Recuentos de viables

El recuento directo al microscopio o el recuento electrnico proporcionan un recuento de todas las clulas, tanto las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide slo las clulas vivas de una poblacin, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir"). Los recuentos en placa y el NMP son recuentos de viables. Cuando se usa la filtracin, se obtiene un recuento de viables. Cada una de estas tcnicas tienen sus ventajas y sus inconvenientes. Recuentos de viables Recuento en placa Filtracin por membrana Nmero ms probable

Recuento en placa
Permite la determinacin de los microorganismos presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.) Adems, a los efectos de que todas las clulas que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del mtodo sean menores, se establece que las condiciones ptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa o menos segn el caso. Cuando esto no se cumple se considera el valor obtenido como una estimacin del recuento, y si es posible se repite hasta caer en las condiciones ptimas. Procedimiento: La preparacin de la muestra se realiza como para cualquier mtodo utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones de 1 en 10 sucesivas, partiendo en general de 10 gramos de muestra para la primer dilucin, y tomando 1 mL de sta descargndolo en 9 mL de diluyente y as sucesivamente. Cada vez que se prepara una dilucin se carga y descarga la pipeta tres veces, descargndola finalmente sobre el tubo con diluyente estril. Se descarta la pipeta luego de preparada cada dilucin. Segn la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar. Generalmente, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3). Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15 minutos siguientes . ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS, EN EL FONDO, CON LOS SIGUIENTES DATOS: Identificacin de la muestra: Nombre y/o Nmero de lote Dilucin Volumen sembrado Superficie o incorporado Fecha Operador

Siembra en superficie: Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada dilucin. Se realiza duplicado para cada dilucin. Se emplea la misma pipeta para todas las diluciones y se comienza por la ms diluda. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas, usando rastrillo estril, en el mismo orden que la siembra (o sea de la ms diluida a la ms concentrada). Siembra incorporada: Se procede de la dilucin mayor a la menor, y se deposita 1 mL de cada dilucin en placas estriles, vacas, por duplicado. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45C en bao o estufa. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular, horario (4 veces o ms para polvos insolubles) y antihorario (4 veces) y movimiento hacia arriba y hacia abajo (siempre sin levantar la placa de la mesa). En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no ms de 2.5 mL por placa. Medio de cultivo: Se elige segn el tipo de microorganismo que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no selectivos. Incubacin: Una vez enfriado el agar en el caso del incorporado, y secada la muestra en el caso de superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde segn los microorganismos a contar, incubndose el tiempo propuesto en la tcnica correspondiente. Interpretacin: Finalizado el perodo de incubacin, observar con buena luz a efectos de visualizar las colonias puntiformes y diferenciar cualquier partcula de muestra que pueda haber. Si molesta, borrar la escritura. Contar las colonias desarrolladas por placa. Se cuentan como colonias individuales, todas aquellas que disten de las colonias prximas una distancia al menos igual al dimetro de la colonia ms pequea. Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente forma: Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias. Se hace el clculo promediando los valores y multiplicando por la inversa de la dilucin. Si slo hubiera placas con menos de 30 colonias, se informa igualmente el resultado, expresndolo por g o mL de muestra. Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (segn sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilucin menor. Si en todas las placas hubiera ms de 300 colonias, se ESTIMA el resultado contando las colonias en una superficie conocida de la placa y luego llevando a la superficie total de la placa: 65 cm2 para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plstico. Se siguen las siguientes reglas: 1) Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 13 cuadrados de 1 cm de lado: 7 consecutivos horizontales y 6 consecutivos verticales. El total de colonias contadas se multiplica por 5 o 4.4 segn el tipo de placa, para estimar el nmero de colonias en toda la placa. 2) Si hay ms de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm de lado, y el promedio se multiplica por 65 o 57 segn el tipo de placa. 3) Si hay ms de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se estima el resultado como Mayor de 6500 o 5700 por placa. Una vez estimado el nmero de colonias por placa, se aplica el factor de correccin para expresar el resultado por gramo o mL de muestra, de acuerdo al mtodo (incorporado o superficie), y a las diluciones de cada placa. Es frecuente que desarrollen colonias extendidas, sobre la superficie, o el fondo y bordes de la placa, o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders" y se cuentan como uno.

Cuando el spreader cubre ms del 50% de la placa, esta no debe contarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la placa, SLO si estn uniformemente distribuidas. Si en todas las placas hay spreaders se informa : Spreaders Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos anteriores, (ej: contaminacin, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de laboratorio" Para alimentos se utilizan los lmites de 25 a 250 ufc/placa.

Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el nmero de colonias que se considera ptimo para contar, suele ser menor de 300, es necesario referirse a la tcnica correspondiente (de referencia) a los efectos de la interpretacin de los resultados. Expresin de los resultados: Se informan los resultados de recuento con slo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando los valores cuando corresponda. Ej: 142 se informa 140 155 se informa 160

El informe debe decir: Recuento de microorganismos (tipo): X u.f.c. /g o mL Ventajas y desventajas de ambos mtodos:

Incorporado Mayor cantidad de muestra. Menor error Mejor aprovechamiento de nutrientes Dificultades al subcultivar colonias Visualizacin de colonias dificultada Temperatura del agar puede afectar Desarrollan microaeroflicos

Superficie Menor cantidad de muestra Mayor error Peor aprovechamiento de nutrientes Facilidad para subcultivar colonias incorporadas. Fcil visualizacin No se afectan las clulas termosensibles a ciertos microorganismos En aerobiosis slo crecen aerobios y anaerobios facultativos

NUMERO MAS PROBABLE o METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES

Se basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en funcin de que crezcan o de que produzcan determinada reaccin en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra. Se analizan en forma paralela por triplicado o quintuplicado porciones de la muestra cada vez menores que se dejan crecer en medio lquido. Por ejemplo se utilizan un total de nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra 0.1 g. de muestra, en tres 0,01 g. y en los otros tres 0.001 g. Luego de la incubacin, se observan y cuenta el nmero de tubos positivos. Segn el tipo de microorganismo que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivo, o medios de propagacin. En funcin de esto se pude considerar como positivos aquellos tubos en los que: a) hubo crecimiento b) hubo crecimiento y se produjo gas que se ve en campana invertida (Durham) c) hubo crecimiento y se produjo viraje de indicador d) hubo crecimiento y se produjo pigmento Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o sospechosos de serlo a placa, o a otro tubo a efectos de confirmarlo. El nmero (de tubos positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta de esta etapa de confirmacin, siendo el valor anterior slo un valor presuntivo. Cada tubo positivo, significa que en la cantidad de muestra en l sembrada haba por lo menos 1 microorganismo de los que se est contando. La interpretacin de los resultados, se hace en base a una distribucin de tipo Poisson, y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos. Ejemplo 1: N de tubos sembrados: Volumen de muestra en c/u (mL): Nmero de tubos positivos: siguientes) 5 5 10 1 2 0 5 0,1 0 (dos tubos positivos para la primera dilucin, ninguno en las

De la tabla adecuada surge el valor: 5 en 100 mL Se informa: Nmero ms probable de (tipo de microorganismo) = 5/100mL Ejemplo 2: N de tubos sembrados: Volumen por tubo (mL) Dilucin de la muestra: Equivalente en gramos/tubo Tubos positivos 3 1 10-2 0.01 3 3 3 1 1 10-3 10-4 0.001 0.0001 2 0

El resultado 3-2-0 se busca en tabla y se obtiene un valor de 93/gramo, cuando en la primer serie de tubos se siembra 0.1 g, como en nuestro caso sembramos 0.01 gramos debe aplicarse el factor de correccin = 0.1/0.01 o sea 10 por lo que el resultado a informar es: NMP de (tipo de microorganismo) = 930/gramo

Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que est construida para condiciones similares a las de trabajo, que sea para igual nmero de tubos por serie, y para cantidades de muestra que sean mltiplo o submltiplo. La correccin se hace utilizando proporcionalidad inversa. En todos los casos el valor informado se considera un ndice de la carga microbiana, y se conocen los lmites de confianza para cada valor. Ventajas y desventajas del mtodo: Este mtodo es especialmente til para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.

Asimismo, es el nico mtodo a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos insolubles, en los que no es aplicable el mtodo de filtracin ni recomendable el de placas debido a la presencia de partculas. Se prefiere tambin este mtodo cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.). Es posible enumerar tambin por este mtodo microorganismos anaerobios utilizando en los tubos medio prerreducido, que se tapan con vaselina-parafina luego de inocular, e incuban en condiciones aerobias.

FILTRACION POR MEMBRANA

Este mtodo consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra lquida, o solucin en agua o en solvente apropiado (miristato de isopropilo) a travs de un filtro de membrana estril (dimetro 50 mm, poro 0.45 mm), colocado en un equipo de filtracin. Luego de enjuagar con soluciones estriles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo a utilizar e incuba. Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiologa se emplean de nitrato o acetato de celulosa generalmente, y pueden tener bordes hidrofbicos, que minimizan la adsorcin de conservadores y antimicrobianos. Luego de transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se considera que las condiciones ptimas del mtodo se dan cuando desarrollan entre 20 y 200 colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para el conteo:

1)

Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retculo, o menos, se cuentan todas.

2) Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia, multiplicando por 100 para obtener el nmero de colonias en el filtro (se multiplica por 100 porque el area del cuadrado representa la centsima parte del rea total del filtro). 3) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 100. 4) Si hay ms de 20 se considera >2000 por filtro Toda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como ESTIMADO. Ventajas y desventajas: 1. Sirve para determinar cargas muy bajas, pues se puede filtrar volmenes de 100 y hasta 500 mL por vez. 2. Es adems el mtodo de eleccin para muestras lquidas o solubles que contienen agentes antimicrobianos, por cuanto no es necesario neutralizarlos. Expresin de los resultados: Una vez conocido el nmero de colonias por filtro, se expresa el valor en u.f.c. al igual que el recuento en placa expresndolo por gramo, o mililitro de muestra.