Aline Alfonso Keusseyan Daniel Vieira Conde Oliveira Felipe Silva Castro

Matheus Trovo de Queiroz Silas Pinto da Silva 2 ano de Biomedicina - Turma 45

Anlise da resposta contrtil de diferentes msculos lisos

Introduo
As clulas musculares lisas so um dos principais componentes dos sistemas respiratrio, circulatrio (vasos), digestrio e trato urogenital. Essas clulas tipicamente formam camadas ao redor de rgos ocos. Assim como no msculo esqueltico, a musculatura lisa deve ser capaz de desenvolver fora, se encurtar para gerar motilidade ou para alterar as dimenses de um rgo. O msculo liso tambm deve realizar contraes, para manter as dimenses do rgo contra cargas impostas como, por exemplo, nos vasos sanguneos, fazendo com que eles resistam presso arterial. Os msculos lisos podem ser classificados de acordo com sua propriedade de acoplamento eltrico, ou seja: unitrios e multiunitrios. As clulas no msculo liso unitrio so acopladas eletricamente, de modo que a estimulao eltrica de uma clula marcapasso seguida pelo estmulo das clulas adjacentes, resultando em uma onda de contrao. Diferente destas, as clulas do msculo liso multiunitrio no so acopladas eletricamente, assim, a estimulao de uma clula no resulta necessariamente na ativao das clulas adjacentes. Os msculos lisos tambm podem ser distinguidos quanto ao padro de atividade. Em alguns rgos as clulas se contraem de modo rtmico ou intermitente, sendo denominado msculo liso fsico; em outros, as clulas esto constantemente ativas mantendo certo nvel de tnus, sendo assim denominado msculo liso tnico. A diferena entre a contrao fsica e tnica est esquematizada na figura abaixo:

Figura 1 Representao grfica das respostas dos msculos tnicos e fsicos A atividade contrtil do msculo liso pode ser controlada por inmeros fatores como hormnios, nervos autonmicos, atividade marcapasso e uma diversidade de substncias. A contrao do msculo liso dependente do Ca2+ intracelular e extracelular, e os msculos citados acima efetuam a contrao por elevao da concentrao intracelular deste on. Diferente do msculo esqueltico ou cardaco, os potenciais de ao do msculo liso nem sempre so necessrios para iniciar uma contrao. Baseando-se nas informaes acima, o pesquisador Michael J. Berridge (Reviso Smooth muscle cell calcium activation mechanisms, 2008) classificou os msculos de acordo com os mecanismos de ativao do clcio: Mecanismo A: ativao pela despolarizao da membrana, que abre canais voltagemdependente (VOCs) do tipo L, permitindo a entrada de Ca2+ externo para disparar a contrao. Essa despolarizao pode ser induzida tanto por receptores ionotrpicos (ducto deferente) quando por um oscilador de membrana (bexiga e tero). O oscilador de membrana, localizado na membrana plasmtica, gera despolarizaes marcapasso peridicas, responsveis pelo potencial de ao que leva contrao. Mecanismo B: as contraes rtmicas dos msculos lisos vascular, linftico, da via area a do corpo cavernoso dependem de um marcapasso endgeno dirigido por um oscilador citoslico de Ca2+, que responsvel pela liberao peridica de Ca2+ do retculo endoplasmtico. Neurotransmissores e hormnios agem modulando a frequncia do oscilador de membrana. Mecanismo C: os msculos lisos das clulas intersticiais de Cajal (ICCs) (gastrointestinal e uretra) ou msculos lisos atpicos (ureter) so ativados por clulas marcapasso. Estas possuem um oscilador citoslico responsvel por gerar transientes de Ca2+

repetidamente para ativar correntes de influxo que se espalham atravs das junes gap para prover um sinal despolarizante que dispara a contrao pelo mecanismo A. Na figura abaixo esto esquematizados os trs mecanismos de ativao do clcio:

Figura 2 Representao dos mecanismos de ativao do clcio Vrios agentes podem aumentar a concentrao de Ca2+ intracelular e, consequentemente, fazer com que o msculo liso se contraa, sem alterar o potencial da membrana. Essa contrao denominada acoplamento frmaco-mecnico e geralmente reflete a capacidade do agente em aumentar o nvel do segundo mensageiro intracelular IP 3. Outros agentes provocam a diminuio da tenso, tambm sem alterar o potencial de membrana; esses agentes geralmente aumentam os nveis dos segundos mensageiros intracelulares GMP e cAMP. Esses mensageiros regulam a atividade de diversos mecanismos intracelulares, como a atividade de bombas e canais inicos que podem atuar modificando as concentraes de Ca2+ intracelular. A despolarizao da membrana desencadeia eventos que tambm levam a contrao muscular. A variao de tenso ativa canais de Ca2+ dependentes de voltagem que se abrem, liberando a passagem do Ca2+ do meio extracelular para o meio intracelular. Este mecanismo denominado acoplamento eletromecnico. Os msculos lisos que trabalham com esse mecanismo tem uma dependncia maior do Ca2+ externo. Os trs tipos de msculo apresentam o mesmo mecanismo de contrao (acoplamento actina-miosina), porm, a unidade motora diferente. O msculo esqueltico e o cardaco apresentam sarcmeros, enquanto msculos lisos apresentam fibras de actina e miosina dispersas no citoplasma, ancoradas membrana por corpos densos.

Outra diferena importante a voluntariedade. Os msculos esquelticos so voluntrios e controlados pelo sistema nervoso. O cardaco involuntrio, pois produz seu prprio potencial de ao, sofrendo apenas regulao do sistema nervoso. O msculo liso pode tanto ser controlado pelo sistema nervoso autnomo quanto sofrer contrao desencadeada por PAs autnomos. Uma diferena qumica ocorre no mecanismo de regulao da contrao. As unidades regulatrias do msculo esqueltico e cardaco so a troponina e a tropomiosina, que controlam a exposio dos stios de ligao da actina, permitindo a ligao de ons clcio. O msculo liso no contm troponina. Sua regulao dada por calmodulina, que quando ligada a ons clcio, sofre uma alterao conformacional que ativa uma cadeia de reaes que fosforila as cadeias leves da miosina, permitindo a interao desta com a actina. As origens do clcio tambm so diferentes. Os msculos cardaco e esqueltico dependem de Ca2+ armazenado no retculo sarcoplasmtico, enquanto o msculo liso usa clcio externo ou osciladores citoplasmticos. O msculo cardaco unitrio, pois possui gap junctions que permitem a transmisso do potencial de clula a clula. O msculo esqueltico multiunitrio, pois h unidades motoras inervadas por neurnios. Essa caracterstica pode variar nos msculos lisos dependendo de sua localizao e sua funo. Quanto ao tipo de contrao, o msculo cardaco fsico, pois apresenta uma contrao rpida e pontual; o esqueltico pode ser fsico ou tnico dependendo do uso; e os msculos lisos, dependendo de sua funo, podem ser fsicos ou tnicos.

Objetivo
Avaliar o comportamento da contrao da musculatura lisa em diferentes meios e sob a ao de diferentes substncias.

Materiais e mtodos
- Banho de rgos isolados; - Soluo Krebs pH 7,4-7,6
Composio: NaCl 115mM, KCl 5,9mM, MgCl2.6H2O 1,2mM, NaHCO3 25mM, NaH2PO4.H2O 1,2mM, Na2SO4 1,2mM e CaCl2.2H2O 2,5mM;

- Pipeta; - Transdutor de tenso; - Amplificadores; - Computador; - Bomba de ar; - leo, clon e aorta de camundongo; - Fio.

- Carbacol; - Soluo de KCl;

Os rgos retirados previamente de camundongos foram colocados isoladamente em banhos de soluo Krebs. Os rgos se encontravam ligados por um fio a um transdutor de tenso que detecta a fora produzida pela contrao muscular isomtrica e transforma esta informao em sinal eltrico, que amplificado e transmitido ao computador. Este sinal est representado graficamente nas figuras abaixo. Caso se quisesse fazer um registro isotnico concntrico utilizando as mesmas preparaes bastaria utilizar uma mola ligada a um transdutor, que seria inserida transversalmente no lmen dos rgos analisados. Desta maneira, a contrao realizada pelos msculos seria transmitida mola, transformada em sinal eltrico pelo transdutor e assim poderia ser analisada a tenso realizada sobre a mola de acordo com a frmula:

F = k.x
F Tenso (Fora elstica) k Constante de distensibilidade da mola x Variao do comprimento da mola

Procedimentos realizados na aorta, clon e leo: Inicialmente, todos os rgos estavam imersos em banho na soluo de Krebs, pois uma soluo fisiolgica apropriada para esse experimento que utiliza material in vivo. No instante T1 (ver resultados e discusso) foi adicionada uma soluo de KCl. Antes de T2, precedeu-se uma lavagem, com a retirada da soluo presente no banho e adicionada novamente a soluo de Krebs. No instante T3 foi adicionado um agonista (carbacol) ao banho. Entre T3 e T4 foi feita uma nova lavagem e entre T5 e T6 adicionou-se ao banho uma soluo sem clcio. No instante T6 adicionou-se novamente KCl ao banho e em T7 o agonista foi mais uma vez adicionado ao banho. importante ressaltar que desde a incluso da soluo sem clcio a soluo de Krebs no foi mais adicionada ao banho.

Resultados e Discusso

Figura 3 Representao grfica Tenso x Tempo (T) na aorta de camundongo

Figura 4 Representao Tenso x Tempo (T) no clon de camundongo

Figura 5 Representao grfica Tenso x Tempo (T) no leo de camundongo Na primeira parte do experimento foram utilizados mtodos para avaliar a resposta muscular ao mecanismo de acoplamento eletromecnico, adicionando soluo de KCl soluo de banho. A despolarizao que altera o potencial de membrana causada principalmente pelo aumento da concentrao extracelular de K+. Este fenmeno pode ser demonstrado matematicamente pela equao de Nernst, como exemplificado abaixo: K>1 e Ce>Ci, portanto: Esperar-se-ia, caso tivssemos mensurado experimentalmente a Vm (potencial de membrana da clula), encontrar valores de diferena de potencial positivos, pois Ce>Ci e z positivo. Esta despolarizao promove a abertura dos canais de clcio dependentes de voltagem e o influxo de clcio externo o responsvel pela resposta celular contrtil (aumento da tenso), representada nos trs grficos entre os instantes T1 e T2. Esta resposta foi diferente nos trs casos, visto que so msculos com diferenas estruturais e funcionais. No caso da aorta pode-se observar uma resposta tnica, com uma contrao estvel e manuteno do tnus muscular. leo e do clon apresentaram respostas fsicas seguidas de manuteno do tnus, mas de menor intensidade se comparados com a aorta. Em T2, a queda de tenso observada nos grficos foi causada pela lavagem e a consequente diminuio da concentrao de K+ na soluo de banho. Na segunda parte (entre T3 e T4) outro mecanismo testado no experimento foi o acoplamento frmaco-mecnico, utilizando carbacol, um agonista da acetilcolina na contrao muscular.

Neste mecanismo o agonista, um frmaco, se liga a um receptor de membrana acoplado a uma protena G. Esta tem suas subunidades alfa e beta separadas, e uma delas, a alfa, ativa a PLC beta (molcula efetora), que possui ao sobre a membrana produzindo molculas de segundos mensageiros (IP3). Os receptores de rianodina presentes no retculo sarcoplasmtico quando ligados a IP3 liberam clcio presente em seu interior.

Figura 6 Representao esquemtica do mecanismo frmaco-mecnico Por fim, o influxo de ctions por esses canais permite que VOCs de clcio sejam abertos, promovendo influxo de clcio extracelular, o grande responsvel pela contrao muscular. Como pode ser observado nos grficos, houve intensificao na resposta celular contrtil nos trs tecidos, quando comparadas com as respostas vistas anteriormente. Isto se explica pela ao do carbacol nos receptores nicotnicos, iniciando a cascata de sinalizao descrita acima. A queda da tenso vista a partir de T4 devida, novamente a lavagem do banho. Na terceira parte do experimento (entre T5 e T8) a soluo do banho foi substituda por outra soluo sem clcio com o intuito de testar a importncia do clcio externo no mecanismo de contrao nos acoplamentos eletromecnico e frmaco-mecnico. Entre T5 e T6, no leo e no clon, podemos observar a diminuio do tnus basal, significando a dependncia do clcio externo para a contrao muscular nestes dois tipos teciduais. Diferentemente, na aorta no houve mudana significativa do tnus basal indicando a independncia do clcio externo para contrao. Entre T6 e T7, agora com adio de KCl na ausncia de clcio externo, a resposta eletromecnica referente ao leo e o clon foi significativamente menor se comparada com a resposta quando o meio continha clcio. J a aorta, apresentou resposta proporcionalmente maior que as respostas do leo e clon. Isso mostra que o grande responsvel pela contrao muscular artica o clcio interno, presente

no retculo sarcoplasmtico. O mesmo foi observado com a adio do agonista na ausncia de clcio no meio externo. No experimento em questo so diversas as fontes de erro, tendo em vista que toda medio acompanhada de certo erro. Os erros so usualmente divididos em: Erros sistemticos: so aqueles que ocorrem por um vicio constante da tcnica de medio. So basicamente subdivididos entre trs grupos: o Erro instrumental - instrumento com calibrao errada; o Erro metodolgico - mtodo de medio inadequada; o Erro pessoal - vcio do observador. Erros acidentais (casuais): ocorrem devido causas independentes do instrumento ou da tcnica utilizados e que escapam ao controle do observador. Ocorrem de modo casual, sendo igual probabilidade de cometer erros para mais e para menos do valor mdio.

Definidos os tipos de erro, pode-se enumerar e classificar os erros que possivelmente ocorreram na execuo do experimento, que so: O tempo de permanncia sem estmulos para que o msculo liso retorne sua tenso basal Erro metodolgico, pois o tempo necessrio para que o tenso basal retornasse ao ideal no foi respeitado devido brevidade da aula prtica; A calibrao do transdutor Erro instrumental; A condensao do grfico obtido no experimento Erro metodolgico e erro pessoal, porque a condensao do grfico dificultou a observao das diversas fases; A concentrao dos ons na soluo de Krebs Erro metodolgico; A aplicao de KCl e outras substncias na cabine de rgos isolados Erro instrumental.

A isto soma-se o fato dos rgos estarem relativamente menos sensveis s diferentes substncias, j que eles estavam sendo estimulados durante algumas horas pelos grupos prvios. Assim, apenas erros sistemticos foram identificados no experimento. Erros acidentais no puderam ser observados porque o experimento foi realizado apenas uma vez, o que impossibilitou a comparao de resultados para se obter um resultado com o menor erro possvel.

Bibliografia
DOUGLAS, C. R. Tratado de Fisiologia Aplicada Cincia da Sade, 4 edio. Editora Robe, So Paulo, 2009. Apostila de Biofsica (2011), organizado por alguns professores do Departamento de Biofsica. BERNE, R. M., LEVY, M. N., KOEPPEN, B. M., STANTON, B. A. Fisiologia, traduo da 5 edio. Editora Elsevier, Rio de Janeiro, 2004.