez aumenta fuertemente.
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Cuadro 41. Producto de 141 ferment4cfone (en 'en peto de cl!dT fermentado)(*)

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( ) Estos valoroa tienen un caricter indicativo. Lu condleionOJ de cultivo tienen una 111n Influencia en la proporcin de pro ductoo formados.

Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

355

XI LA DEGRADACION MICROBIANA DE LAS PROTEINAS Y DE LOS LIPIDOS

eonsiderando tan slo la leche lquida, la proteolisis y la liplisia tie nen menos importancia que la glucidlisis. Sin embargo los mtodos de reoogida de la leche les ha dado, en los ltimos tiempos, un gran protagonismo por la aparicin de una flora sicrotro!a constituida por especies que producen diversas proteasas y lipasas, de las que se tra tar en el captulo XVII. La produccin de proteasas y lipasas exocelulares no est' unifor memente extendida en el mundo microbiano. La mayor parte de las ba.cterlas lcticas no tienen ms que un equipamiento intracelular. Por el contrario, especies pertenecientes a la familia de las enterobacterias o de las esporuladas anaerobias estn muy provistas de enzimas hidroltlcas de todo tipo. La ooagulacin de la leche sin acidificacin, seguida de la digestin y licuefaccin del oogulo, en ocasiones poco visible, se debe a diversas bacterias que no se desarrollan cuando estn presentes las especies tcticas. Los Bacillus cereus y subtilis son los agentes ms comunes de la alteracin de los productos pasterizados o esterilizados (incomple tamente). Streptococcus {aerolis tambin produce la coagulacin de la leche sin acidificacin, pero no resiste la pasterizacin.
B . cereus tiene la particularidad de producir una lecitinasa activa que disgrega los glbulos grasos. Es la causa del defecto llamado "na ta cortada" (bitty cream).

Ya se ha hablado de la liplisls y la rancidez como defecto de la le che que preocupa mucho en algunas regiones . Entre la flora inocua de la leche oonstituida por grmenes gram - se encuentran grandes productores de lipasa. Las lipasas microbianas se suman a la lipopro tena-lipasa natural de la leche, aunque su especificidad es diferente, lo mismo que su termorresistencia, lo que hace difcil emitir un pro nstico. Los cidos grasos liberados son inhibidores de las lipasas pero a un nivel superior al lmite de percepcin organolptica.

XII OBSERVACIONES SOBRE LA ALTERACION DE LA LECHE

Al Los defectos microbianos Son varias las caractersticas que los distinguen de los otros: l. Las condiciones de desarrollo no existen en la leche en el mo
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Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

mento del ordeo. r.o. srmene~ cauaantea no te encuentnn eo la mama aana. 2. Loa defectol18181'8van coo el tiempo. 8. Pueden tnJumitine por ioocnlecln de una Jech.e a otra. 4. El calor (puteriracin, eaterilizacln) deltruye loa grmene~res ponublea e impide la aparicin del defecto. 6. Una determinada alteracin no auele ter producida por una sola eapecie lino por una uociecin de ellaa. Por otro lado, una tmnalormacin, viata en su conjunto, puede eatar provocada, teiJlloa casos, por especies a veces muy alejadaa unu de otru. En la prctica se CO noce una transformacin microbiene de la leche por ciertos aapectos o propiedades caractersticas, antes de averluar la especie o especies de bacteriu que la producen. 6 . La acidificacin d.e la leche se opone a otras alteraciones. Los fermentos lctlcoa Inhiben el desarroUo de lo grmenes que ee deaa rrollan preferentemente en loa medios neutro. o poco icidoa; constituyen una proteccin contra numero.o 1rmenea proteoHticoa. La adicin de un agente neutralizante a la leche o al auero hace que esta proteccin desaparezca, por lo que dicha adicin puede tener efectos nefutos.

Noto:- Allf como en el c:uo do lo lclot do COillumo, eullqulor llteracibn conatituyo un dtfocto, no ocurro lo mltmo on ol c:uo do loo derlvodoa lcteot. Muchos do eatoa productoa dependen do lu actlvldodot mlctbl.,... y puodon

tu muy Influido& por loa defectos mk:roblanoe. Por etta raz6n, en la teenolorra dO fabricac16n lntoi"'IODO on ron parto ol control do lo mlcronora.

B) Sabol'es d ivlll'1os A veces ea dificil diferenciar los saborea procedente. de acciones mi croblanas, de loa que tienen su origen en otras caiiiU (alimentacin, olorea absorbidoa, etc. ). As, por ejemplo, cierto saborea a jabn, nabos, h.eno, etc., pueden debelse a acciones bacterienu. l . El sabor a 1041ta, que puede confundine con el " sabor a coci do", se encuentra en ocasiones en la leche cruda, y se debe a una variedad de bacteria lctica comn, el S. lact~ var. ID41t(lene.

2 . Loe saborea allt4rgos se deben a bacteriu proteolticas, especialmente al S. {Mea/t. var. liquefacien, y a vecet a levaduru como la Torula amaro. Se han encontrado Actinomycee en laalechea de sabor amargo y mohoso.
ynght~:d

atenal

Desarrollo y accin de microorganismos en la leche

357

3. El sabor a patata ae debe al Pseudomonae groveolsna, germen que se deearrolla bien a temperaturas bejas. Este sabor penlate tras la pasterizacin. 4. Las bacterias coliformes se manifiestan en ocaaionea por labores deaagradablea difciles de definir. Por ejemplo, el Aerobacter aerogenea se ha considerado como responsable de un "sabor a medlcamen to" que hizo lnutlllzables para el consumo grandes cantidades de le che en los Estados Unidos; los grmenes, que en este caso procedan del agua de lavado, 10n destruidos por la pasterizacin. En la manta quilla puede encontrarse este germen en grandes cantidades, pues ae desarrolla todava bien a tsc. 5. Existen bacterias no identificadas que producen sabores aromticos, a frutu, no desagradables; en general no 10n persistentes y sue len aer reemplazados por otros menos agradables. 6. Las levaduras confieren a la nata un sabor a "levadura",lndeaea ble, y algunas bacterias proteOlticaa aportan sabores de "queso viejo". La conservacin de las natas sin pasterizar y mal cuidadas, producen numerosas anomalas de sabor, de origen microbiano.

Cl Produccibn de color Las lsches coloreadas a causa de los microorganismos aon raras, a pesar de que la leche contiene corrientemente grmenes cuyas colonias sobre medio slido 10n coloreables. Las leches limpias no experimen tan este defecto, lo mismo que las leches calentadas. En los productos coloreados se Identificaron anteriormente tres microorganismos: Paeudomonll8 aeruginoaa en las leches de vas de acidificacin, que colorea de azul la superficie; Paeudomonii81;)111Xan tha que colorea de amarUio la capa de nata y, por ltimo, .Serratta marcescena, que colorea de rojo la leche, la nata o el babeurre. En las natas conaervadas se ven a veces manchas de color rosado debidas a la levadura Torula gluttnlll, y en la mantequilla zonas verdes dlfusaa debidas a Paeudomonll8 fluoreacena.

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Captulo 12 Bacterias lcticas y fermentos

1 BACTERI AS LACTICAS

Al Clasificecin
La presencia de una cantidad elevada de cido lctico en los produc tos de la fermentacin anaerobia de los azcares, es un carcter blo qumico importante que justifica la integracin, dentro de un mismo grupo, de bacterlaa que acusan grandes diferencias en su morfologa. Las clasificaciones fundadas en esta propiedad derivan de los trabajos fundamentales de Orla.Jensen (1924 ). Esta familia se encuentra disociada en la clasificacin de Prvot y en la del Bergey 'a Manual, que tienen mucho ms en cuenta los carac teres morfolgicos. Las bacterias lcticas esfricas se encuentran en la familia de las Streptococ~ae. y las bacterlaa en forma de bacilos en la de las L4ctoboclllaceoe. La antgua clasificacin de Orla.Jensen (cuadro 42), a pesar de no estar conforme con las normas actuales, no ha cado en deswo; los especialistas en bacterias lcticas emplean siempre loa nombres de los grupos cresdoa por dicho autor. El cuadro 43 muestra las dos familias segn el Bergey 's Manual. Loa estreptococos y los Leucono1toc, o Betacocos, forman una de las tres familias de los cocos gram + , con tres gneros secundarios. Los Lac tobacllos son los nicos representantes de los bacilos asporgenos gram +. Es necesario tener en cuenta que en el momento actual no existe una clasificacin plenamente satisfactoria de estos microorganismos~
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Cuadro 42 C/tulflc4cln de 1M bacterias 16ctlcat eegnORJ.A..Ii:NsEN (1924)


A) GRUPO BOMOPERMJ!NTATIVO

Bacteriu que aolamente forman indicios de productos aoceaorlos junto coa cido lctico, que repre10nta del 90 al 97 % de la lactosa fermentada.
1

17rmnob4cterlum (Lactobacillu) Bastoncitos alarpdos, aislados o en cadenas cortas. Termr.Jos (temperatura ptima entre 40 y SO "C). Acidificantes muy en6ricoa, basta el 2,7 % de cido inac tlvo o levaJro. - Actividad caseoltlca notable. Strtptobllcterlum (LactobaciiJus} - Bastoncitos cortos, en cadenas. - Temperatura ptima baca 30 c. - Acidificacin muy lenta, pero acusada (1 %y m), cido inactivo o doxtriro. - Actividad caseoltlca. Strt ptococcus (g6nero consonado) Formas esf6ricas, cadenitas do lonaitudes diversas, que pueden ser muy cortas en los modios 16Udos; cido dextrsiro.
B) GRUPO HETEROFERMENTATIVO

11

1TI

La produccin de cido es m d~bU; adem del cido lctico se forman otros cidos, sustancias diversas y ps.

IV

Bifidobacttrlum - Bastoncitos que se ahorquJilan en los culthos viejos. - Producen cido a~tico en proporcin elevada y cido lctico dextriro. - Anaerobios abundantes en las heces de los lactantes. Betabacterium (Lactobaclllus) Formas en bastoncito, produccin de ps, de cido succni co, etc. No actan sobre la casena. Acido lctico IDactlvo. Bttacoccus (Leuconoltoc) - Formas esf~ricas, semejantes a loa estreptococo, pero el cido l!ctlco producido es leviro. - Proceden de los -.egeWes en descomposicin, remolachas,
et~tera.

VI

- Fermentan las pentosas y descomponen las pectinas. - Fermentacin vlscoaa con la sacarosa y produccin de mucao.

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Bacterias lctlcas y fermentos

361

Cuadro 48. Claificacln del "Bergey '8 Manual" (Porte~ que compren-

den lol bocterlolldctiroe)*


PARTE 14: COCOS GR.AMI'OSITIVOS
Familia 1) Mlcrocoecaceae (catalua positiva) Gnero: 1) Microcqccu.: aerobia estricta; exigenciasd6bUes; tolera S% NaCI; hbitat: el suelo, el agua; no patgeno. G6nero: 2) StiiPhy/JJcoccu.: aero-anaeroblo, randes exlpncias; tolera el 1S% de NaCI; hbitat: la piel y mucosu animales; patgeno; lntoxicaeonet allmentarias. G6nero : 3) (P/anococcus/ Familia 2) Streptococcacue (catalasa nepti"") G6nero: 1) Streprococcu.: anaerobios facultativos, homofermtntativos, cido lctico D; cultivo a 37 e, grandes exigenclu; hibitat muy variable (a!unu especies puecen restrinsidas a lot productos lcteos); algunas de las especies son pat6enas. Gnero: 2) Leuconostoc: anaerobios facultativos. heterofermentativos; cido lctico D y otros productos; cultivo a 20-30 ~C; tlf&ndes exisencias; hbitat: productos azucarados y productos lcteos; no patgenos. Gneros: 3)Pedicoccu; 4)Atrococcus; 5) Gemella

PARTE 16: BACILOS GRAMPOSITIVOS


Familia uica: Lectobadtaceae (catalasa neptlva)

Gnero nico: Loctobacillus: anaerobios facultativos, homo o heterofer mentativos; cido !Actico variable; exigencu complejas; hbitat: productos animales y veetales en fermentacin y ciertas partes de los animales de san gre callente; no pat6seno (subclivisible en 2 grupos segn su tem~ratura ptima: 35 6 4S e.
Exigencias fuertes: necesidad de aminocidos, vitaminas o factores de crecimiento.

La situacin es todava bastante confusa en lo que se refiere a la definicin de determinadas especies y la eleccin de los nombres. Es probable que se aclare en el futuro gracias a la aplicacin de los mtodos

modernos de identificacin, reacciones aerolgicas, estudio del contenido celular, de la composicin de la pared y de la relacin entre las bases nitrogenadas en el DNA, estudio de la hibridacin del DNA, etc. Existen numerosos homnimos, ya que muchos autores han estudiado las bacterias tcticas en un producto particular, ignorando las investigaciones emprendidas en otros hbitata, de lo que han resulta do nomenclaturas particulares.
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Bacterias lctlcas y fermentos

B1 Aspectos ecol6gicos Las bacterias lcticas tienen numerosos hbitat&. Independientemente de los productos lcteos, se las encuentra abundantemente en los pro duetos vegetales: ensilados, "choucroute", granos, jugos y mostos en fermentacin, etc. Tambin estn presentes en los tubos digestivos del hombre y de los ariimales, y en las cavidades naturales (boca, vagina). Sin embargo, muchas especies individuales estn adaptadas a un ambiente especfico y no se las encuentra, habitualmente, fuera de l. La facilidad con que estas bacterias pueden aislarse en materiales de la misma naturaleza demuestra que se trata de su hbitat natural. Simplificando, es posible hacer las siguientes distinciones: - Loa estreptococos estn fundamentalmente ligados a la vida animal, la mayor parte como saprfitos, otros como patgenos y pocas especies estn ligadas al reino vegetal. - Los lactobacilos son un poco menos restrictivos, ya que las fuentes no animales son importantes; adems son raramente patgenos para el husped.

11 PROPIEDADES GENERALES DE LAS BACTERIAS LACTICAS


Al Importancia de las bacterias lcticas La importancia prctica de las bacterias pertenecientes a esta familia es considerable, por varias razones: l. Produccin de cido y descenso del pH (es la principal razn): - Proteccin de las sustancias alimenticias debida a la inhibicin de las bacterias de la putrefaccin en medio cido. - Establecimiento de las condiciones fisicoqumicas favorables a diversas transformaciones en la industria lctea; desuerado de las cu!ljadas de quesera, elaboracin de mantequilla. - Fermentacin tctica "aromatizante" que permite la obtencin de productos cidos con un sabor deseado: nata, mantequilla, yogur, etc. - Propiedades higinicas resultantes de la accin antisptica del cido lctico en el intestino. - Produccin industrial de cido lctico. 2. Otras actividades que pueden tener efectos tiles o perjudiciales: - Produccin de enzimas que intervienen en la degradacin de las protenas, en especial de la casena en el curso de la maduracin de los quesos .
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Bacterias lctlcas y fermentos

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- Produccin de aW.U.ncias inhibidoraa re.pon111blea de la seleccin de la.s especies. -Produccin de viloosidad, de gas (hinchamiento), de manchas de moho, etc. 3. Poder patgeno desanollado por determinadu especies (ae estudiarn con ma detalle en los captulos siguientes). 4. Valoracin microbiolgica de laa vit.aminaa o de loa aminocidos, aprovechando laa exigencias nutritivas de laa bacterias lcticas.

B) CerliC18ret esenciales Son bacterias esfricas o alargadas aisladas o agrupadas en cadenitas, Gram +, catalaaa -. No poseen citocromo-oxidaaa. Anaerobios facultativoe, soportan tensiones de oxgeno reducidas; poco crecimiento en la superficie de los medios de cultivo usuales; crecimiento ma fcil en profundidad; en general, la coagulacin de la leche comienza por el fondo. No reducen loa nitratos. Muy exigentes en nutricin nitrogenada y vitamnica; por ello, el medio debe aportar una mezcla compleja de amnocidoa y factores de crecimiento, especialmente vitaminas B. No exirle crecimiento con la.s aalea de amonio como nica fuente nitrogenada. La actividad proteoltica en la leche ea, para muchas eapeciea, dbil y no se manifiesta ms que lentamente.

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).

-~
. 1

Flgurall. Aspecto microscpico de un lactObacto homotermentatlvo (Lacto"-eillus


acldophllus). a) Aspecto normal, bastoncitos regulares
b) Formas aUpleas. clulas hinchadas. (Fotoa Aalbaud. t.N.A.A.)

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Bacterias lctlcas y fermentos

Los dlsacridos (lactosa, sacarosa, maltosa) son corrientemente mejores alimentos que las hexosas de las que estn formados (glucosa, tructoaa, galactosa). El cido lctico producido en el cuno de la fermentacin no es del mlsmo tipo para las diferentes especies; algunas dan cido dextrgiro, otras cido levgiro y otras dan cido racmico Inactivo (ver ms adelante). Lea hexosas se transforman en cido lctico, en una proporcin igual o superior al 90 %, por la accin de las bacterias tcticas llamadas "homofermentativas" y al 50% para las denominadas ''heterofermentatlvas"; estas ltimas forman, adems, gas carb6nico (alrededor del 25% del azcar) o productos neutros (alcohol y glicerol) y otros cidos, sobre todo cido actico. Algunas veces se observan IHJI'JCiones de ciertas propiedades, que pueden ser consecuencia de cambios en las condiciones de cultivo o de la seleccin de mutantes. La aptitud para atacar la casena y fermentar loa diferentes azcsrea puede variar con la composicin del medio. Sin embargo, ea preciso sealar que ciertas caractersticas bioqumicas parecen ser estables cuando los estudios se realizan en condiciones muy bien definidas, sobre todo para los lacto bacilos. Igualmente pueden observarse variaciones en la forma de las clulas. Estas variaciones son, en ge.neral, de escasa importancia. No obstante, es preciso hacer constar que algunas especies poseen tendencia notable al polimorflamo; la f'tgUre 61 muestra un ejemplo. Debe sealarse tambin que el medio interviene sobre loacaracteres morfolgicos; por ejemplo, el paso de la leche a un medio nutritivo de laboratorio puede modificar la forma o la dimensin de las clulas de Lacto bacll/118.

111 CARACTER ES FISIOLOGICOS Y BIOOUIMICOS

En los laboratorios se estudian diversas propiedades de las bacterias;


algunas no ofrecen inters ms que para los estudios tericos y de cla-

aiflcacln, pero hay otras cuyo conocimiento es til en la prctica, como el ndice de acidez producida en la leche, la influencia de la temperatura sobre el crecimiento, la termorresistencia, la produccin de slUtancias aromticas y la protelisls. En los cuadros 45 y 46 {vase ms adelante), se encuentran reseados loa principales caracteres de las especies ms interesantes para nosotros. La fermentacin de los glcidos, que es el carcter fisiolgico dominante en nuestra especialidad, es objeto de un .apartado especial (ms adelante). a) La actividad proteoltica sobre sustratos constituidos por gruesas molculas proteicas como la casena, est limitada en general a las bacterias lcticas y es variable sgn las cepas. Ello no significa que
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Bacterlu lictlcu y fermentos

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ettaa bacteria~ no produzcan o produzcan pocaa proteli111 y peptlda .... Se ha coJDe!UIIdo a ettudiar mtemticamente el eqwpamiento protelco de varloa est.reptoooooe y lactobecllos, y 18 ha oblenado que las endmu o eon intracelu18res {plasmticaa o de la membrana) o ettn fuertemente lladaa a la pared microbiana. Ectu enzlm no pueden ejercer una protelilia rpida y amplia en el medio; sin embargo, las peptlduas de las puedes son aptu para producir pj!ptldos y aminoicldoa a expensu de la casena. Eatu auatanciu de ba.jo peso molecular pueden aer transportadu al interior de la clula. Hay en este hecho una va que permite el crecimiento de lu bacteria& lctlcas en un medio deficitario en aminocidos libres, como es la leche. La protelills global no ofrece un buen medio para la determina cln de las especies; por el contrario, algunu degradaciones de ami nocldos son tiles, entre ellas, por ejemplo, la desamlnacin de la arglnina, que produce amonaco, puesto en evidencia por la reaccin de Ne.,J.r. Tambin puede citane la hidrlisis del hlpurato, que es la bue de una prueba corriente.
NotJ>.- M odelanl<l oxpoDdri.ft nria. ejomploo de alal<lmM prol#llolrao, upoclllment. para el Lactobacllhu cc.L

La actfuldad llpolticG de las bacteriu lctlcaa es en general pe quea, al iaual que la actividad proteoltica, y se ejeroe ms fcllmen te eobre la tributlrina (glicrido homo11neo del cido butrico) que eobre la rua lctea. En esta actividad ae han obaervado diferenclu notable entre los 11neros y las especies. Loalactobacllos aon menos llpoltlcos que algunos estreptococos. Parece que existen carboxileste.r uu caractersticas de une especie. De hecho, la proporcin de 11 puu verdaderas en el eqwpamiento enzimtloo de lu bacteriu lctlcas puede con1iderarse billa en comparacin con otros microorp. nilmoa que proliferan en la leche y loa productosllicteoe. e) La actividad nrductora es un carcter til de conocer con refe renda a los est.reptocoooe; se pone tcllmente de manifiesto en la le che tornasolada. Aluna.s cepu de estreptococos tienen une fuerte actividad reductora y decoloran el indicador antes de la coagulacin licida. La accin aobre la leche tornasolada ae representa a veces por lu letru: A acidificacin; e = ooagulacln y R reduccin neta, que se colocan en el orden deseado; !al cepu de est.reptocoooa que acabamos de citar eon del tipo ARe. Se utilizan tambin la reduccin por el cloruro de tetrazolio. d) La influencia de la temperatura permite obtener datos preciosos para la claalficacin. De inters especial ea la posibilidad de cultivo a tem~raturu relativamente bl\iu (10 -15 e o relativamente altas (45 e. La termortesistencia a 60-65 e (supervivencia tras una du
b)

pyr QhleC r1a r al

366

Bacterias lcticas y fermentos

racin de calentamiento de treinta minutos o ms) es tambin interesante conocerla; pocas especies resisten las condiciones de la paste. rlzacin baja (63 C-30 min ). Para estudiar esta propiedad en el caso de los estreptococos se utiliza la leche, y un medio especial en el ca so de los lactobacilos (por ejemplo, el caldo MRS). e) La inhibicin por el cloruro de sodio a concentraciones de hasta el 6,5% es un carcter importante, sobre todo para los estreptococos. El Teepol (al 10,4 %), la bilis, diversos antibiticos, etc., son agentes de inhibicin que se utilizan para la diferenciacin de los lactobaci los. Las cepas pertenecientes a ciertas especies se desarrollan abun dantemente en presencia de estos inhibidores, mientras que las otras no se multiplican.
f) Las exlgenciM nutricionales no son las mismas para todos los

lactobacilos. Las relativas a los factores de crecimiento, determinadas en condiciones ptimas estandarizadas, constituyen caracteres auxiliares que permiten precisar la clasificacin de las especies de Lactobacillus. En los estreptococos, Jos del grupo N exigen nicotinamida, cido pantotnico y biotina. g) La produccin de gM carbnico permite distinguir las especies heterofermentativas. Se pone de manifiesto mediante cultivo en un medio artificial gellficado con gelatina, encima del cual se vierte un "tapn" de gelosa; el gas se acumula entre las dos capas. Las ho mofermentativas no producen ms que indicios de C0 2 La exigencia de gas carbnico es una propiedad de algunas especies homofermen tativas, en especial de los estreptococos del grupo N; es esencial para varias bios.ntesis.
h) Reacciones d wersas - La produccin de acetona y de diaceto est limitada a algunas

cepas de estreptococos; en general es lenta. Estos cuerpos se ponen de manifiesto gracias a reacciones coloreadas muy simples, especialmente la de Voges-Proskauer (produccin de una coloracin roja debida a la reaccin del diacetilo sobre un grupo guandico, en medio alcalino). Pero existen mtodos ms especficos y cuantitativos. - La produccin de agua oxigenada depende de las condiciones de cultivo. En medio relativamente aerobio, los estreptococos lcticos producen cantidades apreciables, lo que tiene como consecuencia Ji. mitar su desarrollo. Es lo que ocurre con una leche que haya sufrido una fuerte agitacin. - La hidrlisis de la esculina (hetersido vegetal) permite dlstin guir los lactobacilos; se pone de manifiesto por la formacin de un precipitado negro en un medio que contenga citrato de h.ierro amo niacal.
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Bacterias IActlcas y fermentos

367

IV FERMENTACION DE LOS GLUCIDOS


A) Aptitudes fa11i81'1bltiws lAa blcteriu lctlcaa pertenecientes a 1aa doe famWu conlideradaa an terionnente, poeeen equipamientos emimtlcot muy variados en lo que se refiere al catabolilmo de laa osaa. Deede el punto de vista prctico, aJunaa especies destacan por no poseer aptitudes para fermentar numerosos acarea, como es el cuo de laa doe principales especies de laa dos familiaa anteriores: S. /Qctll y S . cremom, por una parte, y L. heluctlcu y L. bulgaricuB, por otl-a, que estn liu>itadaa a la utilizacin de la lactosa o de IUs componente.. lAa otl-81 son mucho menos dependiente. de la leche. Las pruebas de fermentacin de los azcares son importantes para la determinacin de laa cepas lcticaa. En el momento actual existen tcnicas rpidas, a baee de "kit", que evitan loe faatldioaos cultivos. El vinlje de un indicador, frecuentemente el rojo de clorofenol, indi ca un resultado poeitivo. Desgraciadamente existen caracteres inconstante. en el seno de una misma especie, particularmente en lo que concierne a la b:ealoaa y a 1aa pentosaa. La 8liciWIIUIIIerobia por va de las hexosaa dilostatos no se utiliza por todas laa blcteri.as tcticas, porque determinadas especies toman la va de 1aa hexosas monofosfatos y de los cidos tl-icarboxli coe, que conduce especialmente al C02 y al dlacetilo. Hay que destacar que la galactoaa puede entl-ar en la segunda faee de la gliclisia a tl-avs de un epmero de la fructoaa, la tagatoaa, que conduce a 1aa trioeas fosfatos.

B) Hidrlisis de la lactosa Se han obeervado diferenciaa en la hidrolizacin de la lactosa segn


laa especies. Lo lactobacilos, que poseen una l-(alactosidasa, hidrolizan la lactosa tal cual. L01 estreptococos lcticos meafllos poseen una foafoil-f81actosidaaa, es decir, slo pueden romper los enlacea ~-1-4 entre la galactosa y la glucosa cuando el primer residuo se fosforiliza sobre el carbono 6. El S. thermophUu parece tener la doble posibilidad. El estudio de la actividad JJ-plactosidaica se realiza habitualmente tomando como IUitl'ato el ortooitl-ofenoliiD-calactsido (ONPG), o .u ster 6-fosfrico. Tras la hidrlisia, ls liberacin de nitl-ofenol, pigmento amarillo, permite la medicin espectromtrica a 420 nm.
C)

Ptoducc6n de 6cido 16ctico

El cido lctico es el producto final de la licol!.is anaerobia. La reduccin del cido pirvico a cido lctico es catalizada por una enzima que puede presentarse bajo dos formas especficas, lss lacticoyr t >d a r ;

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Bacterias lcticas y fermentos

deshidrogenasas L-LDH y D-LDH, que llevan a los dos ismeros D(-) y L(+ ). Pero tambin se encuentra en ciertas especies una racemasa que favorece el paso de una forma a otra. Cuando se forma el cido racmico DL, puede ser consecuencia, segn las especies, de la exis tencia de dos LDH, o bien de una LDH y de la racemasa . . La caracterizacin de las dos LDH puede realizarse por electrofore sia, pero es una operacin compleja. Por el contrario, los modernos mtodos enzimticos permiten determinar fcilmente el tipo de ci do lctico formado. Es un carcter de diferenciacin de las especies utilizadas, sobre todo para los lactobaciloa, porque todos los estreptococos producen solamente la forma L( +) del cido lctico. De hecho, ninguna de las dos formas se produce nunca absolutamente sola. Las especies caracterizadas por el cido L( +) producen todas al final de la fase exponencial un poco de la formaD(-). El metabolismo de las especies homofermentativas puede ser des viado hacia el esquema heterofermentativo, por lo menos en deter minadas especies, actuando sobre una condicin del cultivo: l. Cuando se eleva el pH del medio por encima de 7 ,O,la produccin de cido lctico disminuye en provecho del etanol, del acetato y del formiato; sin embargo, los dos estreptococos ms Importantes en lechera, S. lactis y S. cremoris, no se desvan del carcter homo fermentativo en estas condiciones. 2. En medio glucosado, si el contenido en glucosa desciende por debajo de un determinado lmite, se observa, para determinadas especies, la misma desviacin indicada anteriormente. La causa de este cambio de metabolismo se ha atribudo a la existencia de dos tipos catalticos diferentes de L-LDH. El ms comn funciona sin activador; el otro exige fructosa difosfato y magnesio para ser activo. En este ltimo caso, cualquier modificacin que reduzca la cantidad de fructosa difosfato intracelular (formado a partir de la glucosa) puede tener como consecuencia un cambio metablico, y no acta la LDH. Debe sealarse que el ismero L(+) del cido lctico es el mismo que se produce en el cuerpo humano. La aptitud de una bacteria para producir en la leche ms o menos cido lctico est relacionada con su resistencia a los valores blljos de pH. Los lactobacos homofermentativos son ms resistentes que los estreptococos.

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Bacterias tcticas y tenn&ntos

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V COMPOSICION DE LAS BACTERIAS LACTICAS. REACCIONES SEROLOGICAS Al Estr;uctura entignlca. TiplfiCaci6n ierol6gica El valor de las pruebas precedentes, conaideradas aialadamente, puede ser objeto de diacusin, ya que los resultados dependen ms o menos de las condicionas experimentales; por otn parte, pueden producine variacionea. Existen mtodos de eatudio ms fundamentalea que permiten investipr la naturaleza de los componentes de la clula bacteriana. El estudio directo. de la composicin del contenido celular y de la membrana se encuentra an en sus principios; por el contrario, el eatudio de la estructura "antignica" se halla en estado avanzado gracias a las reacciones serolgicas. Algunos componentes de la clula son "antgenos", es decir, sus tancias de elevado peso molecular, con poder inmunizante. Diferentes reacciones permiten poner de manifiesto los antgenos, ya sea en la bacteria entera, cuando el antgeno se encuentl:a en la parte externa (reaccin de aglutinacin), ya sea en un extracto cido de la bacteria que contenga el antgeno separado (reaccin de precipitacin). Estaa reacciones materializan la unin especfica del antgeno con el anticuerpo contenido en el antisuero, que corrientemente es suero de conejo inmunizado por inoculacin de grmenes muertos (pero no deatruidos) o de extractos bacterianos. Este antgeno se aade al cultivo . De esta manera puede realizarse la "tipificacin" de las cepas y establecer una clasificacin serolgica, teniendo cada tipo una composicin antignica particular. Se distingue el "antgeno de grupo", designado con una mayacula: A, B, e, . .. y el "antgeno tipo", que permite una subdivisin del grupo. Se dispone actualmente de dos cJasi. ficaciones de este gnero, la de Lancefield, para los estreptococos, y la de Sharpe para los lactobacilos. Ambas son completamente independientes una de otra. Se conoce la composicin de varios antgenos. Los de los grupos de estreptococos A, D y E son cidos teicoicos, es decir, grandes molculas catenarias formadas por un polio! (glicerol o ribitol) y cido fosfrico. A este polmero estn ligadas varias hexosas: glucosa, galactosa, ramnosa, etc., que de hecho son las determinantes inmunogentlcas. Los de los grupos B y e son polisacridos que contienen tambin cido teicoico, pero este ltimo no se libera por la extraccin cida en caliente. Al parecer, los antisueros especficos de grupo son tiles para la identificacin de las cepas lcticas, a condicin de utilizarlos en concurrencia con pruebas fisiolgicas. En efecto, las reacciones "cruzadas" no especficas limitan las posibilidades del mtodo serolgico. Por ejemplo, el antgeno del grupo D de los lactobacilos especfico
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Bacterias lcticas y tennentos

de L. plantarum, origina un antlsuero que reacciona dbilmente con L. lacti8 (grupo E). La especificidad de grupo est conferida por protenas de la superficie celular. Han sido estudiadas las del grupo A (Streptococcus pyogenes). Las protenas "M" son tennoestables y digeridas por la trlpsina. El microscopio electrnico revela su presencia en la periferia de las clulas bajo la fonna de proyecciones filamentosas. Se han identificado ms de 70 antgenos "M" diferentes. Existen tambin antgenos R y T que no estn restringidos al grupo A y que no tienen significacin en lo que se refiere ala patogenicidad.

B) Composicin de la pared
Ms recientemente se han observado diferencias en la composicin del pptido que relaciona (puenteo) las cadenas glicnicas que constituyen la pared externa de las bacterias. Se han establecido 12 tipos para los estreptococos. Por el contrario, el mismo pptido se encuentra en todas las especies del subgnero Thermobacterlum. El anl.isis de los aminocidos de la pared slo posee valor taxonmico si se apoya en otros datos fisolgicos o fisicoqumicos.

C) Composicin de la rna111ria nuclear La proporcin de bases nitrogenadas en el DNA, al no ser uniforme,


puede servir de ayuda a los taxonomistas. Habitualmente se utiliza la relacin G + e, es decir, el porcentaje en molculas de guanosina y de cltosina. Esta relacin vara entre lmites muy estrechos en ciertos grupos, como los Leuconostoc (de 37 a 45) o los LactobacUlus homoferment.ativos (de 32 a 41); por el contrario, la variacin es mucho ms amplia en los heterofennent.ativos (32 a 51). Sobre esta base se ha diferenciado, por ejemplo, la especie Lactobacillus jensenii con G + e = 36, que designa hoy da cepas anteriormente consideradas como pertenecientes a la especie L. leichmannii (G + e= 48- 50). Los nuevos procedimientos de hibridacin de los DNA aportan datos complementarios que permiten cifrar el grado de homologa entre especies o subespecies. Por este procedimiento se ha observado una homologa del 84 al 100%entre L. helveticus y L. jugurt. De hecho, este ltimo '10 es ms que la variante maltosa (- ) del primero; es lo que se llam Ul' "biotipo" y est retirado de la lista de especies.

VI PRODUCCION DE SUSTANCIAS ANTIBIOTICAS POR LAS BACTERIAS LACTICAS


El predominio de las bacterias lcticas, sobre todo de los estreptoco coa, en numerosos productos alimenticios, ha llevado a pensar que en su mayor parte eran productores de agentes de inhibicin o de lisis,
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Bacterias lctlcas y fermentos

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ms o menos especficos de otras bacterias: antibticod, en un sentido amplio de la palabra, o bacteriocinas. Pero no hay que fiarse de falsas interpretaciones. La colonizacin de medios variados por las bacterias Jcticas puede tener tambin eomo causa a rapidez de su crecimiento, la produccin de cido y el descenso del pH, o la produccin de perxidos. Indudablemente, la produccin de antibiticos no es general. En los estreptococos parece limitarse a las especies del grupo N, S. loctis y cremoris. En los lactobacilos, esta aptitud puede estar ms extendida, pero el estudio de las sustancias antibi ticas en este grupo est poco adelantado.

Al Nlsina
Es el antibitico mejor conocido entre los de las bacterias lcticas y el nico que se produce industrialmente y se emplea en las industrias alimentarias. Su nombre se deriva de las iniciales de "Groupe N Inhlbitocy Substance ". Es elaborado por determinadas cepas de la especie S. loctis. De hecho, todas las cepas parece que producen pptidos bsicos, pero no todos estn dotados de actividad antibacteriana. La nlsina forma parte del grupo de los antibiticos polpeptdicos. Los primeros de stos que se descubrieron (bacitracina, gramicidina, etc.) son secretados por Bactlhu esporu.lados, que se caracterizan por la presencia de aminocidos atpicos, que no se encuentran nunca en las protenas y cuya forma de a<:cin se puede comparar a la de los detergentes catinicos. El peso molecular de la nisina es 3.600, pero normalmente se encuentra en forma de un dmero de peso molecular 7 .000; contiene, al lado de los L-aminocidos corrientes, dehidroalanina y lantionina (homlogo de la cistina con un tomo menos de azufre). Es sintetizada tras la fase exponencial del crecimiento del S. loctis. Al parecer se sintetiza antes una pronisina por el mecanismo habitual de la sntesis proteica y la conversin en nisina se produce en la superficie celular. Para determinados autores, la nisina y los pptidos bsicos similares tienen una funcin reguladora para el organismo productor, con lo que la actividad inhlbidora sera solamente accesoria. La nisina es soluble y estable en solucin cida, a pH 2,0, y se inactiva en medio alcalino. Es termoestable y puede ser calentada a 100 C durante 6 min, a pH 4,6. El espectro antibitico de la nisina es estrecho, ya que solamente es activa sobre las bacterias gram +, entre las cuales se pueden citar, aparte de las bacterias lcticas, los estreptococos y estafilococos de la mamitis, los Clostridia y Mycobacterium tuberculosis. No se ha utilizado teraputicamente, a causa de su insolubilidad a pH fisiolgico y sus efectos irritantes locales. La base de su aplicacin en las conservas que tengan un pH inferior a 0,6, entre las que puede incluirse el queso fundido, es su actividad
Copynqhled malenal

372

Bacterias lctlcas y fermentos

10bre lot Clo1trldla (la nlalna es a la vez bactericida y eaporlclda). lA adicin de nlalna pennite limiiar lu condicione de tntamiento trmico y prolonpr la vida del producto. Por otro lado, evita el hincha mento de loe quesoe de puta dura por el cto.lrldlum t)'robut)'ri cum. Se la puede considerar como un aditivo que no plantea problemu hlginlc01. De hecho, ea una Sllltancla que exlate nonnalmente en cl.e rtoa productos lcteot; adem. est exenta de toldcidad y no induce a la produccin de cepaa retistentea en loa coruumldores, por que t1 deatruida por las proteaaaa digestivu. lA nllnOICI es una enzima que deltruye e1pecfflcamente a la niaina. Est producida por ciertas cepas de bacterias l'ctlcae, por lot eetafilo cocot, etc., que de eaa forma adquieren una "niaino-reslltencia".

Bl Otros antlb16t leot


Se han dado nombres muy variados a auatanclaa mal conocidas, y en algunot cUOt bipotticaa, de entre lu cuales son doelu que merecen ser nombradas. - lA "DiplococciM" es producida por el otro estreptococo del grupo N : S. cl'f!moril. A pesar de babene caracterizado parcialmente en 1944, parece que no se ha proeeguido su estudio. - lA "Acldofllilla ", extrada del cultivo de LoctobocUiu acldophllu. En 1972 se patent en lot Estadoe Unldoe de Amerlca su pre.paracln. Podra ser utilizado como la nlna. El porcen~ de purlfl. cacln a partir de la "leche acidflla" ae acerca a 260. Al parecer lu caractersticae moleculares no han sido an detennlnadu.

VIl CU LTIVO DE LAS BACTERIAS LACTICAS


Dado que ae trata de especies muy exigentes, los medios utilizados para su cultivo deben ser ricos en vltamlnu bldrosolublea, pptldos, amlnocldoe y sales minerales.
A} Lacha "a~plementada" lA leche desnatada ea un medio de cultivo natural y barato para to daa lu especies que nos Interesan; pero a1gunaa tienen un crecimiento lento en este medio. Si ae la suplementa con extracto o autoliaado de levadura, se comprueba que la produccin de cido, para estas lti mu eapeciea, es ms rpido y ms elevado. El cuadro 44 resume las experiencias claicae de Orla.Jenun (1931); en 61 puede comprobarse que las especies heterodeterminativu son lu rna eatlmuladu; en presencia de extracto de levadura, la produccin de cido puede elevarse al nivel de laa bacteriaa homofermentativaa. Eete cuadro revela tambin las dl!erenciaa existentes entre estreptococo y lactobacilos en Jo

'1

ht ~ rna

1 11

Bacterias 16ctlcas y fermentos

373

que concierne ala aptitud para producir cido lctico en cantidad importante. Loe ectreptococos bomofermentetivo. m activo. producen en la leche d01 o tles men01 kldo lkdco que loslact.obaciloe termtlloe; el enriquecimiento de la leche no modifica loe ~ta doe. & muy posible que estas diferenclaa ee deban a una eenlibilidad a 101 wlorea ~01 de pH.
CUadro 44. Actluld4d tk ltu boctultu lctico.. Eatfmuloci6n con extracto d '-uoduro.
Acldo produclclo (1/1) Al cabo de 1 dl1 Al ct bo de 7 dlu

BIPtciN (l)
Leche

Leche + utn clo

Wrldwl
(1)

Ltclle

Ltdte + utreclo lntdDitl (1)

Ellrep- bomolerJDtlllltl-

S. lfl:t S. cnmorll S. lrt. S. thtnnophlhl S. {MCII/11 S. llqut{ocltnt Ellnptoooooo heterofermentotlvot (Leuc:onootoe) L. cltrovonu L . p~rocltrovoru1 LtctoblcUot bomofermentotlvoo L. lilct L . ht/Wtltv1 L. bulrm..,, L . /IAII<II L. cuct L . p iG111'#1tllrt

1,6

6,S
0,9 S 2,3 5,4

S.S
7;l S,l
6,3 S ,1 5,4

7,4 1,3 5,3


7~

5,7

S~

5,6 8,6 S,l 9,1 6,3 S,4

0,7

O ,S
9 9 ,1 JI ,S 14 0,2

4,3 3,4

1,4
o~

S,S
10,6

o
o o

11,9 11,7 12,2 16,2 0,9

17,1 22,3 17,1 26,1 11,7 1,6

19,7 23,4 16,7 27,3 15,9 JI

Lldoblcilot bcrerofermenUrl""' L . br.,ls L .{ <rmcnrt

o
0,7

0,6

O.S

6.S
10,1

(1) 10% de un extneto de levad un cuyo pH y contenido en mol0ri11 nitroenadu y f6aforo tienen el mismo mor que en la locho. (Sea6n OrltJen.en, 1924).

(2) Nombrea utUI.todot en la 6poca.

374

Bacterias lcticas y fermentos

En la prctica, la leche puede ser suplementada con diversas sustan cas que aportan ya sea nitrgeno protdico soluble, ya sean factores de crecimiento de tipo vitamnico, o de loe doe tipos. La suplementacin es necesaria para obtener cultivos concentrados de fermentos lcticos, utilizados en la actualidad en la industria lctea. Aparte del extracto de levadura se utilizan tambin las peptonas y triptonas y el com-steep liquor (subproducto de la industria del maz). La adicin de glucosa favorece tambin la iniciacin del crecimiento de las bacterias lcticas en la leche. Recientemente se han empleado extractos de algas (Chlorel/a, Scenedesmus), por ejemplo, para producir leche acidificada, en el Japn. Los factores de crecimiento son probablemente bases nitrogenadas (adenina, hipoxantina, etc.). La activacin se puede obtener sin aadir sustancias extraas, provocando una digestin ms o menos amplia de las protenas lcteas, por proteasas, como la pepsina, tripsina (a veces no purificada, como "pancreatina") o papana.
B) Lactosuero

El suero de quesera es un buen medio de cultivo para las bacterias lcticas. Contiene las sustancias solubles de la leche junto con sustan cas nitrogenadas no proteicas resultantes de la accin de las enzimas coagulantes o del metaboliamo de las bacterias que se deaanollan en la leche o en el cogulo. Alguna de estas sustancias entre las que se encuentra el caseino-gllcopptido, tienen propiedades estimulantes frente a las bacterias lcticas; corresponden a lo que se ha denomina do con anterioridad el "whey factor" (factor del suero), cuando se observ que las bacterias lcticas actan ms rapidamente o dan ms diacetilo en el lactosuero que en la leche. Una dicultad para la utilizacin del suero, cuando debe ser pasterizado o esterilizado, es la floculacin de las albminas y globulinas. Segn las condicones de tratamiento termico y el valor del pH, el suero es desproteinizado ms o menoe. El .lactosuero completamente desproteinizado diaminuye sustancialmente sus propiedades como medio de cultivo. Puede hacerse un pretratamiento con una proteasa, como en la leche, con lo que la floculacin de las protenas se puede reducir o evitar y el medio se enriquece en nitrgeno soluble. C) Medios artificiales La leche no es conveniente para todos los trabajos de investigacin referentes a las bacterias lcticas, en especial con miras a su ldentifi cacin. Es necesario disponer de un medio de composicin ms constante y que permita un amplio cultivo de todas las cepas. El empleo de medios diveraoa, en los que no se desarrollan plenamente todoe los grmenes, explica las divergencias en la clasificacin. Las dificultades son mayores con los lactobacilos, sobre todo los heterofermentativoe Copyngh!ed rnatcnal

Bacterias ljctloaa y fermentos

375

(L. brevg y L. fttrment1, cuyo cultivo ea engorroeo), que en loe ea

tzeptococoa.
Se han empleado diwnoe medioe artificiales, concebid01 eapecialment8 para loe lactobaciloe: caldo con jugo de tomate (de Brigp), medio APTO (autolilado de levadura, peptona, triptona y glucosa de Raibaud), caldo MRS (de De Man, Rogoea y Sharpe). La fuente glu cclica ea, en general, la glucoea; el alimento nitrogenado est asegurado por el extzacto de carne, peptona, etc., los factores de crecimiento se aportan principalmente con el extracto de levadura. Los tnbllioa m recient8s sobre la clasificacin de los lactobacos se han realiza do con el caldo MRS, que se caracteriza por la pre.encia de sales en cantidades relativamente Importantes, especialmente sulfato de manganeso. Se ha comprobado que este metal estimula considerablemen te el crecimiento de las eatreptobacterias y de las betabacterias. Es un ejemplo de suatancias que provocan un deaplaumiento del equilibrio en un cultivo lctico cuando se adicionan en pequeas cantidades. En realidad no vuelven al medio selectivo, sino ma favorable para un grupo dado. A ttulo de ejemplo, he aqu la composicin de un caldo MRS, por litr-o, ajustado a pH 6,6: peptona 10 g, extracto de levadura 6 g, ex tracto de carne 10 g, glucosa 20 g, fosfato dipotsico 2 g. acetato de sodio (3 H,O) 6 g, citr-ato biamnico 2g.aulfato de magnesio (7 ~O) 0,2 g, sulfato de IDllJiiiiDI!80 (4 H,O) 0,06 g, tween-80 1 g. Para un cultivo abundante de estreptococos se utiliza corrientemente el medio de Elliker y Anderson, que contienetres azcares di ferentes (lactosa, glucosa y sacaroea) y cido ascrbico, pero no manganeso ni magnesio. Cuando el medio de cultivo se utiliza para el aisl-iento de bacterias lcticaa a partir de cepas contaminadas, ea bueno aadir una sustancia que inhiba a las bacterias gramnegativas, eapecialmente al Escherich/Q coll y otras especies con ella emparentadas, as como diversas especies de PaeudomoTUJS, AlcGligenes, BacU/ru, etc; el acetato de talio (al 0,1%) parece ser el de reaultados ma satisfactorios. En el me dio MRS reseado, el acetato de sodio en proporcin bastante elevada y la IU8tancia tensioactiva "tween-80", tienen una accin selecti va; el ajuste del pH a un valor Inferior a 7 refuerza esta accin. El desarrollo de los estreptococos en un producto que contenga tambin lactobacilot, se favorece mediante la adicin de 8U8tanclas tales como: azida de sodio, etllvioleta, cido nalixdico, etc.

Es preciso sealar que las bacterias tcticas originan colonias pequeas en los medios gelifiCIIdos. Las de estreptococos son corrientemente difciles de observar; aparecen como cabezas de alfiler o de pequeas lentejuelas. Las colonias se forman con frecuencia ma fcil mente en la parte profunda que en la superficie. En loa lactobaci
Copynghted matenal

376

Bacterias lcticas y fermentos

los, pueden observarse colonas de varios tipos, por ejemplo: - Tipo S ("smooth "): pequei\as colonias lenticulares; -Tipo R ("rought"): grandes colonias arborescentes. - Tipo M: colonias mucosas.
Noto:- En la obra de Berrea, Amariello y Petranoxlene (1978), te encuentran numeroau deseripclonea de medioe de cultivo.

VIII ESTREPTOCOCOS LACTICOS MESOFILOS (GRUPO "N")


A) Caracteres del grupo

Los principales caracteres se exponen en el cuadro 45. Son los ms comunes de los homofermentativos y los que producen la mayor cantidad de cido en la leche tornasolada (0,8 a 1% de cido lctico); tienen la mayor actividad reductora (tipo "ARC"), pero debe subrayarSe que esta ltima caracterstica no es regular pgra las cepas que han sido cultivadas durante mucho tiempo en medio artificial. Estos estreptococos son los agentes habituales de la coagulacin de la leche, abandonada a la temperatura ambiente, y constituyen los fermentos lcticos cultivados entre 20 y aoe que es la zona ptima para su crecimiento. A 10 C todava se desarrollan, y an a ms baja temperatura, pero no a 45 C, por lo que son fcilmente destruidos mediante calentamiento moderado, como el de la pasterizacin baja, a sacao mn. Son sensibles a la sal, al 6,5%, y no poseen carcter patgeno. La actividad proteoltica de estos grmenes se considera escasa respecto a la de los enterococos. Los investigadores han llamado la atencin sobre su equipamiento enzimtico, especialmente en el S. eremors, que es bastante complejo. Se halla ligado a la membrana un sistema proteoltico que comprende por lo menos dos endopeptdasas y tres exopeptidasas. Las endopeptidasas contribuyen a la formacin de pptidos amargos que intervienen en el sabor del queso. En los cultivos de estreptococos del grupo N se encuentran frecuentemente variantes lentas que crecen difcilmente en la leche, mientras que el crecimiento es normal en un medio enriquecido en aminocidos. Se les deaigna como "uariante prt- " y se caracterizan por la prdida de las proteinasas de las paredes.
B1 Las especies l. Streptococcus cremoris. Este estreptococo es ms lbil y difcil de cultivar que los otros dos; depende eatrechamente de la leche, ya que no puede utilizar ms glcidos que la lactosa y sus dos componentes. Es muy sensible a diversas drogas como la penicilina y la sal; no se desarrolla o lo hace muy mal a 37 C, no obstante, algunas ce
Copyngh!ed rnatcnal

Cuadro 46. Eatreptococo11 (principale11 e$pecies)


Homofermeatativot (1)
Lcticos
Tenn(>. rnoo

Heterofermeatatlvos EnteroCOCOI

Pi,enoa

LtuconoJtoc

S.
cremoril
Cultivo a 10 e Cultivo a 37 e Cultivo a 45 e Supervttencia 63/30 rain. Ferm.e ntacin pseosa (e02 ) de la sJucosa Reduccin rpida de la leche tor nuolada Produccin de diaoetilo Proclucci6n de NH3 (de la arai nina) Crecimiento en presencia de NaCI: 2 % 4 %

S.
hzct

S. thtr
mophihu

S. ogahzcli4e

S.
faet:tJ!is

L.
cremoril

L.
hzCII

+ +

+
+ +

+ + + +

+ +

+ + + +

+ + +

+ + + + + + + +

6,5%

Azcares fermentados (2): !'entosas Sacarosa Maltosa, manitol, salicina Resistencia a la penicilina Grupo serol6sico (Lancef"~eld) Carcter patpno
(1) Segn AbdElMalek y Glbson (1948).

+
+
N

N
-

+ +
B

+ +

+!-

? -

(2) Todas estas eSPecies fermentan la sJucosa,la plactosa y la lactosa.

376

Bacterl 16ctlcu y hlrmentos

P pueden deamollane a temperaturu muy biJ, huta de sc. No deaamina la &lllinin. Su morfologa ee butante caractartica; 111ele pretentane en la leche en forma de 1arpa cadenltaa, mlentnll que el alulente (StnptOCOCCtU loct) ae encuentn clli aiempre en forma de dlplococoa.. Lu cepaa de estzeptococ011 causantes de la vilcoaided de la leche perten.e cen habitualmente a esta especie, y han recibido mteriormen te divenu denominaciones, como Bacterlum 14ct /o1161, S. ho/14nd cus, etctera. 2. El Strep tococcua /4cti8 est dotado de las propiedades que le faltan al S. cremori8: fermenta varioe glcidos, se reproduce en presencia de NaCI (4 %) e hidroliza la arginina. Produce un alatema enzimtico que degrada la casena, y cuyo papel ae ha estudiado en la maduracin de algunos quesos {Cheddar). Eate estreptococo te halla ms difundido que el anterior. Algunoe eatreptococoe lctlcoe en otro tiem po descritos baJo diversoa nombres, pertenecan probablemente a la especie S. loct (Bacterium 14ct ocldi, S. acldllocllcl, Bacterium 14c t Lt.ter, etc.). S . El Streptococt!ua df<lceti/4cti8. Se considera hoy da como una subeapecle de S. 14ct y ae caracteriza por la produccin de diacetilo a partir de los citratos y no de los azcares. Ea sabido que la produccin de esta cuerpo ae busca en la nata y en las leches fermenta daa. Ea probable que todas laa "cepas aromatizantea" de loa estreptococoalct.lcoa pertenezcan a esta especie. En lo que se refiere al equipo enzimtico de S. dtJcetikJcti$, cabe sealar que esta especie no posee acetona reductaaa, por lo que no reduce los compuestos aromticos de 4 C, contrariamente a lo que ocurro con loa Leuconostoc.
C) Especies de los fermentos lcticos Lu cepas de estreptococos utilizadO& para la aiembra de las natas y de las leches de quesera (putas freacaa y pastas blandas) pertenecen a laa especies antes descritas. Cumdo ee cultivan en la leche, entre 20 y so c. se obtiene un cogulo firme, bomocneo, ain exudacin de suero; pueden aparecer algunas pequeas burbuja& de gas a 30" C, pero nunca a 20-26" C. Existe un an~onismo entre loa eatreptococoa lcticos y las bacterias del grupo CoU; as, por ejemplo,la produccin de gas en la leche por estas ltimas, puede impedirM si al mamo t.lem po se siembra una cepa vigorosa de estzeptococoa. En el queso Cheddar, se ha comprobado una nbibicin semejante. No ea cierto que se trate, en todos los casos, de la detencin del crecimiento de las bacteria& coliformea por descenso rpido del pH; es POiible que au metabolismo se modifique en presencia de los estreptococ01, ya que, prcticamente, no producen gaa, o muy poco.

y h !d 'Tlatenal

Bacterias lctlcas y fermentos

379

Flgurl2. Inhibicin de un lactobacllo por un estreptococo p10ductor de nisina. (Folo J. Fournaud, I.N.R.A.)

Hemos visto anteriormente que algunas cepas de S. lactis y S: eremors producen sustancias con propiedades inhibidors frente a cierto nmero de especies microbianas. Es preciso observar que cada una de estas sustancias es muy activa contra el germen que produce la otra sustancia; las dos especies pueden aer por lo tanto antagnicas; Las cepas productoras de antibiticos son comunes en la leche, loa fermentoe y los quesos; son las "cepas inhibidoras". La figura 62 muestra el aspecto de un cultivo de lactobacilo, microorganismo sensible, en presencia de un estreptococo productor de nisina; el lactobacilo, sembrando en cantidad sobre geloaa nutritiva, no se desarrolla (zonas claras) alrededor de las colonias aisladas del estreptococo, sembrado muy ligeramente.
Nota;- El libro "STREPTOCOCCI" de Skinner y QuWlelaporta documenta ci6n r.ciente aobre el tema.

IX OTROS GRUPOS DE ESTREPTOCOCOS

Al Grupo viridans Las bacterias de este grupo son termfilas y no se desarrollan a temperaturas inferiores a 1sC; por el contrario, pueden cultivarse a 45 C.
Copyngh C'd
fY' aten al

380

Bacterias lctlcas y fermentos

Son tambin termorresiatentea, por lo que no ee destruyen en las condiciones de la pasterizacin baja. La especie ms caracteratlca es el S. thermophllus; este estreptococo se desarrolla todava a 50 e, es muy sensible a la eal. En el captulo anterior hemos visto 9ue no se desarrolla bien ms que en presencia de productos de hidrll.ala de la casena, lo que explica la accin simbitica de los lactobacilos, con los cuales se encuentra ~ cuentemente asociada, especialmente en el yogur, en los quesos de pasta cocida (es el primer agente de la acidificacin) y en loa cut,los naturales (maceracin de los cuajares). Debe indlcane que esta especie termorresiatente ea atacada por un bacterifago que tambin lo es. Sobrevive a 7 4 e; se precisa para destruirlo un calentamiento a 90 o e durante 20 segundos. S. thermophilus se distingue de los estreptococos del grupo N tambin por su metabolismo elucdlco. Es capaz de utilizar la lactosa no fosforilada; fermenta la glucosa pero no la galactosa, que es excretada en el medio . El equipamiento proteaico de esta especie ha sido uno de los que primero se han estudiado seriamente. Se han puesto en evidencia en el contenido celular una proteasa (endopeptldasa) y varias peptldasas. S. thermophilua conatltuye con laa tres especies anterlorea y subespecies la gama de los estreptococos lcticos utilizados por la lnduatria lctea. En el captulo anterior ee ha descrito su asociacin 'con Lactobaclllus bulgaricus en la microtlora del yogur.

Bl Grupo de los en111roc:oc:os


Al grupo serolico D pertenecen cinco especies procedente de los excrementos, pero aolamente tres ae designan con el trmino "enterococoa": S. faecalis, con sua dos variantes lique{acrem y zlrr.ogenea, S. faecium y S. durans (este ltimo considerado como una subespecie del anterior, tiene aptitudes fermentativas baatante reducidas; no fermenta ni las pentosas ni el manito!). Laa otna dos especies del grupo D aon S. bouis y S. equtnus, que no poseen todas las aptitudes de los enterococos para permitirles desarrollane en las condiciones desfavorables a otros estreptococos: - Resistencia al calentamiento a 63 e durante 30 minutos; pueden encontrarse en las leches pasterizadas. -Desarrollo dentro de una amplia zona de temperatura (de 10 a 45 e) y de pH; los enterococos todava crecen en un medio tamponado a pH 9,6. - Desarrollo en preaencia de sal, (6,6 % y en preaencia de bilis ) (40% ). - Resistencia, en presencia de penicilina, a concentraciones relativamente elevadas. Copy nghtC'd m aten al

Bactertul~lca

y lennentos

381

- Penlatencia muy 1arp en anaerobiOiia a valol'tl de pH IUperiorwa 6. Se ba l\llllrido la u1>1izacin de enterococoa (S. (CGU. y S. durczm) para la llembra de la leche en q11BIII&, p - la fabricacin del Cbeddar, con objeto de evitar 101 accidente. debldoa ala pen!Mlina, e lualment. en run de 111 tolerancia alu vulad.o ntt del medio. Pero debe ~- oollltar que esto. amne-11011 aoapeeboaoa para loa billlenlltaa. La prncia del S. (aeoalfl conaldera como un ndice de contamirulcin fecal, 10bre todo en preeencia de ooUformee. Por otro lado, ciertu cepae poaeen un caricter patgeno. En numeroau vuiedadee de queeo, loe nlcoa eatreptococos que ee encuentran el lado de lu eepeciee de fermentoe lctlcoa eon loe del srupo D, y a vecee en cantldadea baetant. elevadas (101 /). Eatoa ent.rococoa tienen actlvldadet catablicas ms a.mpllu que loa otroa eatreptooocoa. Intervienen en la decradeci6n de loa pr6tldoa, ms o menoa ei'Mirllica.mente .ecm lu eepeclee. Se han eatudlado a fondo 1aa d-boxll~tM, que tnnaforma loa a.minokldoa, eapecialmeute la Uroaio&, en amlnM txicas. Eatoa ,mne- mbndoa en la leche de qu_.(a, contribuyen a la aparicin de un aroma pronunciado en el queeo llllldurado. El S. (oeco/;. var./JqiU(oc'-M M fUertemente proteoltiA:o; ee el oico eetreptocooo que ucua la aetatloa; coqula la lecha por medio de una ~ aotae de la acidilicecln, y luego dillieft el coulo; puede eer cana de eabol'tl amaroe comprobedos en la mantequilla y en el quee<r, correeponcle a la pecle antluameote denominada Mlcrococc'" ct~i amari.
C) Leuoonoatoct

Son eetreptococoe heterofermentativos o "&14COcous" de Orla.Jenaen. Se diferencian netamente de loe ant.rtoree en el upecto bioqumico y constituyen un nero aparta. Se carectarizan por una fermentacin poeoaa de los ucare., con produccin de eo, y dlacetilo; forman 'cido lctiA:o inactivo (loa anteriol'tl forman 6cido dextrlliro) en d'bll c:Mtldad; 11011 eseptococoa poco acidlftcantee compa1'8doa con loe otroa. Son doa La e.pecieslnteretantee: - L. e:nrnoril (:cL. citrooonun), no ooacuJa la leche; aece a temperatwu mediN, 2().3()" e (DO a 37" C), y DO ee lermorretliltente; te deltruye por calentamiento a 60" e durmt. 30 minutoa. - L . loctfl ( L . ptii'Ot!ltrovonrm o S. lte(ir), l'tlllte a 63 e (dwante 80 minutoa), ee ba encontrado en lu lecb putarlzadu: fermenta las peptoeu. ~o loa trminoa S. dcctranlciU y S. manteroa ae han deecrito doa etpeelea prximu a eta. Eetoe prmenee proceden de lot veaetaJee; en lu te.r mentaclones lctlcu vegetal, como en la de la "chouorout.e", ee encuentran variedadee de lu eepeclea precedente..

382

Bacterias lctcas y fermentos

Los estreptococos heterofermentativos se encuentran con mucha frecuencia en la leche cruda, junto a Jos estreptococos Jcticoe. Para aromatizar las natas y los quesos frescos se ha recomendado el empleo de ciertas cepas, asociadas a los anteriores, en los fermentos. El manganeso estimula los LeucOIIO$toc y por esta causa se acelera la produccin de compuestos aromticos de 4 C (diacetllo y acetoina); pero ocurre Jo mismo con su reduccin en butan<Hiiol, cuerpo ins pido, bajo la accin de una reductasa.
X LACTOBACILOS Al CaniC'tllres principales La forma bacilo comprende aspectos muy variados, desde el bacilo corto y abultado a formas casi filamentosas. La acidificacin de la leche es ms lenta pero ma acusada que con los estreptococos. En este grupo se encuentran los mayores productores de cido lctico, hasta del 2,8%. Los lactobacilos soportan pH muy bajos, hasta 8,5. La actividad caseoltica es en general claramente ms marcada que en los estreptococos. Han sido caracterizadas varias endo- y exopeptidasas. El "Bergey's Manual" (1974) ha establecido 27 especies en el (ll!nero Lactobacillus, pero enlz'e ellas hay un determinado nmero que aunque puedan agrupar grandes productores de cido lctico, no puede fermentar la lactosa y no se encuentran en Jos productos lcteos. Otras, como L. leichmanll o L. salivarlua, pueden fermentar la lactosa y se encuentran en divenos productos animales, pero no en la leche habitualmente. En el cuadro 46 se han mencionado los caracteres de ocho especies importantes en la industria lctea (segn Sharpe, 1962). Lgicamente se les puede separar en cuatro grupos: los lactobacilos homofermentativos termfilos o Thermobacterium, los lactobacilos heterofermentativos termfilos y Jos lactobacilos heterofermentatlvos mesfilos. Estos dos ltimos grupos corresponden a un grupo nico, Betabacterium de Orla.Jensen. Los Jactohacllos estn muy difundidos. En la leche cruda son mucho menos abundantes que los estreptococos; por el contrario, dominan en divenos tipos de quesos, especialmente en los que se fabrican a temperaturas relativamente altas (superiores a 40" C), al cabo de un cierto tiempo. Los lactohaclloa tienen un papel importante en la preparacin de divenas leches fermentadas (YOIJUr, leche acidfila, etc.), en las fermentaciones de productos vegetales (ensilados, "choucroute", escabeches), en la fermentacin malolctica de los vinos y en las salazones. Se encuentran presentes en la saliva, en las caries dentarias,

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Qladro

46. LQcrolxJcUo (prlnclpole especiu) Bocore......,ta'"oo


T ermflloo
IICidt>-

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her.tticsu bu/fllrlcus
Olltivo a 15 "e Cultivo a 45 e o R . . )60 (90 mln . OsstenCIII 650(30 mln , Acid o (%) en la leche Tipo de cido lctico Produccin de) eo, (ezcarea) NH, (&llinlna) . ) NeCI 2% Cultivo .n NaCI 4 % pttsenca de Teepol 0 ,4 % Exlcendu nutdti- (1) Fermentacin de pentoeaa Fermentacin de oll'Ot azcues
(1)

liJcrlt

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0,8

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1,2,3,4, B

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(S), 6, 7

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6,1,9,0

PF

+ + + +/1,2,3, 4 , S,6, 7,8, 9,0

+ + + +

O ,S DL

1, (4 ,S), 8 F

TF

+ + + + +
+

l ,S

Hidrlisis de la eeeullna Grupo eero1611ico (Sharpe)


"-' ::r

B,C

+!B

"

(1) Factores de crecimiento: R, riboflavlna, P, piridoxal; C, cianobalamlna (8 11 ); F, kido f6Uco; T, t!omtu, (2) Todu eatu oapoclea fermentan la s;lucoaa,la plactoaa y la lactoA. 1..o1 otros azcaJes fermeatadoa ee d._tll'an mediante una cifra:

1, maltose; 2, salicina; 3,llCII'OII; 4 trealoaa; S, mellbioaa; 6, amisdallna ; 7, colobi-; 8, raf' m-; 9, manito!; O,eorbitol. Lu clfrae enm par6ntesb Indican un nsultado variable sen Ju copu,

384

Bacterias lclicas y fennentos

en el Intestino del hombre y de loa anlmalea, etc. Se ha demostrado que, en el tubo dieernvo del cerdo, doe tipos de lactobaciloe (L. aci dophidus y L . fermentum) constituyen una verdadera fiora especfica, mucho ma importante en cantidad que la formada por loa grmenes collformes.
B1 Termfilos homofermentativos Las especies del grupo Thermobacterlus actan bien a 45 el crecimiento es lento por debajo de los 35 C y es nulo a 15 C. Solamente dos especies pueden considerarse termorresistentes entre las que nos Interesan: S. lacti8 y L. helueticus. L . helvetlcus y su variedad L. jugurti son las bacterias que produ cen mayor cantidad de cido en la leche. L. heluetlcus se encuentra en los cuajos naturales y en loe quesos de pasta cocida. L. bultaricus y L. lacti8 tienen similitudes y slo forman un grupo serolgico (E) y producen el mismo tipo de cido lctico (D); los dos se caracterizan por granulaciones metacromticas que aparecen tras la coloracin de las clulas, y por una produccin media de cido en la leche (1,7 %). Sin embargo, el L. bultarlcus se dlatingue del L. lactis por sus limitadas aptitudes para fermentar los diversos azcares. El L. bultaricus slo puede utilizar la lactosa y sus componentes, y este gnero depende estrechamente de la leche; es la especie de lacto bacilos que se encuentra con mayor frecuencia en las lechet fermentadas orientalet. Hasta hace poco se designaba a todos los lactobaciloe aislados del yogur bajo el nombre de L. bultaricus; ahora bien, a veces se encuentran otras especies, por lo menos en las preparaciones hechas en nuettraa regiones, como el L . Juturti y el L. helueticus. El L. lacti8 et el lactobacilo ms abundante en los quetos recientes del tipo "gruyere"; es la especie ma termfila; algunas cepas se deaarrollan todava a 52 C. La ltima especie, el L. acidophilus, es muy distinta de las precedentes bajo el punto de vilta bioqumico; la acidificacin en la leche es dbil (como en los estreptococos lcticos) y pueden asimllane numerosos y diferentes azcares. Esta especie et la nica que puede implantarse entre la fiora intestinal de loe nios alimentados con bibern; tambin se encuentra con frecuencia en las heces del hombre adulto y de los mamferos. La posibilidad de multipUcane en el intestino ha atrado la atencin sobre L. acldophlbu, en lo que se refiere a la utilizacin de las leches fermentadas; sobre este punto volveremos en el captulo xxn. El antibitico "acidofilina" se ha mencionado anteriormente.

e;

C) Masfilos homofermentativos (Streptobacterium) Estos lacto bacilos se cultivan bien alrededor de los 30 C, pero por encima de los 40 C ya no se deaarrollan. Son menos acidificantes
Copynqhled malenal

Bacterlu IAcUc:aa y fermentos

385

que lo. anterlom, aunque fermentan una pu variedad de dcidos. La c~n de la leche DO .parece ma que al cabo de varios das de lncubecln aSO"C. Por sm euact.erea bloqumicoa y flalolgjcos ~e han reconocido doa -.pecies. No obltulte, debe IUbnyane el hecho de que exllten nu.mezoeaa cepas imposlblea de ldenflc:v con aJcun.u de 1a1 e.pedel deacritaa. Lol lactolMiclloa meafiloa aon ma abundante. en la leche cruda que lo. termfiloa. Tienen UD papel comparable a ealol lttmoa en la fabricacl6n de lo. quea01, pero para UD tipo diferente, ea decir, el de loa queeo. prenaadoa no sometidoe al "cocido" (holandt, cheddar). 1. L . caeel. Este germen tiene una morfologa caracterstica: baa toncilol corto con extremos cuadrados y tendencia a dlaponerte en cadena. Eate carcter justifica el nombre "StNrptobaclllrlum ", y no lo po- la especie elgulente. Entre loa me16Cilot ea probablemente el L. - 1 el que tiene mayor actividad en quesera; exlate la variedad a/loototul. que no fennenta la lactoca. Lat oepu del L . OtUIII poseen el mtaeno de f1Npo B, o el C, pero no parece elliltir relacin entre loe c:ancterea bioqumicos y la poeelin de uno u otro de~~ antaenoa. El eatudio del lilteua proteoltico celular de L. - 1 ea UD eemplo de lo que puede llegar a realizaBe con la metodoloca bioqu.mica actual (El Soda y colah., 1978). Se han caracterl&ado cuatro euzimu: una endopeptldua con una e.pecificldad del tipo quimotrpsico, probablemente ligada a loa ribosomaa y que se encuentre en la fraccin aedlmenteble; tres exopeptiduu que ae encuentran en estado toluble en el citopiaema: una aminopeptldua, una dlpeptidaaa y, lo que conatltuye una novedad en el campo de las bacterias Jcticas, una carboxipeptldaaa. Estas peptidaaas aon metaloen.zlmae y lae 8\18tanciQ que queJan loa metales, como el EDTA, las lnactlvan; son reactivad .. por la accin del cobalto y el mananeto . El extracto celular dejp"ada la caeena; pero parece que ette hecho ae debe m a la acc:l. n tlnrslca de lal exopeptideas que a una endopeptldaaa particular. Contrariamente a otra bacterias Uctic:aa, L. caeel no posee proteaaas periplumitical (ligadas a la membrana o a la pared celular). 2. L . plalltonlm. Las clulat en butonc:llol .. hallan, en general, alaladu. Se encuentre en la leche y con meno. frecuencia en loa que. - Su hbitat "nonnal" 1e baDa probablemente en lal materias -.eaetalea, ..... que fermenta (ensilaje, "choucroute") o deteriora (pstula de loa tomate.). ~ la variedad plcmentada ruden, que es la causante de laa "manchaa rojas" de lo. queaoe duros.

O) Lactobllolloa h.....-ofermentativos
Son los Betabacterlum; peor conocidos, y desde nuestro punto de vista, menoe Importantes que los homofermenteUvos. Los que se en-

386

Bacterias lictlcas y fermentos

cuentran en la leche se desarrollan ms lentamente y producen poco cido (0,6% como mximo), en forma de une mezcla de cidos ornlcoa: lctico, a~tico, succnlco, etc.; producen tambin un poco de alcohol. Su caracterstica dominente ea la produccin de pa en cantidad importante durante la fermentacin de loe azcares. SU intervencin en la industria lechera es nefasta, puesto que pueden provocar el hinchamiento precoz de la cuajada o del queso recientemente fabricado y defectos del sabor. Estos lactobacilot son aportadoe a la leche por el cuajo o por reatos vegetales. Tambin se ha explorado el sistema proteoltico de estas bacterias, que ea rico en proteaaas variadas. Las dos especies siguientes ae distinguen por su actividad endopeptidsica; son degradadas parcialmen te las casenas a, y/), as como tambin las protenas del lactosuero. El L. fermentum (ex Betabacterium longum) ea termfilo; forma parte de la microflora de los cuajos naturales, y cuando ae encuentra en abundancia puede producir excesivos "ojos" en los quesos de pasta cocida. El L. breui8 es mesfilo y no ae deii81Tolla por encima de los38 e; puede provocar el hinchamiento de los quesos del tipo Holanda. Exis te, para esta especie (como para L. plant4rum ), una variedad rudenli8 que produce manchas rojas sobre los quesos. A veces se encuentra en la leche una especie prxima, el L. buchneri. Todas estas especies son abundantes en las maceraciones vegetales. Orla.Jensen adicion a este grupo una especie dudosa, el Bet4bacterium caucasicum, que parece proceder del kfir. En realidad, de esta leche fermen lada no ae aislado nunca une especie nueva bien definida.

E) Observaciones
l. Sinonimia En las obras dedicadas a quesera ae encuentran an denominaciones

antiguas, debidas a Von Freudenreich, que realiz un inventario de la mlcroflora de los quesos de pasta cocida. Para algunas de ellas ha podido establecerse una correspondencia con las denominaciones actuales: Bacterium casei a - L. caui Bacterium casei "f - L. breui8 Bacterium casel 6 - L. fermentl Bacterium casei E - L. heluetlcus 2. Especies cambiadas Lactobaclllus blfldus. Se situaba habitualmente dentro del gnero Lactobacillus, junto a los homofermentativos termfos; sin embargo, sus caracteres morfolgicos (formacin de ramificaciones en ciertos medios), fisiolgicos (anaerobiosis estricta, fermentacin de las

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Bacterias lctlcas y fermentos

387

pentoeas, produccin de cido actico, etc.) y serolgicaa,la separan netamente de las anteriores. Se le incluye en un gnero independiente, Bi{idobacterium, unido a la familia Actinomycetaceae. Este germen presenta un gran inters por el hecho de que forma regularmente la parte esencial de la flora intestinal de los recin nacidos alimentados con leche materna. El antiguo Lactobaclllus thermophitu. se caracteriza por sua temperaturas de crecimiento muy elevadas. Ea termorresistente y de hecho se tnta de una especie esporulada del gnero BacU/us.

XI LAS BACTERI AS LACTICAS SELECCIONADAS. ACI DIFICACION

Al Selecci6n de cepas
La prctica de la siembra de la leche para la obtencin de diversos derivados lcteos ea antigua, especialmente en lo que se refiere a las leches fermentadas y quesos de pu',;a cocida. Anteriormente se utilizaban fermentos empricos constituidos por una parte de la preparacin destinada a la fabricacin anterior. En el caso de la maceracin de los cuajares (fabricacin de gruyere y quesos de la misma familia), hay un aporte importante de bacterias procedentes del cuajar mismo. Se tiende a reemplazar las microfloras espontneas por bacterias seleccionadas, cuyas propiedades son conocidas. De esta manera se elimina un factor de inseguridad que es propio de la flora lctica espontnea; en efecto, esta ltima puede eer insuficiente o hallarse yuxtapuesta a otras especies indeseables, por lo que la siembra natural de un producto puede variar mucho de un da a otro. La seleccin de las oepas Jcticas resulta corrientemente del estudio de las que se han aislado de los productos lcteos. Dicha seleccin no suele haoerse en la industria lctea sino en loa institutos de investigacin y en laboratorios especialzadoe, que comercialzan un nmero limitado de tipos de "fermentos lcticos", normalmente como mezclas de oepas. Exiaten importantes organismos de mbito internacional que estableoen el mantenimiento de colecciones de cepas puras, por ejemplo el American Type Culture Collection (ATCC), que ofrece la ms amplia seleccin de bacterias variadas, levaduras y mohos. Por otra parte, algunos oentros de investigacin tienen sua propias colecciones (en Francia el CNRZ, el Instituto Pasteur, etc.). La importancia de las bacterias lcticas es la causa de la investigacin permanente para lograr nuevas cepas, m8 activaa en condiciones dadas, ms resistentes a los bacterifagos, etc. La situacin est muy complicada a causa de los intercambios de cultivos a travs del mundo. Entre las innumerables oepas que estn coleccionadas y que se
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388

Bacterias lcticas y fermentos

utilizan, muchaa ae conocen con diferentes dealgncionea (letru y nmeros), y en cambio proceden de una cepa nica. Loe estudios ba sadoe en la hibridacin de loe DN A permitirn aclarar la situacin, pero estn an poco deearrolladoe.
l

20 --- - - - - - ---------, .
1.s.g
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y

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---

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-----

Str. thermophilus

1t

!4

u horas

a) Culllvo de especlesterm6fllas. a 42 e (en trazos, la asociaciOn de las dos especies)

150

.5- - - - - -- - - -- - - - - - - . ,

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b) Cultivo de especies mesOfllas a 30 'C

Flgu,. 83. Curvas de acidificacin de bacterias lctlcas (en leche esterilizada),

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B1ct.nu 16ctlcu y fennentoe

En un tr.bt,jo <M llleccin orientlldo hacllla paictlca,li>lo conlideran IUJIII ct. 1a1 propiedadel ct. 1u blct.riu lktlcu; fnliw.remoe lOM lu ma lmpart.mtea, lin tratar de la temperatma 6pt:ima, que no precia mayo- IIC!axaciones.

B) Acldiflcecl6n en funcin lei1emfl0


La aptitud de un1 cepa detenuinadl no mlct. 10llmente por el mximo de acidez que puede producir; et neoeeuio conocer tambin la veloc:idt.d de la acidificacin. Lu curvu de la ftura 6S llultran ejemplo de dlferentea nlvelea del desarrollo de la acidez en la leche, inoculada de manera anloga, de cepu comunea mea6fllu y termfilaa. El S. thrrmophllul produce, al cabo de 10 horu a 42 C, mucha ms acidez que el L. halvcticU~; pero la primera cepa eat cerca de tu mximo, mlentru que la lfl8Ullda. deapua de SO horu, ha producido una acldea doa vecea ma fuerte. La diferencia" an m aealada en lu doa cepaa mei6fllu rep:mentadu en la mlama fleura (b).

En la pdctlca, el nlwl de lcides en un momento dedo ea un valor muy Importante. Ea raro que ae mide el dealrroUo continuo de la acidez en tundn del tiempo transcumdo ; ct.tennlnl &Implemente la acidez tru un tiempo m corto que el neceaerio para &lcencar la t.. mb lml; en pneral, .. toman 6 boraa para loalllzeptococol. El 90lumen <M la Inoculacin lnfteye en el teiUitedo. Ea lndiiPiftllbJe oble:rvar condlclonea bien eatanc!arizadu. kllte otro mtodo preoonizado pare apreciar la actividad de lu cepaa lctlcu, el llamado "mtodo de la relacin", y conllate en ha cer doa medlclonea de la ecidea con un Intervalo de tiempo fijo (2 S horu). La relacin de la aecunda acidez a la primera ea un valor conltante en la faae lopritmica (ver ma abt,jo). Eate valor ea caracterfatlco de la cepa e independiente de la Inoculacin. El mtodo es, por lo tanto, m limpie pero menoe preclao que el precedente, C) Acldlflclcl6n en funcl6n del nC.nMro de g6 n111naa
Con el deaarroUo de lu awpenaionea concentndu y conpledu de blcterila lkcu (w - m adelante) ea poelble hallane en preaencia de productoa muY dlferentea en cuanto a ulobO/dod y octwld< acidifican t.. Para linea de compmacin lciool p~~rece.., el ma recomendado, por eu llmplicidt.d, el mtodo de lu dlludonea; dentro de ciertoe lnltea ailt.e un. relacin JjMel entre el factor de dllu.c in (o..., el nC.mero de y la acidez Vllorable; con cepaa diferente. obtendri.n U-toe de rectas paraleloe (en ordent.daa, la acidez alcenredl claapiMe de un1 Incubacin determinada; en abeclaaa, la dilucin correepondlente: l /400,1/200,etc.); la dlatencla entre doe rectas ea une exp-In de la relacin entre lu IICtMdt.dea de doe cepaa. La actividad de una bacteria lctica, valoradl por ejemplo mediante la acidez producida al cabo de 6 horu de Incubacin, podra rela-

.erm->

390

Bacterias tcticas y fennentos

cionarse lgicamente con el nmero de clulaa y permitir la comparacin de cepas o estudiar el efecto de laa condiciones de cultivo y conservacin. Aparte del problema general de viabilidad de laa clulas presentes, existe, en el caao de laa bacterias que se agrupan en cadenas, un problema particular debido a la irregularidad de las agrupaciones. Las curvas de actividad pueden constuirse sobre varias bases: a) nmero total de clulas/mi (microscopa) b) nmero total de cadenaa/ml (microscopa) e) nmero total de colonias formadaa en un medio de cultivo, o cu/ml (colony (orming unlt) d) cfu X longitud media de las cadenas Esta ltima base es sin duda alguna la mejor para la representacin de la actividad, porque aporta una compensacin a la irregularidad de la longitud de laa cadenas, que puede constituir una causa de error. Es el caso especial de los "cultivos concentrados", donde las manipulaciones llevan a longitudes de cadena mucho ms cortas ,que en los cultivos convencionales. La expresin ms satisfactoria de la viabilidad ser: cfu X longitud meda de laa cadenas X lOO nmero total de clulas
Nota.- El recuento de lu baelrlaa euyu .,.lulas quedan m'" o menoa unldu a ot<as ofreee rand" dlfi<:ultadoa, que no podomoo exponer oquf. Posibkomente, el m'todo enzimitlco denominado "ATPuo" aporte en au dfo uno ooluci6n eolia
factoria.

O) Acidificacin y crecimiento

Las curvas de la fgura 64 muestran, por una parte, la sucesin de las rases del desarrollo microbiano, y por otra, el desfase de la curva de acidificacin. Se distinguen cuatro partes en la curva correspondiente al nmero de grmenes, expreaado por el logaritmo, en funcin del tiempo de incubacin. La fase de latencia o de adaptacin (1) depende del volumen del inoculado y del estado fisiolgico de las bacterias; puede ser muy corta con un inculo importante procedente de un cultivo activo; la fase logartmica (2) tiene una pendiente constante para una cepa dada y un medio dado; cuando se acaba, el nmero de grmenes se acerca a su mximo y la acidez est an lejos de su valor lmite . Las dos ltimas fases son las de mximo (3) y de descenso (4), y corresponden al agotamiento de sustanciaa nutritivas en el medio, o bien a la concentracin de una sustancia inhibidora resultante del metaboliamo microbiano, por ejemplo, el cido lctico.
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Bacterias lctlcu y fermentos

391

i10' 110

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101

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Flgu,. 114. Curvas de Ct11Cimiento y acidificacin de una t>Kitria lktlca. (1 ) Fase de latencia o de tdaptacin. (2) F-logalitmlca (crecimiento oc:tM>). (4) Fase decreciente. (3) Fase ITIUima o eslacionaria.

E) Aspectos pr6c1icos

La prueba de la actividad acidifican~ puede dar en el mismo tiempo resultadoe diferentes si ee realiza con leches de dlferen~ origen. Deben teneree en cuenta estos hechos en la apreciacin de lu propiedades de una cepa, ya que explican algunas variaciones regionales. No ea raro comprobar que cepas importadas no dan loe mismo resultados que en la regin de orien. Sin embargo, se puede obeervar con frecuencia una mejora progresiva durante el mantenimiento regular de eatu cepas en la leche de la regin nueva,lo que pone de manifiesto una facultad de adaptacin. Lu dl!erenc:* de composicin, muy manifiestas, pueden ser C8UI8 de modificaciones de la velocidad de crecimiento o del equilibrio entre laa cepas de un fezmento multiplicado, como ha podido demoetnree en el cuo del contenido de ~e.o de la leche. En lo que ae refiere a la quesera, ee ha obeervado que no existe siempre una relacin entre la actividad de laa bacterias cultivadas bajo forma de fermento (acidez medida tru 6 horas de incubacin), y la evolucin de la acidez en la cuba de queeera. Laa condicionea faicu no aon las mismas, sobre todo en la fabricacin con co81Ulacin rpida. Se ha propuesto reemplazar la prueba claica en la leche
opyn:r ed rr a r
1

392

Bacterias tcticas y fermentos

esterilizada por una prueba que comprenda el empleo de cuajo o gelosa, con el fm de reproducir las condiciones prcticas. En presencia de una enzima coagulante, las bacterias lcticas, de una forma general, aon estimuladas para la produccin de cido lcti co. Deade este punto de viata, las enzimas fnglcas son ma eficaces que el cuajo animal. Este efecto actlvador no es constante, ya que determinadas cepas son ma sensibles que otras y adema aumenta la protelisis de la casena ma o menos intensamente segn las aptitudes de las enzimas coagulantes.

XII OTRAS CARACTERISTICAS DE LAS CEPAS SELECCIONADAS

Al Actividad proteolltica
Anteriormente nos hemos referido a los resultados de algunoe trabajos sobre el sistema proteoltico de varias especies de bacterias lcticas. Se sabe que las proteasas estn localizadas en diferentes partes de la clula: ribosomaa, fraccin soluble del citoplasma, membrana, pared. Estas enzimas se liberan en el medio durante la autlisia celular, que se puede producir bastante pronto en la fase estacionaria. Pero parece existir tambin una actividad extracelular, por ejemplo con las clulas intactas de S. lactis. Los trabajos sobre las proteasas bacterianas deben interpretarse con prudencia, puesto que no han dado resultados concordantes. Por otra parte, no dan una respuesta directa a loa prcticos que deben conocer la actividad proteoltica inducida por las bacterias lcticas, en determinadas condiciones, en medios como la leche, la cuajada, el queso, etc. La actividad proteoltica se mide, tal como se ha indicado en el captulo VI, por la proporcin de nitrgeno no proteico (nitrgeno soluble en presencia de cido tricloractlco, cido fosfotunptico, etc.). Esta proporcin es aproximadamente duplicada en un cultivo de estreptococo lctico recientemente coagulado. La naturaleza del sustrato proteico ea muy importante. La protelisis en una solucin de casena suele ser ms lenta que en la leche, para unas mismas condiciones experimentales. Sin embargo, la casena constituye un sustrato empleado con frecuencia, y para evitar interferencias se pueden utilizar casenas marcadas con un elemento radiactivo ( 125 1-easena, 14 Cmetilcasena). Independientemente de las determinaciones de la actividad de las proteasas aisladas del sistema proteoltico de una bacteria lctica, es interesante conocer la actividad "bruta" que permita comparar las especies y las cepas, ya que existen grandes variaciones. A ttulo de ejemplo, en el cuadro 47 se muestran los resultados de experiencias
Copynqhled malenal

Bacterias lcticas y fermentos

393

simples pero significativas. En la parte (a) se resumen los primeros trabllios que ponen en evidencia las derencias entre las aptitudes de algunas especies lcticas importantea, con siembras idnticas en una misma leche, tamponada con carbonato clcico. El eatreptococo lctico tiene una actividad mucho ms dbil que los lactobacilos. La parte (b) muestra las derencias entre cepas de una misma especie; estas cepas se utilizan en la fabricacin de quesos de pasta dura; algunas de ellas, poco numerosas, son "activas" y provocan una aceleracin de la maduracin. Cuadro 47. Actividad proteoWica de laa bacteru ldcticas.
a) Experienciu de Orla-Iensen

%del nitraeno tolo!


Cultlvoa en la leche + CaC03 o durante 45 dlu a 3S e
S. fate<z/11

Nitraeno soluble (1) 82,2 36,1 24,7 2,5

Nitreno de los aminocidos (2) 33,9 34,6 2,2

var. liqutfacitns

L. helv<tlcus
L. CQiti S. lactis

(1) Nitrgeno no precipitado por ebuUici6n en medio cido.

(2) Nltr&eno no precipitado por el 6cido tnastleo. b) Experienciu con los lactobacilos term6filos (V. Bottttzi, 1962) En la leche Nlttaeno no prote_co i (1) 7d
Cepas -normales":

Enelquuo Nitraeno Nitraeno aoluble aminlldo (l) (2) 10 b 0,28 36d O,S6 10 b 0,0008 36 d 0 ,1 3S

26 d
liS ISO

L. lactis L. htlveticus
Cepas uactivuu: L. lactis

70 109
614

L. htlveticus

473

sos

704

0,43

0,77

0,014

0 ,28

(2)En % de queso. En lo que se refiere al sabor, en el queso de 9 das con la cepa "activa" es tan pronunciado como en el queso de 30 das oon la CtOpa
"normal".

(1) En g de tirosina/ml de leche, en presencia de CaC03 .

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Bacterias lctlcas y fermentos

B) Produccin de lllstancia erom6tlc:es, vitco y de CO, Estot caracteres son importantes en caeoa perticularea: siembra de netas de consumo, natas de mantequera, leche. para la produccin de leches fermentadas y queso de pe.ta fresca o de pe.ta blanda. La produ.ccin de diacetilo, de etanol y, sobre todo, de IUitancias v!Jcosea, ea una de las caractarsticu menos constantes. Existen de terminadas cepas que tienen mejores aptitudes que otras, y en este caso es til la seleccin, pero estas aptitudes pueden variar en el curso de las resiembras. Adema Influyen muy especialmente las condicio nes del medio, como la composicin de la leche, la temperatura de cultivo, la temperatura de pasterizacin y la acidez alcanzada, cir cunstanciu a tener en cuenta. Por ejemplo, el descenso de la tempe ratura de cultivo hacia loa 2022 e en el caso de los estreptococos lcticos, aumenta la v!Jcosidad, lo mismo que la adicin de algunos iones estimulantes (Mg, Ca, etc.). Las bacterias aromatizantes del gnero Leuconostoc producen di versos compuestos voltiles, sobre todo diacetilo, pero tambin son capaces de reducir este cuerpo a sustancias inodoras. Interviene un sistema enzimtico (diacetilo reductaaa) cuya actividad depende del pH, y parece que la reduccin del diacetilo, y por consiguiente la disminucin del aroma, es ms rpida por encima de pH 5,0 que por debl\io. La produccin de gas carbnico es muy limitada en las especies homofermentativu. Los estreptococos lcticos S. lactls y S. cremo ris producen un poco de CO, . Esta produccin ea normal y .a veces abundante en las bacterias del aroma. Esta actividad tiene consecuencias sobre la estructura de los quesos y ea beneficiosa para deter minadas variedades de queso en las que se busca la formacin de "ojos"; por el contrario resulta un defecto en los quesos de pasta ho mognea (tipo Cheddar), en las culliadas frescas, que pueden volverse esponjosas, y en los quesos envasados. Para apreciar la produccin de CO, existen varios mtodos. El ms recomendable ea el mtodo manomtrico de Warburg. Los gasme tros especiales tienen menos precisin. C) Sensibilidad a los fagos Probablemente existen bacterifagos especficos de todas las cepas de bacterias leticas que se utilizan como fermentos, pero no estn uni versalmente difundidos. Puede ser interesante conocer la sensibilidad de una cepa a loa fagos que se encuentran en una leche de fabricacin, en un suero de mantequilla o en un iactosuero. La prueba es fcil de realizar: se pone a incubar la cepa considerada en leche estril que contenga resazurina, despus de haber aadido algunas gotas de un filtrado que contenga el fago ; este filtrado se obtiene por pase del producto contaminado a travs de un filtro del tipo "Seltz", en con
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Bacterias lctlcas y lennentos

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diciones aspticas; si se trata de leche, se realiza primero una precipi tacin cida para separar el auero. En la prctica es importante poder disponer de una coleccin de cepas resistente. a loa fagos. S jSueden' o btener a partir de algunas c lulas que dan un cultivo secundario tras la lisis de todas las clulas sensibles. Pero hay que tener en cuenta que no se trata de una insen sibilizacin absoluta a todos los lagos. El procedimiento denominado "rotaCin de cepas" se utiliza sobre todo en Nueva Zelanda. La cepas, simples o asociadas, que se inoculan sucesivamente en la leche de fabricacin, no tienen relacin entre ellaa en lo que se refiere a sensibilidad a los fagos. De esta forma se evita el ver establecerse en la fbrica una peligrosa concentracin de fagos. Es preciso realizar un control continuo dellactosuero para detectar trazas de fagos quiz con relaciones cruzadas con las cepas que anteriormente eran independiente. desde este punto de vista. Hoy da se considera que los bacterifagos de las bacterias Jcticaa no constituyen un grave problema prctico como anteriormente, gracias al progreso de los conocimientos microbiolgicos y tecnolgicos.

DI Variaciones
A Jo largo de este captulo se han citado algunas variaciones en las propiedades de las bacterias lcticas. Desde el punto de vista prctico, la idea de estos ltimos apartados, se plantean varios problemas:
l. Se pueden obtener cepas bastante estables que conserven, tras

resiembras numerosas, sus aptitudes acidificantes, proteolticas y de otro tipo? Lo que equivale a encontrar las condiciones en las que la blosntesls de los sistemas enzimticos no sufran perturbaciones. Esta pregunta an no ha recibido conte.tacin satiafactoria. La evolucin espontnea de las cepas es un hecho perfectamente conocido. Es el caso especial de las cepas de estreptococos lcticos que poseen una notable actividad proteoltica y que con relativa fre cuencia dan, espontneamente, variantes no proteolticas, variante. que tambin tienen una actividad acidificante disminuida, por lo que se las denomina cepas "lentas". Esta evolucin desfavorable no se puede Impedir, pero se puede limitar cultivando la cepa a ms baja temperatura. 2. Se puede propagar durante un largo perodo una mezcla de ce pas sin que se produzca un predominio de unas sobre otras? Al cabo de cierto tiempo es inevitable el desequilibio de las cepas mixtas. Este tiempo es corto para las mezclas de estreptococos lcticos. Despus de algunas resiembras, las cepas pertenecientes a la especie S. lactls predominan respecto a las de la especie S. cremors.
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Bacterias lctlcas y fermentos

3. Se pueden provocar artlficialmente mutaciones para obtener mutantes con mejores aptitudes que la cepa madre? En este caao ee pueden tener en cuenta propiedades distintas de la acidiflcaci6n y la protelisia, por ejemplo, la produccin de diacetilo, la resistencia a loa fagos y a loa antibiticos, y la amplitud para no dar auatancias de sabor desagradable. La irradiacin mediante lii.YOI ultravioletas o por loa rayos X, as como la accin de IIUitancias qumicas como la acrifiavina y el nitroaornetiluretano, ae utilizan con dicha finalidad. Por la accin de los fiiYOO l'ltravioletas ee han obtenido mutantea muy ac tivoa de S. /Dct;. y S. d; 1'ty/Dct;.; stos producen ms cido lctico y diacetilo que laa cepas madre. La modificacin de loa caracteres pa rece eer bastante estable.
Observacin.- Este ltimo problema deriva de lo que actualmente ae designa como "ingeniera pntica". Las manipulaciones genticas permitirn sin duda alguna dominar, en un futuro prximo, loa diver1108 problemas planteados por la utilizacin de los fermentos lcticos en las indllltrlas lecheras, con la creacin de cepas ideales ( o casi ideales!). Aunque tambin puede ocurrir que loa industriales, cansa dos de la incertidumbre que entraa la tcnica de los fermentos, la cambien, cuando sea posible, por la acidificacin qumica o bioqumi ca, aunque esto deje ain realizar parte de las funciones adscritas a los fermentos.
Noto.- Sobre lu cuoatlon" ploateadu e n - _.wio uf como so m lod01 loe upeclol fuodameotalea relociooadoo con la utillzaci6o de cullloo por lu In duatriu Jacheru. puado co111Uitarae proYachooamonte la revl.ol6o reall2ada por Cocan (1980), con referencia o loo mot6fUoa. y de A<oeolu y colab.(1980) pare loo term6filoo. Para loa aopectoo de control y n,llolo, bay que remitlreo al doeu mento FIL/IDF nm. 129 (1980).

XIII FERMENTOS LACTlCOS

Al El cultivo
Loa fermentos no deben conaiderane simplemente como un medio de aporte de cido lctico, lino que constituyen tambin una fuente de bacterias actiVOI, capaces de multlpllcane en el seno de la leche, de la cuajada o de la nata y de producir, en el momento favorable, la acidez y el aroma deseados. Es necesario recordar el desfase de la acidificacin en relacin con la multiplicacin celular. Un fermento que ha alcanzado el mximo de acidez representa un cultivo en declive, que contiene clulas muertas. En la industria, y en el caso de loa es treptococos, en que la produccin de acidez provoca un descenso del pH que rebasa apenas el punto de coagulacin (pH 4,6), ee utilizan frecuentemente fermentos no coagulados o apenas coagulados.
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Bacterias tcticas y fermentos

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Los fermentos deben ser no solamente cultivos activos, sino culti VOl puroe. Por lo tanto es preciao presentar una ran atencin a loe

siguientes puntos, sobre todo cuando se utiliza el mtodo tradicional: a) impedir la contaminacin por especies extraftaa, que puedan ser aportadas con la leche que se utiliza para el cultivo, con la atmafera o con los utensilios, lo que im)'one medidas de riguroaa -pala;
b) impedir la contaminacin por fagos adoptando medidas especia-

les;
e) impedir la degeneracin

de una especie o la evolucin de una

mezcla de especies con predominio de una de ellat, lo que hace preciso el retomo bastante frecuente a las cepas seleccionadas del laboratorio especializado.
Es prudente tener p~ntes los datos expuestos en el captulo anterior sobre la aptitud de la leche considerada como medio de cultivo. Una buena solucin es el empleo de leche desnatada en polvo exenta de antibiticos, reconstituida con agua al 10 a 12% Para la . lucha contra los bacterlfagos se recomienda la adicin de un agente eecuestrente del calcio. Se han propuesto diversos medios "PRM" (pho6o ratan medlum), por ejemplo la mezcla formada por leche en polvo desnatada, lactosuero y cereales hidrolizados, a la que se aaden citrato y fosfato sdicos. La eficacia no es absolute y la solucin ea bastante costoaa. Se han preparado diveraoa sistemas de cultivo, mediante depsitos especiales (cubas presurizadas, tapas con junta hidrulica). El "sistema protegido" de Lewis subre todo el conjunto de operaciones, desde la produccin del fermento congelado al fermento de fabricacin, y se caracteriza por el empleo de recipientes eapeciales y el transporte mediante agujas. Est muy difundido en Gran Bretaa; impide no alo la contaminacin microbiana sino que tambin reduce en alto grado la importancia de loa bacterlfagos.
B) Las cepas

Se limitan a algunas especies de estreptococos (cremoris, diacetylactis, thermophUus, Leuconortoc) y de lactobacilos (bulgaricus, helueti-

cua, lact).
En la industria se utilizan cultivos simples (de una sola cepa), culti vos mltiples (asociacin definida de cepas o cultivos mezclados (diversas cepas en proporciones imprecisas que pueden variar en los sub cultivos). En la prctica, lo ms corriente es utilizar las cepas suministradas por los laboratorios especializados, en tres formas:
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Bacterias lcticas y fermentos

-cultivo lquido, conteniendo 107 a 101 grmenes/mi, de coneervacin limitada, pero que puede dar rpidamente un cultivo madre activo. - cultivo liofilizado, conten.iendo haata 10" grmenes/g; el polvo puede conservane durante mucho tiempo pero exige para su utilizacin un cultivo de "reactivacin". -un cultivo concentrado congelado, conteniendo 101 0 a 1011 grmenes/g, destinado sobre todo a siembras directas (ver ms adelante). Esta forma concentrada puede presentarse liolizadA.
C) Prap.-acin y utilizacin tndicionales

El mtodo tradicional se utiliza casi siempre, a pesar de que cede progresivamente terreno al mtodo moderno que se describir ms adelante. A ttulo didctico hemos conaervado el esquema tradicional (fig. 65).
l. Resem bras Ea raro que se parta cada da de la cepa de laboratorio; en general se utiliza una parte del fermento de la vspera a la dosis del 2 al lO%. Es prudente limitar la serie de resiembras a 7 das, y en caso de accidente, volver rpidamente a la cepa de laboratorio. Se toma la leche de mezcla que baya IUfrido una fuerte pasterizacin, corrientemente a 90 oc durante 10 a 30 minutos. Existen recipientes especiales de acero inoxidable, con agitador y termmetro incorporados, que poseen una doble envoltura que permite calentar y luego enfriar la leche a la temperatura de cultivo. El primer cultivo se hace frecuentemente en el laboratorio de la fbrica, en reclplantes de vidrio de 1 a 5 litros. El cultivo se hace necesariamente a la temperatura indicada, que vara con la na1uraleza de las cepas y el tipo de fabricacin. Cuando el fermento est preparado, si no se utiliza inmediatamente ea necesario enfriarlo por debajo de loa 10 C; no obstante, es preferible adaptar el ritmo de las siembras al horario de las fabricaciones. Regularmente se realizan controles de la calidad de la leche fresca utilizada para la preparacin, de la temperatura de la siembra y durante el desarrollo, y de la acidez final.
NotJJ.- Deode el momento en que la leche ae ha llevado a 90 C, nintliln obje to debe ponerae en contacto con el fermento dn haber ddo ante. eaterilizado por el vapor, el acua hirviente o una aolucl6n de hipoclorlto.

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Bacterias hl.cticaa y fermentos

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1
Cepa comercial
1'' dla

18 ' cultivo madre en el laboratorio (leche esterilizada en el autoclave)

T
(3 1)

T,.,__.... .,~

100 mi (para el segundo c ultivo madre)

3'' da

18 ' fermento en el focal (loctlo pasterizada 90"/30 mln)

~ dfa

Cuba de 100 1especial para fermentos, con termmetro y agitador

100 litros para la fabricacin del 3'" dla

Figura 65. Preparacin de fermentos licticos. (Esquema da una tcnica tradicional simplificada)

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Bacterias tcticas y fermentos

2. Utilizacin Existen numerosos esquemas de preparacin y de utilizacin de los fermentos; de una fbrica a otra se pueden comprobar variantes, por ejemplo: - para pequelas fabricaciones una sola serie de cultivo diario, en 20, 50 100 litros de leche; resiembras por tomu del cultivo
nico; - dos series de cultivos diarios, una en pequeos volmenes (2 a 10 1) formando la serie "madre", la otra en grandes volmenes, utilizada nicamente en la fabricacin (figura 65). El procedimiento ms logico es probablemente el que utiliza la me nor cantidad de recipientes con el mnimo de manipulaciones, pero es necesario tener en cuenta las condiciones especiales de trabajo en cada fbrica (asepsia, regulacin precisa de la temperatura, etc.) y sobre todo las posibilidades de hacer, en el local, la gran masa de fer mento de una pureza perfecta y de una gran actividad, El mtodo racional consiste en aadir el fermento a un medio desprovisto de cualquier microorganismo; la pasterizacin destruye la mayor parte de la flora espontnea y permite controlar la actividad microbiana durante las fabricaciones. Este procedimiento debe aplicarse cuando se uti.liza una flora lctica muy simple, como en mantaquera (maduracin de natas pasterizadas) o para la obtencin de leches fermentadas. En quesera, el problema es mucho ms difcil de resolver. Algunos tipos de queso no pueden producirse con sus caractersticas habituales a partir de leche pasterizada y sembrada con especies puras (cap. XXI); los fermentos lcticos se aaden entonces a la leche cruda, ya sea en el momento de la fabricacin o en el curso de la "maduracin" de la leche, que puede ser ms o menos larga. Queda todava una parte de empirismo, que puede explicar los accidentes de fabricacin. El volumen del primer cultivo a preparar con la cepa dellaborato rio depende de la actividad de esta ltima; por trmino medio, la siembra se realiza de la forma siguiente: - 0,5%con el cultivo liofilizado, - del 2 al 3%con los cultivos lquidos o desecados. Para la resiembra se utiliza el 5%del fermento del da anterior. En la fabricacin, las proporciones varan de acuerdo con el nivel de acidificacin que se desee, y suelen ser, por trmino medio, de: - 3 a 5%para el yogur y la nata, - 0,2 a 1% en quesera.

3. ProblemOJ; La lentitud o ausencia de acidificacin puede deberse a varias causas,


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Bacterias IActlcas y fermentos

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a veces difcUet de determinar y que no son las mismas de un pas a otro: a) Presencia de bacterifaos virulento (como ya hemos dicho). b) Leche no conveniente para ette uso como consecuencia de su pobreza en factorea de crecimiento; este caso parece eer ms frecuen te en invierno. e) Leche con antibiticos, como consecuencia de tratamiento de mamitia (captulo XDI) . En muchos paeet, la causa esencial de la in hibicin de Jae cepas lcticu et la praencia de penicUina. d) En los cultivos en leche cruda o poco pasterizada, las cepas man tenidas en el laboratorio en leche etterizada en autoclave, presentan frecuentemente un retraso en la acidificacin; en este cuo puede exis tU una sensibilidad de Jae cepas a los inhibidorea naturalet de la leche o una falta de factorea ettlmulantee formados en el cuno del calenta miento. Se puede remediar etta falta resembrando varias veces en la leche pasterizada antes de puar a la preparacin del fermento; se ha preconizado el empleo de cepas resistentes a Jaslacteninas. e) Leche con Jipasas activu (leches rancias o en vas de enrancia miento); los cidos grasos libree tienen un efecto inhibidor.

XIV ME TODOS MODERNOS DE UTILIZACION DE LOS FERMENTOS LACTICOS

El mtodo tradicional de preparacin de fermentos tiene varios in convenientes, y son los ma importantes: la necesidad de los subculti vos y la duracin de las incubaciones para pasar de la pequea cepa de laboratorio a las grandes cantidades de fermento destinadas a la siembra de la leche. A ello se suma la necetidad de salas especiales y de personal bien preparado. Desde hace tiempo, los investigadores han estudiado procedimientos para eliminar todos o parte de estos in convenientes. En~ estos procedimientos los ms Importantes son la utilizacin de cultivos concentrados y el cultivo en continuo.
l. Cultivos concentrados congelados o /iofi/~ados
Los cultivos tradicionalet llevan a concentraciones de grmenes del

orden de 101 10 por mi. Mediante la neutralizacin del medio de cultivo y por centrltup.cln se obtiene un rendimiento bacteriano que, tras una mezcla con el medio coa.ervador, permite obtener una concentracin de armenes 50 a 500 vece. ms elevada. La preparacin concentrada se conserva congelada y se destina, en principio, a la siembra de la leche en la cuba de fabricacin; ea la tkcnica ''I.C.F.", a la que nos referimos en el captulo XXI .

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Bacttrlu ttc:tlcu y fermentos

Se han coJliAII'1fldo much01 81tudi01 a la biQUeda del mejor medio para aumentar la "blomsa", - mediante la eleccin del medio de cultivo del tipo de neutnHncin; y tamblb 11 halnW~~tipdo mucho para locrv el mejor medio de conaervacl6n de la prtpllllcin concentrada, Loe principales problemas plantud0110.n trea:
a) En lo referente a 101 medi01,

.e han publk:ado un liJaD nmero

de frmulu. No ae tnte de obtener nic:amente un medio rico que origine un ~ nmero de grmenes, aino tamb"n de producir un medio ec:onomico. De esta forma,la uWizacln de un medio parecido al empleado en el laboratorio bacteriolgico con extracto de levadura, trlptona y lactOia, manteniendo a un pH conatante, permite rebasar los 10' 0 rmenes/ml, pero la fuente nltroenada ea muy cara. La cuestin parece orientarse hacia la utilizacin de suero de quesera, aolo o mezclado con leche y predlgerido mediante una proteaaa ~.o mn, o bien auplementado con extracto de levadura o "com ateep". El d.-nao del contenido de lactoaa del medio u favorable para obtener un nmero elevado de clula$. b) En lo que .e refll!re al pH que debe mantenerae no ae deduce un valor ptimo; el lirmino medio se llita llredeclor de 6,0 y ea poaible que dependa de la naturaleza de lu cepaa. El factor Umitante del crecimiento ea fundamentalmente la concentnc!n en lacteto, aunque probablemente intervienen otros factores, porque Jaa bacterias lcticu pueden producir sustancias inhibidoraa para I mlamu, como la 0-Jeucina, que ae pueden eliminar por dlllala, pero ea un mtodo muy delicado. e) La eleccin del medio conservador y de la temperatura de con gelael6n han aldo tambin objeto de numeroeaa lnveetlacionea. Despus del fosfato como tampn ,las soluciones de azcar y de gelatina, la leche deenatada, etc., parece que en la actualidad el ma recomendable ea el glicerol o el glicerofosfato adlco diluido en agua o en leche. Se han experimentado temperaturu que comprenden entre - 20" y -196 C. La conservacin en nitrf1eno 1fq11ldo da b11enos reIWt.adOI para la conservacin, durante vari01 m-. de bacteriaa lctlcu viables y con N actividad acidllicante Invariable. Sin embargo debe teftalarae q11e el nitrgeno lquido oriatna en el material tensionea f$C81 que p11eden dar lugar a la exploain de 101 recipientes. AJ. gun01induatrialea te inclinan hacia una eonaervecin en el congeladOl' a -40 e por 11n mximo de 3 meses. La eoncentracln mecnica no plantea randea problemu. Los separadorea centrifufiOs utilizados para la teparacln de la c11ajada ci da, el lavado o la "bactoturacin" van bien para este fin, lo mismo que laa aupcrcentzirugadoras del tipo "Sharplea". Laa suspensiones bacterianas concentrada pueden desecarse tam bin por medio de la liofilizacin. De esta forma es ms cmodo el
rra

Bacterias lcticas y fermentos

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almacenamiento, aunque el perodo de latencia de los cultivos sea ms largo que con los actuales cultivos concentrados liofilizados.
2. Cultivos continuos Con el desarrollo de los procedimientos automatizados para la obten cin en quesera de la cuajada en continuo, es muy til disponer de una tcnica de fermentacin continua para obtener un ferme.n to de acidez y actividad convenientes. Con esta finalidad se han utilizado diferentes medios, como leche desnatada, lactosuero, medios artificiales, para los cultivos a pH regulado entre 5 y 6. En la fabricacin tradicional de quesos de pasta cocida se loga cierta continuidad utilizando suero de la vspera. Esta tcnica ha inspirado a varios investigadores para lograr la fabricacin de queso Cheddar en continuo. En esta aplicacin se plantea un problema: la transmisin de bacterias indeseables, especialmente las coliformes, cuyo nmero tiende a aumentar.

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Capitulo 13 Infeccin de la mama y sus consecuencias

1 FRECUENCIA DE LAS INFECCIONES

Al E..,.c'- y frecuencia
Son muy dlvenoaloa rmenet que pueden infectar la mama y provocar mamlt!J, principalmente ecpeclea de loe neroa Str.ptococctu y StGphyloooccua, y ~e<:undariamente E~eherlchla, Corynebocterlum, Proteu1, K/ebalel/4, Peeudomonae, anaerobloe dlveraoa y tambin levaduru. A peaar de los proreaoe de la higiene y de la teraptlutlca, el nmero de in!ecclonea no parece diamlnulr en Europa: ea la fre. cuencla de loe diferente~ aentea patgenoala que cambia como conI8CIIencla de la aplicacin de m4todoe nuevoa, por ejemplo,la utiliza. cl6n de antibitico.. Antea de 1940 poda conaideraree que el 90 ' de laa mmltil eran orlindaa por emeptococoe, eapecialmente S. otol4ctloe. lA aparicin de la penldl.lna, en 1946, como medio de trltamiento, dio oripn a un cambio drtico en laail:ulci.n . En numerotoa pa~e~ 1t han realizado eltimaclonea de la proporcin de vacaa mamticu, cuyoe re.ultadoa no pueden 18r comparablea a cauaa del mtodo llli\lldo y de que loa datos obtenldoa en explotaclonea normales y e.n ganadoa experimentales no aon alempre coherentea. Con referencia a loa principalet pa~t~ lecheroa, 18 pueden hacer laallguientea obeervacionea: - el dlagnatlco de lu mamltla clnlcu hecho por el veterinario no alcanza ms que una pequea parte del ganado afectado. Los

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Infeccin de la mama y sus consecuencias

resultados son poco numerosos, situndose como mximo en el 5% de las vacas. - El conjunto de los abundantes datos obtenidos en el diagnstico de la mamitis mediante sondeo, realizado en diferentes regiones, no muestra muchas diferencias. Como trmino medio dan posi tivo el 40% de las vacas y el 20% de los cuartos (lo que indica que aproximadamente estn infectados dos cuartos por cada vaca). - Los resultados basados en la inflamacin de la mama (prueba CMT, referida ms adelante) son ms elevados. Se puede considerar que el 50% de los cuartos tienen un proceso inflamatorio.
Los estafilococos y los estreptococos son, con mucho,la causa ms frecuente de infeccin. Casi siempre se encuentran en igual proporcin. Entre los diversos grmenes pueden encontrarse especialmente E. coli, otras Enterobacteru:eae, y levaduras. Existen infecciones mixtas con dos y a veces tres especies patgenas en un mismo cuarto.
Bl Los estreptococos El cuadro 48 muestra algunas caractersticas de las especies consideradas. Los estreptococos que se encuentran con mayor frecuencia en las mam.itis son, en orden decreciente de presencia, S. aalactiM, S. uberls, S. dyqa/actiM, S. zooepldemicus, estreptococos de los grupos G, L, E, P y estreptococos del grupo D. A veces, S. uberls es ms fre.cuente que S. aalactiM. El estreptococo pigeno del grupo A, hemoltico (l, se encuentra excepcionalmente en las mamitis. Este germen es patgeno sobre todo para el hombre (afecciones purulentas, erisipela, escarlatina). S. 01alactiae (grupo B) es el agente de la "mamitis contagiosa" de la vaca (durante mucho tiempo fue denominado S. mastltdls). Este germen vive casi exclusivamente en la mama; sin embargo, puede provocar en el hombre infecciones importantes, por ejemplo anginas. Es hemoltico, de manera variable. Da resultado positivo en la prueba de CAMP (figura 67) y no fermenta la esculina. Al ser muy sensible a la penicilina, la frecuencia de mamitis debi das a este germen ha disminuido al introducirse este antibitico en teraputica veterinaria. Pero desde hace algunos aos se est asistiendo a un retroceso considerable, cuya causa es la tendencia a utilizar nuevos antibiticos que, de una manera general, son rnenos activos frente a este germen. La utilizacin de mezclas de antibiticos ha corregido esta tendencia. Los estreptococos del grupo C: S. dyqalactiae y S. zooepidemicus, provocan marnitis de gravedad variable, frecuentemente agudas pero normalmente subclnicas. Estos grmenes son tambin sensibles a la penicilina. S. uberis provoca mamitis subclnicas triviales y se le encuentra
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Infeccin de la mama y sus consecuencias

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cada vez con mayor frecuencia. Generalmente es sensible a la penicilina. Sus caractersticas son aproximadamente inver888 a las de los anteriores: no hemoltico, CAMP negativo o a veces positivo, fermenta la eeculina. Elte germen se diferencia del grupo pigeno por otl'as propiedades, especialmente por la posibilidad de crecer an al Oe y a 45"C.

Cuadro 48. Estreptococos de la mamitis.


Grupo
lOrO

16alco

Eopecle
PYOftn.ll

Hldrll8lo ( 1) Hem6 Prueba Hipu Escu CAMP rato lina llolo

Obaer..clonea raro frecuente bastan . fKc. bastan . free. raro


raro

A
B

e e (3)
D E (4) G

qa/4ct14e dysgaldctloe a zooepldemlcut faeul p ln/rtqutnl

p p (v)

(2)

? L - (E?) u6eri.J

+ (v)

+raro (S)

iuy frecuen.

(1) Todas estaa especies desradan la arginiDa y producen amonaco . (2) v: car4ctor variable, &OJD las copas. (3) Laa otras dos especies delsrupo e (S. equl, S. equslml/is)no se encuentran

en la mama.
(4) La nomenclatura do especies prximas que pertenecen a los tres grupos E.P .U. es confusa. (S) Frecuencia variable SOIJI\ el pas: proceden del perro y del cerdo.

S. uberi$ entra difcilmente en la clasificacin serolgica y se asemeja a las especies del grupo E de Lancefield, especialmente a S. lnfrequens. ya que algunae cepas reaccionan con el antisuero E, a pesar de que no pueden inducir por s mismas este antisuero tras su inyeccin en el conejo. Un hecho interesante es que la inoculacin de estas dos especies en la mama de la vaca en lactacin no provoca infeccin alguna, mientras que si la inoculacin se realiza en el perodo seco, s se puede producir, aunque en un escaso porcentaje. La falta de infeccin est probablemente relacionada con la sensibilidad de estos grmenes a la lactoferrina y al sistema peroxldsico natural de la leche. Contrariamente a lo que ocurre con otros grmenes causantes de maCopynghed r1atenal

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Infeccin de la mama y sus consecuencias


col~

estn ampliamente difundidos en el medio ambiente. En la cama del establo 88 encuentran a veces ms de 106 gnnenes/g. En el anterior captulo 88 ha mencionado que los enterococos (grupo D, S. (aecalls, S. (aeclum, S. bovis) son patgenos algunas veces; las mamitis que provocan son poco graves pero difciles de eliminar, porque estos grmenes son resistentes a varios antibiticos.
C) Los estafilococos Las principales caractersticas de estas bacterias 88 han citado en el

mitis, S. uberis, lo mismo que E.

captulo X. La especie patgena S. aureus elabora una coagulase, una DN-aaa y diferentes toxinas~. (J, , 'Y; fermenta diversos azcares, es pecialmente el manito!, hecho que 88 utiliza para su identificacin mediante cultivo en un medio fuertemente salado; fermenta la lacto sa, pero slo acidifica moderadamente la leche; no tiene actividades proteolticas. La pared celular de S. aureus contiene un componente caracters tico: la protena A, que se puede poner fcilmente de manifiesto mediante una reaccin de hemoag!utinacin. Por ob:a parte, esta bacteria produce un "clumping-factor", 8U8tancia que provoca la formacin de aglutinados con el plasma de conejo. El tipo ~-hemoltlco es bastante raro en las mamitis; ms bien se trata de un parsito humano (el "estafilococo dorado"). El tipo /l-hemoltlco (sea puro, o con ~ o 6) se encuentra en un 95% de los casos. La virulencia de las cepas est ligada a su "tipo toxtco". Las cepas ms virulentas, en la oveja, son del tipo ~ y las menos virulentas son del tipo ~(J o ll puro. La hemolisina 'Y no ha sido identificada. La eliminacin de estafilococos, por la limpieza del instrumental, especialmente la mquina de ordear, o por el uso de antibiticos, es ms difcil que la de los estreptococos; en un porcentaje de casos elevado resisten a todos los tratamientos, aunque sean hechos con anti biticos activos sobre las cepas infectan tes aisladas. Su frecuencia en las mamitis aumenta. En las leches procedentes de ordeo asptico suelen encontrarse microorganismos que no tienen los caracteres anteriores (hemlisis y coagulasa negativas) pero que, en determinados casos pueden perturbar la secrecin de la leche. Son patgenos menores, raramente asociados a sntomas clnicos.

DI Gt-menes diversos a) Algunas enterobacterias (Escherichia, Klebsella) provocan mamitis bastante frecuentes en ciertas regiones, y muy raras en otras; esta frecuencia ha aumentado desde la utilizacin de la penicilina.
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la mama y aus consecuencias

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eapeclea del gn.e ro Kkbs~/14 y algunaa cepu de E. coli aon patpna para el hombre. b) El CoryMixu:tlrium pyo,.nu es la canA de mamllilenvea. cuya trecuencia aumenta en verano. w moscu te encaraan de la difu. lln de 101 grmenea. o) Pseudomo1141, Proteut y grmenes anaerobl01, como el Clostridlum ptrfrlfllen&, el bacilo de Scbmorl (Bac. necrophoru1), etc. d) Lu levaduru etporenu del gnero Cryptococcut, cuya aparicin parece reciente, 18 ilutauran tna 101 tratamiento. con antibiticOI y aon muy reai.Jtentea a lu teraputicu babltualea. En ocasiones telat encuentn en estado puro en un cuarto mamarlo.

11 PRINCIPALES PROPIEDADES DE LOSGERMENESPATOGENOS


Al Htm61illl y coeguleA Loa grmenea patcen01 tienen medi01 de infeccin que ponen en Jueco eru.lm'l extracelulares, lat cuales pueden f6cllmente ponerwe de manlraetto en el laboratorio; algunu ae col18ideran como toxinu: - w hemo/Wtw destruyen loe glbuloe roj01; en un medio de cultivo que contenga tangn~, la bemliais se traduce por la desaparicin de la coloracin roja y la aparicin de una zona circular transparente en tomo a la colonia. - Laa coaguhwls aumentan la velocidad de coagulacin del plasma sanguneo; en los medios que contienen fibrngeno, se forma rpidamente Clbrina coagulada, y una zona opaca rodea la colonia. - w flbrinolilliruu dsuelven loa coguloa de fibrina. En los mediOI opacoa con fibrina coaulada (plasma tanuneo previamente calentado a 56 C), la fibrinolisis ae tnduce por una zona transparente en tomo a la colonia. La hemliais et uno de los caracteres m linirtcatlv01 dd poder patceno; llln embargo, en el caao de loa estarllococos,la coaulasa es el carcter determinante. En el laboratorio de diagnstico 18 utilin.n medloa slidos selectivos para la investigacin de loa estreptococoa y eatarilococoa bemolticoa. El upecto de la bemlisa es variable y depende, por una parte, de la eapecle patgena, y por otra, del origen de la tansre utilizada. Lu diferentes formaa de bemlaa se designan mediante letna del alfabeto grieco; atu no Uenen el mamo aicnltlcado para loa eJtreptococos que para los estefilococos (figura 66).

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Infeccin de la mama y sus consecuencias

1. ESTREPTOCOCOS

8
2.

(en sangre de rumiante$ y de caballo}.

a - pequea zona de hemlisls patclal verde

-hemllsis total ancha o estrecha (11

ESTAFILOCOCOS a - hem61isls total en sangre de conejo (y un poco en sangre de rumiantes).

(J- ham61isis parcial, no transparenta, en

sangre de rumiantes.
a-pequea zona de hemlisls total rodeada de un anillo de hemlisis parcial, en sangre de rumiantes.

S- zona de hemliss total en sangre da conejo, cordero y en sangre humana (las otras formas de
hemli.sis ~o se producen con sangre humana).

Figura 66. Formes de hemlisis.

1. Antes se designaba por ex'una hemlisis total estrecha de los estreptococos.

Los estreptocococ del grupo B, que son los ms frecuentes, producen una hemlisis variable cuando se cultivan solos; pero si se culti.van en presencia de un estafilococo ll-hemoltico, originarn una amplia zona de hemlisis total en la zona de hemlisis parcial del estafilococo. Este es el fenmeno de CAMP, y se llama " CAMP-factor" a la sustancia segregada por el S. aalactae que tiene la propiedad de lisar los hemates de carnero sensibilizados por la toxina estafiloccica /). Este fenmeno permite la identificacin de los estreptococos y estafilococos (figura 67).
Copynqhted malenal

Infeccin de la mama y sus consecuencias

41 1

B) Otras enzimas

Entre el equipamiento enzimtico de los estafilococos se encuentran dos enzimas que permiten distinguirlas de otras especies, especialmente de los estreptococos: la catalasa y sobre todo la DN-aaa termorresistente, llamada tambin termonuc/e(l$11. La prueba de determinacin de la DN-aaa es bstante til en microbiologa alimentaria, ya que si es negativa,.el producto examinado puede darse como sano y si es positiva, se recomienda caracterizar las enterotoxinas.
A
B

Ffgur11 17. AplicacJn anaUtica de la htHTtllsis. Fenmeno de CAMP. Los estreptococos que se desea identificar se siembran perpendicularmente a un dimetro a lo largo del cual se ha sembrado previamente el estafilococ:o /f-hemolltico.

Cepa C: CAMP +. hemlisis Pestredla Cepa H: CAMP +, no hemolltlco 1 Cepa E: Cepa G: Cepa F: Cepa O: Cepa A: CAMP CAMP CAMP CAMP CAMP

+. esculina + -. esculina +

Str. agalacriae Str. uberis

-. hemlisis a esculina + Str. <1ysgolsctiae -. hemllsls pancha Str. pyogones +, hemlisisJancha Str. grupo E. (Foto M. Plommeni, I.N.RA)

Copynghted matenal

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Infeccin de la mama y sus consecuencias

111 DIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO


El grave problema de la mamitia contagioaa no puede resolverse con el descubrimiento de medios eficaces de tratamiento, si no ae dispone de un mtodo de dlagnetico almple, preciso y sensible. Gracias a loa medioa selectivos y a la aplicacin del fenmeno de CAMP, tal medio existe, tanto para los estreptococos como para loa estafllococoa. Des de luego, no puede ponerse en prctica ms que en el laboratorio, pe ro los mtodos rpidos que veremos ms adelante estn Slijetoa a cierto margen de error y no aportan indicacin alguna sobre la naturaleza del germen patgeno. En 1962 Plommet estableci un mtodo de referencia para el aislamiento e identificacin de loa grmenes de ia mamitia, que permite demostrar los agentes ms frecuentes de las mamitls contagiosaa, tan to en las leches de mezcla como en las individuales. La muestra de le che debe tomarse con limpieza, ain que sea neceaaria una toma asp tica. De esta forma se puede realizar un diagnstico de establo, por examen de la mezcla de leche del rebao, con una muestra tomada en el momento de la recogida o en la lechera. Este mtodo consiste en aislar loa grmenes mediante siembra de 0,025 mi de leche sobre geloaa adicionada de esculina y sangre de cordero, seguida de la identificacin de loa grmenes. Con esta finalidad se recomiendan dos medios: 1. Medio T.K.T. para la identificacin de estreptococos; ("Toxine, Kristal-violet, ThaUium ") contiene, adems de las IUStancias nutritivas nitrogenadas (peptona y extracto de carne), sulfato de talio, vio leta cristal, esculina, glbulos rojos de carnero y la toxina eatafiloccl ca, sta t>rocedente del lquido de cultivo de un estafilococo calentado a 85 e, donde la toxina (1 se destruye y alo queda la toxina {1, que es la que interviene en el fenmeno de CAMP. El aspecto de la hemlisis y del cultivo permiten diferenciar el S. GIGI4cti4e de los otros estreptococos. 2. Medio T.G.C. para la identificacin de estafilococo; (Telurita, Glicocola, CAMP-factor), contiene, adems de las BUstancias nutriti vas nitrogenadas, manito!, glicocola, cloruro de litio, telurito de po tasio, glbulos rojos de carnero y factor CAMP eportado por un cultivo de esizeptococo. Las colonias rodeadas de una zona de hemliais total son las de estafilococos patgenos. Los estafllococos patgenos son objeto de interesantes investiga clones, en la actualidad, por motivo de la frecuencia de las infecciones que provocan y de la inseguridad del tratamiento. Se ha propuesto un diagnstico rpido basado en el resultado de tres pruebas a partir de colonias obtenidas sobre geloaa y sangre de cordero: el cultivo pone en evidencia la hemolisina ll, y dos pruebas de aglutinacin sobre pla ca, la protena A y el clumping.factor. El cuadro 49 muestra que nin
Copynghted r- atonal

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guna de laa cepu da resultado negativo para las tres prueba; adems se ha establecido un esquema de identificacin. Cuando un germen se encuentza en pequea cantidad en un medio de cultivo, es necesario determinar si ea originario de la mama o ai proviene de una contaminacin al tomar la mueetza. Para ello ea preciso utilizar un medio de cultivo no selectivo que permite el desarrollo, al lado de loa Jrmenee patgenos, de las especies caractersticas de la contaminacion. La gelosa-eaculina con sangre de cordero responde a eata fmalldad.
Cuadro 49. Prueoo de Identificacin del Staphylococcus aureua.
C.rictor AIIOCiacl6n de re.Wtadoa Proporcl6n de r..Wtadoo poslltt'oa, %

- + Clumplngfctor -+ Protena A - +
Frecuencia

HemosJobina fJ

- o 39,5 37 ,S 0,5 4

+ +

+-- - + + + +

+
-

76 93,5 56

2 10,5 6

200 cepu de divenoa orenes (sen Poutre1 y Ducelllez, 1979).

IV ME TODOS RAPIDOS DE DETECCION DE LAS MAMITIS

Al Evaluacin del nmero da clulas aom6ticas


Las pruebas siguientes indican la presencia de una inflamacin de la mama sin llegar a precisar si se trata de una inflamacin de naturaleza infecciosa. Son muy interesantes por ser muy simples, y algunas convenientes para el primer examen de un gran nmero de animales "in situ".
l. El recuento celuhzr El contenido en clulu somticas de la leche constituye un buen parmetro para la apreciacin del estado sanitario del pezn. Los especialistas consideran que el umbral de 500.000 clulas/mi ea un criterio bsico para diferenciar los cuartos mamticos de los sanos. Los reglamentos de la O.C.D.E. han prohibido la utilizacin de leche que contenga ms de 1 milln de clulas. En algunos pases se han propuesto y aceptado lmites ms bajos (hasta de 200.000), lo quemo-

Copy nghtC'd m aten al

Infeccin de la mama y aus consecuencias tiva u.n a aeleccin mucho m rlida. A eoee ya aprecian altel'llcio. n~ m el funcionanento de la ma!M con 200.000 c41ulaa. El *uento al microecopio, a peaar de lea mejor~~lntroducidaa, es enorroeo, pues se debe contar un ran nmero de campos al se quje. re coJlleiUir alguna precisin. La ut.lliucin de loa contadorea electrnico de particulaa, tras fi. jacln de loa ncleos celutare., airve perfectamente para un anlisis rpido de IP'lD nmero de muestras, pero el equipo ea relativamente caro. En laa leches de buena calidad o de calidad media, los resuJtadoe dadoe por este mtodo y loe obtenidoe por el recuento al microscopio aon concordantea. En laa lechea muy contaminadas, en las que se Corman aclomerados de bacterias que pueden contane como si fuesen clulas, loe reaultadoe son m elevados que la realidad. En el cap tulo xvm se presentan varios tipoa de contadoru de clulas. El mtodo de fluorescencia ptico, aplicado en el aparato "FOSSOMATIC", evita Interferencias en el recuento de partculaa extraas, porqu.e las clulas que ee cuentan han sido marcadas con un colorante fluorescente (bromuro de etidlo). Basado en e1te procedimiento exllte un "citofotmetro" que detecta la nuore.cencia emitida en la reaccin entre el DNA celular y un colorante. (La determinacin colorimtrica del DNA puede realiune siempre que aa Mpare las clulaa por medio de un filtro.) La poblacin ce1u1.ar ea heterogl!nea y comprende en eapeciallinfocitot, leucocitos polinuclearea y clulaa epiteliales. Loa m abundan tea en lea leches mamticas aon los polinuclearea. Se ha tDSliYado el recuento de estas ltimas clulas separadamente, pero en su aplicacin p ara el control de loe establos tiene poco xito. 2. Pruebas con detergentes El DNA procedente de los ncleos celulares puede ponene de manifiesto por medio de varias reacciones que forman una mua vilcosa o elificada. Huta hace poco ee utilizaba la &Ola (pNeba de Whiteside ), que ha aldo auatituida por detergentes sintticos. La pNeba ms simple ea la "CMT" (01/i(om/4 Maalltl$ Tell). En un crlatalizador de vidrio de 6 cm, se mezclan 2 mi de leche y 2 ml de aolucin de Teepol al 10%de principio activo (el producto comercial tiene el 26 t ), que contenp un indicador de pH, la prpura de bromocreaol al 1/10.000. Pueden diatlnguine varios radoa: - reaccin -: la mezcla permanece bomol!nea (probableme.n te menos de 300.000 clulas) - reaccin + : pequeos flculos adheridos a tu paredes (probablemente menos de 500.000) - reaccin + + : flculoa viaco101 (menos de 1 milln de clulas?) - reaccin + + + : el espeso

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Las conelacionea que se indican con el nmero de clulas son aproximadas y se refieren a leches de mezcla limpias. Esta prueba tiene la ventaja de poderse aplicar a las leches de pequeas mezclas (leche de un establo). Es muy utilizada en el momento actual a pesar de su carcter subjetivo. Se ha intentado valorar objetivamente loa resultados de la reaccin. En la "WMT" (Wi8con8in Mll8titu Test) se mide la viscosidad de la mezcla.

B) Pruebas divenas a) Pruebas enzimtlcas basadas en el aumento de determinada actividad de este tipo (ver ms adelante). La prueba de la catalasa (captulo Vlll) es poco utilizada hoy da. Tiene ma aceptacin la de la NA Gasa. b) Pruebas basadas en los cambios de composicin (subblulo IX). Se ha utilizado, en el control de establos, el nivel de lactosa y de &eroalbmina bovina, as como la conductividad elctrica. e) Pueden mencionarse algunas pruebas de carcter histrico: -el pH de las leches mamticas se eleva hasta 7 ,O en un 50% de los casos. El papel "indicador de mamitis", sobre el que ae dejaban caer algunas gotas de leche no constituye un medio significativo de control. - el "cazo de ordeo" no puede poner de manifiesto ms que las Infecciones agudas. Se vierte la leche en una tela negra colocada sobre el cazo y se observa la presencia de grumos.

V FORMAS DE INF ECCION

A) Diferentes tipos de mamitis


Se distinguen: - mamitis clnicas, reconocibles por la vista y el tacto; - mamitis subclnicas, no reconocibles de forma directa pero acompaadas de la secrecin de una leche anormal; - infecciones latentes, que no pueden descubrirse ms que por el examen bacteriolgco sistemtico; la reaccin de los leucocitos es negativa. Una proporcin comn, en Francia, de estas diferentes formas puede estimarse como sigue: mamitis clnicas un 10%, subclnicas 60%y un 30% para las mamitis latentes. Hoy da se admite que una infeccin subclnica de la mama producida por grmenes patgenos menores (micrococos, estafilococos coagulase negativos), da origen a una proteccin contra el establecimienCopyngh!ed r atcnal

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Infeccin de la mama y sus consecuencias

to de infecciones ms graves como las producidas por: S. 178alactiGe, E. co/i o Staphylococcus aureus.

Bl Curso de la infeccin
l. Penetracin de los gmenes en la mama a travs del canal del

pezn. La eficacia de la barrera que representan los pezones y su esfnter, vara notablemente segn los individuos; pero tambin vara de ma neia considerable durante la lactacin. En el caso de la mamltls estaruoccica de la oveja, se ha demostrado que a mayor cantidad de leche, menos eficaz es la barrera. 2. Cuando las bacterias han alcanzado el seno galactforo, pueden presentarse varios casos: - las bacterias se multiplican rpidamente, el organismo es invadido y sus medios de defenaa rebaaados; se declara la mamitls; -las bacterias sobreviven, los medios de defensa .son suficientes para evitar el desarrollo de una mamitis aguda ; la infeccin ea latente o subclnica; - las bacterias son eliminadas, sobre todo por la accin de los leucocitos. 3. Establecimiento de las lesiones y eventualmente, produccin de toxinas. El mecanismo del desencadenamiento de las mamtis clnicas no est an bien definido. La rapidez y la importancia de la aparicin de los grmenes en las leche vara segn el tipo de la infeccin; ocurre lo mismo con los leucocitos resultantes de la reaccin celular. La leche de los primeros ordeos que siguen a la infeccin, ea normal en cantidad y calidad , pero luego se vuelve anormal, ms o menos rpidamente.

Cl Infecciones latentes
La evolucin de las infecciones latentes es imprevisible. Se pueden encontrar los mismos grmenes en la mama durante varios aos, en cantidad bastante regular, sin agravacin. La virulencia de un germen dado es muy irregular en una misma mama y de un cuarto a otro; puede mostrarse muy ofensivoen un cuarto e inofensivo en los otros tres, que tienen apariencia de inmunidad. La emisin de los grmenes por la leche, lo mismo que la emisin de clulas, puede desaparecer bruscamente y volver ms tarde. A veces no hay reaccin celular; se comprueba entonces la presencia de grmenes patgenos sin leucocitos.

DI Produccin de anticuerpos
La introduccin en la mama de microorganismos portadores de antgenos variados, provoca la aparicin de anticuerpos, a la vez en la sanCopynghtC'd rnatenal

Infeccin de la mama y au. consecuancias

417

11'8 y en la mama. Esto. anticuel'J)OI colUtituyen un medio de defensa cuya eficacia no ee IIPtecia m que al cabo de un determinado tiempo. La VICUIUicin local o aeneraJ mediante olulas !ormolacl o por anatozinu, tiene el mismo efecto. Lot anticuerpoe tienen probablemente doe oreenes. Unoe procede.n del sistema tanUneo y pasan a travt del tejido mamario en un porcentaje IIPro.J:imaclamente constante e Independiente de J.u infiamacionea. r.o. otroe ee !onnan en el tejido linftico de la mama traa el estmulo antl~nlco local, y ee excretan con !aleche, pero tambin pasan a la sanre.

Obrvcrci6n.- Para el estudio metdico de la mamltia ee hace In


diapelUible recurrir a la Infeccin provocada en vacu trictamente eeleccionaclu, sobre todo cuando ae trata de mamitia eatafiloccicas. De esta forma ae eliminan l.u incertidumbres que ae producen cuando ae experimenta con eatebloa nonnalea, y ee pueden dominar loa diferente parmetros Implicados en la Infeccin.

VI PROPAGACION DE LA INFECCION
A) El ordlllo En el momento actual ae conoce perfectamente el mecanilmo de la Infeccin. La forma de realiur el ordeo tiene mucha Importancia: l . El contalio ae bace cui Jiempre por l.u manoe del ordeador o por lu pe:r.oneraa de la ordeadora mecnica, que tranaportan los grmenea patenos de una vaca a otra, o tambin de un pezn a otro. Laa bacterias 18 depositan en el extremo del pezn o on el canal es triado, Invadiendo loa 18nos galactforos entre doe ordeiios. 2. La aparicin de la ln!eccin se favorece lualmente con el ordeo realizado violentamente y con ordeadoru mal reuladu. Las heridas del pezn son muy frecuentemente el orien de lu mamitia. En especial te conaidera la mano como un .,ente de contqio para los eatraptococo., y la mquina para loe eatafilococoe. Debe eelne que la aupresin de un ordeo por II!!D.Ina no aumenta ll!nliblemente el pon:en~ de nuevas infecciones ni el nmero de ln!eccionea persiltentea, pero hace ms gravea lu mamitis clni

cu.
8) El medio axterior
Loa ~rmenes de las mamitls contagiosas ma frecuentes no se reproducen en el medio exterior, solamente sobreviven. Todo aqueUo que reduzca la denJidad microbiana en tomo al animal reduce uimiomo el rleao de infeccin; no obetante, es necesario obeervar a eate respecto que la cama tiene un papel secundario en la tranamlai6n de loa

418

lnleccl6n de la mama y sus consecuencias

grmenes patgenos, en comparacin con la mano del vaquero o de la pezonera, aalvo para ciertos grmenes como Streptococcus uber que aon poco afectados por las medidas de higiene tomadas sobre la vaca.

Cl Su~tibilidad del animal


La raza no parece tener Influencia; por el contrario, existe la herencia de la sensibilidad a la mamitis. En los ganados especializados para una elevada produccin lctea, la sensibilidad es ma grande que en loa de produccionea medianas. La sensibilidad del animal vara en el tzanscurso del ciclo de lactacin; ea mxima durante el perodo de secado. La mamitis se manifiesta entonces al principio de la lactacin siguiente, poco despus del parto; hemos visto que el calost-ro tiene un efecto estimulante sobre el S. aal4cti4e. La frecuencia de las mamitis es mayor en los animales ma viejos; las vacas jvenes se infectan con menos facilidad. En las observaciones precedentes, la conformacin y estado del pezn tienen gran influencia.

DI Factores divenos. Aliment11Ci6n La estacin tiene poca influencia, y sin embargo hemos visto antes el caso de mamitis de verano con el Corynebacterlum pyogenes. El estado del animal influye en la aparicin de las mamitis. Entre los factores que la favorecen pueden citarse los enfriamientoa,la congestin, la fatiga y una racin desequilibrada. Tradicionalmente se considera como un factor favorecedor de la mamitis la alimentacin demasiado rica en materias nitrogenadas. Sin embargo, la alimentacin hipemitrogenada no influye en el aumento de las infecciones ni tiene influencia sobre las mamitis clnicas. En el caso de los estreptococos hemolticos de los grupos C, G y L, ea interesante investigar a otros animales como fuente de contaminacin, sobre todo los cerdos.
VIl LA LUCHA CONTRA LA MAMITIS

Al Profilaxis
Existen unas reglas generales que pueden resumirse as: l. En una explotacin sana, la infeccin penetra con la llegada de un portador de grmenes; de aqu que sea preciso el aislamiento de toda nueva vaca durante un tiempo de observacin. 2. En todo tiempo es til la vigilancia regular de las vacas lecheras: examen de la mama, pruebas simples de control de la leche, especialmente mediante el test CMT. Si la leche parece dudosa, se encarga un CopynghtC'd rnalenal

Infeccin <le la mama y stJs consecuencias


u~men

419

bacteriolcioo a un labota!Qrio especializado. Puede u descubrine la infeccin en 1111 principia. o al ponene de manifiesto, y tratarla a empo con mayora probabilidades de zi!Q. Deede el momen!Q en que una VtiCa praenta cualquier anomala (en la leche o en la mama) debe aeparane de las ratantes y ordearae la ltima. 8. Lo6 animalet que praenten anomalas en la. pezonea (deforma clones hereditarias, ndulos, herida en la extremidad) deben elimlnane . El empleo de aondu de ordeo por el pnadero conduce fre. cuentementa al detarroUo de mamtiJ ; es difcil que aquel! aip todas las reaJu de la aaepea, y muy probablemente que letlone el pezn. 4. Ea evidente que el reape!Q de !u reaJu referente a la higiene del animal y del establo et muy favorable para la aalud de la mama. Si la p~a et abundante, et ventl,ia.o practicar la ealabulacln Ubre. Con loa etlabloa ancha. ae aprecian menoe mamitia que con loa eatzoechos. Cuan!Q m eatrecha aea la superficie reservada al animal, mayor ser el rieao de tnumatiamoa en tu mamu por golpe.. 6. El ordeiio debe aer suave y comple!Q. Es neeeaarlo tener en cuenta que el tejido mamario et delcado; por ello, tu manipulaciones violentaa provocan letionet que ae infectan facilmente. Ee necesario inaiatlr en el hecho importante de que las fiuctuaciooe. del vaco en la ordefiadora mecnica deben aer las mnimas poaiblea. 6. Cualquiera que aea la forma de onlefiar, a mano o a mquina, la operacin debe bacerae siempre con minucioeoa cuidada. de limpieza. El ordeiio a mquina (bien reculada y limpia) no produce ms mamitia que el ordeo a mano. Se recomienda el uao de un pao individual para limpiar la mama de cada vaca antes de ordedarla, pao empapado de una solucin acuosa de un antisptico no cast.ico, por ejemplo un hipoclori!Q o una solucin de yodforo con 5 g/1 de yodo. Tambin ae puede hacer un "el\iuague" de la mama con esta solucin durante algunos aegundos. Cuando se teme una in!eccin es muy til la plictica de esta deainleccin deapua del ordedo. 7. La tcnica de la eliminacin de los primeroe chorros antes del ordeo et muy utilizada cte.de hace aos. Se trata de la atraccin a mano, de una forma especial, de tres chorros de leche de cada pezn. De acta manera ae eliminan 101 crmenea que 1e encuentran en el ca nal, antes de au multiplk:acin. La eficacia de dicha operacin es slo evidente cuando ~e realiu antes del ordefio. 8. Es un hecho comprobado que en loa e.tahloe m! cuidados, la proporcin de mamitiJ ctnicu va en aumen!Q, y que en tos establos bien atendidos son raru las mamitia ctnicu, aunque lu infecciones latentea le hacen m trecuentea. No obltanta, eataa ltimu tienen menos Importancia desde el pun!Q de vista de la produccin de leche.