Está en la página 1de 354

VILNIAUS GEDIMINO TECHNIKOS UNIVERSITETAS Chemijos ir bioininerijos katedra

BIOININERIJA
LABORATORINIAI DARBAI IR PRATYBOS

752

Vilnius

2005

Bioininerija. Laboratoriniai darbai ir pratybos. Autori kolektyvas: . Bumelien, V. Chmieliauskait, R. Garuckas, G. Gedminien, J. Giedrien, R. Granien, A. Jakubauskas, J. Jankauskas, A. Juka, J. Kulys, B. Kurtinaitien, V. S. Laurinaviius, R. Marciauskas, M. Meizeraityt, V. Michailovien, J. Sereikait, G. Valinius, A. ilinskas, A. virblien, G. virblis. Vilnius: Technika, 2005. Pateikta laboratorini darb ir pratyb metodin mediaga. Leidin rekomendavo Vilniaus Gedimino technikos universiteto Fundamentini moksl fakulteto studij komitetas

Recenzentai: prof. habil. dr. A. Kazragis ir prof. dr. J. Kerien

VGTU leidyklos Technika 752 mokomosios metodins literatros knyga

ISBN 9986-05-829-5 . Bumelien, V. Chmieliauskait, R. Garuckas, G. Gedminien, J. Giedrien, R. Granien, A. Jakubauskas, J. Jankauskas, A. Juka, J. Kulys, B. Kurtinaitien, V. S. Laurinaviius, R. Marciauskas, M. Meizeraityt, V. Michailovien, J. Sereikait, G. Valinius, A. ilinskas, A. virblien, G. virblis, 2005 VGTU leidykla Technika, 2005

Bendroji chemija

Laboratoriniai darbai Juozas Jankauskas, Rta Granien

1. Laboratorini darb technika


iame darbe susipastama su pagrindinmis operacijomis, atliekamomis chemijos laboratorijoje: skysi tri matavimu, nusodinimu, filtravimu, titravimu. 1. Svrimas Chemijos laboratorijoje naudojamos vairaus tikslumo svarstykls: technins maiau tikslios, analitins bei elektronins tikslesns. Sveriant reikia laikytis i pagrindini taisykli: 1. Negalima perstatyti svarstykli i vienos vietos kit. Perstaius btina patikrinti, ar jos stovi lygiai. 2. Udti ir nuimti svarelius arba sveriam daikt galima tik ijungus svarstykles, velniai. 3. Sveriama mediaga dedama ant kairs lktels, o svareliai ant deins. 4. Svareliai dedami ant lktels tik pincetu majania tvarka. 5. Birios mediagos sveriamos i anksto pasvertuose induose arba ant varaus popieriaus. 6. Baigus sverti, svarstykls ir svareliai sutvarkomi: nuvalomos svarstykli lktels, svareliai pincetu nuimami ir sudedami dut. 7. Nededamas ant lktels svoris, didesnis u nurodyt ant svarstykli. 2. Skysi trio matavimas Skysi triai matuojami vairiais matavimo indais: apytikriai matuojama matavimo cilindrais bei menzromis, tiksliai vairios talpos matavimo kolbomis, pipetmis, biuretmis. Matavimo induose, ypa siauruose, skysio pavirius yra gaubtas, jo auktis nustatomas pagal emiausi menisko lyg viename lygyje su akimi. Naudojami tik vars matavimo indai. Tirpal pamatavus, indai gerai iplaunami ir padedami j viet. Matavimo ind negalima ildyti, pilti juos kart tirpal ir atlikti juose chemini reakcij. Skysiams matuoti galima naudoti tik tuos indus, kurie nurodyti darbo aprayme. Matavimo cilindrai ir menzros naudojami apytikriam skysio triui matuoti. Matavimo kolbos skirtos tiksliam tirpalo triui matuoti, tirpalams iki tam tikro trio praskiesti bei jiems gaminti. Matavimo kolbos yra vairaus trio; jis ymimas ant kolbos ono arba kaklelio. Ilgas, siauras kolbos kaklelis yra su brkneliu; iki jo kolba pripilama skysio (menisko apaia ant brknio). Gaminant arba skiediant tirpalus, paskutiniai laai iki pat brknio lainami pipete, o tada tirpalas gerai sumaiomas. Pipets naudojamos tiksliam skysi triui matuoti; jis gali bti vairus nuo 0,1 iki 100 mL ir ymimas viruje arba ant praplatintos pipets dalies. Ant pipets kaklelio yra brknelis, iki kurio pipet pripildoma tirpalo taip: ji giliai merkiama tirpal ir tirpalas lpomis arba gumine kriaue siurbiamas vir brknelio. Tada pipet uspaudiama smiliumi (ne nykiu!), itraukiama i tirpalo ir priglaudiama prie indo sienels. Atsargiai atleidiant pirt, skysio lygis pipetje nuleidiamas iki brknio (menisko 1 pav. Trio matavimas pipete apaia ant brknio, 1 pav.). Uspausta pirtu pipet perkeliama reikiam ind, pirtas atleidiamas, pipets galas priglaudiamas

prie indo sienels ir skysiui leidiama itekti. Negalima ipsti i pipets skysio likui. Naudota pipet iplaunama ir padedama viet. Naudojamos ir graduotos pipets, kuriomis galima pamatuoti vair ant j paymt tr. Automatins pipets skirtos tiksliam skysi trio matavimui. Jos bna vairios pastovaus ir keiiamo trio, nuo 1 L iki 10 mL. Keiiamo trio pipetse tris reguliuojamas sukant operacin mygtuk pagal laikrodio rodykl, norint sumainti tr, arba prie laikrodio rodykl, norint padidinti tr, kol indikatoriaus langelyje atsiras reikalingi skaiiai. Grietai draudiama nustatyti matuojam tr u matavimo rib, nes galima sugadinti pipet, ji gali prarasti tikslum (matavim ribos yra nurodytos ant pipets rankenos). Pipet privaloma laikyti tik vertikaliai, kad skystis nepatekt mechanizm. Atrama (kablys) turi gulti ant smiliaus, mygtukas spaudiamas nykiu. Dirbama su pipete taip: umaunamas 2 pav. Trio matavimas automatine pipete antgalis, operacinis mygtukas spaudiamas iki pirmo atsirmimo (2 pav. 1 padtis), antgalis panardinamas skyst, mygtukas velniai ir ltai atleidiamas (2 pav. 2 padtis), palaukiama, kol skysio prisipildo antgalis, antgalis itraukiamas i skysio, atsargiai nubraukiamas skysio perteklius indo sieneles, skystis ileidiamas lengvai spaudiant mygtuk iki pirmo atsirmimo, prajus 1 sekundei mygtukas spaudiamas iki galo norint paalinti i antgalio vis skyst (2 pav. 3 pozicija). Baigus darb antgalis nuimamas nuo pipets stmokliu ir kruopiai iplaunamas. Pipet pastatoma special stov. Biurets skirtos tiksliam skysi trio matavimui. Tai yra ilgas plonas stiklinis vamzdelis, sugraduotas deimtsias mililitro dalis, kurio gale yra kranelis arba arnel su stikliniu burbuliuku arba spaustuku ir stiklinis antgalis. Biuret pripildoma skysio per piltuvl taip, kad stikliniame antgalyje nelikt oro burbul. Prie pradedant dirbti piltuvlis btinai iimamas, nes nuo jo sieneli nuvarvjusio skysio laai sumaina matavimo tikslum. 3. Titravimas Titravimas tai inomos koncentracijos tirpalo (titranto, darbinio tirpalo) pilimas i biurets analizuojam tirpal, kol pasiekiamas ekvivalentinis takas. Taip yra nustatoma analizuojamo tirpalo koncentracija. Prie titruojant biuret pripildoma inomos koncentracijos (N1) tirpalo iki nulins padalos taip, kad jos apatiniame gale nebt oro burbuliuk; piltuvlis iimamas. kgin kolbut pilamas tiksliai pipete pamatuotas neinomos koncentracijos (N) tirpalo tris (V), lainami keli indikatoriaus laai, iskyrus tuos atvejus, kai vienas i paimt tirpal pats yra indikatorius. Viena ranka kolbut laikoma u kaklelio ir sukama taip, kad joje esantis skystis nuolat maiytsi (biurets galas yra kolbuts kaklelyje, bet neturi liesti sieneli), kita ranka atsargiai atleidiamas spaustukas. I pradi tirpalas i biurets pilamas plona iurkle nuolat maiant tirpal, paskui darbinis tirpalas pilamas vis liau ir, baigiant titruoti, laais. Titravimo rezultatai bus teisingi, jeigu titravimo pabaigoje nuo vieno lao darbinio tirpalo staiga pasikeis titruojamojo tirpalo spalva. Kad tirpalo spalvos pasikeitimas bt geriau matomas, titruojant naudojamas baltas fonas (balta koklin ploktel arba popieriaus lapas). Pagal biuretje likusio tirpalo lyg randamas titravimui sunaudoto titranto tris (V1, 3 pav.). Kiekvienas tirpalas titruojamas ne maiau kaip du, tris kartus; titravimo rezultatai vienas nuo kito turi skirtis ne daugiau kaip 0,1 mL. Kiekvien kart, baigus titruoti, atskaitoma biurets skalje, kiek sunaudota darbinio tirpalo; rezultatai uraomi. Pirmas titravimas yra orientacinis. Titruojant pirm kart, darbinio tirpalo i biurets rekomenduojama pilti kiekvien kart po 1 mL, kad bt galima nustatyti interval, kurio ribose yra 3 pav. Trio matavimas ekvivalentinis takas. Pvz., jeigu pridjus titruojam tirpal 15 mL titranto, indikatoriaus spalva nesikeiia, o pridjus 16 mL tirpalo, spalva staiga pasikeiia, tai reikia, kad ekvivalentinis takas yra intervale nuo 15 iki 16 mL. Titruojant nauj porcij analizuojamo tirpalo, 15 mL

darbinio tirpalo supilami gana greitai, kolbos turin gerai maiant, o toliau titrantas lainamas jau laais, kol pasikeiia indikatoriaus spalva. Kad bt patogu stebti spalvos pasikeitim, prie pradedant titruoti rekomenduojama i karto kelias kolbutes sipilti analizuojamojo tirpalo ir indikatoriaus vienodus kiekius ir titravimo metu lyginti titruojamojo ir netitruoto tirpal spalvas. Norint sitikinti, ar teisingai atliktas titravimas, nutitruot skyst lainamas analizuojamojo tirpalo laas. Tirpalo spalva turi staiga pasikeisti. Analizuojamo tirpalo koncentracija skaiiuojama naudojant darbinio tirpalo trio vidurk pagal formul: NV = N1V1, ia: N analizuojamojo tirpalo neinoma molin ekvivalent koncentracija (normalingumas), V titravimui paimtos analizuojamojo tirpalo porcijos tris, mL, N1 darbinio tirpalo inomas normalingumas, V1 titravimui sunaudoto darbinio tirpalo vidurkis, mL. 4. Filtravimas Filtravimas yra kietj daleli atskyrimas filtru i skystosios arba dujins terps. Filtravimui reikia turti piltuvl, filtravimo popieriaus ir stiklin lazdel. Ruoiant filtr, filtravimo popierius sulenkiamas du kartus, praskleidiamas taip, kad vienoje pusje likt trys popieriaus lapeliai, t. y. padaromas maielis. Filtras statomas piltuvl. Filtro kratai turi bti madaug 5 mm emiau piltuvlio krato. Jeigu filtras yra didesnis, j reikia apkirpti. Filtras sudrkinamas distiliuotu vandeniu ir prispaudiamas prie piltuvlio sieneli. Filtruojamas skystis kartu su nuosdomis per stiklin lazdel pilamas ant filtro. Skysio pilama tiek, kad jo lygis bt 23 mm emiau filtro krat. Ant stiklinje likusi nuosd upilama truputis distiliuoto vandens. Skystis su nuosdomis vl pilamas ant filtro. i operacija kartojama tol, kol visos nuosdos i stiklins supilamos ant filtro. Skystis, prajs pro filtr, vadinamas filtratu. Jeigu nuosdas reikia praplauti, tai plovimo skystis (distiliuotas vanduo arba nurodytas tirpalas) pilamas porcijomis ant filtro. Kiekviena kita skysio porcija pilama tik tada, kai ankstesnioji bna visikai persifiltravusi. Darbo tikslas Susipainti su daniausiai chemijos laboratorijoje naudojamomis operacijomis ir imokti jas. Darbo priemons ir reagentai Stiklin, pipet, kgins kolbuts, matavimo kolbut, biuret, piltuvas, filtro popierius, stiklin lazdel. Tirpalai: NaOH 1 N; druskos (CuSO4, CoCl2, NiCl2) 1 N; HCl 0,1 N; metiloranas. Darbo eiga Pipete pamatuojama 10 mL 1 N metalo druskos (CuSO4, CoCl2 arba NiCl2), supilama stiklin ir pilama 20 mL pipete pamatuoto 1 N NaOH tirpalo (imamas NaOH perteklius). Tirpalas sumaiomas ir filtruojamas 100 mL matavimo kolbut. Nuosdos ant filtro perplaunamos distiliuotu vandeniu, ir filtratas surenkamas t pai matavimo kolbut. Baigus plauti nuosdas, jos imetamos, o filtratas praskiediamas distiliuotu vandeniu iki brknio ir gerai sumaiomas. Iplauta pipete, skirta NaOH matuoti, pamatuojama 10 mL gauto tirpalo, supilama kgin kolbut, lainama 12 laai indikatoriaus metilorano ir titruojama 0,1 HCl tirpalu. Titravimas kartojamas 3 kartus. Titravimo duomenys suraomi lentel: Titravimas 1 2 3 Titruoti paimto tiriamo tirpalo tris, mL 10 10 10 Titravimui sunaudotos HCl tris, mL Vidutinis titravimui suvartotos rgties tris, mL

Skaiiavimai 1. Nesureagavusio armo tirpalo koncentracija skaiiuojama pagal formul: NV = N1V1, ia: N armo molin ekvivalent koncentracija (normalingumas), V titravimui paimto armo tris, mL, N1 rgties normalingumas, V1 titravimui suvartotos rgties tris, mL. 2. Nesureagavusio armo kiekis gramais 100 mL praskiesto filtrato:
m2 =
E N V , 1000

(1)

(2)

ia: V tirpalo tris, iki kurio buvo praskiestas filtratas, t. y. V = 100 mL, E armo ekvivalento mas, N armo normalingumas (normalin koncentracija). 3. Naudojantis (2) formule, apskaiiuojamas metalo druskos ir armo reakcijai paimto natrio hidroksido kiekis gramais m1 (V = 20 mL, N = 1). 4. Druskos ir natrio armo reakcijai sunaudoto armo kiekis gramais:
m3 = m1 m2.

(3)

5. Paraoma druskos reakcija su armu ir, inant sureagavusio natrio armo kiek, m3, apskaiiuojamas susidariusio metalo hidroksido, t. y. nuosd, kiekis gramais. Atsiskaitymas pateikiama upildyta lentel; pateikiami skaiiavimai.

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Janickis, V.; Kreivnien, N. Neorganins chemijos teoriniai pagrindai, praktikos darbai ir udaviniai. Kaunas: Technologija, 2004. 339 p.

2. Tirpal ruoimas
Laboratorijose daniausiai naudojami procentiniai, moliniai ir normaliniai vairi mediag tirpalai. Moliniai ir normaliniai tirpalai ruoiami tik matavimo kolbose. Procentiniai tirpalai gali bti ruoiami bet kokiuose induose: stiklinse, kginse kolbose ir panaiai. Praktinio darbo skm laboratorijoje nemaai priklauso nuo to, kaip tiksliai paruoiami darbui reikalingi tirpalai. Darbo tikslas Imokyti studentus gerai skaiiuoti ir teisingai paruoti reikiamos koncentracijos tirpalus, taip pat imokyti juos patikrinti jau paruot tirpal koncentracijas. Tobulinti svarstykli, skysi trio matavimo priemoni (automatini pipei, biurei) naudojimo gdius. Supaindinti su skysi tankio nustatymo bdais bei priemonmis. Darbo priemons bei mediagos Elektronins svarstykls, skiriamoji geba 0,01 g. Automatins 5 ir 10 mL trio pipets. 25 mL trio biurets. 200250 mL trio stiklins. Cilindras. 100150 mL trio kgins (Erlenmejerio) kolbuts. Termometras. Areometras. Elektrin plytel. Koncentruota H2SO4, KOH, sausa mediaga. H2SO4 ir KOH 0,500 N tirpalai. Metiloranas, 0,1 % tirpalas. Darbo eiga Studentai apskaiiuoja ir pagamina 100150 gram H2SO4 arba KOH 18 % tirpal (tiksli ruoiamo tirpalo koncentracij ir mas nurodo dstytojas). Ruoiant H2SO4 tirpal, rgt reikia pilti vanden, bet ne atvirkiai. Ruoiant tirpalus tirpinys ir tirpiklis sveriami svarstyklmis. Kadangi tiksliai pasverti apskaiiuot tirpiklio ir tirpinio kiek yra sunku, todl labai svarbu usirayti realiai pasvertas tirpinio ir tirpiklio mases. inant ias mases, patikslinama paruoto tirpalo procentin koncentracija. Kitas darbo etapas yra paruoto tirpalo procentins koncentracijos patikrinimas. Patikrinim galima atlikti dviem bdais: a) surandamas paruoto tirpalo tankis () ir koncentracija nustatoma naudojantis tanki ir koncentracijos lentele; b) nutitruojamas tiksliai paimtas paruoto tirpalo tris (pvz., 10 mL su 0,5 N sieros rgties arba 0,5 N kalio armo tirpalu. Procentin koncentracija apskaiiuojama remiantis titravimo rezultatais ir a bdu nustatytu tirpalo tankiu. a) bdas: ia pateikiama kalio armo tirpalo tankio nustatymo eiga (sieros rgties tirpalo tankis nustatomas analogikai). Ant elektronini svarstykli pastatoma tuia sausa 100150 mL kgin kolbut arba stiklinl, palaukiama, kol svarstykli rodmenys taps stabils ir spaudiamas TARE mygtukas. Svarstykli ekrane matysite 0,00 g. Automatine pipete pamatuojama 10 mL paruoto tirpalo ir supilama ant svarstykli stovini kgin kolbut (Dmesio! Tirpalas turi bti 20 1 C temperatros, jo temperatra patikrinama termometru.) Uraoma 10 mL tirpalo mas. Vl spaudiamas TARE mygtukas. Svarstykli ekrane matysite 0,00 g. Trio matavimas ir svrimas kartojamas tris kartus. Rezultatai suraomi lentel. Tirpalo tris V, mL 10,0 10,0 10,0 Vidutinis tirpalo tankis , g/mL = mvid./V Tirpalo konc. pagal 1 lentel, %

Svrimas 1 2 3

Tirpalo mas m, g m1 m2 m3

Norint apskaiiuoti paruoto tirpalo tank, pirmiausia surandama trij svrim vidutin mas mvid., kuri dalijama i svrimui paimto tirpalo trio V(10 mL).
mvid . =
=

m1 + m2 + m3 , 3

mvid . . V

Apskaiiavus tirpalo tank, i 1 lentels surandama tirpalo procentin koncentracija. Jeigu apskaiiuotos vidutinio tirpalo tankio reikms ir j atitinkanios procentins koncentracijos lentelje nra, reikia perskaiiuoti. Pavyzdiui, surastas vidutinis tirpalo tankis = 1,033 g/mL. 1 lentelje tokios tankio reikms ir j atitinkanios koncentracijos nra. Lentelje yra tankis 1,030 g/mL (3,48 %) ir kitas tankis 1,040 g/mL (4,58 %). iuo atveju reikia apskaiiuoti procentin koncentracij maesnio bei didesnio tankio atvilgiu ir imti vidutin koncentracij:
1,030 g/mL 3,48 % 1,033 g/mL X1 %
1,033 3,48 = 3,49 % 1,030 1,040 g/mL 4,58 % 1,033 g/mL X2 % 1,033 4 ,58 X2 = = 4 ,55 % 1,040 X1 =

X vid . =

X 1 + X 2 3,49 + 4 ,55 = = 4 ,02 % 2 2

b) bdas: iuo bdu randama paruoto tirpalo procentin koncentracija, remiantis titravimo rezultatais. Tam tikslui automatine pipete pamatuojama 10 mL (V mL) paruoto KOH tirpalo, supilama kgin kolbut, lainami 34 laai 0,1 % indikatoriaus metilorano tirpalo ir titruojama 0,5 N HCl arba H2SO4 tirpalu, kol geltona tirpalo spalva nuo 1 titranto lao pereina oranin (apelsino spalv). Uraomas titruoti sunaudotas rgties tris (V1 mL). Titravimas pakartojamas pamus nauj KOH 10 mL porcij. Jeigu dviej titravim rezultatai skiriasi ne daugiau kaip 0,1 mL, trei kart titruoti nereikia. Randamas dviej titravim vidurkis (V1 vid.). Titravimo rezultatai suraomi lentel. Eil. Nr. 1 2 Skaiiavimai 1. Pirmiausia apskaiiuojama KOH tirpalo normalin koncentracija N1 (ekv/L) pagal formul:
V N = V1vid. N1,

Titravimui paimto KOH tirpalo tris (V), mL 10,0 10,0

Titravimui suvartotas 0,5 N rgties tris (V1), mL

Vidutinis 0,5 N rgties tris (V1 vid.), mL

V titravimui paimtas KOH tirpalo tris, mL; N KOH tirpalo normalin koncentracija, ekv/L (iekoma); V1vid vidutinis titravimui sunaudotas 0,5 N rgties tris, mL; N1 rgties (titranto) normalin koncentracija, ekv/L.

2. inant KOH tirpalo normalin koncentracij, galima apskaiiuoti jo mas (m, g) 10-tyje mL(0,01 l) tirpalo:
m (g) = E N 0,01.

3. Apskaiiuojama procentin KOH tirpalo koncentracija (C%) panaudojus svorio bdu surast io tirpalo tank: 10 gram tirpalo m gram KOH 100 gram tirpalo x gram KOH (C%) 4. Apskaiiuojama absoliuti ir santykin paruoto ir pagal tank i lentels surasto procentinio tirpalo paklaida, laikant, kad teisinga yra titravimo bdu nustatyta koncentracija. Ruoiant sieros rgties tirpalus ir tikrinant paruot tirpal koncentracijas daroma tas pats, tik titruojama 0,5 N KOH arba NaOH tirpalu. Be to, gavus dstytojo uduot naudojant tinkamo aukio matavimo cilindr ir areometr (densimetr), surandamas koncentruotos H2SO4 tankis. is tankis toliau naudojamas atliekant reikalingus skaiiavimus. Atsiskaitymas apraomas atliktas darbas, upildomos visos lentels; apskaiiuojamos paklaidos.

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Petrucci, R. H.; Harwood, W. S. Bendroji chemija. Vilnius: Tverm, 2000. 298 p. 3. Korosteliovas, P. Tirpal ruoimas analizins chemijos darbams. Vilnius: Mintis, 1969. 383 p.
1 lentel. Kalio armo vandenini tirpal tankis ir koncentracija esant 20 C temperatrai (KOH, M = 40,01 g/mol)

Tankis, g/cm3 1,000 1,010 1,020 1,030 1,040 1,050 1,060 1,070 1,080 1,090 1,100

KOH, % 0,197 1,295 2,38 3,48 4,58 5,56 6,74 7,82 8,89 9,96 11,03

Tankis, g/cm3 1,110 1,120 1,130 1,140 1,150 1,160 1,170 1,180 1,190 1,200 1,210

KOH, % 12,08 13,14 14,19 15,22 16,26 17,29 18,32 19,35 20,37 21,38 22,38

Tankis, g/cm3 1,220 1,230 1,240 1,250 1,260 1,270 1,280 1,290 1,300 1,310 1,320

KOH, % 23,38 24,37 25,36 26,34 27,32 28,29 29,25 30,21 31,15 32,09 33,03

Tankis, g/cm3 1,330 1,340 1,350 1,360 1,370 1,380 1,390 1,400 1,410 1,420 1,430

KOH, % 33,97 34,90 35,82 36,735 37,65 38,56 39,46 40,37 41,26 42,155 43,04

Tankis, g/cm3 1,440 1,450 1,460 1,470 1,480 1,490 1,500 1,510 1,520 1,530

KOH, % 43,92 44,79 45,66 46,53 47,39 48,25 49,10 49,95 50,80 51,64

2 lentel. Vandenini sieros rgties tirpal tankis ir koncentracija (20 C)

Tankis, g/cm3 1,000 1,005 1,010 1,015 1,020 1,025 1,030 1,035 1,040 1,045 1,050 1,055 1,060 1,065 1,070 1,075 1,080 1,085 1,090 1,095 1,100 1,105 1,110 1,115 1,120 1,125 1,130 1,135 1,140 1,145 1,150 1,155 1,160 1,165 1,170 1,175

H2SO4, % 0,2609 0,9855 1,731 2,485 3,242 4,000 4,746 5,493 6,237 6,956 7,704 8,415 9,129 9,843 10,56 11,26 11,96 12,66 13,36 14,04 14,73 15,41 16,08 16,76 17,43 18,09 18,76 19,42 20,08 20,73 21,38 22,03 22,67 23,31 23,95 24,58

Tankis, g/cm3 1,180 1,185 1,190 1,195 1,200 1,205 1,210 1,215 1,220 1,225 1,230 1,235 1,240 1,245 1,250 1,255 1,260 1,265 1,270 1,275 1,280 1,285 1,290 1,295 1,300 1,305 1,310 1,315 1,320 1,325 1,330 1,335 1,340 1,345 1,350 1,355

H2SO4, % 25,21 25,84 26,47 27,10 27,72 28,33 28,95 29,57 30,18 30,79 31,40 32,01 32,61 33,22 33,82 34,42 35,01 35,60 36,19 36,78 37,36 37,95 38,53 39,10 39,68 40,25 40,82 41,39 41,95 42,51 43,07 43,62 44,17 44,72 45,26 45,80

Tankis, g/cm3 1,360 1,365 1,370 1,375 1,380 1,385 1,390 1,395 1,400 1,405 1,410 1,415 1,420 1,425 1,430 1,435 1,440 1,445 1,450 1,455 1,460 1,465 1,470 1,475 1,480 1,485 1,490 1,495 1,500 1,505 1,510 1,515 1,520 1,525 1,530 1,535

H2SO4, % 46,33 46,86 47,39 47,92 48,45 48,97 49,48 49,99 50,50 51,01 51,52 52,02 52,51 53,01 53,50 54,00 54,49 54,97 55,45 55,93 56,41 56,89 57,36 57,84 58,31 58,78 59,24 59,70 60,17 60,62 61,08 61,54 62,00 62,45 62,91 63,36

Tankis, g/cm3 1,540 1,545 1,550 1,555 1,560 1,565 1,570 1,575 1,580 1,585 1,590 1,595 1,600 1,605 1,610 1,615 1,620 1,625 1,630 1,635 1,640 1,645 1,650 1,655 1,660 1,665 1,670 1,675 1,680 1,685 1,690 1,695 1,700 1,705 1,710 1,715

H2SO4, % 63,81 64,26 64,71 65,15 65,59 66,03 66,47 66,91 67,35 67,79 68,23 68,66 69,09 69,53 69,96 70,39 70,82 71,25 71,67 72,09 72,52 72,95 73,37 73,80 74,22 74,64 75,07 75,49 75,92 76,34 76,77 77,20 77,63 78,06 78,49 78,93

Tankis, g/cm3 1,720 1,725 1,730 1,735 1,740 1,745 1,750 1,755 1,760 1,765 1,770 1,775 1,780 1,785 1,790 1,795 1,800 1,805 1,810 1,815 1,820 1,821 1,822 1,825 1,827 1,830 1,831 1,832 1,833 1,834 1,835 1,8355 1,8364 1,8361 1,8342 1,8305

H2SO4, % 79,37 79,81 80,25 80,70 81,16 81,62 82,09 82,57 83,06 83,57 84,08 84,61 85,16 85,74 86,35 86,99 87,69 88,43 89,23 90,12 91,11 91,33 91,56 92,2 92,8 93,6 93,94 94,32 94,72 95,12 95,72 96,0 97,0 98,0 99,0 100,0

3. Buferiniai tirpalai
Darbo tikslas Imokyti studentus apskaiiuoti ir paruoti norimos pH reikms buferin tirpal ir nustatyti jo buferin talp. Trumpa teorin dalis Buferiniai tirpalai tai tirpalai, kuriuose yra tam tikra vandenilio jon koncentracija (pH), kuri tik nedaug keiiasi skiediant tirpalus arba pridedant juos nedidel kiek stiprios rgties arba bazs. Klasikiniai buferiniai tirpalai gaminami i silpnos rgties ir jos druskos arba silpnos bazs ir jos druskos, pvz., CH3COOH + CH3COONa arba NH4OH + NH4Cl. I silpnos rgties ir jos druskos pagamintuose buferiniuose tirpaluose vandenilio jon koncentracija gali bti apskaiiuota taip:
C H = K rgties
+

C rgties C druskos

(1)

I silpnos bazs ir jos druskos pagamintuose buferiniuose tirpaluose vandenilio jon koncentracija gali bti apskaiiuota taip:
CH =
+

KH O
2

K bazs

C druskos , C bazs

(2)

ia:
Krgties ir Kbazs silpnos rgties ir silpnos bazs disociacijos konstantos (acto rgties ir amonio
KH O
2

hidroksido disociacijos konstantos yra vienodos ir lygios 1,85 105), vandens jonin sandauga (1 1014),

C rgties, bazs ar druskos molin (mol/L) koncentracija. inant vandenilio jon koncentracij, pH apskaiiuojamas taip:
pH = lg CH+.

(3)

Jeigu reikia pagaminti emos pH reikms buferin tirpal, reikia imti rgt, kurios K yra didel. Vidutini pH reikmi buferiniams tirpalams gaminti naudojamos rgtys, kuri K yra maa. Buferiniams tirpalams, kuri pH reikms yra didels, gaminti naudojami bazi ir j drusk miiniai. Buferinius tirpalus galima taip pat pagaminti i daugiavandenilini rgi drusk miini, pvz., NaH2PO4 + Na2HPO4. Skiediant buferinius tirpalus, j pH keiiasi labai nedaug, pvz., CH3COOH + CH3COONa buferinio tirpalo pH, keiiantis rgties ir druskos koncentracijoms (abiej komponent koncentracijos vienodos), keiiasi taip: Normalin koncentracija pH 0,1 4,63 0,01 4,67 0,001 4,73

Taip pat skiediant HCl, pH keiiasi nuo 1 iki 3, o CH3COOH nuo 2,86 iki 3,86. Svarbi bet kurio tirpalo charakteristika yra jo buferin talpa (BT). Buferin talpa (BT) tai stiprios rgties ar stiprios bazs gramekvivalent skaiius, kur galima pridti 1 litr buferino tirpalo, kol jo pH pasikeiia per 1 pH vienet (grekv/L arba mgekv/mL, grekv/L = mgekv/mL). Buferin talpa praktikai nustatoma titruojant tam tikr buferinio tirpalo tr su inomos koncentracijos stiprios rgties (HCl, H2SO4) arba stiprios bazs (KOH, NaOH) tirpalu tol, kol pH pasikeiia per 1 pH vienet. Titravimo metu pH pasikeitimas stebimas naudojant pH-metr (potenciometrinis titravimas).

10

Darbo priemons ir reagentai pH-metras, magnetin maiykl, svarstykls, pipets, biuret, 50 mL stiklinl, 250 mL matavimo kolba, 0,1 N HCl ir 0,1 N NaOH tirpalai, ledin CH3COOH ir CH3COONa arba NH4OH ir NH4Cl. Darbo eiga a) Buferinio tirpalo ruoimas Dstytojui nurodius buferinio tirpalo tip (amoniakinis, acetatinis) ir pH reikm, pirmiausia atliekami skaiiavimai (silpnos rgties, silpnos bazs ir j drusk koncentracijos turt svyruoti 0,05 0,1 M intervale). Skaiiavimo pavyzdys. Reikia paruoti 250 mL acetatinio buferinio tirpalo, kuriame acto rgties koncentracija yra 0,07 M ir kurio pH reikm yra 4,5. 1. Surandama vandenilio jon koncentracija tokiame tirpale: CH+ = 10pH = 104,5 = 3,16 105 mol/L. 2. inant vandenilio jon koncentracij tirpale i (1) surandama reikalinga natrio acetato molin koncentracija:
Cdruskos = K rgties Crgties CH
+

= 1,85 10 5

0 ,07 3,16 10 5

= 0,041 mol/L.

3. Apskaiiuojamos CH3COOH ir CH3COONa mass, reikalingos 250 mL tirpalo paruoimui pagal formul:
m = M CM V (litrais).

Dstytojui patikrinus skaiiavimus, paruoiama 250 mL buferinio tirpalo. 250 mL matavimo kolb pilama 1020 mL distiliuoto vandens, ji statoma ant svarstykli, palaukiama kol stabilizuojasi svarstykli rodmenys ir atliekama taravimo funkcija. Naudojant pipet, pasveriama paskaiiuota acto rgties mas. Matavimo kolba nuimama nuo svarstykli ir atskirai pasveriamas reikalingas CH3COONa kiekis, kuris suberiamas t pai matavimo kolb. Kolba iki puss trio pripilama distiliuoto vandens ir maioma tol, kol druska itirpsta. Tirpalas praskiediamas vandeniu iki brknio ir gerai sumaiomas. Naudojantis pH-metru, imatuojama paruoto buferinio tirpalo praktin pH reikm (r. pH-metro naudojimo instrukcij), kuri palyginama su teorine.

b) Buferinio tirpalo buferins talpos nustatymas Pipete pamatuojama 20 mL paruoto buferinio tirpalo ir supilama 50 mL stiklinl. Stiklinl pastatoma ant magnetins maiykls, tirpal merkiami elektrodai (kombinuotas elektrodas) ir maiant tirpal jis titruojamas 0,1 N rgties tirpalu tol, kol jo pH reikm pasikeiia per 1 pH vienet. Po kiekvienos titranto porcijos pridjimo laukiama, kol stabilizuojasi pH rodmenys. Uraomas titranto tris (V1). Buferin talpa (BT) apskaiiuojama taip:
BT(grekv/L) =
V1N , V

ia:
V1 titravimui sunaudotas stiprios rgties tris, mL, N stiprios rgties molin ekvivalent koncentracija (normalingumas), V titravimui paimtas buferinio tirpalo tris, mL.

Tokiu pat bdu atliekamas 20 mL buferinio tirpalo titravimas su 0,1 N armo tirpalu ir naudojantis ta paia formule vl apskaiiuojama buferin talpa.

11

Atsiskaitymas buferinio tirpalo receptros skaiiavimai; buferins talpos reikms pagal rgt ir pagal arm.

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganins chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p. 3. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius, Mokslas, 1991. 374 p.

12

4. Kompleksiniai junginiai
Kompleksiniais junginiais vadinami tokie junginiai, kuriuos eina daugiau ar maiau patvars sudtingi (kompleksiniai) jonai ar molekuls, galintys egzistuoti tiek tirpalo, tiek kristal pavidalu. Kompleksiniai junginiai gaunami jungiantis neutralioms molekulms, pvz.: NH3 + HCl [NH4]Cl, CuCl2 + 4 NH3 [Cu(NH3)4]Cl2. Kompleksiniai junginiai gali turti: 1) kompleksin katijon, pvz.: [Co(NH3)6]Cl3, 2) kompleksin anijon, pvz.: Na3[Co(NO2)6], 3) kompleksin katijon ir anijon, pvz.: [Ni(NH3)6]2[Fe(CN)6], 4) kompleks neelektrolit, pvz.: [Co(NH3)3(NO2)3], [Pt(NH3)2Cl4]. Kompleksini jungini sandar aikina koordinacin teorija. Pagal j kompleksinis junginys sudarytas i vidins ir iorins koordinacini sfer. Komplekso vidin koordinacin sfera susideda i kompleksadario ir ligand. Formulse vidin komplekso sfera ymima lautiniais skliausteliais. Kompleksini jungini kompleksadaris uima centrin viet. Kompleksadariu bna: 1) metal jonai, pvz.: Ag+, Cu2+, Co3+, Ni2+, Fe2+, Pt4+ ir kt., 2) metal, priklausani d elementams, neutrals atomai, pvz.: Cr, Mn, Fe, Re, Mo, 3) nemetal jonai, pvz.: B3+, N3+, Si4+, P5+,S6+. Ligandai (adendai) isidsto aplink kompleksadar. Ligandais bna: 1) neigiamieji jonai, pvz.: OH, Cl, F, NO2, CN, CO22 ir kt., 2) polins molekuls, pvz.: H2O, NH3, NO, CO, PH3 ir kt., 3) linkusios poliarizuotis molekuls, pvz.: (CH2)2(NH2)2 etilendiaminas ir kt. Koordinacinis skaiius tai skaiius, rodantis, kiek ligand susijung su kompleksadariu. inomi vairs koordinaciniai skaiiai: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12. Daniausiai pasikartoja ie: 6 Co2+, Co3+, Fe2+, Fe3+, Pt4+, Ni2+, Cr3+ jonams, 4 Cu2+, Pt2+, Zn2+, Hg2+, Au3+, Cd2+ jonams. Koordinacinis skaiius visada didesnis u kompleksadario valentingum. Komplekso iorin koordinacin sfer sudaro jonai, esantys toliau nuo kompleksadario. Formulse tai jonai, esantys u lautini skliaust. Pvz., junginio K4[Fe(CN)6]: 1) komplekso vidin koordinacin sfera [Fe(CN)6]4, 2) kompleksadarys Fe2+, 3) ligandai (adendai) CN, 4) koordinacinis skaiius 6, 5) komplekso iorin koordinacin sfera 4K+. inant koordinacins teorijos pagrindinius teiginius, galima sudaryti kompleksini jungini formules. 1 pavyzdys. Sudaryti kompleksin jungin i CrCl3, KCl, 2NH3. Chromo koordinacinis skaiius lygus 6. K[CrCl4(NH3)2]. 2 pavyzdys. Parayti kompleksinio junginio [Ni(NH3)6]SO4 susidarymo reakcij. NiSO4 + 6NH3 [Ni(NH3)6]SO4.

13

Kompleksini jungini grupei priskiriamos dvigubos druskos, pvz., KAl(SO4)2, ir kristalohidratai, pvz., CuSO4 5H2O. Dvigubos druskos yra labai nepatvars kompleksiniai junginiai. Pagrindinis skirtumas tarp dvigub ir kompleksini drusk yra tas, kad dvigubos druskos vandenyje disocijuoja visus jas sudaranius jonus. Pvz.: KAl(SO4)2 K+ + Al3+ + 2SO42. Kompleksiniai junginiai vandenyje disocijuoja kompleksin jon ir jonus, esanius iorinje koordinacinje sferoje. Pvz.: K3[Fe(CN)6] 3K+ + [Fe(CN)6]3, [Ag(NH3)2]Cl [Ag(NH3)2]+ + Cl. Tirpal skiediant vandeniu, kompleksini jungini disociacijos laipsnis didja. Kompleksinio jono ir kompleksadario krvio skaiiavimas Kompleksinio jono krvis lygus kompleksadario ir ligand krvi algebrinei sumai. Pvz.: [Cu(NH3)4]2+, +2+0=+2. [BF4]1, +3+(4)=1. [PtCl4(NH3)2]0, +4+(4)+0=0. (1) (2)

Apie kompleksinio jono krv galima sprsti i iorinje koordinacinje sferoje esani jon krvi (r. 1 ir 2 reakcij lygtis). Kompleksadario krvis skaiiuojamas pagal bendr taisykl: jungin sudarani element krvi algebrin suma turi bti lygi nuliui. Pvz.:
+1+x+0+(4)=0, x = 4 1 =3.

K[Co(NH3)2(NO2)4],

Kompleksinio junginio pavadinimas Kompleksadario prijugt adend skaiiui ir iorinje koordinacinje sferoje esani jon skaiiui rasti vartojami graikiki skaii pavadinimai (mono, di, tri, tetra, penta ir kt.). Kompleksadario krvis ymimas romniku skaiiumi skliausteliuose (kompleksiniame katijone po kompleksadario, kompleksiniame anijone prie kompleksadar). Jei junginyje yra kompleksinis katijonas sakomi prijungt ligand, kompleksadario (lietuvikai) ir iorinje koordinacinje sferoje esani jon pavadinimai. Pvz.: [Ag(NH3)2]NO3 diamoniako sidabro (I) nitratas, [Cu(NH3)4]Cl2 tetraamoniako vario (II) dichloridas. Jei junginyje yra kompleksinis anijonas, sakomi iorins sferos jon, prijungt ligand ir kompleksadario pavadinimai. Kompleksadario pavadinimas sudaromas, prie kompleksadario lotyniko pavadinimo pridedant galn -atas. Pvz.: K3[Fe(CN)6] trikalio heksaciano (III) feratas, K2[PtCl4] dikalio tetrachloro (II) platinatas. Darbo tikslas Ianalizuoti darbe gautus ir vartojamus kompleksinius junginius, parayti j pavadinimus.

14

Darbo priemons ir reagentai Mgintuvliai, matavimo cilindras (10 mL), elektros plytel, stiklin (vandens vonia). Tirpalai: BaCl2, Bi(NO3)3, C2H5OH, CoCl2, FeCl3, Fe(NH4)(SO4)2, FeSO4, KI, K3[Fe(CN)6], K4[Fe(CN)6], KSCN, NH3 konc., NaOH, NiSO4. Sausi reagentai: CuSO4, NH4SCN, raudono lakmuso popierliai. Darbo eiga Atliekamos reakcijos pagal vien i dstytojo nurodyt variant. Paraomos vis atlikt reakcij lygtys ir ianalizuojami darbe naudoti ir pagaminti kompleksiniai junginiai. Duomenys suraomi lentel: Eil. Nr. Kompleksinio junginio formul, jo disociacijos lygtis Komplek- Ligandai Koordinacinis Kompleksadario Kompleksinio jono sadaris (adendai) skaiius valentingumas valentingumas

A variantas 1. Junginys su kompleksiniu katijonu Nedidelis kiekis vario sulfato itirpinamas 2 mL distiliuoto vandens. gaut tirpal pilama 2 mL koncentruoto amoniako ir 1,5 mL etilo alkoholio. Isiskiria rugiagli spalvos tetraamoniako vario sulfatas: CuSO4 + 4NH3 [Cu(NH3)4]SO4. 2. Junginys su kompleksiniu anijonu mgintuvl pilama 1 mL bismuto nitrato ir lainamas kalio jodidas tol, kol ikritusios tamsios bismuto jodido nuosdos itirpsta KI pertekliuje. Paraoma BiI3 susidarymo reakcija ir BiI3 reakcija su KI, inant, kad Bi koordinacinis skaiius yra 4. 3. Kompleksins ir dvigubos druskos vien mgintuvl pilama 2 mL Fe(NH4)(SO4)2 tirpalo, o kit 2 mL K3[Fe(CN)6] tirpalo. abu mgintuvlius pilama madaug po 0,5 mL kalio rodanido KSCN tirpalo. Stebima, kuriame i mgintuvli susidaro raudonos spalvos geleies rodanidas Fe(SCN)3. Paaikinama, kodl jis vienu atveju susidaro, o kitu ne. 4. Kompleksiniai junginiai, vykstant main reakcijoms mgintuvl pilama 2 mL FeCl3 ir 2 mL K4[Fe(CN)6] tirpal. Susidaro mlynos spalvos Berlyno mlis Fe4[Fe(CN)6]3. B variantas 1. Junginys su kompleksiniu katijonu mgintuvl pilama 1 mL nikelio sulfato ir paskui koncentruoto amoniako, kol tirpalas nusidao viesiai mlyna spalva. Susidaro heksaamoniako nikelio sulfatas [Ni(NH3)6]SO4. 2. Junginys su kompleksiniu anijonu mgintuvl pilama 1 mL kobalto chlorido tirpalo ir pridedama truputis NH4SCN druskos tirpalas nusidao mlynai: CoCl2 + 4NH4SCN (NH4)2[Co(SCN)4] + 2NH4Cl. 3. Kompleksins ir dvigubos druskos Imami 4 mgintuvliai. pirm, antr ir trei mgintuvl pilama madaug po 2 mL Fe(NH4)(SO4)2. ketvirt mgintuvl pilama 2 mL K3[Fe(CN)6] tirpalo. pirm mgintuvl pilama madaug 0,5 mL bario chlorido tirpalo. Susidaro baltos spalvos BaSO4 nuosdos.

15

antr mginuvl pilama 10 % koncentracijos natrio armo tirpalo ir vandens vonioje paildoma iki virimo. Vir mgintuvlio palaikomas vandeniu suvilgytas raudono lakmuso popierlis, kuris pamlynuoja nuo isiskyrusio amoniako. trei ir ketvirt mgintuvlius pilama 0,5 mL kalio rodanido KSCN tirpalo. Treiame mgintuvlyje susidaro raudonos spalvos geleies rodanidas Fe(SCN)3. Vadinasi, aptinkami visi tirpale esantys jonai: Fe(NH4)(SO4)2 Fe3+ + NH+4 + 2SO42. Ketvirtame mgintuvlyje spalva nepakinta. Paaikinama, kodl. 4. Kompleksiniai junginiai vykstant main reakcijoms mgintuvl pilama 2 mL FeSO4 ir 2 mL K3[Fe(CN)6] tirpal. Susidaro tamsiai mlynos nuosdos (Turnbulio mlynasis) Fe3[Fe(CN)6]2. Atsiskaitymas paraomos atlikt reakcij lygtys; upildoma pateikto pavyzdio lentel.

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganins chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p. 3. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

16

5. Chemin kinetika, kataliz ir pusiausvyra


Chemin kinetika
v, s-1
v = k[A]n[B]m,

150 100 50

Chemin reakcij apibdina tam tikras greitis. Jis matuojamas reaguojani mediag koncentracij 0 pasikeitimu per laiko vienet. Chemins reakcijos gali bti 20 30 40 50 homogenins ir heterogenins. Reakcijos, kai reaguoja toC vienodos fazs mediagos, vadinamos homogeninmis. Pavyzdiui, itirpusi mediag reakcijos, duj reakcijos. Reakcijos, kai reaguoja skirting fazi mediagos, vadinamos heterogeninmis. Pavyzdiui, itirpusi mediag reakcijos su kieta mediaga, duj reakcijos su kieta mediaga. Chemini reakcij greitis priklauso nuo vairi veiksni, taiau pagrindiniai i j yra reaguojanij mediag koncentracija, temperatra ir katalizatoriai. Chemins reakcijos greitis yra tiesiog proporcingas reaguojanij mediag koncentracij sandaugai. Tai veikianij masi dsnis, kurio matematin iraik galima pritaikyti cheminms reakcijoms. Reakcijos n A + m B p C greit galima ireikti lygtimi: ia: v reakcijos greitis, k proporcingumo koeficientas, vadinamas reakcijos greiio konstanta, [A] ir [B] reaguojani mediag koncentracijos, n ir m stechiometriniai chemins lygties koeficientai. Pvz.: 2SO2 + O2 2SO3, v = k[SO2]2[O2]. Veikianij masi dsnis taikomas ir heterogeninms reakcijoms, taiau iuo atveju reakcijos greitis priklauso nuo itirpusi ir dujini mediag koncentracij ir nepriklauso nuo kiet mediag koncentracij. Pvz., sieros degimo reakcijos greitis priklauso tik nuo deguonies koncentracijos: S + O2 SO2 v = k[O2]. Remiantis iais dsningumais, galima atlikti daug skaiiavim. Pavyzdys. Kaip pasikeis reakcijos 2SO2 + O2 2SO3 greitis, jeigu duj tr sumainsime 3 kartus? Sprendimas. Reakcijos greiio iraika iai reakcijai bus tokia: v = k[SO2]2[O2]. Sumainus duj tr 3 kartus, reaguojani mediag koncentracijos 3 kartus padids, todl reakcijos greiio iraika bus: v = k[3SO2]2[3O2], v = k27[SO2]2[O2]. Reakcijos greitis padids 27 kartus. Reakcijos greiio priklausomumas nuo temperatros ireikiamas vant Hofo (vant Hoff) taisykle: padidinus temperatr 10 C, reakcijos greitis padids 24 kartus. Skaiius, rodantis, kiek kart padidja reakcijos greitis, paklus temperatr 10 C, vadinamas temperatriniu reakcijos greiio koeficientu. Reakcijos greiio (arba konstantos) priklausomumas nuo temperatros ireikiamas lygtimi:

17

vt + t kt + t = = 10 , vt kt

ia: vt ir kt reakcijos greitis ir konstanta, esant t C temperatrai, vt + t ir kt + t reakcijos greitis ir konstanta, esant (t + t) C temperatrai, temperatrinis reakcijos greiio koeficientas. Pavyzdys. Temperatrinis reakcijos greiio koeficientas yra 2,5. Kiek kart padids reakcijos greitis, padidjus temperatrai nuo 20 iki 65 C? Sprendimas. Surandame t: t = 65 20 = 45 C. Paymime reakcijos greit, esant 20 C ir 65 C temperatroms, atitinkamai v ir v1. Reikmes raome lygt:
v1 = 2,5 10 = 2,54 ,5 , v
v1 = 61,76 62 . v
45

Reakcijos greitis padids 62 kartus. Chemin pusiausvyra Reakcijos, kurios vienu metu vyksta dviem prieingomis kryptimis, vadinamos grtamosiomis. Kai tiesiogins ir atvirktins reakcij greiiai yra lygs ir vis reaguojani mediag koncentracijos pastovios, reakcija yra cheminje pusiausvyroje. Chemin pusiausvyra apibdinama pusiausvyros konstanta (K), kurios matematin iraik galima pritaikyti cheminms reakcijoms. Reakcijos n A + m B p C pusiausvyros konstanta ireikiama lygtimi:
K=

[C ]p . [A]n [B]m

Pavyzdiui, reakcijos 2SO2 + O2 2SO3,


K=

[SO3 ]2 . [SO2 ]2 [O2 ]

Chemins pusiausvyros bkl priklauso nuo reaguojani mediag koncentracij, temperatros ir slgio (jeigu reaguoja dujos arba garai). Jeigu pakeiiamas bent vienas i i dydi, pusiausvyra pasislenka. Krypt, kuria pasislenka pusiausvyra, nurodo Le atelj (Le Chatellier) principas. Pakeitus vien i slyg, kurioms esant sistema yra cheminje pusiausvyroje, pusiausvyra pasislenka ta kryptimi, kuri prieinasi padarytam pakeitimui. Pvz.: 2SO2 + O2 2SO3, H = 193 kJ. ioje sistemoje gali vykti tokie pusiausvyros poslinkiai:

18

1. Padidinus SO2 arba O2 koncentracijas ir sumainus SO3 koncentracij, pusiausvyra pasislenka dein, nes, vykstant tiesioginei reakcijai, sumas SO2 ir O2 koncentracijos ir padids SO3 koncentracija. Didinant SO3 koncentracij arba mainant SO2 bei O2 koncentracijas, pusiausvyra pasislenka kair. 2. Sumainus temperatr, pusiausvyra pasislenka dein, nes SO3 susidaro isiskiriant ilumai. Padidinus temperatr, pusiausvyra pasislenka kair, t. y. tos reakcijos pus, kuriai vykstant suvartojama iluma. 3. Padidinus slg, pusiausvyra pasislenka dein, nes ioje pusje yra maesnis duj molekuli skaiius. Sumainus slg, pusiausvyra pasislinks kair, t. y. t pus, kurioje molekuli skaiius yra didesnis. Kataliz Reakcijos greiiui daug reikms turi katalizatoriai. Tai tokios mediagos, kurios pakeiia reakcijos greit. Katalizatoriai po reakcijos lieka nepakit. Kataliz yra skirstoma homogenin ir heterogenin. Homogenin kataliz yra tokia, kai katalizatorius ir reaguojanios mediagos yra vienos fazs. Homogenins katalizs mechanizmas aikinamas tarpini jungini susidarymo teorija. Heterogenin kataliz yra tokia, kai katalizatorius ir reaguojanios mediagos sudaro skirtingas fazes. Heterogenins katalizs mechanizmas aikinamas adsorbcija. Dl adsorbcijos padidja ne tik reaguojani mediag koncentracija katalizatoriaus paviriuje, bet ir j aktyvumas, padidinantis reakcijos greit. Darbo tikslas Itirti reakcijos greiio priklausomyb nuo reaguojani mediag koncentracij ir temperatros, susipainti su katalize bei chemins reakcijos pusiausvyros poslinkiais. Darbo priemons Elektrin plytel, termometras, laikmatis, pipets, mgintuvliai, stiklinls, 2 % Na2S2O3 bei 2 % H2SO4 tirpalai, prisotinti FeCl3 ir KSCN tirpalai, 30 % H2SO4 tirpalas, 1, 0,1 ir 0,01 N KNO3 tirpalai, sausas KCl, metalinis cinkas. Darbo eiga Darbas atliekamas pagal vien i dstytojo nurodyt variant. A variantas. Reakcijos greiio priklausomyb nuo koncentracijos ir temperatros Reaguojant natrio tiosulfatui Na2S2O3 su sieros rgtimi, susidaro nepatvari tiosulfatin rgtis, kuriai skylant isiskiria koloidin siera. Na2S2O3 + H2SO4 = Na2SO4 + H2S2O3, H2S2O3 = H2O + SO2 + S. Siera i reakcijos miinio ima skirtis, prajus kiek laiko po tirpal sumaiymo, todl reakcijos trukme galima laikyti laik, prajus nuo tirpal sumaiymo iki momento, kai miinys tampa nebeskaidrus. Reakcija atliekama, esant vairioms mediag koncentracijoms, taip pat skirtingoms temperatroms. 1. Reakcijos greiio priklausomyb nuo koncentracijos 5 mgintuvlius pilama 2 % Na2S2O3 tirpalo ir distiliuoto vandens. J triai nurodyti 1 lentelje. Paskui pirm mgintuvl pilama 5 mL 2 % H2SO4 tirpalo, reakcijos miinys sumaiomas. Fiksuojamas laikas reakcijos trukm (s) nuo sumaiymo momento iki tirpalo susidrumstimo (arba neskaidrumo). Analogikai atliekami bandymai ir kituose keturiuose mgintuvliuose. iame darbe labai svarbu ufiksuoti laik, per kur mgintuvliuose pasiekiamas vienodas miinio drumstumas. Tam tikslui patogu sekti miini drumstum juodame fone, lyginant tiriamj mgintuvl su

19

kontroliniu, pripiltu vandens (paymima drumstimosi pradia) arba laikant mgintuvl prie suliniuoto popieriaus lapo ir fiksuojant laik, kai pro mgintuvl nebesimato linij. Darbo rezultatai suraomi 1 lentel. Santykin Na2S2O3 koncentracija tirpaluose c randama i trupmenos a/(a + b), o slyginis reakcijos greitis v i reikinio 1000/, sek1.
1 lentel

Bandinio Nr. 1 2 3 4 5

Tirpal triai, (mL) 2 % Na2S2O3, 2 % H2SO4, (mL) a (mL) 2 5 4 5 6 5 8 5 10 5

H2O tris, (mL) b 8 6 4 2 0

Santykin Na2S2O3 konc., c

Reakcijos trukm, (s)

Slyginis reakcijos greitis, v s1

I gaut duomen sudaromas reakcijos greiio priklausomybs nuo natrio tiosulfato koncentracijos grafikas. Abscisi ayje atidedama santykin tiosulfato koncentracija c, ordinai slyginis reakcijos greitis v. 2. Reakcijos greiio priklausomyb nuo temperatros 4 mgintuvlius pilama po 5 mL 2 % Na2S2O3, o kitus keturis po 5 mL 2 % H2SO4 tirpal. 4 chemines 100 mL talpos stiklinles pilama po 7080 mL vandentiekio vandens ir jas statoma po vien mgintuvl su Na2S2O3 bei H2SO4 tirpalais. Pirmoji stiklinl su vandeniu ir statytais mgintuvliais (kartkartm atsargiai pakratant mgintuvlius) ildoma, kol vandens temperatra stiklinje ir abiejuose mgintuvliuose pasiekia 20 C. Abiej mgintuvli turinys supilamas vien mgintuvl. Reakcijos miinys suplakamas. Paymima reakcijos trukm (s) nuo reakcijos pradios iki tirpalo neskaidrumo (stebima dryuotame fone). iame darbe, kaip ir pirmame punkte, svarbu ufiksuoti laik, per kur mgintuvliuose pasiekiamas vienodas miinio drumstumas. Kita stiklinl ir joje esantys mgintuvliai su tirpalais paildomi iki 30 C, tirpalai supilami vien mgintuvl, suplakami ir uraomas laikas nuo tirpal sumaiymo iki susidrumstimo momento. Tas pats atliekama su kitomis stiklinlmis ir jose esani mgintuvli turiniu, esant 40 C ir 50 C temperatroms. Rezultatai raomi 2 lentel. Slyginis reakcijos greitis v imamas lygus santykiui 1000/, s1.
2 lentel

Bandymo Nr. 1 2 3 4

Bandymo temperatra, t (C) 20 30 40 50

Reakcijos trukm, (s)

Slyginis reakcijos greitis, v (s1)

I gaut duomen sudaromas reakcijos greiio priklausomybs nuo temperatros grafikas. Abscisi ayje atidedamos temperatros C, ordinai ayje slyginis reakcijos greitis v. Apskaiiuojamas temperatrinis reakcijos greiio koeficientas pagal formul:

20

1 v2 = , 2 v1

ia: 1 ir v1 laikas, per kur tirpalas susidrumst, ir reakcijos greitis, esant t C temperatrai, 2 ir v2 laikas, per kur tirpalas susidrumst, ir reakcijos greitis, esant (t+10) C temperatrai. Turint tris temperatrinio koeficiento reikmes, randamas j vidurkis. B variantas. Kataliz ir chemin pusiausvyra 1. Katalizatoriaus koncentracijos taka reakcijos greiiui Homogenins katalizs greitis priklauso nuo katalizatoriaus koncentracijos. stiklinl pilama 20 mL 30 % sieros rgties ir lainami 34 laai 0,1 N kalio permanganato. Tirpalas sumaiomas ir supilstomas 3 mgintuvlius, po 5 mL kiekvien. pirm mgintuvl lainami 2 laai 1 N kalio nitrato, antr 2 laai 0,1 N kalio nitrato, trei 2 laai 0,01 N kalio nitrato. Paskui visus mgintuvlius metama po gabaliuk cinko. Mgintuvliai retkariais sukratomi. Cinkui reaguojant su sieros rgtimi, isiskiria vandenilis, kuris redukuoja kalio permanganat, todl violetin KMnO4 spalva inyksta. Zn + H2SO4 ZnSO4 + 2H, 2KMnO4 + 10H + 3H2SO4 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O. Reakcij pagreitina katalizatorius kalio nitratas: 5KNO3 + 10H 5KNO2 + 5H2O, 2KMnO4 + 5KNO2 + 3H2SO4 2MnSO4 + K2SO4 + 5KNO3 + 3H2O. lentel suraomas laikas (s), per kur inyksta violetin tirpalo spalva: Mgintuvlio Nr. KNO3 konc. Reakcijos trukm (s) Reakcijos greitis v = 1000/

Gauti duomenys pavaizduojami grafikai: abscisi ayje atidedama katalizatoriaus koncentracija, ordinai ayje reakcijos greitis v. 2. Chemins pusiausvyros poslinkiai Geleies trichloridui reaguojant su kalio rodanidu, susidaro raudonas geleies rodanidas: FeCl3 + 3KSCN Fe(SCN)3 + 3KCl. Tirpalo spalvos intensyvumas priklauso nuo Fe(SCN)3 koncentracijos. Pusiausvyros poslinkis pastebimas i tirpalo spalvos intensyvumo pasikeitimo. stiklin pilama 20 mL distiliuoto vandens ir lainama 3 laai prisotint FeCl3 ir KSCN tirpal. Gautas raudonas tirpalas padalijamas 4 lygias dalis ir supilamas mgintuvlius. Pirmas mgintuvlis paliekamas palyginimui, antr lainami 2 laai prisotinto FeCl3 tirpalo, trei 2 laai prisotinto KSCN tirpalo, o ketvirt beriamas maas auktelis kristalinio KCl. Tirpal spalvos intensyvumas pasikeiia. Bandym rezultatai suraomi lentel: Bandymo Nr. Pridedama mediaga Tirpalo spalvos intensyvumo pokytis (tamsja ar viesja) Pusiausvyros poslinkio kryptis ( kair ar dein)

Paraoma atliktos reakcijos pusiausvyros konstantos iraika.

21

Atsiskaitymas pateikiamos nustatyto pavyzdio upildytos lentels; pateikiami nurodyti darbo aprayme grafikai; pateikiama apskaiiuota temperatrinio reakcijos greiio koeficiento reikm (5 a variante); paraoma atliktos reakcijos pusiausvyros konstantos iraika (5 b variante).

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganins chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p. 3. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

22

6. Mediag tirpumas
Mediag tirpumu yra vadinama jos savyb tirpti vienokiame ar kitokiame tirpiklyje. Tirpumo matas yra mediagos sotaus tirpalo koncentracija. Daniausiai tirpumas ireikiamas mediagos svorio kiekiu, kuris itirpsta 100 g tirpiklio esant 20 C temperatrai. Daugelio kiet mediag tirpumas didja kylant temperatrai, o duj tirpumas maja. Tirpimo procesas visada yra lydimas iluminio efekto. ilumos kiekis, suvartojamas ar isiskiriantis, tirpstant 1 moliui mediagos, vadinamas tirpimo iluma. Darbo tikslas Natrio arba amonio oksalat tirpumo nustatymas, j soij tirpal vairi koncentracij skaiiavimas. Tyrimo objektas Natrio arba amonio oksalatai. Darbo priemons ir reagentai Kgins kolbuts, stiklinait (2550 mL), stiklin lazdel, piltuvlis, filtro popierius, biuret, pipet, matavimo cilindras, matavimo kolbut (100 mL), elektrin plytel. Na2C2O4, (NH4)2C2O4, tirpalai: KMnO4 0,1 N, H2SO4 1:4. Darbo eiga Pasveriama 2 g Na2C2O4 arba (NH4)2C2O4, supilama chemin stiklinait ir pilama 20 mL distiliuoto vandens (matuojama cilindru). Oksalatas stiklinaitje maiomas stikline lazdele 10 min. Paskui gautas sotusis tirpalas nufiltruojamas pro saus filtr, pipete pamatuojama 10 mL filtrato ir supilama 100 mL matavimo kolbut. Tirpalas iki brknio praskiediamas distiliuotu vandeniu ir gerai sumaiomas. I matavimo kolbuts varia pipete pamatuojama 10 mL tirpalo, supilama kgin kolbut ir pilama 10 mL praskiestos 1 : 4 sieros rgties (matuojama cilindru arba dozatoriumi). Tirpalas paildomas iki virimo temperatros ir kartas titruojamas 0,1 N kalio permanganato tirpalu, kol atsiranda silpnai rausva spalva (r. pav.). Titruojama 23 kartus. Titruojant amonio oksalat kalio permanganato tirpalu, vyksta reakcija: 5(NH4)2C2O4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 2MnSO4 + K2SO4 + 5(NH4)2SO4 + 10CO2 + 8H2O. Titruojant natrio oksalat kalio permanganatu, vyksta analogika reakcija. Titravimo duomenys suraomi lentel: Titravimas 1 2 3 Skaiiavimai I sunaudoto kalio permanganato tirpalo trio apskaiiuojama: 1) praskiesto oksalato tirpalo molin ekvivalent koncentracija (normalingumas) pagal formul: Titravimui paimtas tiriamo tirpalo tris (mL) Titravimui suvartoto kalio permanganato tris (mL) Vidutinis titravimui suvartotas kalio permanganato tris (mL)

23

Tirpumas (g/100 g H2O)

NV = N1V1, ia: N oksalato tirpalo normalingumas, V titravimui paimtas oksalato tirpalo tris, mL, N1 kalio permanganato tirpalo normalingumas, V1 titravimui sunaudoto kalio permanganato tirpalo tris, mL. 2) itirpusio oksalato kiekis (g) 10-tyje mL sotaus tirpalo pagal formul:
m=
E N 100 , 1000

ia: E oksalato ekvivalentin mas, N oksalato tirpalo normalingumas. 3) oksalato tirpumas gramais 100-te gram vandens*, 4) sotaus oksalato tirpalo procentin koncentracija*, 5) sotaus oksalato tirpalo molin koncentracija*.
*

sotaus tirpalo tankis yra 1,02 g/mL

Atsiskaitymas upildyta pateikto pavyzdio lentel; oksalato tirpumo reikm; sotaus oksalato tirpalo procentin koncentracija; sotaus oksalato tirpalo molin koncentracija.

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Stulpinas, B. ir kt. Bendrosios chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Mokslas, 1985. 147 p. 3. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

24

7. Neelektrolito molio krioskopiniu metodu

mass

nustatymas

Tirpal virimo temperatra yra auktesn, negu gryno tirpiklio, o j stingimo temperatra emesn. Tirpalo ir tirpiklio virimo temperatr skirtumas vadinamas tirpalo virimo temperatros pakilimu, o tirpiklio ir tirpalo stingimo temperatr skirtumas vadinamas tirpalo stingimo temperatros nuokryiu (depresija). ias tirpal savybes nusako antrasis Raulio dsnis: stingimo temperatros depresija ir virimo temperatros pakilimas yra proporcingi molialinei tirpalo koncentracijai:
t = Kc,

(1)

ia: t virimo temperatros pakilimas arba stingimo temperatros depresija (nuokrytis), c tirpalo molialin koncentracija, K krioskopin arba ebulioskopin konstanta. Krioskopin konstanta yra vienmolialinio tirpalo stingimo temperatros depresija. Ebulioskopin konstanta yra vienmolialinio tirpalo virimo temperatros pakilimas. Kadangi
c=
m , M

(2)

ia: m itirpusios mediagos kiekis (g) 1000 g tirpiklio, M mediagos molio mas, tai antrj Raulio dsn galima urayti taip:
t = K

m . M

(3)

Pagal Raulio dsn galima apskaiiuoti itirpusi mediag molio mas. Darbo tikslas Nustatyti dstytojo nurodytos mediagos molio mas. Darbo priemons Krioskopas, pipet (10 mL), grstuvas su piesta, ledas, sausas NaCl, tiriamoji mediaga. Darbo eiga Darbas atliekamas su krioskopu, kur sudaro stiklin su joje tvirtintu mgintuvliu. Mgintuvlis ukemamas kamiu, kur statytas termometras. Stiklin pripildoma aldomojo miinio, kur sudaro stiklins susmulkinto ledo ir trys aukteliai natrio chlorido. Randama gryno tirpiklio stingimo temperatra. Tam mgintuvl pilama 10 mL distiliuoto vandens (matuojama pipete). Vanduo atsargiai pamaiomas termometru ir stebima jo temperatra. I pradi vanduo perla temperatra nukrinta emiau nulio. Netrukus atsiranda ledo kristaliukai, vandens temperatra iek tiek pakyla ir nusistovi. Tai ir yra gryno tirpiklio stingimo temperatra t1. Mgintuvlis iimamas ir ildomas rankoje, kol ledas itirpsta. Itirpinus led, mgintuvl pilama analitinmis svarstyklmis tiksliai pasverta tiriamoji mediaga. Mediagai itirpus, anksiau apraytu bdu randama tirpalo stingimo temperatra t2.

25

Bandym duomenys suraomi lentel: Gryno tirpiklio stingimo temperatra, t1 (C) Skaiiavimai Skaiiuojama pagal antrojo Raulio dsnio formul (3). Vandens krioskopin konstanta K = 1,86 C/mol. Gryno tirpiklio svoris imamas lygus jo triui, nes laikoma, kad distiliuoto vandens tankis lygus 1 g/mL. Tirpalo stingimo temperatros depresija:
t = t1 t2,

Tirpalo stingimo temperatra, t2 (C)

Tirpalo stingimo temperatros depresija, t ()

Gryno tirpiklio mas (g)

Tiriamos mediagos mas (g)

(4)

ia: t1 gryno tirpiklio stingimo temperatra, t2 tirpalo stingimo temperatra. Atsiskaitymas pateikiama upildyta lentel; pateikiama apskaiiuota neinomos mediagos molio mas.

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganins chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p. 3. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

26

8. Koloidiniai tirpalai
Koloidiniais tirpalais, arba zoliais, vadinamos dispersins sistemos, kuri dispersins fazs daleli skersmuo yra 1100 nm. Koloidiniai tirpalai yra heterogenins sistemos, todl, norint gauti koloidin tirpal, dispersin faz turi netirpti tirpiklyje. Koloidiniai tirpalai gaunami dviem metodais: 1) dispersiniu smulkinant mediag iki koloidini daleli dydio, 2) kondensaciniu chemini reakcij metu sukimbant molekulms agregatus. Nors koloidini tirpal dalels yra didels, taiau jos neikrenta nuosdomis ir gali ilgai ilaikyti agregatin pastovum. Koloid agregatinis pastovumas aikinamas tuo, kad dalels paviriuje susidaro elektrinis krvis. Koloidins dalels adsorbuoja i tirpalo jonus ir gyja elektros krv, kuris neleidia joms sukibti ir nussti. Susidarant koloidiniams tirpalams, dispersins fazs molekuls sukimba agregatus ir sudaro koloidins dalels branduol. Branduolys adsorbuoja tirpale esanius jonus, kurie neleidia dalelei toliau augti. Koloidins dalels branduolys i tirpalo adsorbuoja tuos jonus, kurie yra jam giminingi ir kuri tirpale yra perteklius. Nuo i jon ir priklauso koloidins dalels krvio enklas. Pvz., AgJ koloidins dalels branduolys gali adsorbuoti Ag+ arba J jonus ir priklausomai nuo adsorbuot jon sielektrinti teigiamai arba neigiamai. Metal hidroksid koloidins dalels turi teigiamj krv, nes adsorbuoja i tirpalo teigiamuosius jonus. Fe(OH)3 koloidins dalels branduolys adsorbuoja Fe3+ jonus. Metalo sulfid koloidins dalels turi neigiamj krv, nes adsorbuoja i tirpalo neigiamuosius jonus. Sb2S3 bei As2S3 daleli branduoliai adsorbuoja S2 arba HS jonus, priklausomai nuo to, kokie jonai yra tirpale. Adsorbuoti branduolio paviriuje jonai pritraukia i tirpalo dal prieingo krvio jon ir sudaro koloidins dalels adsorbcin sluoksn. Taigi adsorbciniame sluoksnyje yra teigiamj ir neigiamj jon. Koloidins dalels branduolys su adsorbciniu sluoksniu sudaro granul. Kita prieingo krvio jon dalis yra toliau nuo koloidins dalels ir sudaro difuzin sluoksn. Granul ir difuzinio sluoksnio jonai sudaro micel. Pvz., As2S3 zolis susidaro pagal i reakcij: As2O3 + 3H2S As2S3 + 3H2O, As2O3 + 3H+ + 3S2 As2S3 + 3H2O. 1) As2S3 molekuls sukimba ir sudaro koloidins dalels branduol m(As2S3), 2) branduolys adsorbuoja S2 jonus, sielektrina neigiamai ir pritraukia i tirpalo dal H+ jon. S2 ir H+ jonai sudaro adsorbcin sluoksn. Branduolys su adsorbciniu sluoksniu granul: {m(As2S3)nS2 xH+}(2nx), 3) kiti tirpalo H+ jonai isidsto toliau ir sudaro difuzin sluoksn. Granul su difuziniu sluoksniu micel: {m(As2S3)nS2 xH+}(2nx) (2nx)H+. Adsorbcinio ir difuzinio sluoksni jonai sudaro dvigub elektros sluoksn dalels paviriuje. Koloidinei dalelei judant atsiranda potencial skirtumas tarp dalels ir tirpale esani jon, kuris vadinamas elektrokinetiniu potencialu, arba (dzeta) potencialu. Kuo didesn potencialo reikm, tuo pastovesn koloidin sistema. Jeigu koloidini daleli krviai labai sumaja arba visai inyksta, koloidins dalels sustambja, i tirpalo isiskiria nuosdos. is procesas vadinamas koaguliacija. Koaguliacij gali sukelti prieing krvi koloid sumaiymas, temperatros pakilimas, zolio koncentravimas ir elektrolit priedai. Elektrolito priedas pakeiia difuzinio sluoksnio struktr. Elektrolito jonai difuzinio sluoksnio jonus istumia adsorbcin sluoksn, todl dalels krvis maja ir, atsivelgiant elektrolito koncentracij, gali visai inykti. Tada koloidins dalels sukimba agregatus ir koaguliuoja.

27

Minimali elektrolito koncentracija, kuri sumaina zolio agregatin pastovum per tam tikr laik, vadinama koaguliacijos slenksiu Csl. Atvirkias jam dydis apibdina elektrolito koaguliacin gali 1/Csl. Koaguliacin galia priklauso nuo jono valentingumo ir spindulio. Kuo didesnis jono valentingumas ir spindulys, tuo didesn elektrolito koaguliacin galia. Darbo tikslas Pagaminti koloidinius tirpalus, nustatyti j patvarum. Apskaiiuoti elektrolit koaguliacin gali. Darbo priemons Elektrin plytel, mgintuvliai, chemins stiklinls, matavimo cilindras, pipets. 4 % FeCl3 arba 3 % AlCl3, 1 % CuSO4, 0,01 % K4[Fe(CN)6], 0,01 M K2SO4, 0,001 M K3[Fe(CN)6], 0,01 M BaCl2, 0,001 M AlCl3 tirpalai. Darbo eiga Darbas atliekamas pagal vien i dstytojo nurodyt variant. A variantas Stiklinlje uvirinama 50 mL distiliuoto vandens, pilama 5 mL 4 % FeCl3 arba 3 % AlCl3 tirpalo ir palaukiama, kol tirpalas dar kart uvirs. Chlorid hidroliz vyksta iki galo, ir susidaro geleies arba aliuminio hidroksido zolis. Paraomos hidroksido susidarymo molekulin ir jonin lygtys ir zolio micels formul, inant, kad koloidins dalels krvis teigiamasis. 8 varius mgintuvlius pilama po 5 mL atauinto hidroksido zolio. kiekvien mgintuvl pridedama distiliuoto vandens ir elektrolito tirpalo tiek, kiek nurodyta lentelje: Mgintuvlio Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 Fe(OH)3 arba Al(OH)3, (mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 Distiliuoto H2O, (mL) 4,5 4 3 1 4,5 4 3 1 0,01 M K2SO4, (mL) 0,5 1 2 4 0,001 M K3[Fe(CN)6], (mL) 0,5 1 2 4 Kai koaguliuoja po 15 min., ymima +

Tirpalai mgintuvliuose sumaiomi, ir po 15 min. lentelje paymima, kuriuose mgintuvliuose vyko koaguliacija (tirpalas susidrumst arba ikrito nuosdos). B variantas 40 mL 0,01 % K4[Fe(CN)6] tirpalo pilama 1 mL 1 % CuSO4. Susidaro raudonas Cu2[Fe(CN)6] zolis. Paraomos io zolio susidarymo molekulin ir jonin lygtys ir micels formul, inant, kad dalels krvis neigiamas ir j stabilizuoja K4[Fe(CN)6]. 8 mgintuvlius pilama po 5 mL gauto zolio, tada pridedama distiliuoto vandens ir elektrolito tirpalo tiek, kiek nurodyta lentelje: Mgintuvlio Cu2[Fe(CN)6] (mL) Distiliuoto H2O (mL) 0,01 M BaCl2 0,001 M AlCl3 Kai koaguliuoja po 15 min., ymima +

28

Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8

5 5 5 5 5 5 5 5

4,5 4 3 1 4,5 4 3 1

(mL) 0,5 1 2 4

(mL) 0,5 1 2 4

Tirpalai mgintuvliuose sumaiomi, ir po 15 min. lentelje paymima, kuriuose mgintuvliuose vyko koaguliacija (tirpalas susidrumst arba ikrito nuosdos). Skaiiavimai Koaguliacijos slenkstis ir koaguliacini galia skaiiuojami kiekvienam i panaudot darbe elektrolit. Koaguliacijos slenkstis Csl apskaiiuojamas pagal maiausi elektrolito koncentracij, kuri sukl koaguliacij: Csl = 100cv, ia: c molin elektrolito koncentracija, v maiausias elektrolito kiekis (mL), kuris sukelia koaguliacij. Paskui apskaiiuojama elektrolito koaguliacin galia: p = 1/Csl. Duomenys suraomi lentel: Elektrolitas Atsiskaitymas pateikiamos zolio susidarymo reakcijos; pateikiama zolio micels formul; pateikiama upildyta duoto pavyzdio lentel. Koaguliacij sukeliantis jonas Koaguliacijos slenkstis Koaguliacin galia

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Stulpinas, B. ir kt. Bendrosios chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Mokslas, 1985. 147 p. 3. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

29

9. Elektrolitin disociacija
Darbo tikslas Apskaiiuoti acto rgties arba amonio hidroksido disociacijos konstant K ir disociacijos laipsn . Darbo priemons ir reagentai pH-metras, biuret, pipet, stiklinl, kgins kolbuts. Tirpalai: CH3COOH, NaOH, fenolftaleinas, arba NH4OH, HCl, metiloranas. Darbo eiga Darbas atliekamas pagal vien i dstytojo nurodyt variant. A. Acto rgties disociacijos konstantos ir disociacijos laipsnio nustatymas Pamatuojamas dstytojo nurodyto tirpalo pH (matavim seka yra aprayta atskirame lape, kur studentas gauna laboratorijoje). Bendra acto rgties molin koncentracija (C) lygi jos normalinei koncentracijai (N), kadangi ios mediagos molio mas lygi jos ekvivalento molio masei. Norint rasti normalin tirpalo koncentracij, pipete tiksliai pamatuojama 5 arba 10 mL tiriamojo tirpalo, pilama kgin kolbut, lainama 34 laai fenolftaleino indikatoriaus ir titruojama duotos koncentracijos NaOH tirpalu. Titravimas atliekamas 23 kartus. Skaiiavimai inant tirpalo pH reikm, i formuls pH = lg[H+], randama vandenilio jon koncentracija [H+] (mol/L) pagal formul: [H+] = 10pH. Disocijuojant vienai acto rgties molekulei, susidaro vienas vandenilio jonas ir vienas acetato jonas: CH3COOH H+ + CH3COO, todl acetato jon koncentracija yra lygi vandenilio jon koncentracijai: [CH3COO] = [H+]. (3) (2) (1)

Pusiausvyroje esanios acto rgties koncentracija [CH3COOH] prilyginama bendrai molinei acto rgties koncentracijai, kuri yra lygi tirpalo molinei ekvivalent koncentracijai (normalingumui): [CH3COOH] = C = N. Normalin acto rgties koncentracija apskaiiuojama i titravimo duomen pagal lygt:
N V = N1 V1,

(4)

(5)

ia: N acto rgties normalin koncentracija,

30

V acto rgties tris, paimtas titruoti (mL), N1 NaOH normalin koncentracija, V1 titruoti sunaudoto NaOH tris (mL). Apskaiiavus visas koncentracijas, galima skaiiuoti acto rgties disociacijos konstant K:
K=

[H ] [CH COO ] , [CH COOH]


+ 3 3

(6)

ia:

[H+] vandenilio jon koncentracija, mol/L, [CH3COO] acetato jon koncentracija, mol/L, [CH3COOH] nedisocijuotos acto rgties koncentracija, mol/L. Acto rgties disociacijos laipsnis skaiiuojamas: =
K , C

(7)

ia: K acto rgties disociacijos konstanta, C acto rgties bendra molin koncentracija, mol/L. B. Amonio hidroksido disociacijos konstantos ir disociacijos laipsnio nustatymas Matuojamas dstytojo nurodyto tirpalo pH. Bendra amonio hidroksido molin koncentracija (C) lygi jo normalinei koncentracijai (N), nes ios mediagos molio mas lygi jos ekvivalento molio masei. Tam, kad bt galima rasti normalin tirpalo koncentracij, pipete tiksliai pamatuojama 5 arba 10 mL tiriamojo tirpalo, pilama kgin kolbut, lainama 12 laai indikatoriaus metilorano ir titruojama duotos koncentracijos HCl tirpalu. Titruojama 23 kartus. Skaiiavimai inant tirpalo pH reikm, apskaiiuojama hidroksilo jon koncentracija [OH], mol/L. inant, kad: pH + pOH = 14, t. y. pOH = 14 pH, i formuls pOH = lg[OH] randama hidroksilo jon koncentracija [OH] (mol/L): [OH] = 10pOH . (10) (9) (8)

Disocijuojant vienai amonio hidroksido molekulei, susidaro vienas amonio jonas ir vienas hidroksilo jonas: NH4OH NH4+ + OH, todl amonio jon koncentracija yra lygi hidroksilo jon koncentracijai: [NH4+] = [OH]. (11)

Pusiausvyroje esanio amonio hidroksido koncentracija [NH4OH] prilyginama bendrai molinei amonio hidroksido koncentracijai, kuri yra lygi tirpalo molinei ekvivalent koncentracijai (normalingumui):

31

[NH4OH] = C = N,

(12)

Normalin amonio hidroksido koncentracija apskaiiuojama i titravimo duomen pagal lygt (5). Apskaiiavus visas koncentracijas, galima skaiiuoti duoto amonio hidroksido disociacijos konstant K:
K=

[NH ] [OH ] , [NH OH ]


+ 4 4

(13)

ia:

[NH+] amonio jon koncentracija, mol/L, [HO] hidroksilo jon koncentracija, mol/L, [NH4OH] nedisocijuoto amonio hidroksido koncentracija, mol/L. Amonio hidroksido disociacijos laipsnis skaiiuojamas pagal (7) lygt.

Atsiskaitymas tiriamos mediagos disociacijos laipsnio reikm; tiriamos mediagos disociacijos konstantos reikm.

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganins chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p. 3. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

32

10. Drusk hidroliz


Hidrolize vadinama druskos ir vandens jon reakcija, kuriai vykstant susidaro bent vienas silpnasis elektrolitas (silpnoji rgtis, baz arba rgtiniai bei baziniai jonai). Todl daniausiai pakinta vandens vandenilio ir hidroksilo jon koncentracija, ir druskos tirpalas pargtja arba paarmja. Kiekvien drusk galima laikyti mediaga, gauta rgiai reaguojant su baze: druskos katijonas apibdina baz, anijonas rgt. Hidrolizuojasi tik tokios druskos, kurias sudaro silpnosios rgtys arba silpnosios bazs. Stiprij rgi ir stiprij bazi druskos (pvz.: NaCl, KNO3) nesihidrolizuoja, nes druskos jon sveika su vandeniu nevyksta (nesusidaro silpnai disocijuojantys junginiai), todl vandens H+ ir OH jon koncentracija nepakinta, ir tirpalas yra neutralus. Rgi ir bazi stiprum nusako j disociacijos laipsnis . Stiprij elektrolit disociacijos laipsnis yra didesnis negu 30 % ( > 30 %), silpn maesnis negu 3 % ( < 3 %). Elektrolit disociacijos laipsni reikmes galima rasti Chemijos laboratorini darb knygutje [1] 126 p. Kai raomos hidrolizs reakcijos, pirma paraoma molekulin lygtis, paskui jonin ir sutrumpinta jonin lygtys. Druskos, sudarytos i silpn daugiavandenili rgi (Na2CO3, K3PO4) arba silpnj daugiahidroksili bazi (Fe(NO3)3, CuCl2) hidrolizuojasi stadijomis (pakopomis). Tais atvejais ir susidaro rgts ar baziniai jonai. Toliau panagrinkime bdingiausi tip hidroliz. Druskos, sudarytos i stipriosios bazs ir silpnosios rgties, hidrolizuojasi ir sudaro silpnai disocijuojani rgt: KCN + H2O HCN + KOH; K+ + CN + H2O HCN + K+ + OH; CN + H2O HCN + OH. Susidaro silpna ciano rgtis ir OH jon perteklius (KOH yra stipri baz ir todl vandeniniame tirpale gerai disocijuoja jonus). Tirpalo reakcija yra armin: pH > 7. Druskos, sudarytos i stiprios bazs ir daugiavandenils rgties, hidrolizuojasi pakopomis: 1 stadija Na2CO3 + H2O NaHCO3 + NaOH; 2 Na+ + CO32 + H2O Na+ + HCO3 + Na+ + OH; CO32 + H2O HCO3 + OH. NaHCO3 + H2O H2CO3 + NaOH; Na+ + HCO3 + H2O H2CO3 + Na+ + OH; HCO3 + H2O H2CO3 + OH.

2 stadija

Hidrolizuojantis stipriosios bazs ir silpnosios rgties druskoms, susijungia vandens vandenilio jonai, ir tirpale ima vyrauti hidroksilo jonai, kurie suteikia jam armini savybi (pH > 7). Be to, susidaro silpnoji rgtis arba rgtusis jonas. Druskos, sudarytos i stipriosios rgties ir silpnosios bazs, hidrolizuojasi ir sudaro silpnai disocijuojani baz: NH4Cl + H2O NH4OH + HCl, NH4+ + Cl + H2O NH4OH + H+ + Cl, NH4+ + H2O NH4OH + H+. Druskos, sudarytos i stipriosios rgties ir daugiavalenio metalo bazs, hidrolizuojasi pakopomis: 1 stadija: CuCl2 + H2O Cu(OH)Cl + HCl, Cu2+ + 2 Cl + H2O Cu(OH)+ + Cl + H+ + Cl,

33

Cu2+ + H2O Cu(OH)+ + H+. 2 stadija: Cu(OH)Cl + H2O Cu(OH)2 + HCl, Cu(OH)+ + Cl + H2O Cu(OH)2 + H+ + Cl, Cu(OH)+ + H2O Cu(OH)2 + H+.

Hidrolizuojantis silpnosios bazs ir stipriosios rgties druskoms, susijungia vandens hidroksilo jonai ir tirpale ima vyrauti vandenilio jonai, kurie suteikia jam rgi savybi (pH < 7). Be to, susidaro silpnoji baz arba bazinis jonas. Druskos, sudarytos i silpnosios bazs ir silpnosios rgties, hidrolizuojasi ir sudaro silpnj rgt ir silpnj baz: CH3COONH4 + H2O CH3COOH + NH4OH, CH3COO + NH4+ + H2O CH3COOH + NH4OH. Arba 1 stadija (NH4)2S + H2O NH4OH + NH4HS, 2 NH4+ + S2 + H2O NH4OH + NH4+ + HS, NH4+ + S2 + H2O NH4OH + HS. NH4HS + H2O NH4OH + H2S, NH4+ + HS + H2O NH4OH + H2S.

2 stadija:

Hidrolizuojantis silpnosios bazs ir silpnosios rgties druskoms, susijungia vandens hidroksilo ir vandenilio jonai. Tirpalo pH priklauso nuo susidariusi mediag disociacijos laipsnio. Acto rgties ir amonio hidroksido disociacijos laipsniai labai panas, todl iuo atveju tirpalas praktikai neutralus. Jei hidrolizje susidariusios rgties disociacijos laipsnis didesnis u bazs disociacijos laipsn tirpalas bus silpnai rgtus (pH < 7), jei bazs disociacijos laipsnis didesnis u rgties tirpalas bus silpnai arminis (pH > 7). Jei vykstant hidrolizei susidaro labai silpna rgtis ir labai silpna baz, be to, jeigu jos yra lakios arba maai tirpios, tai hidroliz gali vykti iki galo, kol suskils visa druska: Al2S3 + 6 H2O 2 Al(OH)3 + 3 H2S. Darbo tikslas Nagrinti drusk vandenini tirpal pH pokyius. Imokti rayti vairi drusk pakopins hidrolizs reakcij lygtis. Darbo priemons ir reagentai Chemins stiklinls (2550 mL) arba mgintuvliai, universalaus indikatoriaus popierliai arba pHmetras. vairios sausos druskos, distiliuotas vanduo. Darbo eiga I darbo vietoje esani drusk stiklinlse arba mgintuvliuose pagaminami tirpalai: imama keliolika kristaliuk druskos ir upilama keliais mililitrais distiliuoto vandens, pamaioma. Druskoms itirpus pHmetru arba universalaus indikatoriaus popierliu nustatomas vis tirpal pH. Gauti rezultatai suraomi lentel: Mgintuvlio arba stiklinls Nr. Druskos formul I ko sudaryta druska (baz ir rgtis) Druskos tirpalo pH reikm Tirpalo reakcija (rgti, armin ar neutrali)

34

Paraomos drusk hidrolizs reakcij molekulins bei jonins lygtys. Drusk, sudaryt i daugiavandenili rgi bei daugiahidroksili bazi, hidrolizs reakcijas privalu rayti pakopomis. Atsiskaitymas upildyta lentel; atlikt reakcij lygtys.

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganins chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p. 3. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

35

11. Galvaniniai elementai ir elektroliz


Galvaniniai elementai Reakcijoje, kai oksidacijos ir redukcijos procesai atskiriami ir elektronai veriami nuo reduktoriaus oksidatori eiti laidu (iorine grandine), gaunama elektros srov. Chemin oksidacijos-redukcijos reakcijos energija paveriama elektros energija. rengimai, kuriuose vyksta toks energijos pasikeitimas, vadinami cheminiais elektros srovs altiniais. Paprasiausi cheminiai elektros srovs altiniai yra galvaniniai elementai. Galvaninis elementas susideda i dviej elektrod. Elektrod sudaro metalas, merktas savo druskos tirpal (elektrolit), pavyzdiui, vino ploktel vino nitrato tirpale ir cinko ploktel cinko nitrato tirpale (r. paveiksliuk). Sujungus tirpalus vamzdeliu, upildytu elektrolito tirpalu, o metalo plokteles laidu, gaunamas galvaninis elementas. merkus metal elektrolito tirpal vandenyje, tarp metalo ir tirpalo susidaro potencial skirtumas, vadinamas elektrodo potencialu. Tiesiogiai imatuoti potencial skirtum tarp metalo ir tirpalo negalima, dl to nustatomas potencial skirtumas, susidarantis tarp dviej elektrod. Elektrodu, su kuriuo lyginami metal potencialai, yra naudojamas standartinis vandenilio elektrodas, kurio potencialas imamas lygus nuliui. Standartiniu metalo potencialu 0 vadinamas elektrodo potencialas, atsirandantis pamerkus metal jo druskos tirpal, kuriame metalo jon koncentracija yra vienas molis litre tirpalo (1 M), esant 25 C temperatrai. Suraius metalus eil pagal didjanias standartini elektrodo potencial (0) reikmes, gaunama metal tamp eil (pateikta [1] altinio 125 p.) Bet kurios koncentracijos druskos tirpale metalo potencialas apskaiiuojamas pagal Nernsto lygt:
= 0 + 0,059 lg c , n

(1)

ia: 0 standartinis metalo potencialas, n metalo valentingumas, c metalo jon koncentracija druskos tirpale (mol/L). Metalo jon koncentracija apskaiiuojama taip:
c = cM nj,

ia: cM druskos tirpalo molin koncentracija, druskos disociacijos laipsnis iame tirpale (praskiestuose drusk tirpaluose jis imamas lygus vienetui), nj metalo jon skaiius, gaunamas disocijuojant vienai druskos molekulei. Galvaniniame elemente anodu yra neigiamesn potencial turintis elektrodas (aktyvesnis metalas). Anodas tirpsta (oksiduojasi, t. y. atiduoda elektronus), ir is procesas vadinamas anodiniu. Teigiamesn potencial turintis elektrodas, ant kurio teigiami metalo jonai netenka krvio (redukuojasi, t. y. prisijungia elektronus), vadinamas katodu. Katodo paviriuje vykstantis redukcijos procesas yra vadinamas katodiniu. Tarp anodo ir katodo susidaro potencial skirtumas. Tuo atveju, kai srovs stiprumas galvaniniame elemente lygus nuliui, is potencial skirtumas vadinamas galvaninio elemento elektrovaros jga EVJ ir skaiiuojamas pagal lygt: EVJ = katodo anodo. (2)

36

Supaprastinta anksiau pavaizduoto galvaninio elemento schema uraoma taip: Zn | Zn(NO3)2 || Pb(NO3)2 | Pb +. iame galvaniniame elemente anodas yra cinkas, nes 0Zn = 0,76 V, katodas vinas, nes 0Pb = 0,13 V. Vykstanios elektrochemins reakcijos yra ios: anodin katodin Zn0 2 Zn2+ (oksidacija, atidavimas), Pb2+ + 2 Pb0 (redukcija, pritraukimas).

Galvaninio elemento elektrovaros jga (EVJ) apskaiiuojama atimant i didesnio (teigiamesnio) elektrodinio potencialo maesn (neigiamesn). Galvaninio elemento, sudaryto i standartini vino ir cinko elektrod, elektrovaros jga yra: EVJ = 0,13 (0,76) = 0,63 V. Elektroliz Elektrolize vadinamas cheminis procesas, vykstantis leidiant per elektrolito tirpal arba lydal nuolatin elektros srov. Elektros srov per tirpalus pernea jonai. Vandeniniame druskos tirpale, be druskos jon, yra vandenilio (H+) ir hidroksilo (OH) jon. Elektrolizs metu prie katodo (neigiamo elektrodo) vyksta redukcija (elektron prisijungimas), prie anodo (teigiamo elektrodo) oksidacija (elektron atidavimas). Katodiniai procesai. Elektrolizje prie katodo atkeliauja tirpale esantieji teigiamieji jonai. Pirmiausia isikrauna to metalo jonai, kurio elektrodinis potencialas yra teigiamiausias. Metal drusk vandenini tirpal elektrolizje galimi trys katodinio proceso atvejai. 1. Labai aktyvi metal, kuri standartinis elektrodo potencialas yra neigiamesnis u 1,2 V (Li+, K+, + Na , Ba2+, Ca2+, Mg2+, Al3+, Ti2+), jonai i vandenini j drusk tirpal elektrolizje neisikrauna. Tuo atveju isikrauna vandenilio jonai (jei elektrolitas yra rgtus): 2H+ + 2 2H H2 arba vandens molekuls (jei elektrolitas yra neutralus arba arminis): 2H2O + 2 H2 + 2OH. (4) (3)

Elektrolizuojant labai aktyvi metal drusk vandeninius tirpalus, ant katodo skiriasi vandenilis. 2. Elektrolizuojant tirpalus, kuriuose yra metalo jon, esani aktyvumo eilje tarp titano ir vandenilio (pradedant manganu), prie katodo redukuojasi metalo jonai: Men+ + n Me. (5)

Kartu su metalo jonais isikrauna vandenilis. Vyksta (3) arba (4) reakcijos. 3. Metal, turini teigiam standartin elektrodo potencial, jonai vandenini tirpal elektrolizs metu redukuojasi katodo paviriuje, ant katodo skiriasi tik metalas. Vyksta tik (5) reakcija. Anodiniai procesai. Anodas elektrolizje gali bti tirpusis, kai jis metalinis, ir netirpusis, kai jis grafito, anglies ar kai kuri metal (pvz.: Pt, Au). 1. Kai anodas tirpusis, jis oksiduojasi, jo jonai pereina tirpal: Me n Men+. 2. Kai anodas netirpusis, prie jo atkeliauja neigiamieji jonai, kurie ir oksiduojasi (isikrauna). Pagal aktyvum oksidacijai neigiamieji jonai gali bti idstomi tokia eile:
J, Br, Cl, S2 OH, H2O, SO 2 , NO3 , ClO 4 4

37

Kai tirpale yra vairi neigiamj jon, pirmiausia isikrauna nedeguonini rgi anijonai, t. y. pirmiau isikraus J, po to Br ir t. t. Deguonini rgi anijonai i vandenini tirpal ant anodo neisikrauna, nes lengviau vyksta OH jon (arminiame elektrolite) arba vandens molekuli (rgiame arba neutraliame elektrolite) oksidacija: 4OH 4 O2 + 2H2O, 2H2O 4 O2 + 4H+. iuo atveju prie anodo skiriasi deguonis. Darbo tikslas Susipainti su galvanini element veikimo principais, sukonstruoti galvanin element, imatuoti jo praktin EVJ ir naudoti j kaip nuolatins srovs altin elektrolit vandenini tirpal elektrolizei.

Darbo eiga a) Galvaninio elemento elektrovaros jgos nustatymas Sudaromas dstytojo paskirtas galvaninis elementas i dviej skirting metal, merkt j drusk tirpalus (pvz.: cinko elektrodas merkiamas cinko druskos tirpal, o varis merkiamas vario druskos tirpal). Abu tirpalai sujungiami lenktu vamzdeliu, upildytu kalio chlorido tirpalu. Nustatoma milivoltmetro skals vert ir, prijungus prie jo elektrodus, imatuojama galvaninio elemento elektrovaros jga, t. y. potencial skirtumas tarp elektrod voltais (matavim seka yra aprayta atskirame lape, kur studentas gauna laboratorijoje). b) Natrio sulfato tirpalo elektroliz Sudaryto galvaninio elemento elektrod viel laisvieji galai leidiami U formos indel su Na2SO4 tirpalu. abi indelio puses lainama po 45 laus fenolftaleino. Einant srovei per tirpal, vyksta elektroliz ir fenolftaleino spalva prie vieno elektrodo pakinta. Skaiiavimai Apskaiiuojama sudaryto galvaninio elemento teorin elektrovaros jga. Abiej metal elektrodiniai potencialai 1 ir 2 randami pagal Nernsto formul (1):
= 0 + 0,059 lg c , n

ia: 0 standartinis metalo potencialas (r. 125 p. [1]), n metalo valentingumas, c druskos tirpalo, kur merktas metalas, molin koncentracija. Tais atvejais, kai disocijuojant elektrolitui i vienos molekuls susidaro vienas metalo jonas, tirpalo molin koncentracija kartu parodo ir metalo jon koncentracij moliais litre. Sudaryto galvaninio elemento teorin elektrovaros jga skaiiuojama pagal (2). Gauti rezultatai suraomi lentel: Galvaninio elemento schema Atsiskaitymas paraomos galvaninio elemento anodin ir katodin reakcijos; Elektrodiniai potencialai (V) 1 2 Elektrovaros jga (V) Apskaiiuota Imatuota

38

paraomos Na2SO4 tirpalo elektrolizs anodin ir katodin reakcijos, paaikinami stebti reikiniai; upildoma pateikto pavyzdio lentel.

Literatra 1. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. 2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganins chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p. 3. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

39

12. Vandens kietis ir jo minktinimas


Darbo tikslas Imokti nustatyti vandens kiet, taip pat j suminktinti. Darbo priemons ir reagentai Biurets, pipets, matavimo cilindras, matavimo kolbut, Erlenmejerio kolbuts, grtamasis vandens aldytuvas su kamiu, elektrin plytel, katijonitu upildyta stiklin kolonl. Tirpalai: Trilono B, HCl, amoniakinis buferinis tirpalas (pH 10), metiloranas, eriochromo juodasis T. 12a. Karbonatinio, pastoviojo ir bendrojo vandens kieio nustatymas Darbo eiga 1. Karbonatinio vandens kieio nustatymas Per etap nustatomas bendras vandens armingumas A ir pavirinto vandens armingumas B, liks paalinus i vandens druskas, sudaranias karbonatin vandens kiet. Abiej armingum skirtumas ir bus karbonatinis (laikinasis) vandens kietis. Kad darbas vykt spariau, i pradi matavimo kolbute tiksliai pamatuojama 100 mL tiriamo vandens, pilama vari kgin kolbut, ukemama kamiu, kuriame statytas aldytuvas ir atsargiai virinama 20 min. Virinant kalcio ir magnio hidrokarbonatai suskyla karbonatus ir nusda, vyksta reakcijos: Ca(HCO3)2 Mg(HCO3)2 Kol vanduo verda, nustatomas bendras vandens armingumas A. Tam tikslui kgin kolbut pilama matavimo kolbute tiksliai pamatuota nauja 100 mL tiriamo vandens porcija, lainami 34 laai metilorano ir titruojama 0,1 N HCl tirpalu, kol geltona spalva tampa oranine. Usiraomas titravimui sunaudotas tikslus HCl tris V1. Pirm kart titruojant druskos rgtimi vyksta reakcijos: Ca(HCO3)2 + 2HCl Mg(HCO3)2 + 2HCl NaHCO3 + HCl Jeigu dar nesibaig nurodytas vandens virinimo laikas, galima nustatyti bendrj vandens kiet (r. 2 punkt). Pavirinus vanden 20 min., vanduo atauinamas iki kambario temperatros po alto vandens srove (sekti, kad vandentiekio vanduo nepatekt kolb). Susidariusios nuosdos nufiltruojamos. Kolbut, kurioje buvo virinamas vanduo, du kartus praskalaujama distiliuotu vandeniu ir is vanduo upilamas ant filtro. filtrat lainami 34 laai metilorano ir titruojama 0,1 N HCl tirpalu. Usiraomas titravimui sunaudotas tikslus HCl tris V2. iuo atveju su druskos rgtimi reaguoja vandenyje likusios armins mediagos, nustatomas liks vandens armingumas B. Antr kart titruojant HCl, vyksta reakcija: NaHCO3 + HCl 2. Bendrojo vandens kieio nustatymas kgin kolbut pilama 100 mL tiriamo vandens, pridedama 5 mL amoniakinio buferinio tirpalo (matuoti cilindru), truputis sauso indikatoriaus eriochromo juodojo T ir, intensyviai maiant, neskubant, titruojama trilono B tirpalu, kol rausva spalva virsta mlyna. Paymimas tikslus sunaudoto trilono B tris V3. 3. Pastoviojo vandens kieio nustatymas Kadangi bendrasis vandens kietis yra laikinojo ir pastovaus vandens kiei suma, pastovusis vandens kietis apskaiiuojamas taip: i bendro vandens kieio atimamas karbonatinis kietis.

40

Skaiiavimai 1. Vandens bendrasis armingumas A:


A= V1 N1 1000 , V

ia: V tyrimui paimtas vandens tris (V = 100 mL), N1 titravimui naudotos HCl normalingumas, V1 pirm kart titruojant sunaudotas HCl tris. Vandenyje liko armins mediagos B:
B= V1 N 2 1000 , V

ia: V2 pavirinto vandens titravimui sunaudotas HCl tris. Karbonatinis kietis KK: KK = A B (mekv/L). 2. Bendrasis vandens kietis BK:
BK = V3 N 2 1000 (mekv/L), V

ia: V3 titravimui sunaudotas trilono B tris, N3 trilono B normalingumas. 3. Pastovusis vandens kietis PK: PK = BK KK (mekv/L). 12b. Vandens minktinimas Darbo eiga Nustatomas tiriamojo vandens bendrasis kietis kompleksonometriniu metodu su Trilonu B (r. ankiau aprayto darbo punkt 2). Kitas to paties vandens bandinys suminktinamas: imama apie 200 mL vandens ir jis praleidiamas per katijonitu upildyt stiklin kolonl. Vl nustatomas per kolonl prajusio vandens kietis tuo paiu metodu. Apskaiiuojama, keliais miliekvivalentais sumajo vandens kietis. Atsiskaitymas paraomos vandens titravimo ir minktinimo reakcijos; pateikiamos laikinojo, pastovaus ir bendrojo vandens kiei apskaiiuotos reikms, padaroma ivada apie vandens kiet; atliekant 12 b darb, pateikiamos bendrojo vandens kieio reikms prie ir po minktinimo.

41

12c. varaus vandens gavimas ir jo kokybs kontrol Darbo tikslas Susipainti su varaus vandens gavimo bdais, pagaminti nedidel kiek tokio vandens ir nustatyti jo varumo laipsn. Darbo priemons ir reagentai Stiklinis vandens distiliavimo renginys, katijonito ir anijonito miiniu upildyta stiklin kolonl, laidumo matuoklis, pH-metras, stiklinl. Reagentai ir tirpalai: 0,01 N Trilono B tirpalas, amoniakinis buferinis tirpalas (pH 10), eriochromo juodojo T indikatorius. Darbo eiga Pridistiliuojama apie 200 mL vandens. Kol vyks distiliacija, imatuojamas vandentiekio vandens savitasis elektros laidis (SEL) (matavim seka yra aprayta atskirame lape, kur studentas gauna laboratorijoje), pH (t. p.) ir kompleksonometriniu metodu nustatomas jo bendrasis kietis (r. 12 a darbo 2 punkt). Tos paios analits nustatomos distiliuotame vandenyje ir palyginami gauti rezultatai. Vandentiekio vanduo praleidiamas per jonit miinio kolonl ir vl nustatomos tos paios analits. Gauti rezultatai suraomi lentel. Vanduo Vandentiekio Distiliuotas Dejonizuotas SEL, S/cm pH Bendrasis kietis, mekv/L

Lyginami gauti rezultatai. Kuris vanduo yra varesnis? Atsiskaitymas upildoma pateikto pavyzdio lentel, padaromos ivados.

Literatra 1. 2. 3. 4. Girien, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p. Stulpinas, B. ir kt. Bendrosios chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Mokslas, 1985. 147 p. Buineviien, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p. Jankauskas, J.. Vandens chemija (paskait konspektas). Vilnius: Technika, 1990. 93 p.

42

13. Neorganini gryninimas


Darbo tikslas

ir

organini

mediag

Susipainti su paprasiausiais chemini mediag gryninimo metodais ir technika. Darbo priemons ir reagentai Stiklinis distiliavimo renginys, elektrin plytel, areometras (spiritometras), apvaliadugn kolba, 400500 mL stiklins, graduotas cilindras. Reagentai: denatruotas spiritas, jodo ir smlio miinys a) Distiliavimas Areometru imatuojamas denatruoto spirito tankis, o spiritometru jo stiprumas (trio procentais). Prirenkama apie 100 mL distiliato ir vl nustatomi jo tankis ir stiprumas. Distiliuojant ufiksuojama temperatra, kuriai esant vyksta distiliacija, ir ji lyginama su teorine etanolio virimo temperatra. b) Sublimavimas (darbas atliekamas traukos spintoje) 400 500 mL saus stiklin beriama apie 1 g jodo ir smlio miinio (pasveriama ant laboratorini svarstykli 0,01 g tikslumu), ir stiklin pastatoma ant elektrins plytels. apvaliadugn kolb pilama i krano alto vandens ir ji pastatoma ant stiklins su jodo ir smlio miiniu. jungiama plytel ir stebima, kaip vyksta jodo sublimavimasis. Sublimavimas baigiamas, kai stiklinje nelieka bdingos spalvos jodo gar. Stiklin su apvaliadugne kolba nukeliama nuo plytels ir pastatoma ant asbesto. Ant apvaliadugns kolbos dugno susidar jodo kristalai surenkami ir pasveriami. Taip pat pasveriamas ir stiklinje liks smlis. Apskaiiuojama, kiek procent jodo ir kiek procent smlio buvo miinyje. Atsiskaitymas atlikto laboratorinio darbo apraymas; pateikiama smlio ir jodo miinio procentin sudtis; etilo alkoholio praktin virimo temperatra.

Literatra 1. Daukas, K.; Ramanauskas, E. Neorganin sintez. Vilnius: Mintis, 1970. 203 p. 2. , . . : , 1971. 272 .

43

Analizin chemija

Laboratoriniai darbai ana Bumelien, Rta Granien, Juozas Jankauskas


Analizini operacij atlikimo technika ir priemons

Kokybin analiz tai vairi metod taikymas cheminei mediagai identifikuoti. Neorganin kokybin analiz nagrinja katijon (teigiamj) ir anijon (neigiamj) jon radim. Imokus atlikti pavieniams jonams bdingas reakcijas, galima analizuoti katijon ir anijon miinius. Analizins reakcijos atliekamos pridedant tiriamj tirpal reagent, sudarani su iekomuoju jonu bdingus produktus. ios reakcijos vadinamos bdingosiomis jono reakcijomis. Jas galima atlikti mgintuvliuose, la arba mikrokristaloskopiniu metodais. Mikrokristaloskopins reakcijos. Ant objektinio stiklelio tiriamojo tirpalo laas sumaiomas su reagento lau ir susidar kristalai stebimi pro mikroskop. Bdingiausi kristalai gaunami, kai jie formuojasi ltai. Laai ant objektinio stiklelio dedami vienas alia kito ir, perbraukiant stikline lazdele, sujungiami. La reakcijos atliekamos ant filtravimo popieriaus lapeli lainant tiriamojo tirpalo ir reagento laelius. Kokybinei analizei daniausiai taikomos tokios operacijos: ildymas ir garinimas, nuosd nusodinimas, j atskyrimas nuo tirpalo, centrifugavimas, nuosd perplovimas, nuosd tirpinimas. ildant ir garinant naudojamos spiritins lemputs, elektrins plytels bei vandens vonios. Daniausiai ildoma centrifuginiuose mgintuvliuose, panardinant juos vandens voni. Atliekant analiz, tirpal danai reikia koncentruoti (sumainti jo tr) arba j sausai igarinti. Tam naudojamos porcelianins lktels, tigliai arba laikrodinis stiklas. Jeigu skyst reikia igarinti sausai, ildymas nutraukiamas dar prie baigiant skysiui visikai igaruoti, nes stiklelis gali skilti. Nusodinimas atliekamas centrifuginiuose mgintuvliuose. mgintuvl pilamas reikalingas tiriamojo tirpalo kiekis. Preliminariai, i vadovlio susipainus su nusodinimo reakcijos atlikimo slygomis, sudaroma atitinkama terp ir temperatra. Terps reakcija patikrinama indikatoriaus popierliu: analizuojamas tirpalas pamaiomas stikline lazdele ir ios lapios lazdels galu palieiamas indikatoriaus popierlis. Mgintuvlis su tirpalu, jeigu reikia, 35 min. panardinamas vandens voni (paildomas). Paskui, maiant tirpal, j lainamas nusodinantis reagentas, kol nebesusidaro nuosdos. Nuosdoms leidiama nussti arba jos centrifuguojamos. Jeigu, dar pridjus nusodinanio reagento tirpalo la, vir nuosd esantis skaidrus skystis nesidrumsia, daroma ivada, kad jonai yra visikai nusodinti. Centrifugavimas. Nuosdos atskiriamos nuo tirpalo filtruojant arba centrifuguojant. centrifug vienas prieais kit dedamas porinis skaiius vienod matmen kgini mgintuvli. juos turi bti pripilti vienodi tirpal kiekiai, paliekant ne maiau kaip 10 mm iki mgintuvlio viraus. pylus daugiau skysio, jis gali isitakyti bei uterti greta esanius mgintuvlius ir centrifug. Centrifuguojama 12 minutes. Ijungus centrifug, btina palaukti, kol rotorius su mgintuvliais visikai sustos, ir tada mgintuvlius iimti. Negalima mgintuvli palikti centrifugoje, nes taip ji gadinama. Po centrifugavimo nuosdos susikaupia mgintuvlio dugne. Skaidrus skystis vir nuosd vadinamas centrifugatu. Jeigu nuosdos bna labai gerai nusdusios, centrifugat galima nusiurbti pipete arba atsargiai perpilti kit var mgintuvl. Skysio nupilimas nuo nuosd vadinamas dekantavimu. Nuosd perplovimas. Ant nuosd upilama perplauti naudojamo skysio, stikline lazdele gerai sumaioma ir centrifuguojama. Centrifugatas ipilamas. Taip nuosdos perplaunamos 23 kartus, naudojant vis nauj plovimo skysio porcij.

44

1. I ir II analizini grupi katijon miinio analiz


Darbo tikslas I ir II analizini grupi katijon pusiau mikroanaliz rgi ir bazi metodu. Katijonams bding chemini reakcij uraymas. Paviens katijon radimo reakcijos. I ir II analizini grupi katijon miinio analiz. Tyrimo objektas Pirmoji analizin katijon grup: Na+, K+, NH4+, Mg2+. Grupinio reagento neturi. Antroji analizin katijon grup: Ba2+, Ca2+. Grupinis reagentas yra praskiesta sieros rgtis. Analizuojant tik III grupes, grupiniu reagentu gali bti ir (NH4)2CO3. I ir II analizini grupi katijon miinio tirpalas. Darbo priemons Cilindrinis ir kginis mgintuvliai; laikrodinis ir objektinis stikleliai; kapiliarins pipets; filtravimo popieriaus lapeliai; vandens ildymo vonia; stiklin mentel; mikroskopas; centrifuga. Skirstant sudting analizuojamj miin atskiras analizines grupes rgi ir bazi metodu, kaip pagrindas imama katijon sveika su sieros ir druskos rgtimis, susidarant netirpiems junginiams, sveika su armais ir amoniaku, susidarant tipikiems arba amfoterikiems hidroksidams, arba remiamasi pavieni katijon savybe sudaryti su amoniaku kompleksinius junginius. Pagal tai, kaip katijonai reaguoja su rgtimis ir armais, jie skirstomi 6 grupes (1 lentel).
1 lentel. Katijon skirstymas analizines grupes rgi ir bazi metodu

Grups charakteristika Grup ir katijono simbolis

Vandenyje tirps chloridai, sulfatai ir hidroksidai Pirma Na+, K+, NH4+, Mg2+ Nra

Vandenyje netirps sulfatai Antra Ba2+, Ca2+, Sr2+ H2SO4, (NH4)2CO3 BaSO4, CaSO4, SrSO4

Vandenyje netirps chloridai Treia Ag+, Pb2+, Hg 2 + 2

Amfoteriniai hidroksidai, tirps arm pertekliuje

Hidroksidai, netirps arm pertekliuje

Hidroksidai, tirps amoniako pertekliuje

Grupinis reagentas Susidar junginiai

HCl AgCl, Hg2Cl2, PbCl2

Ketvirta Zn2+, Al3+, Cr3+, Sn2+, Sn4+, As3+, As5+ NaOH, H2O2 [Al(OH)4], [Zn(OH)4]2, CrO 2 , 4 [Sn(OH)6]2, AsO 3 4

Penkta Mn2+, Fe2+, Fe3+, Bi3+, Sb3+, Sb5+ NH3, H2O2 Mn(OH)2, Bi(OH)3, Fe(OH)3, Sb(OH)3, H3SbO4

eta Ni2+, Co2+, Cu2+, Cd2+, Hg2+ NH3, H2O2 [Co(NH3)6]2+, [Ni(NH3)6]2+, [Cu(NH3)4]2+, [Cd(NH3)4]2+, [Hg(NH3) 4]2+

Darbo eiga

Paraomos bdingosios katijon (2 lentel, Nr. 3) radimo chemins reakcijos (2 lentel, Nr. 4). Paskui atliekamos paviens katijon radimo reakcijos (2 lentel, Nr. 5). Toliau atliekama I ir II grupi katijon neinomos sudties miinio analiz (2 lentel, Nr. 5, 4).

45

2 lentel. I ir II analizini grupi katijon radimo analiziniai signalai

Analizin Grupinis grup reagentas 1


I

Katijonas 3 NH + 4

2 nra

5 Reakcija su natrio armu mgintuvl lainami 4 laai NH + + NaOH 4 tiriamojo tirpalo, pridedami 5 NH3 + H2O laai 2 N NaOH tirpalo. lakmuso popierlis Mgintuvlis atsargiai pamlynuoja paildomas vandens vonelje. Vir mgintuvlio laikoma distiliuotu vandeniu suvilgyta raudonojo lakmuso juostel. Jeigu tirpale yra NH + jon, 4 lakmuso juostel pamlynuoja. Uostant jauiamas isiskirianio amoniako kvapas. 4 NH + 6CH2O 2K+ + Na2[PbCu(NO2)6]
kubo formos juodi arba rudi kristalai
+ 4

Katijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4

Darbo eiga

nra

K+

Pastaba. Amonio jonai trukdo nustatyti K+ jonus mikrokristaloskopine reakcija. Todl naudojamasi formaldehido savybe sujungti amonio jonus urotropin (CH2)6N4. 5 laus tiriamojo tirpalo pridedami 4 laai formalino tirpalo.

nra

Na+

Mikrokristaloskopin reakcija Ant objektinio stiklelio ulainamas laas tiriamojo tirpalo ir greta laas dinatriovino-vario heksanitrito tirpalo. Abu laai stikline lazdele sujungiami ir, jeigu tirpale yra K+ jon, po kurio laiko susidaro pro mikroskop matomi juodi arba rudi kubo formos K2[PbCu(NO2)6] kristalai. Mikrokristaloskopin reakcija Na+ + Ant objektinio stiklelio Zn(CH3COO)23UO2(CH3COO)2 + ulainamas laas tiriamojo tirpalo ir greta laas cinko uranilo CH3COOH + 9H2O acetato tirpalo, pargtinto acto viesiai geltoni tetraedr arba rgtimi. Abu laai stikline oktaedr formos kristalai lazdele sujungiami ir, jeigu tirpale yra Na+ jon, po kurio laiko susidaro pro mikroskop matomi viesiai geltoni tetraedr arba oktaedr formos natrio cinko uranilo acetato NaZn(UO2)3(CH3COO)9 9H2O kristalai.
Pastaba. Jei tiriamoje mediagoje yra K+, gali susidaryti ilg adat pavidalo kristalai. Tokiu atveju

46

Analizin Grupinis grup reagentas 1 2

Katijonas 3

Katijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4

Darbo eiga 5
patartina dal tiriamojo tirpalo 23 kartus praskiesti vandeniu ir tuomet atlikti reakcij.

nra

Mg2+

Mg2+ + Na2HPO4 + NH4OH

II

(NH4)2CO3

H2SO4,

Ba2+

Reakcija su dinatrio hidrofosfatu Ant objektinio stiklelio baltos kristalins ulainami 12 laai tiriamojo nuosdos tirpalo, pridedami 23 laai 2 M HCl, 1 laas 1 M dinatrio hidrofosfato tirpalo ir, atsargiai maiant stikline lazdele, pridedamas 2 M NH3 iki jauiamo amoniako kvapo (pH ~ 9). Jeigu tirpale yra Mg2+ jon, susidaro baltos magnio amonio fosfato kristalai kristalai MgNH4PO4 6H2O kristalins praskiestame koncentruotame nuosdos, kurios stebimos tirpale (lta tirpale (greita mikroskopu. kristalizacija) kristalizacija Reakcija su kalio dichromatu 2Ba2+ + K2Cr2O7 + H2O + mgintuvl lainami 12 laai 2CH3COONa tiriamojo tirpalo, 34 laai natrio acetato ir 12 laai K2Cr2O7. geltonos nuosdos Mgintuvlis ildomas vandens vonioje. Jeigu tirpale yra Ba2+ jon, susidaro bario chromato BaCrO4 geltonos nuosdos.
Pastaba. BaCrO4 tirpsta rgtyse (netirpsta acto rgtyje), todl, atliekant reakcij, btina pridti CH3COONa, kad laisvi H+ jonai bt sujungti silpnos acto rgties molekules.

II

(NH4)2CO3

H2SO4

Ca2+

Ca2+ + (NH4)2C2O4

Reakcija su amonio oksalatu mgintuvl lainami 12 laai tiriamojo tirpalo, pridedami 34 baltos nuosdos laai 6 M NH3 ir 2 laai amonio oksalato tirpalo. Jeigu tirpale yra Ca2+ jon, isiskiria baltos kalcio nuosdos. oksalato CaC2O4 Nuosdos tirpsta stipriose rgtyse, netirpsta acto rgtyje.
Pastaba. Trukdo Ba2+ jonai. BaC2O4 nuosdos tirpsta acto rgtyje.

Ca + H2SO4 + H2O
baltos adatli arba rombo bei suaugusi dvyni formos kristalai

2+

Mikrokristaloskopin reakcija Ant objektinio stiklelio ulainamas laas tiriamojo tirpalo ir greta laas 2 N sieros rgties tirpalo. Abu laai stikline lazdele sujungiami ir

47

Analizin Grupinis grup reagentas 1 2

Katijonas 3

Katijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4

Darbo eiga 5 paliekama pastovti. Jeigu tirpale yra nedaug Ca2+ jon, isiskiria ilgos pro mikroskop matomos CaSO4 2H2O gipso adatls, o jei daugiau, susidaro rombai arba suaug dvyniai.

kristalai praskiestame tirpale (lta kristalizacija)

kristalai koncentruotame tirpale (greita kristalizacija)

Atsiskaitymas

- paraomos bdingosios katijon radimo chemins reakcijos; - I ir II grupi katijon neinomos sudties miinio analizs rezultatai uraomi 3 lentelje pateikta forma:
3 lentel. I ir II analizini grupi katijon miinio analiz

Analizin Katijon radimo bdingais grup, reagentais chemins reakcijos ir reagentas analiziniai signalai I Mg2+ + Na2HPO4 + NH3 Na2HPO4, MgNH4PO4 + 2Na+ NH3 baltos
kristalins nuosdos

Reakcijos atlikimo slygos

Pastebjimai baltos

Atpaintas katijonas Mg2+

Reakcija vyksta Susidaro amoniakinio buferio kristalins terpje. nuosdos Trukdo jonai, sudarantys maai tirpius fosfatus. Netrukdo jonai: NH + , K+, 4 Na+

Literatra

1. Daukas, K. Kokybin analiz. Vilnius: Mintis, 1965. 319 p. 2. kadauskas, J. Katijon ir anijon radimas tirpaluose. Mokomoji priemon. Vilnius: VU, 1997, p. 1014, 2024. 3. , . .; , . .; , . . . . : . . : B. ., 2001, c. 1629.

48

2. III ir IV analizini grupi katijon miinio analiz


Darbo tikslas

III ir IV analizini grupi katijon pusiau mikroanaliz rgi ir bazi metodu. Katijon bding chemini reakcij raymas. Paviens katijon radimo reakcijos. III ir IV analizini grupi katijon miinio analiz.
Tyrimo objektas Treioji analizin katijon grup: Ag+, Pb2+, Hg 2+ . Grupinis reagentas yra praskiesta druskos rgtis, 2 su kuria ie katijonai sudaro maai tirpias vandenyje chlorid nuosdas: AgCl, PbCl2, Hg2Cl2. Taip III analizin katijon grup atskiriama nuo IV. Ketvirtoji analizin katijon grup: Al3+, Cr3+, Zn2+. Tai amfoterini metal katijonai, kuri hidroksidai arm pertekliuje sudaro vandenyje tirpias druskas: NaAlO2, NaCrO2, Na2ZnO2. III ir IV analizini grupi katijon miinio tirpalas. Darbo priemons

Cilindrinis ir kginis mgintuvliai; laikrodinis ir objektinis stikleliai; kapiliarins pipets; filtravimo popieriaus lapeliai; vandens ildymo vonia; stiklin mentel; mikroskopas; centrifuga. Kokybin analiz tai vairi metod taikymas cheminei mediagai identifikuoti. Neorganin kokybin analiz nagrinja katijon (teigiamj) ir anijon (neigiamj) jon radim. Skirstant sudting analizuojamj miin atskiras analizines grupes rgi ir bazi metodu, kaip pagrindas imama katijon sveika su sieros ir druskos rgtimi, susidarant netirpiems junginiams, sveika su armais ir amoniaku, susidarant tipikiems arba amfoterikiems hidroksidams, arba remiamasi atskir katijon savybe sudaryti su amoniaku kompleksinius junginius. Pagal tai, kaip katijonai reaguoja su rgtimis ir armais, jie skirstomi 6 grupes (1 lentel).
1 lentel. Katijon skirstymas analizines grupes rgi ir bazi metodu

Vandenyje Grups tirps chloridai, charaksulfatai ir teristika hidroksidai Pirma Grup ir Na+, K+, NH + , 4 katijono Mg2+ simbolis Grupinis reagentas Susidar junginiai Nra

Amfoteriniai Hidroksidai, Hidroksidai, hidroksidai, netirps arm tirps amoniako tirps arm pertekliuje pertekliuje pertekliuje eta Penkta Antra Ketvirta Treia Ba2+, Ca2+, Ag+, Pb2+, Zn2+, Al3+, Cr3+, Mn2+, Bi3+, Fe2+ Ni2+, Co2+, Cu2+, Sr2+ Cd2+, Hg2+ Sn2+, Sn4+, As3+, Fe3+, Sb3+, Sb5+ Hg 2 + 2 5+ As H2SO4, NH3, H2O2 NH3, H2O2 HCl NaOH, (NH4)2CO3 H2O2 [Co(NH3)6]2+, Mn(OH)2, BaSO4, AgCl, [Al(OH)4], 2 CaSO4, SrSO4 Hg2Cl2, Bi(OH)3, [Ni(NH3)6]2+, [Zn(OH)4] , 2 Fe(OH)3, [Cu(NH3)4]2+, PbCl2 CrO 4 , Sb(OH)3, [Cd(NH3)4]2+, [Sn(OH)6]2, H3SbO4 [Hg(NH3)4]2+ AsO 3 4

Vandenyje netirps sulfatai

Vandenyje netirps chloridai

Darbo eiga

Paraomos bdingosios katijon (2 lentel, Nr. 3) radimo chemins reakcijos (2 lentel, Nr. 4). Tada atliekamos paviens katijon radimo reakcijos (2 lentel, Nr. 5). Toliau atliekama III ir IV grupi katijon neinomos sudties miinio analiz (2 lentel, Nr. 5, 4).

49

III analizins grups atskyrimas nuo IV. centrifugin mgintuvl pilama 3 mL tiriamojo tirpalo ir III grup nusodinama praskiesta 2 N HCl. Vyksta reakcijos:

Ag+ + HCl Hg 2 + + HCl 2 Pb2+ + HCl Gautos nuosdos (AgCl, PbCl2, Hg2Cl2) centrifuguojamos ir 12 kartus perplaunamos altu distiliuotu vandeniu, kur lainama pora la 2 M HCl. Gautas centrifugatas, kuriame yra IV grup, paliekamas tolesnei analizei.
2 lentel. III ir IV analizini grupi katijon radimo analiziniai signalai

Analizin Grupinis Katijon radimo bdingais reagentais Katijonas grup reagentas chemins reakcijos ir analiziniai signalai 1 2 3 4
III

Darbo eiga

HCl

Pb2+

III

HCl

Hg 2 + 2

III

HCl

Ag+

5 Nuosd analiz. Pb2+ radimas Nuosdos mgintuvlyje upilamos distiliuotu vandeniu ir, retkariais maiant, ildomos vandens vonioje. PbCl2 tirpsta kartame vandenyje. Keli laai karto tirpalo, esanio vir nuosd, pipete perkeliami kit mgintuvli ir tirpale iekomas Pb2+ jonas. 2+ Reakcija su kalio dichromatu 2Pb + K2Cr2O7 + H2O mgintuvl lainami 23 laai geltonos nuosdos tiriamojo tirpalo ir 23 laai K2Cr2O7. Jeigu tirpale yra Pb2+ jon, susidaro maai tirpios geltonos vino chromato PbCrO4 nuosdos. Nuosd analiz. Hg 2+ 2 + NH 4 + H2O = NH3 + H3O+ radimas Likusios mgintuvlyje Hg2Cl2 nuosdos upilamos 6 N NH3 Hg2Cl2 +2NH3 pertekliumi ir ildoma vandens nuosdos pajuoduoja vonioje. Jeigu tirpale yra Hg 2 + 2 jon, susidaro miinys: juodos Hg ir HgNH2Cl nuosdos. + + Ag+ radimas NH 4 + H2O = NH3 + H3O AgCl nuosdos tirpsta koncentruotame amoniake. AgCl + 2NH3 + Reakcija su kalio jodidu Gaut jungin ([Ag(NH3)2]Cl) paveikiame KI tirpalu. Susidaro [Ag(NH3)2]Cl + KI + 2H2O viesiai geltonos AgI nuosdos.
viesiai geltonos nuosdos Pastaba. Jeigu chlorid nuosdos nuo NH3 + H2O pajuodavo, o sidabro rasti bdingomis reakcijomis nepavyko, jo reikia iekoti juodose nuosdose.

50

Analizin Grupinis Katijon radimo bdingais reagentais Katijonas Darbo eiga grup reagentas chemins reakcijos ir analiziniai signalai 1 2 3 4 5 Centrifugato analiz Al3+ + NaOH + H2O2 NaOH, IV Zn2+ + NaOH + H2O2 Reakcija su alizarinu H2O2 Cr3+ + NaOH + H2O2 Reagentas su Al3+ jonais sudaro 3+ raudonos spalvos jungin, Al Al3+ + C14H6O2(OH)2 raudonos spalvos aliuminio lakas netirpstant acto rgtyje. Ant filtravimo popieriaus lapelio ulainamas tiriamojo tirpalo laas ir gauta dm 13 min. laikoma vir indo, kuriame yra koncentruotas amoniako tirpalas, kad susidaryt aliuminio hidroksidas. Paskui greta dms lainamas alizarino spiritinio tirpalo laas. Vl palaikoma amoniako garuose. Esant Al3+ jonams, la susilietimo vietoje atsiranda raudona dm.
Pastaba. Reakcija nra specifin. Al3+ surasti iuo reagentu trukdo Sn2+, Fe3+, Zn2+. Norint paalinti j tak, kelet tiriamojo tirpalo la pridedama 2 M NaOH iki stipriai armins reakcijos. Jeigu isiskiria nuosd, jos centrifuguojamos, centrifugate iekoma Al3+ jon.

IV

NaOH, H2O2

Zn2+

Zn2+ + (NH4)2[Hg(SCN)4]

Mikrokristaloskopin reakcija Ant objektinio stiklelio ulainamas acto rgtimi balti kristalai pargtinto tiriamojo tirpalo laas ir amonio tetrarodano merkurato (NH4)2[Hg(SCN)4] tirpalo laas. Abu laai stikline lazdele sujungiami ir, jeigu tirpale yra Zn2+ jon, po kurio laiko susidaro pro mikroskop matomi balti cinko tetrarodano merkurato Zn[Hg(SCN)4] kristalai.
Pastaba. Jei tiriamosios mediagos tirpale yra Cu2+ arba Co2+ jon, nurodytu reagentu iekant cinko, gali ikristi sudtingesni jungini nuosdos: Cu[Hg(SCN)4] Zn[Hg(SCN)4] rausvai alsvos spalvos, Co[Hg(SCN)4] Zn[Hg(SCN)4] violetins, ydros spalvos.

kristalai koncentruotame tirpale (greita kristalizacija)

kristalai praskiestame tirpale (lta kristalizacija)

IV

NaOH, H2O2

Cr3+

2NaCrO2 + 3H2O2 + 2NaOH

Reakcija su vandenilio arba natrio peroksidu mgintuvl lainami 23 laai geltonos spalvos tirpalas tiriamojo tirpalo, pridedami 45 laai 2 M NaOH, 68 laai 3 %

51

Analizin Grupinis Katijon radimo bdingais reagentais Katijonas grup reagentas chemins reakcijos ir analiziniai signalai 1 2 3 4

Darbo eiga 5 H2O2 tirpalo ir paildoma, kol alsva tirpalo spalva pereina gelton, bding CrO 2 jonui. 4

Atsiskaitymas - paraomos bdingosios katijon radimo chemins reakcijos; - III ir IV grupi katijon neinomos sudties miinio analizs rezultatai uraomi 3 lentelje pateikta forma:
3 lentel. III ir IV analizini grupi katijon miinio analiz

Analizin Katijon radimo bdingais Reakcijos atlikimo slygos grup, reagentais chemins reakcijos reagentas ir analiziniai signalai Reakcijai trukdo Ba2+, Sr2+, III 2Pb2+ + H2O + K2Cr2O7 HCl Bi3+, Hg2+, Ag+ jonai, kurie 2PbCrO4 + 2K+ + 2H+ su chromato jonais sudaro geltonos nuosdos spalvotas nuosdas Literatra

Pastebjimai Susidaro maai tirpios geltonos vino chromato nuosdos

Atpaintas katijonas Pb2+

1. Daukas, K. Kokybin analiz. Vilnius: Mintis, 1965. 319 p. 2. kadauskas, J. Katijon ir anijon radimas tirpaluose. Mokomoji priemon. Vilnius: VU, 1997. p. 1419, 2432. 3. , . . ; , . .; , . . . . : . . : B. ., 2001, c. 2950.

52

3. V ir VI analizini grupi katijon miinio analiz


Darbo tikslas

V ir VI analizini grupi katijon pusiau mikroanaliz rgi ir bazi metodu. Parayti katijon chemines reakcijas su bdingais reagentais. Paviens katijon radimo reakcijos. V ir VI analizini grupi katijon miinio analiz.
Tyrimo objektas

Penktoji analizin katijon grup: Fe3+, Mn2+. Grupinis reagentas NH4OH ir H2O2, su kuriais ie katijonai sudaro hidroksidus, netirpstanius nei stipri, nei silpn bazi tirpaluose. Tokiu bdu V katijon analizin grup atskiriama nuo VI. etoji analizin katijon grup: Cu2+, Co2+, Ni2+. ios grups katijon hidroksidai tirpsta amoniako pertekliuje, susidarant amoniakiniams kompleksams. V ir VI analizini grupi katijon miinio tirpalas.
Darbo priemons Cilindrinis ir kginis mgintuvliai; laikrodinis ir objektinis stikleliai; kapiliarins pipets; filtravimo popieriaus lapeliai; vandens ildymo vonia; stiklin mentel; mikroskopas; centrifuga. Kokybin analiz tai vairi metod taikymas cheminei mediagai identifikuoti. Neorganin kokybin analiz nagrinja katijon (teigiamj) ir anijon (neigiamj) jon radim. Skirstant sudting tiriamj miin atskiras analizines grupes rgi ir bazi metodu, kaip pagrindas imama katijon sveika su sieros ir druskos rgtimi, susidarant netirpiems junginiams, sveika su armais ir amoniaku, susidarant tipikiems arba amfoterikiems hidroksidams, arba remiamasi kai kuri katijon savybe sudaryti su amoniaku kompleksinius junginius. Pagal tai, kaip katijonai reaguoja su rgtimis ir armais, jie skirstomi 6 grupes (1 lentel).
1 lentel. Katijon skirstymas analizines grupes rgi ir bazi metodu

Grups charakteristika Grup ir katijono simbolis Grupinis reagentas Susidar junginiai

Vandenyje Amfoteriniai Vandenyje Vandenyje Hidroksidai, Hidroksidai, tirps chloridai, hidroksidai, netirps netirps netirps arm tirps amoniako sulfatai ir tirps arm sulfatai chloridai pertekliuje pertekliuje hidroksidai pertekliuje Ketvirta Treia Pirma Antra Penkta eta + + + Ba2+, Ca2+, Ag+, Pb2+, Zn2+, Al3+, Cr3+, Mn2+, Fe2+, Ni2+, Co2+, Cu2+, Na , K , NH 4 , Sr2+ Sn2+, Sn4+, As3+, Fe3+, Bi3+, Sb3+, Cd2+, Hg2+ Hg 2 + Mg2+ 2 As5+ Sb5+ H2SO4, HCl NaOH + H2O2 Nra NH3 + H2O2 NH3 + H2O2 (NH4)2CO3 AgCl, [Al(OH)4] , BaSO4, [Co(NH3)6]2+, Mn(OH)2, 2 Hg2Cl2, CaSO4, [Zn(OH)4] , Bi(OH)3, [Ni(NH3)6]2+, SrSO4 PbCl2 Fe(OH)3, [Cu(NH3)4]2+, CrO 2 , 4 Sb(OH)3, [Cd(NH3)4]2+, [Sn(OH)6]2, H3SbO4 [Hg(NH3) 4]2+ AsO 3 4

53

Darbo eiga Paraomos bdingosios katijon (2 lentel, Nr. 3) radimo chemins reakcijos (2 lentel, Nr. 4). Paskui atliekamos paviens katijon radimo reakcijos (2 lentel, Nr. 5). Toliau atliekama V ir VI grupi katijon neinomos sudties miinio analiz (2 lentel, Nr. 5, 4). V analizins grups katijonai trukdo VI grups katijonams nustatyti. Todl prie analizuojant miin, grupes reikia atskirti. V analizins grups atskyrimas nuo VI. centrifugin mgintuvl pilama 3 mL tiriamo tirpalo ir, maiant stikline lazdele, lainamas 6 N NH4OH tirpalas tol, kol vir nuosd atsiranda mlynas skaidrus tirpalas. Centrifuguojama. Nuosdose gali bti Fe(OH)3 ir Mn(OH)2, centrifugate VI analizins grups katijon amoniakiniai kompleksiniai junginiai. Fe3+ ir Mn2+ galima nustatyti pradiniame tirpale arba itirpinus nuosdas 2 N HCl tirpale.
2 lentel. V ir VI analizini grupi katijon radimo analiziniai signalai

Analizin grup 1 V

Grupinis reagentas 2 NH3, H2O2

Katijonas 3 Fe3+

Katijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4

Darbo eiga 5 Reakcija su kalio arba amonio tiocianatais Ant filtravimo popieriaus ulainamas tiriamojo tirpalo laas ir greta dms dedamas amonio (kalio) tiocianato (rodanido) laas. Esant Fe3+ jonams, la susilietimo vietoje atsiranda raudona geleies tiocianato Fe(SCN)3 dm. Reakcija su kalio heksacianoferatu (II) Keli laai tiriamojo tirpalo veikiami keliais laais kalio heksacianoferato (II) K4[Fe(CN)6]. Jeigu tirpale yra Fe3+ jon, susidaro amorfins mlynos nuosdos (Berlyno mlynasis). Reakcija su natrio bismutatu mgintuvl lainami 12 laai tiriamo tirpalo, 23 laai 6 N HNO3 tirpalo, 58 laai vandens, tada pateliu beriama truputis NaBiO3 milteli, supurtoma ir paliekama stovti. Jeigu tirpale yra Mn2+ jon, prajus kelioms minutms tirpalas pasidaro raudonai violetinis.
Pastaba. Reakcijai gali kenkti Cl ir Br jonai, kurie suardo

Fe3+ + 3NH4SCN
raudonos spalvos tirpalas

Fe3+ + K4[Fe(CN)6]
Berlyno mlynasis

NH3, H2O2

Mn2+

2Mn2+ + 5NaBiO3 + 16HNO3


violetin permanganato spalva

54

Analizin grup 1 VI

Grupinis reagentas 2 NH3, H2O2

Katijonas 3 Co2+

Katijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4

Darbo eiga 5
permanganat.

Mikrokristaloskopin reakcija Co + (NH4)2[Hg(SCN)4] Ant objektinio stiklelio mlyni kristalai ulainamas silpnai pargtinto (2 N HCl) tiriamo tirpalo laas, greta jo laas amonio tetratiocianomerkurato (NH4)2[Hg(SCN)4] tirpalo. Abu laai stikline lazdele sujungiami ir, jeigu tirpale yra Co2+ jon, po kurio laiko susidaro pro mikroskop matomi mlyni kobalto tetratiociano merkurato Co[Hg(SCN)4] kristalai.
2+

VI

NH3, H2O2

Ni2+

Reakcija su kalio nitritu acto rgties terpje kelis laus tiriamojo Co2+ + 7KNO2 + 2CH3COOH tirpalo lainamas 1 laas koncentruotosios acto geltonos nuosdos rgties ir beriama apie 0,1 g KNO2. Maioma, kol KNO2 itirpsta. Jeigu tirpale yra Co2+ jon, ikrenta geltonos trikalio heksanitritokobaltato (III) K3[Co(NO2)6] nuosdos. iugajevo reakcija 2+ mgintuvl lainami 23 Ni + 2 CH3 C CH CH + 2 NH3 3 laai tiriamojo tirpalo, pridedami keli laai HO N N OH amoniako tirpalo ir 12 laai spiritinio dimetilglioksimo tirpalo. avietins spalvos nuosdos Jeigu reakcija nepavyksta, papildomai pridedama amoniako tirpalo. Jeigu tirpale yra Ni2+ jon, susidaro avietins spalvos nikelio dimetilglioksimato nuosdos.
Pastaba. Reakcijai trukdo Fe2+, Fe3+, Co2+, Cu2+.

Pastaba. Su Cu2+ jonais (NH4)2[Hg(SCN)4] sudaro geltonai alias kristalines nuosdas Cu[Hg(SCN)4] H2O.

55

Analizin grup 1 VI

Grupinis reagentas 2 NH3, H2O2

Katijonas 3 Cu2+

Katijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4

Darbo eiga

5 Reakcija su amoniako 2CuSO4 + 2NH3 + 2H2O tirpalu Jei tirpale nebuvo rasti Ni2+ (CuOH)2SO4 + (NH4)2SO4, jonai, tai Cu2+ jonai atpastami i intensyviai mlynos tirpalo spalvos, (CuOH)2SO4 + 8NH3 + 8H2O pridjus 4 laus 6 N NH3. 2+ intensyviai Amoniako tirpalas su Cu mlyna spalva jonais i pradi nusodina mlynai ali vario oksidrusk, kurios, dedant daugiau amoniako tirpalo, itirpsta. Tirpalas gyja intensyviai mlyn spalv.
Pastaba. Kadangi esant Ni2+, pylus NH4OH, susidaro melsvos spalvos [Ni(NH3)6]2+ jon, reakcija atliekama su K4[Fe(CN)6].

Reakcija su kalio heksacianoferatu (II) mgintuvl lainami 12 2CuSO4 + K4[Fe(CN)6] laai tiriamojo tirpalo. Jeigu jis yra stipriai rgios raudonai rudos nuosdos reakcijos, pridedamas natrio acetato perteklius, o jei yra armin reakcija pargtinamas acto rgtimi iki silpnai rgios terps. Tada lainami keli laai K4[Fe(CN)6] tirpalo. Jeigu tirpale yra Cu2+ jon, susidaro raudonai rud nuosd.

Atsiskaitymas
- paraomos bdingosios katijon radimo chemins reakcijos; - V ir VI grupi katijon neinomos sudties miinio analizs rezultatai uraomi 3 lentelje pateiktu bdu:

56

3 lentel. V ir VI analizini grupi katijon miinio analiz

Katijon radimo bdingais Atpaintas reagentais chemins reakcijos ir Reakcijos atlikimo slygos Pastebjimai katijonas analiziniai signalai Reakcija vyksta Susidaro mlyni Co2+ VI Co2++ (NH4)2[Hg(SCN)4] (NH4)2[Hg(SCN)4] Co[Hg(SCN) ] + 2 NH + neutralioje arba silpnai kristalai, 4 4 rgioje terpje. stebimi pro mlyni kristalai Trukdo Fe3+, Cu2+, Zn2+ mikroskop jonai Analizin grup, reagentas

Literatra 1. Daukas, K. Kokybin analiz. Vilnius: Mintis, 1965. 319 p. 2. kadauskas, J. Katijon ir anijon radimas tirpaluose. Mokomoji priemon. Vilnius: VU, 1997, p. 3249. 3. , . .; , . .; , . . .; . . . . . : . : B, 2001, c. 5072.

57

4. Sausos mediagos analiz


Darbo tikslas Sausos mediagos katijon ir anijon identifikavimas rgi ir bazi metodu. Tyrimo objektas Neinomos sudties druska. Katijonai: Na+, K+, NH + , Mg2+, Ba2+, Ca2+, Ag+, Pb2+, Hg 2 + , Zn2+, Al3+, Cr3+ , 4 2 Fe3+, Mn2+, Ni2+, Co2+, Cu2+; Anijonai: SO 2 , PO 3 , J, Cl . 4 4 Darbo priemons Cilindrinis ir kginis mgintuvliai. Laikrodinis ir objektinis stikleliai. Kapiliarins pipets. Filtravimo popieriaus lapeliai. Vandens ildymo vonia. Stiklin mentel. Mikroskopas. Centrifuga. Skirstant sudting analizuojamj miin analizines grupes rgi ir bazi metodu, kaip pagrindas imama katijon sveika su sieros ir druskos rgtimi, susidarant netirpiems junginiams, sveika su armais ir amoniaku, tipikiems arba amfoterikiems hidroksidams arba remiamasi kai kuri katijon savybe sudaryti su amoniaku kompleksinius junginius. Pagal tai, kaip katijonai reaguoja su rgtimis ir armais, jie skirstomi 6 grupes (1 lentel).
1 lentel. Katijon skirstymas analizines grupes rgi ir bazi metodu

Vandenyje Grups Vandenyje tirps chloridai, charaktenetirps sulfatai ir ristika sulfatai hidroksidai Antra Pirma Grup ir 2+ 2+ Na+, K+, NH + , Ba , Ca , 4 katijono 2+ Sr Mg2+ simbolis Grupinis reagentas Susidar junginiai Nra H2SO4, (NH4)2CO3 BaSO4, CaSO4, SrSO4

Vandenyje netirps chloridai

Amfoteriniai Hidroksidai, Hidroksidai, hidroksidai, netirps arm tirps amoniako tirps arm pertekliuje pertekliuje pertekliuje Penkta Ketvirta Treia eta Mn2+, Fe2+, Fe3+, Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ag+, Pb2+, Cr3+,Sn2+, Sn4+, Bi3+, Sb3+, Sb5+ Cd2+, Hg2+ Hg 2 + 2 3+ 5+ As , As HCl NaOH NH3, H2O2 NH3, H2O2 H2O2 Mn(OH)2, [Al(OH)4], [Co(NH3)6]2+, AgCl, 2 [Zn(OH)4] , Bi(OH)3, [Ni(NH3)6]2+, Hg2Cl2, 2 Fe(OH)3, [Cu(NH3)4]2+, PbCl2 CrO 4 , Sb(OH)3, [Cd(NH3)4]2+, [Sn(OH)6]2, H3SbO4 [Hg(NH3) 4]2+ AsO 3 4

Nors anijon analiz atliekama nesistemins analizs eiga, taiau vis tiek juos reikia grupuoti tam tikras grupes. Tai gerokai lengvina analiz. Pagal tai, kaip anijonai reaguoja su 2 M HCl arba 2 M H2SO4, BaCl2, CaCl2 ir AgNO3 junginiais, jie skirstomi keturias analizines grupes (2 lentel).
2 lentel. Anijon grupavimas

Grup I

Anijonas
2 CO 3 , S2, 2 SO 3 ,

Grupinis reagentas 2 M HCl arba 2 M H2SO4

Reakcijos produktai Dujos: CO2 be spalvos ir kvapo, H2S nemalonaus kvapo, SO2 atraus kvapo, SO2 atraus kvapo (stovint ir ildant

58

Grup

Anijonas 2 S2 O 3 , NO 2
2 SO 2 , PO 3 , SiO 3 , 4 4

Grupinis reagentas

Reakcijos produktai isiskiria elementarioji siera), NO + NO2 raudonai rudos, dusinanios Baltos nuosdos: BaSO4, Ca3(PO4)2, BaSiO3, Ba(BO2)2, CaF2, CaC2O4 Baltos nuosdos: AgCl, AgCNS; gelsvos nuosdos: AgI, AgBr

II III IV

BO , F , C 2 O Cl, I, CNS, Br
NO 3 , ClO 3 , ClO , 4 CH3COO

2 4

BaCl2+ CaCl2; neutrali terp AgNO3 + 2 M HNO3 Grupinio reagento nra

Darbo eiga Apie 0,05 g tiriamos druskos itirpinama mgintuvlyje 5 mL distiliuoto vandens. Preliminars bandymai atliekami naudojant 0,51,0 mL tiriamojo tirpalo taip, kaip nurodyta 3 lentelje.
3 lentel. Preliminars tiriamojo tirpalo tyrimai

Bandymo Tiriamojo tirpalo poymiai Nr. 1. Tiriamosios mediagos tirpalas bespalvis 2. Tirpale nra juod arba tamsiai pilk nuosd 3. Tirpalas neutralios reakcijos 4. 5. 6.

Tirpale nra i katijon Cr3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Fe3+ Hg 2 + , Sn2+ drauge su Bi3+, Hg2+, 2 Hg 2 + , Sb3+, Sb5+, Sn2+, Sn4+, Hg2+, Bi3+ 2

Ag+, Hg 2 + , Pb2+ Pridjus tirpal HCl, neikrinta nuosdos 2 2+ Pridjus tirpal H2SO4, neikrinta nuosdos Ba , (Ca2+), Pb2+, Sr2+ Pilant tiriamj tirpal k tik paruot SnCl2 Hg 2 + , Hg2+, Bi3+ 2 tirpal, nuosdos neikrinta

Katijono radimas Prie 5 la tiriamo tirpalo pridedami 3 laai 6N HCl tirpalo. Jeigu ikrenta nuosdos, katijonas priklauso III grupei. Prie 5 la tiriamo tirpalo pridedami 3 laai (NH4)2SO4 tirpalo. Ikritusios baltos nuosdos rodo, kad katijonas priklauso II grupei. 0,5 mL tiriamo tirpalo pridedami 4 laai 2 N NaOH tirpalo. Jeigu susidaro nuosdos, katijonas priklauso V arba VI grupei. Nucentrifuguotos nuosdos veikiamos 4 laais 6 N NH4OH tirpalo. Jeigu nuosdos neitirpsta, katijonas yra i V grups, jei itirpsta i VI grups. Jeigu po vykdyt reakcij nuosdos nesusidaro, katijonas gali priklausyti I arba IV analizinei grupei. Suradus grup, atliekamos paviens reakcijos visiems grups katijonams (4, 5, 6 lentels).
4 lentel. I ir II analizini grupi katijon radimo analiziniai signalai

Analizin Grupinis Katijonas grup reagentas 1 I 2 nra 3 NH + 4

Katijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4 NH4Cl + NaOH NH3 + H2O + NaCl

Darbo eiga 5 Reakcija su natrio armu mgintuvl lainami 4 laai tiriamojo tirpalo, pridedami 5 laai 2 N NaOH tirpalo. Mgintuvlis atsargiai paildomas vandens vonelje.

59

Analizin Grupinis Katijonas grup reagentas 1 2 3

Katijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai Darbo eiga signalai 4 5 NH3 + H2O NH4OH Vir mgintuvlio laikoma distiliuotu vandeniu suvilgyta lakmuso popierlis pamlynuoja raudono lakmuso juostel. Jeigu tirpale yra NH + jon, lakmuso 4 juostel pamlynuoja. Uostant jauiamas isiskirianio amoniako kvapas. 4 NH + 6CH2O (CH2)6N4 + 4H + 6H2O 2KCl + Na2[PbCu(NO2)6] K2[PbCu(NO2)6] + 2NaCl
kubo formos juodi arba rudi kristalai
+ 4

nra

Pastaba. Amonio jonai trukdo nustatyti K+ jonus mikrokristaloskopine reakcija. Tam tikslui naudojama formaldehido savyb sujungti amonio jonus urotropin (CH2)6N4. 5 laus tiriamojo tirpalo pridedami 4 laai formalino tirpalo.

nra

Na+

NaCl + Zn(CH3COO)23UO2(CH3COO)2 + CH3COOH + 9H2O NaZn(UO2)3(CH3COO)99H2O + HCl


viesiai geltoni tetraedr arba oktaedr formos kristalai

Mikrokristaloskopin reakcija Ant objektinio stiklelio ulainamas laas tiriamojo tirpalo ir greta laas dinatriovino-vario heksanitrito tirpalo. Abu laai stikline lazdele sujungiami ir, jeigu tirpale yra K+ jon, po kurio laiko susidaro pro mikroskop matomi juodi arba rudi kubo formos K2[PbCu(NO2)6] kristalai. Mikrokristaloskopin reakcija Ant objektinio stiklelio ulainamas laas tiriamojo tirpalo ir greta laas cinko uranilo acetato tirpalo, pargtinto acto rgtimi. Abu laai stikline lazdele sujungiami ir, jeigu tirpale yra Na+ jon, po kurio laiko susidaro pro mikroskop matomi viesiai geltoni tetraedr arba oktaedr formos natrio cinko uranilo acetato NaZn(UO2)3(CH3COO)99H2O kristalai.
Pastaba. Jei tiriamoje mediagoje yra K+, gali susidaryti ilg adat pavidalo kristalai. Tokiu atveju patartina la tiriamojo tirpalo 23 kartus praskiesti vandeniu ir tuomet atlikti reakcij.

nra

Mg2+

MgCl2 + Na2HPO4 + NH4OH MgNH4PO4 + 2NaCl + H2O


baltos kristalins nuosdos

Reakcija su dinatrio hidrofosfatu Ant objektinio stiklelio ulainami 12 laai tiriamojo tirpalo, pridedami 23 laai 2 M

60

Analizin Grupinis Katijonas grup reagentas 1 2 3

Katijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4

Darbo eiga 5 HCl, 1 laas 1 M dinatrio hidrofosfato tirpalo ir, atsargiai maiant stikline lazdele, pridedamas 2 M NH3 iki jauiamo amoniako kvapo (pH ~ 9). Jeigu tirpale yra Mg2+ jon, susidaro baltos magnio amonio fosfato MgNH4PO4 6H2O kristalins nuosdos, kurios stebimos mikroskopu. Reakcija su kalio dichromatu mgintuvl lainami 12 laai analizuojamojo tirpalo, 34 laai natrio acetato ir 12 laai K2Cr2O7. Mgintuvlis ildomas vandens vonioje. Jeigu tirpale yra Ba2+ jon, susidaro bario chromato BaCrO4 geltonos nuosdos.
Pastaba. BaCrO4 tirpsta rgtyse (netirpsta acto rgtyje), todl, atliekant reakcij, btina pridti CH3COONa, kad laisvi H+ jonai bt sujungti silpnos acto rgties molekules.

kristalai praskiestame tirpale (lta kristalizacija)

kristalai koncentruotame tirpale (greita kristalizacija)

II

(NH4)2CO3

H2SO4,

Ba2+

2BaCl2 + K2Cr2O7 + H2O + CH3COONa 2BaCrO4 + 2KCl + 2CH3COOH + 2NaCl


geltonos nuosdos

II

(NH4)2CO3,

H2SO4

Ca2+

CaCl2 + (NH4)2C2O4 CaC2O4 + 2NH4Cl

Reakcija su amonio oksalatu mgintuvl lainami 12 laai analizuojamojo tirpalo, baltos nuosdos pridedama 34 laai 6 M NH3 ir 2 laai amonio oksalato tirpalo. Jeigu tirpale yra Ca2+ jon, isiskiria baltos kalcio oksalato CaCl2 + H2SO4 + H2O CaC2O4 nuosdos. Nuosdos CaSO4 2H2O +2HCl tirpsta stipriose rgtyse, netirpsta acto rgtyje.
baltos adatli arba rombo bei suaugusi dvyni formos kristalai

Pastaba. Trukdo Ba2+ jonai. BaC2O4 nuosdos tirpsta acto rgtyje.

kristalai praskiestame tirpale (lta kristalizacija)

kristalai koncentruotame tirpale (greita kristalizacija)

Mikrokristaloskopin reakcija Ant objektinio stiklelio ulainamas laas tiriamojo tirpalo ir greta laas 2 N sieros rgties tirpalo. Abu laai stikline lazdele sujungiami ir paliekama pastovti. Jeigu tirpale yra nedaug Ca2+ jon, isiskiria ilgos pro mikroskop matomos CaSO42H2O gipso adatls, o jei daugiau, susidaro rombai arba suaug dvyniai.

61

5 lentel. III ir IV analizini grupi katijon radimo analiziniai signalai

Analizin Grupinis Katijon radimo bdingais reagentais Katijonas grup reagentas chemins reakcijos ir analiziniai signalai 1 2 3 4 Ag+ + HCl AgCl + H+ Hg22+ + HCl Hg2Cl2 + H+ Pb2+ + HCl PbCl2 + H+

Darbo eiga 5 Nuosd analiz Pb2+ radimas Nuosdos mgintuvlyje upilamos distiliuotu vandeniu ir, retkariais maiant, ildomos vandens vonioje. PbCl2 tirpsta kartame vandenyje. Keli laai vir nuosd esanio skysio pipete perkeliami kit mgintuvl ir tirpale iekoma Pb2+ jono. Reakcija su kalio dichromatu mgintuvl lainami 23 laai tiriamojo tirpalo, pridedami 23 laai K2CrO4 (arba K2Cr2O7). Jeigu tirpale yra Pb2+ jon, susidaro maai tirpios geltonos vino chromato PbCrO4 nuosdos. Hg 2 + radimas 2 Likusios mgintuvlyje Hg2Cl2 nuosdos upilamos 6 N NH3 pertekliumi ir ildomos vandens vonioje. Jeigu tirpale yra Hg 2 + jon, susidaro 2 miinys: juodos Hg ir HgNH2Cl nuosdos. Ag+ radimas AgCl nuosdos tirpsta koncentruotame amoniake. Reakcija su kalio jodidu Gaut jungin ([Ag(NH3)2]Cl) paveikus KI tirpalu, susidaro maai tirpios viesiai geltonos AgI nuosdos.
Pastaba. Jeigu chlorid nuosdos nuo NH3 + H2O pajuodavo, o sidabro rasti bdingomis reakcijomis nepavyko, jo reikia iekoti juodose nuosdose.

III

HCl

Pb2+

2Pb(NO3)2 + K2Cr2O7 + H2O 2PbCrO4 + 2KNO3 +2HNO3


geltonos nuosdos

III

HCl

Hg 2 + 2

NH + + H2O = NH3 + H3O+ 4


Hg2Cl2 +2NH3 Hg2NH2Cl + NH4Cl Hg2NH2Cl HgNH2Cl + Hg
nuosdos pajuoduoja

III

HCl

Ag+

NH + + H2O = NH3 + H3O+ 4


AgCl + 2NH3 [Ag(NH3)2]Cl [Ag(NH3)2]Cl + KI AgI + 2NH3 + KCl
viesiai geltonos nuosdos

IV

NaOH, H2O2

Zn2+

ZnSO4 + (NH4)2[Hg(SCN)4] Zn[Hg(SCN)4] + (NH4)2SO4


balti kristalai

Mikrokristaloskopin reakcija Ant objektinio stiklelio ulainamas acto rgtimi pargtinto tiriamojo tirpalo laas ir amonio tetrarodano merkurato (NH4)2[Hg(SCN)4] tirpalo laas. Abu laai stikline

62

Analizin Grupinis Katijon radimo bdingais reagentais Katijonas grup reagentas chemins reakcijos ir analiziniai signalai 1 2 3 4

Darbo eiga 5 lazdele sujungiami ir, jeigu tirpale yra Zn2+ jon, po kurio laiko susidaro pro mikroskop matomi balti cinko tetrarodano merkurato Zn[Hg(SCN)4] kristalai.
Pastaba. Jei tiriamosios mediagos tirpale yra Cu2+ arba Co2+ jon, nurodytu reagentu iekant cinko gali ikristi sudtingesni jungini nuosdos: Cu[Hg(SCN)4] Zn[Hg(SCN)4] rausvai alsvos spalvos, Co[Hg(SCN)4] Zn[Hg(SCN)4] violetins ydros spalvos.

kristalai koncentruotame tirpale (greita kristalizacija)

kristalai praskiestame tirpale (lta kristalizacija)

IV

NaOH, H2O2

Al3+

Al3+ + C14H6O2(OH)2 raudonos

Reakcija su alizarinu Reagentas su Al3+ jonais sudaro spalvos aliuminio lakas raudonos spalvos jungin, netirpstant acto rgtyje. Ant filtravimo popieriaus lapelio ulainamas tiriamojo tirpalo laas ir gauta dm 13 minutes laikoma vir indo, kuriame yra koncentruotasis amoniako tirpalas, kad susidaryt aliuminio hidroksidas. Paskui greta dms lainamas alizarino spiritinio tirpalo laas. Vl palaikoma amoniako garuose. Esant Al3+ jon, la slyio vietoje atsiranda raudona dm.
Pastaba. Reakcija nra specifin. Al3+ aptikti iuo reagentu trukdo Sn2+, Fe3+, Zn2+. Norint paalinti j tak, kelet tiriamo tirpalo la pridedama 2 M NaOH iki stipriai armins reakcijos. Jeigu isiskiria nuosd, jos centrifuguojamos, centrifugate iekoma Al3+ jon.

IV

NaOH, H2O2

Cr3+

2NaCrO2 + 3H2O2 + 2NaOH 2Na2CrO4 + 4H2O


geltonos spalvos tirpalas

Reakcija su vandenilio arba natrio peroksidu mgintuvl lainami 23 laai analizuojamo tirpalo, pridedami 45 laai 2 M NaOH, 68 laai 3 % H2O2 tirpalo ir paildoma, kol alsva tirpalo spalva virsta geltona, bdinga CrO 2 jonui. 4

63

6 lentel. V ir VI analizini grupi katijon radimo analiziniai signalai

Analizin Grupinis Katijon radimo bdingais reagentais Katijonas grup reagentas chemins reakcijos ir analiziniai signalai 1 2 3 4 V NH3, H2O2 Fe3+

Darbo eiga

NH3, H2O2

Mn2+

5 Reakcija su kalio arba FeCl3 + 3NH4SCN Fe(SCN)3 + 3NH4Cl amonio tiocianatais Ant filtravimo popieriaus raudonos ulainamas tiriamojo tirpalo spalvos laas ir greta dms amonio tirpalas (kalio) tiocianato laas. Esant Fe3+ jon, la slyio vietoje atsiranda raudona geleies tiocianato Fe(SCN)3 dm. Reakcija su kalio heksacianoferatu (II) FeCl3 + K4[Fe(CN)6] Fe4[Fe(CN)6]3 Keli laai tiriamojo tirpalo + KCl veikiami keliais laais kalio heksacianoferato (II) Berlyno mlynasis K4[Fe(CN)6]. Jeigu tirpale yra Fe3+ jon, susidaro mlynos amorfins nuosdos (Berlyno mlynasis). Reakcija su natrio bismutatu mgintuvl lainami 12 2Mn(NO3)2 + 5NaBiO3 + 16HNO3 2HMnO4 + 5Bi(NO3)3 + 5NaNO3 + 7H2O laai tiriamojo tirpalo, 23 laai 6 N HNO3 tirpalo, 58 violetin laai vandens, tada pateliu permanganato beriama iek tiek NaBiO3 spalva milteli, papurtoma ir paliekama stovti. Jeigu tirpale yra Mn2+ jon, po keli minui tirpalas virsta raudonai violetinis.

Pastaba. Cl ir Br jonai gali trukdyti reakcijai, nes jie suardo permanganat. Chloridus ir bromidus galima nusodinti sidabro nitratu AgNO3 ir filtrate (arba centrifugate) atlikti reakcij.

VI

NH3, H2O2

Co2+

CoSO4 + (NH4)2[Hg(SCN)4] Co[Hg(SCN)4] + (NH4)2SO4


mlyni kristalai

Mikrokristaloskopin reakcija Ant objektinio stiklelio ulainamas laas silpnai pargtinto (2 N HCl) arba neutralaus tiriamojo tirpalo, greta jo laas amonio tetratiocianomerkurato (NH4)2[Hg(SCN)4] tirpalo. Abu laai stikline lazdele sujungiami ir, jeigu tirpale yra Co2+ jon, po kurio laiko susidaro pro mikroskop matomi mlyni kobalto tetratiocianomerkurato

64

Analizin Grupinis Katijon radimo bdingais reagentais Katijonas grup reagentas chemins reakcijos ir analiziniai signalai 1 2 3 4

Darbo eiga 5 Co[Hg(SCN)4] kristalai.

Pastaba. Su Cu2+ jonais (NH4)2[Hg(SCN)4] sudaro geltonai alias kristalines nuosdas Cu[Hg(SCN)4] H2O. Jei tirpale yra Zn2+ jon, susidaro Co[Hg(SCN)4] Zn[Hg(SCN)4] violetins ydros spalvos kristal. Fe3+ jonai kenkia reakcijai.

CoCl2 + 7KNO2 + 2CH3COOH 2KCl + 2CH3COOK + NO + H2O + K3[Co(NO2)6]


geltonos nuosdos

VI

NH3, H2O2

Cu2+

2CuSO4 + 2NH3 + 2H2O (CuOH)2SO4 + (NH4)2SO4,

(CuOH)2SO4 + 8NH3 + 8H2O [Cu(NH3)4](OH)2 + [Cu(NH3)4]SO4 + Pastaba. Amoniako tirpalas su Cu2+ jonais i pradi nusodina 8H2O
intensyviai mlyna spalva

Reakcija su kalio nitritu acto rgties terpje kelis laus tiriamojo tirpalo lainamas 1 laas koncentruotosios acto rgties ir beriama apie 0,1 g KNO2. Maioma, kol KNO2 itirpsta. Jeigu tirpale yra Co2+ jon, ikrinta geltonos K3[Co(NO2)6] nuosdos. Reakcija su amoniako tirpalu Jei tirpale Ni2+ jon neaptikta, Cu2+ jonai atpastami i intensyviai mlynos tirpalo spalvos, pridjus 4 laus 6 N NH3.
mlynai ali vario oksidrusk, kurios, dedant daugiau amoniako tirpalo, itirpsta. Tirpalas gyja intensyviai mlyn spalv. Esant Ni2+, pylus NH4OH, susidaro melsvos spalvos [Ni(NH3)6]2+ kompleksas, tokiu atveju reakcija atliekama su K4[Fe(CN)6].

+ K4[Fe(CN)6] 2CuSO4 Cu2[Fe(CN)6] + +2K2SO4


raudonai rudos nuosdos

Reakcija su kalio heksacianoferatu (II) mgintuvl lainami 12 laai tiriamojo tirpalo. Jeigu jis yra stipriai rgios reakcijos, pridedama natrio acetato, o jei yra armin reakcija pargtinamas acto rgtimi iki silpnai rgios terps. Tada lainami keli laai K4[Fe(CN)6] tirpalo. Jeigu tirpale yra Cu2+ jon, susidaro raudonai rud nuosd.

65

Analizin Grupinis Katijon radimo bdingais reagentais Katijonas grup reagentas chemins reakcijos ir analiziniai signalai 1 2 3 4 IV NH3, H2O2 Ni2+
Ni + 2 CH3
HO
2+

Darbo eiga 5 iugajevo reakcija mgintuvl lainami 23 laai tiriamojo tirpalo, pridedami keli laai amoniako tirpalo ir 12 laai spiritinio dimetilglioksimo tirpalo. Jeigu reakcija nepavyksta, papildomai pridedama amoniako tirpalo. Jeigu tirpale yra Ni2+ jon, susidaro avietins spalvos nikelio dimetilglioksimato nuosd.

C N

CH N
H

CH3 + 2 NH3 OH

+ 2 NH4+

H3C

N Ni

CH3

H3C

CH3

O H

avietins spalvos nuosdos

Pastaba. Reakcijai trukdo Fe2+, Fe3+, Co2+, Cu2+. Reakcij galima atlikti mikrokristaloskopikai. Ant objektinio stiklelio lainamas laas tiriamojo tirpalo ir po 1 la amoniako bei dimetilglioksimo. Susidaro raudon kuokteliais sukibusi adat pavidalo kristalai.

Anijono radimas Tirpale, naudojamame anijon analizei, neturi bti IIVI grupi katijon ir Mg2+. Metal katijonai paalinami tiriamj mediag virinant sodos tirpale. tirpal patenka vis anijon natrio druskos, o nuosdas metal karbonatai, hidroksidai ir baziniai karbonatai. Analizuojant itirpint druskos tirpal, imama apie 30 la tirpalo, arminama 3 M sodos tirpalu, lainama dar 30 la to paties sodos tirpalo ir virinama bei centrifuguojama. Centrifugatas perkeliamas kit mgintuvl. Prie analizuojant paruot anijon tirpal, reikia neutralizuoti sodos pertekli. Neutralizuojama azoto rgtimi: pridedamas laas fenolftaleino, ir rgtis lainama, kol inyks avietin spalva (pH8). Tirpale iekoma anijon.
7 lentel. Anijono radimo analiziniai signalai

Analizin Grupinis Anijonas grup reagentas 1 II 2


neutralioji terp

3 SO 2 4

Anijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4 SO 2 + BaCl2 BaSO4 + 2Cl 4
baltos nusdos

Darbo eiga 5 Reakcija su bario chloridu mgintuvl lainami 4 laai tiriamojo tirpalo, 3 laai 2 N BaCl2 tirpalo ir 2 laai 6 N HCl tirpalo. Jei tirpale yra SO 2 jon, susidaro 4 baltos rgtyse netirpstanios BaSO4 nuosdos.
Pastaba. Neutraliame tirpale fosfato jonai sudaro baltas kuokt pavidalo hidrofosfato nuosdas. Pridjus amoniako, isiskiria normalusis fosfatas, tirpstantis acto rgtyje.

BaCl2

66

Analizin Grupinis Anijonas grup reagentas 1 II 2


neutralioji terp

3 PO 3 4

Anijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai signalai 4 HPO 2 + MgCl2 + NH3 4 MgNH4PO4 + 2Cl
baltos kristalins nuosdos

Darbo eiga 5 Reakcija su magneziniu miiniu (MgCl2, NH4Cl ir NH3 tirpalas) mgintuvl lainami 23 laai tiriamojo tirpalo, 45 laai magnezinio miinio tirpalo ir sumaioma. Jeigu tirpale yra PO 3 4 jon, susidaro baltos kristalins magnio amonio fosfato nuosdos.
Pastaba. i reakcij galima atlikti mikrokristaloskopikai.

CaCl2

III

AgNO3, 2M HNO3

Cl

Cl + AgNO3 AgCl + NO 3

baltos nuosdos
I + AgNO3 AgI + NO 3

viesiai geltonos nuosdos

Reakcija su sidabro nitratu mgintuvl lainami 23 laai tiriamojo tirpalo, pargtinama praskiesta azoto rgtimi ir laais pridedama AgNO3 tirpalo, kol nustoja skirtis nuosdos. Jos nuo tirpalo atskiriamos centrifuguojant, perplaunamos praskiesta azoto rgtimi.
Pastaba. Trukdo bromido jonai.

Nuosd analiz Reakcija su sidabro nitratu. Chlorido jon radimas Dalis nuosd itirpinama AgCl + 2NH3 [Ag(NH3)2]Cl koncentruotame amoniako tirpale. Susidaro tirpus kompleksinis junginys [Ag(NH3)2]Cl. Gautj [Ag(NH3)2]Cl + 2HNO3 AgCl tirpal pargtinus azoto rgtimi, + 2NH4NO3 ikrinta baltos sidabro chlorido nuosdos.
Pastaba. Fosfato jonas su AgNO3 sudaro geltonas nuosdas, tirpstanias mineralinse rgtyse ir amoniake. AgI nuosdos amoniake netirpsta.

III

AgNO3, 2M HNO3

Reakcija su bismuto nitratu. Bi(NO3)3 + 3KI BiI3 + 3KNO3 Jodido jon radimas juodos Dalis nuosd mgintuvlyje nuosdos veikiama 45 laais anglies tetrachlorido CCl4, pridedama BiI3 + H2O BiOI + 2HI laais praskiesto bismuto nitrato oranin spalva tirpalo ir gerai suplakama. Atsiranda oranins bismuto oksijodido BiOI nuosdos, ir visas skystis kur laik yra geltonos spalvos. Esant Cu2+ ir Fe3+, tuojau atsipalaiduoja jodas I2 . Tetrachlorido sluoksnis nuo jodo nusidao violetine spalva. Reakcija su krakmolu Amonio persulfatas (amonio

67

Analizin Grupinis Anijonas grup reagentas 1 2 3

Anijon radimo bdingais reagentais chemins reakcijos ir analiziniai Darbo eiga signalai 4 5 2KI + (NH4)2S2O8 + H2SO4 I2 + peroksodisulfatas) rgioje terpje 2KHSO4 + (NH4)2SO4 oksiduoja jodido jonus iki laisvojo jodo. mgintuvl lainami keli laai tiriamojo tirpalo bei praskiestos H2SO4 ir pridedami keli kristaliukai kieto amonio persulfato (NH4)2S2O8 (arba K2S2O8). paruotj miin lainama 12 laai krakmolo tirpalo ir kiek paildoma. Isiskyrs jodas nudao tirpal mlyna spalva. Esant daug jodid, spalva atrodo juoda.

Atsiskaitymas - sausos mediagos analizs rezultatai uraomi 8 lentelje pateikta forma:


8 lentel. Sausos mediagos analizs rezultatai

Analizin Jon radimo bdingais Reakcijos atlikimo slygos grup, reagentais chemins reakcijos reagentas ir analiziniai signalai I Mg2+ + Na2HPO4 + NH3 Reakcija vyksta amoniakinio Na2HPO4, buferio terpje. MgNH4 PO4 + 2Na+ baltos NH3 Trukdo jonai, sudarantys maai kristalins tirpius fosfatus. Netrukdo jonai: nuosdos NH + , K+, Na+ 4 - radus katijon ir anijon, paraoma druskos formul. Literatra

Pastebjimai Susidaro baltos kristalins nuosdos

Atpaintas jonas Mg2+

1. Daukas, K. Kokybin analiz. Vilnius: Mintis, 1965. 319 p. 2. kadauskas, J. Katijon ir anijon radimas tirpaluose. Mokomoji priemon. Vilnius: VU, 1997, p. 4569. 3. , . .; , . .; , . . .; . , . . . : . . : B. . 2001, c. 121142.

68

5. Tiesiogin konduktometrija ir konduktometrinis titravimas


Konduktometrin analiz pagrsta tiriamj tirpal elektrinio laidumo matavimu. Elektrin krv tirpaluose pernea teigiamieji ir neigiamieji elektrolit jonai. Vadinasi, konduktometrin analiz gali bti taikoma tiktai elektrolit (rgi, bazi ir drusk) tirpal analizei. iek tiek teorijos Jau buvo minta, kad elektrin krv tirpaluose pernea jonai. Jon srautas j (jon skaiius, pereinantis per tirpalo skerspjvio vienet per laiko vienet) gali bti apskaiiuotas taip:
j =jkonvekcijos + jdifuzijos + jmigracijos + jilumins difuzijos .

(1)

(1) lygtyje pirmasis narys charakterizuoja konvekcijos sraut, antrasis molekulin difuzij, treiasis jon migracij, ketvirtasis ilumin difuzij. Tirpal elektrinis laidumas paprastai tiriamas esant pastoviai temperatrai, todl ilumin jon difuzij galima nekreipti dmesio. Kiti trys efektai realiose sistemose daniausiai vyksta kartu ir dengia vienas kit. Ribiniu atveju galima laikyti, kad pasireikia tik vienas i j. Pavyzdiui, nemaiomame homogeniniame elektrolite pirmj nar galima nekreipti dmesio. Norint ivengti komplikacij, susijusi su kartu vykstania difuzija, matavimus btina atlikti taip, kad jonams judant nesusidaryt cheminio potencialo gradientas. Tam tikslui naudojama kintamoji srov. iuo atveju jonai virpa apie tam tikr vidutin padt, ir gradientas = 0. Tokiu atveju svarbi tik jon migracija, ir elektrolit tirpal elektrin laidum lemia itirpusios mediagos disociacija bei jon judjimas, sukeliamas iorinio tampos altinio. Kaip ir visi laidininkai, elektrolit tirpalai apibdinami vara R arba savitja vara . Taiau daniau vartojamas atvirkias varai dydis elektros laidis G (S) arba atvirkias savitajai varai dydis savitasis elektros laidis (S/cm).

G=
ia:

A , l

(2)

A elektrod plotas, cm2, l atstumas tarp panardint elektrolit elektrod, cm. Elektrolit tirpal savitasis elektros laidis (SEL) priklauso nuo jon skaiiaus (koncentracijos) ir j migracijos greiio:
= 103 C F(uk + ua), ia: elektrolito disociacijos laipsnis, C tirpalo koncentracija, mol/L, F Faradjaus skaiius (konstanta), uk ir ua katijono ir anijono absoliutusis judjimo greitis. vairi elektrolit savitojo elektros laidio (SEL) ir molinio elektros laidio priklausomyb nuo koncentracijos parodyta 1 pav. Stiprij ir silpnj elektrolit SEL i pradi, didinant elektrolito koncentracij, didja. Taip yra todl, kad didja jon skaiius. Taiau toliau didinant elektrolit koncentracij, didja tirpalo klampumas, todl maja jon greitis ir tuo paiu maja SEL. Be to, didjant koncentracijai silpnj elektrolit tirpaluose, sumaja disociacijos laipsnis, o kartu jon skaiius ir SEL. Keliant temperatr, didja jon judjimo greitis ir kartu SEL. Nustatyta, kad paklus temperatr vienu laipsniu, SEL padidja 1,82,5 %. Todl norint palyginti rezultatus, SEL reikia matuoti esant tai paiai temperatrai. (3)

69

Koncentracija C, mol/L a

Molinis elektros laidis m, Scm2/mol Koncentracija C, mol/L b

1 pav. Savitojo (a) ir molinio (b) elektros laidio priklausomyb nuo koncentracijos

Molinis elektros laidis tai tam tikros koncentracijos tirpalo, gauto disocijavus vienam moliui elektrolito, elektrinio laidio matas. Molinis elektros laidis (m) atitinka elektrolito trio V(cm3), kuriame itirpintas vienas molis mediagos, patalpinto tarp dviej lygiagrei elektrod, tarp kuri yra 1 cm atstumas, elektros laid. Molinis elektros laidis apskaiiuojamas taip:

Savitasis elektros laidis , S/cm

m =

= V . C

(4)

Daniausiai molinis elektros laidis reikiamas S cm2/mol, todl (4) lygtyje koncentracija ireikta mol/cm3. Jeigu koncentracija C bus ireikta mol/L, (4) lygtis atrodys taip:

m =

1000 . C

(5)

Senesnje literatroje vartojamas ir ekvivalentinis elektros laidis , t. y. laidis tirpalo, kuriame yra itirpintas vienas ekvivalentas elektrolito. Taigi reikt inoti, kad molinis elektros laidis yra lygus ekvivalentiniam elektros laidiui, padaugintam i ekvivalentinio daugiklio. Pavyzdiui, NaCl tirpalo m = , H2SO4 arba MgSO4 tirpal m = 2 , Al2(SO4)3 tirpalo m = 6 ir t. t. I (3) ir (4) lygi gauname:

m = F(uk + ua).

(6)

Stiprij ir silpnj elektrolit molinio elektros laidio priklausomyb nuo koncentracijos parodyta 1 pav (b). i priklausomyb ilieka dl to, kad keiiantis tirpalo koncentracijai, pasikeiia ir disociacijos laipsnis. Skiediant tirpal, molinis elektros laidis didja artdamas prie pastovaus dydio, kuris ymimas 0m ir vadinamas ribiniu moliniu elektros laidiu. is dydis atitinka hipotetinio, be galo praskiesto tirpalo, kuris apibdinamas visika elektrolito disociacija ir elektrostatins sveikos jg nebuvimu tarp jon, molin elektros laid. Pagal (6) lygt be galo praskiesto tirpalo molinis elektros laidis bus toks:
0 0 0m = F u k + u a .

(7)

70

Sandauga Fu i0 = 0m,i vadinama ribiniu moliniu jon elektros laidiu, arba moliniu jon judrumu. io dydio dimensija Scm2/mol. Molinis jon judrumas yra kiekvienam jonui bdingas dydis, priklausantis tik nuo tirpiklio prigimties bei temperatros (1 lentel).
1 lentel. Kai kuri jon molinis judrumas 25 0C temperatroje

Katijonas H+ Li K
+ +

0m,k , Scm2/mol

Anijonas OH F

0m,a , Scm2/mol

349,8 38,6 50,11 73,5 77,8 73,4


61,9 106 119 119 127 108 106 107 106 106 139 204 209 209

198,6 55 76,34 78,1 76,8


71,44 67 55 55

Na

Cl

Br I

Rb+ NH4+
Ag+ Mg2+ Ca2+ Sr
2+ 2+

NO3

ClO 4 IO 4 HCOO CH3COO


HCO3

41 45 32 66 139 160 148 170 210

Ba Fe

2+

C6H5COO SCN
2 CO3

Co2+ Cu2+ Zn2+ Hg2+ Pb2+ Fe


3+ 3+ 3+

SO 2 4 C2O 2 4 CrO 2 4 PO 3 4 [Fe(CN)6] [Fe(CN)6]


3 4

La

303 444

Ce

I (6) ir (7) lygi gauname:

m u + ua = k = f , 0 0 0 uk + ua m
ia:

(8)

f elektrinio laidio koeficientas. Absoliutieji jon judjimo greiiai praskiestuose silpnj elektrolit tirpaluose ir be galo praskiestuose tirpaluose yra panas ( f 1), todl:

m = . 0m
Stipriems elektrolitams, kurie visikai disocijuoja, galioja tokia lygyb:

(9)

71

m = f . 0m
Be galo praskiesto tirpalo molinis elektros laidis lygus katijon ir anijon molini judrum sumai:

(10)

0m = 0m,k + 0m,a .
Metodo taikymas

(11)

Tiesioginis savitojo elektros laidio (SEL) matavimas leidia labai greitai ir pakankamai tiksliai nustatyti bendr drusk kiek tirpale. 2 pav. pateikta SEL priklausomyb nuo NaCl procentins koncentracijos tirpale.
90 80 70 SEL, mS/cm 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 NaCl procentin koncentracija

2 pav. NaCl kalibracin ties

Remiantis ia kalibracine tiese galima greitai nustatyti procentin NaCl koncentracij, pavyzdiui, NaCl kiek sdytoje msoje arba uvyje1. Savaime aiku, kad NaCl koncentracij galima nustatyti tik tuo atveju, kai tirpale nra kit elektrolit. Gamtinio vandens (poeminio ir pavirinio) SEL matavimai leidia labai greitai ir pakankamai tiksliai nustatyti bendr vandens mineralizacij (kartais vadinama sausuoju likuiu). Tarp tirpalo savitojo elektros laidio (SEL) ir jo koncentracijos yra toks ryys:

F=
ia:

C SEL

arba C = FSEL .

(12)

C elektrolito koncentracija, g/L arba mg/L, SEL savitasis elektros laidis, mS/cm arba S/cm, F perskaiiavimo faktorius (daugiklis). Jeigu SEL reikiamas mS/cm, tai koncentracija gaunama g/L. Jeigu SEL reikiamas S/cm, tai koncentracija gaunama mg/L. Faktoriaus F reikm iek tiek keiiasi, keiiantis elektrolito riai ir jo koncentracijai. Gamtiniams vandenims, kuriuose vyrauja Ca2+, Mg2+ katijonai bei HCO3 anijonai (hidrokarbonatiniai vandenys), F reikm labai neymiai svyruoja apie 0,57.
i kalibracin ties buvo taikyta NaCl koncentracijai nustatyti sdytoje uvyje. Rezultatai labai gerai sutapo su klasikinio Cl jon nustatymo titrimetriniu metodu, naudojant AgCl, duomenimis (procentin koncentracija skyrsi vos keliomis imtosiomis procento dalimis).
1

72

Pavyzdiui, imatuotas gamtinio vandens SEL = 520 S/cm. Tada tokio vandens bendroji mineralizacija bus lygi: C = FSEL = 0,57 520 = 296,4 mg/L. SEL matuojamas laidumo matuokliais (konduktometrais). iuolaikiniai laidumo matuokliai atlieka rodmen temperatrins kompensacijos funkcij, t. y. visikai nesvarbu, kokios temperatros yra analizuojamasis tirpalas. Prietaiso ekrane pateikiamas rezultatas, tarsi tiriamojo tirpalo temperatra bt 20 0C arba 25 0C (pasirinktinai). Laidumo matuokliai tikrinami ir kalibruojami, naudojant tiksliai inomos koncentracijos KCl tirpalus (2 lentel).
2 lentel. KCl tirpal savitasis elektros laidis (SEL)

KCl konc., mol/L 0,1 0,01 0,001


Konduktometrinis titravimas

Savitasis elektros laidis , S/cm, esant tirpalo temperatrai 20 0C 25 0C 18 0C 11190 11670 12880 1225 1278 1413 127,1 132,6 146,9

Konduktometrij galima taip pat taikyti atliekant trio analiz ekvivalentiniam takui rasti. Dl nevienodo skirting jon judrumo ir dl jon koncentracij pokyi titruojant titravimo kreivse, vaizduojaniose tirpalo savitojo elektros laidio priklausomyb nuo titranto trio, ekvivalentiniame take susidaro lis. Tirpalo SEL, pylus kiekvien titranto porcij, nustatomas kaip vis tirpale esani jon judrum suma. Titravimo kreivi pobdis, rodantis galimus vairi mediag titravimo atvejus, pavaizduotas 3 pav.

3 pav. Konduktometrinio titravimo kreivs

1 kreiv. BaCl2 tirpalas titruojamas Na2SO4 tirpalu:

BaCl2 + Na2SO4 = BaSO4 + 2NaCl.

73

Jeigu BaCl2 tirpal dozuosime Na2SO4 tirpal, tai Cl jonai liks tirpale, o Ba2+ jonai ( 0Ba 2+ = 127 Scm2/mol, 1 lentel) bus keiiami maiau judriais Na+ jonais ( 0Na + = 50,11 Scm2/mol) ir todl SEL maja. Susidarantis maai tirpus BaSO4 neturs jokios takos SEL. SEL mas tol, kol tirpale esantys Ba2+ jonai visikai pereis nuosdas. Dar pilant Na2SO4 tirpal, SEL pradeda didti, nes tirpale didja elektrolito koncentracija.
2 kreiv. AgNO3 tirpalas titruojamas NaCl tirpalu:

AgNO3 + NaCl = AgCl + NaNO3. iuo atveju Ag+ jonai ( 0Ag + = 61,9 Scm2/mol) keiiami Na+ jonais ( 0Na + = 50,11 Scm2/mol) ir SEL beveik nesikeiia iki ekvivalentinio tako. Dar pilant NaCl, SEL didja.
3 kreiv. AgNO3 tirpalas titruojamas HCl tirpalu:

AgNO3 + HCl = AgCl + HNO3. iuo atveju SEL pastebimai didja nuo titravimo pradios, kadangi maai judrs Ag+ jonai ( 0Ag + = 61,9 Scm2/mol) keiiami daug judresniu H+ jonu ( 0H + = 349,8 Scm2/mol). Po ekvivalentinio tako SEL didja dar stipriau.
4 kreiv. Tokia kreiv gaunama titruojant acto rgt amonio hidroksidu (silpnas elektrolitas titruojamas kitu silpnu elektrolitu):

CH3COOH + NH4OH = CH3COONH4 + H2O. Iki ekvivalentinio tako labai judrus H+ jonas yra keiiamas gerokai maiau judriu NH + jonu ir SEL 4 turt mati. Taiau taip neatsitinka, kadangi gaminasi gerai disocijuojantis elektrolitas CH3COONH4 ir SEL didja. Po ekvivalentinio tako SEL nesikeiia. Taigi SEL matavimas titravimo metu leidia rasti ekvivalentin tak netgi tais atvejais, kai titruojami spalvoti tirpalai ir indikatori naudojimas yra nemanomas.
Darbo tikslas

1. Susipainti su savitojo elektros laidio (SEL) matavimo priemonmis ir matavimo technika. Imatuoti vairi vanden (geriamojo vandens, pavirinio vandens, supilstyto butelius glo ir mineralinio vandens, distiliuoto, dejonizuoto vandens ir pan.) SEL ir apskaiiuoti i vanden bendrj mineralizacij. 2. Sudaryti NaCl arba Na2SO4 kalibracin ties ir vliau panaudoti j i mediag tirpal kiekybinei analizei.
Tyrimo objektas

vairi elektrolit vandeniniai tirpalai.


Darbo priemons

Analitins svarstykls. Dejonizuotas vanduo. Matavimo kolbos. Automatins pipets. Laidumo matuoklis (konduktometras), turintis automatin temperatrin rodmen kompensacij, plastikinis matavimo indelis.

74

Mediagos ir tirpalai

Kieti NaCl ir Na2SO4, labai varus vanduo (distiliuotas arba dejonizuotas; jo SEL neturi viryti 5 S/cm).
Darbo eiga

Dstytojo nurodymu pagaminama 250 g 5,0 % vandeninio NaCl arba 250 g 5,0 % vandeninio Na2SO4 tirpalo. Vliau tirpal atitinkamai skiediant, pagaminama toki procentini koncentracij tirpal serija: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 ir 4,0. Imatavus vis i tirpal SEL, duomenys suraomi toki lentel ir atliekami reikalingi skaiiavimai:
3 lentel. Duomen lentel

Eil. Nr.

NaCl (Na2SO4) C, %

SEL, mS/cm

F=

C SEL

Ant milimetrinio popieriaus arba naudojant kompiuter nubriama kalibracin ties. Abscisi ayje atidedama procentin koncentracija, o ordinai SEL. Turint kalibracin ties nustatoma analizei pateikto NaCl arba Na2SO4 tirpalo procentin koncentracija. Apskaiiuojama absoliuti ir santykin nustatymo paklaida.
Atsiskaitymas

Pateikiama: - isamus darbo apraymas, pradedant trumpa teorine dalimi, - tirpal skaiiavimai, - upildyta 3 lentel, - nubrtas kalibracinis grafikas, - apskaiiuotos tam tikros koncentracijos tirpalo analizs paklaidos.
Literatra

Mickeviius, D. Chemins analizs metodai. 2 dalis (Elektrochemin ir chromatografin analiz). Vilnius: iburio leidykla, 1999, p. 2138.

75

Trumpa teorin dalis

Egzistuoja du potenciometrijos metodai: a) tiesiogin potenciometrija; b) potenciometrinis titravimas. Tiesiogin potenciometrija pagrista tuo, kad tarp mediagos koncentracijos (aktyvumo) tirpale ir imatuoto elektrodinio potencialo yra tam tikras ryys. Taikant metod nustatoma 10 20 30 40 50 vandenilio jon koncentracija tirpale ir taip pat tirpalo pH, vairi Etaloninio tirpalo tris V, mL jon koncentracijos tirpale naudojant jon-selektyvius elektrodus (Na+, F, NO3 ir kt., i viso apie 30 katijon ir anijon). Potenciometrinis titravimas pagrstas elektrodinio potencialo matavimu titravimo metu. Ekvivalentinis takas nustatomas pagal potencialo uol, kuris gaunamas ekvivalentiniame take. Jeigu atliekama neutralizacijos reakcija (rgi ir arm metodas), ekvivalentiniame take gaunamas didesnis ar maesnis pH uolis. Jeigu atliekama oksidacijos-redukcijos reakcija, ekvivalentiniame take gaunamas didesnis ar maesnis oksidacijos-redukcijos potencialo uolis. Potenciometrinis titravimas gali bti panaudotas ir vykdant kompleksini jungini susidarymo arba nusodinimo reakcijas. Bet kuriuo atveju pH-metras ar milivoltmetras ia yra kaip indikatorius. Potenciometrinis titravimas turi kelet privalum lyginant su vizualiu titravimu: a) potenciometrinis titravimas yra jautresnis u vizual; b) eliminuojamas subjektyvus faktorius (kiekvienas mogus savaip mato spalvas ir j pasikeitim); c) galima titruoti labai spalvotus ir drumstus tirpalus, kai indikatori naudojimas yra nemanomas; d) galima nustatyti keli komponent koncentracijas viename mginyje; e) galima automatizuoti titravimo proces, kadangi matuojamas elektrinis dydis (potencialas). Reakcijoms, kurios taikomos potenciometriniam titravimui, keliami tie patys reikalavimai, kaip ir atliekant paprast titrimetrin analiz: a) reakcijos turi vykti pakankamai greitai; b) reakcija turi vykti stechiometrikai, t. y. j metu turi pasigaminti inomos sudties cheminiai junginiai (neturi vykti paalini reakcij); c) reakcijos turi vykti iki galo. Jeigu reakcija vyksta nepakankamai greitai, galima taikyti atvirktinio titravimo metod. Jo esm yra tokia: titruojamj tirpal pridedamas titranto perteklius, kuris paskui nutitruojamas su kitu tinkamu titrantu. Kitas bdas padidinti reakcijos greit titravimas auktesnje temperatroje (paildyti titruojam tirpal). Pateiksime kelet potenciometrinio titravimo pavyzdi. arm pridta
1. Neutralizacijos reakcija. Stipri rgtis titruojama su stipriu armu, arba atvirkiai (pvz., HCl + NaOH) iuo atveju tirpale gaminasi nesihidrolizuojanti druska (NaCl), todl, sumaiius ekvivalentinius rgties ir armo kiekius, t. y. pasiekus ekvivalentin tak, tirpalas tampa neutralus (pH = 7). Vadinasi, stipri rgi ir stipri arm titravimo ekvivalentinis takas sutampa su neutraliuoju taku.
1 pav. HCl titravimo natrio armu kreiv
0,4

Siekdami supaprastinti titravimo kreivs skaiiavim tarkime, kad tirpiniai yra visikai suskil jonus ir kad titravimo metu tirpalo tris nekinta. Tarkime, kad 1 N HCl titruojame su 1 N NaOH.

76

E, V

0,8

1,2

6. Tiesiogin potenciometrija ir potenciometrinis titravimas

Prie pradedant titravim 1 N HCl tirpale pH bus lygus: pH = lg 1 = 0. Pridjus 90 % reikaling rgiai neutralizuoti arm, rgties koncentracija, o su ja ir vandenilio jon koncentracija, sumas iki 0,1 dalies. Tuomet:

CH+ = 1/10;
Pridjus 99 % arm:

pH = lg 0,1 = 1.

CH+ = 1/100;
Pridjus 99,9 % arm:

pH = lg 0,01 = 2.

CH+ = 1/1000;

pH = lg 0,001 = 3.

Dabar uteks 12 armo tirpalo la, kad bt perengtas ekvivalentinis takas, kuriame pH = 7. Pridjus 100,1 % arm, tirpalas taps 1/1000 N OH jon atvilgiu:

COH = 1/1000 = 10 3; CH+ = 10 14/10 3 = 10 11; pH = lg 10 11 = 11.


Nuo paskutinij 12 armo tirpalo la pH reikm paoka nuo 3 iki 11. Vadinasi, i esms vis tiek, kuriame intervalo take nuo pH = 3 iki pH = 11 laikysime titravim baigt, kadangi visas intervalas perokamas mau arm tirpalo kiekiu. Tai vaizdiai iliustruoja titravimo kreiv.
2. Oksidacijos-redukcijos reakcija. Moro druskos (Fe2+) titravimas su kalio dichromatu labai rgioje (H2SO4) terpje

Titravimo metu vyksta reakcija, kurios jonin forma yra tokia:


2 Cr2O 7 + 6Fe2+ + 14H+ 2Cr3+ + 6Fe3+ + 7H2O.

Ekvivalentiniame take nuo mao titranto kiekio gaunamas staigus oksidacijos-redukcijos potencialo padidjimas (uolis).
Darbo tikslas

Susipainti su potenciometrinio titravimo technika. Potenciometrinis titravimas, vykdant neutralizacijos ir oksidacijos-redukcijos reakcijas. Titravimo kreivi sudarymas.
Darbo priemons ir reagentai

pH-metrasmilivoltmetras, indikatoriniai Pt ir stiklo elektrodai, palyginamasis sidabro chloridinis elektrodas, biuret, magnetin maiykl, automatins keiiamo trio pipets. 0,1 N NaOH ir HCl tirpalai; 0,1 N K2Cr2O7 ir Moro druskos (NH4)2Fe(SO4)26H2O tirpalai; 10 N H2SO4 tirpalas.

77

Darbo eiga

a) Neutralizacijos metodas: 50 mL stiklinl automatine pipete atmatuojama 10 mL 0,1 N HCl tirpalo, pilama dar apie 10 mL distiliuoto vandens, gaut tirpal pamerkiamas kombinuotas pH matavimo elektrodas ir dedamas magnetukas. Maiant tirpal magnetine maiykle, HCl titruojamas 0,1 N NaOH tirpalu nuolat uraant pridto armo tr ir pH. Titravimo pradioje pridedama po 2 mL 0,1 N NaOH tirpalo ir, sulaukus kol pH stabilizuojasi, uraoma jo reikm. Prie pat ekvivalentin tak pridedamo NaOH tirpalo tris mainamas iki 0,1 mL (madaug 2 laai titranto). Po ekvivalentinio tako per kelis kartus dar pridedama apie 1 mL titranto bei uraomos pH reikms. Titravimo rezultatai suraomi toki lentel:
1 lentel. Titravimo rezultat lentel

Titranto tris, mL

pH

Pagal lentels rezultatus nubriama titravimo kreiv; abscisi ayje atidedamas titranto tris, o ordinai pH.

b) Oksidacijos-redukcijos metodas: titruojama taip pat kaip a) variante. stiklinl pilamas Moro druskos tirpalas, kuris pargtinamas 5 mL 10 N H2SO4 tirpalo. tirpal merkiami indikatorinis (Pt) bei palyginamasis (sidabro chloridinis) elektrodai ir, maiant tirpal magnetine maiykle, titruojama 0,1 N K2Cr2O7 tirpalu. Titranto tris ir oksidacijos-redukcijos potencialas E, mV suraomi lentel bei nubriama titravimo kreiv.
Atsiskaitymas

- atlikto darbo apraymas. Jame turi bti trumpa teorin dalis, upildyta lentel bei nubrta titravimo kreiv.
Literatra

1. Mickeviius, D. Chemins analizs metodai. 2 dalis (Elektrochemin ir chromatografin analiz). Vilnius: iburys, 1998, p. 3941, 4749, 6365, 85. 2. , . . / . . : , 1966, c. 415422.

78

7. Molekulin absorbcin spektrin analiz (spektrofotometrija)


Trumpa teorin dalis
A

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4

Spektrofotometriniai analizs metodai pagrsti viesos 0,3 absorbcijos matavimu. Tiriamosios mediagos tirpalo spalvos 0,2 intensyvumas lyginamas su standartinio tirpalo spalvos 0,1 intensyvumu. is metodas yra labai jautrus ir pakankamai greitas. Jis taikomas tais atvejais, kai dl maos analits 0 koncentracijos negalima naudoti svorio ar trio analizs 440 460 480 500 520 540 560 580 600 metod. , nm Normali sauls skleidiama viesa yra vadinama baltja viesa. I tikrj tai yra miinys vairaus bangos ilgio viesos. i baltj vies galima iskaidyti sudtines spalvotas dalis, kurios skiriasi bangos ilgiu. mogaus akiai matomoje viesos spektro dalyje gaunamos vaivorykts spalvos (r. 1 lentel).
1 lentel. Spalvos priklausomyb nuo viesos bangos ilgio.

Spalva Violetin Indigo Mlyna alia Geltona Oranin Raudona

viesos bangos ilgis, nm 380446 446464 464500 500578 578592 592620 620780

viesa, kurios bangos ilgis yra maesnis negu 380 nm, vadinama ultravioletine viesa (UV spektro sritis). Sritis, kur viesos bangos ilgis yra didesnis negu 780 nm, vadinama infraraudonja (IR) sritimi. Intervalas tarp 380780 nm vadinamas matomja sritimi. Ultravioletin ir infraraudonoji viesa mogaus akiai yra nematomos. Pagrindinis viesos absorbcijos dsnis. Jeigu viesos sraut, kurio intensyvumas I0, nukreipsime kiuvetje supilt spalvot tirpal, tai dalis srauto, kurio intensyvumas Ir , atsispinds nuo kiuvets paviriaus, kita dalis (intensyvumas Ia) bus absorbuota tirpalo, o treia dalis (intensyvumas It ) pereis pro tirpal. Tarp i keturi dydi yra tokia priklausomyb:

I0 = Ir + Ia + It .

(1)

Kadangi atspindtos viesos srauto dalies intensyvumas Ir, dirbant su vienod optini savybi kiuvetmis, yra pastovus ir nedidelis dydis, tai atliekant skaiiavimus j galima neatsivelgti. Tada (1) lygyb galima parayti taip:

I0 = Ia + It .

(2)

i lygyb apibdina tirpalo optines savybes, t. y. jo savyb praleisti arba absorbuoti vies. viesos absorbcijos intensyvumas priklauso nuo to, kiek tirpale yra spalvot daleli, kurios absorbuoja vies daug labiau, negu tirpiklis. Perjs pro tirpal viesos srautas praranda tuo didesn dal intensyvumo, kuo didesn spalvoto junginio koncentracija tirpale ir kuo storesnis spalvoto tirpalo sluoksnis. Spalvotiems tirpalams tarp monochromatins (vienodo bangos ilgio) viesos absorbcijos laipsnio, krintanios viesos intensyvumo, spalvoto junginio koncentracijos ir tirpalo sluoksnio storio yra tam tikra priklausomyb,

79

ireikiama Lamberto-Bugerio-Bero dsniu. Pagal dsn spalvoto tirpalo monochromatins viesos absorbcija yra proporcinga tirpalo koncentracijai ir tirpalo sluoksnio storiui:

I = I 0 10 C l ;
ia: I perjusio pro tirpal viesos srauto intensyvumas, I0 krintanios viesos srauto intensyvumas, C spalvoto junginio (nustatomo elemento) molin koncentracija tirpale, mol/L, molinis absorbcijos koeficientas (sinonimas ekstinkcijos koeficientas), l tirpalo sluoksnio storis (kiuvets ilgis), cm. Logaritmav (3) lygyb, gausime:

(3)

lg

I0 = C l. I

(4)

Santykio tarp krintanios viesos intensyvumo ir viesos, perjusios pro tirpal, intensyvumo deimtainis logaritmas yra vadinamas tirpalo absorbcija arba optiniu tankiu ir ymimas raide A2:

lg

I0 I

= A, (5)

A = C l.

Matome, kad absorbcija yra proporcinga spalvoto junginio koncentracijai tirpale ir spalvoto tirpalo sluoksnio storiui. Molinis absorbcijos koeficientas tai absorbcija tirpalo, kurio 1 cm storio sluoksnyje yra 1 mol/L absorbuojanios mediagos. Jis priklauso nuo absorbuojanios vies mediagos chemins sudties bei fizini savybi ir nuo monochromatins viesos bangos ilgio. Kuo didesn reikm, tuo jautresn reakcija, t. y. tuo maesnius tiriamosios mediagos kiekius galima nustatyti be papildomo jos koncentravimo. Atvirkias viesos absorbcijai (A) dydis yra viesos pralaidumas (T) (angl. Transmission). Pralaidumas daniausiai reikiamas procentais. Tarp absorbcijos A ir pralaidumo T yra toks ryys:
A = log T.

Pavyzdiui, T = 23,6 % = 0,236; tada A = log 0,236 = 0,627. Paprastai prie taikant spektrofotometrin metod vienos ar kitos mediagos kiekiui nustatyti, pirmiausia nustatoma, kokio ilgio viesos bangas spalvotas tirpalas absorbuoja labiausiai, t. y. sudaromas spalvoto junginio tirpalo absorbcijos spektras (abscisi ayje atidedamas viesos bangos ilgis, o ordinai ayje absorbcija A) ir randamas max. Paskui, esant iam bangos ilgiui, sudaromas kalibravimo grafikas naudojant standartinius tirpalus su tiksliai inomomis analizuojamos mediagos koncentracijomis. Imatavus i tirpal absorbcij, briamas kalibravimo grafikas abscisi ayje atidedant koncentracijas, o ordinai ayje absorbcij (A.). Vliau, imatavus analizuojamo tirpalo absorbcij, pagal kalibravimo grafik randama iekomos mediagos koncentracija tirpale. Spektrofotometriniai analizs metodai prajo ilg tobuljimo keli. Pradioje buvo taikomi vizualiniai kolorimetriniai (spalvos lyginimo) metodai, kai tiriamojo tirpalo spalva buvo vizualiai lyginama su standart spalvine skale. Vliau buvo pradti kurti ir tobulinti spalv intensyvumo matavimo (lyginimo) prietaisai

Ankstesnje literatroje absorbcija (optinis tankis) buvo ymima raide D. Kai kuriose usienio alyse absorbcija ymima raide E ir vadinama ekstinkcija.

80

(kolorimetrai, fotometrai, spektrofotometrai). 1 ir 2 pav. pateiktos vieno spindulio ir dviej spinduli spektrofotometr principins schemos.

1 pav. Vieno spindulio spektrofotometro principin schema: 1 viesos altinis; 2, 5 sferiniai veidrodiai; 3 veidrodis; jimo ir ijimo plyys; 6 prizm; 7 viesos filtras; 8 kiuvets su tiriamuoju ir palyginamuoju tirpalais; 9 fotoelementas; 10 srovs stiprintuvas; 11 mikroampermetras; 12 maitinimo blokas

2 pav. Dviej spinduli spektrofotometro principin schema: 1 viesos altinis; 2 viesos filtras; 3 prizm; 4 veidrodis; 5 kiuvets su tiriamuoju ir palyginamuoju tirpalais; 6 plyin diafragma; 7 fotoelementas; 8 srovs stiprintuvas; 9 mikroampermetras

Darbo tikslas

1. Spalvot mediag tirpal viesos absorbcijos maksimumo (max) nustatymas (absorbcijos spektro sudarymas).

81

2. Absorbcijos (sugerties) (A) priklausomybs nuo tirpalo koncentracijos (C) A = f(C) nustatymas, t. y. kalibracins tiess sudarymas. 3. Junginio ar elemento koncentracijos nustatymas tirpale naudojantis sudaryta kalibracine tiese.
Tyrimo objektas

inomos koncentracijos vandeniniai kalio permanganato (KMnO4) arba geleies kompleksinio junginio su sulfosalicilo rgtimi tirpalai.
Darbo priemons ir tirpalai

Analitins svarstykls. Dejonizuotas vanduo. Matavimo kolbos. Automatins pipets. Spektrofotometras. Kiuvets. Tirpalai; 1. 0,01 M KMnO4 tirpalas. 1,5804 g KMnO4 1 litro matavimo kolboje itirpinama nedideliame distiliuoto vandens kiekyje, pilami 5 mL konc. H2SO4, tirpalas praskiediamas iki yms ir gerai sumaiomas. 2. Standartinis geleies tirpalas. 0,8634 g FeNH4(SO4)212H2O per piltuvl suberiama 1 litro matavimo kolb, itirpinama nedideliame distiliuoto vandens kiekyje, pilama 100 mL ledins acto rgties, tirpalas praskiediamas iki yms ir gerai sumaiomas. 1 mL io tirpalo yra 0,1 mg geleies (Fe3+) jon. 3. Sulfosalicilo rgties tirpalas. 20 g sulfosalicilo rgties itirpinama 100 mL distiliuoto vandens.
Darbo eiga 1. Spalvot jungini tirpal viesos absorbcijos maksimumo (max, nm) nustatymas (absorbcijos spektro sudarymas)

Dstytojo nurodymu yra sudaromi KMnO4 arba geleies kompleksinio junginio su sulfosalicilo rgtimi absorbcijos spektrai ir randama, kokio bangos ilgio vies spalvotas junginys absorbuoja labiausiai (max, nm). Absorbcijos spektrui sudaryti naudojama 1 cm ilgio kiuvet ir tokia tiriamojo tirpalo koncentracija, kad Amax 1. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas distiliuotas vanduo. Absorbcija matuojama 450 600 nm viesos bangos ilgio intervale. Pirmiausia sudaromas apytikris (grubus) absorbcijos spektras, kai viesos bangos ilgis keiiamas kas 50 nm. Kai apytikriai randama max vieta, ji tikslinama, keiiant iame rajone bangos ilg kas 10 nm. Vliau, sudarant kalibracin ties, absorbcija matuojama esant btent iam (max, nm) viesos bangos ilgiui. Matavim rezultatai yra suraomi 1 lentel.
1 lentel. Absorbcijos (A) priklausomyb nuo viesos bangos ilgio (, nm)

viesos bangos ilgis , nm

Absorbcija (A)

Pagal 1 lentels rezultatus ant milimetrinio popieriaus arba kompiuteriu nubriamas absorbcijos spektras. Abscisi ayje atidedamas viesos bangos ilgis, o ordinai ayje absorbcija A. Suradus max, sudaroma kalibracin ties.
2. Absorbcijos (sugerties) (A) priklausomybs nuo tirpalo koncentracijos (C) A = f(C) nustatymas (kalibracins tiess sudarymas)

Dstytojo nurodymu atliekamas ios darbo dalies 2.1. arba 2.2. punktas. 2.1. Jeigu kalibracin ties sudaroma kalio permanganatui, tai eias 50 mL matavimo kolbutes imami skirtingi (didjania tvarka) inomos koncentracijos KMnO4 standartinio tirpalo triai ir distiliuotu vandeniu praskiediami iki yms bei gerai sumaiomi (dmesio: didiausios koncentracijos tirpalo absorbcija A neturt viryti 1,00 absorbcijos vieneto).

82

Violetins spalvos permanganato tirpal absorbcija matuojama naudojant 1 cm ilgio kiuvet, o kaip palyginamasis tirpalas naudojamas distiliuotas vanduo. Gauti rezultatai suraomi 2 lentel ir atliekami visi reikalingi skaiiavimai (kitaip tariant, visikai upildoma 2 lentel). 2.2. Jeigu kalibracin ties sudaroma geleies kompleksiniam junginiui su sulfosalicilo rgtimi (violetins spalvos junginys), tai septynias 50 mL matavimo kolbutes pilami skirtingi (didjania tvarka) inomos koncentracijos geleies standartinio tirpalo triai, kiekvien kolbut pilama po 1 mL sulfosalicilo rgties tirpalo ir tirpalai distiliuotu vandeniu praskiediami iki yms bei gerai sumaiomi. Visose kolbutse (iskyrus pirmj) atsiranda daugiau ar maiau intensyvi violetin spalva. ios spalvos intensyvumas yra proporcingas tiktai Fe3+ jon koncentracijai, kadangi sulfosalicilo rgties visur imamas didelis perteklius. Po 5 minui (per tiek laiko iki galo susidaro kompleksinis junginys ir isivysto spalva) imatuojama vis spalvot tirpal viesos absorbcija esant tokiam viesos bangos ilgiui, kai buvo gauta maksimali absorbcija. Absorbcijos matavimams naudojama 1 cm ilgio kiuvet, o kaip palyginamasis tirpalas tirpalas Nr. 1. Gauti rezultatai suraomi 2 lentel, apskaiiuojama geleies koncentracija mg/50 mL ir mg/L, taip pat kiekvienos koncentracijos ekstinkcijos koeficientas bei faktorius F ir vidutins j reikms. Dmesio: pirmj kolbut geleies standartinio tirpalo nepilama. j pilama tiktai 1 mL sulfosalicilo rgties tirpalo, kuris distiliuotu vandeniu praskiediamas iki yms bei gerai sumaiomas (palyginamasis tirpalas).
2 lentel. Kalibracins tiess sudarymas

Eil. Nr. 1 2 3 4 5 6 7

Paimta mL standartinio Fe tirpalo 0 1,0 3,0 5,0 7,0 10,0 15,0

Fe koncentracija mg/50 mL mg/L

F=

C , mg / L A

Palyginamasis tirpalas

Palyginamasis tirpalas

F=

Pagal 2 lentls duomenis briamas kalibracinis grafikas. Abscisi ayje atidedama geleies (Mn) koncentracija C (mg/50 mL), o ordinai ayje absorbcija A. Naudojantis kalibracine tiese atliekama neinomos koncentracijos geleies tirpalo kiekybin analiz. I dstytojo suinojus Fe koncentracij analizuojamame tirpale, apskaiiuojama absoliutin ir santykin nustatymo paklaida.
Atsiskaitymas

Atlikto darbo apraymas. Jame turi bti: a) absorbcijos priklausomybs nuo viesos bangos ilgio lentel ir grafikas; b) upildyta 2 lentel ir kalibracins tiess grafikas.
Literatra

Mickeviius, D. Chemins analizs metodai. 1 dalis (Spektrin analiz). Vilnius: iburio leidykla, 1998, p. 2329; 99130.

83

8. Skysi trio matavimo priemoni (pipei, biurei, matavimo kolbui ir kt.) metrologini charakteristik nustatymas
Trumpa teorin dalis

Chemins analizs rezultat tikslumas ir patikimumas priklauso nuo daugelio veiksni: naudojam matavimo priemoni ir prietais tikslumo; naudojam reagent varumo; analitiko kvalifikacijos; analizei taikomo metodo charakteristik. Trio matavimo priemons kokyb geriausiai apibdina du standartiniai dydiai tikslumas (A) (angl. Accuracy) ir variacijos koeficientas (CV) (angl. Coefficient of variation). Tikslumas(A) tai skirtumas procentais tarp realiai paimto nominalaus skysio trio ir idealaus nominalaus pipets ar biurets trio. Tikslumas ir yra tas dydis, kuris nustatomas atliekant kalibravim. Variacijos koeficientas (CV) (kartais dar vadinamas precizikumu) tai atsikartojamumo matas. Variacijos koeficientas parodo daug kart i eils atliekam matavim rezultat glaustum. Blogo variacijos koeficiento prieastimi gali bti netikusi matavimo prietaiso ar priemons konstrukcija, prietaiso ar priemons susidvjimas, bloga matavimo (pipetavimo) technika ir pan. 1 pav. pateikti taikini pavidalo pieiniai labai gerai ir vaizdiai iliustruoja tikslumo ir variacijos koeficiento esm. Taikinio centras vaizduoja planuojamj (norim) idealij trio vert, o kiekvienas pataikymas vaizduoja realiomis slygomis su ia priemone imatuotas tri vertes.

1 pav. Atsikartojamumo ir tikslumo iliustracija Blogas atsikartojamumas. Pataikymai labai isibarst. Blogas tikslumas. Pataikymai toli nuo centro. Matavimo priemon bloga. Blogas atsikartojamumas. Nra dideli paklaid, bet pataikymai isibarst. Geras tikslumas. Vidutin vert yra arti centro. Su ia priemone galima gauti gerus rezultatus. Geras atsikartojamumas. Pataikymai arti vienas kito. Blogas tikslumas. Pataikymai arti vienas kito, bet toli nuo centro. Sistemin paklaida. Geras atsikartojamumas. Pataikymai arti vienas kito. Geras tikslumas. Visi pataikymai arti centro (nominalaus trio verts).

Darbo tikslas
Nustatyti analizei naudojam pipei (Moro, graduotj ir automatini pipei) bei biurei metrologines charakteristikas ir palyginti jas su gamintoj deklaruojamomis charakteristikomis. I gaut rezultat padaryti ivadas, kurios i patikrint trio matavimo priemoni yra tiksliausios ir gali bti naudojamos svarbioms analizms atlikti.

84

Darbo priemons ir mediagos

Dstytojo nurodyta skysi trio matavimo priemon (priemons). Svarstykls, sverianios ne maesniu negu 0,001g tikslumu. Distiliuotas arba dejonizuotas vanduo. Termometras.
Darbo eiga

Dstytojo nurodyta biuret ar pipet pripildoma distiliuoto vandens. svrimo stiklinl supilamas nominalusis biurets ar pipets tris (5, 10, 15, 25 mL ir pan.). Vanduo pasveriamas analitinmis svarstyklmis. Termometru pamatuojama ir urauose pasiymima distiliuoto vandens temperatra. Apskaiiuojamas matavimo priemons tris, padarius temperatros patais. ios operacijos kartojamos 10 kart. Statistikai rezultatams apdoroti reikia turti ne maiau kaip 10 duomen. Svrim rezultatai suraomi lentel: Matavimo priemons nominalusis tris, mL Svrinio mas xi, g Vidutin svrini mas x , g

Svrimo eil. Nr. 1 2 3 ... 10

- Apskaiiuojamas matavimo priemons tikslumas (A, %) ir variacijos koeficientas (CV, %).


Skaiiavimai

1. Svrimo rezultat vidurkis apskaiiuojamas pagal formul:

x=
ia:
xi svrim rezultatai, g, n svrim skaiius.

xi , n

2. Vidutinis matavimo priemons tris (mL) apskaiiuojamas pagal formul:

V = xZ ,
ia:
Z temperatros pataisos koeficientas. Jis imamas i priede esanios lentels (pvz., 1,0029 mL/g, esant 20 oC ir 1013 hPa).

3. Apskaiiuojamas matavimo priemons tikslumas ( %):


A=

V V0 100 , V0

ia: Vo matavimo priemons nominalusis tris, mL. 4. Standartinis nuokrypis ( mL) apskaiiuojamas pagal formul: s= Z
( xi x )2 . n 1

85

5. Apskaiiuojamas variacijos koeficientas ( %): CV =


Atsiskaitymas

100 s . V

- pateikiamas atlikto darbo apraymas; - pateikiami nustatyt metrologini charakteristik apibrimai ir j skaiiavimai; - padaromos ivados apie trio matavimo priemoni tikslum, arba palyginamas keli trio matavimo priemoni tikslumas.
Priedas
Pataisos koeficiento Z priklausomyb nuo vandens temperatros

Temperatra, 0C 15,0 15,5 16,0 16,5 17,0 17,5 18,0 18,5 19,0 19,5 20,0 20,5 21,0 21,5 22,0 22,5

Pataisos koeficientas Z, mL/g 1,0020 1,0020 1,0021 1,0022 1,0023 1,0024 1,0025 1,0026 1,0027 1,0028 1,0029 1,0030 1,0031 1,0032 1,0033 1,0034

Temperatra, 0C 23,0 23,5 24,0 24,5 25,0 25,5 26,0 26,5 27,0 27,5 28,0 28,5 29,0 29,5 30,0

Pataisos koeficientas Z, mL/g 1,0035 1,0036 1,0038 1,0039 1,0040 1,0041 1,0043 1,0044 1,0045 1,0047 1,0048 1,0050 1,0051 1,0052 1,0054

86

Organin chemija
Laboratoriniai darbai Albinas ilinskas

1. Distiliavimas
Skystoms ir kai kurioms kietoms mediagoms gryninti yra naudojamas distiliavimas. Distiliavimas skysio virtimas garais ir vl j kondensavimas skyst. Mediag perskyrimas distiliavimu yra pagrstas j lakumo skirtumu. Yra keli distiliavimo bdai: distiliavimas atmosferos ir sumaintu (vakuume) slgiais, taip pat distiliavimas vandens garais. Pagal iskiriam i miinio mediag skaii skiriamas paprastasis distiliavimas, kai i miinio idistiliuojama viena frakcija, ir frakcinis distiliavimas, kai gaunamos kelios skirtingose temperatrose verdanios frakcijos. Frakcinis distiliavimas Frakciniu distiliavimu iskiriame atskirus homogenini skyst mediag komponentus, besiskirianius savo virimo temperatromis. Perskirti galima tik tokius miinius, kuriems verdant susidar garai turi skirting sudt negu skystis. Aceotropini miini perskirti distiliavimu negalima, nes skystis ir garai turi vienod sudt, toks miinys distiliuojasi nesikeiiant sudiai. Toliau pateikta frakcinio distiliavimo aparatra.

Dviej homogenini mediag miinio atskyrimas Surenkama aparatra frakciniam distiliavimui. Per piltuvl kolb supilamas distiliuojamasis miinys, metama keletas pemzos gabaliuk. Kolba pradedama ildyti. Po kiek laiko skystis kolboje pradeda virti ir garai pradeda kondensuotis kondensatoriuje. Atsirads skystis nuteka rinktuv. Nusistovjus temperatrai, pakeiiamas rinktuvas ir renkama pirmoji distiliacijos frakcija (iki tol, kol temperatra pradeda greitai kilti). Nenutraukiant ildymo, pakeiiamas rinktuvas ir renkama antroji (tarpin) frakcija (kol virimo temperatra

87

vl nusistovi). Tada, pakeitus rinktuv, renkama treioji frakcija. Kai kolboje lieka keli mililitrai skysio arba virimo temperatra vl ima staigiai kilti, nustojama ildyti kolb ir distiliavimas baigiamas. Imatuojamas frakcij tris (mL) ir nustatomi l ir 3 frakcij lio rodikliai refraktometru. Briama distiliavimo kreiv (tris, mL; virimo temperatra, C). Kreivs horizontaliosios dalys tai iskirt frakcij virimo temperatros. Frakcij virimo temperatros ir lio rodikliai palyginami su tam tikromis konstantomis inyne. Kai kuri mediag konstantos pateiktos 1 lentelje.
1 lentel. Kai kuri organini jungini fizikins konstantos

Pavadinimas Trichlormetanas (chloroformas) Tetrachlormetanas 2-Propanonas (acetonas) Cikloheksanas Benzenas Toluenas 2-Propanolis Etiletanoatas (etilacetatas)

Formul CHC13 CC14 CH3COCH3 C6Hi2 C6H6 C6H5 CH3 CH3CHOHCH3 CH3COOC2H5

Virimo temperatra, C 61 76,8 56 80,8 80 110 82,4 77

n (lio rodiklis) 1,4455 1,4630 1,3589 1,4288 1,5011 1,4969 1,3775 1,3728

2. Kristalizacija
Kristalizacija yra daniausiai naudojamas kiet mediag gryninimo metodas. Jis pagrstas nevienodu skirting mediag tirpumu altame ir kartame tirpiklyje. Junginys, kuris tirpsta blogiau, negu priemaios, kristalizuojasi aldant kart persotint tirpal; kitos mediagos lieka tirpale. Kristalizacijoje skiriame iuos etapus: a) karto sotaus mediagos tirpalo atitinkamame tirpiklyje paruoim; b) karto sotaus tirpalo atskyrim nuo neitirpusi priemai; c) tirpalo aldym iki mediagos isiskyrimo nuosdas; d) nuosd (kristal) atskyrim nuo tirpalo; e) kristal diovinim. Kristalizacijos skm labai priklauso nuo tirpiklio parinkimo. Koki taisykli laikytis parenkant tirpikl? 1) Gryninamoji mediaga neturi reaguoti su tirpikliu. 2) Ji turi blogai tirpti altame tirpiklyje (prieingu atveju daug mediagos liks tirpale, gryno produkto ieiga bus nedidel). 3) Ji turi gerai tirpti kartame tirpiklyje. 4) Tirpiklis turi geriau tirpinti priemaias. 5) Tirpiklis turi lengvai atsiskirti nuo diovinamos mediagos. 6) Tirpiklio virimo temperatra turi bti 1015 C emesn u gryninamosios mediagos lydymosi temperatr, prieingu atveju mediaga gali isiskirti alyvos pavidalu. Parenkant tirpikl, vadovaujamasi taisykle: panaus tirpsta panaiame, t. y., tos paios klass junginiai tirpsta vieni kituose. Nepoliniuose tirpikliuose gerai tirpsta nepolins mediagos, bet netirpsta polins ir atvirkiai. Angliavandeniliai gerai tirpsta angliavandeniliuose, alkoholiai, nesudtingi angliavandeniai ir karboksirgtys tirpsta vandenyje, alkoholiuose. i taisykl ne visada galioja, nes tirpumui dar turi takos ir kitos, esanios molekulje, funkcins grups, taip pat mediagos molio mas. Kristalizacijos atlikimas. Pasvert gryninamj mediag sudedame kolb, sujungt su grtamuoju kondensatoriumi. (Jei tirpiklis vanduo, kristalinti galima Erlenmejerio kolboje ar stiklinje, nenaudojant kondensatoriaus.) kolb metame gabaliuk pemzos arba stiklin ulydytu galu kapiliar, siekiant kolbos kaklo vidur. Per grtamj kondensatori kolb pilame tirpiklio, i pradi maiau, negu reikia mediagai itirpinti. ildome. Tirpalas turi virti. Jei mediaga neitirpsta, dar pilame tirpiklio. Jei tirpalas spalvotas, tai pridedama aktyvuotos anglies arba kito spalvos alintojo. Viriname 510 min. Kartas tirpalas filtruojamas nuo netirpi priemai. Filtratas auinamas, isiskyr kristalai atskiriami nuo tirpalo ir diovinami. Nustatoma junginio lydymosi temperatra: ubrus iupsnel mediagos ant termometro gyvsidabrio rutuliuko ir ildant j vir elektrins plytels, stebima, kada mediaga lydosi.

88

Benzenkarboksirgties kristalinimas 100 mL stiklinje 50 mL vandens virinant itirpinama 1 g benzenkarboksirgties. Kartas tirpalas greitai filtruojamas pro lankstytj filtr. Kad filtruojant besikristalizuojanti benzenkarboksirgtis neukit filtro, reikia piltuvl, kuriame yra dtas filtras, paildyti. Tam imama 100 mL Erlenmejerio (kgin) kolbut, j pilama 510 mL vandens, statomas piltuvlis su filtru ir ildoma. Kai vandens garai suildys piltuvl, ant filtro pilamas kartas benzenkarboksirgties tirpalas. Filtratas aldomas vandens ir ledo vonioje. Isiskyr kristalai filtruojami naudojant Biuchnerio piltuv ir Bunzeno kolb, diovinami ore ir sveriami. Apskaiiuojama ieiga procentais. Nustatoma lydymosi temperatra (lyginama su inyne pateikta temperatra).

3. Ekstrahavimas
Tai mediag atskyrimo bdas, besiremiantis skirtingu mediag tirpum tarpusavyje nesimaianiuose tirpikliuose. Ekstrahavimas daniausiai taikomas mediagai iskirti i vandens eteriu arba kitais su vandeniu nesimaianiais tirpikliais. Ekstrahavimui naudojami dalijamieji piltuvai, o esant maiems mediag kiekiams lainamieji piltuvliai. Ekstrahuojama taip. Dalijamajame piltuve mediagos vandenin tirpal pilamas ekstrahentas (tirpiklis). Piltuvas pripildomas skysiu ne daugiau 2/3 trio (tirpiklio (ekstrahento) tris sudaro madaug l/3 ekstrahuojamojo tirpalo). Piltuv, ukim kamiu, prilaikydami kamt ir iaup, apveriame kamiu emyn ir kelis kartus supurtome. Dl tirpiklio garavimo piltuve susidaro padidjs gar slgis. Garus reikia ileisti. Tam trumpam atsukamas piltuvo iaupas. Paskui, usukus iaup, energingai purtoma kelet minui, ileidiant susidariusi gar pertekli. Nustojus purtyti, piltuvas tvirtinamas stove. Sluoksniams atsiskyrus, atkemamas kamtis ir, atsukus iaup, apatinis sluoksnis ileidiamas stiklin. Virutinis sluoksnis ipilamas pro kakl. Jungini atskyrimas ekstrahavimu (rgtinis-bazinis ekstrahavimas) Darbo tikslas iskirti junginius i trikomponenio miinio, susidedanio i neutralaus bei rgtinmis ir bazinmis savybmis pasiymini komponent, kurie parenkami i i mediag:
2 lentel. Junginiai, i kuri sudaromas trikomponentis miinys ekstrahavimui

Formul C6H5COOH C6H5 CH = CH COO C6H5CONH2 C6H5NHCOCH3 BrC6H4NH2 Cl C6H4NH2

Pavadinimas Benzenkarboksirgtis 3-Fenil-2-propeno (cinamono) rgtis Benzenkarboksamidas (benzamidas) N-Feniletanamidas (acetanilidas) 4-Bromanilinas (p-bromanilinas) 4-Chloranilinas (p-chloranilinas)

Lydymosi temperatra, C 121123 132133 132 113 66 72

Erlenmejerio kolbutje 25 mL dietileterio itirpinamas mediag miinys. Tirpalas supilamas dalijamj piltuvl, o kolbut praplaunama 5 mL dietileterio, kuris taip pat supilamas piltuvl. Organin baz ekstrahuojama dviem 25 mL 5 % druskos rgties tirpalo porcijomis. Ekstraktai atskiriami ir supilami vien kolbut. Eterinis sluoksnis plaunamas 10 mL vandens, kuris atskirtas supilamas ankstesn ekstrakt. Gautas rgtinis ekstraktas ataldomas ledo vonioje ir paarminamas 10 % natrio hidroksido tirpalu, atsargiai j lainant iki silpnai armins reakcijos. Isiskyr kristalai filtruojami, diovinami, pasveriami ir nustatoma j lydymosi temperatra. Organin rgtis i likusio eterinio tirpalo ekstrahuojama dviem 25 mL 5 % natrio hidroksido tirpalo porcijomis. Tada eterinis tirpalas dar plaunamas 10 mL vandens. Atskirti arminiai ekstraktai ir praplovimo vanduo supilami vien kolbut. Ekstraktas ataldomas ledo vonioje, neutralizuojamas koncentruota druskos rgtimi, atsargiai j lainant iki silpnai rgios terps. Isiskyr kristalai filtruojami, diovinami, pasveriami ir nustatoma j lydymosi temperatra.

89

Liks eterinis tirpalas i piltuvlio ipilamas Erlenmejerio kolbut, diovinamas bevandeniais magnio arba natrio sulfatais 1015 minui, retkariais supurtant kolbut. Diovikl nufiltravus, eteris atsargiai igarinamas (traukos spintoje!). Lieka neutralus junginys, kuris pasveriamas ir nustatoma jo lydymosi temperatra. Atskirti junginiai identifikuojami palyginus j lydymosi temperatras su lentelje pateikt jungini lydymosi temperatromis. Parayti atlikt reakcij lygtis.

4. Chromatografija (adsorbcin)
Tai mediag atskyrimo, gryninimo ir identifikavimo metodas, kurio esm sudaro mediagos sveika su stacionaria bei pro j praeinania judria fazmis. Stacionari faz kietas adsorbentas, judri faz dujos arba skystis, praeinantys pro stacionarios fazs sluoksn. Chromatografavimo metu junginiai pasiskirsto tarp judrios ir nejudrios fazi. Judri faz eliuentas (tirpiklis), praeidamas pro adsorbent, sveikauja su juo ir jame adsorbuota mediaga ir nea j tolyn. Mediagos skiriasi savo judrumu, nevienodai sveikauja su eliuentu (tirpikliu), praeinaniu adsorbentu (juda skirtingais greiiais ir dl to atsiskiria viena nuo kitos). Chromatografinis atskyrimas tai procesas, pagrstas daugkartine mediag sorbcija ir desorbcija joms judant judanios fazs sraute per nejudani faz. Chromatografins kolonls schema pateikta deinje. Adsorbcinje chromatografijoje plaiausiai naudojami pasiskirstymas kolonlje ir ploname sluoksnyje. Pagal judanios fazs krypt chromatografija gali bti kylanioji ir nusileidianioji. Pasiskirstymas kolonlje naudojamas mediagoms atskirti. Kolonl upildoma sorbentu, daniausiai silikageliu arba aliuminio oksidu (stacionari faz). Ant virutinio sorbento sluoksnio upilamas mediag miinys, itirpintas minimaliame eliuento kiekyje. Susigrus iam tirpalui, kolonl parinktas tam tikras eliuentas (judri faz), kuris, leisdamasis savitaka emyn, nea su savimi atskirus komponentus. Kai mediagos spalvotos, galima vizualiai stebti j pasiskirstym ir ijim i kolonls. Itekantis i kolonls tirpalas nedidelmis porcijomis renkamas atskirus indus ir analizuojamas. Igarinus tirpikl (eliuent), gaunamos atskiros mediagos. Plonasluoksn chromatografija Plonasluoksnje chromatografijoje (kylaniojoje) naudojamos stiklo, metalo arba plastmass ploktels, padengtos plonu adsorbento sluoksniu. Vienas ar keli laai paruoto mediagos arba j miinio l % tirpalo kapiliaru ulainami ant ploktels krato (11,5 cm atstumu nuo ploktels apaios). Nugaravus tirpikliui, ploktel dedama stiklinait su judria faze (eliuentu). Stiklinait udengiama ploktele. Eliuento pilama nedaug, jis neturi apsemti viet, kuriose buvo ulaintas pavyzdys. Eliuentas kyla ploktele ir kartu nea mediagas. Ploktel iimama i eliuento (jam 11,5 cm nepasiekus ploktels viraus), idiovinama ir rykinama, dedant j udar ind su jodu arba po ultravioletine lempa. Jodo garai su daugeliu organini mediag sudaro spalvotus kompleksus. Ultravioletinje viesoje junginiai matomi violetini dmi pavidalu adsorbento fluorescuojaniame fone.

90

Nustatomas sulaikymo faktorius Rf kaip parodyta schemoje. ia a atstumas nuo mediagos starto linijos iki dms centro; h atstumas nuo starto linijos iki eliuento fronto linijos. Eliuentas chromatografijai parenkamas eksperimentikai, pradedant tirpikliu su nedidele eliuavimo galia. Pagal eliuavimo gali silikageliui tirpikliai isidsto: cikloheksanas pentanas tetrachlormetanas toluenas benzenas trichlormetanas dietileteris etiletanoatas etanolis acetonas acto rgtis metanolis. 2,4-dinitrofenilhidrazon sintez Karbonilini jungini 2,4-dinitrofenilhidrazonai (DNFH) karboniliniams junginiams reaguojant su 2,4-dinitrofenilhidrazinu.
O
+

lengvai

susidaro

rgioje

terpje

H2N

H N O2N

NO2

H+

H N N O2N

NO2 + H2O

DNFH turi tikslias lydymosi temperatras, lengvai kristalizuojasi ir todl taikomi karboniliniams junginiams identifikuoti. Be to, skirtingi DNFH labai skiriasi savo judrumu (sulaikymo faktoriumi Rf), todl chromatografija ploname sluoksnyje danai naudojama j miini analizavimui. Darbo metu reiks susintezuoti kai kuri karbonilini jungini (r. 3 lentel) 2,4-dinitrofenilhidrazonus, nustatyti j grynum chromatografijos ploname sluoksnyje metodu (apskaiiuoti Rf), taip pat lydymosi temperatr.
3 lentel. 2,4-dinitrofenilhidrazon lydymosi temperatros

Karbonilinis junginys Acetonas 2-Butanonas Ciklopentanonas Acetofenonas Benzofenonas Etanalis Benzaldehidas Butanalis Propanalis

Tam tikro 2,4-dinitrofenilhidrazono lydymosi temperatra, C 126 111 146 250 239 168 237 124126 155156

Reagentai: 0,5 g karbonilinio junginio, 0,4 g 2,4-dinitrofenilhidrazino, 60 mL 95 % etanolio, 2 mL konc. H2SO4. 25 mL talpos kolbutje 0,4 g 2,4-dinitrofenilhidrazino tirpinama 2 mL konc. sieros rgties. miin atsargiai, laais, kolbut supurtant, pilama 3 mL vandens ir 10 mL 95 % etanolio (dar ilt tirpal). Kitoje kolbutje 20 mL etanolio tirpinama 0,5 g karbonilinio junginio ir j supilamas anksiau paruotas 2,4-dinitrofenilhidrazino tirpalas. Miinys paliekamas stovti kambario temperatroje. Tirpalui autant (po 510 min.) pradeda kristi tam tikro 2,4-dinitrofenilhidrazino kristalai. Kristalai atskiriami, kristalinami i 95 % etanolio ir diovinami. Junginio grynumas patikrinamas plonasluoksne chromatografija. Paskui nustatoma jo lydymosi temperatra. Apskaiiuojama ieiga procentais. Chromatogramos gavimas Chromatografijai naudojamos 5x10 cm dydio silufolo ploktels.

91

Keli kristaliukai analizuojamo pavyzdio kginiame mgintuvlyje itirpinami 23 mL etanolio ir stikliniu kapiliaru vienas arba keli tirpalo laai ulainami ant ploktels l cm atstumu nuo krato. alia lainama po la pradini mediag tirpal 1,5 cm atstumu vienas nuo kito. Tirpikliui nugaravus, ploktel dedama stiklinl su eliuentu (toluenu) ir udengiama dangteliu. Eliuentas turi neapsemti viet, kuriose buvo ulaintas pavyzdys. Judri faz kyla adsorbento sluoksniu, nepasiekdama ploktels virutinio krato (lcm). Tada ploktel itraukiama i stiklinls, paymima eliuento fronto vieta, nugarinamas tirpiklis. Chromatograma rykinama jodo garuose (eksikatoriuje su jodu). Apskaiiuojamas Rf.

5. p-Toluensulfonrgtis
CH3 H2SO4 CH3

SO3H
trigurkl 100 mL talpos kolb su mechaniniu maiikliu bei grtamuoju aldytuvu supilama 32 mL tolueno ir 19 mL konc. sieros rgties. Maiant miinys silpnai virinamas, kol inyksta sluoksniai (apie 1 val.). Tada ildyti nustojama, o reakcijos miinys ipilamas 100 mL vandens (kolba praplaunama nedideliu vandens kiekiu). Pridjus aktyvuotos anglies, tirpalas virinamas 10 min. Jei tirpalas lieka tamsus, pridedama dar aktyvuotos anglies ir virinama pakartotinai. Bespalvis tirpalas nugarinamas stiklinje iki 50 mL ir ataldomas ledu. Jei nesusidaro kristalai, tai tirpalas aldomas ledu ir prisotinamas dujiniu vandenilio chloridu (gaunamas lainant sieros rgtis ant natrio chlorido). Ikritusi p-toluensulfonrgtis nufiltruojama per stiklo filtr, gerai ant jo nuspaudiama ir diovinama eksikatoriuje vir sieros rgties. Lyd. t. 104105 C, ieiga 3540 g (65 %).

6. Benzenkarboksirgtis
CH3 1.KMnO4 2.HCl
apvaliadugn 200 mL talpos kolb, sujungt su dviej atak alonu, aldytuvu ir maiikliu, sudedama 2,5 g tolueno, 3,2 g smulkiai sutrinto kalio permanganato ir 75 mL vandens miinio. Reakcijos miinys 4 val. ildomas maiant verdanio vandens vonioje (kol tampa bespalvis). Jei reakcijos miinys tebeturi rausv atspalv, tai pridedami keli laai etanolio (arba oksalo rgties), nes ie priedai redukuoja likus kalio permanganat. Reakcijos miinys ataldomas, nufiltruojamas mangano (IV) oksidas, kuris 2 kartus praplaunamas karto vandens porcijomis po 10 mL. Sujungti filtratai koncentruojami ildant, garinant vir vandens gar vonios iki 1520 mL trio. Nufiltruojamas papildomai isiskyrs mangano (IV) oksidas, kuris praplaunamas 5 mL karto vandens kiekiu. Sujungti filtratai pargtinami praskiesta (1 : 1) druskos rgtimi, tirpalas ataldomas, susidariusios nuosdos nufiltruojamos, praplaunamos nedideliu alto vandens kiekiu ir diovinamos ore. Benzenkarboksirgties ieiga 2 g, lyd. t. 122 C (i vandens).

COOH

92

7. Acetonas
OH Na2Cr2O7 (H2SO4) O

Apvaliadugn 200 mL talpos kolba sujungiama su dviej atak alonu, sujungtu su lainamuoju piltuvu ir aldytuvu. kolb supilama 20 mL 2-propanolio ir sulainama nedidelmis porcijomis (po 12 mL) oksiduojanio miinio, pagaminto nedidelje stiklinlje 60 mL vandens itirpint 22,8 g natrio bichromat atsargiai maiant ir pilant 20 mL konc. sieros rgties. I karto prasideda stipri egzotermin reakcija, ir kiekviena nauja oksiduojanio miinio porcija pridedama po tam tikro reakcijos miinio atvsinimo. Tada kolba 10 min. ildoma verdanio vandens vonioje, reakcijos miinys ataldomas, grtamasis aldytuvas pakeiiamas nutekamuoju (Libicho) ir acetonas nudistiliuojamas nuo vandens vonios pasvert ind, surenkant frakcij, turini 5558 C virimo temperatr. Gaunama apie 10 g acetono (ieiga 66 %), vir. t. 56 C.

8. 1-brombutanas
KBr + H2SO4

CH3CH2CH2CH2OH

CH3CH2CH2CH2Br

250 mL talpos apvaliadugn kolb dedama 30,5 g smulkaus kalio bromido, supilama 26 mL vandens ir 15 g butanolio-1. staius grtamj aldytuv ir lainamj piltuv, supurtant nedidelmis porcijomis, sulainama 20 mL konc. sieros rgties. Miinys virinamas 11,5 val., kaitinant atvira liepsna per skirstytuv. Paskui, vietoj grtamojo aldytuvo staius nuoulnj, nudistiliuojamas susidars butilbromidas. Distiliatas dalijamajame piltuve plaunamas 25 mL vandens ir nuo jo atskiriamas. Dar kart plaunamas 10 mL ataldytos sieros rgties, atskiriant nuo susidariusio dibutileterio ir nesoi angliavandenili. Atskyrus butilbromid nuo sieros rgties, jis praplaunamas vandeniu, tada 30 mL sotaus natrio karbonato tirpalu ir dar kart vandeniu. Atskiriant sluoksnius plovimo metu, atkreiptinas dmesys tai, kuriame, kuriam sluoksnyje yra butilbromidas! Diovinama kalcio chloridu, nufiltruojama ir perdistiliuojama. Renkama frakcija, verdanti 99103 C intervale (gryno butilbromido vir. t. 101 C ).

9. Etiletanoatas

CH3CH2OH +

CH3COOH

C2H5OCOCH3

H2O

100 mL talpos Viurco kolboje 15 mL etilo alkoholio atsargiai sumaioma su tokiu pat sieros rgties kiekiu. Kolba ukemama kamiu, kur statomas dalijamasis piltuvas. Prijungiamas aldytuvas ir ildoma alyvos vonioje iki 140 C (reakcijos miinio temperatra 110120 C). ilt miin i dalijamojo piltuvo laipsnikai leidiamas 30 mL etilo alkoholio ir 30 mL acto rgties miinys. Lainama tokiu greiiu, kokiu distiliuojasi susidars esteris. Reakcijai pasibaigus, distiliatas plakamas su prisotintu natrio karbonato tirpalu nesureagavusiai acto rgiai paalinti, kol virutin esterio sluoksn merktas mlynas lakmuso popierius neberaudonuoja. Natrio karbonatas dedamas maomis porcijomis, nes isiskiriant CO2, tirpalas smarkiai putoja. Miinys perpilamas dalijamj piltuv, esteris atskiriamas nuo vandens ir alkoholio priemaiai paalinti suplakamas su 15 mL 50 % kalcio chlorido tirpalu. Esteris atskiriamas, idiovinamas bevandeniu

93

natrio sulfatu ir nudistiliuojamas. Atkreiptinas dmesys tai, kad etilacetatas yra lakus ir gerai tirpsta vandenyje. Vir. t. 77 C, ieiga 30 g (70 %).

10. Ciklopentanonas
COOH

Ba(OH)2

O + CO2 + H2O

COOH
100 g (0,67 mol) milteli pavidalo adipo rgties gerai sumaioma su 5 g (0,015 mol) kruopiai sutrinto kristalinio Ba(OH)2. Miinys suberiamas 500 mL talpos Viurco kolb, sujungt su aldytuvu ir termometru, kurio gyvsidabrio burbullis nuo kolbos dugno yra apie 5 mm. Tada Viurco kolba per vien valand kaitinama iki 285295 C, ir i temperatra palaikoma tol, kol kolboje liks tik nedidelis kiekis sukepusios mass (geriausia temperatr palaikyti 290 C, nes 300 C ir auktesnje pradeda distiliuotis adipo rgtis). Distiliavimas utrunka apie 1,5 val. Priimtuve surinktas ciklopentanonas turi vandens, todl jis isdomas K2CO3. Kartu vandens sluoksnyje sujungiamas nedidelis kiekis adipo rgties, kuri reakcijos metu gali bti persidistiliavusi priimtuv. Ciklopentanono sluoksnis atskiriamas, diovinamas CaCl2 ir perdistiliuojamas. Ieiga 4045 g, vir. t. 128130 C, n 20 1,4348. D Literatra 1. Jakubkien, V.; Urbonas, A. Organin chemija.Vilnius: B UAB Litimo, 2000. 63 p. 2. Butkus, E.; Purvaneckas, G.; Tumkeviius, S. Organins chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: VU leidykla, 1988. 142 p.

94

Biologija

Pratybos Genovait Gedminien

1. viesinis mikroskopas, jo sandara. vairaus dydio lsteli stebjimas


Darbo tikslas Susipainti su viesaus lauko viesinio mikroskopo sandara ir veikimo principu; stebti vairaus dydio lsteles. Tyrimo objektas viesaus lauko viesinis mikroskopas: didinimo geba, skiriamoji geba, kontrastikumas; gyvieji ir fiksuotieji biologiniai objektai. Darbo eiga Naudojantis prietaiso instrukcija, susipainti su mikroskopo pagrindinmis dalimis: okuliaru, objektyvais, kondensoriumi, staleliu, makro- ir mikro- sraigtais, apvietimu ir pan. Stebti fiksuotus bakterij E. coli preparatus, parinkus apvietim ir reikiamo didinimo objektyv. Stebti mogaus audini lsteles, parinkus apvietim ir reikiamo didinimo objektyv. Stebti alio lapo audinio lsteles ir chloroplastus jose.

95

Atsiskaitymas Darbo urauose aprayti darbo su mikroskopu eig. vertinti stebt biologini objekt dydius, m, pagal okuliaro ir objektyv didinimo gebos sandaug. Literatra 1. Mader, Sylvia S. Biologija, I knyga. Vilnius: viesa, 1999, p. 5779. 2. Lodish, H.; Berk, A.; Lawrence Zipursky, S.; Matsudaira, P.; Baltimore, D.; Darnell; J. B. Molecular cell biology. New York, Second printing, 2000, p. 140142.

96

2. iuolaikin mikroskopija. Elektroninis mikroskopas


Darbo tikslas Susipainti su elektroniniu mikroskopu, jo sandara ir veikimo principu; paruoti biologinius objektus elektroninei mikroskopijai; stebti vairaus dydio objektus: bakteriofagus, augal virusus, bakterij E. coli lsteles. Tyrimo objektas Elektroninis mikroskopas. Biologini objekt paruoimas elektroninei mikroskopijai. Elektroninio mikroskopo didinimo geba, skiriamoji geba, kontrastikumas. Darbo eiga

97

is praktikos darbas atliekamas Lietuvos MA Botanikos instituto Virusologijos laboratorijoje, padedant ios laboratorijos vadovui. Stebimos skirtingai padidintos E. coli bakterij lstels. Stebimi augal virusai. Stebimi bakterij virusai bakteriofagai. Atsiskaitymas Darbo urauose aprayti elektroninio mikroskopo veikimo princip; vertinti stebt biologini objekt dydius, nm. Literatra 1. Mader, Sylvia S. Biologija, I knyga. Vilnius: Alma littera, 1999, p. 5779. 2. Lodish, H.; Berk, A.; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, P.; Baltimore, D.; Darnell, J. B. Molecular cell biology. Second printing. New York. 2000, p. 147152.

98

3. Paveldimumas ir kintamumas
Darbo tikslas

Sprendiant udavinius patikrinti genetikos inias. Tyrimo objektas


Remiantis G. Mendelio dsniais: pirmosios kartos individ vienodumas, poymi isiskyrimas, gamet grynumas. Poymi, susijusi su lytimi, paveldjimas.

Darbo eiga
Kiekvienas studentas gauna po tris udavinius. Kaip skmingi jie sprendiami, priklauso nuo to, ar sisavintas teorinis kursas: lsteli dalijimasis, mitoz, mejoz; somatins ir lytins lstels; genotipas, fenotipas, genai, aleliai, G. Mendelio dsniai bei poymi, susijusi su lytimi, paveldimumas. Udavini pavyzdiai 1 udavinys. Durnarops ied purpurin spalva ir spygliuotas sklos luktas dominuojantys poymiai; balta ied spalva ir lygus sklos luktas recesyviniai. Kryminamas homozigotinis individas purpuriniais iedais ir spygliuotomis sklomis su baltaiede durnarope, kurios sklos lygios. Kokie bus antrosios kartos palikuoni fenotipai ir koks j santykis? 2 udavinys. Deiniarankikumas (sugebjimas geriau valdyti dein rank) ir ruda aki spalva dominuojantys poymiai; kairiarankikumas ir mlyna aki spalva recesyviniai. Kokie galimi vaik fenotipai, jei j tvai rudaakiai, deiniarankiai, heterozigotiniai pagal du poymius? 3 udavinys. Hemofilija A yra liga, kuria sergant nekrea kraujas dl faktoriaus FVIII stygiaus. i liga paveldima kaip su X chromosoma susijs recesyvinis poymis. Hemofilija A sergantis vyras ved sveik moter. Jiems gim sveiki sns ir dukros, kurie sukr eimas su asmenimis, kurie nesirgo ia liga. Nustatykite, ar sirgs hemofilija A treiosios kartos asmenys i pradi i asmen ankai? Jei taip, tai kokia yra tikimyb, kad jie sirgs? Atsiskaitymas 1 udavinys. Durnarops ied purpurin spalv lemiant gen pasiymime A, ied balt spalv a, spygliuot sklos lukt B, o lyg sklos lukt b. P F1 P A//A B//B A//aB//b A//aB//b A//aB//b a//ab//b

Gametos: AB, Ab, aB, ab F2 palikuonims vertinti sudarome Peneto gardel: Gametos AB Ab aB ab AB A//A B//B A//A B//b A//a B//B A//a B//b Ab A//A B//b A//A b//b A//a B//b A//a b//b aB A//a B//B A//a B//b a//a B//B a//a B//b ab A//a B//b A//a b//b a//a B//b a//a b//b

99

Atsakymas. Antroje kartoje skirting fenotip palikuoni santykis 9 : 3 : 3 : 1; purpuriniais iedais, spygliuotu luktu : purpuriniais iedais, lygiu luktu : baltais iedais, spygliuotu luktu : baltais iedais, lygiu luktu. 2 udavinys Rud aki spalv lemiant gen paymime A, mlyn a, deiniarankikum B, kairiarankikum b. Poymius paymime: deiniarankikum D, kairiarankikum K, rud aki spalv R, mlyn M. P Gametos A//aB//b A//aB//b AB, Ab, aB, ab.

AB, Ab, aB, ab

Sudaroma, kaip ir pirmajame udavinyje, Peneto gardel. Po genotipais suraomi fenotipai. Gametos AB Ab aB ab AB A//A B//B DR A//A B//b DR A//a B//B DR A//a B//b DR Ab A//A B//b DR A//A b//b DM A//a B//b DR A//a b//b DM aB A//a B//B DR A//a B//b DR a//a B//B KR a//a B//b KR ab A//aB//b DR A//a b//b DM a//a B//b KR a//a b//b KM

Atsakymas. Tvai gali tiktis keturi fenotip palikuoni: deiniaranki rudaki; deiniaranki mlynaki; kairiaranki rudaki; kairiaranki mlynaki. 3 udavinio sprendimas. Vyro, serganio hemofilija, genotipas yra XhY. Moters genotipas XHXH. Visi sns, gim i ios santuokos, bus sveiki (XHXh), o visos dukros lig lemianio geno neiotojos (XHXh). Sn, vedusi sveikas moteris, eimose visi vaikai gims sveiki; dukroms, itekjusioms u sveik vyr, 25 % vaik gims sergantys, t. y. sirgs tik tie j sns, kurie turs gen. Tikimyb, kad sns pavelds gen, yra 50 %. Literatra 1. Mader, Sylvia S. Biologija, I knyga, Vilnius: Alma littera, 1999, p. 235250. 2. Grigalinien, I. Molekulins biologijos ir genetikos udavini rinkinys. Kaunas: viesa, 2000, 44 p.

100

4. Baltym sintez
Darbo tikslas Patikrinti inias i baltym sintezs kurso. Tyrimo objektas Baltym sintez. Darbo eiga Kiekvienas studentas gauna po penkis udavinius. J skmingas sprendimas priklauso nuo to, kaip sisavintas teorinis kursas: genetinis kodas, komplementarioji sveika, kodonai, antikodonai, genetinio kodo ypatybs, transkripcija ir transliacija.

Udavini pavyzdiai 1 udavinys. Kokios aminorgtys ir kokia tvarka susijungs polipeptidin grandin, esant tokiai DNR atkarpos struktrai: GAC TCA ATA CCA , jei iRNR tripletas CUG koduoja aminorgt leucin, GUU valin, AGU serin, GCU alanin, UAU tirozin, GGU glicin? 2 udavinys. I koki 6 aminorgi ir kaip joms isidsius sudarytas baltymas, jeigu inoma, kad paskutines tris aminorgtis koduoja iRNR dalis: GUU UUU ACU, o pirmutines tris DNR atkarpa: TTT TAT GAG , ir yra inoma, kad tRNR tripletai, atpastantys aminori sijungim polipeptidin grandin, yra: UUU lizino, UGA treonino, CAA valino, GAG leucino, UAU izoleucino, AAA fenilalanino? 3 udavinys. Susintetinta 14 baltymo molekuli. Kiek aminorgi reiks i baltymo molekuli sintezei, jei inoma, kad vyko dviej iRNR, koduojani baltym, transkripcijos ir joms sunaudota 60 nukleotid? 4 udavinys. Duota tripeptido struktra: argininas tirozinas alaninas. Taip pat inomi tRNR antikodonai (nukleotid tripletai, atpastantys amino rgties sijungimo tripeptidin grandin viet): arginino GCA, alanino CGG, tirozino AUA. Kokia bus DNR molekuls, lemianios io polipeptido sintez, seka? 5 udavinys. Nustatykite sintetinamo baltymo pirmin struktr, jei kai kurie DNR nukleotidai yra neinomi: ne ne ne C A ne ne C C G ne G A ne ne, o aminorgi, kurios eina io baltymo sudt, iRNR kodonai yra: triptofano UGG, prolino CCC, valino GUU, glicino GGG, metionino AUG? Atsiskaitymas 1 udavinio sprendimas. Duotai DNR atkarpai komplementari iRNR: CUG AGU UAU GGU. Aminorgtys polipeptidin grandin susijungs tokia tvarka: leucinas serinas tirozinas glicinas. 2 udavinio sprendimas. Visos iRNR struktra: AAA AUA CUC GUU UUU ACU. tRNR antikodonai: UUU, UAU, GAG, CAA, AAA, UGA. Pirmin baltymo struktra: lizinas izoleucinas leucinas valinas fenilalaninas tirozinas. 3 udavinio sprendimas. Vienos iRNR transkripcijai sunaudota 30 nukleotid, todl vienos baltymo molekuls sintezei bus sunaudota 10 aminorgi (30 : 3 = 10).

101

4 udavinio sprendimas. Suraome tRNR antikodonus i eils pagal polipeptido struktr: GCA AUA, CGG. iRNR, koduojant polipeptid, yra: CGU UAU GCC. DNR atkarpos, koduojanios polipeptid, nukleotid seka: GCA ATA CGG . 5 udavinio sprendimas. Sugrupuojame DNR nukleotidus tripletais, neinomus paymdami X. DNR atkarpa: XXX CAX XCC GXG AXX . DNR atkarpai komplementari iRNR: XXX GUX XGG CXC UXX. Sintetinamo baltymo pirmin struktra: metioninas valinas glicinas prolinas triptofanas. Literatra 1. Mader, Sylvia S. Biologija, I knyga. Vilnius: Alma littera, 1999, p. 235250. 2. Grigalinien, I. Molekulins biologijos ir genetikos udavini rinkinys. Kaunas: viesa, 2000.

102

Laboratoriniai darbai Gintaras Valinius

Fizikin chemija
22

1. Kietj mediag tirpimo entalpijos nustatymas


Darbo tikslas Nustatyti kietj mediag tirpimo entalpij. Tyrimo objektas Tiriama neinomos druskos arba organins mediagos tirpimo entalpija. Nustatomas iluminio efekto enklas ir jo absoliuioji reikm. Matavimo priemons

t, o C

21,5 21 20,5 20 19,5 19 18,5 18 0 200 400 600 , s


paskutinis takas prie ampul sudauant

1 pav. Temperatros kitimo kalorimetre grafikas

Kalorimetrinis indas, stiklin, stiklinis mgintuvlis-ampul su stikline nusmailinta lazdele. Termometras, leidiantis registruoti temperatros kitim 0,10,5 C tikslumu. Kaitiklis su nuolatins tampos altiniu. Darbo eiga Darbas atliekamas dviem etapais. Pirmuoju etapu nustatoma kalorimetrinio indo konstanta (ilumin talpa). Antruoju etapu studentas gauna neinomos druskos mgin (gali bti keli mginiai) ir nustato jos tirpimo ilumos efekto enkl ir dyd. Kalorimetro konstantos nustatymas kalorimetrin ind statoma stiklin su 50 g distiliuoto (dejonizuoto) vandens. kalorimetrinio indo dangtel montuojamas mgintuvlis-ampul, kuri suberiama studentui duota neinoma druska ir statoma nusmailinta stiklin lazdel, elektrinis kaitiklis, termometras. statomo termometro apatins dalies paviri reikt kiek sudrkinti glicerinu arba sutepti vakuuminiu tepalu ar vazelinu. Kalorimetrinis indas udengiamas dangteliu. Bendroji surinkto kalorimetro schema pavaizduota 2 pav. Udengus dangtel ir palaikus madaug 1015 min. stebimas temperatros kitimas (jeigu toks vyksta) kalorimetre. Laukiama, kol temperatros kitimo greitis taps didesnis nei 0,5 laipsnio per 5 min. Elektrinis kaitiklis prijungiamas prie nuolatins tampos altinio, nustatoma 2 V (patikslinti pas dstytoj!) tampa. Fiksuojamas laikas ir jungiamas nuolatins tampos altinis. Madaug kas 30 sekundi uraomas temperatros kitimas kalorimetre. Matavimo metu kalorimetras atsargiai judinamas, kad skystis vidinje stiklinje maiytsi. Elektrinis kaitiklis irgi gali bti panaudotas vandeniui maiyti kalorimetro viduje. Matuojama madaug 300500 s. tampa ijungiama, kai temperatra kalorimetre pakyla 1,52,5 C. Briama temperatros t (C) priklausomybs nuo laiko (s) kreiv ir apskaiiuojamas tiess nuolinkio koeficientas . Tada randama kalorimetro konstanta kcal pagal formul: kcal = W/, J/K, ia: W elektrinio kaitiklio galingumas, lygus 0,5 W, kai pastoviosios srovs altinio tampa lygi 2 V (pasitikrinti dl konkreios reikms pas dstytoj).

103

2 pav. Bendroji kalorimetro schema: 1 indas, kuriame palaikoma pastovi temperatra 2 dangtelis, 3 stiklin su vandeniu, 4 kaitiklis, 5 termometras, 6 ampul su tiriamja mediaga, 7 put polistireno pagrindas

Kalorimetro konstanta rodo, kiek dauli energijos ilumos pavidalu turi isiskirti kalorimetre, kad jo temperatra pakilt 1 laipsniu. inodami i konstant, galime apskaiiuoti tirpimo proceso entalpij. Tirpimo ilumos matavimas Vl stebimas temperatros kitimas per tam tikr laik. Sulaukiama tokio momento, kai temperatra kinta maiau nei 0,5 C per 5 min. Tada stiklins lazdels smailiuoju galu staigiu judesiu sudauomas ampuls su tiriamja mediaga dugnas. Fiksuojamas laiko momentas sudauymo metu ir, gana intensyviai judinant kalorimetr, pasiekiama, kad visa druska itirpt. Tirpimo proceso metu kas 30 sekundi fiksuojamas temperatros kitimas. Temperatros kitimas atvaizduojamas grafikai. Nustatomas bendrasis temperatros pokytis t (r. 1 pav.), i kurio pagal formul apskaiiuojamas entalpijos pokytis: H = kcal t, J. Jei tirpimo proceso metu temperatra pakilo, sistemos entalpija sumajo, tirpimo procesas yra egzoterminis ir atvirkiai. Atsiskaitymas pateikiamos dvi skaitins reikms kalorimetro konstanta ir neinomos mediagos savitoji tirpimo entalpija (J/g K); pateikiami kalibracinis ir temperatros eksperimento metu kitimo grafikai; paaikinami stebti reikiniai ir principai, kuriais remiantis buvo atliekami matavimai.

104

Literatra 1. Daujotis, V.; Jankauskas, T.; Kaikaris, V.; Levinskas, A.; Skuas, V. Fizikins chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Vilniaus Universitetas. 1986, p. 2835. 2. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6th edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 108 115. 3. , . .; , . . . : , 1976, . 7685.

105

2. Koligatyviosios tirpal savybs 1. Ebulioskopinis garavimo entalpijos nustatymas


Darbo tikslas Nustatyti benzeno ar kito, dstytojo nurodyto, tirpiklio ebulioskopin konstant ir apskaiiuoti molin jo garavimo entalpij. Tyrimo objektas Ebulioskopinis efektas viena tirpal koligatyvij savybi, pasireikianti tirpalo virimo temperatros padidjimu, palyginti su grynuoju tirpikliu. iame darbe bus tiriamas benzenas arba kitas dstytojo nurodytas tirpiklis. Matavimo priemons Distiliacijos ranga: apvaliadugn 250 300 mL talpos kolbut su lifo ataka, aldytuvas, cilindras distiliatui surinkti. Speciali distiliavimui skirta elektrin plytel. Termometras, leidiantis registruoti virimo temperatr 0,1 C tikslumu. Pipets. Technins svarstykls, leidianios sverti 0,1 g tikslumu. Individualiosios apsaugos priemons apsauginiai akiniai arba apsauginis skydas2, vienkartins gumins pirtins. Darbo eiga
1 pav. Bendroji distiliatoriaus schema
Distiliacijos kolbut Cilindras

Termometras

onin ataka aldytuvas

Elektryn plytel

Surenkama distiliavimo aparatra. Bendroji distiliatoriaus schema parodyta 1 pav. kolbut dedama keli trupiniai susmulkinto stiklo ar keramikos, kad tolygiau virt. Pro onin distiliavimo kolbuts atak kolbut supilama 50 mL benzeno (apskaiiuojama ir usiraoma pilto benzeno mas, mtirpiklio, benzeno savitoji mas yra 0,88 g/cm3). Surinkta distiliacijos aparatra parodoma dstytojui ar laborantui. Draudiama jungti kaitinimo plytel, neparodius dstytojui paruotos distiliavimo aparatros. jungiama elektrin plytel ir kaitinama tol, kol kolbutje uverda benzenas. Tada pagal virimo intensyvum (jis neturi bti labai smarkus) gali tekti sumainti kaitinim. Termometro gyvsidabrio rezervuaras turi bti pusiau pamerktas tirpal. Kaitinant stebimi distiliavimo aparatros termometro rodmenys. ios eksperimento dalies uduotis nustatyti tiksli benzeno virimo temperatr. Paprastai ji yra 80,1 C, kai slgis p = 1 atm, taiau gali kisti priklausomai nuo atmosferos slgio. Kai i aldytuvo pradeda lati benzeno distiliatas, madaug kas 15 s intervalais uraoma 1012 termometro rodmen. Nustaius tiksli benzeno virimo temperatr,

Koligatyviosios tirpalo savybs tai savybs, priklausanios tik nuo tirpiklio fizikinio ir cheminio bvio, bet ne nuo tirpinio. Vienintelis tirpinio parametras, turintis takos koligatyviosioms savybms, yra io tirpinio koncentracija (pvz., molin dalis). 2 darb draudiama dirbti be apsaugini akini!

106

kaitinimo plytel ijungiama. Distiliacija nutraukiama, atsargiai pakeliant distiliavimo aparatr. Imatuojamas distiliuoto benzeno tris, reikm usiraoma. Apskaiiuojama vidutin benzeno virimo temperatra Tbenz. Atvsus distiliavimo kolbutei tiek, kad ranka galima bt atidaryti onins atakos lifo kamt, pro j benzen suberiama 6,88 g bifenilo (dstytojas gali nurodyti kit mediag ir jos kiek). Prie tai elektros plytel reikia patraukti on. Taip pat pro atak supilamas distiliuotasis benzenas. Ataka ukemama ir pradedama kaitinti, kaip aprayta anksiau. Kadangi abiej eksperiment slygos yra vienodos, t. y. atmosferos slgis per 2030 minui menkai tepakinta, tai pagal virimo temperatros padidjim T galima nustatyti ebulioskopin benzeno (ar kito tirpiklio) konstant, kuri lygi santykiui Kbp = T/m, ia: T virimo temperatros pokytis, laipsniais, T = Ttirp. Tbenz., Ttirp. tirpalo virimo temperatra, Kbp ebulioskopin tirpiklio konstanta, m tirpinio molialumas, ireiktas mol kg1. Taigi temperatros pokytis nustatomas eksperimentikai, o tirpinio molialumas apskaiiuojamas pagal lygt: m = mx/(Mxmtirpiklio), ia: mx bifenilo (ar kito dstytojo nurodyto tirpinio) mas gramais, Mx tirpinio molio mas gramais, mtipriklio tirpiklio mas kilogramais. Vykstant distiliacijai molialumas ir atitinkamai T kis. Todl kai tirpalas prads virti, reiks usirayti ne tik distiliacijos temperatr, bet ir distiliuotojo benzeno kiek. Atliksime 1215 matavim madaug kas 15 5 s. Sudarysime toliau pateikto pavyzdio lentel. Dviejose paskutiniosiose lentels eilutse pateiksime vidutin tirpalo virimo temperatr ir vidutin ebulioskopins konstantos reikm. Jas takysime toliau, skaiiuodami molin benzeno virimo entalpij (J/mol): (2) (1)

H vir . = R Tbenz
ia:

M benz 1000 K bp

R universalioji duj konstanta, lygi 8,314 J K 1 mol 1, Mbenz benzeno (tirpiklio)molio mas gramais. Savitoji tirpiklio garavimo entalpija, apskaiiuojama padalijant molin entalpij i tirpinio mass (gramais arba kilogramais). Tirpalo virimo temperatra, C Virimo temperatros pokytis T, C Distiliuojamo tirpalo molialumas, Ebulioskopin mol kg1 konstanta m = mx/[Mx(mtirpiklio, pr. mdistil.)], mtirpiklio, pr. yra pradin benzeno Kbp = T/m mas, kg

Matavimo nr.

Distiliuotojo benzeno mas mdistil., kg

1 2 3 4 5 Vidutin tirpalo virimo temperatra, Ttirp.vidut. Vidutin ebulioskopins konstantos reikm, Kbpvidut.

107

Atsiskaitymas
pateikiama nustatyto pavyzdio eksperimentini duomen lentel; apskaiiuojama molin ir savitoji tirpiklio garavimo entalpijos.

Literatra 1. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6th edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 297 302. 2. , . .; , . . . : , 1976, . 137143.

108

3. Reakcijos pusiausvyros konstantos nustatymas


Darbo tikslas Nustatyti chemins reakcijos KI + I2 KI3 pusiausvyros konstant. Tyrimo objektas

KI +I2KI3

Tyrimo objektas yra chemin trij mediag vandenyje pusiausvyra: KI, I2 ir KI3. Norint nustatyti chemins pusiausvyros konstant, reikia inoti i trij mediag pusiausvyrines koncentracijas. Jodas lengvai nustatomas titruojant tiosulfato tirpalu, kaip indikatori naudojant krakmol. Taiau KI3 junginys yra labai labilus, todl tik pradjus titruoti jod tiosulfatu, KI3 greitai skyla, taigi titruojant I2 ir KI3 pusiausvirj miin nustatomas bendras jodo (laisvojo ir susijungusio KI3) kiekis tirpale. i problema isprendiama pritaikant jodo savyb tirpti organiniame su vandeniu nesimaianiame, tirpiklyje. Tam tekt nustatyti molekulinio jodo pasiskirstymo tarp organinio tirpiklio ir vandens konstant. Matavimo priemons Dalijamasis piltuvas (100250 mL talpos), kolbut su kamiu, 25 mL biuret, graduotos 5 ir 10 mL pipets, 50 mL stiklinls, sotusis jodo tirpalas anglies tetrachloride, 0,1 M KI tirpalas, sotusis KI tirpalas, 0,02 M Na2S2O3 tirpalas, krakmolo tirpalas vandenyje. Darbo eiga I pradi nustatome molekulinio jodo pasiskirstymo tarp tetrachlorido ir vandens konstant: Kpasisk. = [I2]tetrachloridas/[I2]vanduo (1)

Tam tikslui 5 mL soiojo jodo tirpalo anglies tetrachloride sumaioma ukemamoje kolbutje su 50 mL vandens. Madaug 1520 minui miinys intensyviai kratomas. Tada miinys perpilamas dalijamj piltuvl, pastatomas stov ir paliekamas nusistovti, kad organin ir vandes fazs visikai atsiskirt. Fazs atskiriamos skirtingas stiklinles. Erlenmejerio kolb imama 3 mL jodo tirpalo tetrachloride, pridedama 2 mL vandens ir lainami keli laai soiojo KI vandeninio tirpalo, pridedami keli laai krakmolo tirpalo. Prie pradedant titruoti ir titravimo metu miinys intensyviai supurtomas. Titruojama 0,02 M tiosulfato tirpalu, kol inyksta mlyna spalva. Pasiymime titravimui sunaudoto tiosulfato tirpalo tr A, mL. Tokia paia seka titruojama ir vandenin jodo faz. Tik imama 30 mL vandens tirpalo ir, pridjus tik kelis laus krakmolo tirpalo, titruojama tiosulfato tirpalu, kol inyksta mlyna spalva. Sunaudoto tiosulfato tirpalo tr paymsime B, mL. Molekulinio jodo pasiskirstymo konstanta bus1: Kpasisk. = 10A/B. (2)

Antrajuoju etapu atliekame analogik eksperiment tik naudodami ne gryn vanden, o 0,1 M KI tirpal. iplaut kolbut su kamiu vl pridedama 5 mL soiojo jodo tirpalo anglies tetrachloride ir 50 mL 0,1 M KI tirpalo. Vl 1520 min. miinys intensyviai kratomas. Dabar dalis jodo, buvusio soiajame anglies tetrachlorido tirpale, pereina vandenin terp, ir susidaro kompleksas KI3. Laikome, kad pasiskirstymo konstanta nepriklauso
1

Paaikinkite, kodl pasiskirstymo konstant paprasiau skaiiuoti pagal (2), o ne pagal (1) lygt.

109

nuo vandenyje vykstanios reakcijos KI + I2 KI3. Pastaba: KI3 i esms netirpsta anglies tetrachloride. Po 15 20 min. iplautame dalijamame cilindre leidiama atsiskirti organinei ir vandens terpms. I pradi titruojami 3 mL anglies tetrachlorido tirpalo. Titravimo procedra yra tokia pati kaip ir pirmuoju etapu. Sunaudoto tiosulfato tirpalo kiekis paymimas A1. Vandens fazei titruoti imama 30 mL vandens tirpalo. Jame yra itirps laisvasis jodas ir KI3 kompleksas, kuris titravimo metu skils, atpalaiduodamas laisvj jod. Taigi bendrj tiosulfato tirpalo tr (mL), sunaudot vandeniniam tirpalui titruoti, paymjus B*, galima urayti: B* = B1 + B2, ia: B1 tiosulfato tirpalo tris (mL), sunaudotas laisvajam jodui vandeninje terpje titruoti, B2 tiosulfato tirpalo tris (mL), sunaudotas susijungusiam KI3 jungin jodui titruoti. B1 lengvai randame lygt (2) ra eksperimentin reikm A1. inodami, kad jodas reaguoja su tiosulfatu ekvimolikai, galime apskaiiuoti reakcijoje dalyvaujani jungini pusiausvyrines koncentracijas: [I2] = B1 [Na2S2O3]/30, [KI3] = (B* B1) [Na2S2O3]/30, [KI] = 0,1 [KI3], ia: [Na2S2O3] natrio tiosulfato molin koncentracija (0,02 M), [KI] lygus 0,1 M. inodami vis trij jungini pusiausvyrines koncentracijas, apskaiiuojame pusiausvyros konstant: Kpus. = [KI3]/{[I2] [KI]}. Atsiskaitymas pateikiami eksperimentiniai titravimo duomenys: A, B, A1, B*; pateikiamos apskaiiuotos pasiskirstymo ir pusiausvyros konstantos; paaikinama eksperimento logika, uraoma titravimo reakcija. (7) (4) (5) (6) (3)

Literatra , . .; . . . . : , 1976, . 161172.

110

4. Jon pernaos ypatum tyrimas


Darbo tikslas Itirti jon judjim elektriniame lauke. Nustatyti katijon ir anijon pernaos skaiius. Tyrimo objektas Tiriama elektros pernaa dl neorganins ar organines rgties (bazs) jon judjimo vandeniniame tirpale. Matavimo priemons ir tirpalai Elektrolizs indelis su grafito elektrodais. 25 mL biuret su stoveliu, 5 ir 10 mL pipets, plokiadugn 50 100 mL kolbut arba stiklinl, du 25 mL matavimo cilindrai. Nuolatins srovs altinis, vario kulonometras. Analizins svarstykls. Darbinis tirpalas 0,1 M HClO4 arba 0,1 M KOH. Tirpalai titravimui 0,01 M NaOH arba 0,01 M HCl, fenolftaleino tirpalas, vario kulonometro tirpalas 0,2 M CuSO4 + 0,1 M H2SO4 + 0,001 M tiokarbamido. Darbo eiga Surenkama elektrolizs schema. Indelis pripildomas dstytojo ar laboranto nurodyto elektrolito (0,1 M HClO4 arba 0,1 M KOH). Vario kulonometro elektrodas kruopiai nuplaunamas vandeniu, nusausinamas, pasveriamas analizinmis svarstyklmis (4 skaii po kablelio tikslumu) ir statomas kulonometro indel1.

1 pav. Elektrolizs schema: 1 indelis su tiriamuoju elektrolitu, 2, 3 grafitiniai elektrodai (anodas ir katodas), 4 vario kulonometras su katodu ir anodu, 5 nuolatins tampos altinis, 6 indelis katolitui, 7 indelis anolitui
1

Jeigu darbe dstytojo nurodymu kulonometras nenaudojamas, tai pratekjs pro cel elektros kiekis apskaiiuojamas pagal ampermetro rodmenis ir elektrolizs trukm.

111

Sujungiama elektrin elektrolizs schema (r. 1 pav.). Ji parodoma dstytojui ar laborantui. Draudiama srovs altin jungti tinkl, neparodius sujungtos schemos dstytojui. jungiamas nuolatins tampos altinis ir ufiksuojamas elektrolizs proceso pradios laikas. Elektrolizs tampa nustatoma tokia (1020 V), kad tekanios srovs stiprumas bt apie 20 mA. Elektroliz vykdoma 4050 min. Pasiymjus elektrolizs laik, srovs altinis ijungiamas, o katolitas ir anolitas tuojau pat ipilami atskirus matavimo cilindrus ir juos naudojant imatuojami abiej tirpal triai. Tarkime, darbe buvo tiriamas vienbazs rgties tirpalas. Titravimo bdu nustatoma, kiek moli rgties yra katolite ir anolite. Titravimui atskirai imsime po 2 mL anolito ir katolito. Kiekvien titravim kartosime 2 kartus. Taip pat du kartus nutitruosime po 2 mL pradinio rgties tirpalo. Imsime titravimo rezultato vidurk. Po elektrolizs rgties koncentracija katolite sumas, o anolite padids, palyginti su pradine rgties koncentracija. inodami pradin rgties koncentracij, galime nustatyti rgties kiekio pokyius anolite ir katolite. Tarkime, kad katolito buvo A mL. Tada rgties kiekis A mL katolito prie elektroliz yra: nkat,1 = [0,01 V,1 A/2]/1000, ia: V,1 pradiniam rgties tirpalui titruoti sunaudoto armo kiekis, mL (imame dviej titravim rezultat vidurk). Po elektrolizs liks rgties kiekis katolite yra: nkat,2 = [0,01 V,2 A/2]/1000, ia: V,2 katolito po elektrolizs titruojant sunaudoto armo kiekis, mL. Rgties kiekio pokytis (sumajimas) katolite yra: nkat = nkat,2 nkat,1. Analogikai apskaiiuosime ir rgties kiekio pokyt (padidjim) anolite. Rgties kiekio pokyiai katolite ir anolite leidia apskaiiuoti katijon ir anijon tiriamajame tirpale pernaos skaiius: nkat = nan = t (Q/F), ia: nkat ir nan rgties kiekio sumajimas ir padidjimas atitinkamai katolite ir anolite, t ir t+ atitinkamai anijono ir katijono pernaos skaiius, Q elektrolizs metu pratekjs elektros kiekis, F Faradjaus skaiius (96480 C). Q randamas pagal vario kulonometro rodmenis: Q = 2[(m2 m1)/63,5] F, ia: m1 ir m2 atitinkamai vario kulonometrins ploktels mas prie elektroliz ir po elektrolizs. Kai vario kulonometras nenaudojamas, srovs kiekis apskaiiuojamas pagal formul: Q = I , ia: I srovs stiprumas (A), elektrolizs laikas (s). Toks srovs kiekio apskaiiavimas tinka tada, kai I = const elektrolizs metu. Prieingu atveju reikia integruoti srov pagal laik. t+ = 1 t ,

112

Atsiskaitymas: pateikiami tiramos rgties ar bazs jon pernaos skaiiai; paaikinami stebtieji reikiniai ir matavimo principai.

Literatra 1. Baltrnas, G. Fizikins chemijos laboratoriniai darbai. Elektrochemija. Vilnius: Vilniaus Universitetas. 2001, p. 36. 2. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6th edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 365 371.

113

5. Molekuli dipolinio momento nustatymas


Darbo tikslas Nustatyti polins molekuls dipolin moment. Tyrimo objektas Tiriama dstytojo nurodyta organin polin mediaga. Taikant Debajaus lygt nustatomi molekuls poliarizuojamumas bei individualus dipolinis momentas. Plokiojo kondensatoriaus talpos matavimo metodu nustatoma organins mediagos dielektrin skvarba. Matavimo priemons Kompleksinis skaitmeninis matuoklis M890F1, darbini elektrod pora, 50 g svarelis, polietileno plvels tarpin, perforatorius priemon kiaurymei polietileno plvelje isikirsti, kelios popierins servetls, dvi graduotos 1 mL pipets, stiklinl tirpalui pasiruoti, vienkartins gumins pirtins. Darbo eiga Darbas atliekamas trimis etapais. Pirmuoju etapu imatuojama tuios elektrod sistemos ( 1 pav.) elektrin talpa ir apskaiiuojama sistemos konstanta:
C0 = A 0 = K cell , d

ia: Co tuios elektrod sistemos talpa, A darbini elektrod plotas (apytiksliai 3,2 cm2), d atstumas tarp elektrod (apytiksliai 0,01 cm), o vakuumo dielektrin skvarba (8,85 1014 F/cm).

1 pav. Mediag dipolinio momento matavimo elektrod sistema

r. darbo su matuokliu M890F apraym.

114

Ms analizuojamos sistemos parametrai leidia vertinti apytiksl ios konstantos reikm: Kcell = 3,2 8,85 1014/0,01 = 28,32 10 11 F (28,32 pF).

i reikm priklauso nuo tikslios matavimo sistemos geometrijos, o ypa nuo dielektriko plvels storio d. Jungiamiesiems laidams, kuriais objektas jungiamas prie prietaiso, bdinga ir vadinamoji parazitin talpa. Taigi norint padidinti matavim tikslum bei ivengti parazitini laid talp takos, labai rekomenduojama prie kiekvien matavim nustatyti tuios sistemos konstant Kcell. Tai atliekama matuojant tuios elektrod sistemos talp. Elektrod sistem sudaro pagrindo ploktel (a-elektrodas, 1 pav.), ant kurios padedama polietilenin madaug 0,01 cm storio plvel su apskrita apytiksliai 2 cm skersmens kiauryme centre. Ant plvels dedama antroji metalin ploktel (b-elektrodas, 1 pav.) ir prispaudiama 50 g svareliu. Kalibracinio matavimo metu elektrod sistema turi bti idealiai sausa. Antrasis etapas. Imatavus cels talp, svarelis ir b-elektrodas nuimami ir pipete ant a-elektrodo paviriaus centre ulainamas laas gryno nepolinio tirpiklio1. Naudosime benzen, nors dstytojas savo nuoira gali nurodyti ir kit nepolin tirpikl. b-elektrodas grinamas viet ir prispaudiamas svareliu. Imatuojama grynojo tirpiklio elektrin talpa C1, pagal j apskaiiuojama dielektrin tirpiklio konstanta: 1 = C1/Kcell. Treiasis etapas. Sausai nuvalius elektrodus po antrojo etapo matavimo, tarp elektrod ulainamas laas polins mediagos tirpalo benzene. Tirpal i anksto turi pasiruoti pats studentas taip, kad tirpinio molin dalis bt 0,2. Imatuojama tirpalo talpa Ctirp. Pagal j apskaiiuojama tirpalo dielektrin konstanta: tirp = Ctirp/Kcell. Skaiiavimai Kadangi tiriamoji polin mediaga (tirpinys) yra itirpinta nepoliniame tirpiklyje, skaiiavimams taikysime molini poliarizacij adityvumo princip: Ptirp. = P1X1 + P2X2 , ia: (1)

P1, P2, X1 ir X2 atitinkamai tirpiklio (indeksas 1) ir tirpinio (indeksas 2) molins poliarizacijos ir molins dalys. Tirpinio molin poliarizacija gali bti nesunkiai apskaiiuota i (1) lygties: P2 = ( Ptirp. P1X1)/X2. Deinje lygybs pusje esanios Ptirp ir P1 randamos i dielektrini konstant pagal lygtis: Ptirp. = [(tirp. 1)/( tirp. + 2)] (Mtirp./) ir P1 = [(1 1)/(1 + 2)] (M1/), Mtirp. = M1X1 + M2X2 (Mtirp. yra vidutin tirpalo mas), o tirpalo tank prilyginsime tirpiklio (benzeno) tankiui. Apskaiiav P2, uraome tirpinio Debajaus lygt: (2)

is darbas turi bti atliekamas traukos spintoje arba labai gerai vdinamoje patalpoje. Naudojami tirpikliai yra kenksmingi sveikatai ir didesns j koncentracijos ore gali sukelti sunkius apsinuodijimus.

115

P2 =

N A N 2 , + A 3 0 9 0 k BT

(3)

ia: NA Avogadro skaiius, 0 vakuumo dielektrin skvarba 8,85 10 14 F/cm, kB Bolcmano konstanta, lygi 1,3806 10 23 J/K, T absoliuioji temperatra, - poliarizuojamumas, dipolinis momentas. Mediagos poliarizuojamumas yra nustatomas atliekant molins refrakcijos matavimus. iame darbe poliarizuojamum nenustatysime. Pasinaudodami lentelse pateikiamomis inom organini mediag molekuli poliarizuojamumo reikmmis, pagal eksperimentin P2 reikm i (3) lygties apskaiiuojame molekuls dipolin moment. Kai kuri organini mediag poliarizuojamumo reikms nurodytos priedo lentelje. Atsiskaitymas pateikiama apskaiiuota dipolinio momento reikm; paaikinami stebti reikiniai ir principai, kuriais remiantis buvo atliekami matavimai.

Literatra 1. Daujotis, V.; Jankauskas, T.; Kaikaris, V.; Levinskas, A.; Skuas, V. Fizikins chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Vilniaus Universitetas. 1986, p. 722. 2. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6th edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 700 711. 3. Atkins, P. Physical Chemistry. W. H. Freeman and Company. San Francisco. Second Edition. 1978, p. 766 778. Priedas
Kai kuri organini mediag poliarizuojamumas1

Junginys CH3Cl CH2Cl2 CH3OH Kamparas 1 debajus = 3,3381030 Cm = 3,338 1028 Ccm

/1036, J1 C2 cm2 5,04 7,57 3,59 0,365

Kai kada molekuli poliarizuojamumai literatroje pateikiami 3 arba cm3, t. y. trio vienetais. is dydis vadinamas poliarizuojamumo triu ir ymimas . Poliarizuojamum galima apskaiiuoti i pagal lygt: = 4 o. ioje lygtyje turi bti ireiktas cm3, todl reikia prisiminti, kad 1 3 = 1024 cm3.

116

6. Difuzijos koeficiento nustatymas sukamuoju diskiniu elektrodu


srov

Darbo tikslas Naudojant sukamj diskin elektrod nustatyti redokso aktyviosios dalels difuzijos koeficient. Tyrimo objektas Nustatysime hidroksimetilferoceno difuzijos koeficient, tirdami jo oksidacij HMF e <=> HMF+, ant sukamo diskinio auksinio arba grafitinio elektrodo1. Matavimo priemons

rib

potencialas

1 pav. Srovs priklausomyb nuo potencialo

Poliarografinis analizatorius PA-3, leidiantis tiesikai keisti poliarizuojamj tamp. Elektrochemin cel su lyginamuoju sidabro chloridiniu elektrodu, pripildytu soiojo NaCl tirpalo, ir pagalbiniu Pt arba grafito elektrodu. Sukamojo diskinio elektrodo stendas su daniamaiu apsisukim daniui matuoti. Matavimams naudojamas fosfatinis 0,1 M buferinis tirpalas (pH = 6,86), turintis 0,1 M NaClO4 elektriniam tirpalo laidumui padidinti2. Hidroksimetilferoceno 10 mM3 tirpalas tame paiame buferyje. Dvi 5 mL pipets ir 50 mL stiklinl. Darbo eiga Tiriamasis tirpalas ruoiamas i esamo buferinio ir hidroksimetilferoceno tirpal. Pipete paimami 20 mL buferio ir 5 mL hidroksimetilferoceno tirpal, sumaiomi stiklinlje ir supilami elektrochemin cel. Cel udengiama dangteliu, o pro dangtelio kiaurymes sustatomi palyginamasis ir pagalbiniai elektrodai. Cel, atsargiai prilaikant i apaios, pakeliama ir ufiksuojama taip, kad sukamas diskinio elektrodo strypelis pasinert tirpal (kaip parodyta 2 pav.). Sukamojo diskinio elektrodo apsuk matavimo blokelio koaksialinis laidas prijungiamas prie danimaio. Jeigu bus naudojamas danimatis 3-33, tai kabelis jungiamas A lizd, o deinje pusje esaniomis rankenlmis Nr. 1 ir Nr. 2 nustatomas danio matavimo reimas f bei skaiiavimo laikas 1 s. Taip nustatytas danimatis rodys sukamojo elektrodo apsisukim per 1 min. skaii. Elektrodai jungiamaisiais laidais prijungiami prie poliarografinio analizatoriaus. Valdymo rankenlmis Nr. 1, Nr. 2 ir Nr. 6 nustatomas pradinis potencialas, skleidimo amplitud ir potencialo skleidimo greitis, jungikliu Nr. 4 potencialo skleidimo kryptis. Priklausomai nuo konkreios elektrochemins sistemos ie parametrai gali skirtis, todl dirbant btina pasikonsultuoti dl i dydi su dstytoju ar laborantu. jungiamas sukamasis diskinis elektrodas ir palaukiama, kol stabilizuosis daniamaio registruojamos sukimosi reikms. Tada jungiama cel ir dvikoordinaiu saviraiu uraoma ciklin voltamperograma.4
1 2

Dstytojo nurodymu gali bti nustatomas kitos elektroaktyvios mediagos difuzijos koeficientas. Vietoj NaClO4 kaip viena i buferio sudtini mediag gali bti naudojamas 0,1 M KCl. 3 Hidroksimetilferocenas kambario temperatroje neitirpsta iki 10 mM, todl tirpalas yra drumstas. Hidroksimetilferoceno tirpal, prie imant skiedimui, reikia paildyti iki madaug 5060 C.
4

Matavim sekos apra studentas gauna laboratorijoje.

117

Sukamojo disko elektrodo kontaktas

Sukamasis diskinis elektrodas Palyginamasis Ag/AgCl elektrodas Pagalbinis grafito elektrodas

Elektrochemin cel su elektrolitu

2 pav. Matavimo priemoni surinkimo schema

Tipika sukamojo diskinio elektrodo voltamperograma (srovs i priklausomyb nuo potencialo E) parodyta 1 pav. iame darbe reikia gauti kelias voltamperogramas, esant skirtingiems diskinio elektrodo sukimosi greiiams1. Paprastai gaunamos 45 voltamperogramos. Skaiiavimai Uraius 45 voltamperogramas, nustatomos difuzins ribins srovs reikms. Lygtis, susiejanti difuzijos ribin srov Irib. su diskinio elektrodo sukimosi greiiu, vadinama Levio (Levich) lygtimi ir yra [2]: Irib = 0,620nFADo2/31/2v1/6Co* . ia: A diskinio elektrodo plotas (cm2), Do elektroaktyviosios mediagos difuzijos koeficientas (cm2/s), sukamojo diskinio elektrodo sukimosi greitis rad/s, v kinematinis klampis (cm2/s), kurio reikm praskiest vandenini tirpal, kai t = 20 C, yra artima 0,01 cm2/s, * Co elektroaktyvios mediagos koncentracija tirpale (mol/cm3), n elektron, dalyvaujani redokso reakcijoje, skaiius, F Faradjaus konstanta (96 500 C/mol). Kaip matome i lygties, tarp ribins srovs ir kvadratins aknies i diskinio elektrodo sukimosi greiio turi bti tiesin priklausomyb. (1)

Sukamojo diskinio elektrodo sukimosi greiiai keiiami tik su laboranto ar dstytojo pagalba ir jiems nurodius.

118

Atsiskaitymas darbo rezultatai pateikiami tokios lentels pavidalu: Eil. nr. Sukimosi greitis, rad s 1 Ribin srov, A

Pagal iuos duomenis briama grafin priklausomyb Irib. nuo 0,5; nustatomas tiess nuolinkio kampo koeficientas . Pagal (1) lygt matome, kad: = 0,620nFADo2/3v1/6Co*, i ios lygties randame elektroaktyvios mediagos difuzijos koeficient.

Literatra Bard, Allen J. and Faulkner, Larry R. Electrochemical Methods. John Willey & Sons, New York. 1980, p. 230 231.

119

7. Elektrono pernaos greiio konstantos nustatymas ciklins voltamperometrijos metodu


Darbo tikslas Nustatyti heterogenins elektrono pernaos konstant ciklins voltamperometrijos metodu. Tyrimo objektas Tiriama elektrono pernaa kalio heksacianoferato redokso reakcijoje ant inertinio Au (arba Pt) elektrodo. Jonin tiriamos oksidacijos-redukcijos reakcijos lygtis: Fe(CN)63 + e <=> Fe(CN)64 .
1 pav. Tipin voltamperograma

i reakcija lengvai vyksta ant inertini elektrod, reakcijos reagentai ir produktai stabils.1 Matavimo priemons Poliarografinis analizatorius PA-3, leidiantis tiesikai keisti poliarizuojamj tamp. Elektrochemin cel su darbiniu Au (arba Pt) elektrodu, palyginamasis sidabro chlorido elektrodas, pripildytas soiojo KCl tirpalo, pagalbinis Pt elektrodas. Matavimams fosfatinis 0,01 M buferinis tirpalas (pH = 7,0), turintis 0,1 M KCl elektriniam tirpalo laidumui padidinti. 0,1 M redokso mediagos (K4Fe(CN)6 arba K3Fe(CN)6) tirpalas tame paiame buferyje, 50 mL matavimo cilindras, 5 mL pipet ir stiklinl. Darbo eiga Tiriamasis tirpalas ruoiamas i esamo buferinio ir redokso mediagos tirpal. Pipete paimamas reikiamas oksidacins-redukcins mediagos tris (alikvota) ir perkeliamas matavimo cilindr. stiklinl pilame buferinio tirpalo ir i jos pamau, atsargiai maiydami, perpilame reikiam kiek buferio matavimo cilindr. Konkrei tiriamo tirpalo koncentracij nurodo dstytojas. Studentas pats apskaiiuoja reikiamus tirpal trius. Skaiiavimo pavyzdys. Uduotis pasiruoti 50 mL 0,01 M redokso mediagos tirpal fosfatiniame buferyje. Imame 5 mL 0,1 M redokso mediagos tirpalo ir perkeliame matavimo cilindr. Pridedame fosfatinio buferio iki 50 mL. Pagamintas tirpalas supilamas elektrochemin cel. Cel udengiama dangteliu, o pro dangtelio kiaurymes sustatomi darbinis, palyginamasis ir pagalbinis elektrodai. Elektrodai jungiamaisiais laidais prijungiami prie poliarografinio analizatoriaus. io valdymo rankenlmis nustatomas pradinis potencialas, potencialo skleidimo greitis ir skleidimo amplitud, jungiama cel ir dvikoordinaiu saviraiu uraoma ciklin voltamperograma.2 Tipin voltamperograma (srovs i priklausomyb nuo potencialo E) parodyta 1 pav. iame darbe reikia gauti kelias voltamperogramas, esant skirtingiems potencialo skleidimo greiiams.

1 2

Dstytojas gali nurodyti tirti ir kit oksidacijos-redukcijos reakcij. Matavim sekos apra studentas gauna laboratorijoje.

120

Skaiiavimai Tipika voltamperograma turi du srovs maksimumus katodin, kuris esti skleidiant potencial neigiama kryptimi, ir anodin, kai potencialas sklinda teigiama kryptimi. Atstumas tarp i maksimum E leidia apskaiiuoti heterogenin elektrono pernaos greit tarp redokso dalels ir elektrodo. Kuo ltesn elektrono pernaa, tuo didesnis atstumas tarp maksimum. Kai pernaa vyksta labai greitai, E artja rib, kuri 298 K temperatroje yra lygi 58 mV, jei redokso reakcija yra vienelektron. Labai svarbu, kad atstumas tarp srovs maksimum priklauso nuo potencialo skleidimo greiio. Didjant skleidimo greiiui, atstumas didja, todl manoma nustatyti greitesni elektrono pernaos reakcij konstantas. Elektrono pernaos greiio konstanta skaiiuojama pagal lygt (1):
DO k0 D R , = [DO v( nF / RT )]1 / 2
/2

(1)

ia: k0 elektrono pernaos greiio konstanta (cm/s), Do oksiduotos redokso formos difuzijos koeficientas, DR redukuotos formos difuzijos koeficientas (cm2/s), v potencialo skleidimo greitis (V/s), n elektron, dalyvaujani oksidacijos-redukcijos reakcijoje, skaiius, F Faradjaus konstanta (96500 C/mol), R universalioji duj konstanta, lygi 8,31 J/(K mol), T absoliuioji temperatra, elektrodinio proceso simetrijos koeficientas (artimas 0,5). Funkcija yra bedimens skaitin funkcija, nusakanti ry tarp E ir elektrono pernaos greiio konstantos. Jos reikms pateiktos 1 lentelje.
1 lentel. Ryys tarp kinetins funkcijos ir atstumo tarp katodinio ir anodinio srovs maksimum

E, mV

20 61

7 63

6 64

5 65

4 66

3 68

2 72

1 84

0,75 92

0,5 105

0,35 121

0,25 141

0,10 212

Jei atstumo tarp maksimum reikms nra lentelje, ji randama tiesins interpoliacijos bdu. Tokiu bdu eksperimentikai imatav E, esant keliems potencialo skleidimo greiiams, pagal lygt (1) apskaiiuojame elektrono pernaos greiio konstant. Skaiiuojama supaprastinus DO DR, o DO reikm randama inyne arba nurodoma dstytojo. Jeigu tiriama elektrono pernaa ferocianidinje redokso sistemoje, taikoma DO reikm, lygi 0,6 105 cm2/s.

Atsiskaitymas
rezultatai pateikiami tokioje eksperimentini duomen lentelje (2 lentel):

121

2 lentel

Apskaiiuota konstantos reikm, ko (cm/s)

Potencialo skleidimo greitis, (V/s)

apskaiiuojama vidutin konstantos reikm ir standartin paklaida.

Literatra 1. 2. Bard, Allen J. and Faulkner, Larry R. Electrochemical Methods. John Willey & Sons, New York 1980, p. 230231. , .; , . . : , 1986, . 5158.

122

8. Koligatyviosios tirpal savybs 1 . Krioskopija


Darbo tikslas
Konteineris Tiriamasis pavyzdys Palyginamasis pavyzdys

Nustatyti neinomos kietosios mediagos molekulin mas, pritaikant koligatyvines tirpal savybes. Tyrimo objektas Krioskopinis efektas viena tirpal koligatyvini savybi, pasireikianti tirpalo stingimo temperatros sumajimu, palyginti su grynojo tirpiklio. iame darbe kaip tirpiklis bus naudojamas ilydytas kamparas. Matavim priemons

Kaitikliai Kompiuteris, valdantis ilumos srautus ir temperatr

1 pav. Principin kalorimetro schema

Skenuojantis diferencinis kalorimetras DSK2. Analizins svarstykls. Darbo eiga skenuojanio diferencinio kalorimetro aliuminin mikrokonteiner atsveriama apie 40 4 mg kamparo kristal (tiksli reikm pasiymima laboratoriniuose urauose). t pat konteiner taip pat atsveriama ir dedama apie 45 mg neinomos mediagos, kuri studentui pateikia laborantas arba dstytojas. Tai yra tiriamasis miinys. ias mases pasiymime urauose atitinkamai mtirpiklio ir mx. kit (kontrolin) mikrokonteiner atsveriama tik 40 mg kamparo kristal. Reikia stengtis, kad i mas nesiskirt daugiau nei 1 2 mg nuo pirmj konteiner atsvertos kamparo mass. Tai yra palyginamasis pavyzdys. Nustatoma 130 C pradin skenuojanio kalorimetro temperatra bei temperatros didjimo greitis 1 C/min.3 ir jungiamas kalorimetro temperatros skenavimas. jungus skenavim, prietaisas automatikai didins pavyzdio ir kontrolinio konteineri temperatr nustatytu greiiu. Taigi kiekvienu laiko momentu atitiks nustatytas pavyzdi temperatras. Pavyzdiui, kai skenavimo greitis yra 1 C/min., o pradin temperatra 130 C , prajus 10 min. nuo eksperimento pradios, pavyzdi temperatra bus 130 C + 10 C. Kalorimetro veikimo metu, keliant tiriamojo ir palyginamojo pavyzdi temperatr, matuojamas tiriamojo miinio ir palyginamojo pavyzdio konteineri ilumins galios sraut skirtumas. Jei, tarkime, tam tikroje temperatroje vyksta fazinis virsmas lydymasis, kurio metu pavyzdys absorbuoja energij, tai, norint palaikyti nustatytj temperatros kilimo greit, tiekiamos energijos gali reikia padidinti ir atvirkiai. Tokiu bdu, atliekant pavyzdio diferencin kalorimetrin tyrim, galima nustatyti fazinio virsmo lydymosi temperatr ir energijos kiek, absorbuot ir iskirt fazinio virsmo metu. iame darbe mus domins tiksli fazinio virsmo temperatra.

Koligatyviosios tirpalo savybs tai savybs, priklausanios tik nuo tirpiklio fizikinio ir cheminio bvi, bet ne nuo tirpinio. Vienintelis tirpinio parametras, turintis takos koligatyvinms savybms, yra jo koncentracija (pvz., molin dalis). 2 Principin kalorimetro schema parodyta 1 pav., taip pat irkite darbo su skenuojaniu diferenciniu kalorimetru apraym-instrukcij. 3 Dstytojas gali nurodyti kit pradin kalorimetro temperatr ir skenavimo greit.

123

Galia, santykiniais vienetais

70 50 30 10 -10 -30 0

Tirpalas

Grynasis kamparas

2 pav. Tipin diferencin skenuojanio kalorimetro termograma. Tirpalo lydymosi kreivs dalis paymta raudonais, o grynojo tirpiklio mlynais takais
T

20

40

60

Laikas, min,

Tipika diferencin kalorimetrin kreiv termograma pavaizduota 2 pav. Kaip matome, keliant temperatr (laiko koordinats ais), kreiv i pradi kinta gana monotonikai. Pasiekus tirpalo lydymosi tak, kreiv staigiai kyla. is kilimas susijs su tirpiklio lydymusi, esant tirpinio. Kadangi vykstant lydymosi procesui sunaudojama energija, galios srautas tiriamojo miinio konteineryje yra ymiai didesnis nei grynojo tirpiklio (kamparo) palyginamajame konteineryje, kreiv tada siekia maksimum. Isilydius tirpalui, toliau kylant temperatrai, pasiekiamas grynojo tirpiklio lydymosi takas. Dabar jau palyginamojo konteinerio galios srautas ymiai virija galios sraut tiriamj konteiner, todl kreiv krinta iki minimumo. Ufiksavus vis kreiv, pagal maksimumo ir minimumo padi skirtum temperatros ayje galima nustatyti stingimo temperatros depresij (sumajim) T.1 Tirpiklio stingimo temperatros pokyt ir tirpinio molialin koncentracij nusako i ssaja: T = Kfpm, ia: T stingimo temperatros pokytis laipsniais, Kfp krioskopin tirpiklio konstanta, kuri kamparo yra lygi 40 K kgmol 1, m molialin tirpinio koncentracija, ireikta molkg 1. Kadangi eksperimentikai nustatome T ir inome Kfp, tai pagal (1) lygt nesunkiai galime apskaiiuoti ms tiriamos neinomos mediagos molialin koncentracij. inant molialins koncentracijos reikm, pagal molialins koncentracijos apibrim: m = nx/mtirpiklio = mx/(Mxmtipriklio), ia: nx neinomos mediagos atsvert moli skaiius, Mx randama neinomos mediagos molin mas. Pagal diferencins kalorimetrins kreivs plot vertiname molins mass nustatymo paklaid. (1)

Skenavim gali tekti kartoti kelis kartus. Mat dl netolygaus kietj mediag susimaiymo pradiniame miinyje miinio lydymosi temperatros intervalas gali bti labai neaikus, pasklids. Todl, rekomenduojama t pat miin skenuoti bent 34 kartus.

124

Atsiskaitymas pateikiama diferencin termograma. Nustatoma temperatros depresija ir vertinama galima T paklaida. Pagal diferencines kalorimetrines kreives vertinama kamparo lydymosi temperatra; pateikiama apskaiiuota neinomos mediagos molin mas. Dstytojui pateikus procentin neinomos mediagos elementin sudt studentai privalo nustatyti vien ar kelet galim tirpinio izomer.

Literatra 1. Valinius, G. Darbo su DSK apraymas. Vilnius, 2003. 2. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6th edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 297 302.

125

Biochemijos pagrindai

Laboratoriniai darbai Romualdas Marciauskas, Vilma Michailovien, Jolanta Giedrien, Artras Jakubauskas, Aurelija virblien

1. Kiekybiniai baltym nustatymo metodai


Romualdas Marciauskas Darbo tikslas Nustatyti baltym koncentracij mginiuose Lowry, Bradfordo ir spektrofotometriniu metodais. Tyrimo objektas Jauio serumo albuminas (JSA). Matavimo priemons Automatins 20 L, 200 L, 1000 L, 5000 L pipets, maiykl, spektrofotometras SF26, svarstykls. Darbo eiga Lowry metodas: Metodas pagrstas specifine baltymo sveika su Folino reagentu ir susidariusio komplekso matavimu spektrofotometrikai, kai bangos ilgis yra 750 nm. Tirpalai: 1. Reagentas A: 1 % CuSO4 5H2O tirpalas, 100 mL. 2. Reagentas B: 2 % NaK tartrato tirpalas, 100 mL. 3. Reagentas C: 0,2 N NaOH tirpalas, 1000 mL. 4. Reagentas D: 4 % Na2CO3 tirpalas, 500 mL; 5. Reagentas E: ruoiamas prie pat baltym nustatymo bandym. 49 mL reagento C sumaioma su 49 mL reagento D ir pridedama po 1 mL reagento A ir reagento B. 6. Reagentas F: 10 mL Folino reagento sumaioma su 10 mL distiliuoto vandens. 7. JSA tirpalas: 50 mg JSA itirpinama 50 mL distiliuoto vandens. I io pradinio tirpalo imami inomo trio mginiai (r. lent.), ir iki 25 mL skiediami distiliuotu vandeniu. Eil. nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 JSA pradinio tirpalo tris, mL 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50 3,75 Iki 25 mL skiesto JSA tirpalo koncentracija, C mg/mL 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,07 0,10 0,15

Matavimo eiga: Atliekamas bandymas baltym kalibracinei tiesei sudaryti. pirmj mgintuvl pilama 0,5 mL distiliuoto vandens, o 29 mgintuvlius po 0,5 mL skiesto JSA tirpalo (r. lentel, 18 mginiai). Tada visus mgintuvlius pilama po 2,5 mL reagento E. Mginiai skubiai imaiomi maiyklje ir po 10 min. pridedama po 0,25 mL reagento F (Folino reagentas). Greitai imaioma ir laikoma 30 min. tamsoje. Po 30 min. mginiai matuojami spektrofotometru, esant bangos ilgiui 750 nm. Pirmasis mgintuvlis

126

kontrolinis. Remiantis gautomis optinio tankio reikmmis briamas grafikas viesos sugerties priklausomyb nuo baltymo kiekio. Gaunama kalibracin baltym kiekio nustatymo ties. Neinomas baltymo kiekis nustatomas imant 0,5 mL tiriamojo baltymo tirpalo ir atliekant visas anksiau apraytas operacijas. Gauti rezultatai palyginami su kalibracine tiese. Bradfordo metodas Metodas pagrstas specifine baltymo sveika su dau Coomasie Brilliant Blue G-250 (CBB) ir susidariusio komplekso koncentracijos matavimu spektrofotometrikai, kai bangos ilgis 595 nm. Tirpalai: 1. CBB tirpalas (Bradfordo reagentas): 100 mg CBB dao itirpinama 50 mL etilo alkoholio, tirpalas filtruojamas pro stiklo filtr, filtrat pridedama 100 mL 85 % arba 134,64 mL 70 % ortofosforo rgties ir skiediama vandeniu iki 1000 mL. 2. JSA standartinis tirpalas (r. Lowry metod). Matavimo eiga: Atliekamas bandymas baltym kalibracinei tiesei sudaryti. pirmj mgintuvl pilama 0,2 mL distiliuoto vandens, o 29 mgintuvlius po 0,2 mL skiesto JSA tirpalo (18 mginiai, r. lentel). Tada visus mgintuvlius pilama po 2,5 mL CBB tirpalo. Mginiai skubiai imaiomi maiyklje ir po 1520 min. matuojami spektrofotometru, esant bangos ilgiui 595 nm. Pirmasis mgintuvlis bus kontrolinis. Remiantis gautomis optinio tankio reikmmis briamas grafikas viesos sugerties priklausomyb nuo baltymo koncentracijos. Gaunama kalibracin baltym kiekio nustatymo ties. Neinomas baltymo kiekis nustatomas imant 0,2 mL tiriamojo baltymo tirpalo ir atliekant visas anksiau apraytas operacijas. Gautieji rezultatai palyginami su kalibracine tiese. Spektrofotometrinis metodas Baltym tirpalai sugeria ultravioletinius spindulius 280 nm srityje. Aromatini aminorgi (tirozino, fenilalanino, triptofano), kurios sugeria spindulius esant bangos ilgiui 280 nm, kiekis vairiuose baltymuose nra vienodas, todl is nustatymo bdas nra grietai kiekybinis. Apytikriai galima teigti, kad spektrofotometro kiuvetje, esant baltymo koncentracijai 1 mg/mL, tirpalo sluoksnio storiui 1 cm (kiuvets storis), optinis tankis lygus 1. Nustatomas neinomas baltymo kiekis tirpale. Atsiskaitymas - Pateikiamos Lowry ir Bradfordo metod kalibracins baltym nustatymo tiess; - nustatoma tiriamojo baltymo kiekis: Lowry metodu; Bradfordo metodu; spektrofotometriniu metodu. Literatra 1. Lowry, O.; Rosebruoght, N.; Farr, A.; Randall, R.; J. Bio. Chem. 193, 1951, p. 265275. 2. , .; , .; , . .: . . 1975. . 513. 3. Bradford, M. Anal. Biochem. 72, 1976, p. 248254. 4. ( . . . . . ) . . 1989, . 8083.

127

2. Alkoholdehidrogenazs pradinio fermentins reakcijos greiio ir aktyvumo nustatymas


Romualdas Marciauskas Darbo tikslas Nustatyti alkoholdehidrogenazs (ADH) pradin reakcijos greit ir aktyvum. Tyrimo objektas Mieli ADH. Matavimo priemons Automatins 200 L, 1000 L, 5000 L pipets, spektrofotometras SF26 su kiuvete, kurioje palaikoma pastovi temperatra, svarstykls. Darbo eiga Darbo esm. Fermentas ADH priklauso oksidoreduktazi klasei ir katalizuoja reakcij: ADH C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+ Vykstant oksidacijos-redukcijos procesams, kuriuos katalizuoja nikotinini koferment turinios dehidrogenazs, kinta koferment absorbcijos maksimumai. NAD+ ir NADH absorbuoja vies, esant bangos ilgiui 260 nm. Taiau esant bangos ilgiui 340 nm, absorbuoja tik NADH, o NAD+ absorbcija i esms nevyksta. Todl vienos kofermento formos perjim kit labai patogu sekti registruojant spektrofotometru optinio tankio kitim, esant bangos ilgiui 340 nm. Kai fermentins reakcijos grtamosios, reakcijos produktai turi didels takos fermentini reakcij greiiui, todl danai labai svarbu nustatyti pradin reakcijos greit. Tirpalai: 1. 0,06 M natrio pirofosfatinis buferis, pH 8,5, 500 mL. 2. 3 M etilo alkoholio tirpalas, 100 mL. 3. 0,015 M NAD+ tirpalas (50 mg NAD+ itirpinama 5 mL distiliuoto vandens) ruoiamas prie bandym. 4. ADH tirpalas (1 mg ADH itirpinama 1 mL distiliuoto vandens). I io tirpalo prie bandym ruoiami 25, 50 ir 100 kart skiesti tirpalai. Pradinio fermentins reakcijos greiio nustatymas NADH absorbcijos pokytis matuojamas spektrofotometru 30 C temperatroje, esant bangos ilgiui 340 nm. 3 mL talpos spektrofotometro kiuvet pilama: 2,2 mL distiliuoto vandens; 0,5 mL 0,06 M natrio pirofosfatinio buferinio tirpalo, pH 8,5; 0,1 mL 3 M etilo alkoholio; 0,1 mL 0,015 M NAD+ (galutin koncentracija kiuvetje 0,5 mM); 0,1 mL skiesto fermentinio tirpalo. Prie pilant fermentin tirpal kiuvet, kontrolin kiuvet pilama 3 mL distiliuoto vandens ir sureguliuojamas kiuvet patenkantis viesos srauto kiekis. Tada kiuvet pilama 0,1 mL fermentinio tirpalo, greitai imaioma automatine pipete (traukiant ir atgal ipilant kiuvet tirpal) ir kas 15 s 23 min. registruojamas optinis tankis. Bandymas atliekamas su 100, 50 ir 25 kartus skiestais ADH tirpalais. Pradinis reakcijos greitis ireikiamas M susidariusio produkto (NADH) per 1 minut. Nubraiomi optinio tankio (gauto per 23 min.) priklausomybs nuo laiko grafikai. Nubraiomos liestins, kurios eina per koordinai pradios tak (r. pav.). Nubraiomas pradinio reakcijos greiio priklausomybs nuo fermento kiekio (praskiedimo) grafikas.

128

A [NADH]

20

40

60

80

100

t (s)

Pradinio ADH reakcijos greiio nustatymas

Skaiiavimai Pradinis fermentins reakcijos greitis. NADH molinis ekstinkcijos koeficientas yra lygus 6,22 103, o mikromolinis 0,00622. Pradinis fermentins reakcijos greitis skaiiuojamas taip:
A340 / 15s =

(A

30 s

A15s + A45s A30 s , 2

) (

kadangi A = xC, A optinis tankis, kai bangos ilgis 340 nm per minut, NADH mikromolinis ekstinkcijos koeficientas, C pradinis fermentins reakcijos greitis, ireiktas M/min.
C=
A340 / min. 0 ,00622

fermento praskiedimo kartai.

Fermento aktyvumas. Kadangi ADH aktyvumo vienetu laikomas toks fermento kiekis, kuris generuoja 1 mol NADH susidarym per 1 min., ir ireikiamas aktyvumo vienetais mL (E/mL), tai 3 mL kiuvetje susidariusio produkto bus:
1000 mL
A340 / min. fermento praskiedimo kartai, arba C. 0,00622

3 mL X

X=

3 A340 / min. fermento praskiedimo kartai 10. 0,00622 1000

Dauginame i 10, nes spektrofotometro kiuvet pilta 0,1 mL fermentinio tirpalo. Gauname fermento aktyvum (E/mL).

129

Atsiskaitymas optinio tankio (gauto per 23 min. reakcijos) priklausomybs nuo laiko grafikai, skirtingai praskiedus ferment; pradinio reakcijos greiio priklausomybs nuo fermento kiekio grafikas; ADH pradinis reakcijos greitis (M/min.); ADH aktyvumas (E/mL).

Literatra 1. Valee, B. L.; Hoch, F. L. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 41, 1955, p. 327338. 2. Walker , J. R. L. Biochem. Educ. 20(1), 1992, p. 4243.

130

3. Nukleorgi nustatymo kiekybiniai metodai


Romualdas Marciauskas Darbo tikslas Nustatyti bendr nukleorgi (NR) kiek Escherichia coli lsteli biomasje ir DNR bei RNR kiek tirpaluose. Tyrimo objektas E. coli lsteli biomas, DNR ir RNR tirpalai. Matavimo priemons Automatins 20 L, 200 L, 1000 L, 5000 L pipets, spektrofotometras SF26, centrifuga K24, svarstykls, vandens vonia. Darbo eiga Bendrojo NR kiekio nustatymas Kiekybinio nustatymo metodai pagrsti NR sudt einani heterociklini bazi geba absorbuoti vies ultravioletinje spektro dalyje. Tam btina NR ekstrahuoti i biologinio objekto ir jas hidrolizuoti iki mononukleotid. Vienas i spektrofotometrini NR nustatymo metod, pasilytas A. Spirino, grindiamas nukleorgi ekstrakcija i biologinio objekto karta perchlorato rgtimi ir tolesniu ekstrakto absorbcijos nustatymu ultravioletinje spektro dalyje, esant bangos ilgiams 270 nm ir 290 nm. NR kiekis apskaiiuojamas pagal A. Spirino pasilyt formul. Tirpalai: 0,2 M HClO4 tirpalas, 500 mL; 0,5 M HClO4 tirpalas, 500 mL. 500 mg E. coli biomass patalpinama centrifugin mgintuvl ir upilama 10 mL ataldytos 0,2 M perchlorato rgties. Mgintuvlio turinys kruopiai sumaiomas ir centrifuguojama 5 min. 10000 g greiiu 0 C temperatroje. io proceso metu i audinio paalinami rgtyje tirps laisvieji nukleotidai. Centrifuguotos nuosdos suspenduojamos 10 mL 0,5 M HClO4, perkeliamos stiklin mgintuvl, ukemama kamiu su statytu stikliniu vamzdeliu, aldomu oro, ir 30 min. kaitinamos verdanio vandens vonioje. NR visikai ekstrahuojamos i lsteli ir hidrolizuojamos. Susidaro rgtyse tirps produktai. Hidrolizatas ataldomas, centrifuguojamas (10 min. 10000 g), nupilamas iki nuosd, skiediamas 200 ir 500 kart 0,5 M HClO4 ir matuojama spekrofotometru viesos absorbcija, esant bangos ilgiams 270 nm ir 290 nm. Kaip kontrolinis tirpalas naudojama 0,5 M HClO4. Pagal formul apskaiiuojamas 1 mL NR tirpale esantis fosforo kiekis:
Cg P = D270 D290 , 0,19

0,19 perskaiiavimo koeficientas, atitinkantis 1 g NR fosforo, 1 mL tirpalo. Norint apskaiiuoti NR kiek, reikia fosforo kiek padauginti i koeficiento 10,3 ir praskiedimo kart.
CgNR = CgP 10,3 praskiedimo kartai.

Gauname NR kiek g/mL. Praskiesto NR tirpalo viesos absorbcija matuojama dar kart, esant bangos ilgiui 260 nm. Optinis tankis turi bti apytikriai lygus reikmei, gautai matuojant, kai bangos ilgis 270 nm (galimi 15 % nuokrypiai).

131

DNR kiekio tirpaluose nustatymas Tirpalai: Jauio blunies DNR tirpalas. DNR tirpalai sugeria ultravioletinius spindulius 260 nm srityje. Nustatyta, kad tirpalo sluoksnio storiui esant 1 cm (kiuvets storis) ir optiniam tankiui D = 1, DNR koncentracija atitinka 50 g/mL. Imami 4 mgintuvliai: pirmuosius du mgintuvlius pilama po 10 L DNR tirpalo ir po 3 mL distiliuoto vandens (skiediama 300 kart), antrus du po 20 L DNR tirpalo ir po 3 mL distiliuoto vandens (skiediama 150 kart). Tirpalai gerai imaiomi maiyklje. Mginiai matuojami spektrofotometru, esant bangos ilgiui 260 nm, kaip kontrolin naudojant distiliuot vanden. Mgini optinis tankis nustatomas ir kai bangos ilgis 280 nm. Optini tanki santykis 260 nm /280 nm rodo DNR tirpal varum. is santykis turi bti lygus arba didesnis nei 1,8. inant praskiest DNR tirpal, esant bangos ilgiui 260 nm, optinio tankio reikmes, apskaiiuojamas DNR kiekis, g/mL. Taikoma formul:
Cg DNR/mL = D260 50 praskiedimo kartai.

RNR kiekio tirpaluose nustatymas Tirpalai: Mieli RNR tirpalas. RNR tirpalai sugeria ultravioletinius spindulius 260 nm srityje. Nustatyta, kad tirpalo sluoksnio storiui esant 1 cm (kiuvets storis) ir optiniam tankiui D = 1, RNR yra 40 g/mL. Darbas atliekamas taip pat, kaip ir nustatant DNR kiek. RNR kiekis, g/mL, apskaiiuojamas pagal formul:
CgRNR/mL = D260 40 praskiedimo kartai.

RNR tirpal optini tanki 260 nm/280 nm santykis turi bti ne maesnis nei 1,8. Atsiskaitymas NR koncentracija E. coli lsteli biomass ekstrakte (g/mL); DNR tirpalo koncentracija (g/mL); RNR tirpalo koncentracija (g/mL).

Literatra 1. , . . 23(4), 1958, c. 656662. 2. , . ; , .; , . .: . : , 1984, . 410.

132

4. DNR iskyrimas i Escherichia coli lsteli biomass


Romuoaldas Marciauskas Darbo tikslas Iskirti DNR i E. coli lsteli biomass, nustatyti DNR ieig ir varum. Tyrimo objektas E. coli lsteli biomas. Matavimo priemons Automatins 20 L, 200 L, 1000 L, 5000 L pipets, centrifuga K23D, spektrofotometras SF26, ultratermostatas U15. Darbo eiga Tirpalai: 1. Lsteli lizs buferinis tirpalas, 50 mL: 0,1 M EDTA tirpalas, pH 8,0, turintis 0,15 M NaCl. Pradiniai tirpalai 0,2 M EDTA, pH 7,5, 1 M NaCl. 2. Fermento lizocimo tirpalas: 10 mg lizocimo tirpinama 1 mL distiliuoto vandens (tirpalas ruoiamas prie naudojant). 3. Na dodecilsulfato tirpalas, 100 mL: 0,1 M Tris-HCl buferinis tirpalas, turintis 1 % Na dodecilsulfato ir 0,1 M NaCl, pH 9,0. 4. Distiliuoto fenolio buferinis tirpalas: 80 mL vieiai perdistiliuoto fenolio sumaioma su 20 mL buferiniu tirpalu Nr. 3. 5. 0,15 M Na citrato tirpalas, turintis 1,5 M NaCl, 100 mL. 6. 0,0015 M Na citrato tirpalas, turintis 0,015 M NaCl pH 7,0, 100 mL (1 mL tirpalo Nr. 5 skiediamas iki 100 mL). 7. Ribonukleazs be deoksiribonukleazini priemai tirpalas: 10 mg ribonukleazs A itirpinama 5 mL 0,15 M NaCl tirpalo. Tirpalas pakaitinamas 10 min 80 C (tirpalas ruoiamas prie naudojant). 8. 0,15 M NaCl tirpalas, 100 mL. 9. 0,01 M Tris-HCl buferinis tirpalas pH 7,5, turintis 0,02 M NaCl, 100 mL. 10. 96 % etilo alkoholis. Lsteli liz ir DNR iskyrimas 1 g E. coli lsteli biomass suspenduojama 1 mL lsteli lizs buferinio tirpalo (Nr. 1), gerai imaioma ir pridedama 0,2 mL lizocimo tirpalo (Nr. 2). Bakterijos lizuojamos 20 min. 37 C temperatroje ultratermostate. Lsteli liz atliekama stikliniame centrifuginiame mgintuvlyje. Tada mgintuvl pridedama 8,3 mL Na dodecilsulfato tirpalo, ir miinys atsargiai maiant laikomas ultratermostate 10 min. 60 C temperatroje. Mgintuvlis statomas ledo voni ataldyti. Pridedamas toks pat tris fenolinio buferinio tirpalo (Nr. 4), maioma stikline lazdele 10 min. leduose. Fenolis denatruoja baltymus. Miinys centrifuguojamas 20 min. 5000 aps./min. greiiu. Centrifuguojant DNR, baltym ir fenolio miinys pasiskirsto sluoksniais (r. pav.).

DNR Baltymas Fenolio frakcija

DNR, baltym ir fenolio frakcijos pasiskirstymas centrifuginiame mgintuvlyje

133

Virutinis sluoksnis su itirpusia DNR atsargiai automatine pipete nusiurbiamas 1020 mL matavimo cilindr. centrifugin mgintuvl su baltym ir fenolio frakcijos sluoksniais pilama 23 mL lizs buferinio tirpalo (Nr. 1), leduose maioma 5 min. ir 20 min. centrifuguojama 5000 aps./min. greiiu. DNR virutinis sluoksnis atsargiai nusiurbiamas t pat 1020 mL talpos cilindr. DNR tirpalas supilamas menzrl (100 mL) ir veikiamas 2,5 trio alto etilo alkoholio (20 C). Miinys 0,5 val. statomas aldytuv (20 C). Ikrit nuosdas DNR silai vyniojant lazdele itraukiami i spiritinio tirpalo mgintuvl. Mgintuvlyje lazdele nuspaudiamas spiritas ir DNR perkeliama kit mgintuvl. Pridedama 9 mL buferinio tirpalo Nr. 6 ir mgintuvlis statomas savaitei aldytuv (+4 C), kad DNR brinkt ir tirpt. DNR gryninimas Itirpus DNR, tirpal pilama 1 mL tirpalo Nr. 5 ir ribonukleazs A tirpalo (Nr. 7) RNR priemaioms paalinti. 1 mL DNR tirpalo pridedama 50 g ribonukleazs A ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatros vandens vonioje. Tirpalas statomas ledo voni ir veikiamas tokiu pat triu fenolio buferinio tirpalo (Nr. 4). Miinys maiomas 5 min. ledo vonioje ir centrifuguojamas 5000 aps./min. greiiu. Virutinis sluoksnis su itirpusia DNR atsargiai automatine pipete nusiurbiamas 1020 mL talpos matavimo cilindr. DNR tirpalas supilamas menzrl (100 mL) ir veikiamas 2,5 trio alto etilo alkoholio (20 C). Miinys 0,5 val. statomas aldytuv (20 C). I spiritinio tirpalo DNR iimama stikline lazdele ir tirpinama 3 mL tirpalo Nr. 9. Mgintuvlis statomas savaitei aldytuv (+4 C). Itirpus DNR, nustatoma koncentracija ir varumas. DNR tirpalas, prie matuojant optin tank, skiediamas. Imami 2 mgintuvliai: pirmj mgintuvl pilama 10 L DNR tirpalo ir 3 mL distiliuoto vandens (skiediama 300 kart), antr 20 L DNR tirpalo ir 3 mL distiliuoto vandens (skiediama 150 kart). Tirpalai gerai imaiomi maiyklje. Mginiai matuojami spektrofotometru, esant bangos ilgiui 260 nm, naudojant distiliuot vanden kaip kontrolin. Mgini optinis tankis nustatomas ir bangos ilgiui esant 280 nm. Optini tanki santykis 260 nm/280 nm rodo DNR tirpal varum. is santykis turi bti ne maesnis nei 1,8. inant optinio tankio reikmes, apskaiiuojama DNR koncentracija (g/mL) pagal formul: CgDNR/mL = D260 50 praskiedimo kartai. Atsikaitymas DNR kiekis 1g E. coli lsteli biomass; DNR varumas.

Literatra 1. , . . 24(3), 1959, c. 472480. 2. ( . , . , . .). : . . 1989, . 166171.

134

5. RNR iskyrimas i Eschrichia coli lsteli biomass


Romualdas Marciauskas Darbo tikslas Iskirti RNR i E. coli lsteli biomass, nustatyti RNR ieig ir varum. Tyrimo objektas E. coli lsteli biomas. Matavimo priemons Automatins 20 L, 200 L, 1000 L, 5000 L pipets, centrifuga K23D, ultratermostatas U7, spektrofotometras SF26. Darbo eiga Tirpalai: 1. Lsteli lizs buferinis tirpalas, 100 mL: 0,015 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,45 M sacharoz, 0,008 M EDTA. Pradiniai tirpalai 1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 M EDTA, pH 7,5. 2. Fermento lizocimo tirpalas: 6 mg lizocimo itirpinami 1 mL distiliuoto vandens (tirpalas ruoiamas prie naudojant). 3. Distiliuoto fenolio buferinis tirpalas,100 mL: 80 mL vieiai perdistiliuoto fenolio sumaioma su 20 mL 0,01 M Tris-HCl buferio, pH 7,5. 4. Chloroformo / izopentilo alkoholio miinys 24 : 1 (200 mL). 5. 40 % kalio acetato tirpalas (KCH3COO), 10 mL. 6. 96 % etilo alkoholis. 7. 1 M MgCl2 tirpalas, 10 mL. 8. 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,025 M MgCl2 tirpalas, 100 mL. 9. Deoksiribonukleazs I, neturinios ribonukleazi priemai, tirpalas: 1 mg fermento itirpinamas 1 mL tirpalo Nr. 8. Lsteli liz ir RNR iskyrimas 1 g E. coli lsteli biomass suspenduojama 1 mL lsteli lizs buferiniame tirpale (Nr. 1) ir dar pridedama 14 mL lizs buferinio tirpalo. Stikline lazdele imaioma iki homogenikos suspensijos, pridedama 80 L lizocimo tirpalo (Nr. 2) 1 mL lsteli suspensijos. 5 min. laikoma leduose. Lizocimas suardo lsteli sieneles. Visa tai atliekama stikliniame centrifuginiame mgintuvlyje. Gautas lizatas veikiamas dvigubu fenolio buferinio tirpalo (Nr. 3) triu ir 10 min. maioma stikline lazdele leduose. Fenolis denatruoja baltymus. Visa tai centrifuguojama 20 min. 5000 aps./min. greiiu. Centrifugavimo metu RNR, baltym ir fenolio miinys pasiskirsto sluoksniais (r. pav.).

RNR Baltymas Fenolio frakcija

RNR Baltymas Chloroformas/izopentilo alkoholis

RNR, baltym, fenolio frakcijos bei RNR, baltym ir chloroformo/izopentilo alkoholio pasiskirstymas centrifuginiuose mgintuvluose

135

Virutinis sluoksnis su itirpusia RNR atsargiai nusiurbiamas automatine pipete ir surenkamas 10 20 mL matavimo cilindr. centrifugin mgintuvl su baltym ir fenolio sluoksniais pilama 23 mL lizs buferinio tirpalo, 5 min. maioma leduose ir 20 min. centrifuguojama 5000 aps./min. greiiu. RNR vandenin faz atsargiai nusiurbiama, fazs sujungiamos ir veikiamos tokiu pat chloroformo/izopentilo alkoholio miinio triu. Miinys maiomas 5 min. leduose, centrifuguojamas 10 min. 5000 aps./min. greiiu. Virutinis RNR tirpalo sluoksnis atsargiai nusiurbiamas 1020 mL matavimo cilindr, pridedama 40 % KCH3COO tirpalo iki galutins 2 % koncentracijos ir 2,5 trio alto etilo alkoholio (20 C). Miinys savaitei statomas aldytuv (20 C). RNR gryninimas Su DNR priemaiomis ikritusios RNR nuosdos centrifuguojamos 10 min. 5000 aps./min. greiiu. Virutinis spirito sluoksnis nupilamas. Mgintuvlis statomas stiklinl su filtravimo popieriumi dugnu auktyn ir 10 min. laikomas aldytuve +4 C temperatroje. Nuosdos tirpinamos 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, buferyje, turiniame 0,025 M MgCl2. Palaipsniui iki 10 mL pilama buferinio tirpalo. Tirpalas veikiamas deoksiribonukleazs I tirpalu (Nr. 9) (50100 vienet) ir laikomas kambario temperatroje 25 min. Tada statomas ledo voni ir veikiamas dvigubu triu fenolio tirpalo (Nr. 3). Miinys 5 min. maiomas leduose, 10 min. centrifuguojamas 5000 aps./min. greiiu. Virutinis sluoksnis su itirpusia RNR atsargiai nusiurbiamas ir surenkamas 1020 mL matavimo cilindr, pridedama 40 % KCH3COO tirpalo iki galutins 2 % koncentracijos ir 2,5 trio alto etilo alkoholio (20C). Miinys savaitei statomas aldytuv (20C). Ikritusios RNR nuosdos centrifuguojamos 10 min. 5000 aps./min. greiiu. Virutinis spirito sluoksnis nupilamas. Mgintuvlis statomas stiklinl su filtriniu popieriumi dugnu auktyn ir 10 min. laikomas aldytuve +4 C temperatroje. Nuosdos tirpinamos 2 mL distiliuoto vandens. Nustatoma RNR koncentracija ir varumas. Apskaiiuojamas iskirtas RNR kiekis. Iskirta RNR yra E. coli lsteli sumin RNR. J sudaro ribosom 23S, 16S, 5S rRNR ir transportin 4S tRNR. RNR tirpalas, prie matuojant optin tank, skiediamas. Imami 2 mgintuvliai: pirmj pilama 30 L RNR tirpalo ir 3 mL distiliuoto vandens (skiediama 100 kart), antrji 60 L RNR tirpalo ir 3 mL distiliuoto vandens (skiediama 50 kart). Tirpalai gerai imaiomi maiyklje. Mginiai matuojami spektrofotometru, esant bangos ilgiui 260 nm, naudojant kaip kontrolin distiliuot vanden. Mgini optinis tankis nustatomas ir kai bangos ilgis 280 nm. Optini tanki santykis 260 nm/280 nm rodo RNR tirpal varum. is santykis turi bti ne maesnis nei 1,8. inant praskiest RNR tirpal optinio tankio reikmes, kai bangos ilgis 260 nm, apskaiiuojama RNR koncentracija (g/mL) :
Cg RNR/mL = D260 40 praskiedimo kartai.

Atsiskaitymas RNR kiekis 1 g E. coli lsteli biomass; RNR varumas.

Literatra 1. , .; , .; , . .: . : , 1984, . 402407. 2. ( . , . . , . . M: . , 1989, . 166171.

136

6. Restriktazs EcoRl aktyvumo nustatymas


Romualdas Marciauskas Darbo tikslas Gauti fago lambda DNR restriktogram, nustatyti restriktazs EcoRI aktyvum. Tyrimo objektas Restriktaz EcoRI (AB Fermentas). Matavimo priemons Automatins 20 L, 200 L, 1000 L, 5000 L pipets, horizontalus elektroforezs aparatas, srovs altinis, ultratermostatas U2, svarstykls, chromatoskopas. Darbo eiga Restriktazs yra fermentai, specifikai atpastantys ir skaidantys tam tikr DNR nukleotid sek. Restriktaz EcoRI atpasta ir skaido toki DNR sek: 5GAATTC3 3CTTAAG5 Fago lambda DNR restriktaz EcoRI atpasta penkiose vietose ir skaido jo DNR eis fragmentus. Restriktazs aktyvumo vienetas toks fermento kiekis, kuris per 1 val. visikai suskaido 1 g fago lambda DNR 50-yje L reakcijos miinio. Suskaidytos DNR fragmentai iskiriami agarozs gelyje elektroforezs bdu. Fragment isidstymo vaizdas vadinamas restriktograma. Tirpalai: 1. Koncentruotas restriktazs EcoRI reakcijos buferinis tirpalas. 2. Fago lambda DNR tirpalas. 3. Buferinis tirpalas restriktazei skiesti (20 mM KH2PO4, pH 7,4, 200 mM KCl, 1 mM EDTA, 7 mM 2merkaptoetanolio, 10 % glicerolio, 0,2 mg/mL jauio serumo albumino). 4. Stop buferinis tirpalas tirpalas fermentinei reakcijai sustabdyti (60 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio mlio, 50 % glicerolio). 5. Agarozs tirpalas (0,71 g agarozs upilama 100 mL elektroforezs buferinio tirpalo Nr. 6). 6. Elektroforezs buferinis tirpalas (2 mM EDTA, 0,2 M natrio borato, pH 8,2). 7. 6,25 mg/mL etidio bromido tirpalas. Reakcijos miinio paruoimas Naudodami reagentus Nr. 1 ir Nr. 2 paruoiame 400 L reakcijos miinio taip, kad 50 L io miinio bt 1 g lambda fago DNR. mgintuvl eils tvarka pilame: 40 L koncentruoto EcoRI reakcijos buferio (Nr. 1); 20 L fago lambda DNR (0,4 mg/mL) (Nr. 2); 340 L distiliuoto vandens; Gerai imaiome. I viso: 400 L

reakcijos miin ipilstome eis mgintuvlius po 50 L. Stovel su mgintuvliais dedame vonel, kurioje dta ledo. Fermento EcoRI paruoimas

137

Tiriamas restriktazs preparatas yra koncentruotas, todl nustatant jo aktyvum skiediama 20 kart fermento skiediamuoju buferiniu tirpalu (Nr. 3). Fermento aktyvumas 10 vnt./L. mgintuvl pilame: 190 L skiediamojo buferinio tirpalo (Nr. 3); 10 L EcoRI su 190 L skiediamojo buferinio tirpalo; Gerai imaiome. I viso: 200 L

paruotus mgintivlius: pilama skiesto fermento preparato:

2 1 L

3 1,5 L

4 2 L

5 2,5 L

6 3 L.

Pirmasis mgintuvlis kontrolinis j fermento nepilame. Mgintuvlius inkubuojame 1 val. 37 C temperatroje. Pasiruoimas elektroforezei ir elektroforez 0,71 g agarozs upilame 100 mL elektroforezs buferinio tirpalo (Nr. 7) 250 mL kolboje. ildome, kol agaroz itirpsta. Tada tirpal ataldome iki 6070 C ir atsargiai supilame paruot gelio formavimo viet horizontaliame elektroforezs aparate. Sustingus agarozei, itraukiame ukas, kuriomis buvo suformuotos duobuts pavyzdiams, nuimame bortelius ir pripildome elektroforezs aparat elektroforezs buferinio tirpalo (Nr. 6) taip, kad gelis bt apsemtas. Po inkubacijos stovel su mgintuvliais perkeliame vonel su ledais. Reakcij stabdome priddami po 25 L stop buferinio tirpalo (Nr. 4). Po 30 L kiekvieno mginio pilame gelio duobutes. Vykdome elektroforez paleidiame 150 mA elektros srov, kol daai pasieks gelio krat (madaug 1 val.). Baigus elektroforez, ijungiamas srovs altinis, nuimamas gelis, dedamas vonel ir upilamas etidio bromido tirpalu (Nr. 7). Po 10 min. etidio bromido tirpalas nupilamas, o gelis upilamas distiliuotu vandeniu (laikoma 10 min.). Elektroforezs buferinis tirpalas i elektroforezs aparato ir etidio bromido tirpalas i vonels supilami atgal indus kitam kartui. Fermento aktyvumo apskaiiavimas DNR fragment isidstymas gelyje po elektroforezs stebimas ultravioletinje viesoje chromatoskopu. Nupieiame gaut restriktogramos vaizd. Nustatome minimal restriktazs kiek, L, kuris visikai suskaido 1 g DNR (kad DNR visikai suskaidoma, akivaizdu tada, kai padidinus restriktazs kiek restriktogramos vaizdas nesikeiia). Apskaiiuojame restriktazs aktyvum, vnt./L, pagal formul: Cvnt./L = ia: l fago lambda DNR kiekis g mginyje, 20 kiek kart atskiestas fermentas, A skiesto fermento kiekis mginyje L (13 L), kai DNR suskaidoma visai. Atsiskaitymas fago lambda DNR restriktograma; restriktazs EcoRI aktyvumas (vnt./L).
l 20 , A

Literatra MBI Fermentas katalogas 20022003, p. 22, 61.

138

7. Baltym molekulins mass nustatymas gelfiltracijos metodu


Vilma Michailovien Darbo tikslas Nustatyti neinomo baltymo molekulin mas. Matavimo priemons: Stiklin 44 1,0 cm (ilgis skersmuo) kolonl, pripildyta sorbento (arba gelio). Peristaltinis siurbliukas (tekjimo gretis 0,6 mL/min.). Detektorius. 280 nm, 0,2 AVPS (absorbcijos vienetai per skal). Saviratis. Greitis 1 mm/min. Sorbentas: Toyopearl HW-50F (daleli dydis 3060 m, por dydis 125 , globulini baltym frakcionavimo ribos 50060 000 Da). 6. Eliuentas: 0,01 M KH2PO4/K2HPO4, pH 7,0, 0,2 M NaCl, 0,02 % NaN3. 7. Standartiniai baltymai. 1. 2. 3. 4. 5. Standartai: 7.1. Mlynasis dekstranas 7.2. Jauio serumo albuminas 7.3. Ovalbuminas 7.4. Ribonukleaz Standartiniai baltymai tirpinami eliuente. Darbo eiga Paruoiami mlynojo dekstrano ir inomos molekulins mass baltym tirpalai eliuente (53 mg/mL). Kolona pusiausvirinama eliuento tirpalu (10 kololonos tri) ir dedama mlynojo dekstrano, tik tada atliekama standartini baltym ir neinomo baltymo pavyzdi chromatografija. Injekcijos tris 0,5 mL (ne daugiau kaip 12 % kolonos trio). Pagal gautas chromatogramas skaiiuojami i baltym iplovimo triai ir kiti chromatografiniai parametrai: Vb bendrasis kolonos tris , Vo laisvasis kolonos tris (kolonos tris, nepripildytas sorbento daleli, mlynojo dekstrano iplautasis tris), Ve baltym iplautieji triai (eliuento kiekis, itekjs i kolonos nuo pavyzdio eliuavimo pradios iki tol, kol detektoriuje buvo ufiksuota jo smails virn). Skaiiuojamas kiekvieno baltymo Kv. Braioma kalibracin kreiv, kuri parodo santyk tarp baltym iplautj tri ir j molekulini masi logaritm (X ayje atidedamas baltymo Kv, Y ayje io baltymo molekulins mass logaritmas). Apskaiiavus neinomo baltymo Kv, i kalibracins kreivs nustatoma jo molekulin mas. Skaiiavimai Kolonos tris skaiiuojamas pagal formul: ia: Vb = r2H, Molekulin mas 2000000 67000 43000 13700 Koncentracija, mg/mL 1 5 5 5

H imatuotas sorbento auktis kolonoje, cm, r imatuotas kolonos spindulys, cm. Tuomet Vb = 3,14 . 0,52 . 44 = 34,5 mL. Laisvasis kolonos tris apskaiiuojamas pagal mlynojo dekstrano chromatogram. Imatuojamas atstumas nuo chromatogramos pradios iki nuo mlynojo dekstrano smails virns nubrto statmens (r. pav. smail A). Imatuojamas eliuento tekjimo gretis V. 18 mm imatuotas atstumas,

139

0,6 mL/min. imatuotas eliuento tekjimo greitis, 1 mm/min. nustatytas saviraio greitis. Tuomet Vo = 18/1 . 0,6 = 10,8 mL. Gauname, kad mlynojo dekstrano eliuavimo tris yra 10,8 mL. Tai ir yra laisvasis kolonos tris. Tokiu pat metodu skaiiuojami ir baltym eliuavimo triai. Dabar skaiiuojamas kitas baltym eliuavimo parametras Kv pasiskirstymo konstanta, kuri rodo baltymo prasiskverbimo poras lyg:
Kv =
Ve Vo . Vb Vo

Tuomet mlynojo dekstrano


Kv =
Ve Vo 10 ,8 10 ,8 = . 34 ,5 10,8 Vb Vo

Baltym dideli molekuli, kurios neprasiskverbia sorbento poras, Kv = 0. Jos isiplauna su laisvuoju kolonos triu (r. pav. smail A). Baltym smulki molekuli (pvz., drusk) Kv 1. Jos prasiskverbia smulkiausias sorbento poras (pav. smail D). Matome, kad is koeficientas gali bti nuo 0 iki 1.

Baltymo eliuavimo tris, laikas arba Kv Vo mobilios fazs tris tarp sorbento daleli, Vi mobilios fazs tris sorbento daleli porose, Vt = Vo + Vi, MM molekulin mas. Kalibracin kreiv baltym eliuavimo tri priklausomyb nuo j molekulin mass logaritmo. Viruje standartini baltym chromatograma

Gautus duomenis atidedame grafike. Apskaiiav neinomo baltymo Kv i kalibracins kreivs nustatome jo molekulin mas (r. pav.).

140

Atsiskaitymas baltym eliuavimo tri priklausomybs nuo j molekulins mass logaritmo kalibracin kreiv; tiriamo baltymo molekulin mas.

Literatra , . . .: . : , 1985, . 109 162.

141

8. Baltym elektroforez 12 % poliakrilamidiniame gelyje


Jolanta Giedrien Darbo tikslas Tiriam baltym santykins molekulins mass nustatymas taikant baltym elektroforez 12 % poliakrilamidiniame gelyje denatracijos slygomis. Tyrimo objektas Baltym preparatai. Matavimo priemons Elektroforetin cel Mini-PROTEAN II BIO-RAD, rinkinys geliui upyilti, stovelis BIO-RAD, aparatas geliui fotografuoti ULTRA LM, srovs altinis EC 250-90. Tirpalai 30 % akrilamido Bis tirpalas. 1,5 M Tris-HCl/Na dodecilsulfato (NDS) buferinis tirpalas, pH 8,8. 0,5 M Tris-HCl/NDS buferinis tirpalas, pH 6,8. 10 elektrodinio buferio koncentratas. Elektrodinis buferis (25 mM Tris-HCl, 192 mM glicino). 10 % amonio persulfato tirpalas (APS). Pavyzdio buferinis tirpalas (1 M Tris-HCl/NDS buferinis tirpalas, pH 6,8, 2 % NDS, 0,001 % bromfenolio mlio, 40 % glicerolio). 8. 1 M DTD tirpalas. 9. TEMED tirpalas. 10. Gelio daas (0,1 % Coomasie Brilliant Blue G-250, 40 % etanolio, 10 % acto rgties). Darbo eiga 1. Surenkama kaset geliui upilti ir statoma stovel. 2. Paymima vieta, iki kurios bus upilamas apatinis gelio sluoksnis (1,5 cm emiau uk apaios). 3. Paruoiamas apatinis skiriamasis gelio sluoksnis: 1015 mL mgintuvl pilama: 30 % akrilamido Bis tirpalo 2,0 mL, 1,5 M Tris-HCl/NDS buferinio tirpalo, pH 8,8 1,25 mL, dejonizuoto vandens 1,75 mL. Tirpalas imaiomas ir dar pilama: 10 % APS 17 L, TEMED 10 L. Gerai imaioma ir supilama tarp stikl iki paymtos vietos. Ant tirpalo paviriaus upilama 1,0 mL vandens. Geliui sustingus (madaug po 20 min.) pavirius nusausinamas filtriniu popieriumi. 4. Paruoiamas virutinis koncentruojamasis gelio sluoksnis: 1015 mL mgintuvl pilama: 30 % akrilamido Bis tirpalo 325 L, 0,5 M Tris-HCl/NDS buferinio tirpalo, pH 6,8 625 L, dejonizuoto vandens 1500 mL. Tirpalas imaiomas ir dar pilama: 10 % APS 10 L, TEMED 10 L. Tirpalas gerai imaiomas, supilamas tarp stikl ir kiamos ukos. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

142

5. Geliui sustingus (po 3040 min.), ukos itraukiamos tiesiai vir, nepakreipiant. Susidar ulinliai praplaunami vandeniu. Kaset su geliu statoma aparat ir dedama rezervuar. virutiniam buferiui skirt viet supilama 350 mL elektrodinio buferinio tirpalo. 6. Paruoti pavyzdiai bei molekulins mass standartai pilami ulinlius virutiniame gelyje. Imamas toks pavyzdio tris, kad baltymo kiekis jame bt 1020 g. 7. Paruoiamas mginys: baltyminis tirpalas praskiediamas iki 50 L, pridedama 40 L pavyzdio buferio ir 10 L 1 M DTD. Pavyzdys vandens vonioje virinamas 1 minut. 8. pylus pavyzdius, elektroforetin cel udengiama dangiu. Leidiama 13 mA elektros srov, kol bromfenolio mlynojo frontas pasiekia skiriamj gel (apie 20 min.). Tada srov padidinama iki 30 mA. 9. Elektroforez baigiama, kai bromfenolio mlynojo frontas pasiekia gelio apai (apie 1 val.). Ijungiamas srovs altinis, nuimamas gelis ir dedamas gelio dao tirpal. Daoma 2 ir daugiau valand (paprastai per nakt). 10. Nudaytas gelis blukinamas 20 % etanolio ir 10 % acto rgties tirpale, kol gelio pagrindas tampa varus. 11. Iblukintas gelis nufotografuojamas. Skaiiavimai 1. Nudaius ir nufotografavus gel, apskaiiuojama neinomo baltymo santykin molekulin mas. Imatuojamas atstumas R (cm) nuo skiriamojo gelio pradios iki bromfenolio mlynojo juostos gelio apaioje, taip pat atstumai r1, r2ri (cm) nuo skiriamojo gelio pradios iki standartini baltym ir neinomo baltymo nudayt juosteli. 2. Santykinis kiekvieno baltymo (standartinio, neinomo) nueitas kelias Rf apskaiiuojamas pagal formul:
Rf = ri/R.

3. Braiomas grafikas: ordinai ayje atidedami standartini baltym santykini molekulini masi deimtainiai logaritmai, o abscisi Rf. I gautos priklausomybs pagal neinomo baltymo Rf apskaiiuojama jo santykin molekulin mas (r. pav.):
5,5 5,3 5,1 4,9 4,7 lgM 4,5 4,3 4,1 3,9 3,7 3,5 0 0,2 0,4 Rf 0,6 0,8 1

Baltym molekulins mass deimtainio logaritmo priklausomyb nuo Rf

Atsiskaitymas baltym molekulins mass deimtainio logaritmo priklausomybs nuo Rf grafikas;

143

tiriamj baltym santykins molekulins mass.

Literatra 1. Current Protocols in Molecular Biology, 1999. 10.2B 134. 2. Mickeviius, D. Chemins analizs metodai 2. Vinius: iburio leidykla, 1999, p. 282302.

144

9. Restrikcijos endonukleazi aktyvumo nustatymas. Restrikcijos endonukleazi preparat kokybs vertinimas


Artras Jakubauskas Darbo tikslas Restrikcijos endonukleazi aktyvumo nustatymas. Restrikcijos endonukleazi preparat kokybs vertinimas pagal ilgalaiks restrikcijos perteklin fermento kiek ir restrikcijos-ligavimo-restrikcijos testais. Tyrimo objektas Restrikcijos endonukleazi preparatai. Matavimo priemons Elektroforezs aparatas, srovs altinis B5-50, Ultra-Lum geli dokumentavimo sistema, termostatas, automatins pipets. Reagentai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Koncentruot restrikcijos endonukleazi buferini tirpal rinkinys, naudojamas UAB Fermentas. fago DNR tirpalas (0,3 mg/mL). Tiriam restrikcijos endonukleazi preparatai. Buferinis tirpalas restrikcijos endonukleazi preparatams skiesti (20 mM KPi (pH 7,4), 200 mM KCl, 1 mM EDTA, 7 mM 2-merkaptoetanolio, 10 % glicerolio, 0,2 mg/mL BSA). T4 DNR ligazs preparatas. 25 mM ATP tirpalas. 125 mM DTT tirpalas. Stop buferis tirpalas fermentinei reakcijai sustabdyti (60 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio mlynojo, 50 % glicerolio). Agaroz. Elektroforezs buferis (0,1 M natrio borato (pH 8,2), 2 mM EDTA, 0,5 g/mL etidio bromido).

Darbo eiga Restrikcijos endonukleazi aktyvumo nustatymas Pagal UAB Fermentas katalog parenkame tiriamai restrikcijos endonukleazei rekomenduojam reakcijos bufer. Naudodami reagentus (Nr. 12), paruoiame 300 L reakcijos miinio taip, kad 50-yje L io miinio bt 1 g fago DNR. Miin ipilstome 6 mgintuvlius po 50 L. Stovel su mgintuvliais dedame led vonel. Tiriamasis restrikcijos endonukleazs preparatas yra koncentruotas, todl siekdami nustatyti jo aktyvum, skiediame j 2030 kart buferiu (Nr. 4). 1, 1,5, 2, 2,5 ir 3 L praskiesto restrikcijos endonukleazs preparato pilame paruotus mgintuvlius (paskutinis mgintuvlis kontrolinis) ir sumaiome. Inkubuojame 1 val. 37 C temperatroje. 0,71 g agarozs upilame 100 mL elektroforezs buferio (Nr. 10). Kaitiname, kol agaroz visikai itirpsta. Tirpal atvsiname iki 6070 C ir atsargiai supilame paruot gelio formavimo viet. Sustingus agarozei, itraukiame ukas, kuriomis buvo suformuoti ulinliai pavyzdiams, nuimame bortelius ir dedame gel elektroforezs aparat. Pripilame elektroforezs buferio (Nr.10) tiek, kad gelis bt apsemtas. Po inkubacijos stovel su mgintuvliais perkeliame led vonel. Reakcij stabdome priddami po 25 L stop buferio (Nr. 8). Po 2030 L kiekvieno mginio pilame gelio ulinlius. Atliekama elektroforez. DNR fragment isidstymas gelyje po elektroforezs stebimas ultravioletinje viesoje ir fotografuojamas. Nustatomas minimalus restrikcijos endonukleazs kiekis (L), kuris visikai suskaldo 1 g

145

DNR (DNR visikai suskaldyta, kai padidinus restrikcijos endonukleazs kiek restriktogramos vaizdas nebesikeiia). Restrikcijos endonukleazs aktyvumas (vnt./L) apskaiiuojamas pagal formul:
c(vnt./L) = XY/A, ia: X fago DNR kiekis mginyje (g); Y fermento skiedimas (kartais); A skiesto fermento kiekis mginyje (L), kai DNR visikai suskaldoma.

Restrikcijos endonukleazi preparat kokybs vertinimas Restrikcijos endonukleazs preparato kokybei vertinti atliekame du testus: 1. Ilgalaik inkubacij. 2. Restrikcij-ligavim-restrikcij. 1. Nespecifini nukleazi priemaias restrikcijos endonukleazs preparate vertiname inkubuodami perteklin fermentinio preparato kiek su 1 g fago DNR 17 val. 37 C temperatroje. 2, 3, 5 L koncentruoto restrikcijos endonukleazs preparato dedame mgintuvlius su reakcijos miiniu (paruoiamu taip pat kaip ir aktyvumui nustatyti). Inkubuojame per nakt. Reakcij stabdome priddami 25 L stop buferio (Nr. 8). Gautus DNR fragmentus iskiriame elektroforezs bdu. Jeigu fermentiniame preparate nra nespecifini nukleazi, elektroforetinis vaizdas visais atvejais turi atitikti standartin (r. UAB Fermentas kataloge) ir nepriklausyti nuo dto restrikcijos endonukleazs preparato kiekio. 2. DNR restrikcijos-ligavimo-restrikcijos kokybs testas atliekamas trim etapais: a) Pirmin restrikcija. du mgintuvlius su 60 L reakcijos miinio, turinio 9 g fago DNR, dedame 10 ir 30 vnt. tiriamos restrikcijos endonukleazs ir inkubuojame per nakt 37C temperatroje. Elektroforezei imame po 10 L i kiekvieno mgintuvlio, pridedame po 20 L vandens ir 15 L stop buferio (Nr. 8) (pirmins restrikcijos kontrol R1). Restrikcijos endonukleaz likusiame mginyje inaktyvinama, kaitinant 20 min. 65 C temperatroje. b) Ligavimo reakcija. mginius su inaktyvinta restrikcijos endonukleaze dedame po 2 L ATP, 2 L DTT ir 2 L T4 DNR ligazs preparato. Inkubuojame 1 val. 22 C temperatroje. Ligaz inaktyvinama kaitinant 20 min. 65 C temperatroje. Ligavimo kontrolei imame po 12 L kiekvieno mginio, pridedame po 18 L vandens ir 15 L stop buferio (L). c) Antrin restrikcija. mginius su ligavimo reakcijos produktais dedame po 30 vnt. tiriamos restrikcijos endonukleazs ir inkubuojame 1 val. 37 C temperatroje. Po inkubacijos i kiekvieno mginio paimame po 16 L, pridedame po 14 L vandens ir 15 L stop buferio (kontrol antrinei restrikcijai R2). Gauti pirmins restrikcijos (R1), ligavimo (L) ir antrins restrikcijos (R2) pavyzdiai analizuojami elektroforetikai ( gel pavyzdiai pilami tokia tvarka: R1, L, R2). Jei fermento kokyb gera, tai pirmins restrikcijos metu gauti fragmentai turi bti suliguoti, o antrins restrikcijos vaizdas turi bti identikas pirmins restrikcijos vaizdui. Atsiskaitymas pateikiami apskaiiuotas tiriamos restrikcijos endonukleazs aktyvumas ir restriktograma, pagal kuri jis nustatytas; pateikiamos restrikcijos endonukleazs preparato kokybs vertinimo restriktogramos ir ivados.

Literatra 1. UAB Fermentas katalogas, 20042005, p. 2021. 2. Roberts, R.J.; Belfort, M.; Bestor, T.; Bhagwat, A.S.; Bickle, T.A.; Bitinaite, J. et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 31, 2003. p. 18051812.

146

3. Pingoud, A.; Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29, 2001. p. 37053727.

147

10. Specifini antikn titro nustatymas imunofermentiniu metodu


Aurelija virblien Darbo tikslas Nustatyti antikn prie alfa-interferon lyg (titr) imunizuoto gyvno kraujo serume. is metodas pagrstas imobilizuoto antigeno ir jam specifik antikn sveika. Antigenas iuo atveju mogaus alfa-interferonas adsorbuojamas specialioje ploktelje, skirtoje imunofermentinei analizei. Ploktel inkubuojama su tiriamuoju pavyzdiu imunizuoto triuio kraujo serumu, kuris prie tai skiediamas nuo 100 iki 100 000 kart. Kraujo serume esantys specifiniai antiknai prisijungia prie imobilizuoto antigeno. Paalinus neprisijungusius antiknus, ploktel pridedama peroksidaze ymt antikn prie triuio imunoglobulinus (antiknus). Po inkubacijos pridedamas peroksidazs substrato tirpalas. Vyksta fermentin reakcija. Spalvos intensyvumas (optinis tankis), kuris yra proporcingas specifini antikn kiekiui tiriamajame pavyzdyje, matuojamas spektrofotometru. Antikn titras atitinka tok serumo praskiedim, kuriam esant optinis tankis sumaja perpus, palyginti su didiausiuoju optiniu tankiu. Tyrimo objektas Imunizuoto triuio kraujo serumas. Matavimo priemons Spektrofotometras Multiskan, mikropipets, svarstykls, pH-metras. Mediagos ir reagentai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Ploktel imunofermentinei analizei. Antigenas mogaus alfa-interferonas. Imunizuoto triuio kraujo serumas. Antiknai prie triuio imunoglobulinus, konjuguoti su peroksidaze (konjugatas). Imobilizacijos buferis (0,05 M Na-karbonatinis buferis, pH 9,5). Buferis PBS (0,05 M K/Na-fosfatinis buferis su 0,15 M NaCl, pH 7,27,4). Buferis PBS-T (PBS su 0,1 % detergento Tween-20). Blokavimo buferis (PBS su 1 % albumino). Substratinis buferis (0,025 M Na-acetatinis buferis, pH 5,0). o-fenilendiaminas. 19 % vandenilio peroksido tirpalas. 10 % sieros rgties tirpalas.

Darbo eiga 1. Antigeno imobilizacija. Paruoiamas 5 g/mL antigeno (alfa-interferono) tirpalas imobilizacijos buferyje. ploktels ulinlius ipilstoma po 50 L io tirpalo. Ploktel inkubuojama 16 val. 37 C temperatroje. 2. Blokavimas. Laisvas ploktels pavirius blokuojamas albuminu. ploktel ipilstoma po 150 L blokavimo buferio, inkubuojama 30 min. kambario temperatroje. 3. Tiriamojo serumo titravimas. Tiriamasis serumas atskiediamas PBS-T 100 kart. ploktels A ulinlius pilama po 100 L io tirpalo. ploktels B-H ulinlius pilama po 50 L buferio PBS-T. I A ulinli perkeliama 50 L antikn tirpalo B ulinlius, gerai sumaioma, toliau perkeliama 50 L C, i C D, ir t. t. Taigi tiriamasis serumas kiekvien kart atskiediamas 2 kartus. Po

148

titravimo visuose ulinliuose turi likti po 50 L tirpalo. Ploktel inkubuojama 1 val. kambario temperatroje. 4. Inkubacija su ymtaisiais antiknais prie triuio imunoglobulinus. Ploktel 5 kartus praplaunama PBS-T buferiu. Konjugatas atskiediamas 1000 kart PBS-T buferiu. ploktels ulinlius ipilstoma po 50 L io tirpalo. Ploktel inkubuojama 1 val. kambario temperatroje. 5. Fermentins reakcijos irykinimas. Paruoiamas peroksidazs substrato tirpalas: 5 mg ofenilendiamino itirpinama 10 mL substratinio buferio ir pridedama 30 L vandenilio peroksido tirpalo. ploktels ulinlius ipilstoma po 100 L io tirpalo. Ploktel inkubuojama 1015 min., kol irykja spalva. Tada fermentin reakcija sustabdoma, pridedant po 50 L sieros rgties tirpalo. Optinis tankis imatuojamas spektrofotometru, esant viesos bangos ilgiui 492 nm. Skaiiavimai Braioma kalibracin kreiv: ordinai ayje atidedamos gautos optinio tankio reikms, abscisi ayje atitinkamuose ulinliuose esanio serumo praskiedimo kartai (r. pav.). Specifini antikn titras atitinka didiausi serumo praskiedim, kuriam esant, kaip nustatyta, optinis tankis sumajs 50 %, palyginti su didiausiuoju optiniu tankiu.
2.5 Optinis tankis, 450 nm 2 1.5 1 0.5 0

80 0

60 0

20 0

00

00

00

16

32

64

12

25

51

Serumo praskiedimas, kartai

10

24 0

20

40

10

80

.
Specifini antikn titro nustatymo kreiv

Atsiskaitymas specifini antikn titro nustatymo kreiv; specifini antikn titras.

Literatra 1. Abbas, A. K.; Lichtman, A. H. Basic immunology. Philadelphia: W. B. Saunders Co., 2001, p. 622. 2. Roitt, I.; Brostoff, J.; Male, D. Immunology. 5th ed. St. Luois, USA: Mosby, 2000, 1426, p. 7180.

149

11. Alfa-interferono kiekybinis nustatymas imunofermentiniu metodu


Aurelija virblien Darbo tikslas Imunofermentiniu metodu nustatyti alfa-interferono koncentracij tiriamajame pavyzdyje, naudojant monokloninius antiknus. Alfa-interferonui (IFN) nustatyti taikomas dviej epitop imunofermentins analizs metodas. Monokloniniai antiknai prie IFN (klonas 9D3) imobilizuojami ploktelje. Tada ploktel inkubuojama su IFN standartu ir tiriamaisiais pavyzdiais. IFN specifikai prisijungia prie imobilizuot antikn. Prisijungs IFN aptinkamas, inkubuojant su kitais monokloniniais antiknais (klonas 4E10), konjuguotais su peroksidaze. Pridjus peroksidazs substrato tirpalo, spektrofotometru imatuojamas fermentins reakcijos metu gauto junginio spalvos intensyvumas (optinis tankis). Jis yra tiesiogiai proporcingas IFN koncentracijai. Braioma kalibracin kreiv: optinio tankio priklausomyb nuo IFN standarto koncentracijos. I kalibracins kreivs nustatoma IFN koncentracija tiriamajame pavyzdyje. Tyrimo objektas mogaus alfa-interferonas. Matavimo priemons Spektrofotometras Multiskan, mikropipets, svarstykls, pH-metras. Mediagos ir reagentai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Ploktel imunofermentinei analizei. mogaus alfa-interferono standartas (0,18 mg/mL arba 7,2107 TV/mL). Monokloniniai antiknai 9D3 prie mogaus alfa-interferon. Monokloniniai antiknai 4E10, konjuguoti su peroksidaze (konjugatas). Imobilizacijos buferis (0,05 M Na-karbonatinis buferis, pH 9,5). Buferis PBS (0,05 M K/Na-fosfatinis buferis su 0,15 M NaCl, pH 7,27,4). Buferis PBS-T (PBS su 0,1 % detergento Tween-20). Blokavimo buferis (PBS su 1 % albumino). Substratinis buferis (0,025 M Na-acetatinis buferis, pH 5,0). o-fenilendiaminas. 19 % vandenilio peroksido tirpalas. 10 % sieros rgties tirpalas.

Darbo eiga 1. Monoklonini antikn 9D3 imobilizacija. Paruoiamas antikn 9D3 tirpalas: 5 L antikn suspensijos itirpinama 5 mL imobilizavimo buferio. kiekvien ploktels ulinl pilama po 50 L antikn tirpalo. Ploktel inkubuojama 16 valand +37 C temperatroje. 2. Blokavimas. Laisvas ploktels pavirius blokuojamas albuminu. ploktel ipilstoma po 150 L blokavimo buferio, inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. ulinli turinys ipilamas, ir ploktel tris kartus praplaunama PBS-T buferiu. 3. Standartini tirpal paruoimas. Standartiniai tirpalai ruoiami i IFN-2b substancijos tirpalo (010398), kuriame IFN koncentracija yra 0,18 mg/mL (7,2107 TV/mL), skiediant PBS-T buferiu. Paruoiami standartiniai tirpalai, kuriuose IFN koncentracija yra: 500, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 TV/mL.

150

4. Pavyzdi paruoimas. Tiriamieji pavyzdiai skiediami PBS-T buferiu tiek kart, kad numatoma IFN koncentracija bt 5003000 TV/mL koncentracij. 5. Inkubacija su standartais ir pavyzdiais. ploktels 1, 6 ir 12 eilutes pilama po 100 L IFN standartini tirpal. kitus ulinlius pilama po 100 L tiriamj pavyzdi. Ploktel inkubuojama 1 valand 37 C temperatroje. Tada ulinli turinys ipilamas, ploktel 5 kartus praplaunama PBS-T buferiu. 6. Inkubacija su konjugatu. Konjugatas 4E10 atskiediamas 1000 kart PBS-T buferiu. visus ploktels ulinlius pilama po 100 L konjugato tirpalo. Ploktel inkubuojama 1 val. kambario temperatroje. Tada ulinli turinys ipilamas, ploktel 10 kart plaunama PBS-T buferiu ir 2 kartus distiliuotu vandeniu. 7. Fermentins reakcijos nustatymas. Paruoiamas peroksidazs substrato tirpalas: 5 mg ofenilendiamino itirpinama 10 mL substratinio buferio ir pridedama 30 L vandenilio peroksido tirpalo. ploktels ulinlius ipilstoma po 100 L io tirpalo. Ploktel inkubuojama tamsoje 1015 min., kol irykja spalva. Tada fermentin reakcija sustabdoma, pridedant po 50 L sieros rgties tirpalo. Optinis tankis imatuojamas spektrofotometru, esant viesos bangos ilgiui 492 nm. Skaiiavimai Braioma kalibracin kreiv: ordinai ayje atidedamos gautos optinio tankio reikms, abscisi ayje IFN standarto koncentracija, TV/mL (r. pav.). IFN koncentracija tiriamuosiuose pavyzdiuose nustatoma i kalibracins kreivs, vertinant praskiedim. Braiant kalibracin kreiv ir nustatant IFN koncentracij rekomenduojama naudoti Origin, GraphPad ar kit kompiuterin program.

0.9 0.8

Optinis tankis, 492 nm

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 500 1000 1500 2000 2500 3000

IFN koncentracija, TV/m l

INF koncentracijos nustatymo imunofermentiniu metodu kalibracin kreiv

Atsiskaitymas INF koncentracijos nustatymo kalibracin kreiv; INF koncentracija tiriamajame tirpale.

Literatra 1. Abbas, A. K.; Lichtman, A. H. Basic immunology. Philadelphia: W. B. Saunders Co., 2001, p. 125146. 2. Roitt, I.; Brostoff, J.; Male, D. Immunology. 5th ed. St. Luois, USA: Mosby, 2000, p. 381394.

151

Bioorganin chemija
Laboratoriniai darbai Albinas ilinskas

1. Aminorgtys ir baltymai
Aminorgtys Aminorgtimis vadinami junginiai, kuri sudtyje yra NH2 ir COOH grupi. Yra aminorgi, kurios turi kelias ias grupes arba imido grup NH (cikle), arba dar papildomai OH, SH grupes. Klasifikacija. Pagal radikalus aminorgtys skirstomos aciklines ir ciklines (aromatines ir heterociklines), o pagal funkcines grupes monoaminomonokarbonines, monoaminodikarbonines, diaminomonokarbonines, hidroksiaminorgtis, merkaptoaminorgtis. Izomerija. Aminorgtys turi: 1) grandins, 2) funkcini grupi tarpusavio padties, 3) optinius izomerus. Nomenklatra. Aminorgi nomenklatra niekuo nesiskiria nuo kit organini jungini nomenklatros, taiau daniau vartojami trivialieji aminorgi pavadinimai. Gavimas. Dauguma gamtini aminorgi yra -aminorgtys. Jos gaunamos halogenintas rgtis veikiant amoniaku, hidrolizuojant baltymus ir kt. bdais. Fizikins savybs. Aminorgtys yra kristalins mediagos, vairiai tirpstanios vandenyje. Chemins savybs. Pasiymi ir amino, ir karboksi- grupei bdingomis cheminmis savybmis. Biologikai svarbios aminorgi reakcijos: a) dekarboksilinimas susidaro aminai, b) dezamininimas susidaro rgtys; hidrolizinio dezamininimo produktas hidroksirgtys, oksidacinio oksorgtys, redukcinio soiosios rgtys; kai tiesiog atskyla amoniakas nesoiosios rgtys, c) peptid bei polipeptid (baltym) susidarymas i gretim aminorgi COOH ir NH2 grupi atskylant H2O molekulei ir d) transamininimas amino grups perneimas oksorgtims. Baltymai Tai labai sudtingos struktros polipeptidai, t. y. biopolimerai (j yra daugiau kaip 20 ri), sudaryti i aminorgi. Baltym sudaro per 100 aminorgi. Klasifikacija. Pagal sudt baltymai (proteinai) skirstomi paprastuosius, - tik i aminorgi, ir sudtinius, kuriuose yra ir nebaltymin prostetin grup, prisijungusi kovalentinmis, joninmis bei koordinacinmis jungtimis. Sudtiniai baltymai, kuri prostetin grup yra angliavandeniai, vadinami glikoproteinais; jei nukleino rgtys nukleoproteinai, jei lipidai lipoproteinai ir t. t. (sudtiniai baltymai dar vadinami proteidais). Pagal molekuls form ir tirpum baltymai skirstomi globulinius ir fibrilinius. Nomenklatra. Daniausiai trivialioji, pavyzdiui, miozinas yra raumen (gr. myos) baltymas. Savybs. Baltymai kaip ir aminorgtys yra amfoteriniai junginiai. J tirpal stabilum lemia molekuli krvis ir hidratinio vandens sluoksnis. Baltymai isiskiria nuosdomis, kai praranda vien arba abu stabilumo veiksnius. Baltymai, veikiami katalizatori, hidrolizuojasi. Jiems bdingos spalvins reakcijos. Reikm. Baltymai svarbs pramonje: jie yra natralios odos, vilnos, ilko pagrindas, i j gaminama elatina. is i dalies hidrolizuoto jungiamojo audinio baltymo kolageno polipeptid miinys vartojamas fotopopieriui, kino juostoms gaminti, poligrafijoje, kulinarijoje ir kt. Biologins baltym funkcijos kartu su nukleino rgi aktyvumu sudaro gyvybs proces pagrind. Baltymai eina lsteli sandar, reguliuoja visas chemines reakcijas (visi fermentai, kai kurie hormonai, pvz., insulinas), saugo nuo infekcijos (antikniai), lemia judjim (raumen baltymai) ir kt. Aminorgi tirpal pH nustatymas Aminorgi tirpal pH priklauso nuo to, koki disocijuojani jonus grupi rgtini ar bazini j molekulse yra daugiau, ir nuo i grupi disociacijos laipsnio.

152

Darbo eiga 1. Ant filtravimo popieriaus juostels lygiais tarpais vienas nuo kito ulainami keli laai universaliojo indikatoriaus ir ant j po la vairi aminorgi tirpal (24 %). 2. La spalva palyginama su universaliojo indikatoriaus spalv skale ir apytiksliai nustatoma aminorgi tirpal pH reikm. Aminorgi amfoterins savybs Aminorgtys turi ir bazini, ir rgtini grupi, todl joms bdingos dvejopos rgties ir bazs savybs. Darbo eiga A. 1. vien mgintuvl lainami 4 laai 4 % glicino tirpalo, kit 4 laai vandens. 2. abu mgintuvlius lainus po la 1 % fenolftaleino spiritinio tirpalo, n viename mgintuvlyje skysiai nenusidao avietine spalva, bdinga fenolftaleinui arminiame tirpale (pH > 8). 3. Tada abu mgintuvlius lainama po la 0,01 N NaOH. Aminorgties tirpale spalva neatsiranda, nes su NaOH glicinas sureaguoja kaip rgtis, o mgintuvlyje, kuriame yra paarmintas vanduo, fenolftaleinas gyja bding avietin spalv. B. 1. vien mgintuvl lainami 4 laai 4 % glicino tirpalo, kit 4 laai vandens, abu po la 0,2 % indikatoriaus metilorano tirpalo. N vienas tirpalas nenusidao raudonai spalva, bdinga rgtiesiems tirpalams (pH < 4). 2. Tada abu mgintuvlius lainama po la 0,01 N HCl. Aminorgties tirpalas lieka bespalvis, nes su HCl glicinas sureaguoja kaip baz, o mgintuvlyje, kuriame yra stipria rgtimi pargtintas vanduo, metiloranas gyja raudon spalv. Aminorgi kompleksniai junginiai su vario druskomis Aminorgtys su vario katijonais sudaro kompleksines mlynos spalvos druskas chelatus. Laisvieji azoto elektronai sijungia laisvas iorines vario atomo orbitales:
NH2 Cu O O H2N O

glicino vario chelatas

Darbo eiga mgintuvl lainama po la 0,2 N CuSO4, 4 % glicino ir 2 N NaOH tirpal. Tirpalas gyja vario kompleksams bding intensyviai mlyn spalv. Bandyme svarbu atsivelgti, kokie junginiai tiriami pavyzdiui, glicino natrio druska ar laisvasis glicinas, lizino ir HCl druska ar laisvasis lizinas. Aminorgi reakcija su nitrito rgtimi Aminorgtys, veikiamos nitrito rgtimi, virsta hidroksirgtimis. Reakcijoje isiskiria N2:
R CH NH2 COOH + HONO R CH OH COOH + H2O + N2 .

(NaNO2 + HCl)

153

Darbo eiga mgintuvl lainama po la 2 N HCl, 24 % aminorgties ir 0,5 N NaNO2 tirpal. Tuojau pradeda skirtis azotas. Aminorgi reakcija su formaldehidu Formaldehidas reaguoja su aminorgties NH2 grupe ir susidaro N-metilenaminorgtis:

R CH NH2

COOH

CH2 O

R CH N CH2

COOH

H2O.

Kadangi blokuojama NH2, tai disocijuoja tik COOH grup, ir tirpalas pargtja. Formaldehidas tirpale yra hidrato HOCH2OH pavidalo, todl gali susidaryti tokie N dariniai: NH, CH2OH ir N(CH2OH)2. Darbo eiga A. 1. mgintuvl lainama 3 laai formalino ir 1 laas 0,2 % indikatoriaus metilo raudonojo. Formaline yra skruzdi rgties, todl tirpalas parausta. 2. Plonu ulydytu stikliniu kapiliaru tirpal lainama labai nedaug 2 N NaOH, ir tirpalas tampa neutralus (geltonas). 3. kit mgintuvl lainama 3 laai 4 % glicino ir 1 laas to paties indikatoriaus tirpal. Glicino tirpalas neutralus, todl metilo raudonasis nudao j geltonai. glicino tirpal supylus mgintuvl su formaldehido tirpalu, skystis tuoj pat parausta, nes susidaro N-metilenglicinas. B. pH pakitimai stebimi lainus universaliojo indikatoriaus. Baltym biureto reakcija Vario jonai labai arminje terpje su baltym peptidinmis jungtimis sudaro violetins spalvos kompleksin jungin:
C O Tautomerija NH2 C OH NH

OH NH CHR1 C N CHR2 Cu H N CO N CHR3 CO

CHR4

CO

CHR5 C N OH

CHR6 CO

154

Reaguoja junginiai, kuriuose yra ne maiau kaip dvi peptidins jungtys: biuretas (nuo to kilo pavadinimas), tripeptidai, be to, kai kurios aminorgtys. Reakcija gali bti taikoma baltym kiekiui nustatyti. Darbo eiga mgintuvl pilama po 1 mL baltym, 2 N NaOH ir 1 laas 0,2 N CuSO4 tirpal. Nusidao rausvai arba mlynai violetine spalva. Jei baltym nedaug, imama daugiau CuSO4 ir atsargiai sienele supilama mgintuvl, nesumaiant su arminiu baltymo tirpalu. Susidaro violetinis iedas. Bandymams daniausiai vartojamas kiauinio albumin tirpalas (vieno kiauinio baltymas kratant sumaiomas su 100200 mL vandens ir globulinai nufiltruojami pro audekl). Ninhidrino reakcija su baltymais Veikiamos indan-1,2,3-triono hidrato (ninhidrino) -aminorgtys oksiduojasi, dezamininamos ir dekarboksilinamos. Ninhidrinas, susidars redukuotas ninhidrinas ir NH3 kondensuojasi mlynos spalvos konjuguot jungi produkt: Reaguojant peptidams bei baltymams, CO2 neisiskiria.
O OH OH O O H OH O + NH3 + HO HO O O R CH + NH2 O O O N O HO . COOH t O H OH O + R H + NH3 + CO2 .

-3H2O

Darbo eiga 5 laus baltym tirpalo lainama tiek pat 0,1 % ninhidrino tirpalo ir pavirinama apie minut. Nusidao violetine, o atauus mlyna spalva. Reakcija taikoma aminorgi chromatografijoje ir kolorimetrinje analizje. Ksantoproteino reakcija Veikiant koncentruotja HNO3, baltym aromatins aminorgtys nitrinasi, ir susidaro geltoni (gr. xantos) nitrojunginiai:
O2N HO CH2 CH NH2 COOH +2 HNO3

-2 H2O

HO O2N

CH2

CH NH2

COOH .

Tokia reakcija vyksta azoto rgiai patekus ant odos.

155

Darbo eiga 1. mgintuvl pilama 1 mL nepraskiest baltym ir lainama koncentruotoji HNO3, kol isiskiria baltym nuosdos. Galima imti 5 laus baltym tirpalo (10 %) ir 3 laus koncentruotosios HNO3 2. Mgintuvl atsargiai pakaitinus, tirpalas ir nuosdos gyja gelton spalv. Folio reakcija Sieros turinios aminorgtys cisteinas (Cis) ir cistinas (Cis-S-S-Cis), bet ne metioninas (Met), baltymuose nustatomos pagal j molekulse randam sier. Darbo eiga A. 5 laus baltym tirpalo lainama tiek pat 2 N NaOH ir kaitinama kelias minutes. Atauintame skystyje nustatomas sulfido jonas. B. Galima virinti baltym tirpal su Folio reagentu. is reagentas ruoiamas taip: 5 % vino acetato tirpal pilama tiek 2 N natrio armo tirpalo, kad itirpt susidariusios Pb(OH)2 nuosdos. Gaunamas natrio pliumbitas Na2PbO2. is junginys ir reaguoja su sulfidu: (CH3COO)2Pb + 2NaOH Pb(OH)2 + 2NaOH Na2PbO2 + Na2S + 2H2O Pb(OH)2 + 2CH3COONa, Na2PbO2 + 2H2O, PbS + 4NaOH.

2. Angliavandeniai
Klass pavadinimas rodo, kad daugelio i jungini molekulin formul galima nagrinti kaip sudaryt i anglies ir vandens tam tikru santykiu (pvz., gliukoz C6H12O6 = 6C : 6H2O). Nors dabar yra inoma toki angliavandeni, kuri sudtis nra ireikiama tokia formule, ir daugelis turi N, S atom, bet terminas angliavandeniai vartojamas plaiausiai (sinonimai sacharidai, karbohidratai). Angliavandeniai klasifikuojami paprastuosius, t. y. monosacharidus, kurie negali bti hidrolizuoti iki paprastesni molekuli, ir sudtinguosius, t. y. polisacharidus, kurie hidrolizuojami skyla n molekuli monosacharid. Kai n = 2 10, angliavandeniai vadinami oligosacharidais (gr. oligos nedaug). Svarbiausi i j yra disacharidai. Reikm. I organini jungini emje daugiausia yra angliavandeni. J reikm vairiapus. Gryna celiulioz yra vata ir filtravimo popierius. is polisacharidas yra popieriaus, linini ir medvilnini audini, viskozinio ilko bei celofano pagrindas. Svarbs ir celiuliozs esteriai: i acetilceliuliozs gaminamas acetatinis ilkas, kino juostos, lakai. I visikai nitrintos celiuliozs (piroksilino) gaminamas bedmis parakas. Maiau nitrinta celiulioz (koloksilinas) vartojama kolodijui, nitrolakams, celiulioidui gaminti. I celiuliozs gaunama gliukoz, o i jos etilo alkoholis (hidrolizinis). Pektinai dl hidrofilikumo ir tirpal elatinjimo vartojami maisto, kosmetikos pramonje. Daug sacharozs suvartojama konditerijoje. I jos gaminami vertingi detergentai, dervos, lakai ir kt. Biologins angliavandeni funkcijos vairios. Angliavandeniai yra btina sudtin maisto dalis. Kaip energijos altinis krakmolas yra pagrindinis mogaus (celiulioz kai kuri gyvn, pvz., vabzdi termit) maisto komponentas. Krakmolas augal, o glikogenas gyvn lstelse yra rezervins energijos altinis. Daugelis jungini, susijusi su mediag apykaitos procesais, turi angliavandenin komponent (nukleino rgtys, kofermentai, kai kurie hormonai, fermentai ir kt.). Polisacharidai reikmingi struktriniu poiriu: membranose, jungiamajame audinyje ir pan. jie sudaro kompleksus su baltymais ir lipidais (hialurono rgtis, chondroitinsulfatai). Augal lsteli struktros pagrind sudaro celiulioz, pektinai, viagyvi chitinas. Specifins biologins organizmo savybs (kraujo grupi specifikumas, imunitetas) taip pat susijusios su angliavandeniais. Medicinoje gliukozs tirpalo virkiama ven tada, kai organizmo lsteles reikia greitai aprpinti maisto mediagomis (energija), pavyzdiui, sutrikus irdies veiklai. Gliukozs dedama tabletes, pavyzdiui, kartu su vitaminu C. is vitaminas bei eias OH grupes turintis alkoholis sorbitolis (skiriamas diabetikams) sintetinami i gliukozs. Sacharoz vartojama suteikti saldumo vaistams (milteliams) arba jiems konservuoti (sirupai). Krakmolas gali

156

bti vartojamas tabletms gaminti, pabarstams. Yra vaisi (obuoli), kurie vertingi tuo, kad j pektinai arnyne sujungia kenksmingus produktus. Celiuliozs (medvilns) dirbiniai yra bintas, marl, vata, ligonini skalbiniai. Tam tikr bakterij gaminami polisacharidai dekstranai vartojami, kaip kraujo plazmos pakaitalai nukraujavus. Be to, i j gaminami sefadeksai, kuriuos panaudojant nustatoma baltym molekulin mas. Angliavandeni hidroksilo grupi reakcija Angliavandeni molekulse, kaip ir glicerolyje, viena greta kitos yra keletas hidroksilo grupi. Todl arminiuose tirpaluose jos, kaip ir glicerolis, reaguoja su Cu(II) jonais ir sudaro spalvotus kompleksinius junginius. Darbo eiga mgintuvl lainama po 1 la (1 %) tirpal: I gliukozs, II fruktozs, III sacharozs, IV laktozs arba maltozs, po 6 laus 2 N NaOH ir po la 0,2 N CuSO4. Isiskiria melsvos Cu(OH)2 nuosdos. Supurius jos itirpsta, susidaro mlynos spalvos vario ir sacharido chelatas. Angliavandeni aldehidins grups reakcija Nors dauguma gliukozs ir kit angliavandeni molekuli yra ciklins formos, bet oksidacijos reakcijoje jos dalyvauja bdamos tautomerins formos aldehido pavidalo. Kaip oksidatoriai daniausiai bna metal kompleksiniai junginiai arminiame tirpale. Reakcijos metu oksidatoriai redukuojasi, todl visi angliavandeniai, kurie turi aldehidin grup arba juose yra laisvasis pusacetalinis hidroksilas, vadinami redukuojaniaisiais sacharidais. Monosacharidai. Aldozs oksiduojasi lengvai. Ketozs, veikiamos arm, izomerizuojasi aldozes per tarpin enol (endiolin jungin), todl jos taip pat lengvai redukuoja metalus:
CH2OH C O H C C OH OH H H C C O OH .

ketoz

enolin forma

aldoz

I disacharid reaguoja tik tie, kurie turi laisv pusacetalin hidroksilo grup. Polisachariduose laisv aldehidini grupi nedaug (pvz., krakmole viena imtams gliukozs vienet), todl pagal ias reakcijas jos neaptinkamos. Taiau maesns polisacharid molekuls (dekstrinai) gali redukuoti metalus. Reagentai: 1) vario hidroksidas (Tromerio reagentas); 2) vario gliceratas (Haineso reagentas); 3) vyno rgties kalio ir natrio druskos vario alkoholiatas (Felingo reagentas).
2 CuSO4 H2O+ [O] + 2 CuOH . t

C O

OH

[O]

COOH

Cu2O + H2O raudonas

OKSIDACIJA

REDUKCIJA

157

iuose cheminiuose reagentuose yra Cu(II) jon. Jiems redukuojantis iki Cu(I) jon, angliavandeniliai oksiduojasi rgtis, pavyzdiui, oksiduojant gliukoz arminje terpje, susidaro glicerolio, glikolio, skruzdi rgtys, t. y. produktai, kuri maesnis C atom skaiius. Kaip oksidatoriai gali bti ir kiti metalai: Ag(I), Bi(III), Fe(III). i metal redukcija pagrsti metodai taikomi gliukozei nustatyti kraujyje, lapime. Taiau biologiniuose skysiuose gali bti ir kit redukuojani jungini (lapimo rgties, kai kuri vaist ir kt.). Specifikiausias yra fermentinis metodas gliukozei nustatyti gliukozs oksidaze. Darbo eiga A. Tromerio reakcija. 4 mgintuvlius su kompleksiniais vario sacharato tirpalais, gautais praeitame laboratoriniame darbe, lainama po 56 laus H2O. Mgintuvliai pakreipiami nedideliu kampu ir kaitinama tik virutin skysio dalis (apatin dalis yra kontrolin), kol uverda (nevirinti, nes gali skilti Cu(OH)2 ir oksiduotis kiti junginiai). Paildytos skysio dalies spalva i mlynos Cu(OH)2 pasikeiia gelton CuOH arba raudon Cu2O spalv. B. Haineso reakcija. 4 mgintuvlius lainama po 5 laus CuSO4, 10 la NaOH, 5 laus glicerolio; supurius susidaro tamsiai mlynas vario glicerato tirpalas. Tada lainama po 5 laus H2O ir gautas tirpalas pakaitinamas iki virimo. Mgintuvliai pakreipiami ir ant sienels ulainama po 3 laus angliavandeni tirpal. Virutiniame karto reagento sluoksnyje vyksta oksidacijos ir redukcijos reakcija. C. Felingo reakcija. 4 mgintuvlius lainama po 5 laus Felingo-I ir Felingo-II ir po 3 laus angliavandeni tirpal. Mgintuvliai kaitinami verdanio vandens vonioje arba degiklio liepsna, kol pasirodo redukuot vario jungini spalva. D. Tolenso reakcija. 4 mgintuvlius lainama po 1 la 0,2 N AgNO3 ir 2 laus 2 N NaOH tirpal. Susidariusios nuosdos itirpinamos 34 lauose 2 N NH4OH. kiekvien mgintuvl lainama po 1 la angliavandeni tirpal. Mgintuvliai truput paildomi vir degiklio liepsnos, kol susidrumsia tirpalai (isiskiria laisvasis Ag). Blizganiu sluoksniu (sidabro veidrodis) sidabras nusda tik tada, jei mgintuvlio sienels buvo variai nuplautos (neriebaluotos). i reakcija taikoma veidrodiams, egluts aislams gaminti. Ketozi reakcija Ketoheksozs, ildomos su praskiesta HCl, dehidratuojasi iki 5-hidroksimetilfurfuralio (ketopentozsiki furfuralio). Gautas aldehidas kondensuojasi su rezorcinoliu (arba kitais fenoliais bei aromatiniais aminais), sudarydamas spalvot jungin:
HOH2C H H HO H OH O OH

H+
HOH2C CH2OH

O rezorcinolis

-H2O

Raudonos spalvos kondensacijos produktai

ioje F. Selivanovo pasilytoje reakcijoje aldoheksozs reaguoja 1520 kart liau, todl metodas bdingas ketozms. Darbo eiga 1. mgintuvl lainama 5 laai angliavandeni tirpal ir 5 laai Selivanovo reagento (0,01 g rezorcinolio, itirpinto 10 mL koncentruotosios HCl ir 10 mL H2O miinyje) arba metama kruopel sauso rezorcinolio ir lainami 2 laai koncentruotosios HCl.

158

2. Mgintuvlis 2 min. laikomas verdanio vandens vonioje. Spalva mgintuvlyje su fruktoze tampa rykiai raudona. Paaikinkite, kodl mgintuvlyje su sacharoze tirpalas tampa raudonas. Isiaikinkite, kaip ioje reakcijoje pakinta disacharidai, kad galt vykti Selivanovo reakcija. Angliavandeni hidroliz Monosacharidai nesihidrolizuoja. Disacharidai suskyla dvi, polisacharidai n monosacharid molekuli. Hidrolizei btini katalizatoriai (rgtys, fermentai). Polisacharidai hidrolizuojasi pakopomis: didels j molekuls skyla vis maesnio polimerizacijos laipsnio polisacharidus, toliau susidaro disacharidai ir pagaliau monosacharidai. Hidrolizs produktai nustatomi spalvinmis reakcijomis. Sacharoz + Vanduo Gliukoz + Fruktoz [] D(+66) []D (+52) []D (92) Sacharozs hidroliz. Sacharoz, esant katalizatoriams (rgtims, o organizme arnyno fermentams), suskyla gliukoz ir fruktoz: Reakcijos pabaig galima sekti cheminiu (oksiduojant) arba fizikiniu (matuojant poliarizuotos viesos lyginamj sukimo kamp []) bdu. Darbo eiga 1. du mgintuvlius lainama po 1 la 2 % sacharozs, 1 la 2 N HCl ir 6 laus H2O. 2. Vienas mgintuvlis labai pakreipiamas ir nuolat supurtant (atsargiai!) 30 s kaitinamas degiklio liepsnoje. 3. abu mgintuvlius lainama po 2 laus 2 N NaOH, 5 laus Felingo-I ir 5 laus Felingo-II tirpal. 4. Abu mgintuvliai kaitinami. Kodl spalva pasikeiia tik viename mgintuvlyje? Paraykite reakcijos lygt struktrinmis formulmis. Krakmolo hidroliz Krakmolas hidrolizuojasi palaipsniui veikiant H2O ir katalizatoriumi: (C6H10O5)n
krakmolas

(C6H10O5)x
tirpusis krakmolas

(C6H10O5)1-2
dekstrinai

n/2 C12H22O11
maltoz

n C6H12O6
gliukoz

Kai katalizatorius yra rgtis, hidroliz vyksta kaitinant, krakmolas virsta -gliukoze. Kai hidrolizs katalizatorius yra fermentas amilaz, procesas vyksta neildant, o pagrindinis produktas yra maltoz. Hidrolizs produktai aptinkami atliekant reakcij su jodu arba oksidacijos reakcij. Jodo molekul siterpia amilozs spirals pavidalo molekuls vid, susidaro spalvotas kompleksas. Katalizatorius rgtis 1. vien mgintuvl lainami 5 laai 0,5 % krakmolo kleisterio ir 2 laai H2O (kontrolinis palyginamasis mgintuvlis). 2. Verdanio vandens vonioje mgintuvliai laikomi 5 min. Tada kas 12 min. i pirmojo mgintuvlio 1 laas hidrolizato ant stiklelio arba mgintuvlyje sumaiomas su 1 lau labai praskiesto jodo tirpalo (atskirame mgintuvlyje 1 laas jodo praskiediamas 5 laais H2O). Taip pat daroma ir su kontroliniu mgintuvliu. Krakmolas su jodu sudaro mlynai violetins spalvos produkt, o hidrolizs reakcijoje susidar vis majanio polimerizacijos laipsnio tarpiniai produktai dl jodo gyja violetin, vliau raudonai violetin spalv. Maltoz ir gliukoz su jodu nereaguoja (ilieka gelsva jo tirpalo spalva). iuos angliavandenius galima nustatyti vykstant bet kokiai oksidacijos reakcijai; prie tai tirpal reikia

159

neutralizuoti ir pridti armo pertekli, pavyzdiui, hidrolizat lainama 68 laai 2 N NaOH, 1 laas 0,2 CuSO4 ir ildoma. Krakmolo hidrolizs reakcija taikoma gliukozei gauti. Katalizatorius fermentas. Mgintuvlyje gerai sumaioma 5 laai krakmolo kleisterio ir 5 laai savo seili. Po 12 min. hidrolizs substratas krakmolas (reakcija su jodu) ir io proceso produktas maltoz (oksidacija) analizuojami taip pat, kaip ir vartojant rgtin katalizatori. Celiuliozs hidroliz Celiulioz per tarpinius produktus, veikiant H2O ir katalizatoriui (rgiai, o oldi gyvn arnyno mikroorganizm fermentams), suskyla -gliukoz: (C6H10O5)n
celiulioz

(C6H10O5)x
amiloidas

n/2 C12H22O11
celiobioz

n C6H12O6
gliukoz

Celiuliozs dalin hidroliz. Trumpai paveikto pakankamai koncentruotu H2SO4 tirpalu popieriaus paviriuje susidaro dalins hidrolizs produktas amiloidas, kuris upildo poras ir suklijuoja plauelius. Toks popierius nepraleidia vandens, riebal, yra stiprus. Juo pakuojami medikamentai, maisto produktai (sviestinis popierius). Darbo eiga 1. Filtravimo popieriaus juostel (0,54 cm) iki puss merkiama porcelianin lktel su 70 % H2SO4 tirpalu ir palaikoma 1520 s. 2. Tada juostel gerai iplaunama tekaniu vandeniu ir vandeniu, kur lainta keli laai NH4OH. Palyginama abiej juostels pusi tankis, tvirtumas. Celiuliozs hidroliz iki gliukozs. Kadangi celiulioz vandenyje netirpsta, ji itirpinama koncentruotoje H2SO4, paskui pilama vandens, kad vykt hidroliz (sieros rgtis ne tik tirpina ji veikia sudtingiau: kartu celiulioz esterinama, vyksta jos destrukcija, susidaro rusvi sudtingos struktros produktai ir kt.). i reakcija taikoma pramonje gliukozei, o i jos hidroliziniam spiritui gauti (celiuliozs aliava ia medienos atliekos). Darbo eiga 1. mgintuvl dedamas nedidelis (0,51 cm) gaballis filtravimo popieriaus ir lainami 35 laai koncentruotos H2SO4. Trinant ir maiant lazdele, celiulioz itirpsta (galima paildyti; atsargiai!). 2. lainus (atsargiai!) 10 la H2O, miinys kaitinamas verdanio vandens vonioje. 3. Po 20 min. prie 2 la hidrolizato pridedami 8 laai 2 N NaOH ir 1 laas 0,2 N CuSO4 tirpalo vyksta Tromerio reakcija.

3. Nukleino rgtys
Nukleino rgtys yra biopolimerai, sudaryti i mononukleotid, t. y. jos yra polinukleotidai. Nukleozidai yra pentozi N-glikozidai su heterociklinmis azoto bazmis, t. y. sudaryti i bazs ir pentozs. Nukleotidai nukleozid fosfatai, t. y. sudaryti i bazs, pentozs ir fosforo rgties. Struktra. Nukleino rgtys yra dviej tip: DNR ir RNR. J sudtis (DNR dezoksiriboz ir timinas, RNR riboz ir uracilas), struktra ir biologins funkcijos skirtingos. Reikm. Mononukleotidai nukleozid 5-monofosfatai sudaro nukleino rgtis. ATP yra pagrindinis lsteli junginys, kurio dviejose makroenergetinse fosfatinse jungtyse susikaupia vairi jungini biologins oksidacijos metu atsipalaiduojanti energija. Bdama chemins energijos atsargin forma, ATP aktyvuoja junginius vykstant j skilimo reakcijoms (gliukoz virsta gliukozs-6-fosfatu) ir ypa biosintezs reakcijoms. Pavyzdiui, aminorgtis, reaguodama su ATP, prisijungia AMP ir sudaro aminoaciladenilat

160

(io darinio pavidalu ir pradedama baltym sintez). Analogikas vaidmuo ir kit trifosfat: GTP dalyvauja baltym, UTP polisacharid biosintezje. Be to, ATP reikalingas, kad susitraukt raumenys bei mediagoms transportuoti per membranas ir kt. Kalcio adenozinmonofosfatas (CaAMP) yra ypatingas lstels metabolizmo ir vairi fiziologini proces reguliatorius, svarbus hormon funkcionavimui, polinukleotid DNR ir RNR funkcijoms lsteli genetins informacijos saugojimui, perdavimui ir realizavimui. Medicinoje ATP natrio arba kalcio druskomis gydomos raumen ir kraujagysli ligos. Nukleoprotein hidroliz Nukleoproteinai yra nukleino rgi nekovalentiniai junginiai su baltymais, pavyzdiui, lsteli branduoliuose DNR fosfatins jonizuotos grups sveikauja su armini baltym histon aminorgi arminmis grupmis. Nukleoprotein daug lstelse, kurios intensyviai dauginasi bei kuriose vyksta aktyvi baltym sintez. Nukleoprotein hidroliz in vitro (mgintuvlyje) atliekama veikiant rgtiniu katalizatoriumi, o in vivo (gyvame organizme) vyksta dl ferment poveikio. Hidrolizs produktai nustatomi pagal bdingas reakcijas. Paraykite reakcijos schem. Darbo eiga 1. Gaballis supresuot mieli (apie 1 g) pirtais sutrupinama ir sumetama ilg mgintuvl arba kolbut. 2. Miels upilamos 20 mL 2 N H2SO4. Mgintuvlis ukemamas kamiu su oro aldytuvu 30 cm ilgio stiklo vamzdeliu ir tvirtinamas stove nuoulniai. aldytuvo anga nukreipiama lang. 3. Mgintuvlio turinys silpnai virinamas, kaitinant mgintuvl per asbesto tinklel apie 1 h (atsargiai!). 4. Ataus hidrolizatas filtruojamas pro popieriaus filtr mgintuvl. 5. Polipeptidai nustatomi pagal biureto reakcij. 5 laus hidrolizato lainama 10 la 2 N NaOH ir 1 laas 0,2 N CuSO4 tirpalas nusidao rausvai violetine spalva. 6. Pentozs nustatomos atliekant Tromerio reakcij. 5 laus hidrolizato lainama 10 la 2 N NaOH ir lainamas 0,5 N CuSO4 tirpalas, kol susidaro neinykstanios Cu(OH)2 nuosdos. Paildius tirpal iki virimo, susidaro geltonos CuOH arba raudonos Cu2O nuosdos. 7. Purino bazs nustatomos pagal susidariusias sidabro druskas. 10 la hidrolizato neutralizuojama 1 lau koncentruoto amoniako ir lainami 5 laai 0,2 N AgNO3. Po 5 min. susidaro negausi rusv nuosd purino sidabro darini (jo imidazolo ciklo NH grups H+ pakeiiamas Ag+). 8. Fosforo rgtis nustatoma pagal molibdenin reakcij. 10 la molibdeno reagento (amonio molibdato tirpalo azoto rgtyje) lainama tiek pat hidrolizato ir virinama kelias minutes (degiklio liepsna). Tirpalas pageltonuoja, o i atauusio isiskiria geltoni kompleksinio junginio kristalai. Reakcijos lygtis tokia: 12(NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21HNO3 (NH4)3PO412MoO3 + 21NH4NO3 + 12H2O. Glikoprotein prostetins grups nustatymas Glikoproteinai yra baltymai, kovalentinmis jungtimis prisijung angliavandenius. Pavyzdiui, seili glikoprotein (mucin) prostetin grup yra oligosacharidai, O-glikozidine jungtimi prisijung prie baltymo OH grupi. mogaus seili mucinuose yra sialo rgties, N-acetilgalaktozamino, galaktozs ir kt. ie angliavandeniai gali bti nustatyti atliekant Molio reakcij (analogika Selivanovo reakcijai). Darbo eiga 1. mgintuvl surenkama 2 mL seili ir lainami 5 laai koncentruotos acto rgties. 2. Susidariusios mucino nuosdos lazdele perkeliamos kit mgintuvl, lainami 2 laai 1 % spiritinio naftolio tirpalo ir sumaioma. 3. Per pakreipto mgintuvlio sienel atsargiai leidiama 1 mL koncentruotos H2SO4. Skysi paviriuje ties riba susidaro violetinis iedas (jei nesusidaro, reikia dar pridti H2SO4). Vietoj naftolio pamus timolio, susidaro raudonas iedas, jei dedama difenilamino mlynas.

161

4. Lipidai
Vieni i svarbiausi jungini, priklausani lipidams, yra riebalai. Jie yra glicerolio ir auktesnij soij ir nesoij karbonini lyginio C atom skaiiaus (C16, C18) rgi esteriai trigliceridai. Glicerolis esterinamas vienodomis arba (daniau) vairiomis rgtimis. Pagal tirpum organiniuose tirpikliuose riebalus panaios esti vairios struktros mediagos. Jos sudaro kitas lipid klases. Lipidams priskiriami biologikai svarbs junginiai, kuriuose yra esterini jungi: fosfatidai (glicerolio dariniai), sfingolipidai (nesoiojo amino alkoholio sfingozino dariniai), steridai (policiklinio nesoiojo alkoholio, turinio ciklopentanoperhidrofenantreno ied, dariniai), vakai (auktesnij alkoholi dariniai). Fosfatidai yra fosfatido rgties ir aminoalkoholi etanolamino, cholino arba serino esteriai. J bazini savybi aminogrup prisijungia proton i fosforo rgties, ir susidaro vidin druska. Nomenklatra ir klasifikacija. Riebalai vadinami pagal juos sudaranias rgtis, pavyzdiui, tristearinas. Jei rgtys nevienodos, nurodoma, kuris glicerolio hidroksilas sudaro ester su ta ar kita rgtimi, pavyzdiui 1,3-dioleoil-2-stearoilglicerolis. Praktikoje jie daniausiai vadinami trivialiais vardais, pavyzdiui, saulgr aliejus, uv taukai. Pagal konsistencij, kuri priklauso nuo soij ir nesoij rgi santykio, riebalai skirstomi kietuosius (juose vyrauja soiosios, stearino ir palmitino rgtys) ir skystuosius (juose daugiau nesoij rgi oleino, linolio, linoleno), vadinamus aliejais. Savybs. Riebal cheminis aktyvumas daugiausia priklauso nuo j sudtyje esani nesoij rgi. 1. Riebal nesotum nusako jodo skaiius, t. y. jodo, prisijungusio prie 100 g riebal, kiekis, g. 2. Riebal molekulin mas apibdina sumuilinimo skaiius. Jis rodo, kiek kalio armo miligram reikia 1 g riebal sumuilinti. 3. Ore kai kurie aliejai (lin ir kt.) sudaro kietas plveles. io proceso metu nesoiosios rgtys polimerinasi ir oksiduojasi. 4. Aliejai ilgainiui apkarsta, nes jie suyra veikiami mikroorganizm ferment: gliceridai hidrolizuojasi, laisvosios nesoiosios rgtys oksiduojasi per vandenilio peroksido stadij iki aldehid, keton, danai nemalonaus kvapo. Dl panaios lsteli membran lipid peroksidins oksidacijos, ypa kai trksta vitamino E, paeidiama membran struktra ir funkcijos. 5. Hidrogenizuojam aliej nesoiosios rgtys virsta soiosiomis, susidaro kietas produktas. 6. Svarbi riebal savyb yra j geba hidrolizuotis. Reikm. Lin ir kiti distantieji aliejai vartojami daams, linoleumui gaminti. Hidrogeninami aliejai sukietja, produkt pridjus pieno, kiauini tryni, vitamin gaunamas margarinas. I riebal gaminami muilai. Riebalai vartojami kosmetikoje. Medicinoje kai kurie vaistai, virkiami po oda, bna itirpinti aliejuose. Biologikai svarbios yra auktesniosios polienins rgtys. Organizmas pasisavina vitaminus A, D, E, K, itirpusius riebaluose. Biologin lipid reikm vairi. Riebalai saugo kn, kad neatalt ir nuo smgi. Jie yra chemins energijos atsargin forma. Fosfatidai sudaro pagrindin lsteli membran dal. Jie reikalingi mediagoms transportuoti per membran. Sfingomielin taip pat yra membranose, j daug nervinio audinio lstelse. Du tredaliai kraujo palzmos cholesterolio yra susijung esterius cholesteridus. Bii vakas yra savita struktrin mediaga. Jame yra palmitino rgties ir miricilo alkoholio esterio. Augal vakai taip pat yra auktesnij rgi ir alkoholi esteriai. Lapus, vaisius vakas saugo nuo idivimo, mikroorganizm ir kt. Jr planktono, kuriuo minta daugelis jros gyventoj, pagrindinis lipidinis komponentas yra vakai. Riebal hidroliz ir susidariusi produkt nustatymas Riebalai, kaip ir visi esteriai, hidrolizuojasi. Esant arm, susidaro glicerolis ir riebij rgi druskos muilai, todl armin hidroliz vadinama muilinimu. Kad susidar muilas, galima nustatyti pagal tirpum vandenyje (riebalai netirpsta) arba i to, kad muilas, sumaindamas paviriaus tempim oro ir vandens slyio paviriuje, sudaro putas.

162

CH2 O CH O

CO CO CO

C17H33 C15H31 C17H31 t + 3 NaOH

CH2 OH CH OH +

C17H33COONa C15H31COONa . C17H31COONa

CH2 O

CH2 OH

Riebal hidroliz Darbo eiga 1. porceliano lktel lainama 20 la aliejaus ir 20 la 40 % NaOH tirpalo. 2. Miinys maiomas stikline lazdele ir 68 min. laikomas verdanio vandens vonioje; galima kaitinti degiklio liepsna per asbestuot tinklel. 3. Vietoj igaravusio vandens retkariais lainama 5 laai naujo. 4. Riebal hidroliz laikoma baigta, kai gelsvas vienalyio skysio laas, o ilgiau pakaitinus baltos mass gaballis, visikai itirpsta vandenyje (1 mL). 5. Suplakus gauto muilo tirpal, susidaro put. Hidrolizuoti galima saulgr arba lengviau reaguojant ricinos aliej. Glicerolio nustatymas riebal hidrolizs produktuose Darbo eiga mgintuvl lainama 5 laai tirpalo, gauto sumuilinus riebalus, 1 laas 0,2 N CuSO4 tirpalo ir suplakama. Susidaro mlynas tirpus vario gliceratas. Laisvj riebij rgi iskyrimas i muilo Stipri neorganin rgtis istumia karbonines rgtis i j drusk:

2 C15H31COONa + H2SO4 natrio palmitatas

2 C15H31COOH + Na2SO4 . palmitino r.

Muilas yra tirpus, o i jo susidariusios laisvosios riebal rgtys netirpios, pagal tai ir sprendiama apie reakcij. Darbo eiga mgintuvl dedamas pagaminto muilo gaballis, lainama 57 laai distiliuoto vandens. Mgintuvlio turinys maiomas ir plakamas, kol itirpsta muilas. lainami 3 laai 2 N H2SO4 tirpalo. Miinys turi bti rgtus tikrinama mlyno lakmuso popierliu. Tuoj pat isiskiria baltos nuosdos laisvosios riebal rgtys. Miin paildius, rgtys susikaupia paviriuje. 5. lainami 5 laai bromo vandens bromo spalva inyksta. Vadinasi, aliejuje yra nesoij riebij rgi. Jas galima nustatyti ne tik laisvsias, bet ir einanias aliejaus sudt. 1. 2. 3. 4.

5. Alkaloidai, terpenai, steroidai


Alkaloidai. Tai grup sudtingos struktros jungini, kuri molekulse yra heterociklai su azoto (N) atomais. Alkaloid pavadinimai daniausiai yra trivials, pavyzdiui, rodo gavimo altin (kokainas i augalo kokamedio lap).

163

Dauguma alkaloid yra kristalins mediagos; kai kurie skysiai, pavyzdiui, nikotinas. Daniausiai jie vandenyje netirpsta, o alkoholyje, chloroforme tirpsta. Alkaloidai su vienomis organinmis rgtimis (vyno, obuoli, citrin, oksalo) sudaro tirpisias druskas i j drusk randama augaluose, o kit rgi (pikrino, tanino) ir alkaloid druskos netirpios. Su neorganinmis rgtimis alkaloidai taip pat sudaro tirpisias (HCl, H2SO4) ir netirpisias (fosfomolibdeno) druskas. Kai kurie alkaloid junginiai yra spalvoti (su HNO3 ir kt.). Dl azotini heterocikl alkaloidams yra bdingos bazins savybs (arab. ai gilj armai). Alkaloid randama tam tikr ri augaluose; juose alkaloidai yra sudar druskas su organinmis rgtimis. Kita bdinga alkaloid savyb yra j stiprus fiziologinis veikimas: daugelis alkaloid labai nuodingi (pvz., keli laai nikotino apie 0,05 g yra mirtina doz mogui). Dauguma alkaloid maomis dozmis vartojami medicinoje (atropinas aki ligoms, chininas maliarijai gydyti, morfinas skausmui malinti, rezerpinas kraujospdiui mainti ir t. t.). Baltymuose yra toki pat heterocikl, kaip ir alkaloiduose, todl tais paiais reagentais galima nusodinti (arba nudayti) i abiej grupi junginius. Terpenai. Tai didel grup gyvajame pasaulyje paplitusi jungini. J bendroji formul (C5H8)n; ia n > 2, t. y. molekulse kartojasi izopreno fragmentas (izoprenoidiniai junginiai). Terpen cikluose arba oninse grandinse yra dvigubj jungi. Vieni j yra alifatins struktros, kiti turi cikl arba yra cikliniai. Izoprenoidams priklauso karotinoidai, steroidai, kauiukas ir kiti gamtiniai junginiai, kurie danai atlieka vitamin (A, E, K), hormon (antinksi ievs kortikosteroidai, lytiniai), antibiotik (nistatinas) funkcijas. Juose izopreno grandys susijungia daniausiai galva uodega padtyje (izopreno taisykl), bet gali bti ir kit jungimosi variant: uodega galva ir uodega uodega. Skvalenas yra tarpinis cholesterolio, i kurio susidaro kiti steroidai, biosintezs produktas. iame procese susidaro ir farnezolio pirofosfatinis esteris. Farnezolis paplits augal eteriniuose aliejuose (liep ied, pakalnui kvapioji mediaga). is terpenas yra kamani feromonas (biologins signalizacijos mediaga), drugeli hormonas. Farnezolio acetatas dl roi kvapo vartojamas parfumerijoje. ia nagrinsime tik tuos ciklinius terpenus, kuri bendroji formul yra C10H16 (monoterpenus). Pagrindins j grups yra: 1) monocikliniai terpenai (turi l cikl ir 2 dvigubsias jungtis), i kuri svarbiausi mentano dariniai, pavyzdiui, limonenas; 2) bicikliniai terpenai (turi 2 ciklus ir l dvigub jungt). Svarbs yra pinano (pvz., pinenas) ir bornano dariniai (pvz., kamparas). Terpen, laisvj arba esteri pavidalo, yra augal eteriniuose aliejuose. Jie danai sudaro i aliej pagrindin dal. iedai, lapai, vaisiai kvepia dl lakij terpen klass ir kit jungini. Terpen pavadinimai danai empiriniai, rodantys gavimo altin arba savyb, i dalies struktr, pavyzdiui, pinenas (lot. pinus puis, priesaga -en- rodo esant dvigubj jungt). Galima juos pavadinti ir pagal tarptautins nomenklatros taisykles, pavyzdiui, mentanas yra 4-izopropil-l-metilcikloheksanas.
Terpen klasifikacija

Tipas Monoterpenai Seskviterpenai Diterpenai Triterpenai Tetraterpenai Politerpenai

Izoprenini fragment skaiius 3 4 6 8 n 3 (10 106) eils

Anglies atom skaiius C10 C15 C20 C30 C40 C5n

Pavyzdys limonenas, mentolis, farnezolis retinolis skvalenas p-karotinas kauiukas

Terpen chemines savybes daniausiai nulemia juose esanios dvigubosios jungtys. Terpentinai vartojami parfumerijoje, maisto pramonje, medicinoje ir kt. Daugelio augal eteriniai aliejai dirgina audinius, kuriuos lieia, todl jais trinama oda (kamparo aliejus, terpentinas ir kt.). Terpentinas gaunamas i spygliuoi sak; tai tirpiklis. Jo pagrindin dalis yra pinenas, i kurio gaunamas kamparas, panaudojamas celiulioidui gaminti (fotografins ir kino juostos, aislai), medicinoje irdies veiklai skatinti. Terpinhidratas padeda atsikosti. Steroidai. Ciklopentano perhidrofenantrenas, arba steranas, yra biologikai svarbi jungini steroid pagrindas. I steroid svarbiausi yra sterinai (steroliai), pavyzdiui cholesterolis, be to, vitaminai D, tulies rgtys, steroidiniai hormonai (antinksi ievs, lytiniai), augal steroidai (ird veikiantys glikozidai ir kt.).

164

Tulies rgtys btinos riebalams virkinti, vitaminai D kalcio ir fosforo apykaitai, antinksi ievs hormonai reguliuoja mediag apykait, lytiniai hormonai susij su specialiomis organizmo funkcijomis, cholesterolis eina biologines membranas, i jo susidaro mintieji junginiai. Cholesterolio apykaitos sutrikimas vienas i aterosklerozs vystymosi veiksni. Tai labai paplitusi liga, pasireikianti patologiniais kraujagysli pokyiais: j elastingumo praradimu, susiaurjimu ir kt. ird veikiantys glikozidai skatina miokardo susitraukimus. Kofeino iskyrimas i arbatoli sublimacijos bdu Kofeinas yra viena i mediag, kurios lengvai sublimuojasi, todl pasinaudojant ia savybe gali bti iskiriamas i miini. Kofeino yra kavos pupelse (iki 1,5 %), arbatoli lapeliuose (iki 3 %). is heterociklinis junginys purino darinys. Jis ekstrahuojamas i arbatoli gamybos atliek arba susintetinamas. Kofeinas skatina centrins nerv sistemos ir irdies veikl. Bdamas panaios struktros kaip nukleino rgi purino bazs kofeinas yra silpnas mutagenas, t. y. sukelia mutacijas nukleino rgi struktros pokyius. Kofeino sublimacijos temperatra tS = 180 C, tlyd = 235 C. Darbo eiga 1. porceliano lktel beriama 0,5 g smulki saus arbatoli. 2. Stiklinio piltuvlio anga ukemama vata ir juo apvoiama lktel. Kad sublimato kristalai nekrist atgal, lktel udengiama filtravimo popieriaus skritulliu, kuriame pradurta keletas skylui. 3. Lktel kaitinama smlio vonioje; smlio temperatra sekama termometru. Vonios nereikia per daug kaitinti, kad nepradt lydytis kofeinas, nes tada labai sumaja mediagos pavirius, ir sublimacija sultja. 4. Isiskyrus vandens garams, i arbatoli pradeda sublimuotis kofeinas: balzganomis ilkinmis adatlmis jis kaupiasi ant piltuvlio sieneli. 5. Nustojama ildyti ir leidiama lktelei atauti. 6. Kofeino kristalai atsargiai nugramdomi nuo piltuvlio sieneli ir itirpinami keliuose mililitruose vandens. 7. kofeino tirpal pylus tanino arba kito alkaloid reagento tirpalo, susidaro nuosdos. Darb galima atlikti ir paprasiau: arbatoli beriama porcelianin tigliuk ir udengiama objektiniu stikleliu. Tiglis kaitinamas per asbestuot tinklel. Alkaloid bendrosios reakcijos (nusodinimas) Alkaloidai paprastai yra isiskiriami netirpi drusk pavidalu. Daniausiai tai atliekama veikiant alkaloid turinius tirpalus kai kuriomis rgtimis (pikrino rgtimi, taninu reaguoja su alkaloidais, turiniais fenolini hidroksil) ir kitais junginiais (gyvsidabrio druskomis, jodo tirpalu kalio jodide). Darbo eiga 1. Mgintuvlyje l laas 1 % chinino druskos su vandenilio chloridu (arba kito alkaloido tirpios druskos tirpalo) praskiediamas 5 laais H2O. 2. Skirtingose objektinio stiklelio vietose ulainami 3 laai tirpalo. 3. alia pirmojo lao, kad susiliest, ulainamas l laas I2 tirpalo KI, alia antro l laas 0,5 % tanino tirpalo, alia treio l laas soiojo pikrino rgties tirpalo. Tose vietose, kur lieiasi laai, susidaro nuosdos. iais bendrais alkaloid reagentais naudojamasi teismo medicinoje, kai tariama apsinuodijus alkaloidais. Norint rodyti, koks yra alkaloidas, reikia atlikti specifines reakcijas, pavyzdiui, chinino drusk tirpalai fluorescuoja.

165

Terpen dvigubj jungi nustatymas Dvigubosios jungtys terpenuose prijungia halogenus. Joms oksiduojantis, susidaro dihidroksiliai alkoholiai:
CH3 Br Br H3C CH3 Br2 + H3C CH3 CH3

CH3 HO HO H3C CH3 [O], H2O H3C

CH3

CH3

Darbo eiga 2 mgintuvlius su KMnO4 ir Br2 tirpalais lainami 12 laai terpentino ir sumaioma tuoj pat pasikeiia tirpal spalva. Terpen oksidavimas oro deguonimi Terpen dvigubj jungt lengvai oksiduoja oro deguonis. Susidaro peroksidai. ie vliau skyla isiskirdami atomin deguon, kuris reaguodamas su oro deguonimi sudaro ozon. Ozono skilimo metu isiskyrs atominis deguonis oksiduoja jodido anijon i KI iki laisvojo jodo I2, kuris aptinkamas pagal bding reakcij su krakmolu:
O O2 C C CH CH O O2 C C O + O3 [O] O2

Terpeno dviguboji jungtis

Terpeno peroksidas

Terpeno oksidas

Ozonas
.

KI + HOH

KOH + HI

2 HI + [O]

H2O + I2

Spygliuoi mik aromatas bna gaivus ne tik dl eterini aliej, bet ir dl ozono. Darbo eiga mgintuvl lainama 2 laai 0,5 % krakmolo kleisterio, l laas 0,5 N KI ir l laas terpentino. Po keleto sekundi laisvasis jodas nudao krakmolo tirpal mlynai. Kai susidars HI oksiduojasi, kalio jodido hidrolizs pusiausvyra pasistumia dein. Terpino dehidratacija Dehidratuojant dihidroksil alkohol terpin koncentruota H2SO4, susidaro nesotusis monohidroksilis alkoholis terpineolis:
CH3 OH CH3 CH3 CH3

H2SO4

IR

IR

H3C OH

CH3

H3C OH

CH3

H3C

CH2

H3C

CH3

166

Priklausomai nuo to, i kur atskyla H2O, susidaro skirtingi izomerai. Dl malonaus kvapo jie vartojami parfumerijoje. Darbo eiga 1. Keletas terpinhidrato kristalli (terpinas kristalizuojasi su viena H2O molekule) metama mgintuvl ir lainami 56 laai H2O. 2. Reakcijos miinys kaitinamas iki virimo. 3. kart tirpal atsargiai lainami 56 laai koncentruotos H2SO4. Koks jauiamas kvapas? Literatra atinskien, R.; Kondratas, D.; Grigalinien, V.; Prakeviius, A. Organins chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Mokslas, 1988. 280 p.

167

Biocheminiai metodai

Laboratoriniai darbai ir pratybos Valdas Stanislovas Laurinaviius ir Bogumila Kurtinaitien

1. Statistinis duomen apdorojimas


ia pateikiamos pagrindins statistiniam eksperimentini duomen apdorojimui reikalingos formuls, terminai ir lentels. Matavim vidurkis (Mean), x :
n xi i =1

x=

(1.1)

x eksperimentiniai duomenys (nuo 1 iki n), n matavim skaiius. Standartinis nuokrypis (Std. Dev), s:

s=

x x |2 , n 1

(1.2)

ia n 1 laisvs laipsni skaiius . Variacijos koeficientas (CV, %):


CV = s 100 %. x

(1.3)

Standartin paklaida (St. err.), S:


S= s n

. (1.4)

Tikroji matuojamojo dydio reikm (X) vertinama taip:

X = x St ,
ia t Stjudento koeficientas, arba t skirstinys. Jis ireikiamas kaip statistikos skirstinys:

(1.5)

t=
ia:

X s/ n

(1.6)

s empirinis standartinis nuokrypis, empirinis vidurkis, populiacijos vidurkis, n imties dydis.

168

Stjudento koeficiento dydis priklauso nuo atlikt matavim skaiiaus ir patikimumo lygio. Koeficient reikms pateiktos 1 lentelje. Eksperimentiniai duomenys yra patikimi, jeigu jie (x) neieina u rib: x = x 2 s (95 % patikimumo intervalas) arba x = x 3 s (99% patikimumo intervalas). Biologiniuose-biocheminiuose eksperimentuose paprastai yra pakankamas 95% (0,05) patikimumo intervalas. Duomen nepatikimum galima nustatyti ir kitu bdu. Jeigu eksperimentini matavim (to paties parametro) yra nedaug (iki 10), galima taikyti kriterijaus Q metod:

Q=
ia:

x1 x 2 R

(1.7)

x1 tartinas duomuo, x2 artimiausias skaitine reikme duomuo, R = xmaks. xmin., t. y. viso duomen masyvo didiausiojo ir maiausiojo duomen skirtumas. Gautas kriterijaus Q reikmes palyginame su 2 lentels reikmmis. Jeigu gautosios kriterijaus Q reikms yra didesns u lentelje pateiktas, galime teigti, kad matavimas yra nepatikimas, ir jo duomenis, skaiiuojant toliau, galima atmesti.
1 lentel. Stjudento koeficient reikms

Patikimumo lygis Laisvs laipsni skaiius 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

0,9

0,95

0,98
Stjudento koeficient reikms

0,99

0,999

6,31 2,92 2,35 2,13 2,02 1,94 1,90 1,86 1,83 1,81 1,80 1,78 1,77 1,76 1,75 1,75 1,74 1,73 1,73 1,73

12,71 4,30 3,18 2,78 2,57 2,45 2,37 2,31 2,26 2,23 2,20 2,18 2,16 2,15 2,13 2,12 2,11 2,10 2,09 2,09

31,82 6,97 4,54 3,75 3,37 3,14 3,00 2,90 2,82 2,76 2,72 2,68 2,65 2,62 2,60 2,58 2,57 2,55 2,54 2,53

63,66 9,93 5,84 4,60 4,03 3,71 3,50 3,36 3,25 3,17 3,11 3,06 3,01 2,98 2,96 2,92 2,90 2,88 2,86 2,85

636,62 31,60 12,94 8,61 6,86 5,96 5,41 5,04 4,78 4,59 4,44 4,32 4,22 4,14 4,07 4,02 3,97 3,92 3,88 3,85

169

2 lentel. Kriterijaus Q reikms

ni 3 4 5 6 7 8 0,9 0,89 0,68 0,56 0,48 0,43 0,40

Patikimumas 0,95 0,94 0,77 0,64 0,56 0,51 0,48

0,99 0,99 0,89 0,76 0,70 0,64 0,58

3 lentel. Kvantili tT reikms

ni 3 5 8 10 15 20 25 0,9 1,41 1,79 2,04 2,15 2,33 2,45 2,54

Patikimumas 0,95 1,41 1,87 2,17 2,29 2,49 2,62 2,72

0,99 1,41 1,96 2,37 2,54 2,8 2,96 3,07

Jeigu matavim daugiau, apie 1020, tada nepatikimiems duomenims nustatyti verta taikyti kvantili metod. tartinos visada bus paios maiausios arba paios didiausios matavim reikms. Tada reikia rasti skirtum tarp didiausiosios arba maiausiosios reikms (xi) ir matavim vidurkio ir t skirtum padalyti i standartinio nuokrypio s:
tT = maks. xi x s

(1.8)

Tada gautas kvantili tT reikmes palyginti su 3 lentelje pateiktomis reikmmis. Jeigu gautosios kvantili reikms didesns, vadinasi, tartinas duomuo yra nepatikimas ir jo, skaiiuojant toliau, galima netaikyti. Koreliacin ir regresin analiz Yra skiriamos tokios regresijos rys: kintamj atvilgiu: paprastoji (ryys tarp dviej kintamj), grupin (ryys tarp keleto kintamj), formos atvilgiu: tiesin; netiesin, arba kreivin. pobdio atvilgiu: teigiama (didjant x didja y), neigiama (didjant x maja y). Regresija vertina statistinio ryio form, o koreliacin analiz to ryio stiprum. Koreliacin analiz padeda vertinti statistinio ryio y = f(xi) stiprum ir kartu atrinkti veiksnius.

170

Paprastoji tiesin regresija Regresinje analizje priklausomasis kintamasis bna tas, kurio kitim norime isiaikinti, o nepriklausomasis kuriuo bandome aikinti priklausomojo pokyius. iame skyrelyje nagrinsime situacij, kai du kintamuosius gali sieti tiesin priklausomyb. Turint surinktus duomenis apie nagrinjamus kintamuosius, prasta i pradi pavaizduoti juos grafikai vadinamojoje sklaidos diagramoje (angl. scatter diagram). i diagrama leidia vizualiai parinkti geriausiai tinkant regresin model. Tik tuo atveju, kai diagramos takai grupuojasi apie ties, turime pagrind taikyti paprastj tiesin regresij. Diagramai sudaryti ir duomenims apdoroti panaudosime vien i Statsoft produkt kompiuterin program SIGMA PLOT. Tarkime, turime eksperimentini duomen, kuriuos suvedame lentel (Data Worksheet). I stulpelyje yra nepriklausomieji duomenys (x), o II stulpelyje matavim rezultatai (y). Reikia itirti statistin priklausomyb tarp j. Pagal iuos duomenis sudarysime grafik taikydami SIGMA PLOT galimybes. I pagrindinio meniu parenkame Graph, Create Graph,2D Cartesian Line/ScatterOK. Paymj priklausomj ir nepriklausomj kintamuosius, gausime norim sklaidos diagram. Kaip gauti toki tiesin funkcij, kuri geriausiai atspindt turimus duomenis? Daniausiai tam taikoma matematin procedra, vadinama maiausij kvadrat metodu. is metodas leidia tarp vis galim tiesi rasti toki, kuri nutolusi nuo eksperimento duomen maiausiai. Maiausij kvadrat metodo pavadinimas atspindi tai, kad minimizuojama atstum tarp tiess ir duomen kvadrat suma. Tiesins regresijos lygties = bo + b1x parametrai (koeficientai bo ir b1 ) parenkami i slygos, kad (yi i)2 turi gyti maiausi galim reikm. J reikms skaiiuojamos pagal formules:
b1 = xy x y x2 x2

, (1.9)

b0 = y b1x.

Naudojant SIGMA PLOT program, tiesins regresijos lygties parametrus galima gauti keletu bd. I pagrindinio meniu reikia pasirinkti Graph, Design Summary ir lange Regressions nurodyti regresins kreivs tip Order 1. Mygtuku View results atidarome lang. Jame randame tiesins regresijos lygties koeficientus bei determinacijos koeficient r2. Paymjus varnele atitinkamus kvadratlius Regressions lange, grafike atsiranda regresin ties. Kitas bdas yra duomen aproksimavimas curve fit programa. Ar gerai regresin kreiv atitinka eksperimentinius duomenis? Vienas i svarbiausi tinkamumo mat yra apibrties koeficientas. Jis ymimas r2 ir ireikiamas santykiu:
KSR r2 = = KSB
n y ( i i =1 n ( yi i =1

y )2 y )2

(1.10)

ia: KSR regresinio nuokrypio kvadrat suma KSB klaid nuokrypio kvadrat suma. 0 r2 1. Aiku, kad kuo r2 yra ariau vieneto, tuo regresin kreiv geriau atitinka eksperimentinius duomenis. Daniausiai taikomas koreliacijos tarp kintamj stiprumo matas vadinamas koreliacijos koeficientu. Jis ymimas raide r ir apibriamas kaip kvadratin aknis i determinacijos koeficiento. Koreliacijos koeficientas gyja reikmes tarp 1 ir 1. Daugelis kreivins regresijos lygi, iek tiek pertvarkius ir elementariai paymjus, gali bti suvestos tiesin regresij. Tada labai nesunkiai randami regresijos ir koreliacijos koeficientai bei verio klaid iraikos.

171

2. Eksperimentini duomen aproksimavimas


Programos SIGMA PLOT galimybs leidia gautus eksperimentinius duomenis aproksimuoti tiesins regresijos lygtimi y = ax + b, gauti regresijos koeficientus a ir b, i koeficient paklaidas ir ivesti patikimumo interval ribas. Programa taip pat leidia automatikai aproksimuoti duomenis laipsnine eilute (iki 10 eils). Pvz., antrosios eils regresija yra duomen aproksimavimas lygtimi y = ax2 + bx + c. Programa pateikia ios lygties koeficientus ir alia eksperimentini tak iveda regresin kreiv. Kartais tyrjas turi savo matematin model, pagal kur nori aproksimuoti eksperimentinius duomenis. Tam naudojama paprogramyje Math esanti programa curve fit. 1 pavyzdys. Turime eksperimentini duomen masyv, kurio I stulpelyje yra nepriklausomieji duomenys (x), o II stulpelyje yra matavim rezultatai (y). Manoma, kad tarp i duomen egzistuoja tiesin priklausomyb. Reikia aproksimuoti eksperimentinius duomenis tiesins regresijos lygtimi y = ax + b ir apskaiiuoti tiess lygties koeficientus bei j paklaidas. Manome, kad koeficient a ir b reikmes galima pradti skaiiuoti nuo 0. Taip pat inome, kad a gali bti tik teigiamasis skaiius. (ios slygos gali bti skirtingos kiekvienam eksperimentui). Komandiniame lauke surenkame: [Parameters] a=0 b=0 [Variables] x = col(1) y = col(2) [Equations] f = a*x + b fit f to y [Constraints] a>0 Programa pateikia tiess lygties y = ax + b parametr a ir b reikmes, j paklaidas ir variacijos koeficientus. 2 pavyzdys. Matavome fermentu katalizuojamos reakcijos greiio priklausomyb nuo substrato koncentracijos. Eksperimentiniai duomenys vedami SIGMA PLOT programos duomen lentel. Stulpelyje I yra substrato koncentracija (mmol/L), o stulpelyje II imatuotas reakcijos greitis (mol/min.). Manome, kad reakcijos greiio priklausomyb nuo substrato koncentracijos gali bti apraoma Michaelio ir Menten lygtimi:

v=
ia:

V S , KM + S

(1.11)

v reakcijos greitis, V maksimalus reakcijos greitis, S substrato koncentracija, KM Michaelio konstanta. Reikia patikrinti, kaip tiksliai eksperimentiniai duomenys atitinka pasirinkt model ir rasti konstant V ir KM reikmes. Tam paprogramje Math pasirenkame program Curve fit. Manome, kad koeficientus reikt pradti skaiiuoti nuo 0 reikms. Skaiiavimams palengvinti apibriame, kad K ir V gali bti tik teigiamieji skaiiai.

172

Substrato koncentracija, mmol/L

Komandiniame lauke surenkame: [Parameters] V=0 K=0 [Variables] x = col(1) y = col(2) [Equations] f = V*x/(K + x) fit f to y [Constraints] K>0 V>0 [Options]

1 pav. Eksperimentini duomen aproksimavimas hiperbols Michaelio ir Menten lygtimi

. Programa pateiks: koeficient V ir K reikmes (Value), koeficient paklaidas (Std Err), variacijos koeficientus (CV, %), priklausomumo koeficientus (Dependencies). Jeigu priklausomumo koeficientai yra artimi vienetui, tai rodo, kad pasirinktame matematiniame modelyje per daug neinomj; teorines y reikmes (Functions), kurias galima nukopijuoti laisv stulpel ir nubrti teorin kreiv per tuos takus. 3 pavyzdys. Turime eksperimentini duomen masyv (2 pav.). Manome, kad ie duomenys gali bti aprayti hiperboline priklausomybe y = a/x. Tam komandiniame lauke surenkame:

Reakcijos greitis, mol/min

Reakcijos greitis, mol/min.

0.8

0.6

Y reikms

[Parameters] a=0 [Variables] x = col(1) y = col(2) [Equations] f = a/x fit f to y [Constraints] [Options]

0.4

0.2

0.0

10

20

30

40

50

nepriklausomas kintamasis X Nepriklausomasis kintamasis X

2 pav. Eksperimentini duomen aproksimavimas atvirktine priklausomybe pagal 3 pavyzd

173

Programa pateiks koeficiento a reikm (Parameter), jo standartin paklaid, variacijos koeficient, teorines y reikmes (Functions) ir j skirtumus nuo eksperimentini y reikmi (Residuals). Galime grafik papildyti nauja kreive, kuri suformuojame pagal t pat x duomen stulpel ir teorines y reikmes. Jeigu matome, kad teoriniai skaiiai blogai aproksimuoja eksperimentinius duomenis, hiperbols model galime daryti sudtingesn, pvz., y = a*x/(b + x), arba y = c + a*x/(b + x). Tada komandiniame langelyje atitinkamai surenkame: [Parameters] arba: [Parameters] a=0 a=0 b=0 b=0 2.0 [Variables] c=0 x =col(1) [Variables] 1.9 y = col(2) x = col(1) [Equations] y = col(2) 1.8 f = a*x/(b+x) [Equations] f=a*x/(b+x)+c*x fit f to y 1.7 [Constraints] fit f to y [Constraints] 1.6 [Options] [Options]
Y reikms
1.5 0 10 20 30 40 50

X reikms

3 pav. Eksperimentini duomen aproksimavimas hiperboline priklausomybe pagal 3 pavyzd

Netiesines priklausomybes galime nesunkiai aprayti lygtimi y = (cx + a)/(b + x), kvadratinmis arba kubinmis lygtimis. Pvz., y = a + bx + cx. Tada komandiniame lauke po urau [Equations] raome: f = a + b*x + c*x^2. Kiekvienas gali susikurti savo model, geriausiai aproksimuojant jo duomenis. Udaviniai Statistiniam apdorojimui pateikiami gliukozs nustatymo kraujo serume duomenys. Svarbu inoti: Gliukoz yra vienas i svarbiausi metabolit; suaugusio sveiko mogaus kraujyje yra 3,6 6,1 mmol/L gliukozs; sergant cukriniu diabetu, gliukozs koncentracija kraujo serume gali sumati iki 2 mmol/L ar dar labiau (hipoglikemija) arba pakilti iki 3035 mmol/l (hiperglikemija); fiziologikai svarbus gliukozs koncentracijos pokytis yra 0,5 mmol/L; fiziologikai pagrstas variacijos koeficientas (CV) 11,2 %; analitinis rekomenduojamas CV 5 %. 1 uduotis Taikant nauj gliukozs nustatymo metod buvo imatuota gliukozs koncentracija viename kraujo serumo pavyzdyje. Gautieji rezultatai (mmol/L): 8,81; 8,52; 8,83; 9,01; 8,21; 8,85; 7,21; 8.33; 8,47; 9,00; 8,27; 8,47; 8,31. apskaiiuokite: matavim vidurk ( x ); standartin nuokryp (s); standartin paklaid (S);

174

raskite nepatikimus matavim rezultatus ir paalinkite juos i duomen masyvo; perskaiiuokite visus aunksiau mintuosius rodiklius; apskaiiuokite 95 % patikimumo interval, kuriame yra tikroji gliukozs koncentracijos kraujo serume reikm (X). 2 uduotis 10 to paties kraujo serumo pavyzdi buvo pridta koncentruoto vandeninio gliukozs tirpalo tiek, kad kiekviename kitame pavyzdyje gliukozs koncentracija bt 1 mmol/L didesn negu ankstesniame. A metodu nustatyta gliukozs koncentracija kiekviename pavyzdyje. Rezultatai pateikti 1 lentelje.
1 lentel

Pridtos gliukozs koncentracija, mmol/L Nustatytoji, mmol/L

1 5,4

2 6,2

3 7,5

4 8,7

5 9,4

6 10,6

7 11,2

10

12,5 13,7 14,7

Nubraiykite dvikoordinat grafik: nustatytosios gliukozs koncentracijos priklausomyb nuo serum pridtos gliukozs koncentracijos. Aproksimuokite eksperimentinius duomenis tiess lygtimi, nustatykite tiess lygties parametrus ir j paklaidas. Apskaiiuokite koreliacijos koeficient. 3 uduotis 13 to paties kraujo serumo pavyzdi pridta koncentruoto gliukozs tirpalo tiek, kad gliukozs koncentracija kiekviename kitame pavyzdyje padidt 2, 4, 6 ir t. t. mmol/L. Tokiuose pavyzdiuose B metodu nustatyta gliukozs koncentracija. Rezultatai pateikti 2 lentelje. 2 lentel Pridtos gliukozs koncentracija, mmol/L Imatuotoji gliukozs koncentracija, mmol/L (x) (y) 2 8,5 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

10,0 13,8 14,1 18,1 18,3 20,1 21,2 23,1 23,2 24,5 24,5 25,0

Nubraiykite dvikoordinat grafik: nustatytosios gliukozs koncentracijos priklausomyb nuo pridtosios gliukozs koncentracijos. vertinkite kreivs tiesin dal. Nubraiykite grafik, naudodami tik tiesin dal patenkanius eksperimentinius takus. Apskaiiuokite tiess lygties koeficientus, j paklaidas ir koreliacijos koeficient. Palyginkite 2 ir 3 uduotyse taikytus metodus tikslumo poiriu. 4 uduotis Pritaikant praktikoje naujj gliukozs nustatymo metod kartu buvo atlikti t pai serumo pavyzdi matavimai naujuoju ir referentiniu metodais. inoma, kad taikant referentin metod: galima gauti tiesin signalo priklausomyb nuo gliukozs koncentracijos serume nuo 2 iki 30 mmol/L; metodo variacijos koeficientas visame tiesinio veikimo diapazone nevirija 5 %. Gautieji rezultatai pateikti 3 lentelje.

175

3 lentel

Metodas Referentinis (x) Naujasis (y) Referentinis (x) Naujasis (y) 2,2 2,6 19,8 20,1 2,7 2,6 4,6 4,4 3,0 3,4 28,0 24,1

gliukozs koncentracija, mmol/L 5,0 5,1 12,5 12,3 2,0 1,8 21,7 20,5 9,0 8,5 6,3 6,5 3,5 3,9 18,5 18,1 12,1 13,1 25,3 22,5 15,9 15,6 3,5 3,4 27,3 23,0 21,2 19,5

Nubraiykite dvikoordinat grafik: x ayje gliukozs koncentracija, nustatyta referentiniu metodu, y ayje gliukozs koncentracija, nustatyta naujuoju metodu. Nubraiykite koreliacin kreiv. vertinkite koreliacins kreivs tiesin dal. Atmeskite takus, kurie ieina u tiesins dalies rib, ir perbraiykite koreliacin kreiv. Apskaiiuokite tiess lygties koeficientus, j paklaidas, koreliacijos koeficient.

5 uduotis Tikrinamai laboratorijai buvo pateikiami kontrolinio serumo pavyzdiai ir buvo praoma nustatyti juose gliukozs koncentracij. Kartu gliukozs koncentracija tuose paiuose pavyzdiuose buvo nustatoma referentinje laboratorijoje. Rezultatai pateikti 4 lentelje. Judeno metodu vertinkite tikrinamos laboratorijos darbo kokyb; Suformuluokite rekomendacijas tikrinamai laboratorijai.
4 lentel

Gliukozs koncentracija, nustatyta referentinje laboratorijoje (x) tikrinamoje laboratorijoje (y) referentinje laboratorijoje (x) tikrinamoje laboratorijoje (y)

5,55 5,7 5,56 5,62

5,4 5,9 5,3 5,6

c, mmol/L 5,37 5,6 5,2 5,6 5,6 5,8 5,5 5,5 5,6 5,7 5,2 5,5 5,7 5,79 5,2 5,8

5,8 5,6 5,6 5,9

5,6 5,3 5,2 5,5

5,2 5,2 5,8 5,3

5,6 5,78 5,54 5,7

+2s +s

-s -2s

-2s

-s

+s

+2s

4 pav.176 Judeno grafikas

3. Fermentini kinetini konstant nustatymas


Pagrindins charakteristikos, nusakanios fermento katalitines savybes, yra: aktyvumas (E), Michaelio konstanta (KM), katalitin konstanta (k). Fermentinis aktyvumas rodo, kokiu greiiu fermentas geba katalizuoti substrato virtim produktu. Fizikine prasme fermentinis aktyvumas yra greitis, kuris daniausiai yra ireikiamas mol susidariusio produkto (arba sunaudoto substrato) per minut (mol/min). Labai mao aktyvumo ferment aktyvumai kartais normuojami ne minutei, o valandai ar net parai. SI sistemoje fermentinio aktyvumo vienetas yra mol/s ir vadinamas kataliu. Taigi praktikoje tokie dideli greiiai pasitaiko itin retai, todl reikt taikyti 108109 eils katali reikmes. Fermento aktyvumui nustatyti parenkamos tokios slygos, kad gautsi maksimalus reakcijos greitis: naudojama didel substrato koncentracija (paprastai 510 kart virijanti KM). Parenkamas tam fermentui optimalus reakcijos terps pH. Temperatra gali bti vairi. Daniausiai parenkama 20 C, 25 C arba 37 C. Fermentinio aktyvumo vienetas yra fermento kiekis, kuris paveria produktu 1 mikromol substrato per minut. Jis vadinamas tarptautiniu vienetu ir daniausiai ymimas raide E arba U. Jo dimensija yra mol/min. Fermentinis aktyvumas normuojamas fermento svorio vienetui, paprastai miligramui arba gramui. Normuotas aktyvumas vadinamas santykiniu arba specifiniu aktyvumu ir ireikiamas mol min1mg1. Pvz., firmos SIGMA parduodama gliukozs oksidaz, iskirta i Aspergillus niger, turi specifin aktyvum 2 00010 000 U/g. Tai reikia, kad 1 mg tokio preparato geba katalizuoti nuo 2 iki 10 mol gliukozs oksidacij per minut. Ne visada pavyksta tiksliai nustatyti fermento koncentracij preparate. Labai danai fermentas bna negrynas. Fermentiniame preparate priemaios (daniausiai kiti baltymai arba neorganins druskos) sudaro ymi dal (iki 90 %) preparato svorio. Tokiu atveju fermentinis aktyvumas normuojamas preparato svorio vienetui, daniausiai miligramui, taiau pasitaiko aktyvumo normavimo gramui ir net kilogramui. Kartais, kai parduodamas fermento tirpalas, fermentinis aktyvumas normuojamas trio vienetams mililitrui (mL) preparato, decilitrui (dL) ar litrui (L). Klinikinje biochemijoje kraujyje esani ferment aktyvumas normuojamas litrui, decilitrui arba mililitrui kraujo. Bendra baltym koncentracija tirpaluose yra apytiksliai nustatoma spektrofotometrikai, kai viesos bangos ilgis 280 nm. Todl kartais fermentinis aktyvumas normuojamas baltym mass vienetui. Pvz., firmos SIGMA parduodamas fermentas katalaz (iskirtas i jauio kepen) yra suspenduotas 3,2 M amonio sulfato tirpale. Fermento aktyvumas 10 00030 000 U/mg baltym. Tai reikia, kad 1 mg baltym, esani ioje suspensijoje, geba katalizuoti 1030 milimoli vandenilio peroksido skilim iki vandens ir deguonies, taiau tai dar nereikia, kad visas preparate esantis baltymas yra katalaz. Fermentinis aktyvumas, normuotas normalinei fermento koncentracijai, vadinamas fermento katalitine konstanta (k). Dauguma ferment turi po vien aktyvj centr, todl j normalin koncentracija yra lygi molinei koncentracijai. Fermento katalitin konstanta paprastai normuojama sekundei, o suvartoto substrato (ar susidariusio produkto) kiekis ireikiamas moliais.
k= Vmaks . , [E ]

ia:
Vmaks. maksimalusis reakcijos greitis (mol/s), [E] aktyvaus fermento kiekis reakcijos miinyje, (mol).

Fermento katalitin konstanta rodo, kiek substrato molekuli viena fermento molekul geba paversti produktu per sekund. Katalitin konstanta dar vadinama fermento apsuk skaiiumi ir nusako fermento kaip katalizatoriaus efektyvum. Ferment katalitin konstanta k svyruoja nuo 102 iki 105 s1. Michaelio konstanta (KM) nusako substrato giminingum fermentui. Eksperimentikai Michaelio konstanta nustatoma matuojant fermentins reakcijos greit esant skirtingoms substrato koncentracijoms. Michaelio konstanta skaiiuojama i Michaelio ir Menten lygties:
V [S ] , v = maks . [S ] + K M

177

ia: v fermentins reakcijos greitis, [S] substrato koncentracija, KM Michaelio konstanta. KM verts gali bti nuo 102 mol/L iki 107 mol/L.

Udaviniai
Darbo tikslas Naudojantis atlikto eksperimento duomenimis imokti apskaiiuoti reakcijoje dalyvaujani mediag koncentracij, fermentins reakcijos greit ir fermento kinetines konstantas. Paprastai apskaiiuotus ir kompiuteriu gautus rezultatus vertinti tikslumo poiriu. Tyrimo objektas Fermentas alkoholdehidrogenaz (ADH) iskirtas i mieli. Alkoholdehidrogenaz katalizuoja alifatini alkoholi (metanolio, etanolio, blogiau propanolio) oksidacij. Oksidatorius NAD+ molekul: Etanolis Acetaldehidas

Alkoholdehidrogenaz CH3-CH2-OH NAD+


Matavimo priemons

O CH3-C H

NADH

Spektrofotometras UV-VIS su saviraiu. Esant 340 nm bangos ilgiui nustatomas NADH susidarymo greitis. Eksperimento apraymas Mieli homogenizatas buvo frakcionuojamas. Surinkta frakcija, turinti ADH aktyvum. Chromatografiniais metodais parodyta, kad i frakcij sudaro homogenikas baltymas, kurio molekulin mas 141 000 Da. Fotometriniu metodu (esant 280 nm bangos ilgiui) nustatyta baltymo koncentracija frakcijoje 12 mg/mL. Manoma, kad tai ADH. Paruoiami darbui reikalingi tirpalai: 0,1 mol/L fosfatinis buferis, pH = 7,0; NADH tirpalas matavimo sistemai graduoti. Tam 91,37 mg NADH (M = 709,4 g/mol) itirpinama 1 mL buferio; 1 mol/L NAD+ tirpalas buferyje; 0,5 mol/L etilo alkoholio tirpalas buferyje (substratas). Prie nustatant fermento aktyvum reikia sugraduoti matavimo sistem. Tam fotometro kiuvet pilama 1,8 mL buferinio tirpalo ir ufiksuojama saviraio plunksnos padtis (0). Tada fotometro kiuvet pilama 0,2 mL NADH tirpalo ir ufiksuojama nauja saviraio plunksnos padtis. ADH aktyvumas matuotas taip: fotometro kiuvet supilama: 1 290 L buferio; 500 L alkoholio tirpalo; 200 L NAD+ tirpalo. jungiamas saviratis ir ufiksuojama pradin plunksnos padtis. sitikinama, kad plunksnos poslinkio laikui bgant nra (nra joki paalini reakcij, kurios keist viesos sugert kiuvetje).

178

Tada kiuvet pilama 10 L fermento ir tirpalas greitai imaiomas. Registruojamas sugerties didjimas fotometro kiuvetje (24 min.). Kalibravimo ir aktyvumo matavimo vaizdas pateiktas 1 paveiksle.

1 pav. ADH aktyvumo nustatymo vaizdas diagraminiame popieriuje ir saviraio juostos gradavimas

1 uduotis ADH aktyvumo nustatymas. Darbo eiga Apskaiiuokite saviraio padalos (1 mm) vert mol NADH (naudodamiesi 1 pav. vaizdu). Apskaiiuokite NAD ir substrato koncentracijas fotometro kiuvetje. Apskaiiuokite fermentins reakcijos greit fotometro kiuvetje (naudodamiesi 1 pav. vaizdu) Apskaiiuokite fermento aktyvum tarptautiniais vienetais (mol/min.) ir kataliais (mol/s) Apskaiiuokite ADH katalitin konstant. Apskaiiuokite fermento santykin aktyvum tarptautiniais vienetais (mol min.1mg1).

2 uduotis ADH Michaelio konstantos nustatymas. ADH aktyvumas buvo imatuotas esant skirtingoms substrato koncentracijoms. Tam fotometro kiuvet buvo pilti skirtingi substrato kiekiai. Reakcijos miinio kiuvetje tris visais atvejais buvo vienodas 2 mL. Reagent triai pateikti 1 lentelje:

179

1 lentel

Buferio tris, 1775 1770 1765 1760 1750 1740 1730 1720 1700 1680 1660 1630 1580 L NAD+ tirpalo 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 tris, L Fermento 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 tris, L Substrato 5 10 15 20 30 40 50 60 80 100 120 150 200 tris, l Substrato koncentracija, mmol/L Reakcijos greitis, mol/min. Darbo eiga Upildykite 1 lentel: Apskaiiuokite substrato koncentracij kiekviename eksperimente; Apskaiiuokite kiekviename eksperimente fermentins reakcijos greit (mol/min) (naudojantis 3.2 pav. vaizdu);

2 pav. Fermentins reakcijos greiiai, matuoti esant skirtingoms etanolio koncentracijoms reakcijos miinyje. Vaizdas diagraminiame popieriuje. Skaiiais nurodyta, koks bazinio etanolio tirpalo tris piltas 2 mL reakcijos miin kiuvetje

180

Ant milimetrinio popieriaus nubraiykite fermentins reakcijos greiio priklausomybs nuo substrato koncentracijos grafik; Lineweaver ir Burk metodu apskaiiuokite alkoholdehidrogenazs KM pagal ia pateikt pavyzd.

0.6

0.5

1/reakcijos greitis

0.4

0.3

0.2

-1/KM 0.1

1/Vmaks

0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1/substrato koncentracija

3 pav. Lineweaver ir Burk grafikas

Tam Michaelio ir Menten lygtis yra invertuojama:

KM 1 1 . = + v Vmaks. Vmaks. S
Koordinatse 1/v 1/S turtume gauti ties. 3 uduotis Taikydami SIGM PLOT program aproksimuokite eksperimentinius duomenis Michaelio ir Menten lygtimi ir apskaiiuokite: ADH Michaelio konstant, jos standartin paklaid (s) ir variacijos koeficient (CV); Maksimal reakcijos greit (Vmaks.), jo standartin paklaid (s) ir variacijos koeficient (CV). Koreliacijos koeficient. 4 uduotis Taikydami SIGMA PLOT program bei Lineweaver ir Burk metod apskaiiuokite: ADH Michaelio konstant, maksimal reakcijos greit (Vmaks.).

181

5 uduotis Tas paias konstantas galime gauti Eadie ir Hofstee metodu. Tam invertuot Michaelio ir Menten lygt dauginame i v:
1= v Vmaks . + Vmaks .S KM

ir pertvarkome:
v = Vmaks. K M V . S

Koordinatse v nuo v/S turtume gauti tiesin priklausomyb (4 pav.). Regresins tiess koeficientai atitinka Vmaks. ir KM.

45 40 35 30 25 v 20 15 10 5 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 v/S 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 nuolinkis = -KM Vmaks

4 pav. Eadie ir Hofstee koordinats

Apskaiiuokite ADH Michaelio konstant, jos standartin paklaid (s) ir variacijos koeficient (CV); Maksimal reakcijos greit (Vmaks.), jo standartin paklaid (s) ir variacijos koeficient (CV). 6 uduotis Apskaiiuokite KM ir Vmaks. Hans metodu. Tam invertuot Michaelio ir Menten lygt dauginame i s:
K S S = + M . v Vmaks . Vmaks .

182

Atidj duomenis koordinatse S nuo S/v taip pat turtume gauti tiesin priklausomyb. Atlik duomen aproksimavim tiess lygtimi, apskaiiuokite: ADH Michaelio konstant; maksimal reakcijos greit (Vmaks.). Palyginkite tarpusavyje visais metodais apskaiiuot KM konstantos reikm.

-KM

S/v 2 1 nuolinkis = 1/Vmaks 0 -20 -10 0 10 20 30 40 50 S 60

5 pav. Hans koordinats

4. Analitini sistem metrologinis vertinimas


Darbo tikslas Imokti atlikti biochemins analitins sistemos metrologin patikr. Darbo priemons Gliukozs analizatorius EKSAN-G; 0,01 mol/L fosfatinis buferis pH 7,2 7,4 su 0,1 mol/L KCl ir 1 mmol/L EDTA; 0,1 mol/L buferinis gliukozs tirpalas (bazinis tirpalas); kraujo serumas, arba kontrolinis serumas; mgintuvliai; 10 mL ir 1 mL talpos graduotos pipets; pipetinis dozatorius su keiiamu triu (nuo 20 iki 200 L).

183

Analitins sistemos apraymas Darbui naudojamas gliukozs analizatorius Eksan-G. Analizatoriaus schema yra pateikta 1 pav.

1 pav. Gliukozs analizatoriaus Eksan-G principin veikimo schema. 1 elektrochemin gardel, kurios tris 1 mL; 2 poliarografinis H2O2 elektrodas; 3 dviej kanal peristaltinis siurblys; 4 atliek surinkimo indas; 5 magnetinis maiiklis; 6 pagalbinis titaninis elektrodas; 7 fermentin membrana

Gliukozs analizatoriaus veikimo principas. Peristaltiniu siurbliu (1 pav.) elektrochemin gardel praplaunama buferiniu tirpalu. Siurbliui sustojus, gardel lieka pripildyta buferinio tirpalo. Jos tris vis laik ilieka pastovus (1 mL). gardel pilama 50 L tiriamo tirpalo, 20 kart praskiediama ir magnetine maiykle imaioma. Terpje esanti gliukoz ir kitos maos molekuls difunduoja fermentins membranos vid. Geliniame membranos sluoksnyje imobilizuota gliukozooksidaz katalizuoja toki reakcij: -D-gliukoz + O2 + H2O Gliukono laktonas + H2O2 kurio paviriuje vyksta

Susidarantis vandenilio peroksidas difunduoja prie platinos elektrodo, elektrocheminis vandenilio peroksido oksidavimas: H2O2 O2 + 2H+ + 2e-

Platinos elektrodo anodinio signalo dydis tiesiog proporcingas gliukozs koncentracijai tiriamame pavyzdyje. Gliukozs analizatorius Eksan-G turi bti i anksto, bent prie valand, paruotas darbui, t. y. ant elektrodo udta fermentin membrana, gardel pripildyta buferinio tirpalo ir analizatorius sugraduotas. Darbo eiga 1 uduotis Reagent paruoimas Buferin tirpal galima ruoti patiems arba sigyti jo sauso pakuotse. 1 pakel reikia itirpinti 1 litre distiliuoto vandens. Paruoto buferio vartojimo trukm 1 savait. Gliukozs bazinis tirpalas ruoiamas

184

bent prie par iki eksperimento pradios. io laiko reikia, kad nusistovt gliukozs ir anomerini form pusiausvyra tirpale. Bazinis gliukozs tirpalas ruoiamas pagal toki metodik. Gliukoz idiovinama diovinimo krosnyje 105 C temperatroje iki pastovaus svorio. 1,8016 g idiovintos gliukozs supilama 100 mL matavimo kolbut, upilama 5060 mL buferinio tirpalo ir itirpinama kambario temperatroje. Kai visa gliukoz itirpsta, kolbut iki yms pripilama buferinio tirpalo. Paruotas bazinis gliukozs tirpalas laikomas aldytuve gerai ukimtas ne ilgiau kaip mnes. Jei gliukozs tirpalas laikomas nevariuose induose arba naudojamasi nevariomis pipetmis, tirpal gali patekti mikroorganizm, dl j veiklos atsiranda drumzli ir keiiasi gliukozs koncentracija. Toks gliukozs tirpalas tolesniam darbui netinka. Laboratoriniams darbams tinka ir mogaus, ir galvij kontrolinis kraujo serumas. Galima naudoti kitus kontrolinius serumus. Laboratoriniam darbui atlikti reikia 7 mL serumo. I bazinio gliukozs tirpalo paruokite 2, 5, 10, 15, 20, 25 ir 30 mmol/L gliukozs tirpalus. Apskaiiuokite, kok tr bazinio gliukozs tirpalo ir buferio reikia paimti, kad gautumte po 10 mL reikiamos koncentracijos gliukozs tirpal. 1 ir 10 mL pipetmis paruokite tirpalus 1215 mL talpos mgintuvliuose ir gerai juos imaiykite. Tirpalai tinka vartoti 1 dien. I serumo ir bazinio gliukozs tirpalo paruokite serumo pavyzdius su didjania gliukozs koncentracija juose. Apskaiiuokite, kiek bazinio gliukozs tirpalo ir buferio reiks pridti prie 0,9 mL serumo, kad galima bt gauti 1 mL serumo pavyzdius su didjania (2; 4; 6; 8; 10 mmol/L) gliukozs koncentracija. Ruodami tirpalus naudokite reguliuojamo trio pipetin dozatori. Paruoti tirpalai tinka vartoti 1 dien. 2 uduotis Analizs tikslumas. Vandeninio gliukozs tirpalo analiz. Statistinis duomen apdorojimas. Gliukozs analizatoriumi atlikite 10 mmol/L gliukozs tirpalo 10 matavim. Apskaiiuokite: matavim vidurk ( x ); standartin nuokryp (s); matavim variacijos koeficient (CV, %); standartin paklaid (S); imatuoto gliukozs tirpalo koncentracij (X) ir patikimumo lygio (0,95) ribas ( X = x St ). 3 uduotis Analizs teisingumas. Serijos gliukozs tirpal analiz. Grafinis duomen apdorojimas, paklaid skaiiavimas. Po tris kartus imatuokite gliukozs koncentracijas visuose paruotuose (2, 5, 10, 15, 20, 25 ir 30 mmol/L) buferiniuose gliukozs tirpaluose. Nubraiykite grafik, gautus rezultatus atidj koordinatse gliukozs analizatoriaus rodmen priklausomyb nuo gliukozs koncentracijos. Aproksimuokite duomenis tiess lygtimi. Apskaiiuokite: pirmojo laipsnio regresijos lygties koeficientus; koeficient standartin paklaid (S) ir patikimumo lygio ribas (0,95); koreliacijos koeficient r. Pagrskite ivad apie analizs teisingum. 4 uduotis Gliukozs nustatymas kraujo serume pried metodu. Imatuokite po tris kartus vis 6 paruot serumo pavyzdi gliukozs koncentracijas. Gautus rezultatus atidkite koordinatse: gliukozs analizatoriaus rodmen priklausomyb nuo pridtos gliukozs koncentracijos.

185

Aproksimuokite duomenis tess lygtimi. Apskaiiuokite: pirmojo laipsnio regresijos lygties koeficientus; koeficient standartin paklaid (s) ir patikimumo lygio ribas (0,95); koreliacijos koeficient; nustatykite gliukozs koncentracij kraujo serume.

5 uduotis Gliukozs analizatoriaus gradavimo tiess rib nustatymas. Nustatykite gliukozs analizatoriaus gradavimo tiess ribas. Tam: paruokite 10; 20; 30; 40; 50; 80; 100 mmol/L gliukozs tirpalus, skiesdami bazin (100 mmol/L) tirpal buferiu; atlikite po tris kiekvieno gliukozs tirpalo matavimus; gautus rezultatus atidkite koordinatse: analizatoriaus rodmen priklausomyb nuo gliukozs koncentracijos; vertinkite gradavimo kreivs tiesin dal, t. y. suraskite gliukozs koncentracij interval, kuriame analiz atliekama tiksliai ir teisingai. 6 uduotis Gliukozs analizatoriaus gradavimo kreivs apatins ribos nustatymas. Nustatykite gliukozs analizatoriaus gradavimo kreivs apatin rib. Tam: paruokite 2; 1,5; 1,0; 0,5; 0,2, 0,1 mmol/L gliukozs tirpalus; atlikite po penkis gliukozs matavimus kiekviename tirpale; apskaiiuokite variacijos koeficient kiekvienai matavim serijai, atliktai naudojant vienos koncentracijos tirpal; gautus rezultatus atidkite koordinatse: variacijos koeficiento priklausomyb nuo gliukozs koncentracijos tirpale; raskite gliukozs koncentracij, kuriai esant CV < 5 %. Egzistuoja ir kitas apatins matavimo ribos nustatymo bdas. Atlikite 10 buferinio tirpalo matavim; apskaiiuokite tuiojo matavimo standartin paklaid (s). Vidurkinis tuiojo matavimo signalas + 2s yra apatin matavimo riba. Palyginkite iuos du matavimo prietaiso apatins matavimo ribos nustatymo metodus.

186

5. Ferment inhibicijos tyrimas


1 uduotis E. coli biosintezs metu susidaro metioninas fermentinio homocisteino 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato metilinimo produktas. Buvo atliktas eksperimentas, kurio metu matuota susidariusio metionino kiekio priklausomyb nuo substrato koncentracijos esant inhibitoriui ir be jo. Gauti tokie rezultatai (1 lentel): Darbo eiga nubraiykite produkto kiekio priklausomybs nuo substrato koncentracijos grafikus (tiesioginse ir atvirktinse koordinatse) pagal 1 lentels duomenis, nustatykite inhibicijos tip, apskaiiuokite inhibicijos konstantos Ki reikm.

1 lentel

Substrato koncentracija, (mol/L) pridjus 30 mol/L inhibitoriaus 143 172 218 286 455

Susidariusio metionino kiekis, (nmol) be inhibitoriaus 500 526 555 589 714

10 12,5 16,7 25 50

2 uduotis Salicilatas inhibuoja glutamato dehidrogenazs veikim. Pagal 2 lentels duomenis grafiniu analizs metodu nustatykite inhibicijos tip, nustatykite fermento KM ir inhibicijos konstantos Ki reikm.

2 lentel

Substrato koncentracija, mmol/L 1,5 2 3 4 8 16 3 uduotis

Reakcijos produkto susidarymo greitis, mg/min 0,21 0,25 0,28 0,33 0,44 0,435

Reakcijos produkto susidarymo greitis, mg/min, esant 40 mmol/L salicilato 0,08 0,10 0,12 0,13 0,16 0,18

Gliukozs oksidazs inhibicijos tyrimas. Inhibicijos tipo nustatymas Darbo priemons: EKSAN-G ekspresanalizatorius su saviraiu, gliukozs oksidaz; tirpalas buferyje, 2 mg/mL, 0,01 mol/L fosfatinis buferis (pH 7,27,4 su 0,1 mol/L KCl ir 1 mmol/L EDTA),

187

3 % vandenilio peroksido tirpalas, 100 mmol/L D-gliukozs tirpalas tame paiame buferyje (bazinis tirpalas), 1 mol/L D-gliukozs tirpalas, 1 mol/L inhibitoriaus D-gliukalio tirpalas, 1015 mL talpos mgintuvliai, 10 mL ir 1 mL talpos graduotos pipets, 50 L talpos pipetinis dozatorius, 220 L talpos pipetinis dozatorius. Darbo eiga Darbo priemoni paruoimas Gliukozs oksidazs tirpalas (2 mg/mL) ruoiamas eksperimento atlikimo dien. Vandenilio peroksido tirpal paruokite taip: 3 % H2O2 tirpal (i vaistins) praskieskite 1000 kart vandeniu 100 mL matavimo kolboje. Gauto tirpalo koncentracij patikrinkite spektrofotometru (sugerties koeficientas 240 = 39,4 Lmol1cm1 ). Analizatorius turi bti paruotas darbui, prijungtas prie saviraio. I elektrochemins gardels paalinama fermentin membrana. Rekomenduojamas saviraio popieriaus juostos slinkimo greitis 1 cm/min. Elektrochemins gardels kalibravimas. Gardel pripildoma buferinio tirpalo (gardels tris 1 mL), jungiamas saviratis ir uregistruojamas bazinio signalo dydis (srovs stipris, kai gardelje nra analits). gardel pilama 50 L nustatytos koncentracijos vandenilio peroksido tirpalo ir registruojamas stacionariojo signalo dydis. Peroksido pilama keleta kart. Po kalibravimo gardel kruopiai plaunama. Liniuote imatuojami signal pokyiai saviraio juostoje, atsirad pylus vandenilio peroksid. Apskaiiuokite keli signal vidurk (mm). Apskaiiuokite saviraio skals padalos vert (mol H2O2/mm). Fermentins reakcijos greiio matavimas. analizatoriaus 1 mL gardel pilama 50 L 1 mol/L gliukozs tirpalo. Registruojamas elektrodo signalo dydis. Nestabdant saviraio ir nusistovjus stacionariam signalui gardel pilama 20 L fermento (gliukozs oksidazs) tirpalo. Reakcijos metu susidaro vandenilio peroksidas. Jo koncentracijos didjim atspindi elektrodo registruojamos anodins srovs didjimas. Jis uraomas saviraio juostoje. dedamo fermento kiek ir juostos slinkimo greit galima kaitalioti, parenkant tokius, kad kreiv su laiko aimi sudaryt madaug 45o kamp. raas atliekamas ne ilgiau kaip 5 min. Tada gardel plaunama. Per kreivs stacionariosios fazs dal ivedama liestin. Apskaiiuokite fermento koncentracij gardelje. Apskaiiuokite reakcijos greit v, ireikdami j per 1 minut susidariusio vandenilio peroksido kiekiu (mol/min). Gliukozs oksidazs inhibicijos tyrimas Paruokite gliukozs tirpalus i bazinio tirpalo (100 mmol/L) taip, kaip nurodyta 3 lentelje.
3 lentel

Mgintuvlio Nr. Gliukozs koncentracija, mmol/L Bazinio gliukozs tirpalo tris, mL Buferio tris, mL

1 2

2 4

3 8

4 12

5 20

6 30

7 40

8 100

0,2 9,8

0,4 9,6

0,8 9,2

1,2 8,8

2,0 8,0

3,0 7,0

4,0 6,0

10 0

188

pilant i tirpal 1 mL gardel po 50 L, gardelje bus: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,0; 1,5; 2,0 ir 5,0 mmol/L gliukozs. pilkite analizatoriaus gardel 50 L 100 mmol/L gliukozs tirpalo ir saviraiu uregistruokite srovs stipr. Nusistovjus pastoviam signalui, gardel pilkite 20 L gliukozs oksidazs tirpalo. Reakcijos greit fiksuokite 35 min. Iplaukite gardel. Su visais paruotais gliukozs tirpalais i eils imatuokite reakcijos greit, naudodami visuose eksperimentuose vienod to paties fermento tirpalo tr. Apskaiiuotus reakcijos greiius suraykite 4 lentel ir nubraiykite greiio priklausomybs nuo gliukozs koncentracijos grafikus tiesioginse ir atvirktinse koordinatse. Apskaiiuokite fermento KM.
4 lentel

Gliukozs koncentracija, mmol/L Reakcijos greitis, mol/min. Reakcijos greitis, pridjus inhibitoriaus, mol/min.

0,1

0,2

0,4

0,6

1,0

1,5

2,0

5,0

Eksperiment serij pakartokite, naudodami tuos paius gliukozs tirpalus (koncentracija gardelje nuo 0,1 iki 5 mmol/L), tik priddami kiekvien mgin po 0,05 mL inhibitoriaus D-gliukalio 1 mol/l tirpalo. Apskaiiuokite inhibitoriaus koncentracij reakcijos miinyje. Apskaiiuokite reakcijos greii reikmes, gautas pridjus inhibitoriaus, raykite lentel 5.4. anksiau nubraiytus grafikus raykite reakcijos greii reikmes, gautas pridjus inhibitoriaus. Nustatykite gliukozs oksidazs inhibicijos D-gliukaliu tip. Apskaiiuokite inhibicijos konstant Ki.

189

Modeliai biologijoje
Pratybos Alfonsas Juka

1. Funkcij skaiiavimas ir grafinis vaizdavimas. Tiesins ir pusiau logaritmins koordinats


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir atvaizduoti funkcijas grafikais:
1 ) f1 = 2 t , 2 ) f 2 = e t , 3 ) f 3 = et / , 4 ) f 4 = e t , = , 5 ) f 5 = 1 e t , 6 ) x = e t , f 6 = x .

Darbo eiga Pratyb lape (Pratybos.xls) pasirinkite langelius (eilut) modeli (funkcij) parametrams (patartina 8 eilut, virutin lapo dal paliekant laisv), taip pat lauk lentelms (patartina nuo 10 eiluts). Nepriklausomo kintamojo ir parametr reikms gali bti (beveik) bet kokios; pradiai patartina rayti tokias, kokios yra Excel pavyzdi 8 lape. (9 eilut patartina palikti ymenims: t, f1, f2) 9 Sudarykite nepriklausomo kintamojo (t) reikmi stulpel: A10 10 0 langelyje raykite 0, A11 1 (ar kok kit skaii >0), tada iuos 11 1 + langelius paymkite, uvesdami pels rodykl ant A10, nuspausdami 12 pels klavi ir, jo neatleid, pervesdami rodykl A11, kaip parodyta 13 emyn! paveiksllyje; r. taip pat Excel Help, Selecting Cells, paskui kiek pratskite emyn paymtj stulpel, uvesdami pels rodykl ant deiniojo apatinio paymt langeli kampo [juodo kvadratlio; pels rodykl iuo atveju turi pavirsti + (pliuso enklu)] ) ir tempdami pels rodykl emyn kaip parodyta paveiksllyje. Excel upildo stulpelio langelius pagal du pirmuosius (iuo atveju pagal aritmetin progresij). Jei susidar ~ 1520 Js kintamojo reikmi stulpelis, galima baigti, jei ne, tsti. (Tsti galima ir vliau, ir ne tik 1, bet kelis stulpelius i karto.) a. Ireikkite pateikt funkcij langeli, kuriuose (yra ar bus) raytos kintamojo, parametr ir funkcijos reikms, adresais. Tegu funkcijos reikmi lentel bus B stulpelis, nepriklausomo kintamojo (t) stulpelis yra A, o parametras te bus B8 langelyje. Uveskite pels rodykl ant B10 langelio (j Excel payms rmeliu), paskui rodykl uveskite ant = (lygybs enklo) formuli juostoje Formula bar spustelkite pels klavi, po = enklo raykite pateikt formul atitinkam langeli adresais, t. y. 2^(B8*A10); uveskite rodykl ant formuli juostoje ir spustelkite klavi. B10 langelyje ikart pasirodys skaiiavimo rezultatas. Nukopijuokite io langelio turin ir terpkite j kaip formul (Paste special, Formulas) kuriame nors kitame io stulpelio langelyle (pvz., B13). ). Atkreipkite dmes tai, kad B13 langelio turinys netapatus (lygties prasme) B10 langelio turiniui: =2^(B10*A13). Pakito ne tik nepriklausomojo kintamojo adresas (kaip ir turjo bti), bet ir parametro adresas (kuris turjo likti tas pat). Kad to neatsitikt, B10 langelyje formul reikia patikslinti tarp parametro langelio koordinai (raids ir skaiiaus) terpti $ (dolerio simbol): 2^(B$8*A10). Patais formul, pakartokite kopijavimo ir terpimo veiksmus ir sitikinkite, kad skaiiuojama teisingai. Sudarykite funkcijos reikmi stulpel tokiu pat bdu, kaip ir nepriklausomojo stulpel, t. y. tsdami u deiniojo kampo stulpel emyn.
1 1

190

1.

2.

3.

4.

5.

Pastabos: jei kairje nuo sudaromojo stulpelio jau yra reikiamo ilgio stulpelis, naujj galima sudaryti paprasiau: uvesti pels rodykl ant langelio, nuo kurio norima tsti, apatinio deiniojo kampo, kad rodykl pavirst +, tuomet dukart spustelti pels klavi; raydami formules, galite nepaisyti didij ar maj raidi: 2^(B$8*A10) ir 2^(b$8*A10) Excel supranta vienodai; formules nebtina rinkti po simbol. Po = formuli juostoje reikiam adres galima (ir patartina) nurodyti, atvedus pels rodykl atitinkam langel ir spusteljus klavi; taip galima surinkti vis formul, vliau beliks tik sudlioti, kur reikia, $. b. Paymkite (Select) k tik sudaryt lentel (upildytus stulpelius, pradedant nuo 9 eiluts). mygtuko (Chart Wizard), spustelkite pels klavi, paskui Uveskite pels rodykl ant spustelkite (XY (Scatter)), tada lautin linij (Chart sub-type). Ikart bus pavaizduotas modeliujamosios funkcijos grafikas. Pertempkite pele paveiksl, sum j u balto lauko (Chart Area) pakraio ir neatleisdami pels klavio, pasirinkt viet, udengdami nereikaling lentels dal, perstumkite paaikinim (Legend) laisv paveikslo srit (Plot Area), iplskite i srit per vis paveiksl (Chart Area), pakeiskite paveikslo dyd, pakeiskite skaiius pagal koordinai ais sveikaisiais ar su tam tikru deimtaini enkl skaiiumi (dukart spustelkite klaviu atved rodykl ant aies Format axis/Number/Decimal places). a ir b. Tokiu pat bdu sudarykite f2 funkcijos reikmi stulpel (nuo C10), parametrui paskirdami A8 langel. Paymkite (Select) vis paveiksl, uvesdami ant jo balto lauko (Chart Area) pels rodykl ir spusteldami klavi: pagrindinje menu juostelje vietoje Data atsiras Chart. Spustelkite Chart, paskui Add Data. Atsiradusiame langelyje galima rayti duomen adresus (diapazon), t. y. nuo C9 iki Cn langelio. Galima padaryti ir paprasiau: uveskite rodykl ant C9 langelio ir, neatleisdami klavio, tempkite emyn, kol bus aprptas reikalingas diapazonas (jei stulpelio pradi ar pabaig dengia Add Data dialogo paveiksliukas, nutempkite j alin, kad netrukdyt). Atleiskite klavi ir spustelkite OK. Paymkite k tik atsiradusi kreiv, kad skirtsi nuo ankstesniosios: uved rodykl ant ios kreivs, dukart spustelkite klavi; dialogo Format Data Series langelyje Patterns skyrelyje Marker paymkite Automatic (arba Custom, tuomet reiks dar pasirinkti Style, Foreground ir Background) ir spustelkite OK. a ir b. Sudarykite f3 funkcijos reikmi stulpel (nuo D10), parametrui paskirdami D8 langel, papildykite paveiksl ios funkcijos grafiku. Paymkite i kreiv, kaip tai darte anksiau. Parodykite, kad f3 galima sutapatinti su f1 (ar f2). a ir b. Sumodeliukite f4 funkcij su = arba = , pavaizduokite atskirame paveiksle. (Nurodymas: ireikkite kaip sandaug = * , o gals bti 1 arba 1; iam parametrui paranku paskirti langel, pvz. E8, taigi D8=E8*A8). c. Nukopijuokite paveiksl ir terpkite j greta, nustatykite tinkam dyd. Pakeiskite vertikaliosios aies mastel logaritmin: atveskite rodykl ios koordinats zon [Value (Y) Axis] ir dukart spustelkite klavi; spustelkite Scale ir paymkite ( ) Logarithmic scale, spustelkite OK. Pakeiskite parametro enkl (t. y. parametro dyd: i 1 1 arba atvirkiai). Atkreipkite dmes tai, kaip kinta 2 ir 3 pavekslai. Pakaitaliokite parametro enkl pirmynatgal (patogu naudotis Undo, Redo). Sumodeliuokite f5 funkcij, kai < 0. Nukopijuokite 2 paveiksl, terpkite jo kopij greta 3, nustatykite tinkam dyd, papildykite j f5 modeliu. Atkreipkite dmes tai, kad i kreivi suma lygi 1, kaip bekaitaliotumte parametr. Sumodeliuokite f6 funkcij, pavaizduodami j atskirame paveiksle. Palyginkite su ankstesniuoju paveikslu, atkreipdami dmes koordinai ais ir skaiius. Pakaitaliokite parametrus. Nukopijuokite paveiksl ir terpkite jo kopij greta, nustatykite tinkam dyd. Pakeiskite Logarithmic scale, horizontaliosios aies mastel ir ribas: Minimum nustatykite 1, paymkite paspauskite OK. Palyginkite paveikslus tarpusavyje ir su ankstesniaisiais.

191

2. Dispersin analiz. Modelio patikra


Uduotis Sudaryti Excel funkcijos FDIST(x; Deg_freedom1; Deg_freedom2) skaiiavimo program. ia Deg_freedom1, Deg_freedom2 (arba n1, n2) laisvs laipsniai; x vietoje statyti Fisherio santyk, kiti ymenys aikinami darbo eigos metu.

F=

2 ^ n Yi Yi pi n2 i =1 2 n1 n p Yij Yi i =1 j =1
i

Darbo eiga Pradioje sitikinkite, kad Excel pavyzdyje pateikta programa veikia ir pateiktas modelis neprietarauja bandym duomenims: FDIST(F; n1; n2) > 0,05. Pakaitaliokite parametr reikmes, stebdami, kaip kinta FDIST. Ivalykite (delete) vien kit duomen lentels langel. Atkreipkite dmes tai, kad FDIST beveik nekinta. Panaikinkite pakeitimus (Undo). Pakeiskite duomenis (ne visus i karto, o po vien langel ir ne gretimuose langeliuose, o parinkdami atsitiktinai): dabar FDIST turi labiau kisti. Undo. Pakeiskite pat model. Dabar modelin kreiv turi gerokai nukrypti nuo duomen, o FDIST labai sumati. Duomen lentelje (Pratybos.xls) sudarykite nepriklausomojo dydio stulpel (tiesin skal). Pavaizduokite duomenis grafiku. G stulpelyje skaiiuokite vidurkius ( Yi ): paymj G10 langel, spustelkite klavi ant = enklo formuli juostoje, ioje juostoje pasirinkite reikiam funkcij (AVERAGE), paymkite vidurkintin duomen eilut (nuo C iki F, kaip tai darte, papildydami paveiksl naujais duomenimis) ir paspauskite OK. Vidurki linij pavaizdukite lautine (pirminiai duomenys tegu lieka pavaizduoti pabirais takais). H stulpelyje skaiiuokite pi, t. y. kiek atlikta bandym (matavim), atitinkani tos eiluts nepriklausomojo dyd: pasirinkite funkcij COUNT, paymkite skaiiuotin duomen eilut (nuo C iki F), paspauskite OK (funkcija COUNT skaiiuoja tik langelius su skaiiais, tui neskaiiuoja). J, K, L ir M stulpeliuose skaiiuokite atitinkamo matavimo rezultato nuokrypio nuo vidurkio kvadratus, t. y. Yij Yi . Turkite omeny, kad, jei matavimo nra (langelis tuias), nuokrypio taip pat neturi bti. i slyg gali automatikai patikrinti Excel funkcija IF(logical, any, any): ia logical reikia login slyg (pvz., langelis tuias), any langelio turin (turinys, jei tai ne skaiius, ymimas kabutse: " " reikia, kad langelyje yra tarpo simbolis, o "", kad jame nieko nra). Taigi Y10 ,1 Y10 = IF(C10="";"";(C10-G10)^2). I stulpelyje skaiiuokite pi Yi Yi , taip pat turdami omeny, kad nuokrypis skaiiuojamas tik tuo

^

)2

)2

atveju, kai yra atitinkamas vidurkis (ir pi) taigi naudokits Excel funkcija IF. N stulpelyje skaiiuokite sumas
p Yij j =1
i

Yi

)2 , naudodamiesi Excel funkcija SUM. Pasirink i funkcij

formuli juostoje, paymkite atitinkamus langelius (J M), paspauskite OK. Upildykite lentel iki paskutins eiluts, kurioje yra nepriklausomas kintamasis, tempdami emyn u deiniojo apatinio kampo vis G10 N10 eilut. Skaiiavimai 8 eilutje: F langelyje modelio parametr skaii (q) [COUNT(A8:E8)], G langelyje vidurki skaii (COUNT), H langelyje vis Y matavim skaii (pi, SUM), I langelyje susumuokite I stulpelio (nuo I10) rezultatus, N langelyje susumuokite N stulpelio (nuo N10) rezultatus, J langelyje n1 = n q, K langelyje n2 = pi n, L langelyje Fisherio santyk F(0,05; n1; n2), M langelyje FDIST(F; n1; n2). Jei FDIST(F; n1; n2) < 0,05, modelis atmetamas.

192

Pamginkite aproksimuoti iuos duomenis paprasiausiu Jums inomu (tiesiniu) modeliu. Aproksimuokite duomenis sudtingesniu modeliu.

3. Ribotojo augimo modelis


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:
1 ) f1 = a e , 2 ) f 2 =
t

a e t

a 1 + e t 1 b

, 3) f 3 = a e t .

Darbo eiga Sumodeliuokite f1 funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys). Tokiu pat bdu sumodeliuokite f2 funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo ankstesniosios. Tokiu pat bdu sumodeliuokite f3 funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo ankstesnij. Atkreipkite dmes skirtum tarp f1 ir f2 funkcij. Pakaitaliokite b parametro reikm, stebdami, kaip kinta kreivs pavidalas; pakeiskite j taip, kad f2 kreiv priartt prie f1. Nukopijuokite paveiksl ir terpkite jo kopij greta, nustatykite jos dyd. Pakeiskite vertikaliosios Logarithmic scale, paspauskite OK. aies mastel ir ribas: nustatykite Minimum, paymkite Sumainkite b reikm ir atkreipkite dmes tai, jog f2 kreiv, prieingai nei f1 ar f3, antrajame paveksle nesitiesina.

4. Grtamojo proceso modeliavimas


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:
1) p = e t , 2) q = ( + )t e + , 3) r = 1 q , 4) s = e t , 5 ) f = Aq. + +

Darbo eiga Sumodeliuokite p funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys). Tokiu pat bdu sumodeliuokite q, r ir s funkcijas, pavaizduokite jas grafikais tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreives papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi viena nuo kitos. Tokiu pat bdu sumodeliuokite f funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo ankstesnij. Atkreipkite dmes skirtum tarp p ir q funkcij. Pakaitaliokite parametro dyd, stebdami, kaip kinta kreivs pavidalas; pakeiskite j taip, kad q kreiv priartt prie p. Nukopijuokite paveiksliuk ir terpkite jo kopij greta, nustatykite jos dyd. Panaikinkite iame paveiksle r kreiv. Pakeiskite vertikaliosios koordinats mastel ir ribas: nustatykite Minimum, paymkite Logarithmic scale, paspauskite OK. Sumainkite reikm ir atkreipkite dmes tai, jog q kreiv, prieingai nei p ar s, antrajame paveiksle nesitiesina.

193

5. Biferments sistemos modeliavimas


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:
1) f1 = q0 e t / + a 1 e t / , 2) f 2 = q1 e t +

b 1 e t .

Darbo eiga Sumodeliuokite f1 funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys). Tokiu pat bdu sumodeliuokite f2 funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo ankstesniosios. Atkreipkite dmes skirtum tarp f1 ir f2 funkcij. Pakaitaliokite q1, b ir parametr dydius, stebdami, kaip kinta kreivs pavidalas; pakeiskite juos taip, kad f2 kreiv sutapt su f1.

6. Jon pernaos per lstels membran modeliavimas


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais: 1) f1 = A Darbo eiga Sumodeliuokite f1 funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys). Atkreipkite dmes tai, kad i funkcija kinta greiiau, todl reiks daugiau nepriklausomojo dydio reikmi. Patartina pasinaudoti standartinmis Excel funkcijomis: et = EXPONDIST(t; ; FALSE) ir 1 et = EXPONDIST(t; ; TRUE). Tokiu pat bdu sumodeliuokite f2 funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle. Priartinkite f2 kreiv prie duomen (Pratybos.xls). Nurodymas. Pradioje nustat , parametro nekaitaliokite.
+ t + t t e ( 1 e t ), 2 ) f 2 = c0 A1 e 1 + e .

7. Paprastosios kinetikos modeliavimas. Skatinimas. Slopinimas


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:
1) p = x x x x , 2) q = 1 p , 3 ) r = , 4) s = , 5) t = , 6) u = , x+ x+ x+ x+ y+ x++ z

7 ) f1 = A( aq + bp ), A > 0, 0 < a 1, 0 < b 1, 8) f 2 = B( cs + dr ), B > 0, 0 < c 1, 0 < d 1.

194

Darbo eiga Sumodeliuokite p funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys). Pakeiskite horizontaliosios aies mastel ir ribas: nustatykite Minimum tok, kokia maiausia x reikm, Logarithmic scale, paspauskite OK. paymkite Tokiu pat bdu sumodeliuokite q, r, ir s funkcijas, pavaizduokite jas grafikais tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreives papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo p. Atkreipkite dmes tai, kad p ir r (taip pat q ir s) funkcijos i esms nesiskiria. Pakaitaliokite parametro reikm, stebdami, kaip r kreiv slankioja p kreivs atvilgiu (s kreiv q atvilgiu); pakeiskite taip, kad r kreiv sutapt su p (s su q). Nukopijuokite paveiksl ir terpkite jo kopij greta, nustatykite jos dyd. Pakeiskite horizontaliosios aies mastel ir ribas: nustatykite Minimum = 0, nuimkite nuo Logarithmic scale, spustelkite OK. Atkreipkite dmes tai, kaip iuose paveiksluose skiriasi kreivi pavidalas. Tokiu pat bdu sumodeliuokite t ir u funkcijas, pavaizduokite jas grafikais pirmajame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreives papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo kit. Pakaitaliokite y ir parametrus, stebdami, kaip kinta t funkcija. Pakaitaliokite z ir parametrus, stebdami, kaip kinta u funkcija. Tokiu pat bdu sumodeliuokite f1 ir f2 funkcijas, pavaizduokite jas atskirame paveiksle. Pakaitaliokite j parametrus.

8. Atsako slopinimas ligando pertekliumi


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:
x ,q = x+ x . 2 + 1 + x + x

p=

Darbo eiga Sumodeliuokite p funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys). Pakeiskite horizontaliosios aies mastel ir ribas: nustatykite Minimum tok, kokia maiausia x reikm, Logarithmic scale, paspauskite OK. paymkite Tokiu pat bdu sumodeliuokite q funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo p. Pastaba. Kadangi lygt ir parametrai eina tik kartu kaip / santykis, is santykis laikytinas vienu parametru; Excel modeliuojam funkcij pakanka rayti tik santyk. Pakaitaliokite parametr stebdami, kaip q kreiv slankioja p kreivs atvilgiu. Kokia turi bti io parametro reikm, kad p ir q kreivi pradia sutapt? Pakaitalioite / santyk, stebdami, kaip kinta kreivs pavidalas. Koks turi bti is santykis, kad q kreiv priartt prie p? Pakaitaliokite parametr tokiu bdu, kad kreiv neslankiot, tik kist jos pavidalas. (Nurodymas. Ireikkite per .) Koks turi bti ir santykis, kad q priartt prie p? Sumodeliuokite f funkcij ir pritaikykite j prie bandym duomen.

195

9. Dviej vienod sveikos viet kinetikos modelis


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:
1) p = x , 2 ) q = 1 p, x+

3 ) f = A aq 2 + 2bpq + cp 2 .

Darbo eiga Sumodeliuokite p funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys). Pakeiskite horizontaliosios aies mastel ir ribas: nustatykite Minimum tok, kokia maiausia x reikm, paymkite Logarithmic scale, paspauskite OK. Tokiu pat bdu sumodeliuokite q funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Tokiu pat bdu sumodeliuokite f funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau (pradioje lai A = 1). Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo p ir q. Pakaitaliokite a, b ir c parametr reikmes, stebdami, kaip kinta f kreivs pavidalas. Kokios turi bti i parametr reikms, kad f kreiv sutapt su p? Kad sutapt su q?

10. Dviej nevienod sveikos viet kinetikos modelis


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:
x x , 2) q = , x+ x+

1) p =

3 ) f = A {a( 1 p )( 1 q ) + b [ p( 1 q ) + q( 1 p )] + cpq )}.

Darbo eiga Sumodeliuokite p funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys). Pakeiskite horizontaliosios aies mastel ir ribas: nustatykite Minimum tok, kokia maiausia x reikm, Logarithmic scale, paspauskite OK. paymkite Tokiu pat bdu sumodeliuokite q funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo p. Atkreipkite dmes tai, kad p ir q kreivs i esms nesiskiria. Pakaitaliokite parametro reikm, stebdami, kaip q kreiv slankioja p kreivs atvilgiu; pakeiskite taip, kad q kreiv sutapt su p. Tokiu pat bdu sumodeliuokite f funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau (pradioje tegu A = 1). Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo p ir q. Pakaitaliokite a, b ir c parametr reikmes, stebdami, kaip kinta f kreivs pavidalas. Kokios turi bti i parametr reikms, kad f kreiv sutapt su p?

196

11. Kooperatinio veikimo kinetikos modeliavimas


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:

p=

x , q = p 2 , r = 1 (1 p )2 , x+ 1 x + 4 x + 6 x + 4 x 3 3 + 4 4
4 3 2 2 2

f =

g = 4 f ,u = x4 f , v = 1 g.

Darbo eiga Sumodeliuokite p funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys) (patartina imti maesnius nepriklausomojo intervalus ir daugiau jo reikmi). Pakeiskite horizontaliosios aies mastel ir ribas: nustatykite Minimum tok, kokia maiausia x reikm, paymkite Logarithmic scale, paspauskite OK. Tokiu pat bdu sumodeliuokite q ir r funkcijas, pavaizduokite jas grafikais tame paiame paveiksle, kaip ir anksiau. Paymkite kreives papildomomis ymmis (Marker). Padarykite greta io paveikslo kopij. Tokiu pat bdu sumodeliuokite pagalbines f ir g funkcijas, pam < 1 (vaizduoti nereikia). Taip pat sumodeliuokite u ir v funkcijas, pavaizduokite jas grafikais antrajame paveiksle. Paymkite kreives papildomomis ymmis (Marker), kad skirtsi nuo kit. Padarykite greta io paveikslo kopij. Panaikinkite jame q ir r kreives. Tokiu pat bdu sumodeliuokite w funkcij, pavaizduokite j. Pakaitaliokite parametro reikm, stebdami, kaip kinta u, v, ir w kreivi statumas. Atkreipkite dmes tai, kad pastaroji kreiv (w) susilieja su p, kai priartja prie 1.

12. Imunofermentins analizs modeliavimas


Uduotis Sudaryti i funkcij reikmi lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais: Darbo eiga
A( 1 + B ) A + C , jei D 2 n 1 + C , f2 = , AD 2 n , jei D 2 n > 1 1 + 2n B

f1 =

2 A x + + 2 n D x + + 2 n D 4 x 2 n D + C. f3 = 2 1 + + D (1 + + D ) 4 D

197

Sumodeliuokite f1 funkcij, kaip tai darte anksiau, pavaizduokite j grafiku, nustatykite paveikslo dyd, koordinai ais (Excel pavyzdys). Priartinkite f1 kreiv prie duomen (Pratybos.xls). Atkreipkite dmes tai, kad i esms nemanoma pakeisti kreivs pavidalo, kai parinktas jos viutinis lygmuo ir fonas. Ji gali slankioti tik horizontalia kryptimi. Tokiu pat bdu sumodeliuokite f2 funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle. Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker). Priartinkite apatin deinij jos dal prie duomen. Atkreipkite dmes tai, kad jos pavidalas taip pat nekinta, kai parinktas fono lygmuo. Ji gali slankioti tik horizontalia kryptimi. Tokiu pat bdu sumodeliuokite f3 funkcij, pavaizduokite j grafiku tame paiame paveiksle. Paymkite kreiv papildomomis ymmis (Marker). Priartinkite j prie duomen (pradiai galite nustatyti tokius pat parametr dydius, kaip Excel pavyzdyje). Atkreipkite dmes tai, kad jos pavidalas priklauso nuo parametro dydio.

198

Gen ininerijos pagrindai

Laboratoriniai darbai Gintautas virblis, Meilut Meizeraityt, Valerija Chmieliauskait

1. E. coli RRI kamieno transformacija, naudojant plazmidin DNR


Meilut Meizeraityt, Gintautas virblis Teorinis vadas Rekombinantins DNR vedimas bakterin lstel yra vienas i svarbiausi molekulinio klonavimo etap. Tam, kad bakterins lstels efektyviai jungt DNR, jos yra atitinkamai apdorojamos. Dl to padidja j membran pralaidumas. Pvz., lsteles paveikus tokiomis metal druskomis, kaip MgCl2, RbCl ar CaCl2, padidja membran gebjimas praleisti lstels vid transformacijai naudojam DNR. Pastaruoju metu daniausiai naudojami du bakterij transformacijos metodai: elektroporacijos (membran pralaidum sukelia stiprus elektros laukas) ir cheminis (paveikiant lsteles mintosiomis metal druskomis). Transformacijos efektyvumas siekia 105109 kolonij/mikrogramui panaudotos plazmidins DNR ir priklauso nuo mikroorganizm prigimties, DNR struktros (ar tai linijiniai DNR fragmentai, ar plazmidin DNR yra iedin, ar pastaroji turi superspiralin struktr) ir naudojamo transformacijos metodo. Patekus bakterij plazmidinei DNR, prasideda jos replikacija ir pasireikia atsparumo genai (ymenys). Dl to transformantai gyja atsparum antibiotikams. Darbo tikslas Transformuoti plazmid pUC18 E. coli RRI kamien ir vertinti transformacijos efektyvum. Darbo priemons bei reagentai: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. aldoma Hetticho centrifuga. Sterils mgintuvliai ir Petri lktels. Ledo vonia. Vandens termostatas. Glaistikliai. Spiritinis degiklis. Terp LB (triptono 10 g/L; mieli ekstrakto 5g/L; NaCl 10g/L). Agarizuotoji terp (terp LB + Bakto agaras 15g/L). Transformacijos buferis (100 mM CaCl2; 10 mM Tris-HCl pH 7,0; 5 mM MgCl2). 100 mg/mL ampicilino tirpalas. Etanolis.

Darbo eiga 1. Kompetentini lsteli paruoimas 1. I vakaro mgintuvl su sterilia terpe (3,5 mL) usjame E.coli RRI kamieno kultr ir inkubuojame per nakt purtant 37 C temperatroje. 2. Ryte 50 L naktins bakterij kultros pilame mgintuvl su sterilia terpe (5 mL) ir inkubuojame purtant 24 val. 37 C temperatroje. (Rekomenduojama, kad lsteli kultra bt logaritminje augimo fazje.) 3. Lsteli kultr ataldome ledo vonioje 10 min. ir centrifuguojame 3000 aps./min. 10 min. 4 C temperatroje. 4. Steriliai supernatant nupilame, o lsteles resuspenduojame tokiame pat tryje (t. y. 5 mL) sterilaus, ataldyto lede transformacijos buferio (100 mM CaCl2; 10 mM Tris-HCl pH 7,0; 5 mM MgCl2 ). Laikome leduose 30 min.

199

5. Lsteli kultr centrifuguojame 5 min. 3000 aps./min. greiiu 4 C temperatroje. Steriliai nupilame supernatant, o lsteles resuspenduojame 200 l sterilaus, lede ataldyto transformacijos buferio, Lstels ilieka kompetentins 1224 val., laikant jas 4 C temperatroje. 2. Kompetentini lsteli transformacija 1. mgintuvl su kompetentine lsteli kultra steriliai pridedame 0,050,1 g (mikrogram) plazmidins DNR (pUC18) buferiniame tirpale. Mgin supurtome ir laikome leduose 30 min. 2. Mgin perneame 42 C temperatros vandens termostat ir inkubuojame 2 min. Po termooko mgin palaikome 1 min. ledo vonioje. 3. mgintuvl su mginiu steriliai pripilame 1 mL sterilios terps LB ir inkubuojame 1 val. 37 C temperatroje. Per t laik bakterijose vyksta atsinaujinimo procesai ir prasideda atsparumo antibiotikams gen ekspresija. 4. Atsargiai (nespausdami) glaistikliu paskleidiame po 50100 L lsteli kultros ant lkteli su agarizuotja LB terpe ir ampicilinu (100 g /mL). Glaistoma, kol agaro pavirius lieka sausas. 5. Lkteles inkubuojame per nakt 37 C temperatroje. 6. Skaiiuojamas transformacijos efektyvumas, t. y. kiek transformant kolonij gauta skaiiuojant vienam mikrogramui plazmids DNR. Skaiiavimas atliekamas pagal formul (reikia atsivelgti, kiek g DNR teko vienai istai lktelei): Transformant skaiius Transformacijos efektyvumas = . Plazmids DNR kiekis, (g) Kontrolinai klausimai 1. 2. 3. 4. Kodl ruoiant kompetentin kultr lsteles reikia paveikti metal druskomis? Koks gali bti transformacijos efekyvumas vienam mikrogramui intaktins DNR? Kokioje augimo fazje turi bti lstels ruoiant kompetentini lsteli kultr? vertinkite i savo eksperimentini duomen gautj transformacijos efektyvum.

Atsiskaitymas Pateikiamas atlikto darbo apraymas, kuriame yra nustatytas atliktos DNR transformacijos efektyvumas. Literatra 1. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000. 2. , . . . -: - , 1999. 3. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989. 4. , . . : , 1987. 5. , . . : , 1976. 6. Sambrook, J.; Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. 7. old Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. 7. Short protocols in molecular biology. Ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

200

2. Plazmidins DNR hidroliz restrikcijos endonukleazmis


Valerija Chmieliauskait, Gintautas virblis Teorinis vadas Restrikcijos endonukleazs (restriktazs) fermentai, atpastantys tam tikras sekas dvigrandje DNR ir skeliantys DNR molekul iose vietose. Restriktazs klasifikuojamos tris tipus. I ir III tipo fermentai pasiymi DNR modifikuojaniuoju (metilinaniuoju) ir kartu ATP priklausomu restrikciniu aktyvumais. Abiej tip restrikcijos endonukleazs atpasta nemetilintas sekas DNR substrate, taiau I tipo fermentai hidrolizuoja atsitiktines sekas, o III tipo fermentai hidrolizuoja DNR tik specifinse vietose. II tipo fermentai tai didiausia restriktazi klas apimanti atuonis subtipus [1]. Daniausiai II tipo restrikcijos modifikacijos sistema, sudaryta i dviej atskir ferment restriktazs ir metilazs. Taiau IIT tipo fermentai sudaryti i dviej skirting subvienet restrikcijos ir modifikacijos, IIG tipo fermentai i vieno polipeptido su restrikcijos ir modifikacijos aktyvumais. Buvo iskirta daugiau negu 1000 restriktazi, priklausani II tipui. Dauguma i j buvo panaudotos molekulinio klonavimo darbuose. ie fermentai hidrolizuoja DNR atpastamos sekos (taikinio) viduje arba alia jos. Restrikcijos sekos paprastai sudarytos i 48 nukleotid, daniausiai turini simetrin (palindromin) struktr. Pvz., restriktaz HindIII atpasta restrikcijos toki sek: 5-AAGCTT-3 ^ 3-TTCGAA-5 ^ Po sklimo susidaro DNR fragmentai: 5-A AGCTT-3 3-TTCGA A-5 Jie turi lipnius galus (atsiranda trumpos, komplementarios viengrands sekos). Restriktaz Eco47III atpasta sek: 5-AGCGCT-3 ^ 3-TCGCGA-5 ^ Po sklimo susidaro fragmentai: 5-AGC GCT-3 3-TCG CGA-5 Jie turi bukus galus (po hidrolizs nra viengrandi komplementari sek). Restriktaz AluI atpasta sek: 5-AGCT-3 ^ 3-TCGA-5 ^ Dauguma restriktazi yra gana labils baltymai, todl saugomi 20 C temperatroje specialios paskirties buferyje, turiniame savo sudtyje 50 % glicerolio (kad neualt). Eksperimento metu restriktazs btinai dedamos ledo voni. Jei ferment reikia skiesti, naudojamas specialus skiedimo buferis. Labai svarbus reakcijos buferio komponentas yra Mg2+ jonai, atliekantys kofaktoriaus vaidmen beveik visoms restrikcijos endonukleazms. Pastaruoju metu restrikcijos reakcijai atlikti parengta ir naudojama

201

unifikuota penki buferi sistema. Darbui su konkreia restriktaze rekomenduojamas vienas i penki buferi. Lentelse lygiagreiai nurodomas fermento aktyvumas (%) likusiuose keturiuose buferiuose. Restrikcijos reakcija atliekama rekomenduojamoje temperatroje, daniausiai 37 C, ir nutraukiama pridedant etilendiaminotetraacto rgties (EDTA) jon, specifikai suriani dvivalenius metal jonus (Mg2+). Restriktazs aktyvumo vienetu laikomas toks fermento kiekis, kuris per vien valand savo optimalioje temperatroje ir buferyje visikai hidrolizuoja 1g substratins DNR, esanios 50 l bendrojo reakcijos trio. Darbo tikslas Hidrolizuoti pBR322 DNR restriktazmis HindIII, Eco47III, AluI ir elektroforeze identifikuoti susidaranius DNR fragmentus. Prietaisai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Mikrocentrifuga. Elektroforezs aparatas. Srovs altinis. Termostatas, 37 C. Automatin pipet, 20 L. Antgaliai automatinms pipetms: geltoni. Ependorfiniai mgintuvliai. Vonel agarozs geliui dayti. UV altinis. Gumins pirtins. Svarstykls. Kaitinimo plytel. Vaizdo dokumentacijos sistema.

Tirpalai 1. Buferis Y/Tango: 33 mM Tris-acetatas (pH 7,9, kai 37 C), 10 mM Mg-acetatas, 66 mM K-acetatas, 0,1 mg/mL jauio serumo albumino. 2. Buferis R: 10 mM Tris-HCl (pH 8,5, kai 37 C), 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mg/mL jauio serumo albumino. 3. Buferis O: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5, kai 37 C), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1 mg/mL jauio serumo albumino. 4. Daas mginiams neti agarozs gel: 60 % glicerinas, 50 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio mlis. 5. Etidijaus bromido tirpalas (0,5 g/mL). 6. pBR322 DNR tirpalas (0,5 mg/mL). 7. Restrikcijos endonukleazs: HindIII, Eco47III, AluI. 8. Buferis elektroforezei: 0,04 M Tris-acetatas (pH 7,5), 0,002 M EDTA. 9. 1,5 % agarozs tirpalas. Darbo eiga Nustatyta tvarka supilstomi komponentai: H2O 14 L, 10xbuferis R, O ar Y/Tango 2 L, pBR322 DNR 2 L, restriktaz 2 L. Laus surenkame centrifuguodami mikrocentrifugoje 510 sek., mgintuvlius supurtome ir vl centrifuguojame 510 sek. Mgintuvlius inkubuojame 2 val. 37 C temperatroje.

202

Agarozs geliui paruoti atsveriame 0,75 g agarozs, itirpiname virindami 50 mL elektroforezs buferio. Kai agarozs tirpalas pasidaro skaidrus, atauiname iki 5060 C ir iliejame parengt form apie 25 mL agarozs tirpalo. Po 2 val. nutraukiame fermentin reakcij priddami 4 L dao, sumaiome ir 12 L neame agarozs gel, esant elektroforezs aparate. Mginius neame tokia tvarka: pBR322 DNR (nerestriktuota), su dau elektroforezei 4 L, pBR322+HindIII 12 L, pBR322+Eco47III 12 L, pBR322+AluI 12 L, 1 kb DNR fragment dydio standartas 7 L. Elektroforez atliekame 11,5 val., esant 100 V tampai, kol mlynas daas nueina du tredalius gelio ilgio. Baigus elektroforez, pirmiausia ijungiamas srovs altinis. Gelis iimamas ir dedamas vonel su etidijaus bromido tirpalu 15 min. Paskui plaunama du kartus i iaupo ir vien kart distiliuotu H2O. Gelis fotografuojamas UV viesoje. Jei plazmidin DNR visikai hidrolizuota, tai elektroforeograma turi atrodyti taip, kaip pateikta 1 pav. Kontroliniai klausimai 1. 2. 3. 4. Apibdinti svok lipns DNR fragment galai. Apibdinti svok buki DNR fragment galai. K laikome restriktazs aktyvumo vienetu? Koks turi bti fragment skaiius, hidrolizavus iedin plazmidin DNR viena, dviem ir trimis skirtingomis restriktazmis?

1 2

3 4

1 pav. Elektroforetin pBR322 DNR hidrolizs produkt analiz: 1 nerestriktuota pBR322 DNR; 2 pBR322+HindIII; 3 pBR322+Eco47III; 4 pBR322+AluI; 5 1 kb fragment dydiai bazi poromis (10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500,3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250)

Atsiskaitymas Atlikto darbo apraymas, kuriame pateikiamas DNR restrikcijos produkt elekroforezs gelio vaizdas. Literatra 1. Pingoud, A.; Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases, Nucleic Acids Research, 2001, 29(18):37053727.

203

2. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000. 3. , . . . -: - , 1999. 4. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989. 5. , . . : , 1987. 6. Sambrook, J. Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. 7. Short protocols in molecular biology. Ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

204

3. Plazmidins DNR iskyrimas ir jos koncentracijos nustatymas


Meilut Meizeraityt, Gintautas virblis Teorinis vadas Plazmids tai nechromosominiai genetiniai elementai, galintys autonomikai (atskirai nuo chromosomins DNR) replikuotis. Tai dvigrand, iedin DNR, kurios dydis gali bti nuo 1 iki 200 kilobazi (kb, arba tkstani nukleotid por). Kai kurios plazmids gali integruotis chromosomin DNR ir replikuotis kartu su ja. Fenotipiniai poymiai, kuriuos lemia plazmidi genai, gali bti ie: atsparumas antibiotikams, kolicin ir enterotoksin sintez, restrikcijosmodifikacijos ferment sintez, organini jungini hidroliz bei kai kurie kiti poymiai. inomi du plazmidi replikacijos tipai: grietosios arba susilpnintosios replikacijos kontrols tipai. Pirmuoju atveju plazmidi skaiius grietai kontroliuojamas, ir j replikacija priklauso nuo eimininko chromosomins DNR replikacijos. Todl bakterinje lstelje bna tik viena arba kelios plazmids kopijos. Esant susilpnintai replikacijos kontrolei, plazmidi kopij skaiius gali siekti nuo 10 iki 1000 vienoje lstelje. iuo atveju kai kuri plazmidi skaii galima dar padidinti iki keli tkstani kopij, naudojant antibiotiko chloramfenikolo inicijuojam plazmids amplifikacij. Chloramfenikolas sustabdo bakterijos baltym sintez, o plazmids replikacija nenutrksta, dl to santykinai padidja plazmids kiekis chromosomins DNR ir lstels baltym atvilgiu. Dauguma plazmidi iskyrimo metodik paremtos tuo, kad lstelje plazmids yra stabilios kovalentikai sujungtos iedo formos, be to, jos yra daug maesns negu bakterin chromosomin DNR. Pvz., Escherichia coli genomas turi 4,7 106 bazi por, o stambiausi plazmidi 2 105, bet paprastai nevirija 104 bazi por. iuo metu vienas i daniausiai naudojam plazmidins DNR iskyrimo metod yra armins ekstrakcijos, arba Birnboimo-Doly metodas [1] bei vairios io metodo modifikacijos. Metodas paremtas tuo, kad, paveikus lsteles natrio armo ir SDS (natrio dodecilsulfato) tirpalu, jos yra lizuojamos ir denatruoja dvigrands linijins DNR molekuls (atsiskiria komplementariosios DNR grandins). Denatracija intensyviausiai vyksta su chromosomine bakterijos DNR, o nedidels plazmidins DNR molekuls lieka maai paveiktos. arminis lizato pH pervedamas rgtin, naudojant didel natrio arba kalio acetato pertekli. Chromosomins DNR, membranini baltym bei SDS kompleksas dl to ikrenta nuosdas, o plazmidin DNR lieka itirpusi supernatante (po nuosd centrifugavimo). Stabiamolekulin RNR gali bti paalinama gaut plazmids preparat pridjus 10 M LiCl ir ataldius (priemaiin RNR ikrenta nuosdas ir atskiriama centrifuguojant) arba kitais atvejais RNR yra degraduojama panaudojus RNR nukleaz, kuri vliau paalinama fenolo ekstrakcijos bdu. DNR reikia saugoti nuo DNR nukleazi poveikio, kuri nemaai yra lsteliniuose ekstraktuose. Todl DNR preparatuose stengiamasi atsikratyti nuo vis baltym (kartu ir nukleazi), naudojant fenolins ekstrakcijos metod, be to, daugum DNR tirpal yra pridedami nukleazi inhibitori, toki kaip EDTA, kurie suria nukleazi aktyvumui reikalingus metal jonus. Darbo tikslas Iskirti plazmidin DNR (pUC18) i transformuotojo E. coli RRI kamieno ir nustatyti galutinio DNR preparato koncentracij.

Darbo priemons 1. 2. 3. 4. 5. 6. Laminarinis boksas. Termostatuojama purtykl. Krioaldiklis 70 C ar emesns temperatros. aldoma centrifuga ir minicentrifuga. Spektrofotometras. Automatins pipets.

205

7. Eppendorfo tipo mgintuvliai. Tirpalai ir reagentai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. TE tirpalas: 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA. Lizavimo tirpalas: 0,2 M NaOH, 1 % SDS (natrio dodecilsulfatas). 3 M natrio acetatas, pH 4,8. 10 M LiCl. Etanolis. Izopropanolis. Chloroformas.

Darbo eiga Biomass auginimas: vieiai transformuotos E. coli RRI kolonijos nuo agaro lktels usjamos mgintuvl su 5 mL LB terps ir 100 g/mL ampicilino. Auginama per nakt +37 C temperatroje intensyviai purtant. Biomass suspendavimas: Uaugintos naktins kultros centrifuguojamos 5 min. 4000 aps./min. greiiu Hetticho aldymo centrifugoje (+4 C). Supernatantas (skystis vir nuosd) atsargiai nupilamas, o biomas suspenduojama 200 l ataldyto TE buferio ir suspensija perkeliama vien Eppendorfo tipo mgintuvl. Lsteli lizavimas: 200 l mL lsteli suspensijos pridedama vieiai paruoto lizavimo tirpalo (400 l). Atsargiai vartant inkubuojama 5 min. kambario temperatroje (kt). Tirpalas pasidaro skaidresnis ir klampus. Chromosomins DNR isodinimas: mgintuvlius pridedama 300 l ataldyto (+4 C) natrio acetato ir 30 l chloroformo. Atsargiai vartant inkubuojama 15 min. ledo vonelje arba aldytuve +4 C. Chromosomins DNR, membranini baltym bei SDS komplekso nuosdos centrifuguojamos 10 min. 14 000 aps./min. greiiu kt minicentrifuga. Plazmidins DNR isodinimas (I): Supernatantas nusiurbiamas var Eppendorfo tipo mgintuvl ir pridedama 0,6 mL izopropanolio (~0,7 trio nuo supernatanto trio) ir 5 min. vartant inkubuojama kt. DNR nuosdos centrifuguojamos 10 min. 14 000 aps./min. greiiu minicentrifuga kt. RNR isodinimas: Supernatantas kuo variau nusiurbiamas, o nuosdos itirpinamos 200 l TE, pridedama 400 l LiCl tirpalo ir mgintuvliai 20 min. aldomi skystajame azote arba kriogeniniame aldytuve (70 C arba emesnje temperatroje). Nuosdos centrifuguojamos 5 min. 14000 aps./min. greiiu kt minicentrifuga. Plazmidins DNR isodinimas (II): Supernatantas perkeliamas naujus mgintuvlius ir pridjus 450 l izopropanolio aldomas 10 min. 70 C. Centrifuguojama 10 min. 14 000 aps./min. greiiu kt. minicentrifuga. Supernatantas atsargiai nusiurbiamas (nuosd lieka labai nedaug ir jos labilios), o mgintuvliai su nuosdomis praplaunami 70 % etanoliu. Dar kart trumpai (12 min.) centrifuguojama ir etanolis sausai nusiurbiamas. Nuosdos itirpinamos 50 l TE buferio. Spektrofotometrinis DNR koncetracijos nustatymas: DNR koncentracija matuojama spektrofotometru esant viesos bangos ilgiui 260 nm. ia: CDNR = A E R,

CDNR DNR koncentracija g/mL; A viesos absorbcija optiniais vienetais (o.v.); E ekstinkcijos koeficientas, kuris dvigrandei DNR lygus 50 g/mL; R tiriamojo tirpalo praskiedimas (kartais). Apskaiiavimo pavyzdys: Prie matuojant, DNR preparatas buvo atskiestas 100 kart ( 3 mL distiliuoto H2O pridta 30 l analizuojamos plazmids tirpalo). Nustatyta, kad praskiesto DNR preparato viesos absorbcija lygi 0,1 o.v., taigi: CDNR = 0,1 50 100 = 500 g/mL = 0,5 mg/mL.

206

Kontroliniai klausimai 1. 2. 3. 4. 5. Kokiomis savybmis pasiymi plazmid? Kokie yra inomi plazmidi replikacijos tipai? Kuo paremtas plazmidins DNR armins ekstrakcijos metodas? Kokius fenotipinius bakterij poymius nulemia plazmids? Kokie bna plazmidins DNR ir bakterinio genomo dydiai?

Atsiskaitymas Pateikiamas atlikto darbo apraymas, kuriame yra nustatyta iskirtos plazmidins DNR koncentracija. Literatra 1. Birnboim, H. C.; Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., vol. 7, 1979, p. 15131523. 2. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000. 3. , . . . -: - , 1999. 4. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989. 5. Sambrook, J.; Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. 6. Short protocols in molecular biology. Ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

207

4. Plazmidins DNR ligavimas


Valerija Chmieliauskait, Gintautas virblis Teorinis vadas Fermentai, naudojami sujungti dviem fragmentams DNR, yra vadinami DNR ligazmis. Gen ininerijoje parastai naudojamos dviej ri DNR ligazs: bakteriofago T4 DNR ligaz ir E. coli DNR ligaz. Dirbant su pastarja, btinas kofaktorius NAD+, o norint sujungti bukus galus, btina pridti polietilenglikolio arba fikolio (ie komponentai sumaina reakcijos tr, kartu padidja liguojamj fragment gal koncentracija). E. coli DNR ligaz buvo panaudota cDNR klonavimo darbuose. Paprastai is fermentas nra plaiai naudojamas, kadangi daug efektyvesn T4 bakteriofago DNR ligaz, gebanti sujungti bukus DNR fragment galus netgi nesant polietilenglikolio. Taigi molekulinio klonavimo eksperimentuose daniausiai naudojama bakteriofago T4 DNR ligaz yra skiriama i bakteriofag T4 infekuot E. coli lsteli. Tai 68 kDa dydio polipeptidas, katalizuojantis fosfodiesterinio ryio susiformavim tarp DNR 3-OH ir 5-fosfatins grupi. i ligaz gali bti panaudota: DNR fragmentams su lipniais galais sujungti suliguoti, pvz.: 5 -pApCpGOH pApApTpTpCpGpT- 3 3 -TpGpCpTpTpApAp HOGpCpAp- 5 + Mg2+, ATP, bakteriofago T4 DNR ligaz 5 -pApCpGpApApTpTpCpGpT- 3 3 -TpGpCpTpTpApApGpCpAp- 5 Sujungti DNR molekulms, turinioms bukus galus, viena su kita arba su sintetiniais linkeriais, pvz.: 5 -pCpGpAOH 3 -GpCpTp pCpGpTpA- 3 HOGpCpApTp- 5 + Mg2+, ATP, bakteriofago T4 DNR ligaz 5-pCpGpApCpGpTpA- 3 3 -GpCpTpGpCpApTp- 5 Trki dvigrandje DNR, RNR arba DNR RNR hibride reparacijai. Suliguoti galima tik DNR fragmentus, turinius suderinamus lipnius galus, t. y. sujungti DNR fragmentus, turinius EcoRI lipnius galus, arba HindIII lipnius galus ir t. t. Negalima suliguoti DNR fragmento, turintio lipn EcoRI gal su DNR fragmentu, turiniu lipn HindIII gal ir t. t. Bakteriofago T4 DNR ligaz gali sujungti bet kokius bukus galus. Bakteriofago T4 DNR ligazs neinhibuoja reakcijos miinyje esantys dNTP (dezoksiribonukleozidtrifosfatai), be to, ligavimo reakcij galima atlikti buferiuose, naudojamose restrikcijos endonukleazms. ferment inhibuoja NaCl ir KCl druskos, jei j koncentracijos virija 200 mM. Paprastai liguojama 1522 C temperatroje 0,52 val. Jeigu norima gauti kuo daugiau rekombinantini klon arba ligavimas 1522 C temperatroje buvo nepilnas, tai liguojama 4 C temperatroje per nakt. Jei norima sujungti bukus galus, dedama dvigubai daugiau ligazs. Darbo tikslas Suliguoti plazmidin DNR pUC19, hidrolizuot restrikcijos endonukleaze HindIII, naudojant bakteriofago T4 DNR ligaz, ir elekroforezs bdu patikrinti ligavimo efektyvum.

208

Prietaisai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Mikrocentrifuga. Elektroforezs aparatas. Srovs altinis. Automatins pipets: 20 L, 200 L. Geltoni antgaliai automatinms pipetms. Ependorfiniai mgintuvliai. Vonel agarozs geliams dayti. UV altinis. Vaizdo dokumentacijos sistema. Svarstykls. Maiykl. Gumins pirtins. Kaitinimo plytel.

Tirpalai 1. Buferis T4 DNR ligazei: 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (pH 7,8 esant 25 C). 2. Plazmidins DNR pUC19 + HindIII tirpalas: 0,1 mg/mL. 3. T4 DNR ligaz: 5 vienetai/L. 4. Daas mginiams neti agarozs gel: 60 % glicerinas, 50 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio mlis. 5. Etidijaus bromido tirpalas: 0,5 g/mL. 6. Buferis elektroforezei: 40 mM Tris-acetatas (pH 7,5), 2 mM EDTA. 7. 1 % agarozs tirpalas. Darbo eiga Nustatyta tvarka supilstomi komponentai: H2O 39 L, 10 x buferis ligazei 5 L, DNR (pUC19 + HindIII) 5 L, T4 DNR ligaz 1 L. Laus surenkame centrifuguodami mikrocentrifugoje 510 sek., mgintuvl supurtome ir vl centrifuguojame 510 sek. Reakcijos miin inkubuojame 22 C temperatroje 0,5 val. Fermentin reakcij nutraukiame priddami 10 L dao, sumaiome ir 12 L neame agarozs gel. Agarozs geliui paruoti atsveriame 0,5 g agarozs, itirpiname virindami 50 mL elektroforezs buferio, atauiname iki 5060 C ir ipilame parengt form apie 25 mL agarozs tirpalo. Mginius agarozs gel neame tokia tvarka: pUC19 DNR (nerestriktuota), su dau 12 L, pUC19 DNR + HindIII, su dau 12 L, reakcijos miinys po ligavimo 12 L. Elektroforez atliekame 11,5 val., esant 100 V tampai, kol mlynas daas nueina du tredalius gelio ilgio. Baigus elektroforez, pirmiausia ijungiamas srovs altinis. Gelis iimamas ir dedamas vonel su etidijaus bromido tirpalu 1015 min. Paskui plaunama du kartus i iaupo ir vien kart distiliuotu vandeniu. Jei ligavimas vyko, tai elektroforeograma turi atrodyti taip, kaip pateikta 1 pav. Kontroliniai klausimai 1. 2. 3. 4. Koki reakcij katalizuoja DNR ligazs? Kokius DNR fragment galus gali sujungti bakteriofago T4 DNR ligaz? Kokius DNR fragment galus laikome suderinamais ligavimui? Kokius DNR fragment galus laikome nesuderinamais ligavimui?

209

1 pav. Elektroforetin pUC19 DNR ligavimo produkt analiz: 1 nerestriktuota pUC19 DNR; 2 pUC19 DNR + HindIII; 3 pUC19 DNR + HindIII + T4 DNR ligaz

Atsiskaitymas Atlikto darbo apraymas, kuriame pateikiamas vaizdo dokumentacijos sistema remiantis gautas ligavimo produkt elekroforezs gelio vaizdas. Literatra 1. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000. 2. , . . . -: - , 1999. 3. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989. 4. , . . : , 1987. 5. Sambrook; J. D.; Russell, W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. 6. Short protocols in molecular biology, ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

210

5. Ekspresins plazmids palaikymas E. coli kamiene ir jos stabilumo kontrol


Meilut Meizeraityt, Gintautas virblis Teorinis vadas Po ekspresins plazmids transformacijos tinkam E. coli kamien gaunamas reikalingo baltymo producentas, kurio ekspresines ir kitas biologines svybes btina stabiliai ilaikyti. Be to, svarbu nustatyti, ar producento ekspresin plazmid yra stabiliai ilaikoma E.coli kamiene jo kultyvavimo metu. Pagrindiniai metodai, naudojami producent ilgalaikiam palaikymui, bt ie: mikroorganizm liofilizacija (ualdyt preparat arba skysio idiovinimas vakuume); mikroorganizm kultr laikymas ant agarizuotos terps po vazelino arba parafino sluoksniu; kriogeninis konservavimo metodas, t. y. producento ualdymas ultraemoje temperatroje (nuo 70 C iki 196 C). Pastaruoju metu populiarus ir atskiro plazmids bei E. coli kamieno konservavimo metodas, atliekant transformacij prie pat producento kultyvavim. Danai naudojamas kriogeninis konservavimas atliekamas ualdant dviem arba trimis etapais: pirmuose etapuose naudojant ltj ualdym (ne greiiau kaip 1 C/min.) iki 25 C, o toliau aldant greitai iki 70 C arba 196 C. Lsteli gyvybingumui reikms turi ne tik aldymo greitis bei temperatra, bet ir atildymo greitis, apsaugins terps sudtis. Ualdomas lsteles nuo uvimo gerai saugo 1020 % glicerinas arba sacharoz. Mikroorganizmai daniausiai atildomi greitai. Svarbi kiekvieno gero producento svyb yra stabilus savo ekspresins plazmids ilaikymas E. coli kamiene. Producentai, kurie kultyvavimo metu pameta plazmides arba j fragmentus, vliau negali produkuoti pakankamai didelio rekombinantinio baltymo kiekio. Plazmids paprastai turi atsparumo antibiotikui gen. Kadangi producentas kultyvuojamas terpje su tuo antibiotiku, tai lstels, pametusios plazmid arba atsparumo antibiotikui gen, va. Taiau, jei toki lsteli dalis yra pakankamai didel (10 % ir daugiau), tai pastebimai sultina producento augimo greit ir pablogina jo kultyvavimo slygas bei rekombinantinio baltymo ieig. Taigi, patikrinus producento plazmids stabilum, galima vertinti jo kokyb ir kai kuriais atvejais nustatyti maos rekombinantinio baltymo ieigos prieast. Producento plazmids stabilumas gali bti nustatomas replik metodu arba titruojant iaugusi lsteli skaii terpse, pridjus ir nepridjus antibiotik. Replik bdu tiriant plazmids stabilum, atskiros producento kolonijos yra perneamos nuo agarizuotos terps be antibiotik ant terps su antibiotikais, kuri atsparumo gen nea analizuojama ekspresin plazmid. Skaiiuojamas kolonij kiekis (ne maiau kaip 100), iaugs po 18 val. ant abiej tip lkteli. Nustatomas kolonij, neiaugusi ant terps su antibiotikais skaiius ir lyginamas su skaiiumi kolonij, uaugusi ant terps be antibiotik. is santykis ir rodo tiriamojo producento plazmids stabilumo procent. Nustatant producento plazmids stabilum titravimo bdu, vairaus praskiedimo lsteli suspensijos yra isjamos ant agarizuotosios terps, pridjus ir nepridjus antibiotik, kuri atsparumo gen koduoja ekspresin plazmid. Suskaiiavus kolonijas, uaugusias ant abiej ri terps, randamas bakterij titras. Daroma prielaida, kad i vienos gyvybingos lstels iauga viena kolonija ant agarizuotosios terps. Mikrobiologiniu titru vadinamas mikroorganizmo gyvybing lsteli skaiius trio vienete (mL), kuris nustatomas pagal formul:
T= A 10 n , V

ia: T mikrobiologinis titras (lst./mL); A vidutinis kolonij skaiius; 10n praskiedimo laipsnis; V ustos suspensijos tris (mL). Norint gauti statistikai patikim titr, btina suskaiiuoti ne maiau kaip trij lkteli kolonijas kiekvienam analizuojamam praskiedimui. Nustatant aritmetin titro vidurk, rekomenduojama skaiiuoti t lkteli kolonijas, kuriose yra nuo 30 iki 300 kolonij.

211

Darbo tikslas Patikrinti producento plazmids stabilum kultyvavimo metu po transformacijos ar konservavimo. Prietaisai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Laminarinis boksas. Termostatuojama purtykl. Krioaldiklis 70 C ar emesns temperatros. Automatins mikropipets su steriliais antgaliais (200 l ir1000 l). Sterilios Petri lktels. Sterilios pipets: 2 mL, 10 mL. Sterils mgintuvliai, 15 mL. Sterilios stiklins lazdels (glaistikliai).

Tirpalai 1. 2. 3. 4. 5. Sterilus fiziologinis tirpalas 0,15 M (0,87 %) NaCl. Sterili skystoji LB terp mieli ekstraktas 5 g/L, triptonas 10 g/L, 10 g/L NaCl. Strerili agarizuotoji LB terp agaras 15 g/L skystojoje LB terpje. Kanamicino sulfato tirpalas steriliame H2O 30 mg/mL. Konservuotas (ualdytas) mogaus augimo hormono producento preparatas.

Darbo eiga Konservuota (ualdyta) mogaus augimo hormono producento kultra su rekombinantine ekspresine plazmide pET28-hGH (mgintuvliai po 1 mL) perkeliama kambario temperatr, kur ji per 1525 min. atyla. Naudojant 1 mL konservuotos kultros laminariniame bokse sterilia pipete inokuliuojama (usjama) kolbut su 50 mL sterilios LB terps ir kanamicinu (30 g/mL). Kultivuojama termostatuojamoje purtyklje 200 aps./min. greiiu 2 val. 37 C temperatroje. Kol kultra auga, yra paruoiamos Petri lktels su agarizuotja LB terpe: po 6 lkteles su kanamicinu (30 g/mL) ir 6 lktels be antibiotik. Be to, paruoiami mgintuvliai kultrai skiesti. Mgintuvliai sunumeruojami po eis ir kiekvien i j pilama po 9 mL fiziologinio tirpalo. Visos procedros atliekamos laminariniame bokse. Prajus dviem kultivavimo valandoms, kai suspensijos optinis tankis, esant 550 nm viesos bangos ilgiui, pasiekia vienet (tai apie 108 lsteli mililitre suspensijos), kultrinis skystis (1 mL) yra steriliai perkeliamas pirmj mgintuvl su fiziologiniu tirpalu. Skysiai gerai imaiomi mikropipete ir procedra kartojama nuosekliai (po 1 mL praskiestos kultros perneama vis kit mgintuvl) iki etojo mgintuvlio imtinai. Tada 0,1 mL lsteli suspensijos i penktojo ir etojo mgintuvli isjama ant paruot Petri lkteli, po tris lkteles kiekvienam praskiedimui. Glaistikliu atsargiai ir nespaudiant, sklaidoma lsteli suspensija ant agarizuotosios terps paviriaus, kol visikai idista. Lktels inkubuojamos termostate 37 C temperatroje 18 val. Rezultatai suraomi lentel:

212

Terp 10 LB 1. t1 2. t2 3. t3
T5 =

Praskiedimas 10 1. t1 2. t2 3. t3
T6 =

Mikrobiologinio titro vidurkis (kolonijos/mL)


T +T Tvid = 5 6 2

t1 + t2 + t3 3

t1 + t2 + t3 3

LB + kan

1. t1 2. t2 3. t3

t +t +t T5kan = 1 2 3 3

1. t1 2. t2 3. t3

t +t +t T6kan = 1 2 3 3

T +T Tvidkan = 5kan 6kan 2

ia: t1, t2, t3 titrai, suskaiiuoti i trij skirting Petri lkteli; T titr vidurkiai. Ekspresins plazmids stabilumas apskaiiuojamas pagal formul:
T Stabilumas = vidkan 100 %. Tvid

Atsiskaitymas Pateikiamas atlikto darbo apraymas, kuriame apskaiiuojamas analizuotos ekspresins plazmids stabilumas. Kontroliniai klausimai 1. 2. 3. 4. Kaip apibdintumte producent? Kokie yra producent konservavimo bdai? Kas yra mikrobiologinis titras ir kaip jis skaiiuojamas? Kokie yra plazmids stabilumo kontrols metodai?

Literatra 1. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000. 2. , . .. . -: - , 1999. 3. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989. 4. , .; . : , 1987. 5. , . . : , 1976. 6. Sambrook, J.; Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. 7. Short protocols in molecular biology, ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

213

6. Polimerazin grandinin reakcija (PGR)


Valerija Chmieliauskait, Gintautas virblis Teorinis vadas Polimerazin grandinin reakcija (PGR, danai vartojamas ir PCR trumpinimas Polimerase Chain Reaction) metodas, naudojamas specifins DNR sekos amplifikacijai (padauginimui) in vitro. Metodo esm: naudojant du specifinius pradmenis, komplementarius pasirinktai matricins DNR sekai, termostabili DNR polimeraz bei DNR matric, keiiami temperatr ciklai nuo DNR denatracijos iki polimerizacijos temperatr. i kintani temperatrini cikl rezultatas milijonus kart amplifikuotas DNR fragmentas, apribotas dviem pasirinktais pradmenimis ir tiksliai atitinkantis matricins DNR sek tarp i pradmen (1 pav.).

2540 ciklai 1 pav. Polimerazins grandinins (ciklins) reakcijos schema

Metodo principus labai isamiai apra Khorana, o 1985 m. Saiki pritaik praktikai amplifikacijos reakcijoje panaudodamas DNR polimerazs Klionovo (Klenow) fragment. Kadangi is fermentas inaktyvuojasi denatracijos temperatroje (94 C), tai kiekvieno naujo ciklo metu reikdavo pridti viei fermento porcij. Geri rezultatai bdavo tik tuomet, kai tekdavo amplifikuoti maus DNR fragmentus (< 200bp), o amplifikuojant didelius fragmentus, ieiga smarkiai sumadavo, be to, fragmentai bdavo heterogeniki pagal dyd. Visas problemas pavyko isprsti, kai 1988 m. Saiki [1] amplifikacijai pritaik termostabili Taq DNR polimeraz, iskirt i bakterij Thermus aquaticus. Fermento aktyvumo pusperiodis

214

yra madaug 40 min. 95 C temperatroje. Taip modernus PGR metodas tapo vienu i daniausiai naudojam molekulins biologijos metod. Tai atsitiko visai pagrstai, kadangi PGR greitas, gana nebrangus bdas gauti mikrograminius kiekius DNR fragmento nuo labai mao kiekio DNR matricos: panaudojus 10-6 g matricins DNR ir atlikus 3035 PGR ciklus, galima tiktis nuo 0,5 g iki 1 g amplifikacijos produkto, kurio ilgis gali siekti kelis tkstanius bazi por. Polimerazin grandinin (ciklin) reakcija yra naudojama genetiniams susirgimams ir viui diagnozuoti, patogenini mikroorganizm ir virus detekcijai, teisminei ekspertizei ir t. t. Daugelio pasaulio mokslini laboratorij PGR naudojama tokiems rutininiams darbams atlikti, kaip klon analizavimas, restrikcini emlapi sudarymas (kartiravimas), subklonavimas, DNR sekos nustatymas (sekvenavimas), mutagenez ir t. t. Pastaraisiais metais i technika danai naudojama atliekant molekulinio klonavimo eksperimentus. Metodo silpnoji vieta klaidos, pasitaikanios amplifikuotame fragmente. rodyta, jog Taq DNR polimerazs jungiamo neteisingo nukleotido danis 2x10-4 nukleotido vienam ciklui. is danis 4 kartus didesnis nei dirbant su DNR polimerazs Klionovo fragmentu. Atliekant 30 cikl amplifikacij, klaidos danis gali sudaryti iki 0,25 %. Kuo didesn Mg2+ ir dNTP koncentracija, tuo didesn klaid tikimyb. PGR vykdyti gali bti panaudojamos ir kai kurios kitos termostabilios DNR polimerazs (Tth, Vent, Pfu, Tfl, Tli), daranios maiau klaid negu Taq polimeraz. Pradedant PGR pirmiausia reikia denatruoti DNR matric (14 min., 94 C95 C). Vliau atliekama 2540 cikl, kuri kiekvienas susideda i: 1. Matricins DNR denatracijos stadijos (12 min., 94 C95 C). 2. Pradmen specifinio (komplementaraus) prisijungimo (hibridizacijos) su martricos DNR (annealing) stadijos. Paprastai naudojama temperatra yra 35 laipsniais maesn u duplekso (pradmuo viengrand DNR matrica) lydymosi temperatr Tm. Inkubuojama 12 min. Jei pradmuo trumpesnis nei 25 nukleotidai, Tm apskaiiuojama pagal empirin formul:
Tm = 4(G + C) + 2(A + T),

ia G, A, T, C atitinkam nukleotid skaiius pradmenyje. Pvz., pradmens CTG CAT ATG ACA CCT TTA GG lydymosi temperatra yra lygi: Tm = 4(4 + 5) + 2(5 + 6) = 58 C. 3. Komplementarios matricai DNR sintezs arba polimerizacijos stadijos (72 C). Sintezs greitis 24 kb/min. 1 minuts praktikai pakanka 2 kb ilgio PGR produktui susintetinti. Jeigu reikia amplifikuoti didesnius fragmentus, kiekvienam 1000 bp sintezs trukm pailginame 1 min. Pasibaigus paskutiniam sintezs ciklui, mginiai yra papildomai inkubuojami 515 min., kad Taq polimeraz upildyt pasilikusius viengrandius amplifikuotojo produkto galus. ios inkubacijos metu Taq DNR polimeraz prideda papildom (nekomplementar) A nukleotid produkto 3-gale, kuris gali bti panaudojamas tolesniam gautojo fragmento klonavimui reikiam vektori. Atliekant PGR labai svarbu teisingai parinkti pradmen por: Turi bti subalansuotas A/T ir G/C kiekis, panaus abiem pradmenims, be to, G/C ne maiau kaip 40 %. Neturi bti stiprios vidins pradmen antrins struktros (vidinio komplementarumo). Tarp abiej pradmen neturi bti komplementarumo. Optimali pradmen koncentracija: 0,11 M. Optimali Mg2+ koncentracija parenkama kiekvienam eksperimentui. Rekomenduojama Mg2+ koncentracija yra 14 mM. rodyta, kai dNTP galutin koncentracija 0,2 mM, optimali Mg2+ jon koncentracija 1,5 mM. Paprastai 100 L reakcijos miinio imama 0,52,5 vieneto Taq DNR polimerazs. Pridjus daugiau fermento, gaunama nespecifini reakcijos produkt. Jeigu btina (naudojamas termocikleris nekaitina mgintuveli viraus), ant reakcijos miinio usluoksniuojama mineralin alyva, kad neigaruot reakcijos turinys. Darbo tikslas Amplifikuoti E. coli chromosomins DNR 250 bazi por ilgio fragment, naudojant polimerazins grandinins reakcijos metod. Prietaisai 1. Mikrocentrifuga. 2. Maiykl.

215

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Termocikleris. Elektroforezs aparatas. Nuolatins srovs altinis. Kaitinimo plytel. Automatin pipet, 20 L. Antgaliai automatinei pipetei: geltoni. Ependorfiniai mgintuvliai, 0,5 mL. Vonel agarozs geliams dayti. UV altinis. Vaizdo dokumentacijos sistema. Gumins pirtins. Svarstykls.

Tirpalai ir reagentai 1. 10xPCR buferis: 100 mM Tris-HCl (pH 8,8, kai 25 C), 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0,8 % Nonidet P-40. 2. 4 dNTP (dezoksiribonukleozidtrifosfat) miinys: 2 mM kiekvieno. 3. MgCl2 25 mM. 4. Oligonukleotidinis pradmuo 1, komplementarus E. coli 23S rRNR genui, 2 M: 5 CAA-ATC-CGG-AAA-ATC-AAG-GCT-GA 3. 5. Oligonukleotidinis pradmuo 2, komplementarus E. coli 23S rRNR genui, 2 M: 5 TCC-ATC-CGC-GAG-GGA-CCT-CAC-CT 3. 6. DNR matrica plazmidin DNR. 7. Termostabili Taq DNR polimeraz su jauio serumo albumino priedu: 5 vienetai/L. 8. Daas mginiams, dedamiems agarozs gel: 60 % glicerinas, 50 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio mlis. 9. Etidijaus bromido tirpalas: 0,5 g/mL. 10. Buferis elektroforezei: 0,04 M Tris-acetatas (pH 7,5), 0,002 M EDTA. 11. 2 % agarozs tirpalas. Darbo eiga vien mgintuvl nustatyta tvarka supilstomi komponentai: dejonizuotasis H2O 21 L, 10xPCR buferis 5 L, MgCl2 3 L, dNTP 5 L, 1 pradmuo 5 L, 2 pradmuo 5 L, plazmidin DNR 5 L, Taq DNR polimeraz 1 L. kit mgintuvl supilstomi komponentai tokia pat tvarka, tik vietoje plazmidins DNR pripilame 5 L H2O (neigiama kontrol). Laus surenkame centrifuguodami mikrocentrifugoje 510 sek., mgintuvlius supurtome ir vl centrifuguojame 510 sek. Pradin denatracija 4 min. 94 C temperatroje, o toliau 25 ciklai, kuri kiekvienas susideda i: matricins DNR denatracijos 1 min., 94 C, pradmen specifinio susiriimo su DNR 1 min., 65 C, DNR sintezs (polimerizacijos) 1 min., 72 C. Paskutinio ciklo DNR grandini sintez vyksta 10 minui 72 C. Agarozs geliui paruoti atsveriame 1 g agarozs, itirpiname virindami 50 mL elektroforezs buferio. Kai agarozs tirpalas pasidaro skaidrus, atauiname iki 5060 C ir ipilame parengt form apie 25 mL agarozs tirpalo. PGR pasibaigus 10 L amplifikacijos miinio sumaiome su 2 L dao ir dedame agarozs gel. Mginius dedame tokia tvarka:

216

amplifikacijos miinys (be DNR) 12 L, amplifikacijos miinys (su DNR) 12 L, pBR322 DNR/AluI fragment DNR dydio standartai 7 L. Elektroforez atliekame 11,5 val., esant 100 V tampai, kol mlynas daas nueina du tredalius gelio ilgio. Baigus elektroforez, pirmiausia ijungiamas srovs altinis. Gelis iimamas ir dedamas vonel su etidijaus bromido tirpalu 1015 min., plaunamas 3 kartus distiliuotu vandeniu. Gelis fotografuojamas UV viesoje, naudojant vaizdo dokumentacijos sistem. Jei PGR vyko, tai elektroforezs gelyje matysime 250 bp dydio fragment (amplifikacijos miinys su DNR, 2 pav.). Kontroliniai klausimai 1. 2. 3. 4. 5. Kodl PGR metodas naudoja termostabili polimeraz? Kodl reikalingas pradinis DNR matricos denatravimas? Kodl naudojamas btent toks PGR cikl eilikumas? Kaip apskaiiuojama pradmens lydymosi temperatra Tm? Kur naudojamas PGR metodas?

2 pav. Elektroforetin PGR produkt analiz: 1 amplifikacijos miinys be matricins DNR (neigiama kontrol); 2 amplifikacijos miinys (su DNR); 3 pBR322 DNA / AluI marker (MBI Fermentas) DNR standartai (908, 659, 656, 521, 403, 281, 257, 226, 100, 90 bp)

Atsiskaitymas Atlikto darbo apraymas, kuriame pateikiamas PGR produkt elekroforezs gelio vaizdas. Literatra 1. Saiki, R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S. et al. 1988, Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239: 487491. 2. Sambrook, J.; Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual, third edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. 3. Short protocols in molecular biology, ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

217

Chromatografijos pagrindai
Laboratoriniai darbai Vilma Michailovien

1. Baltym jon main chromatografija


Darbo tikslas Atlikti jauio chimotripsinogeno (pI = 9,5) ir kiauinio lizocimo (pI = 11,0) miinio atskyrim ant stipraus katijonito S-sefarozs Darbo priemons Kolonl, spektofotometras, grandientatorius, chromatografin aparatra, automatins pipets. Paruoiamieji darbai 1. Sorbento S-Sefaroz paruoimas. Chromatografin kolonl (skersmuo 10 mm, ilgis 10 cm) pripildoma 5,0 mL vandeniu nudekantuoto sorbento. Per kolonl 40 mL/h greiiu praleidiamas 0,001 N HCl vandeninis tirpalas, pH 3,0 (ne maiau kaip 10 tirpalo tri sorbento triui), nuo rgties atplaunama dejonizuotu vandeniu. Kolonl nupusiausvyrinta 50 mL 20 mM Na fosfatiniu buferiu pH 6,0. 2. Buferini tirpal ruoimas 2.1. 20 mM Na fosfatas,pH 6,0, 150 mL, (buferis-1). 2.2. 20 mM Na fosfatas, pH 6,0, turintis 0,8 M natrio chlorido (buferis-2) 3. Baltym miinio ruoimas Po 10,0 mg chimotripsinogeno ir lizocimo atsveriama analitinmis svarstyklmis ir tirpinama 10,0 mL buferiu 1. Matuojama bendroji baltymo koncentracija miinyje (Bradfordo metodu, 5x skiestam tirpalui) Darbo eiga Baltym miinio pavyzdys vedamas kolonl 37,5 mL/h greiiu peristaltiniu siurbliu ir sorbentas plaunamas buferiu-1 (5 triai/sorbento triui), renkant eliuato frakcijas ( 5 mL) kas 8 min. Sorbuotojo baltym miinio dalis desorbuojama linijiniu NaCl gradientu iki 800 mM, esant bendram gradiento triui 50 mL (25 mL buferio 1 ir 25 mL buferio 2). Gradientins eliucijos frakcijose (tris 3,5 mL, rinkimo laikas kas 6 min.)) matuojama baltymo koncentracija Bradfordo metodu. Baltymo koncentracijai matuoti mginiai i gradiento frakcij skiediami buferiniu tirpalu 1: frakcijai Nr. 6 matuojama neskiedus, frakcijoms Nr. 711 praskiedus mgin 5x ir frakcijoje 12 neskiedus. Apkaiiuojamas bendrasis desorbuotojo baltymo kiekis. Jo santykis su vestu kolonl baltymo kiekiu rodo baltymo desorbcijos ieig. Atlikt matavim lentel Fr.nr. Fr. tris, mL Optinis tankis Konc., mg/mL Praskiedimas Baltym kiekis, mg

Atsiskaitymas 1. Chromatograma, detektuojanti eliuato absorbcijos, esant 280 nm, kitim nuo chromatografijos pradios iki gradientins eliucijos pabaigos. 2. Baltymo koncentracija NaCl gradiento frakcijose ir bendras desorbuoto baltymo kiekis 3. NaCl koncentracija, kuriai esant pasirodo maksimalios chimotripsinogeno ir lizocimo koncentracijos, detektuojant eliuato absorbcij esant 280 nm.

Literatra , . . . : , 1985, c. 249330.

2. Biomolekuli pasiskirstymas vandeninse fazinse sistemose


Darbo tikslas Atlikti mogaus serumo albumino (SA) pasiskirstym dvifazje sistemoje PEG/dekstranas. Nustatyti baltymo pasiskirstymo koeficient pokyius. Suskaiiuoti baltymo ieig kiekvienoje dvifazje sistemoje. Darbo priemons Spektrofotometras, svarstykls, pH-metras, pipts,automatins pipts,centrifga. Tirpalai 40 % (svorio procentai) polietilenglikolio PEG 6000 (molek. mas 60007500) tirpalas vandenyje 50 mL. 20 % (svorio procentai) dekstrano (molek. mas 60 000) tirpalas vandenyje 50 mL. Paruotas tirpalas uvirinamas ir ikarto ataldius laikomas +4 C, 40 % (svorio procentai) PEG-daas, tirpalai vandenyje po 2 mL tirpalo kiekvienam konjugatui, 0,2 M natrio fosfatinis buferis, pH 7,01020 mL, 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,0100 mL, SA tirpalas 20 mM fosfatiniame buferyje, pH 7,0, baltymo koncentracija 5,56,0 mg/mL 5,0 mL. Fazini sistem ruoimas Darbui naudojama dvifazs sistemos sudtis 6,5 % (svorio procentai) PEG/ 10 % (svorio procentai) dekstranas. Fazins sistemos svoris 4,0 g. Fazins sistemos sudties skaiiavimo pavyzdys Skaiiuojamas PEG (grynosios mediagos) kiekis, reikalingas nurodytos sudties 4,0 g svorio fazinei sistemai paruoti: 6,5 g 100 g, X 4g, X = 0,26 g. Kadangi PEG tirpalas yra 40 % koncentracijos, perskaiiuojamas jo svoris, reikalingas 4,0 g fazinei sistemai 40 g 100 g 0,26 g X, X = 0,65 g. Analogikai skaiiuojamas dekstrano tirpalo kiekis, reikalingas nurodytos sudties 4,0 g svorio fazinei sistemai: 10 g 100 g X 4 g, X = 0,4 g, ir, 20 g 100 g 0,4 g X, X = 2,0 g.

Taigi fazinei sistemai paruoti reiks atsverti 0,65 g 40 % PEG tirpalo ir 2,0 g 20 % dekstrano tirpalo. Likusj svor iki 4,0 g sudarys vanduo, buferinis tirpalas ir baltymo mginys, pvz., 0,4 mL 0,2 M
219

fosfatinio buferio (jo galutin koncentracija fazinje sistemoje bus 20 mM), 0,4 mL baltymo tirpalo (2,2 2,4 mg) ir 0,55 mL vandens. Ruoiant fazines sistemas su konjugatais, PEG-dao kiekis skaiiuojamas procentais nuo bendrojo PEG kiekio, reikiamo 4,0 g fazins sistemos paruoti. Pvz., jeigu PEG-daas koncentracija fazinje sistemoje 5 % nuo PEG, tai sudarys 0,013 g grynojo PEG-daas konjugato arba 0,0325 g 40 % jo tirpalo. iuo kiekiu atitinkamai turi bti mainamas PEG tirpalo kiekis, t. y. fazinei sistemai reiks sverti 0,0325 g 40 % PEG-daas ir 0,6175 g 40 % PEG tirpal. Darbo eiga Fazins sistemos ruoiamos centrifuginiuose 10 mL talpos mgintuvliuose. Kiekvienam bandymui fazini sistem mgini skaiius dubliuojamas. PEG-daas konjugat koncentracijos keiiamos kas 10 % nuo bendrojo PEG kiekio, imant 10 ir 20 %. Taip ruoiami: trys mginiai fazini sistem PEG/dekstranas (treiasis tuias mginys, neturintis baltymo, naudojamas kaip palyginamasis atliekant optinio tankio matavimus) ir po du mginius PEG-(10 % PEG-daas)/dekstranas ir PEG-(20 %.PEG-daas)/dekstranas. Centrifuginis mgintuvlis dedamas stiklinl, atsveriamas, ir j i stiklins pipets lainama sveriant reikiami PEG ir dekstrano tirpal kiekiai. Paskui kiekvien mgintuvl sulainama po 0,4 mL 0,2 M fosfatinio buferio, 0,4 mL SA tirpalo ir 0,55 mL distiliuoto vandens. Mgintuvli virus udengiamas parafilmo plvele. Kad tirpalai gerai susimaiyt, apie 1015 kart pavartoma. Mgintuvliai dedami centrifug ir centrifuguojama, kad fazs atsiskirt 23 min. 5000 aps./min. Mgintuvliai iimami j nesudrumsiant, fiksuojamas virutins ir apatins fazi triai. I kiekvienos fazins sistemos fazs imami mginiai baltymo koncentracijai nustatyti Bradfordo metodu (tirpal optinio tankio sugrimo, kai 280 nm, matavimas netinka). Tam tikslui paimti fazi mginiai skiediami (10x ir daugiau) 20 mM fosfatiniu buferiu ir juose matuojama baltymo koncentracija: fazinms sistemoms be konjugato PEG-daas prie 20 mM natrio fosfatin bufer, o praskiesti mginiai i virutins fazs, turinios konjugat PEG-daas prie tiek pat kart praskiest tui PEG faz. Skaiiavimai 1. Skaiiuojamas bendrasis baltymo kiekis fazinje sistemoje: Cb = Cb.v.xVv +Cb.a.xVa, ia Cb.v, ir Cb.a baltymo koncentracija, atitinkamai virutinje ir apatinje fazse; Vv ir Va atitinkamai virutins ir apatins fazi triai. Cb reikms santykis su sistem vestu baltymo kiekiu rodo baltymo pasiskirstymo ieig sistemoje. 2. Skaiiuojami SA pasiskirstymo tarp fazi koeficientai (K0) fazins sistemos PEG/dekstranas mginiuose. Skaiiuojama vidutin K0 reikm. 3. Skaiiuojamos vidutins SA pasiskirstymo koeficient (K) reikms fazinse sistemose, dalyvaujant 10 % ir 20 % PEG-daas konjugatui. 4. Skaiiuojamas SA pasiskirstymo koeficiento pasikeitimas (log K) kiekvienai PEG-daas konjugato koncentracijai pagal formul:
K =

K , tai log K = log K log K, K0

ia, K0 ir K = ligandui. Atsiskaitymas

Cv , SA pasiskirstymo koeficientai atitinkamai fazinse sistemose be ligando ir esant Ca

Baltymo ieiga kiekvienoje dvifazje sistemoje. Skaiiuojami SA pasiskirstymo koeficientai (K0) fazins sistemos PEG/dekstranas. Skaiiuojamos SA pasiskirstymo koeficientai (K) fazins sistemos, dalyvaujant 10 % ir 20 % PEG-daas konjugatui. Skaiiuojamas SA pasiskirstymo koeficiento pasikeitimas (log K).

220

Literatra , -. . : , 1974, c. 101124, 283290.

3. Afinin (biospecifin) chromatografija


Darbo tikslas Atlikti mogaus serumo albumino (SA) chromatografij ant grupinio specifikumo sorbento Sepharose-Cibacron Blue F3GA. Darbo priemons Spektrofotometras, svarstykls, pH-metras, pipets, automatins pipets Paruoiamieji darbai 1. Sorbento Sefaroz-Cibacron Blue F3GA paruoimas Gamintoj tiekiamas sorbentas yra liofilizuotas su stabilizuojaniais priedais, kurie prie naudojim turi bti paalinti. Tam tikslui atsveriama apie 1 g liofilizuoto sorbento, upilama vandeniu ir leidiama visikai ibrinkti (ibrinkusio sorbento tris 4 mL). Sorbento suspensijai leidiama nussti, ji nudekantuojama nuo smulki daleli, perneama ant stiklo filtro ir plaunama 50 mL, 1,0 M NaCl tirpalu (10 tri tirpalo sorbento triui) stabilizatoriams paalinti, ir 1520 tri distiliuoto vandens atplauti nuo NaCl. Chromatografin kolonl (skersmuo 10 mm, ilgis 10 cm) upildoma 3,0 mL paruoto sorbento, ir jis nupusiausvyrinamas 30 mL pradinio chromatografijos buferio, leidiant j 35 mL/val. greiiu. 2. Buferini tirpal ruoimas 2.1. 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,1, buferis 1 (100150 mL) 2.2. 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,1, turintis 0,5 M KCNS, buferis 2 2.3. (50 mL). 3. SA pavyzdio ruoimas. 30 mg liofilizuoto SA preparato tirpinama 3,0 mL buferio-1. 0,1 mL baltyminio tirpalo praskiediama 100 kart baltymo koncentracijai nustatyti Bradfordo metodu (0,1 mL 1 mL, ir 0,1 mL pastarojo 1 mL). Lik 2,9 mL baltyminio tirpalo neami ant kolonls. Darbo eiga kolonl, nupusiausvyrint buferiu 1, neamas peristaltiniu siurbliu 35 mL/val. greiiu baltymo tirpalo mginys (2,9 mL). Sorbentas plaunamas buferiniu tirpalu 1 (25 mL), renkant eliuato frakcijas (tris 6 mL) kas 10 min. Sorbuoto baltymo eliucija atliekama leidiant per kolonl tuo paiu greiiu buferin tirpal 2 (50 mL). Frakcijose nuo chromatografijos pradios iki baltymo desorbcijos buferiu 2 pabaigos analizuojama baltymo koncentracija. Jos matavimui skirti mginiai i frakcij Nr. 16 analizuojami be papildomo skiedimo. Mginiai i frakcij Nr. 7 ir 8 skiediami atitinkamai 10x ir 40x, mginiai i kit eliuato frakcij Nr. 911 analizuojami papildomai neskiesti.
Matavim lentel

Fr. Nr.

Fr. tris, mL

Optinis tankis

Koncentracija mg/mL

Praskiedimas

Baltym kiekis, mg

Atsiskaitymas 1. Chromatograma, parodanti baltymo koncentracijos kitim nuo chromatografijos pradios iki eliucijos buferiu 2 pabaigos.
221

2. Sorbuotojo baltymo kiekis, Cb.s. 3. Baltymo kiekis, desorbuotas buferiu 2 (Cb.des ). 4. Baltymo desorbcijos ieiga (%) = Cb.des /Cb.s x100. Literatra , . . : , 1980.

4. Baltym afinin chromatografija, naudojant imobilizuotuosius metalo jonus (Immobilized metal ions affinity chromatography, IMAC)
Darbo tikslas Atlikti kiauinio lizocimo (eksponuota His-15 liekana) ir arklio irdies mioglobino (eksponuotos His113 ir His-116 liekanos) miinio frakcionavim ant sorbento Sefaroz-IDA, krauto Cu (II) jonais. Darbo priemons Kolonl (10/100 mm),spektofotometras, pH-metras, grandientatorius,pipts, automatins pipts, chromatografin aparatra. Paruoiamieji darbai 1. Sorbento Sefaroz-iminodiacto rgtis paruoimas ir pakrovimas Cu2+ jonais. Chromatografin kolonl (skersmuo 10 mm, ilgis 10 cm) upildoma 3,0 mL sorbento. Per kolonl praleidiamas 30 mL/h greiiu 0,001 N HCl vandeninis tirpalas, pH 3,0 (ne maiau kaip 10 tirpalo tri sorbento triui kolonoje), nuo rgties atplaunama dejonizuotu vandeniu ir per kolonl leidiama 30 mL 50 mM Cu(NO3)2 3H2O tirpalo dejonizuotame vandenyje. Cu2+ jon perteklius ir silpnai laikomi metalo jonai atplaunami vandeniu, ir sorbentas pusiausvirinamas 10 kolonos tri 10 mM Tris-HCl buferio, pH 7,0, turinio 0,2 M Na2SO4 (buferis 1). 2. Buferini tirpal ruoimas 2.1. 10 mM Tris-HCl buferis, pH 7,0, turintis 0,2 M natrio sulfato 150 mL (buferis 1) 2.2. 10 mM Tris-HCl buferis pH 7,0, turintis 0,2 M natrio sulfato ir 100 mM imidazolo 17 mL (buferinio tirpalo pH turi bti 7,0) (buferis 2) 3. Baltym miinio ruoimas. 3,0 mg mioglobino ir 12,0 mg lizocimo atsveriama analitinmis svarstyklmis ir tirpinama 15,0 mL buferinio tirpalo 1. Matuojama bendroji baltymo koncentracija miinyje (Bradfordo metodu, 10x skiestam tirpalui). Darbo eiga Baltym miinio pavyzdys (15 mL) vedamas kolonl 30 mL/h greiiu su peristaltiniu siurbliu. Sorbentas plaunamas buferiniu tirpalu 1 (10 tri/sorbento triui), renkant eliuato frakcijas kas 7 min. Sorbuotojo baltym miinio dalis desorbuojama linijiniu imidazolo gradientu iki 100 mM, esant bendrajam gradiento triui 34 mL (17 mL buferio 1 ir 17 mL buferio 2). Gradientins eliucijos frakcijose (tris 3,53,7 mL) matuojama baltymo koncentracija Bradfordo metodu. Baltymo koncentracijai matuoti mginiai i gradiento frakcij skiediami buferiniu tirpalu 1: frakcijai Nr. 115x, frakcijoms Nr. 24 10x ir frakcijai Nr. 5 5x. Apskaiiuojamas bendras desorbuoto baltymo kiekis. Jo santykis su netu kolonl baltymo kiekiu rodo baltymo desorbcijos ieig.
Matavim lentel

Fr. Nr.

Fr. tris

Optinis tankis

Praskiedimas

Baltym koncentracija, mg/mL

Baltym kiekis

222

Atsiskaitymas 1. Chromatograma, rodanti eliuato absorbcijos kitim, esant 280 nm, nuo chromatografijos pradios iki gradientins eliucijos pabaigos. 2. Baltymo koncentracija imidazolinio gradiento frakcijose ir bendras desorbuoto baltymo kiekis 3. Imidazolo koncentracija, kuriai esant pasirodo didiausia lizocimo ir mioglobino koncentracija, detektuojant eliuato absorbcij, kai 280 nm. Literatra Frances H. Arnold. Metal-Affinity separations: a new dimension in protein processing. Biotechnology. 1991, p. 152155. 2. Porath, J.; Carlsson, J.; Olsson, I. and Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258, 1975, p. 598599. 1

5. Chromatografins kolonls efektyvumo nustatymas


Darbo tikslas Apskaiiuoti pagrindinius chromatografins kolonls parametrus: teorini lkteli skaii N, ekvivalentin aukt vienai teorinei lktelei H, redukuotosios lktels aukt h, pik asimetrijos veiksn As Darbo priemons Analitinis chromatografas; atvirki fazi kolonl BIO-RAD RP-304 (RP-318), 4,6x250 mm, virktas 20 L, automatins pipets 20 l, 1000 L, mikromgintuvliai 1,5 mL, filtravimo ranga. Reagentai Acetonitrilas, benzenas, toluenas, acetonas, Mill-Q vanduo. Chromatografijos slygos eliuentas: acetonitrilas/vanduo = 50/50(V/V); tekjimo greitis: 1 mL/min.; detekcija: 254 nm injekcijos tris: 1050 L. Darbo eiga Paruoiamas eliuentas. kolb su 100 mL mill-Q vandens pilama 100 mL acetonitrilo ir gerai imaioma. Tirpalas prie naudojim filtruojamas per 0,45 m filtr. Paruoiami mginiai. mikromgintuvl pilama 1 mL eliuento ir 10 L atitinkamo organinio tirpiklio (benzeno, tolueno arba acetono) ir gerai imaioma. Kolonl pusiausvyrinama eliuentu ne trumpiau kaip 15 min 1 mL/min greiiu. Injekcija leidiama 1050 L mginio ir gaunama chromatograma. Atsiskaitymas I gautos chromatogramos suskaiiuojame piko plot puss piko auktyje W1/2h arba ties piko pagrindu Wb ir piko laikymo laik. Skaiiuojame teorini lkteli skaii, asimetrijos veiksn pagal atitinkamas formules. Literatra , . . . : , 1985, c. 3140.

223

Teorini lkteli skaiius

N = 5,54(tr/W1/2h)2 N = 5,54(tr/Wb)2

Auktis ekvivalentinis vienai teorinei lktelei H = Redukuotasis teorins lktels auktis


h =

L , ia L kolonls ilgis. N

H , ia dp sorbento daleli dydis. dp

Asimetrijos veiksnys 10 % piko aukio

6. Baltym hidrofobins sveikos chromatografija (HSCH)


Darbo tikslas Atlikti mogaus serumo albumino (SA) hidrofobins sveikos chromatografij ant sorbento FenilSefaroz (Phenyl-Sepharose). Darbo priemons Kolonl, sorbentas fenil-sefaroz, chromatografin aparatra, filtras, automatins pipets, spektofotometras. Paruoiamieji darbai 1. Fenil-Sefarozs paruoimas 78 mL sorbento suspensijos perneama ant stiklinio filtro ir praplaunama ~ 80 mL vandens. 5,0 mL perplauto ir nuo smulki daleli su vandeniu nudekantuoto sorbento perneama chromatografin

224

kolonl, ir sorbentas pusiausvyrinamas pradiniu chromatografijos buferiu 1 (10 kolonls tri) leidiant 40 mL/val. greiiu. 2. Chromatografijai reikaling buferini tirpal ruoimas. 2.1. 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,1, turintis 1,8 M amonio sulfato, buferis 1 (250300 mL). 2.2. 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,1 buferis 2 (250300 mL). 3. SA pavyzdio ruoimas. 75 mg liofilizuoto SA preparato tirpinama 5,0 mL buferio 1. 4,0 mL baltyminio tirpalo paliekama uneti ant sorbento, o 1,0 mL baltymo koncentracijai nustatyti. Tam tikslui imama 0,1 mL SA tirpalo ir skiediama iki 5,0 mL su buferiu 1. Matuojamas tirpalo optinis sugrimas, kai 280 nm. Tiksli baltymo koncentracija apskaiiuojama pagal formul:
A c = 280 praskiedimas , (mg/mL), 0,53

ia SA A280 = 5,3, esant baltymo koncentracijai 1,0 mg/mL, A280 yra lygus 0,53. Darbo eiga kolonl, nupusiausvyrinta buferiu 1, neamas peristaltiniu siurbliu 40 mL/val. greiiu baltymo tirpalo mginys (4 mL), ir sorbentas plaunamas buferiniu tirpalu 1, renkant eliuato frakcijas (tris 78 mL) kas 10 min. Matuojamas frakcij optinis sugrimas, kai 280 nm, prie bufer tirpal 1. Mginys i frakcijos Nr. 1 matuojamas neskiestas, frakcij Nr. 23 mginiai skiediami 2x buferiu tirpalu 1, o kitose eliuato frakcijose optinis sugrimas matuojamas papildomai neskiedus, kol optinis tankis pasiekia pastovi reikm < 0,100. Tuomet per kolonl tuo paiu greiiu leidiamas buferinis tirpalas 2. Baltymo koncentracijai matuoti mginiai i eliuato buferiu 2 frakcij skiediami: frakcijai Nr. 13x buferiniu tirpalu 2, frakcijai Nr. 210x. (sugrimas, kai 280 nm, matuojamas prie bufer 2). Likusiose buferinio tirpalo 2 eliuato frakcijose baltymo koncentracija matuojama papildomai neskiedus, iki optinis tankis pasieks pastovi reikm < 0,100. Matavim lentel Fr.Nr. Fr. tris, mL Optinis tankis Konc., mg/mL Praskiedimas Kiekis, mg

Atsiskaitymas 1. Chromatograma, rodanti eliuato absorbcijos kitim, kai 280 nm, nuo chromatografijos pradios iki eliucijos buferiu 2 pabaigos. 2. Sorbuoto baltymo kiekis, Cb.s. 3. Baltymo kiekis, desorbuotas buferiu 2 (Cb.des ). 4. Baltymo desorbcijos ieiga (%) = Cb.des /Cb.s. Literatra , . . : , 1982, c. 154158.

225

Biofarmacija 1
Laboratoriniai darbai Genovait Gedminien

1. Rekombinantinio baltymo biosintez E.coli lstelse. Pasjamosios kultros paruoimas


Darbo tikslas Iauginti rekombinantinio baltymo producento biomas. Paruoti pasjamj kultr. Tyrimo objektas Rekombinantinis kiauls augimo hormono baltymas. Darbo priemons Autoklavas, termostatuojamieji kratytuvai, sterilaus oro boksas, svarstykls, analitins svarstykls, centrifuga, spektrofotometras, aldytuvas/aldiklis, pH-metras, cilindrai, automatins pipets, diovinimosterilinimo krosnis, kaitinimo (elektrin) plytel. Paruoiamieji darbai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Tirpal, reikaling rekombinantins E.coli fermentacijai, paruoimas. Tirpal sterilinimas autoklavuojant. Fermentatoriaus ir jo pried sterilinimas. Sterili kolb paruoimas ikaitinant jas 2 val. esant 180 C (0,25 l ir 0,8 l) Sterili antgali paruoimas autoklavuojant 20 min. esant 1 atm. (1 mL mlyni, 0,2 mL geltoni). Sterilus vanduo. Mgintuvliai tirpalams skiesti.

Tirpal ruoimas LB(Luria-Bertani) terp Triptonas 10,0 g, Mieli ekstraktas 5,0 g, NaCl 10,0 g. Mediagos atsveriamos, itirpinamos 700800 mL vandens, patikrinama pH. Terps rgtingumas turi bti pH 6,87,2 ribose. Jei reikia pakoreguoti pH, tai atliekama su natrio armo arba fosforo rgties tirpalu. Vliau terps tris papildomas iki 1 L vandens. Paruota terp ipilstoma kolbas po 80 mL, ukemama mikrobiologiniais kamiais ir sterilinama autoklavuojant 1atm. (121 C) 20 min. Sterilus vanduo induktoriaus ir antibiotiko tirpalams ruoti 4 mgintuvlius pilama po 10 mL vandens, ukemama mikrobiologiniais kamiais ir sterilinama esant 1 atm. (121 C) 20 min. 30 % NaOH (sv/v) 60 g NaOH ir iki 200 mL H2O 60 g NaOH itirpinama 150 mL vandens, atauinama iki kambario temperatros ir tris papildomas iki 200 mL vandens. 70 % etanolis 70 mL 96 % etanolio skiediama cilindre iki 96 mL vandeniu. Terpi ir jos pried, reikaling fermentatoriui upildyti, paruoimas Azoto altinis Peptonas 80 g, pH 6,87,2, Mieli ekstraktas 40 g,

226

Amonio chloridas 8g. Tirpinti ildant iki 5 l. Pakoreguoti pH 6,87,2 ir vliau tr papildyti iki 8,0 l. Paruot tirpal supilti fermentatori ir sterilinti 1 atm. (121 C) 30 min. (r. instrukcij!). Fosfatai 47,2 g, Na2HPO4 (bevandenis) 24,0 g. KH2PO4 (bevandenis) Tirpinti ildant iki 0,8 l. Pakoreguoti pH 6,87,2 ir vliau tr papildyti iki 1,0 l. Paruot tirpal supilti 3 kolbas ir sterilinti 1atm. (121 C) 30 min. (r. instrukcij!). Anglies ir energijos altinis Gliukoz 80 g, 1,8 g, MgSO4 7H2O 0,07 g. CaCl2 Gliukoz ir magnio sulfato hektahidratas yra itirpinami 400 mL vandens. Atskirai itirpinama 70 mg CaCl2 100 mL vandens. Kalcio chlorido tirpalas supilamas gliukozs-magnio sulfato tirpal ir tris papildomas iki 1,0 l vandens. Sterilizuojama 0,5 atm. 20 min. Prie fermentatoriaus pH palaikyti biosintezs metu reikaligi: 30 % NaOH (sv/v) 60 g NaOH ir iki 200 mL H2O. 35 % fosforo rgtis komercin, 200 mL. 10 % propinolio tirpalas (sterilus) putoms gesinti. IPTG (induktorius) izopropil--D-tiogalaktozidas. Ampicilinas. Darbo eiga Rekombinantinio producento auginimas kolbose. Pasjamosios mediagos paruoimas Isterilinus terpes, palaukiama, kol jos atau iki kambario temperatros. Steriliai kiekvien kolb su 80 mL terpe pilama antiobiotiko ampicilino tirpalo iki galutins koncentracijos 50 g/mL terps. taip paruot terp usjama rekombinantinio kamieno kultra E.coli K802recAH. Imama ualdyta 1,5 mL talpos mgintuvlyje darbin kultra, atildoma iki kambario temperatros. Mgintuvlio pavirius nuvalomas 70 % etilo alkoholio tirpalu ir aseptikai usjama po 50 l ios darbins recAH kultros kiekvien kolb (10 kolb). Kolbos sustatomos kratytuv, nustatoma 37 C temperatra, apsuk skaiius 200 aps./min. ir auginama per nakt 1620 val. Kit dien darbas tsiamas. Literatra 1. Becker, J. M.; Caldwell, G. A.; Zachgo, E. A. Biotechnology. 2000, p. 930. 2. Nicklin, J.; Graeme-Cook, K.; Paget, T. & Killington, R. Instant Notes in Microbiology. 2001, p. 147155. 3. , .; , .; , . . 1984, c. 925, 3436.

227

2. Rekombinantinio baltymo biosintez E.coli lstelse. Biomass gavimas


Darbo tikslas Rekombinantinio kiauls augimo hormono baltymo biosintez. Biomass gavimas. Tyrimo objektas Kiauls augimo hormono rekombinantinis baltymas. Darbo priemons Termostatuojamieji kratytuvai, sterilaus oro boksas, svarstykls, analitins svarstykls, centrifuga, spektrofotometras, aldytuvas/aldiklis, pH-metras, diovinimo-sterilinimo krosnis, kaitinimo (elektrin) plytel, fermentatorius ir jo priedai, automatins pipets, stiklinls, mgintuvliai. Darbo eiga Rekombinantinio producento auginimas fermentatoriuje. Biomass gavimas Prie fermentatoriaus pajungiamas pH ir pO2 elektrodai. steril fermentatori supilami visiparuotos ir sterilios terps komponentai, pilama antibiotiko ampicilino tirpalo iki galutins 50 L/mL koncentracijos ir patikrinama pH. Jei reikia, pH koreguojama fosforo rgties ar armo tirpalu. Supylus fermentatori visus terps komponentus, paimama ~200 mL terps skiedimams. Pasjamoji (danai vadinama naktine) kultra, auginta 10-yje kolbui po 80 mL, yra supilama sterili 1,0 l ar didesns talpos kolb. Aseptikai paimama ~10 mL lsteli suspensijos pasjamosios kultros optiniam tankiui vertinti. Prie usjant kultr fermentatori, matuojamas optinis tankis prie 540 nm bangos, 1 cm kiuvetje. Lsteli suspensija prie matavim 5 ir 10 kart atskiediama. Optiniam tankiui matuoti kultrinis skystis skiediamas tiek kart, kad pavyzdio rodmenys spektrofotometro skalje, palyginti su kontrole, bt 0,10,6 O.V. ribose. Skiedimams ir kontrolei imama terp. Optinis tankis apskaiiuojamas pagal formul: A = DxP, ia: A optinis tankis, O.V., D spektrofotometro rodmenys, P praskiedimas. Pasjamoji producento kultra usjama fermentatori pagal fermentatoriaus instrukcijos reikalavimus. Usjus i fermentatoriaus paimamas lsteli suspensijos mginys pradiniam optiniam tankiui imatuoti ir pH patikrinti. Optimalios rekombinantinio producento auginimo slygos: - temperatra 37 C, - terps pH 6,87,2 Kai lsteli suspensijos absorbcija 540 nm bangoje pasiekia 23 optinius vienetus (O.V.), imamas 10 mL lsteli suspensijos mginys rekombinantinio baltymo sintezei lstelse vertinti. Lstels nucentrifuguojamos staline centrifuga, ualdomos aldiklyje ir paliekamos analizei (rekombinantinio baltymo ekspresija biomasje prie induktoriaus IPTG (izopropil--D-tiogalaktozidas) vedim). fermentatori aseptikai supilamas iki 0,2 mM/L koncentracijos induktorius. Auginimas tsiamas dar 2 val. Prajus 30, 60 ir 120 min., imami mginiai rekombinantinio baltymo biosintezei vertinti. Lsteli suspensija nucentrifuguojama kaip ir mginys prie induktoriaus vedim, lsteli nuosdos ualdomos ir paliekamos tolesnei analizei.

228

Baigus fermentacij, vl imamas 10 mL lsteli suspensijos mginys rekombinantinio baltymo ekspresijai vertinti. Lsteli suspensija i fermentatoriaus supilama indus, statytus ledo vonelje. Atauinama iki 1015 C. Kol lsteli suspensija auinama, sunumeruojami ir pasveriami centrifugavimo indai; uraomi svoriai. Lsteli suspensija supilama centrifuginius indus, subalansuojamas svoris ir centrifuguojama esant +4 C 5000 aps./min. 15 min. arba 3000 aps./min. 30 min. Kultrinis skystis po centrifugavimo surenkamas atskir ind, upilama ~1/10 koncentruoto H2O2. Gali bti nukenksminama naudojant ir kit dezinfektant. Taip nukenksminus, kultrin skyst galima ipilti kanalizacij. Biomas su centrifuginiais mgintuvliais pasveriama, uraomas indo svoris su biomase. Paskui biomas su mentele surenkama i centrifugini ind, perkeliama polietilenin maiel, uraoma fermentacijos data ir darb atlikusi student pavards. Saugoma buitinio aldytuvo aldiklyje (esant 1518 C) iki kit laboratorini darb. Baigus darb, sutvarkoma darbo vieta: iplaunamas fermentatorius, jo priedai, ivalomas boksas, nuvalomai laboratoriniai stalai, nevars indai sumerkiami ind su dezinfekavimo tirpalu. variai nuplaunamos rankos ir dezinfekuojamos tam skirtu tirpalu. Atsiskaitymas io darbo metu turi bti: kas 0,5 val. registruojama lsteli suspensijos adsorbcija (O.V.), matuojant spektrofotometru 1 cm kiuvetje 540 nm bangoje. Rezultatus patogiausia rayti lentelje.

Rekombinantinio producento auginimas LKB fermentatoriuje

Mginio Nr.

Mginio pamimo laikas

Auginimo trukm, min.

O.T. 540 nm

O.T. 540 nm, ln

O.T. 540 nm, lg

Auginimo greitis,

Generacijos laikas, td

ie rezultatai turi atsispindti grafike, atidedant vertikalioje ayje O.V., o horizontalioje kultros auginimo trukm valandomis; turi bti apskaiiuotas eksponentinis augimo greitis. Eksponentinis bakterij augimo greitis apskaiiuojamas pagal formul:
= ln xt ln x 0 , (t t0 )

ia: lnxt lsteli suspensijos optinio tankio logaritmas po tam tikros auginimo trukms, min.; lnx0 lsteli suspensijos optinio tankio logaritmas auginimo pradioje, t. y. laikas, nuo kurio norima apskaiiuoti augimo greit; t laikas po tam tikros auginimo trukms, min.; t0 laikas, nuo kurio norima apskaiiuoti lsteli kultros auginimo greit, min. Jei lsteli kultra yra eksponentinje augimo fazje, greitis yra pastovus dydis. Nubr laiko ir optinio tankio, ireikto natriniu logaritmu ln, priklausomybs grafik, gauname ties. ioje augimo stadijoje E.coli lsteli skaiius padvigubja per tam tikr laiko tarp. Lsteli padvigubjimo laikas vadinamas generacijos laiku td ir apskaiiuojamas pagal formul:
td = ln2/, ln2 = 0,693.

apskaiiuotas lsteli generacijos laikas ir generacij skaiius. Generacij skaiius apskaiiuojamas i gyv lsteli titro arba optinio tankio kultros auginimo pradioje ir pabaigoje. Titrui apskaiiuoti sjama po 3 arba 5 pakartojimus Petri lkteles su agarizuota mitybine terpe po 50 l neskiestos lsteli suspensijos i kolbos arba fermentatoriaus auginimo pradioje ir po 0,1 mL praskiedim 10-5, 10-6, 10-7 auginimo pabaigoje. Titras X vienam mL lsteli suspensijos apskaiiuojamas pagal formul:

229

X =

a 10 n , V

ia: a vidutinis kolonij skaiius lktelse; n atskiedimo laipsnis; V ustos suspensijos tris, mL.; Generacij skaiius n apskaiiuojamas pagal formul:
n = 3,32 log x , x0

ia: x lsteli titras arba optinis tankis auginimo pabaigoje; x0 lsteli titras arba optinis tankis auginimo pradioje. Lsteli dalijimosi greiio konstanta (lsteli pasidalijim skaiius per valand) apskaiiuojamas:
v= n lg N lg N 0 . = t lg 2 ( t t0 )

Laikas, reikalingas vienam pasidalijimo ciklui, arba generacijos laikas, yra lygus:
g= t 1. = n v

Pvz., jei per 10 val. suspensijoje lsteli skaiius padidjo nuo 103 iki 109, tai dalijimusi skaiius per valand bus:
v= lg 109 lg 103 , 0 ,3010 10 v = 2.

Vadinasi, generacijos laikas bus 30 min. Biomass derlius, t. y. biomass svoris, g, vienam litrui lsteli suspensijos. Literatra 1. Nicklin, J.; Graeme-Cook, K.; Paget, T. & Killington, R. Instant Notes in Microbiology. 2001, p. 147155. 2. Williams, J.; Ceccarelli, A.; Wallace, A. Genetic Engineering. 2001, p. 81102. 3. , .; , .; , . . 1984, c. 925, 3436. 4. , . . . 1978, c. 1539.

230

3. Rekombinantinio producento lsteli suardymo laipsnio priklausomyb nuo ardymo trukms


Darbo tikslas Rekombinantinio producento biomass ardymas. Tyrimo objektas Rekombinantinio producento biomas. Darbo priemons pH metras, maiykl magnetin, centrifuga, svarstykls, termometrai, chronometras, vandens vonel, ultragarsinis aparatas, ependorfiniai mgintuvliai, vairaus trio cilindrai ir automatins pipets. Tirpal ruoimas 0,1 M natrio hidroksidas. 2 g natrio hidroksido tirpinama 300400 mL vandens, atauinama iki kambario temperatros, ir tirpalo tris papildomas iki 500 mL vandens. Fosfatinis buferis, 10. NaCl 40,03 g; KCl 1,08 g; Na2HPO4 x 12H2O 14,5 g; KH2PO4 0,73 g. Visos ios druskos itirpinamos vandenyje iki 400 mL. Natrio hidroksido tirpalu yra koreguojamas rgtingumas, kuris turi bti pH 7,07,2 ribose. Vliau tirpalo tris papildomas iki 500 mL vandens. Darbo eiga Biomass ardymas ultragarsu Paruoiama ledo vonel su aldomuoju miiniu. aldomajam miiniui paruoti imama lygiomis dalimis vandens ir susmulkinto ledo. Atsveriama 5 g rekombinantinio producento ualdytos biomass. Upilama 50 mL fosfatinio buferio. Maioma magnetine maiykle arba stikline lazdele, kol gaunama homogenin suspensija. Stiklinl statoma ledo vonel. Paskui suspensija ardoma ultragarsiniu aparatu 10 kart po 1 min., kaskart atauinant mgin po 30 sek. Po kiekvieno ardymo ciklo imama po 1,5 mL du mginiai: 1 suardymo laipsniui vertinti, matuojant absorbcij 540 nm bangoje (iame darbe), ir 2 baltym koncentracijai nustatyti. Baltym koncentracijai nustatyti, skiriamas atskiras laboratorinis darbas. Atsiskaitymas inoti ir paaikinti lsteli ardymo bdus. Pagrindiniai lsteli ardymo metodai Eil. Ardymo bdas Nr. 1. Lsteli liz 2. Ferment poveikis 3. Pavyzdys Principas

Eritrocitai, bakterijos Bakterijos paveikiamos lizocimu Chemin soliubilizacija Mieli ekstrakcija ir autoliz toluolu Ualdymas, atildymas

4.

Osmotinis lsteli membranos suardymas Suardius lsteli sienel lizocimu, dl osmozs plyta lsteli membranos Lsteli sienel (membran) i dalies itirpdo chemines mediagos, o lstelje esantys fermentai ubaigia proces Bakterijos, E.coli lstels Ledo kristalai uima didesn tr nei vanduo. Lsteles atildant, jos suplyta

231

5. 6.

Osmotinis okas Homogenizacija rankiniu bdu ar naudojant buitin maiykl Ardymas stiklo, plieno, polimeriniais mikrorutuliukais Gaulino homogenizatorius, Freno presas Ultragarsas

Interferono iskyrimas i Membranos plyta koncentruotame drusk arba Pseudomonas sp. cukraus tirpale Kepen lstels, peli Lstels suardomos mechanikai, naudojant audiniai homogenizatorius

7.

8.

9.

Lstels sutraikomos tarp dideliu greiiu maiom stiklo, plieno arba polimerini mikrorutuliuk vairi lsteli Lsteles ardo auktas slgis, leidiant jas per mao suspensijos skersmens angas, esant 200600 atm. slgi skirtumui Lsteli suspensija. Ultragarso bangos sudaro slgio gradient, dl to Tinka tik laboratorinmis plyta lstels slygomis

vairi lsteli suspensijos

eksperimento metu gauti rezultatai pateikiami lentelje ir pagal gautus duomenis braiomas grafikas, atspindintis optinio tankio E 540nm ir ardymo trukms priklausomyb. Pav. Nr. 1. 2. 3. Min. 0 1 2 ir t. t. Ardyta ultragarsu O.T.

Literatra Coligan, J. E. et al. Current protocols in protein science. 1995. 6.1.56.1.11.

232

4. Rekombinantinio producento lsteli suardymo laipsnio vertinimas pagal baltym koncentracij


Darbo tikslas Rekombinantinio producento suardymo laipsnio vertinimas pagal baltymo koncentracij. Tyrimo objektas Rekombinantinio producento biomass homogenatas. Darbo priemons pH-metras, svarstykls, analitins svarstykls, mgintuvliai, matavimo kolbuts, maiykl, automatins pipets, spektrofotometras, chronometras. Tirpal ruoimas Standartinis albumino tirpalas: Imama 5 mg/mL jauio albumino serumo (BSA) tirpalo ir atskiediama 10 kart: mgintuvl pilama 9 mL distiliuoto vandens ir 1 mL BSA tirpalo. Paruoto tirpalo koncentracija yra 0,5 mg/mL. Reagentas A: 4 g natrio armo bei 20 g natrio karbonato tirpinama vandenyje ir praskiediama iki 1 l. Reagentas B: 0,5 g vario sulfato pentahidrato ir 1 g natrio citrato dihidrato tirpinama vandenyje ir praskiediama iki 100 mL. Reagentas C: Sumaiomi tirpalas A ir tirpalas B santykiu 50 : 1. Ruoiamas ir naudojamas darbo dien. Folino reagento tirpalas: Firminis Folino reagentas prie darb du kartus atskiediamas vandeniu. Darbo eiga Baltym koncentracijos nustatymas Baltym koncentracija nustatoma mginiuose, paruotuose ardant biomas ultragarsu. Tiriamieji mginiai skiediami vandeniu tiek kart, kad bendrj baltym koncentracija tiriamuose tirpaluose bt 0,020,5 mg/mL ribose. Kalibracins kreivs sudarymas. Kalibracinei kreivei sudaryti ruoiamos standartinio baltymo tirpalo 6 koncentracijos. stovel sudedami 7 mgintuvliai (1020 mL trio) ir ant j uraoma eils tvarka: 0 (Kontrol), 1, 2, 3 ir t. t. Lentelje nurodyti standartinio baltymo tirpalo ir vandens triai, kuriuos supylus, gaunamos atitinkamos baltymo standarto koncentracijos.
Standartinini baltym koncetracij tirpal paruoimas

Mg. Baltymo standarto Nr. koncentracija, mg/mL 0 1 2 3 4 5 6 0 0,02 0,05 0,1 0,15 0,25 0,5

Vanduo, mL 2,0 1,92 1,8 1,6 1,4 1,0 0

Baltymo tirpalo, 0,5 mg/mL, tris, mL 0 0,08 0,2 0,4 0,6 1,0 2,0

233

Spalvins reakcijos atlikimas. stovel sudedama po 3 mgintuvlius kiekvienai baltymo koncentracijai: 0,02, 0,05 mg/mL ir t. t. bei 1 mgintuvlis kontrolei (baltym standartini koncentracij paruoimo stovelyje paymtas 0.) kontrolei skirt mgintuvl pilama 0,5 mL vandens vietoj baltymo tirpalo (0 mgintuvlis). kitus mgintuvlius pilama paruoto atitinkamos baltymo koncentracijos tirpalo po 3 pakartojimus. kiekvien mgintuvl (ir kontrolin) pilama po 2,5 mL reagento C, sumaioma purtykle ir laikoma kambario temperatroje 10 min. Paskui kiekvien mgintuvl pilama po 0,25 mL 2 kartus atskiesto Folino reagento, sumaioma, laikoma kambario temperatroje 30 min. ir spektrofotometru matuojama absorbcija ( 750 nm). Lyginama su kontroliniu mginiu (0,5 mL vandens vietoj baltymo tirpalo). Pagal gautus duomenis briama kalibracin kreiv: absorbcijos priklausomyb nuo baltymo koncentracijos, mg/mL. Tiriamj pavyzdi matavimas ir duomen apskaiiavimas. Tiriamieji pavyzdiai skiediami vandeniu taip, kad j koncentracija bt 0,20,5 mg/mL ribose. Analizs eiga yra tokia pati kaip ir kalibracinei kreivei. Pirmiausia atskiediami tiriamieji baltym tirpalai, vliau atliekama spalvin reakcija, supilant ta paia tvarka reagentus kaip nurodyta kalibravimo kreivei. Pavyzdiai po tris pakartojimus supilami mgintuvlius po 0,5 mL, pilama po 2,5 mL reagento C, sumaioma ir laikoma kambario temperatroje 10 min. Paskui pilama po 0,25 mL Folino reagento, sumaioma, laikoma kambario temperatroje 30 min. ir matuojama absorbcija, palyginti su kontroliniu mginiu. Tiriamj pavyzdi baltymo koncentracija, mg/mL, nustatoma pagal kalibracin kreiv, dauginant i tiriamojo tirpalo praskiedimo. Atsiskaitymas pagal gautus duomenis briama baltym koncentracijos kalibracin kreiv: absorbcijos priklausomyb nuo baltymo koncentracijos, mg/mL; tiriamj mgini baltymo koncentracija nustatoma pagal paruot kalibracin kreiv ir apskaiiuojama dauginant i praskiedimo; pagal gautus duomenis braiomas grafikas, ardymo trukms ultragarsu ir baltym koncentracijos priklausomyb.

Literatra 1. Becker, J. M.; Caldwell, G. A.; Zachgo, E. A. Biotechnology. 2000, p. 119124. 2. , . . 1989, c. 290333.

234

5. Rekombinantinio augimo hormono gryninimas jon main chromatografijos metodu


Darbo tikslas Rekombinantinio augimo hormono gryninimas, naudojant jon main chromatografij. Tyrimo objektas Rekombinantinis augimo hormonas. Darbo priemons Peristaltinis siurblys, kolonl, densitometras, spektrofotometras, cilindrai, automatins pipets. Tirpal ruoimas 0,5N HCl (komercin) 1 M Tris-HCl, pH 8,2. 30,3 g Tris-HCl tirpinama 150180 mL vandens, druskos rgtimi subalansuojamas pH, o tirpalo tris papildomas iki 250 mL vandens. 20 mM Tris-HCl, pH 8,2. 20 mL 1 M Tris-HCl skiediama vandeniu iki 800 mL, patikrinama pH ir tris papildomas iki 1 l vandens. 1 M NaCl. 29,2 g NaCl itirpinama 20 mM Tris-HCl, pH 8,2, iki 500 mL. 50 mM NaCl, 250 mL. 12,5 mL 1 M NaCl skiediama 20 mM Tris-HCl, pH 8,2, tirpalu iki 250 mL. 150 mM NaCl. 37,5 mL 1 M NaCl skiediama iki 20 mM Tris-HCl, pH 8,2 tirpalu iki 250 mL. 0,5 M NaOH. 10 g tirpinama 300400 mL vandens, o itirps tris papildomas iki 500 mL. DEAE 52 celiulioz. Darbo eiga DEAE 52 celiuliozs paruoimas Atsveriama 20 g DEAE-52 celiuliozs ir 200 mL talpos stiklinje upilama 23 triais vandens. Celiuliozs milteliams leidiama 11,5 val. ibrinkti. Vanduo atsargiai nupilamas nuo celiuliozs paviriaus, upilamas toks pat tris 0,5 N druskos rgties tirpalo, imaioma ir paikoma 15 min. Vanduo nupilamas, o celiulioz plaunama vandeniu 56 kartus, kiekvien kart palaukiant, kol celiulioz visikai nuss. Universaliu pH popierliu tikrinama, kad sorbentas bt atplautas iki neutralaus pH. Kai pasiekiamas neutralus pH, celiulioz upilama 23 triais 0,5 M natrio hidroksido tirpalo, imaioma ir palaikoma 20 25 min. Natrio armo tirpalas atplaunamas vandeniu iki neutralaus pH. Paskui upilama 20 mM Tris-HCl buferiu ir sorbentas plaunamas, kol pH pasiekia 8,18,5 ribas. Kolonls paruoimas 1,6 x 5 cm kolonl upildoma 10 mL paruotos DEAE-52 celiuliozs. Pagrindins kolonls paruoimo baltym chromatografijai taisykls yra ios: vertikaliai pritvirtinti kolonl; udaryti apatinj iaup; pripilti 1/3 kolonls trio distiliuoto vandens; sitikinti, ar neliko oro burbul. taip paruot kolonl atsargiai supilama paruotos DEAE-52 celiuliozs. Galima pilti per piltuvl arba atsargiai per stiklo lazdel, stebint, kad nepaklit oro burbul. Suspensijai leidiama kelet minui nussti ir, atsukus apatinj iaup, kolonl pamau upildoma. Upildius kolonl iki reikiamo lygmens (aukio), udaryti apatinj iaup ir leisti suspensijai nussti. Stebti, kad neapdit virutinis sorbento sluoksnis. Visada vir sorbento turi bti buferio sluoksnis. Virutinis gelio sluoksnis turt bti tolygiai lygus ir horizontalus. Paskui udarius itekjimo arnel, i viraus udedamas adapteris. Pusiausvirinama 20 mM frakcij kolektorius, savirais, pH-metras,

235

Tris-HCl tirpalu, esant 60 mL/val. tekjimo greiiui. Kolonls pusiausvirinimas vertinamas pagal pH: einaniojo kolonl ir i jos itekaniojo buferio pH turi bti tos paios reikms. Prie pradedant naudoti kolonl reikia nustatyti, kok tr V uima sorbentas. Jis apskaiiuojamas pagal pateikt formul: V = r2 h, ia: V sorbento tris kolonlje, mL; 3,14; r kolonls skersmens vidinis spindulys, cm; h sorbento auktis kolonlje, cm. Baltym tirpalo upylimas Baltym tirpalas, gautas ultragarsu suardius 1 g rekombinantinio producento biomas ir atmetus lsteli nuolauas, siurbliu uneamas ant kolonls. Siurblio greitis 60 mL/val. Baltymo tirpalo tris 2025 mL, koncentrcija 3,54,5 mg/mL. Frakcijos renkamos po 10 mL, t. y. po 1 kolonls tr, atplaunant 20 mM Tris-HCl buferiu. Tirpaus rekombinantinio baltymo desorbcija Tikslinio baltymo desorbcija vykdoma laiptiniu NaCl gradientu: 50 mM nuimant balastinius baltymus ir 150 mM nuimant tirp rekombinantin augimo hormon. Greitis 60 mL/val. Atsiskaitymas Surinktos frakcijos analizuojamos, nustatant optin tank spektrofotometru 280 nm bangoje. I kiekvienos frakcijos du ependorfinius mgintuvlius paimama po 1,5 mL, uraomas frakcijos Nr. ir pavyzdiai paliekami aldiklyje baltym koncentracijai nustatyti Louri metodu bei homogenikumui vertinti PAAG-SDS elektroforezs metodu. Atlikto darbo ivadose turi bti pateikta: - upilto ant kolonls baltymo tris, eliucijos greitis, surinkt frakcij skaiius, chromatograma ir pan.
Surinktos baltym frakcijos E 280 nm bangoje ir chromatograma

Mg. Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

E280 0,080 0,280 1,479 2,674 1,833 0,905 0,680 0,616 0,554 0,514

Mg. Nr. 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

E280 0,462 0,407 0,364 1,362 2,308 1,309 0,86 0,559 0,359 0,238

Mg. Nr. 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

E280 0,215 1,338 2,030 1,990 1,610 1,170 0,808 0,589 0,449 0,446

236

3.0 2.5

O.T. 280 nm

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

10

15

20

25

30

35

Frakc. Nr.
1 pav. Rekombinantinio augimo hormono gryninimo ant DEAE celiuliozs chromatograma: 112 frakcijos praok baltymai; 1320 frakcijos balastini baltym desorbcija 50 mM NaCl tirpalu; 2129 frakcijos tikslinio-tirpaus rekombinantinio baltymo desorbcija 150 mM Na Cl tirpalu

Literatra 1. Preparation of Soluble Proteins from Escherichia coli in J. E. Coligan et al., Current protocols in protein science. 1995. 6.2.16.2.10. 2. Stevenson, C. L.; Hageman, M. J. Estimation of Recombinant Bovine Somatotropin Solubility, Pharmaceutical Reseach. 1995. 12(11), p. 16711676.

237

6. Rekombinantinio baltymo ekspresijos vertinimas elektroforezs PAAG-SDS metodu


Darbo tikslas vertinti rekombinantinio baltymo ekspresij biomasje prie ir po indukcijos IPTG. Tyrimo objektas Rekombinantinis kiauls augimo hormonas. Darbo priemons Vertikalusis elektroforezs aparatas, stovas geliui upilti, pastovios srovs altinis, purtykl, vandens vonel, geli diovintuvas, automatins pipets, mikromgintuvliai, stiklinls, maiykl, svarstykls, pHmetras, skaitytuvas. Tirpal ruoimas 30 % akrilamidas + BIS: 29,2 g akrilamido ir 0,8 g BIS (N,N-metilen-bis-akrilamidas) itirpinama vandenyje ir praskiediama matavimo kolboje iki 100 mL. 1,5 M TRIS, pH 8,8: 18,15 g tris (hidroksimetil) aminometano itirpinama 70 mL vandens. Tirpalo pH koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rgtimi iki 8,8. Praskiediama matavimo kolboje iki 100 mL. 0,5 M TRIS, pH 6,8: 6,0 g tris (hidroksimetil) aminometano itirpinami 70 mL vandens. Tirpalo pH koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rgtimi iki 6,8. Praskiediama matavimo kolboje iki 100 mL. 1,0 M TRIS, pH 6,8: 6,0 g tris (hidroksimetil) aminometano itirpinami 35 mL vandens. Tirpalo pH koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rgtimi iki 6,8. Praskiediama matavimo kolboje iki 50 mL. 10 % natrio dodecilsulfatas (SDS): 5,0 g natrio dodecilsulfato itirpinama, praskiediama vandeniu iki 50 mL. 10 % amonio persulfatas: 1,52,0 mL mgintuvl atsveriama 100 mg amonio persulfato, pilama 1 mL vandens, itirpinama. Tinka naudoti tik pagaminimo dien. Elektrodinis buferis, 5 koncentruotas: 30 g tris(hidroksimetil)-aminometano, 144 g glicino, 10 g natrio dodecilsulfato itirpinama vandenyje ir praskiediama iki 2 l. Laikoma 4 C temperatroje. Tirpalo pH turi bti 8,38,6, taiau koreguoti negalima Prie naudojim tirpalas skiediamas (5 kartus) vandeniu. 0,5 % bromfenolio mlis: 50 mg bromfenolio mlio itirpinama 10 mL vandens. Pavyzdio buferis: 800 mg natrio dodecilsulfato, 2,5 mL 1,0 M TRIS, pH 6,8, 4,0 mL glicerino, 0,1 mL 0,5 % bromfenolio mlio skiediama vandeniu iki 8,0 mL. Ipilstoma po 0,8 mL mgintuvlius. Laikoma kambario temperatroje. - R - redukuotojo pavyzdio buferiui paruoti 0,8 mL tirpalo pridedama 0,2 mL 2-merkaptoetanolio. Coomassie Brilliant Blue R 250 (CBB R-250) daas: 1,0 g CBB R-250 tirpinamas 400 mL etanolio 3 val. Tada pridedama 100 mL acto rgties ir praskiediama vandeniu iki 1 l. Blukiklis: sumaioma 300 mL etanolio, 100 mL acto rgties. Praskiediama vandeniu iki 1 l. Tirpalas geliui diovinti: 325 mL distiliuoto vandens pilama 160 mL 96 etanolio ir 15 mL glicerolio. Tirpalas sumaiomas. Darbo eiga Upylimo formos surinkimas Poliakrilamidinio gelio polimerizacijai naudojama stiklin forma, kuri surenkama i 2 stikl (vidinis 16 20 cm ir iorinis 18,3 20 cm), tarp j esani tarpini (storis 0,75 mm, auktis 18,3 cm, plotis 19,0 mm) bei onini laikikli, suspaudiani i konstrukcij. Paruota forma statoma stovel geliui upilti.

238

Skiriamojo (apatinio) gelio paruoimas 12 % poliakrilamidiniam geliui paruoti stiklinlje sumaioma 12 mL 30 % akrilamido/BIS tirpalo, 7,5 mL 1,5 M TRIS ir 9,1 mL vandens. Pridedama 0,3 mL 10 % natrio dodecilsulfato, 0,2 mL amonio persulfato ir 0,02 mL TEMED. Gerai imaiius, tirpalas pilamas form iki paymtos vietos (4 cm nuo stiklo viraus). Paskui atsargiai pilama 1 mL vandens. Polimerizacija vyksta apie 40 min. kambario temperatroje. Jos pabaiga gerai matoma fazi riboje tarp polimero ir vandens. Sustingusio gelio pavirius praplaunamas vandeniu ir nusausinamas filtriniu popieriumi. Koncentruojaniojo (virutinio) gelio paruoimas 4 % poliakrilamidiniam geliui paruoti stiklinlje sumaiomi 1,3 mL 30 % akrilamido/BIS tirpalo, 2,5 mL 0,5 M TRIS ir 6,1 mL vandens. Pridedama 0,1 mL 10 % natrio dodecilsulfato tirpalo, 0,05 mL amonio persulfato ir 0,01 mL TEMED. Gerai imaiius, tirpalas pilamas ant apatinio gelio iki formos viraus. I karto statomos ukos, formuojanios penkiolika ulinli, stebti, kad nelikt oro burbul. Polimerizacija trunka apie 40 min. Jai pasibaigus, ukos itraukiamos, ikratomas nesusipolimerizavs skystis, ulinliai praplaunami elektrodiniu buferiu ir forma statoma aparat. Pavyzdi paruoimas Biomasi mginiai, gauti 2-ame laboratoriniame darbe, nucentrifuguoti prie induktoriaus IPTG vedim ir prajus 30, 60 ir 120 min., paruoiami baltym elektroforezei. Biomas upilama 0,2 mL vandens, gerai homogenizuojama plona stikline lazdele, o paskui atskiediama iki 0,4 mL. Gauta suspensija atskiediama vandeniu iki 5 mL. ependorfin mgintuvl imama 120 l ios suspensijos, upilama 40 mL mginio buferio su 2-merkaptoetanoliu ir virinama 10 min. verdanio vandens vonelje. Atauinama iki kambario temperatros. Pavyzdi supylimo schema pirmj gelio ulinl supilama 10 l molekulins mass standart, antrj AHr baltymo 24 g, t. y. 810 l. kitus ulinlius supilama po 10 l paruot biomass mgini prie indukcij ir po indukcijos: 30, 60 ir 120 min. Elektroforezs slygos Virutinis ir apatinis aparato rezervuarai upildomi elektrodiniu 5 kartus atskiestu buferiu; apie 250 mL virutin rezervuar ir apie 2000 mL apatin. Pavyzdiai pilami ulinlius po elektrodinio buferio sluoksniu. Elektroforez vykdoma pastoviosios srovs reimu. Kol daai pereis koncentruojantj gel, nustatoma srov 1820 mA/geliui. Daui jus skiriamj gel 23 mm (po 80100 min.), srov padidinama iki 25 mA/geliui. Daui i gelio ijus, elektroforez dar tsiama 2050 min. Paskui srovs altinis ijungiamas, stiklai iimami i aparato, nuimami oniniai laikikliai ir atskiriamas maasis stiklas. Nupjaunamas koncentruojantysis gelis, o skiriamasis gelis dedamas vonel su CBB R-250 dau ir paliekamas per nakt ar ilgiau. Da nupylus, upilamas blukiklis, kuris kelet kart keiiamas. Nuolat maiant, procesas pagreitja. Baigus blukinti, fonas beveik inyksta ir gelis dedamas vanden. Gel reikia gerai atplauti nuo blukalo. Tai daroma 5 kartus keiiant vanden. Kiekvien kart upylus vanden 20 30 min. inkubuojama ant purtykls. PAAG-SDS gelio diovinimas Poliakrilamidiniai geliai diovinami diovintuvuose. J neturint galima diovinti rankiniu bdu pagal toliau aprayt metodik. Iblukintas gelis 3 kartus praplaunamas distiliuotu vandeniu, kas deimt minui pakeiiant vanden. Paskui gelis upilamas tirpalu diovinimui. Tirpalo pilama tiek, kad gelis bt apsemtas. Gelis inkubuojamas kambario temperatroje 1520 min., kartkartmis pajudinant vonel, kad tirpalas tolygiai sigert gel. Inkubacijos pabaigoje 1520 sek. vonel pamerkiami 2 celofano laktai. Celofano matmenys turi bti apie 1 cm didesni u gel. Paskui imamas vienas celofano laktas ir paklojamas ant varaus stiklo taip, kad tarp stiklo ir celofano nelikt oro tarp. Ant pakloto lakto dedamas gelis, kuris i viraus uklojamas antruoju celofano laktu. Tinkamai diovinimui paruotame gelyje neturi bti oro burbul. Celofano pakraiai priklijuojami prie stiklo lipnija juostele ir vienaidviem dienoms paliekama diti kambario temperatroje.

239

94,0 67.0

43.0

30.0

20.1

14.4
kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 pav. Rekombinantinio baltymo biosintez E.coli lstelse: 1 baltym molekulini masi standartai, kDa; 2 Augimo hormono standartinis baltymas; 3 ir 7 biomass lizatas prie induktoriaus IPTG vedim; 46 biomass lizatai, prjus 30, 60, 120 min. po induktoriaus vedimo; 811 biomass lizatai, paruoti i nucentrifuguotos biomass (keturi pakartojimai)

Literatra 1. Westermeier, R. Electrophoresis in Practice. A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. 1997, p. 165186. 2. , . , 1989, c. 6063.

240

Enzimologija (pasirinkimas 1)
Laboratoriniai darbai Jolanta Sereikait

1. -galaktozidazs i Kluyveromyces fragilis specifinio aktyvumo nustatymas


Darbo tikslas Nustatyti -galaktozidazs specifin aktyvum. Tyrimo objektas -galaktozidazs i Kluyveromyces fragilis tirpalas Lactozym 3000L (Novo Nordisk). -galaktozidaz (E.C. 3.2.1.23, -D-galaktozid-galaktohidrolaz, laktaz) fermentas, hidrolizuojantis laktoz bei kitus galaktozidus ir atskeliantis -D-galaktozs liekan:
CH2OH O H OH H H H OH H OH CH2OH O H H OH CH2OH O H OH H H OH CH2OH O H H OH H OH OH H

HO H

H
O

OH H

HO

OH H

H OH

H2O

Darbo priemons Spektrofotometras, termostatas, verdanio vandens vonia, mikropipets. Reagentai 1. 208 mM laktozs tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5. 2. 400 kart skiestas -galaktozidazs preparato Lactozym 3000L tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5. 3. 80000 kart skiestas -galaktozidazs preparato Lactozym 3000L tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5. 4. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas. 5. Bradfordo reagentas. Darbo eiga -galaktozidazs aktyvumo nustatymas. mgintuvl pilama 2 mL 208 mM laktozs tirpalo, paildoma 5 min. 37 C temperatroje, supilamas 1 mL 80 000 kart skiestas -galaktozidazs tirpalas, sumaioma ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Reakcija sustabdoma statant mgintuvl su reakcijos miiniu verdanio vandens voni 5 min. Lygiagreiai paruoiamas kontrolinis bandymas su neaktyviu fermentu. 1 mL 80 000 kart skiesto galaktozidazs tirpalo kaitinama verdanio vandens vonioje 5 min. Paskui pilama 2 mL 208 mM laktozs tirpalo ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Susidariusi gliukoz matuojama gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu (gliukozooksidaz, o-dianizidinas, peroksidaz). Imama 0,5 mL reakcijos miinio, sumaioma su 3 mL io reagento ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Kontrolei: 0,5 mL reakcijos miinio i kontrolinio bandymo su neaktyviu fermentu, 3 mL reagento, inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Absorbcija matuojama, esant bangos ilgiui 460 nm. Perskaiiavimams i optini tanki gliukozs mikromolius analogikai atliekamas eksperimentas su inomos koncentracijos gliukozs tirpalais intervale 0,10,6 mol/mL. Gaunama

241

kalibracin kreiv, apraoma lygtimi y = ax + b, kur b iuo atveju lygus nuliui (kalibracin kreiv paruoia laborantas). Apskaiiuojamas fermentinis aktyvumas -galaktozidazs aktyvumo vienet skaiius, tenkantis 1 mL fermento tirpalo (mol x min-1 x mL-1). Baltymo koncentracijos nustatymas: 0,2 mL 400 kart skiesto -galaktozidazs tirpalo sumaioma su 2,5 mL Bradfordo reagento ir po 5 min. matuojama absorbcija, esant bangos ilgiui 595 nm. Analogikai gaunama kalibracin kreiv su inomomis baltymo (albumino) koncentracijomis intervale 0,010,15 mg/mL (kalibracin kreiv paruoia laborantas). inant baltymo koncentracij ir -galaktozidazs aktyvumo vienet skaii, tenkant 1 mL fermento tirpalo, apskaiiuojamas specifinis -galaktozidazs aktyvumas (mol x min-1 x mg-1). Atsiskaitymas ferment klass, klasifikavimo principai; ferment aktyvumo vienetai; ferment specifinis aktyvumas; baltym koncentracijos nustatymo bdai.

Literatra 1. , . .; , . .; , . . , . , 1988. 2. , .; , . . 1 . , 1982. 3. Price, N. C.; L. Stevens. Fundamentals of enzymology. Oxford University Press, 1999. 4. , . .; , . ; ; . . , 42, 1977, c. 13721376.

242

2. -Galaktozidazs kinetins kreivs gavimas


Darbo tikslas Nustatyti -galaktozidazs kinetinius parametrus KM, Vmaks. ir kkat. Tyrimo objektas -galaktozidaz i Kluyveromyces fragilis. Darbo priemons Spektrofotometras, termostatas, verdanio vandens vonia, mikropipets. Reagentai 1. 208 mM laktozs tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5. 2. -galaktozidazs preparato Lactozym 3000L tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5 (baltymo koncentracija 2,5 x 10-4 mg/mL). 3. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas. 4. Bradfordo reagentas. Darbo eiga Bazinis 208 mM laktozs tirpalas skiediamas 2, 3, 5, 10, 20 ir 40 kart 0,1 M kalio fosfatiniu buferiu pH 6,5 (suskaiiuokite gaut laktozs tirpal molines koncentracijas). Kiekvienai i gaut laktozs koncentracij nustatomas fermentins reakcijos greitis v. Tam tikslui mgintuvl pilama 2 mL atitinkamos koncentracijos laktozs tirpalo, paildoma 5 min. 37 C temperatroje, paskui pilama 1 mL -galaktozidazs tirpalo, sumaioma ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Reakcija sustabdoma statant mgintuvl su reakcijos miiniu verdanio vandens voni 5 min. Lygiagreiai paruoiamas kontrolinis bandymas su neaktyviu fermentu. 1 mL -galaktozidazs tirpalo kaitinama verdanio vandens vonioje 5 min., paskui pilama 2 mL atitinkamos koncentracijos laktozs tirpalo ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Susidariusi gliukoz matuojama gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu (gliukozooksidaz, o-dianizidinas, peroksidaz). Imama 0,5 mL reakcijos miinio, sumaioma su 3 mL io reagento ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Kontrolei: 0,5 mL reakcijos miinio i kontrolinio bandymo su neaktyviu fermentu, 3 mL reagento, inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Absorbcija matuojama, esant bangos ilgiui 460 nm (gliukozs kalibracin kreiv ruoia laborantas). Skaiiuojamas fermentins reakcijos greitis (M x s-1), esant skirtingoms laktozs koncentracijoms. Briama fermentins reakcijos greiio priklausomyb nuo substrato koncentracijos. Panaudojus H. Lainuivero ir D. Berko linearizacijos metod, apskaiiuojama KM ir Vmaks. inant fermento koncentracij reakcijos miinyje (-galaktozidazs molekulin mas 201000), randama fermentins reakcijos katalitin konstanta kkat.

Atsiskaitymas
fermentins reakcijos greiio priklausomyb nuo substrato koncentracijos; Michaelio ir Menten (Michaelio-Menten)lygtis; KM fizikin prasm.

Literatra 1. Price, N. C.; Stevens, L. Fundamentals of enzymology. Oxford University Press, 1999. 2. Palmer, T. Understanding enzymes. Ellis Horwood Limited, 1985. 3. Glema, A. Fermentai. Vilnius, 1987.

243

3. -galaktozidazs imobilizacija. Baltymo ir aktyvumo nustatymas liekamajame imobilizacijos tirpale


Darbo tikslas Imobilizuoti -galaktozidaz ant aminosilochromo, imatuoti imobilizuotojo -galaktozidazs preparato ir liekamojo tirpalo aktyvum. Tyrimo objektas -galaktozidaz i Kluyveromyces fragilis. -galaktozidazs imobilizacij ant aminosilochromo galima urayti schematikai:
E

NH2

O H

O C

NH2

CH2 3 C
H

N CH

CH2 3

C
H

N CH

CH2 3

CH

Darbo priemons Spektrofotometras, termostatas, verdanio vandens vonia, mikropipets, purtytuvas mgintuvliams, termostatuojamosios 25 mL kiuvets. Reagentai 1. 2. 3. 4. 5. 6. -galaktozidazs preparatas Lactozym 3000L. 12,5 % glutaro aldehido tirpalas 0,05 M boratiniame buferyje pH 9,2. 208 mM laktozs tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas. Bradfordo reagentas. 0,1 M kalio fosfatinis buferis pH 6,5.

Darbo eiga -galaktozidazs imobilizacija. 2 g aminosilochromo upilama 40 mL 12,5 % glutaro aldehido tirpalu 0,05 M boratiniame buferyje pH 9,2; vakuumuojama ir purtoma 30 min. kambario temperatroje. Paskui silochromas plaunamas 100 mL H2O ir 100 mL 0,1 M kalio fosfatinio buferio pH 6,5. Imobilizacijai atsveriama 300 mg drgno aktyvuoto aminosilochromo, upilama 0,5 mL -galaktozidazs preparato Lactozym 3000L (kurio aktyvumas buvo matuotas pirmame laboratoriniame darbe) ir 0,5 mL 0,1 M kalio fosfatinio buferio pH 6,5. Reakcija vykdoma 1 val., purtant kambario temperatroje. Vliau aminosilochromas nufiltruojamas, naudojant stiklo filtr, praplaunamas 100 mL 0,1 M kalio fosfatinio buferio pH 6,5 ir nustatomas imobilizuotojo preparato aktyvumas. Filtrate matuojamas liekamasis -galaktozidazs aktyvumas ir nustatoma baltymo koncentracija.

244

Imobilizuotosios -galaktozidazs preparato aktyvumo nustatymas termostatuojam 37 C temperatroje kiuvet pilama 5 mL 208 mM laktozs tirpalo, paildoma 5 min., suberiama 50 mg drgno imobilizuotos -galaktozidazs preparato ir inkubuojama maiant 30 min. Paskui reakcijos miinys filtruojamas ir matuojamas susidariusios gliukozs kiekis. Imama 0,5 mL 400 kart skiesto reakcijos miinio, pilama 3 mL gliukozooksidazinio-peroksidazinio reagento ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Optinis tankis matuojamas, esant 460 nm bangos ilgiui. Kontrolei: 0,5 mL 0,1 M kalio fosfatinio buferio pH 6,5, 3 mL reagento ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje (gliukozs kalibracin kreiv ruoia laborantas). Apskaiiuojamas imobilizuotojo -galaktozidazs preparato aktyvumas (mol x min.-1 x g-1preparato). Baltymo ir -galaktozidazinio aktyvumo nustatymas liekamajame imobilizacijos tirpale Baltymui nustatyti liekamasis imobilizacijos tirpalas skiediamas 10 kart 0,1 M kalio fosfatiniu buferiu pH 6,5. 0,2 mL skiesto tirpalo sumaioma su 2,5 mL Bradfordo reagento ir po 5 min. matuojamas optinis tankis, esant bangos ilgiui 595 nm. Apskaiiuojama baltymo koncentracija (baltymo kalibracin kreiv ruoia laborantas). -galaktozidazinio aktyvumui nustatyti liekamasis imobilizacijos tirpalas skiediamas 20 000 kart 0,1 M kalio fosfatiniu buferiu pH 6,5. Tada mgintuvl pilama 2 mL 208 mM lakozs tirpalo, paildoma 5 min. 37 C temperatroje, supilamas 1 mL skiesto liekamojo tirpalo, sumaioma ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Reakcija sustabdoma statant mgintuvl su reakcijos miiniu verdanio vandens voni 5 min. 1 mL 20 000 kart skiesto liekamojo tirpalo pakaitinama 5 min. verdanio vandens vonioje, pilama 208 mM laktozs tirpalo ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Susidariusiai gliukozei pamatuoti imama 0,5 mL reakcijos miinio, sumaioma su 3 mL gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Kontrolei: 0,5 mL reakcijos miinio i kontrolinio bandymo su neaktyviu fermentu, 3 mL reagento inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Optinis tankis matuojamas, esant bangos ilgiui 460 nm (gliukozs kalibracin kreiv ruoia laborantas). Apskaiiuojamas -galaktozidazs aktyvumas liekamajame tirpale (mol x min.-1 x mL-1). Imatav imobilizuotos -galaktozidazs preparato aktyvum ir -galaktozidazin aktyvum liekamajame tirpale, sudarykite aktyvumo balans. Atsiskaitymas ferment imobilizacija. Imobilizavimo metodai; kovalentinei ferment imobilizacijai naudojami neikliai; j aktyvacija.

Literatra 1. , . . , 1981. 2. Palmer, T. Understanding enzymes. Ellis Horwood Limited, 1985.

245

4. Tirpiosios ir imobilizuotosios -galaktozidazs i Kluyveromyces fragilis pH optimumo nustatymas


Darbo tikslas Nustatyti tirpios ir imobilizuotos -galaktozidazs pH optimum laktozs hidrolizs reakcijoje. Tyrimo objektas Tirpioji ir imobilizuotoji ant aminosilochromo -galaktozidaz i Kluyveromyces fragilis. Darbo priemons Spektrofotometras, termostatas, verdanio vandens vonia, mikropipets, termostatuojamosios 25 mL kiuvets. Reagentai 1. -galaktozidazs preparatas Lactozym 3000L. 2. Imobilizuotosios ant aminosilochromo -galaktozidazs preparatas. 3. 208 mM laktozs tirpalas 0,1 M acetatiniame buferyje pH 5,5 ir 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 ir 8,0. 4. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas. Darbo eiga Tirpiosios -galaktozidazs pH optimumo nustatymas. Tirpiosios -galaktozidazs pH optimumui nustatyti yra imatuojamas laktozs hidrolizs reakcijos greitis, esant pH reikmms: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 ir 8,0. Tam tikslui mgintuvl pilama 2 mL 208 mM laktozs tirpalo atitinkamos reikms pH buferyje, paildoma 5 min. 37 C temperatroje, paskui supilamas 1 mL 80 000 kart skiesto -galaktozidazs tirpalo, sumaioma ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Reakcija sustabdoma statant mgintuvl su reakcijos miiniu verdanio vandens voni 5 min. Lygiagreiai paruoiamas kontrolinis bandymas su neaktyviu fermentu. 1 mL 80 000 kart skiesto -galaktozidazs tirpalo kaitinama verdanio vandens vonioje 5 min. Paskui pilama 2 mL 208 mM laktozs tirpalo atitinkamos pH reikms buferyje ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Hidrolizs reakcijos metu susidariusi gliukoz matuojama gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu. Imama 0,5 mL reakcijos miinio, sumaioma su 3 mL io reagento ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Kontrolei: 0,5 mL reakcijos miinio i kontrolinio bandymo su neaktyviu fermentu, 3 mL reagento, inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Optinis tankis matuojamas, esant bangos ilgiui 460 nm. Apskaiiuojamas fermentins reakcijos greitis (M x min.-1) (gliukozs kalibracin kreiv ruoia laborantas). Briamas reakcijos greiio priklausomybs nuo pH grafikas, ordinai ayje atidedant reakcijos greit, o abscisi pH. Imobilizuotosios -galaktozidazs pH optimumo nustatymas Imobilizuotosios -galaktozidazs pH optimumui nustatyti imatuojamas laktozs hidrolizs reakcijos greitis, esant pH reikmms: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 ir 8,0. termostatuojam 37 C temperatroje kiuvet pilama 5 mL 208 mM laktozs tirpalo atitinkamos pH reikms buferyje, paildoma 5 min, suberiama 50 mg imobilizuotosios -galaktozidazs preparato ir inkubuojama maiant 30 min. Paskui reakcijos miinys filtruojamas ir matuojamas susidariusios gliukozs kiekis. Imama 0,5 mL 400 kart skiesto reakcijos miinio, pilama 3 mL gliukozooksidazinio-peroksidazinio reagento ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Kontrolei: 0,5 mL 400 kart skiesto 208 mM laktozs tirpalo atitinkamos pH reikms buferyje, 3 mL reagento ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Optinis tankis matuojamas, esant 460 nm bangos

246

ilgiui. Apskaiiuojamas fermentins reakcijos greitis (M x min.-1) ir -galaktozidazs reakcijos greiio priklausomybs nuo pH grafikas. Palyginami tirpiajai ir imobilizuotajai -galaktozidazei gauti pH optimumai. Atsiskaitymas pH taka fermentins reakcijos greiiui. pH optimumas; imobilizuotj ferment katalitins reakcijos priklausomyb nuo pH.

briamas

imobilizuotos

Literatra 1. Price, N. C.; Stevens, L. Fundamentals of enzymology. Oxford University Press, 1999. 2. Glema, A. Fermentai. Vilnius, 1987. 3. Hartmeier, W. Imobilized biocatalysts. Springer. Berlin, 1986.

247

5. Tirpiosios ir imobilizuotosios -galaktozidazs i Kluyveromyces fragilis katalitinio aktyvumo priklausomyb nuo temperatros
Darbo tikslas Nustatyti tirpiosios ir imobilizuotosios -galaktozidazs i Kluyveromyces fragilis katalitinio aktyvumo priklausomyb nuo temperatros laktozs hidrolizs reakcijoje. Tyrimo objektas Tirpioji ir imobilizuotoji ant aminosilochromo -galaktozidaz i Kluyveromyces fragilis. Darbo priemons Spektrofotometras, termostatas, verdanio vandens vonia, mikropipets, termostatuojamosios 25 mL kiuvets. Reagentai 1. 2. 3. 4. -galaktozidazs preparatas Lactozym 3000L. Imobilizuotosios ant aminosilochromo -galaktozidazs preparatas. 208 mM laktozs tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas.

Darbo eiga Tirpiosios -galaktozidazs katalitinio aktyvumo priklausomyb nuo temperatros. Nustatomas laktozs hidrolizs reakcijos greitis, esant 25 C, 30 C, 35 C; 40 C, 45 C ir 50 C temperatroms. Tam tikslui mgintuvl pilama 2 mL 208 mM laktozs tirpalo 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5, paildoma 5 min. atitinkamoje temperatroje, paskui supilamas 1 mL 80 000 kart skiesto -galaktozidazs tirpalo, sumaioma ir inkubuojama 30 min. atitinkamoje temperatroje. Reakcija sustabdoma statant mgintuvl su reakcijos miiniu verdanio vandens voni 5 min. Lygiagreiai paruoiamas kontrolinis bandymas su neaktyviu fermentu. 1 mL 80 000 kart skiesto -galaktozidazs tirpalo kaitinama verdanio vandens vonioje 5 min. Paskui pilama 2 mL 208 mM laktozs tirpalo ir inkubuojama 30 min. atitinkamoje temperatroje. Hidrolizs reakcijos metu susidariusi gliukoz matuojama gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu. Imama 0,5 mL reakcijos miinio, sumaioma su 3 mL io reagento ir inkubuojama 37 C temperatroje. Kontrolei: 0,5 mL reakcijos miinio i kontrolinio bandymo su su neaktyviu fermentu, 3 mL reagento, inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Optinis tankis matuojamas, esant bangos ilgiui 460 nm (gliukozs kalibracin ruoia laborantas). Apskaiiuojamas reakcijos greitis (M x s-1) atitinkamose temperatrose ir briamas reakcijos greiio priklausomybs nuo temperatros grafikas, ordinai ayje atidedant reakcijos greit, o abscisi temperatr. Aktyvacijos energijai apskaiiuoti briamas grafikas Arenijuso koordinatse. Imobilizuotosios -galaktozidazs katalitinio aktyvumo priklausomyb nuo temperatros Nustatomas laktozs hidrolizs reakcijos greitis, esant 25 C, 30 C, 35 C, 40 C, 45 C ir 50 C temperatroms. Tam tikslui atitinkamoje temperatroje termostatuojam kiuvet pilama 5 mL 208 mM laktozs tirpalo 0,1 M fosfatiniame buferyje pH 6,5, paildoma 5 min., suberiama 50 mg imobilizuotos -galaktozidazs preparato ir inkubuojama maiant 30 min. Paskui reakcijos miinys filtruojamas ir matuojamas susidariusios gliukozs kiekis. Imama 0,5 mL skiesto reakcijos miinio, pilama 3 mL gliukozooksidazinio-peroksidazinio reagento ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Kontrolei: 2 mL laktozs tirpalo, inkubuoto atitinkamoje temperatroje 30 min., skiediama 400 kart. Paskui 0,5 mL tirpalo

248

sumaioma su 3 mL gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu ir inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Optinis tankis matuojamas, esant bangos ilgiui 460 nm. Apskaiiuojamas reakcijos greitis (M x s-1) atitinkamose temperatrose ir briamas imobilizuotosios -galaktozidazs reakcijos greiio priklausomybs nuo temperatros grafikas, ordinai ayje atidedant reakcijos greit, o abscisi temperatr. Aktyvacijos energijai apskaiiuoti briamas grafikas Arenijuso koordinatse. Atsiskaitymas procesai, lemiantys katalitinio aktyvumo priklausomybs nuo temperatros pobd; temperatrinio optimumo svoka; Arenijuso lygtis.

Literatra 1. Price, N. C.; Stevens L. Fundamentals of enzymology. Oxford University Press, 1999. 2. Glema, A. Fermentai. Vilnius, 1987. 3. Hartmeier, W. Imobilized biocatalysts. Springer. Berlin, 1986.

249

Biotechnologini maisto produkt technologijos pagrindai


Pratybos Rimantas Garuckas

1. aliavos, j technologinis paruoimas, naudojami renginiai, j veikimo principas


Darbo tikslas Susipainti su alaus gamyboje naudojamomis aliavomis, j technologiniu paruoimu, naudojamais renginiais bei j veikimo principu. Tyrimo objektas aliav paruoimo skyrius ir salyklo gamybos cechas. Naudojamos priemons ir renginiai: orinis separatorius, cilindrinis trijeris, kgio formos mirkymo renginys, salyklid su judania lysve, horizantalioji dviaukt diovykla, daigeli numuimo maina. Darbo eiga 1.1. aliavos Alaus pramonje naudojamas salyklas gaminamas i miei. Alaus gamybai naudojami dvieiliai mieiai, nes j grdai vienodesnio dydio ir formos. Sausoji grdo mediaga sudaryta i organini ir neorganini jungini. Organiniai junginiai: angliavandeniai, baltymai, riebalai, polifenoliai, organins rgtys ir vitaminai. Neorganins mediagos: P, S, K, Na, Mg, Ca, C, Cl. Grduose esantys angliavandeniai: monosacharidai (gliukoz, fruktoz), disacharidai (sacharoz, maltoz), trisacharidai (kinoz), polisacharidai (krakmolas, celiulioz ir pektinins mediagos). Pagrind sudaro krakmolas, kuris ir randamas endosperme grdeli pavidalu. Mieiuose yra amilolitini, proteolitini ir celiulitini ferment. Grdo sudtyje yra ir vitamin: B1, B2, B6, PP, E, H, folins rgties ir karotino. Salyklo gamybai skirti mieiai turi bti stambs, turti daug krakmolo ir maai baltym, subrend, be priemai, viesiai gelsvos spalvos (1 lent.)
1 lentel. Miei charakteristika

Rodikliai Spalva Kvapas Smulki grd kiekis, % iuklini priemai kiekis, %

I klass mieiai viesiai geltona, nepatamsjusi Be nemalonaus, paalinio pelsi kvapo 5 1

II klass mieiai viesiai geltona, nepatamsjusi Be nemalonaus, paalinio pelsi kvapo 7 2

Salyklas nustatytos temperatros ir drgnumo dirbtiniu bdu sudaiginti grdai. Alaus pramonje tai yra pagrindinis pusfabrikatis. Salykle susikaupia amilolitini, proteolitini ir celiulitini ferment. Veikiant amilolitiniams fermentams, augalins aliavos krakmolas hidrolizuojasi ir virsta maltoze. Salyklas turi bti viesiai geltonos spalvos, saldaus skonio. Paalinis kvapas ir skonis neleidiami. Salyklas turi bti varus, be priemai, suskaldyt grd kiekis ne didesnis nei 0,5 %. Chemin salyklo sudtis: krakmolas 57 %, redukuojantieji cukrs 4 %, sacharoz 5,5 %, tirps pentozanai 1 %, netirps pentozanai ir heksozanai 9 proc., celiulioz 5,5 proc., riebalai 2,5 proc., mineralins mediagos 2,5 proc. Salyklas bna dviej tip: viesusis ir tamsusis.

250

Grdai Principinis grd valymas Grd saugojimas Antrinis grd valymas Grd riavimas I ris
H20 Dezinfekcijos priemons

Priemaios

Priemaios

II ris Plovimas ir dezinfekcija H20 Nuoplovos

H20 Suspaustas oras Kondicionuotas oras Kartas oras

Mirkymas Daiginimas alio salyklo diovinimas Daig atskyrimas Sauso salyklo ilaikymas Salyklas gamyb 1 pav. Principin salyklo gamybos schema

H 20 Oras Oras Daigai

1.2. Miei valymas ir riavimas gamykl atveami mieiai turi visoki priemai ir yra netinkami alaus gamybai, nes priemaios ne tik blogina grd kokyb, bet ir maina sandliavimo laik. Tokie mieiai prie sandliuojant yra valomi (1 pav.). Valymo metu pagrindin kultra (mieiai) yra ivaloma nuo priemai. Valymas atliekamas oriniame separatoriuje. Elevatoriumi grdai i silos patenka orin separatori, kur sveiki grdai askiriami nuo dulki, lukt ir lengv IIIIV ries grd. Orinis separatorius atskiria grdus ne tik pagal fizinius duomenis, bet ir aerodinamines savybes (2 pav.).

251

2 pav. Orinio separatoriaus schema. 1 stovas; 2 sietinis korpusas; 3 primimo sietas; 4 riavimo sietas, 5 posietinis sietas; 6 primimo dut; 7 sraigtas; 8 sklends grd ileidimui reguliuoti; 9 smagratis; 10, 11 nusdinimo kamer skyriai; 12, 13 nusdinimo kamer votuvai; 14 ments priemaioms paalinti; 15 ventiliatoriai; 16, 17 oro kanalai, 18 perdavimo renginys

Grdai patenka dut, kur sraigtu paskirstomi po vis plot. Toliau jie patenka kanal, kur veikiant stipriai oro srovei yra apvalomi nuo lengv daleli (dulki, iaud). Grd srov i kanalo patenka ant pirmojo virutinio sieto, kurio skylui skersmuo 1012 mm. ia atskiriamos stambiosios priemaios (akmenukai, ems gabaliukai). Vliau ant antrojo (pagrindinio) riuojamojo sieto, kurio skylui skersmuo 45 mm. ia atskiria likusias priemaias, kurios stambesns u grdus. Smulkias priemaias ir sml paalina treiasis sietas, kurio skylui skersmuo (1,52 mm), o vars grdai i separatoriaus oro kanale antr kart prapuiami stipria oro srove. Taip paalinamos dulks bei lengvos priemaios, susidariusios separatoriaus viduje jo darbo metu. Lengvos priemaios, tokio pat dydio kaip grdai, ant siet yra neatskiriamos, o paalinamos tik oro srove. I separatoriaus grdai nukreipiami ant magnetins ploktumos, kur paalinamos visos metalins priemaios. Separatoriaus veikimo efektyvum rodo grd kiekis (tonomis) per laiko vienet (valand). Grd skirstymas pagal grdo dyd yra vadinamas riavimu. Tiktai vienodo dydio miei grdai pasiekia vienod drgnumo lyg ir tolygiai vystosi daiginant. Miei riavimas vyksta trijeryje, kur jie suriuojami keturias ris. I ir II rys tinka gamybai, o III ir IV rys naudojamos kaip atliekos kiams (3 pav.).

252

3 pav. Cilindrinis trijeris: 1 latakas grdams tiekti; 2 sraigto mentel; 3 gramtukas; 4 trijerio pavirius; 5 sraigtas; 6 rankenl; 7 velenas

Trijeris susideda i plieninio cilindro su vidiniu akytuoju paviriumi. Sukantis cilindrui, trumpi grdai gerai telpa akutes, o ilgi netelpa akutes ir pakyla emesn aukt, todl ilgi grdai slysta vidiniu paviriumi ir ltai juda cilindro gal, kur ir ieina i trijerio. Mai grdai i akui ikris tik tuo atveju, jei j svoris bus didesnis nei icentrins jgos. Grd tiekimas turi bti nepertraukiamas, taiau negalimos ir perkrovos, nes bus prastas riavimas. vieiai nuimti grdai prastai dygsta, o tai labai svarbu salyklo gamybai, todl jie turi bti ilaikomi 68 savaites, nes per t laik jie galutinai subrsta. viei mieiai negali bti naudojami gamyboje, nes nra visai prinok. Tokie mieiai maiau daigs, todl grdai sandliuojami apie 2 mnesius silosuose. 1.3. Miei mirkymas Pagrindinis mirkymo tikslas yra suaktyvinti grd gyvybinius procesus. Prasiskverbus reikiamam kiekiui vandens grd, suaktyvja biocheminiai procesai, susij su gemalo gyvybine veikla, sustiprja kvpavimas ir aktyvuojasi fermentai. Kad mieiai gerai dygt, tinkamiausias imirkymo laipsnis yra 4245 %. drgnumo. Gyvybingumo procesai grde atsiranda kai j drgnumas pasiekia 30 %. Kai 38 % drgnumas, grdas greitai dygsta, o kai 4448 %, pradeda kauptis fermentai ir gerai tirpsta endospermas. Mirkant grd tris padidja 3540 %. Keiiasi j fizins savybs. Tvirtas ir trapus grdas po mirkymo tampa minktas ir elastingas. Grdo imirkymas vyksta nevienodai: pradioje palyginti greitai, o vliau procesas sultja. Mirkymo trukm priklauso nuo daugybs veiksni: vandens temperatros ir kietumo, grd dydio. Kuo vandens temperatra yra auktesn, tuo spariau vyksta mirkymas. Optimaliausia mirkymui vandens temperatra 1012 C. Grd aeracija vienas i svarbiausi veiksni, utikrinani ger grd dygim. Trkstant deguonies, prasideda spiritinis rgimas, kurio produktai trukdo grd gyvybinei veiklai. Daniausiai naudojami kubilo formos mirkymo renginiai. Mirkymo kubilo paruoimas. Kiekvien katr prie upilant mirkymo kubil mieiais, j btina ivalyti, iplauti ir idezinfekuoti (4 pav.). Prie kubilo plovim i jo paalinama angliargt (apipurkiant vandeniu i arnos). Paskui kubilas plaunamas altu vandeniu ir dezinfekuojamas. Dezinfekcijai naudojamos chlorkalks.

253

Itepus kubil dezinfekciniu tirpalu, palaikoma 1 val. ir skalaujama altu vandeniu. Miei dezinfekcija ir mirkymas. Mirkymo pradioje mieiai dezinfekuojami. Dezinfekcijai naudojama: chlorkalks 0,3 kg vienai tonai miei arba kalio permanganato (KMnO4) 1015 g vienam m vandens. Dezinfekuojant chlorkalkmis 1,5 kg chlorkalki itirpinama 10 l vandens. mirkymo kubil prileidiama 0,4 jo trio vandens, supilamas perkotas chlorkalki tirpalas ir puiant or 5 min. maioma. Tada supilami grdai. Dezinfekcinis tirpalas turi apsemti grdus (neapsemiant pridedama vandens), intensyviai imaioma oru ir paliekama 1,52 val. ramybje. Nuleidus nevar vanden, kubilas i apaios pripildomas vieio vandens, imaioma, nuimamos nuoplovos. Mieiai mirkomi nepertraukiamoje vandens ir oro srovje (kubilo viruje nuolat teka vanduo, oro aeratoriais tolygiai per vis kubilo paviri tiekiamas oras). Mirkymo trukm 32 val. Vandens temperatra 910 C. Visiko imirkymo laipsniui (4345 %) pasiekti grdai dar drkinami daiginimo lysvse.

4 pav. Mirkymo renginys: 1 centrinis vamzdis; 2 Segnerio ratas; 3 vamzdelis suspausto oro; 4 aeratorius, 5 grotels; 6 nuleidiamasis vamzdis

1.4. Salyklo daiginimas Daiginimo metu vyksta sudtingi morfologiniai ir biocheminiai pokyiai. Grdo dygimo metu pasirodo gemalin aknel, kuriai susprogus atsiranda keli daigeliai. Daiginimo intensyvumui didel tak turi aeracija. Esant nepakankamai aeracijai, grdai liau dygsta, bet, esant per dideliam deguonies kiekiui, spariai vyksta kvpavimas ir sunaudojama daug maistini mediag. Ferment aktyvacija. Sausame grde didioji dalis ferment yra neaktyvs. Daiginant grdus, proteolitiniai fermentai suskaldo baltymus ir fermentai pereina laisv aktyvi form. Ferment aktyvumas diovinant salykl yra isaugomas.

254

Grd kvpavimas. Dygstaniame grde, veikiant fermentams, vyksta didels molekulins mass jungini skaldymas. Dygim lydi intensyvus kvpavimas. Pagrindin kvpavimo mediaga yra angliavandeniai, nors kvpavimo procese gali dalyvauti rgtys, riebalai ir azotins mediagos. Aerobinmis slygomis maltoz virsta gliukoze, o anaerobinmis etilo spiritu. Angliavandeni skilimas. Nesudygusiame grde pagrindin dalis angliavandeni yra netirps. Nedidelis kiekis tirpi cukr sunaudojamas dygimo pradioje, o vliau maistins mediagos gaunamos skaldant didels molekulins mass junginius. -amilaz skaldo krakmol dekstrinus, kurios toliau veikia -amilazs. Taip krakmolas tampa oligosacharid, dekstrin ir monosacharid miiniu. vieiai sudygusi miei cukr koncentracija yra 3,5 karto didesn. pH kitimas. Miei pH yra apie 6, o salyklo apie 6,25. Taiau ie rodikliai keiiasi skaidant angliavandenius, baltymines mediagas ir organines rgtis. Alaus darykloje Tauras salyklo daiginimas vykdo salyklidse su judanija lysve (5 pav.).

5 pav. Salyklid su judanij lysve: 1 miei daiginimo d; 2 sietas; 3 mieiai; 4 posietins zonos; 5 vartytuvas; 6 siet valymo zona; 7 drkinimo kubilas; 8 ikrovimo sraigtas; 9 kondicionuojamas oras; 10 orinis kanalas

I mirkymo kubil mieiai hidrauliniu siurbliu ipumpuojami daiginimo lysv. vieiai ipumpuoti grdai 1,52 paras apipurkiami i arnos vandeniu (vis laik turi bti drgni). Dygimo metu temperatra palaikoma 1216 C. Judaniojoje lysvje mieiai kauiniu vartytuvu vartomi 2 kartus per par (kas 12 val.). Dygimo metu temperatr palaiko kondicionuojamas oras. kondicionavimo kamer ventiliatoriais tiekiamas lauko arba patalpos oras, taip pat altas ar iltas vanduo. Daiginimo patalpoje palaikoma oro drgm. Miei dygimo trukm 7 paros. 1.5. alio salyklo diovinimas alias salyklas yra lengvai paeidiamas, todl prie laikym j reikia diovinti. Turi bti sustabdytos grde vykstanios chemins-biologins reakcijos. Be to, diovinimo uduotis yra alio salyklo kvapo paalinimas ir suteikimas aromato, bdingo kiekvienos ries salyklui. Diovinimo metu vyksta fizikiniai ir cheminiai pokyiai. Tamsiojo ir viesiojo salyklo skirtumas atsiranda keiiant drgms paalinimo greit, laik ir diovinimo temperatr. Fizikiniai pokyiai lemia grdo drgnum, tr, mas ir spalv. Dehidratavimo proceso metu iskiriamos dvi stadijos: vytinimo ir visiko idiovinimo. Mirkymo ir daiginimo metu mieio grdas padidja ir pasidaro stangrus. Dl tirpumo grdo viduje susidaro maos tutumos, kurios teisingai atliekant diovinim turi ilikti. Dl ios prieasties salyklo tris 1624 % didesnis nei mieio grdo. K tik sudygs ir ilaikytas salyklas nenaudojamas alui gaminti, nes neturi aromato, daani mediag ir yra drgnas. Tam salyklas yra diovinamas. Diovinimo temperatra keliama nuo 2025 C iki 8085 C. Tuo metu salyklo daigeliai tampa traps ir lengvai paalinami. Diovinimas susideda i 2 dali: H2O alinimo (I stadija) ir sausojo salyklo kaitinimo (II stadija). I stadijoje dar vyksta fermentiniai procesai. ios

255

stadijos metu grd drgm nukrenta iki 8 %, o II stadijoje iki 1,52 %. Diovinimo metu salyklas gauna spalv, kvap ir aromat. I stadijoje susikaupia cukrs, amino rgtys, tirps baltymai. II stadijoje, padidjus temperatrai, gemalas sta ir ferment aktyvumas sumaja. Diovinimo metu skiriami 3 procesai: fiziologinis, cheminis, fermentinis. Fiziologinio proceso metu salyklas kaista nuo 20 iki 45 C. Gemalas ir daigeliai auga toliau, vyksta fermentiniai procesai, salyklo drgnumas sumaja iki 30 %. Fermentinio proceso metu temperatra nuo 45 C pakeliama iki 70 C ir gemalo augimas bei kvpavimas sustoja, o fermentinai procesai stiprja, nes hidrolitini ferment optimali veikimo temperatra 4560 C. Cheminio proceso metu temperatra didinama iki 105 C. 75 C temperatroje fermentins reakcijos baigiasi. io proceso metu susiformuoja aromatas, suyra fermentai. Amino ir cukr reakcijos metu susidaro aldehidai (acetoaldehidas, metilglioksalis), kurie suteikia salyklui malon skon ir aromat. Galutiniai ios reakcijos produktai suteikia salyklui spalv. Drgm 3,85,8 %, spalva (mL 0,1 N jodo tirpalo) 0,160,3, pH 5,65,8. Diovinimas vyksta horizontalioje dviauktje diovykloje (6 pav.). Auktame pastate yra 2 horizontalios grotels (4, 6). vieias salyklas lygiu sluoksniu paskleidiamas ant virutini groteli ir ia paalinama didiausia vandens dalis. Tada salyklas perkeliamas ant apatini groteli, kur galutinai idiovinamas ir susiformuoja spalva, aromatas, skonis. Apatiniame diovyklos aukte yra peius (9). Kartos dujos i peiaus tiekiamos kalorifer, kur oras kaitinamas ir i ia leidiamas per salyklo sluoksnius apatiniame ir virutiniame aukte. Karto oro sraut reguliuoja votuvai. Ant groteli salyklas periodikai vartomas. I virutini groteli apatines salyklas perneamas per virutinse grotelse esanias angas. I apatini groteli salyklas ikraunamas kastuvu. Karto oro judjimas i apaios vir vyksta dl traukos, todl salyklo sluoksnis virutinse grotelse neturi viryti 25 cm. Tam, kad padidint trauk (ir virutini groteli salyklo stor), traukos vamzdyje montuojami siurbiamieji ventiliatoriai.

256

6 pav. Horizontalioji dviaukt diovykla: 1 imetimo vamzdis; 2 ventiliatorius; 3 ikrovimo vamzdis; 4, 6 horizontaliosios grotels; 5,7 vertikalieji kanalai; 8 votuvai; 9 peius; 10, 11, 12, 13 kaloriferiai

1.6. Sausojo salyklo apdorojimas ir laikymas Salyklo daigeliai turi kart skon, todl alaus gamybai naudoti netinka. Daigeliai alinami i karto po diovinimo. Daigeli numuimo maina yra bgnas, kurio viduje yra sietai ir besisukanios ments (7 pav.).

257

7 pav. Daigeli numuimo maina: 1 pakraunamasis sraigtas; 2 ments; 3 sraigtas; 4 ventiliatorius; 5 sietinis bgnas

Salyklas su daigeliais tiekiamas bgno vid, kur ments suteikia salyklui sukamj judes. Salyklo daigeliai lenda sieto akutes ir, besisukant bgnui daigeliai nulta. Dulks isiurbiamos ventiliatoriumi, o daigeliai paalinami sraigtu. Ivalytas salyklas sveriamas ir veamas sandlius. Salyklo laikymo temperatra neturi viryti 20 C. Prie tiekiant gamyb salyklas ilaikomas 30 par. Tuo metu pasibaigia visi procesai. Neilaikytas salyklas yra trapus ir malant susidaro daug smulki kruopeli bei maai milt. Per 45 ilaikymo savaites salyklo drgnumas padidja nuo 34 % iki 56 %. vieiai idiovintas salyklas saugomas 34 m storio sluoksniu. gamyb tiekiamas salyklas turi bti varus, be daigeli, priemai ir pelsi. Spalva vyrauja nuo viesiai geltonos iki geltonos. Salyklo kvapas turi bti varus ir aromatingas, o skonis saldokas. Atsiskaitymas 1. 1 2 3 4 5 aliavos parinkimas. Miei klasifikavimas. Miei imirkymas. Salyklo daiginimas. alio salyklo diovinimas. Sausojo salyklo apdorojimas ir laikymas.

Literatra 1. , . . . Moc: , 1985. 146 c. 2. , . . . Moc: , 1964. 516 c. 3. , . . . Moc: , 1974. 620 c. 4. LST 44:1993. Alus. Bendrosios technins slygos. Lietuvos standartizacijos tarnyba. 1997. 5 p. 5. Puslapis alaus mgjams-Internet: http://www.alutis.lt

258

2. Alaus misos paruoimo technologija


Darbo tikslas Susipainti su alaus misos paruoimo ranga, gamybos technologijomis ir reimais. Tyrimo objektas Alaus virimo skyrius. Naudojamos priemons ir renginiai Miei malimo malnas, alaus virimo katilas, mentalo umaiymo katilas, filtravimo katilas, ilumokaitis. Darbo eigos technologijos apraymas Svarbiausias procesas alaus gamyboje yra cukraus, esanio misoje fermentacija tam, kad susidaryt alkoholis ir anglies dioksidas. Pradiniai netirps komponentai salykle turi bti paveriami tirpius produktus ir turi bti gaunami ypa tirps fermentuojamieji cukrs. i jungini susidarymas ir tirpimas yra misos gamybos tikslas. Alaus misos paruoimo technologinis procesas apima ias operacijas: salyklo smulkinim, mentalo paruoim, mentalo filtravim, misos virim ir misos auinim (1 pav.).

1 pav. Alaus misos gamybos technologin schema

Salyklas i salyklo laikymo bunkerio (1) perduodamas grd maln (2), kuriame jis sumalamas iki tinkamo dydio. Salyklo grdai sumaiomi su vandeniu ( mentalo gavimas) ir paskirstomi du mentalo indus (3), mentalo perdirbimo indus (arba mentalo kubilus) ir mentalo virimo katil tam, kad bt gauta kuo daugiau tirpaus ekstrakto. Danai naudojamas ir kitas indas, papildomas virimo katilas. Skaidrinimo inde (mentalo atskyrimo inde) (4) tirpusis ekstraktas misoje yra atskiriamas nuo netirpij mediag, nuo saladino. Tada misa verdama su apyniais misos virimo katile (5). ioje stadijoje igaunamas kartus alaus

259

skonis. Misos virimo katile virimo pabaigoje nustatyta ekstrakto ieiga padeda kontroliuoti ekstrakto virimo proces. Karta misa yra atskiriama nuo nusodint daleli whirpooly (specialiame skuriniame kubile) (6) ar centrifugoje ir atauinama lkteliniame ilumokaityje (7), nes toliau fermentacija turi bti vykdoma emesnje temperatroje. [1] Salyklo smulkinimas. Tam, kad salykle esantys fermentai pereit mis, salyklas turi bti susmulkintas. Susmulkinus grdus, ekstraktyviosios mediagos tampa prieinamos vandeniui, taip pat pagreitja tirpumas ir kiti cheminiai bei fizikiniai procesai. Prie ekstrahuojant salyklas smulkinamas valcais. Gaunami tokie malimo produktai: luktai, stambios ir smulkios kruopos, miltai, pudra. Malimo kokyb labai priklauso nuo filtravimo bdo. Salyklas malamas smulkiam filtravimui filtravimo presuose ir rupiam filtravimui filtravimo bosuose. Luktai filtravimo bosuose sudaro pur natral filtr, ir misa geriau filtruojasi. Gerai sumaltame salykle yra 1215 % lukt, 4550 % kruop ir 35 % milt. Salyklas malamas dviej, keturi, penki ir ei velen valcais. ei velen valcus sudaro lygi velen poros ir rantyt velen pora. Pradioje salyklas rupiai smulkinamas pirmja lygi velen pora ir malinys sijojamas sijotuvje. Sietus praeina kruopels ir miltai, o luktai ir stambios kruopos malamos antrja lygi velen pora. Paskui malinys vl sijojamas sijotuvje, kur iskiriami luktai, miltai ir kruopos, kurios dar malamos rantyt velen pora. Tokiu bdu gaunama daug smulki kruopeli su luktu. Lik luktai naudojami filtravimui. Luktai filtruojant katiluose sudaro pur natral filtr, todl misa geriau filtruojasi. Gerai sumaltame salykle yra apie 1520 % lukt, 30 % milt ir 4550 % kruop. Mentalo paruoimas. Sumaiius smulkint salykl su vandeniu, gaunama vienalyt telos pavidalo mas, vadinama mentalu. I mentalo atskyrus netirpias dalis, gautas tirpalas vadinamas misa, o misos tirpiosios dalys ekstraktu. Ruoiant mental, i salyklo siekiama gauti kuo daugiau tam tikros sudties, atitinkanios alaus r, ekstrakto. Salykle yra nedaug (1015 %) vandenyje tirpi mediag: cukr, dalis baltym ir j skilimo produkt, iek tiek pentozan, pentozi, pektino, tanino ir karij rgi. Didioji ekstrakto dalis susidaro mentale, veikiant fermentams. Amilaz skaldo krakmol iki dekstrin ir maltozs, proteolitiniai fermentai baltymus veria tirpiomis azotinmis mediagomis, fitaz skaldo fitin inozit ir fosfatus. ie fermentaciniai procesai prasideda daiginant salykl ir daug greiiau vyksta mentale, esant palankiai temperatrai ir pakankamam vandens kiekiui. Mentale fermentaciniai procesai reguliuojami keiiant aplinkos temperatr, pH ir virimo metu inaktyvuojant fermentus. 4550 C temperatroje geriausiai skaldomos azotins mediagos. 50 C temperatra yra palankiausia aminorgtims kauptis, o 7075 C temperatroje greiiau skyla krakmolas, bet daugiau susidaro dekstrin negu 6065 C temperatroje. Taigi ilgiau ar trumpiau ilaikant mintj temperatr, reguliuojama baltymini mediag ir krakmolo hidroliz. Mentale svarbiausias fermentacinis procesas yra krakmolo hidroliz, veikiant amilazei. Amilolitiniai fermentai greitai veikia krakmolo kleister, kuris pradioje skystja, o paskui susicukrina dekstrinus ir maltoz. Miei krakmolas kleisterizuojasi 6080 C temperatroje, o skystja, veikiant fermentams ir esant optimaliam reimui 6570 C temperatrai ir pH 4,6. Sucukrinant krakmol, jo skilimas turi bti gilus, kad misoje nebt amilo- ir eritrodekstrin. Misoje turi bti ne tik maltozs, bet ir tam tikras kiekis achro-, maltodekstrin, nuo kuri alus yra klampesnis ir geresnio skonio. Santykis tarp maltozs ir dekstrin priklauso nuo - ir -amilazs veikimo. Optimalios slygos -amilazei veikti mentale yra 70 C temperatra ir pH 5,8, o -amilazei 6065 C temperatra ir pH 5,4. -amilaz inaktyvuojama 80 C temperatroje, o -amilaz 7075 C temperatroje. Misos ekstrakte nustatomas cukr ir necukr santykis. Cukr kiek sudaro maltoz, gliukoz ir kiti redukuojantieji cukrs, vadinami alia maltoze. Necukrums priskiriami dekstrinai ir visos organins bei neorganins mediagos, nepasiyminios redukuojaniomis savybmis. Mentale labai svarbus procesas yra baltymini mediag hidroliz. Baltym skylimo produktai turi takos alaus skoniui, putojimui ir laikymui. Jie taip pat reikalingi mielms maitinti. Mentale daugiausia veikia proteinazs, kurios baltymus veria albumozmis, pentonais ir polipeptidais. Peptidazs yra jautrios auktesnei temperatrai ir inaktyvuojamos diovinant salykl. Albumozs, peptonai, polipeptonai ir aminorgtys sudaro grup tirpi baltym, kurie verdant nekoaguliuoja. Mentale iek tiek tirpsta organiniai fosfatai. Veikiant fitazei jie i dalies skaldomi inozit ir neorganinius fosfatus. Nuo inozito miels labiau auga, dauginasi, o neorganiniai fosfatai reikalingi mielms maitinti. Be to, fosforas (fosforo rgties pavidalu) dalyvauja alkoholinio rgimo reakcijose. Ruoiant mental, susidaro melanoidinai, o dal jo virinant, susidaro karamel. Tada mentalo spalva sodrja. Raugins mediagos oksiduojasi flobafenus, turinius takos mentalo spalvai. Nuo tirpal

260

perjusi lukt raugini ir karij mediag blogja jo skonis. i mediag tirpumas esti didesnis, kai pH auktesnis. Dl to, pargtinus vanden iki pH 5,2 pieno rgtimi, gaunama viesesn, velnesnio skonio misa ir padidja ekstrakto ieiga, aktyviau veikiant amilolitiniams ir proteolitiniams fermentams. Mentalui ruoti yra daugelis bd. Jie visi skirstomi dvi grupes: upylimo (infuzinius) bdus ir virimo (dekokcinius) bdus. Ruoiant upylimo (infuziniais) bdais, visas mentalas ildomas ltai iki 75 C temperatros (nevirinant). Tai pagrindiniai bdai auktutinio rgimo alaus misai gaminti. Mentalas ildomas iki 4550 C temperatros, joje ilaikomas 1 h, paildomas iki 6263 C ir ilaikomas 3040 min., paskui paildomas iki 75 C temperatros, joje ilaikomas 1015 min. ir varomas filtravimo bosus. Mentalo paruoimo bosuose temperatra keliama 12 /min. greiiu. Ruoiant virimo (dekokciniais) bdais, dalis mentalo virinama, o paskui sumaioma su nevirintomis mentalo dalimis ir mentalo temperatra pakeliama iki 75 C. Gaminant mental iais bdais, j veikia ne tik fermentai, bet ir aukta temperatra (virinant). Tai klasikiniai bdai emutinio rgimo alaus misai gauti. Mentalui virti naudojamas mentalo bosas, virimo katilas, filtravimo bosas arba filtravimo presas ir misos virimo katilas. Yra trij, dviej ir vieno virimo bdas. Klasikinis mentalo paruoimo bdas yra trij virim. Mentalas pradedamas ruoti 35 C temperatroje. Viena treioji tirto mentalo dalis leidiama virimo katil, i lto ildoma iki virimo ir ilaikoma, esant optimaliai baltymo skilimo ir sucukrinimo temperatrai. Gaminant vies al, virinama 1015 min., o garinant tams 2030 min. Grinus mentalo bos virint mentalo dal, viso mentalo temperatra pakyla iki 5055 C. Tada vl 1/3 tirto mentalo leidiama virimo katil ir uvirinama. Grinus antr kart virint dal, mentalo mass temperatra pakyla iki 6265 C. Pagaliau, grinus trei kart pavirint mentalo dal, temperatra pakyla iki 75 C ir mentalas varomas filtravimo bosus. Pasiekus visos mass 70 C temperatr, suardomi fermentai. is bdas trunka ilgiausiai, bet daugiausia taikomas tamsiam alui gaminti ir blogiau daigintam salyklui perdirbti. Dviem bdais virtas mentalas pradedamas ruoti 50 C temperatroje. Po pirmojo virimo jo temperatra pakyla iki 6263 C, o po antrojo iki 75 C. Vieno virimo mentalo paruoimo bdas yra labai panaus upylimo bd. 35 C mentalas yra po truput kaitinamas iki 50C temperatros ir palaikomas, paskui visas mentalas pakaitinamas iki 64 C temperatros. Tada imama dalis mentalo ir varoma virimo katil. Grinus mental, jo temperatra siekia 75 C. is metodas labiausiai tinka gaminant vies al. Bet kuriuo bdu ruoiant mental, turi bti gaunama misa, kurioje bt pakankamas rauginam cukr kiekis [3]. Skaidrinimas. Saladinas susideda daugiausia i lukt, daig ir kit mediag. Misa yra naudojama tikalaus gamyboje, todl turi bti kaip galima geriau atskirta nuo saladino. is atskyrimo procesas vadinamas skaidrinimu (mentalo filtravimu). Skaidrinimo metu turi bti igauta kaip galima daugiau ekstrakto. Skaidrinimas yra filtracijos procesas, kurio metu saladinas vaidina filtro vaidmen. Skaidrinimas vyksta dviem stadijomis: pirmins misos itekjimas, saladino apipurkimas ekstrakto iplovimas (antrin misa). Misos isunkimas i saladino vadinamas pirmine misa. Kai misa isunkiama i saladino, pastarasis dar turi ekstrakto. Dl ekonomini sumetim is ekstraktas turi bti igautas. Todl, itekejus pirminei misai, saladinas yra apipurkiamas. Apipurkimas pamau praskiedia mis. Saladino sulaikytas ekstraktas iplaunamas kartu vandeniu. is procesas vadinamas apipurkimu. Maesnis itekanios misos kiekis po apipurkimo vadinamas antrine misa. Apipurkimui naudojamas vandens kiekis priklauso nuo pirmins misos kiekio, jos koncentracijos ir nuo norimos gauti koncentracijos virimo katile. Kuo didesnis apipurkimui naudojamo vandens kiekis praeina pro saladin, tuo didesnis vandens kiekis turi bti vl igarintas. Skaidrinimo temperatra yra labai svarbi. Filtruojamo mentalo temperatra turi bti 7577 C. Temperatrai didjant, maja skysio klampa. Vadinasi, skaidrinimas greiiausiai vyks 100 C temperatroje. Nors itirps liks krakmolas kiekvienu atveju iplaunamas i saladino apipurkimo metu, vlyvasis cukrinimas -amilaze gali vykti su slyga, kad nebuvo inaktyvuota didesne nei 78 C temperatra.

261

Kadangi -amilaz sunaikinama 80 C temperatroje, skaidrinimo metu btina palaikyti emesn temperatr. Apipurkimas vykdomas tol, kol pasiekiama norima koncentracija virimo katile. Maaprocentin misa, kuri iteka vliausiai, vadinama paskutine frakcija arba paskutine misa. Stipraus alaus atveju paskutin frakcija vis dar turi ekstrakto kiek apie 0,50,6 %. i paskutin frakcija kartais naudojama kaip vanduo mentalui sudaryti kitame alaus gamybos procese. Artjant prie paskutini frakcij igavim, didja pereinani tirpal nepageidaujam mediag (polifenoli ir karij mediag i lukt, silikato rgties ir t. t.) kiekiai. Norint gauti geros kokybs al, nereikt daug kart kartoti apipurkimo procedros: nors tai ir pagerina ieig, bet pablogina kokyb. Kai paskutins frakcijos vis dlto panaudojamos, jos turt bti apdorotos aktyvija anglimi tam, kad bt paalinti nepageidautini skonio komponentai. Ar bus naudojamos paskutins frakcijos, lemia ir ekonominiai rodikliai. Mentalas atskiriamas arba skaidrinimo (filtravimo) kubile, arba mentalo filtre (2 pav.). Skaidrinimo aparatas pagamintas i chromo nikelio plieno ir yra termikai izoliuotas. J sudaro cilindrins formos indas, kurio viduje yra dar vienas indas su sietiniu dugnu. Mentalas yra tiekiamas i apaios tam, kad bt palaikomas deguonies pasisavinimas. Apaioje yra 26 udaromi leidimo votuvai, kurie turi utikrinti ne didesn kaip 10 min. itekjimo laik.

1 Votuvo vamzdis; 2 CIP- ryys; 3 Hidraulins sistemos ryys; 4 Tiekimo anga; 5 Hermetikas dangtis; 6 Apipurkimo vandeniu ryys; 7 Hidraulinis cilindras; 8 Peili juostos;

2 pav. Filtravimo kubilas: 9 Saladino plokt; 17 Pagrindas; 10 Saladino votuvas; 18 Mentalo leidimas; 11 Mentalo leidimo 19 Filtravimo sistema; votuvas; 12 Pavara; 20 Filtravimo sistema; 13 Dvigubo dugno 21 Drumstos ir skaidrios misos siurblys; skalavimas; 14 Filtravimo vamzdiai; 22 Hidraulinis klimo ir nuleidimo renginys; 15 iediniai vamzdiai; 23 Mentalo siurblys; 16 Grotels; 24 Saladino konvejeris

262

Veiksm seka skaidrinimo kubile apima kelias stadijas: Oro ivarymas. Mentalo pumpavimas. Mentalo stingimas. Drumstos misos ipumpavimas atgal. Pirmosios misos itekjimas. Apipurkimas. Saladino paalinimas. Kad bt staigiai nuskaidrinama, dvigubas dugnas turi bti ivalytas nuo nevarum ir oro burbul, kurie trukdo filtruoti. Taigi kartas vanduo yra tiekiamas per dvigub dugn i apaios ir tuo pat metu j kaitindamas. Mentalas kaip galima greiiau tiekiamas skaidrinimo kubil ir ten paskirstomas. Nuo nevienodo saladino pasiskirstymo priklauso netolygi ekstrakcijos ir redukcijos ieiga. Todl pumpavimo metu turi bti palaikomas kaip galima maesnis greitis, tam, kad bt ivengta netolygaus isimaiymo. Pageidautina, kad mentalas bt pumpuojamas i apaios. Mentalo laikymo inde pumpavimo metu veikia maiytuvai, taigi mentalas yra imaiytas. pumpavus mental, saladinas stingsta iki 3040 cm aukio (iki 6070 cm, esant drgnam malimui), ir pirmoji misa susirenka vir jo. Taigi saladinas panaudojamas kaip natralus filtro sluoksnis. is procesas trunka 530 min. Stingstant saladinui, jo dalels pasiskirsto 3 sluoksniais nuo sunkiausi apaioje iki lengviausi viruje. Pirmiausia i filtro teka drumsta misa, todl ji varoma atgal filtravimo kamer. Kuo didesn galutin mentalo temperatra, tuo laisvesns saladino dalels ir tuo greitesnis skaidrinimas. Dl ios prieasties skaidrinimo metu turi bti vengiama vsinimo. Nuleidus mis, i apaios leidiamas 80 C vanduo, kuris iplauna ekstrakt i netirpios dalies. Tokiu bdu gaunama antroji misa. Mas plaunama tol, kol joje lieka ne daugiau kaip 0,5 % ekstrakto. Pirmosios misos koncentracija yra visur vienoda. Pirmoji misa praeina pro saladin ir itaip ifiltruojama. Skaidrinimo pabaiga nustatoma matuojant misos koncentracij misos katile. Skaidri nufiltruota misa siuniama virimo katilus. [1] Misos virimas. Misa virinama 12 val. tam, kad stabilizuotsi jos sudtis. Virimo metu pridedama apyni. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Verdama dl keli prieasi: misa turi pasiekti reikiam koncentracij (igaruoja vanduo); misa sterilizuojama ir dezaktyvuojami enzimai; paalinami nestabils baltymai; ilaisvinamos kariosios apyni skonins mediagos; paalinamos nereikalingos aromatins mediagos. [5] Misos virimo metu kartumas ir aromatiniai apyni komponentai yra perduodami mis ir tuo pat metu nusodinami baltymai. Apyniai turi takos putoms susidaryti ir veikia kaip antiseptikas. Misa verdama misos virimo katile, kuris rengtas taip, kad virimas vykt sklandiai. Galutinis misos virimo produktas yra karta galutin misa. Misos virimo metu vyksta keletas svarbi proces:

263

Ekstrakcija ir apyni komponent perdavimas. Baltym polifenoli kompleks formavimas ir nusodinimas. Vandens igarinimas. Misos sterilizavimas. Ferment sunaikinimas. Misos spalvos intensyvjimas. Misos rgtinimas. Redukcini mediag formavimasis. Dimetilsulfido kiekio misoje poveikis. Alaus gamybai svarbs apyni komponentai yra ie: apyni dervos ar apyni kariosios mediagos; apyni eterinis aliejus; apyni polifenoliai. Apyni dervos arba kariosios mediagos yra svarbiausi apyni komponentai alaus gamyboje, nes jie suteikia alui bding kartumo skon. -rgtys yra visikai netirpios altoje misoje. Verdanioje misoje pasireikia pokyiai -rgi struktroje, kurie remiasi izomerizacija. Izo- junginiai yra tirpesni nei -rgtys. -rgi izomerizacija virimo metu nebaigta. Vidutinikai 1/3 pridt -rgi regeneruojama verdanioje misoje izo- jungini forma. Izohumulono ieiga verdant ir alaus kartumas priklauso nuo: Izohumulono ries. Skirtingi -rgi komponentai izomerizuojami iki skirting dydi. Naudojamos vairios apyni rys, turinios daugiau humulono, kad bt gauta daugiau kariojo alaus. Virimo trukms. Ilgjant virimo laikui, izohumulono ieiga didja. Dauguma -rgi izomerizuojasi virimo pradioje ir virimo metu izomerizacijos greitis maja. pH. Kuo didesnis pH, tuo geresn izomerizacija, bet kartumas, gautas esant emam pH, yra labiau subalansuotas. Humulono koncentracijos. Izohumulono ieiga maja, kai didja pridedam apyni kiekis, taiau majimas yra nedidelis (iki 10 %). Apyni malimas padidina ekstrakcijos greit ir karij mediag ieig. Apyni polifenoliai yra tirps vandenyje ir itirpsta ikart. Polifenoli tarpe yra antocianogen, tanin ir katechin. Polifenoliai i apyni ir salyklo visikai itirpsta misoje ir susiformuoja junginiai su baltymais. Salyklo polifenoliai yra chemikai aktyvesni. Yra daug bakterij, kurios, jei nesunaikintos, gali al pargtinti ir pereiti mental su salyklo dulkmis. Virimo metu misoje dar tebesantys keli fermentai visikai sunaikinami, todl vliau nebeatsiranda nekontroliuojam misos turinio pasikeitim. Esant tam tikroms slygoms, turi bti pridedama salyklo ekstrakto ar pirmosios misos tam, kad visikai suskilt krakmolas. Misa patamsja. Virimas lemia melanoidin formavimsi ir polifenoli oksidacij. Dl to virimo pabaigoje spalva patamsja. Spalva iek tiek paviesja fermentacijos metu. Misa pargtja dl to, kad virimo metu susiformuoja melanoidinai, o ir apyni poveikis yra iek tiek rgtinantis. Nevirintos misos pH yra apie 5,85,9. Virtos misos pH yra apie 5,55,6. Dauguma svarbi proces geriau vyksta esant emesniam pH. Tai tokie procesai, kaip: geras baltympolifenoli kompleks nusdimas, misai verdant, kai pH 5,2; maesnis spalvos patamsjimas, esant emesniam pH; geresnis, skanesnis apyni kartumas, esant emesniam pH; maesnis mikroorganizm atsparumas, esant emesniam pH. Taiau, naudojant emesn pH, blogesnis apyni karij mediag panaudojimas, dl to reikia imti daugiau apyni. Taip pat pageidautina pargtinti nevirint mis. Misos virimo metu susiformuoja mediagos, kurios gali reaguoti su misa ir itaip lemti redukcin poveik. ios mediagos vadinamos reduktonais. Tai, pavyzdiui, melanoidinai. Dimetilsulfidas (DMS) yra labai lakus sieros junginys, kur aluje galima aptikti pagal jo nemalon kvap ir skon. Todl pageidautina, kad aluje jo bt kaip galima maiau (5060 g DMS/l).

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

264

Cinko kiekis misoje. Cinko misoje turt bti bent jau 0,10,15 mg/l. Cinkas dalyvauja baltym sintezje mieli lstelse ir kontroliuoja j nukleorgi ir angliavandeni metabolizm. Trkstant cinko, blogja put stabilumas aluje. Virimas trunka 60100 minui. Pageidaujama virti ilg laik ir stipriai, nes daugiau karij mediag pereina tirpal; koaguliuojantys baltymai geriau nusda; daugiau DMS paalinama. Taiau ilgiau verdant sunaudojama daugiau energijos, todl verdama kiek galima trumpiau. Prie pradedant virti svarbu patikrinti, ar cukrinimas pasibaigs. Gali bti, kad mentalo gavimo ir skaidrinimo metu daugiau krakmolo jungini pereina tirpal ir jie nesucukrinami, nes aukta temperatra aktyvina amilazes. Kad bt ivengta krakmolo drumstumo aluje, vykdomas papildomas cukrinimas, pridedant pirmins misos ar salyklo ekstrakto (vliau to pataisyti jau nemanoma). Labai svarbus procesas yra baltym koaguliavimas (nes tirps baltymai drumsia mis). is procesas vyksta dviem etapais. I pradi baltymai denatruoja ir praranda dal vandens, paskui koaguliuoja jungiantis micelms. I pradi baltymai ikrenta maomis dalelmis, bet paskui juos verdant susidaro dideli dribsniai. Geriausias koaguliantas susidaro, esant pH 5,2. Filtruota karta misa teka virimo katilus ir j pridedama apyni. Dedama ne tik natralius apynius, bet ir apyni ekstraktus. Apyni kiekis priklauso nuo gaminamos alaus ries ir gali svyruoti nuo 100 iki 500 g 1 hl. Apyniai racionaliau suvartojami veikiant juos ultragarsu, t. y. 2030 % daugiau karij mediag i to paties kiekio apyni, taip pat gerja alaus kokyb, geriau denatruojami prastesni baltymai. Misa verdama sandariuose katiluose, esant auktam slgiui. Taip verdant mis, labiau koaguliuojami baltymai, geriau nuskaidrja alus, tampa biologikai patvaresnis. Pagrindiniai rodikliai, rodantys virimo pabaig, yra misos koncentracija ir susidar dribsniai. Baigus virim, apyni liekanos ir kitos netirpios dalels atskiriamos specialiame nusodintuve (whirpool) (4 pav.). Tada tikrinami tokie parametrai: misos skaidrumas; vlusis cukrinimas; ivirtos misos kiekis; ivirtos misos ekstrakto turinys. Dribsniai i ivirtos misos vadinami iurkiaisiais arba kartaisiais dribsniais. Tai didels (3080 m dydio) dalels, kurios yra sunkesns u mis ir gerai nusda, suformuodamos kompaktik mas, jei suteikiama pakankamai laiko. ie dribsniai turi bti paalinami. Tai daroma nusodintuve. Nusodintuvas yra vertikalus cilindrinis indas be vidins rangos, kur pumpuojama misa. Tai sukelia inde sukamj tkm. Ji lemia kart dribsni nusdim kgio formos indo viduryje. Whirpool yra udaras cilindrinis indas plokiu dugnu, su 2 % palinkimu ijimo angos link. Nusodintuvas izoliuojamas, kad bt ivengta vsinimo i iors. Yra toki whirpool nusodintuv, kurie vietoj plokio dugno turi kgik dubim pagrindo viduryje. Misa leidiama daniausiai per du kartus: vienas leidimas dugne, kad bt ivengta deguonies pasisavinimo, leidimas apatiniame tredalyje, kad bt sukeliama rotacija. Ijimas visada yra emiausio whirpool tako pusje.

265

4 pav. Nusodintuvas Whirpool: 1 gar paalinimo dmtraukis; 2 virutinis dangtis; 3 kondensuotojo vandens paalinimas; 4 CIP valymas; 5 apvietimas; 6 oninis langas ir angos dangtis; 7 onin siena; 8 izoliavimas; 9 pagrindas su 1 % laitu; 10 CIP dugno purktuvas; 11 tangentinis leidimas; 12 ijimas

Svarbu, kokiu bdu misa pumpuojama whirpool. Misos tekjimo greitis neturt viryti 5 m/s. Danai pakanka daug maesni greii, kad bt sukelta misos rotacija ir igaunamas skurio efektas. Misa whirpool nusodintuve bna 2040 min. [1] Ferment naudojimas Amilosubtilinas G20x hidrolitini ferment kompleksas, turintis iuos aktyvumus: -amilazin ~ 600 vnt/g, proteolitin ~ 50 vnt/g ir -gliukanazin, ne maesn nei 400 vnt/g. Tai viesiai rudi milteliai, kuriuose paprastai esti ir amilosubtilino G20x, ir protosubtilino G20x. ie komponentai gaminami i skirting Bacillus subtilis kamien, auginam giluminiuose fermentatoriuose, filtruojant kultrin skyst ir koncentruojant filtrat ultrafiltracijos bdu, paskui diovinant j purktuvinje diovykloje. Fermentiniai preparatai fasuojami po 10 kg polietileniniuose maiuose, kurie pakuojami 34 sluoksni popierinius maius. Pagrindiniai naudojami preparatai: amilosubtilinas, protosubtilinas, multienzimins kompozicijos (MEK), citorozeminas (Px). Amilosubtilinas imamas norint pakeisti 2030 % blogo itirpimo salyklo nesalyklinmis mediagomis, tai ~ 0,51 kg ferment miinio / 1 t nesalyklini mediag (pvz.: kukurzai, ryiai ir kt.). Prie vartojim preparatai paprastai imaiomi nedideliame kiekyje alto vandens ir, ruoiant mental nusistovjimo bdu, visas preparatas supilamas aliav umaiymo metu, kai temperatra 4045 C; o pavirinimo bdu 1/22/3 preparato dozuojama mentalo dal su nesalyklinmis mediagomis, esant 40 45 C, o likusioji dalis mental su salyklu. Misos auinimas. Kadangi miels veikia emoje temperatroje, misa turi bti ataldoma kaip galima greiiau iki 56C arba iki 710C. Misa vsinama iki rauginimo temperatros. J auinant, igarinama dalis vandens. Dl to padidja misos koncentracija, misa sugeria deguon, kuris chemikai veikia sudtines jos dalis, ir nusda ikritusios mediagos. Deguon misa sugeria fiziniu ir cheminiu bdu. Auktesnje temperatroje deguonis naudojamas organinms mediagoms oksiduoti: cukrums (fruktozei), apyni dervoms, azotinms ir rauginms mediagoms. emesnje temperatroje deguonis tirpsta misoje, visikai j prisotindamas. Viename litre atauintos misos yra 7 mg deguonies. Misos auinimo bdai skirstomi : 1. Ant aldom lki bei drkinamuose vamzdeliniuose aldytuvuose. io proceso metu misa labai ukreiama oro mikroorganizmais, kas labai sumaina alaus biostabilum ir gadina skon. 2. Udaros nusistovjimo aldymo talpos (virpuliai) padeda ivengti ukrtimo.

266

3. Plokteliniai aldytuvai (ilumokaiiai) ia misa auinama altu vandeniu. ilumos perdavimas vyksta per plonas chromo bei nikelio plieno plokteles, kurios gali bti vairi dydi ir form.

5 pav. Ploktelinio ilumokaiio ploktels: 1 misos tekjimas; 2 misos itekjimas; 3 auinaniojo vandens tekjimas; 4 auinaniojo vandens itekjimas; 5 guminis sandarinimas

Plokteliniame ilumokaityje misa auinama altu vandeniu. ilumos perdavimas vyksta per plonas chromo bei nikelio plieno plokteles, kurios gali bti vairi dydi ir form (5 pav.). Ploktelinis ilumokaitis sudarytas i daugelio plon metalini plokteli, isidsiusi viena po kitos, tarp kuri paeiliui teka misa ir altas vanduo. aldomasis agentas bei lanti misa plonu sluoksniu patenka prieingas kiekvienos plokts puses ir juda vienas prie kit. Kad bt gerai perduodama iluma, reikia: panaudoti labai plonas metalines plokteles; ploktels turi bti tokios formos, kad sukelt turbulentikum; kad tarp plokteli bt labai maas tarpas; panaudoti priesrovin misos ir alto vandens tkm; kad tkms kryptis bt danai keiiama. Ploktels sukabinamos rmelyje ant lygiagrei stryp, kurie pritvirtinti prie atramos, ir sandariai suspaudiamos tarpusavyje. Ploktelinis ilumokaitis sudarytas i: rmelio su suspausta ranga; sujungt plokteli; ilumos perdavimo plokteli. Ypa svarbu, kad ploktels bt tankiai suspaustos tarpusavyje ir bt utikrinamas ilumokaii sandarumas. Plokteliniame ilumokaityje karta misa ataldoma altu vandeniu nuo madaug 9895 C iki 68 C raugimo temperatros. Vanduo, kuriuo vsinama misa, kaista. Tokiu bdu iluma perduodama i kartesns misos altesniam vandeniui. is ilumos perdavimas priklauso nuo keli veiksni. Kartesnis skystis atiduoda ilum per sienel altesniam skysiui. Svarbs ie temperatros pokyio veiksniai: sienels storumas; mediaga, i kurios padaryta sienel; ilumos laidumo koeficientas (). ilumai perduoti per sienel yra svarbs ie veiksniai:

ilumos perdavimo i skysio sienelei koeficientas;

267

ilumos laidumo koeficientas; ilumos perdavimo i sienels skysiui koeficientas. Taigi: iluma besikeiiantys skysiai turi tekti prieingomis kryptimis; skysiai judti turi greitai; turi bti ilaikomas varus mediagos pavirius; turi bti naudojamos didel ilumos laidumo koeficient turinios ilumokaiio ploktels. Auinimas gali bti vykdomas viena arba dviem pakopomis. Dviej pakop vsinimas. Parengiamojo auinimo skyriuje misa perduoda ilum procese naudojamam altam vandeniui. Kol misa auinama iki 1618 C temperatros, auinimo vanduo kaista iki 8088 C temperatros. Kitame emesns temperatros auinimo skyriuje misa vsinama lediniu 12 C vandeniu iki norimos raugimo temperatros. Ledinis vanduo yla (bet ilieka emesns nei proceso vanduo temperatros) ir grinamas atgal ledinio vandens aldytuv. Vienos pakopos vsinimas. io proceso metu iki 12 C atals ledinis vanduo yla plokteliniame ilumokaityje iki 8088 C, kol karta 9598 C misa auinama iki raugimo temperatros. Ploktelinio ilumokaiio privalumai: ploktelinis ilumokaitis neuima itin daug vietos; vyksta geras ilumos perdavimas, esant nedideliam slgio majimui; lengvai ivalomas; misa aldytuve ibna labai trump laik; nepasireikia uterimo rizika, utikrinamas misos sterilumas, nes is ilumokaitis nekontaktuoja su atmosferos oru. [1] Separavimas. Tai pagreitintas nusodinimas, kurio metu, veikiant icentrinms jgoms, svorio jga padidja iki 5000 kart (Leval firmos vedijoje aparatai). Jie bna periodinio veikimo ir su automatiniu susikaupusi atliek alinimu, nepertraukiant separatoriaus darbo. Separatoriuje bna 3 cilindrins kameros, sudarytos i nerdijanio plieno dkl. Separatoriaus bgnas tvirtinamas prie vertikaliojo veleno, kur suka apie 6000 aps/min. greiiu galingas variklis sliekine pavara. Per separatoriaus virutins dalies atvamzd misa savitaka patenka vidin cilindrin kamer, i kur nuosekliai pereina i vienos kameros kit, atsimua bgno sienel ir, jau nuskaidrjusi, per nuvedimo vamzd spaudimu imetama separatoriaus virutin dal. Icentrins jgos misos nuosdas su didesniu lyginamuoju svoriu atmeta prie kameros ir bgno sieneli, kur jos ir nusda. Toki separatori naumas 510 m3/val. Mis galima separuoti prie ar po aldymo. Labiau paplits kartas separavimas, nors vliau, isiskyrus altoms baltyminms dalelms, misa gali kiek padrumslti. Separuojant ataldyt mis, separatoriaus naumas sumaja perpus dl padidjusio klampumo, todl geriausia derinti abu metodus. Filtravimo separatoriais pranaumai: pagerja higienins proceso slygos ir misos sterilumas, sutrumpja nuskaidrinimo ciklas, gerokai sumaja gamybinis plotas ir eksploatavimo ilaidos, sumaja ekstrakto nuostoliai. Atsiskaitymas 1. Alaus misos ruoimas, salyklo smulkinimas, mentalo paruoimo operacijos. 2. Mentalo filtravimo, misos virimo su apyniais technologins operacijos. 3. Mentalo virimo bdai ir j metu vykstantys procesai. Literatra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Kunze international edition Technology brewing and malting. Germany, Berlin: WLB, 1996. 726 p. , .; , . . Moc: , 1977. 294 c. Venskeviius, J.; Bernatonis, J. Bendroji maisto produkt technologija. Vilnius: Mokslas, 1977. 248 p. UAB Utenos alus, Internetas: http://www.utenosalus.lt AB Utenos grimai, Internetas: http://www.utenosgerimai.htm LST 44 : Alus. Bendrosios technins slygos. Vilnius, 1993. 41 p. AB Kalnapilis, Internetas: http://www.kalnapilis.lt

268

3. Alaus fermentavimo ir ilaikymo technologija


Darbo tikslas Susipainti su alaus gamyboje vykstaniais fermentacijos ir ilaikymo procesais. Tyrimo objektas Fermentacijos ir ilaikymo technologiniai procesai. Naudojamos priemons ir renginiai Fermentavimo talpos, auinimo renginys (vamzdis vamzdyje), ilaikymo talpos. Darbo eiga Pagrindinis rgimas vyksta atviruose arba udaruose rauginimo renginiuose. oninje renginio sienoje 1015 cm aukiau dugno yra iaupas nuleisti jaunam alui, o dugne iaupas nusdusioms mielms paalinti, viduje yra gyvatukas skysiui auinti. Pagrindinis rgimo biocheminis procesas yra cukr virtimas etilo alkohol ir anglies dioksid: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2. Vykstant iai reakcijai, isiskiria iluma. Didioji dalis misos susideda i angliavandeni. Apytiksliai apie 75 % j dalyvauja reakcijoje. Kit dal sudaro dekstrinai, baltymai, mineralins mediagos ir kt. Prasidjus reakcijai, pirmiausia suskaldoma fruktoz ir gliukoz. Sacharoz skyla iki fruktozs ir gliukozs veikiant mielse esanius fermentus -fruktafuranozidaze. Po fruktozs ir gliukozs miels vartoja maltoz, kuri veikiant fermentui -glikozidazei virsta gliukoz. ios reakcijos metu maltoz skaldoma ltai ir nevisikai. Etilo alkoholis ir anglies dioksidas yra pagrindiniai spiritinio rgimo produktai. Be j, misoje susidaro glicerinas, acto aldehidas, acto, gintarin, citrin ir pieno rgtys. I amino rgi susidaro auktesnieji alkoholiai, btent jie turi takos alaus aromatui ir skoniui. Rgstant misai aerobinmis slygomis, ji tampa jaunu alumi. Visi susidar produktai taip pat turi takos alaus aromatui ir skoniui. Prie supilant mieles rauginimo rengin, jos tam skirtame inde sumaiomos su alta misa (26 l misos ir 1 l mieli). Maioma steriliu suspaustu oru arba maiytuvu ir paliekama 23 val., kad prasidt rgimas. Temperatra turi bti 6 C. iltos misos (57 C) rauginimo aparat pilama tiek, kad apsemt jo dugn. Paskui dedamos miels, imaioma ir supilama visa likusi misa. Pirmojoje rgimo stadijoje, vadinamoje pabalimu, misos paviriuje pasirodo velniai baltos putos. i stadija trunka 11,5 paras ir apibdinama kaip intensyvus mieli pumpuravimas. Antrj rgimo stadij emj garban period apibdina didesnis CO2 iskyrimas, tankios kylanios putos susidarymu, kuri panai garbanas. Putos i pradi bna baltos, vliau tamsja, nes apyni smalos oksiduojasi. i stadija trunka 23 paras. Treioji rgimo stadija auktj garban periodas. Tai didiausias rgimo intensyvumas, maksimali viso proceso temperatra. Puta pasidaro puri, silpnai kyla vir, garbanos pasidaro didiausios, virutins garbanos gauna rud spalv, o apatins balt. i stadija trunka 34 paras. Ketvirtojoje rgimo stadijoje, vadinamoje garban kritimu, garbanos nyksta, putos nusda. Dl to misos pavirius pasidengia plonu sluoksniu. Garban nykimas vyksta dvi paras. Krintant misos pH, mieli lstels pasidengia slidia plvele, turinia klijuojamj savybi. Lipdamos vienos su kitomis, jos nusda dugn.

269

Mielms nusdus, rgimas nutraukiamas, ir jaunas alus nuskaidrinamas ildant. Tuo baigiamas pagrindinis rgimas. Gautas produktas vadinamas jaunu alumi. Ilaikant al, vyksta tie patys procesai, kaip ir pagrindiniame rgime, bet liau, nes jaunas alus laikomas maesnje temperatroje (02 C). Ilaikant al, vyksta ie procesai: karbonizacija, nuskaidrinimas, subrandinimas. Karbonizacija. Jaunas alus turi apie 0,2 % CO2. J ilaikant reikia padaryti taip, kad po filtravimo likt ne maiau kaip 0,3 % CO2. Rauginant jauname aluje esant ekstrakt, jis ir yra CO2 altinis. Anglies dvideginis yra aluje ir itirpsta ir susiria su ekstrakto komponentmis. Taip pat dalis CO2 yra angliargts pavidalu. CO2 CO2 CO2 suritas itirps dujinis Nuskaidrinimas. ilaikym patenkantis alus turi tam tikr kiek mieli lsteli. Ataldant al iki 02C, atsiskiria mediagos, kurios vykstant pagrindiniam rgimui buvo suritos su tirpalu. Alus pamau skaidrja. Nuskaidrinimo stadijoje nepasiekiamas visikas alaus skaidrumas, bet tai pasiekiama filtruojant al. Brandinimas. Brandinant jaun al, jam bdingas mieli ir apyni skonis inyksta. Veikiant deguoniui, jauname aluje diacetilo koncentracija sumaja iki 4050 %. Vertinant al, vertinimo sistem eina diacetilo ir organini sieros jungini koncentracijos. Alaus branda vertinama organoleptikai. Alaus nokinimas Po fermentavimo alus noksta, stabilizuojasi ir yra prisotinamas angliargts. Nokinimas trunka vairiai, jis priklauso nuo alaus ries ir technologinio proceso (nuo 812 par (Utenos alui) iki 21 paros iguliniam alui), po kuri alus gyja visas norimas skonio ir kvapo savybes. Nokinimas vyksta, esant temperatrai nuo 0 iki +4 C vertikaliuose arba horizontaliuose tankuose esant CO2 slgiui nuo 0,03 iki 0,06 MPa (iguliniam alui). Tankai, kuriuose vyksta is procesas, paprastai pagaminti i aliuminio arba plieno. Vertikals ir horizontals tankai skiriasi tik atram buvimo vietomis ir iaup idstymu. Vertikals geriau panaudoja gamybini patalp erdv. (14 pav.) Alaus skirstymas pagal fermentacijos tip emutinio rgimo fermentacjos alus (anglikai vadinamas lager) paprastai yra viesios spalvos ir lengvo, rykesnio skonio dl trumpesns ir altesns (210 C) fermentacijos bei ilgesnio nokinimo laiko. Bene populiariausios ios grups alaus rys yra Pilsener, Mnchener Helles, Bock, Doppelbock, Marzen ir amerikietikasis Lager alus. Pilsener Yra dvi io alaus rys: vokikasis Pilsener ir Bohemijos Pilsener. Vokikoji ris yra laikoma viesaus apatinio rgimo fermentacijos alaus pasauliniu standartu. Tuo tarpu Bohemijos ris, atsiradusi ekijos mieste Pilzene, XIX a. labiausiai padjo Lager tipo alui iplisti visame pasaulyje. Abi ios Pilsener rys yra labai panaios, taiau klasikinis vokikasis alus paprastai yra iek tiek viesesnis u ekikj ir yra kiek silpnesnio apyni aromato. Mnchener Helles i alaus ris itin populiari pietinse Vokietijos srityse. Mnchener Helles yra velniai kartus ir nelabai stiprus alus, j geriant gerai jauiamas salyklo skonis. Taiau kai kurios io alaus atmainos gaminamos labiau irykinant apyni aromat. Mnchener Helles visuomet yra labai viesios spalvos. Bock is stiprus alus, turintis madaug 6,5 % alkoholio trio, dl savo ildomj savybi nuo seno gaminamas Vokietijoje iemos laikotarpiu. Bock ris kilusi i emutins Saksonijos, taiau dabar is alus daniau siejamas su Bavarija. ios ries alaus spalva gali kisti nuo gana viesios iki tamsiai rudos. Bock paprastai yra vidutinio kartumo, j geriant gerai juntamas salyklo skonis. Doppelbock Doppelbock isiskiria stiprumu (nuo 7 iki 12 % alkoholio trio). Doppelbock yra intensyvios gintaro spalvos ir danai bna gerai juntamo vaisi aromato. Toks alus paprastai nra labai kartus.

270

Marzen is vario spalvos alus kils i Vienos, taiau vliau jo gamybos procesas buvo patobulintas Miunchene (Vokietija). Vokietijoje Marzen alus bdavo pradedamas nokinti kovo mnes ir laikomas iki pat Oktoberfest vents, kuri tradicikai rengiama ruden, po derliaus numimo. Pastaruoju metu Marzen al visoje Vokietijoje istm vadinamasis festbiere, kuris yra kiek stipresnis ir populiaresnis per Oktoberfest vent. Amerikietikasis Lager ios ries alus daniausiai yra velnaus skonio ir turi daugiau angliargts nei gaminamas Europoje. Gamindami Lager al, amerikieiai gana danai naudoja kukurz arba ryi pried. Pastaruoju metu taip pat itin iplito vadinamasis light alus, kuris yra ypa velnus, viesus ir smarkiai prisotintas angliargts. Virutinio rgimo fermentacijos alus (anglikai vadinamas ale) paprastai isiskiria tamsesne spalva. ios grups alus fermentuojamas 1020 C temperatroje ir gana trumpai nokinamas. Ale tipo alaus skonis paprastai apibdinamas kaip rykus ir ilgai iliekantis burnoje. iai grupei priklauso tokios populiarios alaus rys kaip altbier, bitter, stouts, porter, weissbier, pale. Altbier is alus gaminamas Diuseldorfe ir kai kuriuose kituose iaurins Vokietijos regionuose pagal senovin virutinio rgimo fermentacijos technologij, naudojama daug apyni. Kartais is alus daromas i kviei salyklo. Altbier alus yra vario spalvos, aromatingas, isiskiria kartoku skoniu. Bitter i ris yra bene labiausiai paplitusi Anglijoje ir Velse. Bitter alus daniausiai bna rausvos spalvos, taiau gaminama ir viesesni ios ries atmain, kurios pradjo ypa populiarti pastaruoju metu. Bitter yra sauso skonio su gerai juntamu apyni kartumu. is alus daniausiai turi apie 3,5 % alkoholio trio, nors gaminamos ir stipresns rys (English special bitter, English extra-special bitter). Stouts Stout yra tradicinis airikas alus, kur dedama stipriai degint miei. Kartais iam alui naudojami avi priedai. Stout alus yra tirtas, labai tamsios spalvos, neskaidrus ir isiskiria itin standia puta. Skonis paprastai yra velnus ir ilgai iliekantis. Porter Porter tipo alus yra gana tirtas, tamsiai rudos spalvos, kiek primenanios stout al. Taiau tamsi porter spalva gaunama dl ypatingai paruoiamo tamsaus salyklo, o ne dl degint miei priedo, kuris naudojamas stout alui gaminti. Porter skonis bna labai vairus ir svyruoja nuo saldaus iki kartaus. Weissbier Iskirtin io alaus savyb yra ta, kad jam naudojamas mieinio ir kvietinio salyklo miinys. Weissbier brandinamas buteliuose arba statinaitse. Taip pat prasta, kad iame aluje bt mieli nuosd. Toks alus nra kartus, danai juntamas vaisi, vanils ar gvazdikli prieskonis. Spalva gali kisti nuo viesiai iki tamsiai rudos. Pale io blykaus alaus spalva gali kisti nuo visai viesios iki vario rausvumo. Geriant Pale tipo al, gerai juntamas apyni kartumas ir vaisi prieskonis. India Pale Ale ris buvo specialiai sukurta XIX a. tam, kad alus nesugest j plukdant laivais i Anglijos Indij. Savaiminio rgimo fermentacijos alus (anglikai lambic) yra gaminamas beveik vien Belgijoje. Verdant io tipo al, danai pridedama vaisi, uog ir cukraus, todl jo skonis smarkiai skiriasi nuo prasto alaus. Kriek is tamsios spalvos alus gaminamas pridedant kriek ries vyni, kurios sukelia antrin fermentacij ir suteikia grimui papildom vaisi bei migdol skon. Tokia alaus gamybos technologija Belgijoje egzistuoja jau kelet ami. Geuze i ris gaminama maiant jaun ir sen lambic tipo al. Taip maiant sukeliama antrin fermentacija, dl kurios alus bna savotikas, gausiai putoja. Toks alus tradicikai nra filtruojamas, pasterizuojamas ar aldomas. Geuze alus, kaip ir ampanas, parduodamas kamiu udarytais buteliais. Faro Anksiau tai buvo bene labiausiai paplits lambic tipo alus. Faro alus yra silpnas ir daniausiai saldomas cukrumi. iais laikais ios ries alus beveik nebegaminamas.

271

Atsiskaitymas 1. Alaus fermentavimo technologinis reimas. 2. Alaus ilaikymo technologinis reimas. Literatra 1. Dagys, V. Darau savo al. kininko patarjas, 2000. 8 c. 2. , . .; , . . , 1985. 468 c. 3. , .; , . . , 1977. 448 c. 4. Alus, Internetas: http://www.utenosalus.lt 5. Alaus gamyba, Internetas: http://www.alutis.lt

272

1 pav. Cilindrinis kginis tankas: 1 produkto jimas ir ijimas; 2, 3 aldymo agento jimas ir ijimas; 4 termometras; 5 plovimo galvut; 6 mgini pamimas; 7 vandens ir dezinfekcinio skysio iaupas; 8 laidas; 9 sklend; 10 CO2 ijimas

273

2 pav. Cilindrin fermentacijos talpa: 1 alaus iaupas; 2 liukas; 3 mgini pamimas; 4 laidas; 5 slgmaio srieg; 6 suspaustojo oro iaupas; 7 stovai; 8 mechaninio plovimo renginys

3 pav. Principin technologin nepertraukiamos fermentacijos ir ilaikymo schema: 1 fermentacijos talpa; 2 matuoklis; 3 nussdintuvas; 4 aldytuvas; 5 dekantatorius; 6 separatorius; 7, 8, rauginimo talpos; 9 siurblys; 10 separatorius; 11 lkt; 2 jauno alaus talpa; 13 karbonizatorius; 14 brandinimo talpa; 15 saikininkas

274

4 pav. Principin technologin nepertraukiamos fermentacijos ir ilaikymo schema (APV): 1 misos talpa; 2 misos su mielmis talpa; 3 fermentacijos talpos; 4 brandinimo talpos; 5, 7, 9, 11 tarpins talpos; 6 CO2 surinktuvai; 8 saikininkas; 10, 12 brandinimo talpos; 13 alaus surinkimo talpos

4. Alaus mieli gamybos technologija


Darbo tikslas Susipainti su alaus gamyboje naudojamomis mielmis, j paruoimo technologija, naudojamais renginiais bei j veikimo principu. Tyrimo objektas Alaus mieli gamybos cechas. Naudojamos priemons ir renginiai: 1. 2. 3. 4. Ganzeno aparatas. Greinerio aparatas. Praplovimo ir laikymo vonel. Apdorojimo, paruoimo ir perpumpavimo aparatas.

Darbo eiga 1. Bendroji mieli charakteristika Mieli charakteristika

275

Miels tai didiausias emesnij augal skyrius. J sudaro apie 100 000 gryb ri. Grybai aerobiniai, heterotrofiniai, saprofitiniai, kai kurie parazitiniai, neturintys chlorofilo augalai, paplit dirvoje ir vandenyje. Vieni j yra makrofitai, sudarantys didelius vaisiaknius. Jiems priklauso kepurtieji, tarp j valgomieji, grybai. Dauguma j yra mikrofitai, matomi pro mikroskop, danai vadinami pelsiais. Grybai bna vienalsiai ir daugialsiai. J lsteli citoplazm supa tvirta sienel. Citoplazmoje yra mitochondrij, lizosom, voliutino, lipidais upildyt vakuoli, vienas ar keli branduoliai. Grybuose yra kaupiamas ne krakmolas, kur kaupia auktesnij augal lstels, o glikogenas. Lsteli sienelse yra chitino, o vienas i mediag apykaitos produkt yra lapalas. Todl pagal iuos, skirtingus nuo augal, poymius grybai artimi gyvnams, o pagal absorbcin mitybos bd ir neribot lsteli dauginimsi augalams. Dauguma gryb intensyviai gamina vairias biologikai aktyvias mediagas: fermentus (amilazes, proteazes, pektinazes), augimo stimuliatorius (giberelinus), antibiotikus (penicilin ir kt.). Todl tikr gryb grynos kultros auginamos pramoniniu bdu ir gaminamos mintos biologikai aktyvios mediagos. Miels naudojamos etilo alkoholio, alaus, vyno, giros, duonos bei pyrago gamini gaminiams. Nefermentuojanij mieli rass auginamos nemaistiniuose substratuose (sulfitiniuose popieriaus ir celiuliozs laugtuose, augaliniuose hidrolizatuose, naftos angliavandeniliuose) ir naudojamos kaip baltyminis ir vitamininis paaras gyvuliams erti. Pagal grybienos sandar grybai yra skirstomi emesniuosius ir auktesniuosius. emesnieji grybai yra vienalsiai. iems grybams priskiriamos trys klass: chitridiomicet (Chytridiomycetes), oomicet (Oomycetes), zigomicet (Zygomycetes). Auktesnij gryb grybiena gerai isivysiusi. Micelis yra gerai isivysts, sudarytas i vienabranduoli ir daugiabranduoli lsteli (daugialstis). iems grybams priskiriamos trys klass: aukliagrybiai (Ascomycetes), papdgrybiai (Basidiomycetes), grybiai (Deuteromycetes). Aukliagrybi klasje yra apie 30 000 ri. Jai priklauso miels ir daugialsiai grybai. Miels dauginasi daniausiai pumpuravimu ir konidijomis. Lytinio dauginimosi metu susiformuoja maieliai askai, kuriuose paprastai esti atuonios askosporos. Grybai turi nariuot micel, yra heterotrofai, saprofitai, gadina maisto produktus ir paarus. Tarp j yra ir daug kultrini augal parazit. Daugelis ios klass gryb turi svarbi pramonin reikm. Aukliagrybi klas skirstoma du poklasius: plikaaukli (Protoascomycetidae) ir tikraaukli (Euascomycetidae). Plikaaukli poklasio grybai nesudaro vaisiakni. Poklasyje yra dvi eils: mieliei (Endomycetales) ir ragangrybiei (Taphrinales). Mieliei eilei priklauso dvi labai svarbios eimos: Saccharomycetaceae ir Endomycetaceae. Saccharomycetaceae eimos svarbiausia gentis mieliagrybis (Saccharomyces). Paprastai ios genties grybai vadinami mielmis. Jos yra apvalios, ovalios arba elipss formos lstels (1 pav.). J dydis apie 1015 m. Miels fakultatyviniai anaerobai, nesudaro micelio, taiau, daugindamosi pumpuravimu ir iskirdamos gleives, gali laikinai sulipti nepatvariomis grandinlmis arba kuokteliais. ios eimos miels specialiuose maieliuose arba aukliuose (askuose) gali suformuoti askosporas, kuriomis dauginasi. J sporos daugiausia apvalios arba ovalios, taiau pasitaiko ir kitokios formos (2 pav.). Kultrini mieli sugebjimas sudaryti sporas yra susilpnjs, o kai kurios gentys j nesudaro. Mieli lsteles supa stora sienel. Kai kuri ri lstels iskiria gleives, kurios suklijuoja lsteles dribsnius, skystose terpse nusdanius ant dugno. Tai labai svarbi savyb alaus gamyboje. Lsteli citoplazm dengia membrana. Citoplazmoje yra ribosom, mitochondrij ir branduolys, diferencijuotas dviguba membrana. Be i organoid, citoplazmoje randama atsargini mediag: glikogeno, voliutino, riebal. Senstaniose lstelse atsiranda vakuoli, piln suli. Mieli lstels judjimo organoid neturi, todl yra nejudrios. Miels turi svarbi pramonin reikm, naudojamos etilo alkoholio, alaus, vyno, giros, duonos gamyboje. Kai kuri geni (Pichia, Hansenula, Debaryomyces) miels, patekusios kepimo ar paarini mieli, spirito, alaus vyno fermentatorius, sutrikdo gamybos proces, maina pagrindins produkcijos ieig ir blogina kokyb. Jos gali daugintis ir vairiuose cukringuose produktuose (uogiense, sultyse, vaisiuose, uogose). Todl tokios miels gadina maisto produktus bei grimus. [4]

276

1 pav. Saccharomycetaceae eimos mieli lsteli formos: 1 kiauinikos (Sacch. Cerevisiae); 2 pailgos (Pichia); 3 elipsins (Sacch. Ellipsodeus); 4 citrinikos (Pseudosacch. Apiculatus); 5 lazdelins (Sacch. Pasteurianus)

2 pav. Saccharomycetaceae eimos kai kuri geni mieliagrybi sporos: 1 Saccharomyces, 2 Fabospora; 3 Zygopichia, 4 Hansenula, 5 Williopsis, 6 Debaromyces, 7 Schwanniomyces, 8 Metschnikowia

277

1.2. Alaus mieli charakteristika Alui gaminti naudojamos speciali rasi miels. Mikroorganizmai j gadina. Alus yra silpnai alkoholinis grimas, pagamintas i miei salyklo, apyni ekstrakto ir mieli. Jame yra apie 90 % vandens, 1,57,5 % alkoholio, 0,3 % anglies dioksido, 5,510 % ekstraktini mediag. Alaus gamyboje naudojamos miels skirstomos: auktutinio rgimo (top) ir emutinio rgimo (lager). Alaus mielms keliami ie reikalavimai: 1) greitai ir visikai surauginti cukr; 2) sudaryti dribsnius ir greitai nussti ant rauginimo kubilo dugno (lager), kad grimas bt skaidrus; 3) sudaryti bdingas skonines ir aromatines mediagas. Auktutinio (top) rgimo miels priklauso Saccharomyces cerevisiae riai, naudojamos alaus gamybai auktesnje temperatroje (+12 iki +20 C). Jos isiskiria lsteli maumu bei silpnu sugebjimu flokuliuoti. Dl savo maumo ios miels kartu su anglies dioksidu ikeliamos ir auginamos misos viruje. Tai i dalies apsunkina j pakartotin panaudojim. Likusios po fermentacijos miels suteikia alui matin gelsv spalv. emutinio (lager) rgimo miels alaus pramonje naudojamos daniausiai. ios miels priklauso Saccharomyces carlsbergensis riai. Jos skiriasi nuo auktutinio rgimo mieli daug didesniu dydiu ir geromis flokuliacinmis savybmis. Tokios miels priklauso alto rgimo mielms ir aktyviai dauginasi +5+10C temperatroje. Daugumos emutinio rgimo mieli lsteli ilgis yra 911 mikrono, o plotis 47 mikronai. Jaun mieli lsteli plona sienel ir smulkiagrd citoplazma. Senstaniose lstelse atsiranda daugiau stambi intarp, vakuoli. Senos, badaujanios lstels paprastai esti nusdusios, j citoplazma stambiagrd, o negyvos gauna netaisykling form ir greitai nusidao silpnais mlynojo metileno ar kit da tirpalais. Apatinio rgimo miels trisacharid rafinoz suskaido fruktoz ir melibioz, o i, veikiama fermento melibiazs, suskyla gliukoz ir galaktoz. Todl apatinio rgimo miels rafinoz visikai suraugina, o virutinio suraugina tik vien tredal, nes neturi fermento melibiazs. Miels ima daugintis anksiau nei prasideda j sukeliamas rgimas. Taiau dauginimasis usibaigia per 23 paras, o rgimas trunka 710 par. Pridjus maai mieli, alkoholinis rgimas vyksta liau. I karto pridjus j daug, rgimas prasideda greiiau, bet ir liau j daugja. Mieli dauginimsi skatina ir terpje esantis deguonis. Taiau tokiomis aerobinmis slygomis spariai besidauginanios miels naudoja maisto mediagas, ir terpje susikaupia j mediag apykaitos produktai, prailginantys alaus brendimo laik. Miels spariausiai dauginasi iki tam tikros temperatros. Apatinio rgimo miels geriausiai dauginasi 2527 C, bet gali daugintis ir 23 C temperatroje, 6065 C temperatroje miels va. Daugelis mediag slopina mieli dauginimsi. Jau 1,5 % etilo alkoholio slopina j dauginimsi, o kai alkoholio esti daugiau kaip 3 %, sultja cukraus rgimas. 0,5 % sieros rgtis arba 1 % acto rgtis per 12 val. umua mieli lsteles, o 1 % pieno rgtis joms neturi takos. Anglies dioksidas iki 0,2 % ltina lsteli pumpuravimsi, o 1,5 % sustabdo alkoholin rgim. Alaus gamyboje svarbiausia, kad miels sukelt alkoholin rgim. Mieli dauginimosi greitis ir alkoholinio rgimo intensyvumas priklauso nuo deguonies kiekio terpje ir temperatros. Gaminant al, mieli dauginimsi slopina ema rauginimo temperatra, o alkoholin rgim aktyvina anaerobini slyg sudarymas. Gamybai vertingiausiomis laikomos aktyviai rauginanios miels, sugebanios gerai nuskaidrinti al ir suteikti jam malon skon bei aromat. Mieli sugebjimas skaidrinti al vadinamas flokuliacija, arba dribsni susidarymu. Dribsnius sudaro stambialsts apatinio rgimo ir virutinio rgimo miels. Apatinio rgimo dribsniai nusda ant indo dugno, o virutinio rgimo ikyla paviri. Dribsni nesudaro smulkialsts miels. Jos iki rgimo pabaigos lieka pasklidusios rauginamoje misoje. Dribsnius sudaranios miels misos cukrus suraugina greiiau, taiau nevisikai. Jos dribsnius sudaro surauginusios apie du tredalius misoje esani sausj mediag, ltai baigia rauginti cukrus. Tuo tarpu smulkialsts miels cukrus raugina liau, taiau pilniau ir, pasklidusios misoje, ilieka ilgiau, greiiau ubaigia fermentacij. Dauguma alaus kultr sudarytos i stambialsi ir smulkialsi mieli miinio. Gerai rauginaniose mielse gali bti daugiau kaip 90 % smulkialsi ir 510 % stambialsi mieli rasi, o silpnai rauginaniose 450 % dribsnius sudarani mieli. [4]

278

1.3. Alaus mieli chemin sudtis Mieli chemin sudtis labai kinta. Ji priklauso nuo mieli rass, maitinimosi slyg ir fiziologins mieli sudties. Miels sudarytos i 75 % vandens ir 25 % sausj mediag. Sausj mediag procentin sudtis: 3565 % azotins mediagos, 2063 % neazotins ekstraktins mediagos, 25 % riebalai (lipidai ir lipoidai), 511 % mineralins mediagos. Pagrindins mieli mediagos yra: glikogenas, mieli sakai, azotins mediagos, riebalai, mineralai. Glikogenas (C6H10O5)n atsargin mieli maistin mediaga. Mielse glikogeno kiekis labai svyruoja (nuo 0 iki 40 %). Tai priklauso nuo mieli maitinimosi. Patekusios rauginimo terp, kurioje didel gliukozs koncentracija, miels pradeda gaminti glikogen (glikogenez), o mieles laikant po vandeniu vyksta atvirktinis procesas (glikogenoliz) (3 pav.). [12]

3 pav. Glikogeno molekuls sandara

Glikogeno gliukozs molekuls sujungtos -14 ir -16-glikozidinmis jungtimis. akotos glikogeno molekuls susidarym katalizuoja amilo-1,41,6-glikoziltransferaz. is fermentas katalizuoja ne atskir glikolizs vienet, bet atskir glikogeno molekuls dali, sujungt -14-glikozidinmis jungtimis, perneim. Pernetos glikogeno molekuls dalys -16-glikozidinmis jungtimis prijungiamos prie tos paios ar jai analogikos grandins. Tiriant glikogeno sintez radioaktyviu gliukozs-1-fosfatu nustatyta, kad i pradi vyksta linijinis onini glikogeno molekuls grandini ilgjimas, susidarant -14glikozidinms jungtims. Kai onins glikogeno molekuls grandinse susijungia vienuolika gliukozs vienet, pradeda veikti atsiakojimo fermentas ir susidaro naujos onins grandins. Glikogeno sintezei energija naudojama i ATF. [5] Mielse daug baltym, vidutinikai 45 % nuo sausosios mass. 90 % azoto yra baltymuose. Mieli baltymai turi apie 64 % tikrj baltym, apie 10 % amino rgi ir peptid, apie 26 % fosforo turini baltym. Pagrindiniai du baltymai tai cerevizinas ir zimokozeinas. Baltymuose yra ymi dalis gliutationo, kuris svarbus oksidacijos-redukcijos procesuose. Riebal kiekis mielse kinta ir priklauso nuo amiaus ir mitybos. Senose mielse riebal daugja ir gali siekti 1020 %. [12] I neorganini mediag pus sudaro fosforo rgtis ir tredal kalis. 3050 % fosforo rgties mielse yra sujungta su organinmis mediagomis, eina toki jungini sudt kaip lecitinas, nukleoproteidai, nukleotidai, ribonukleinins rgtys. Mieli pelen chemin ir procentin sudtis nurodyta 1 lentelje.
1 lentel. Mieli chemin sudtis

P2O5 MgO K2O CaO

4773 % 3,07,4 % 2,84,0 % 0,411,3 %

SiO2 Cl SO3

0,280,73 % 0,10,65 % 0,090,74 %

Pelenuose yra nedideli kiekiai toki element: geleies, vario, mangano, cinko, sieros. Siera mieli baltym sudt eina kaip disulfidin S-S grup, taip pat ir sulfhidridin S-H grup. Geleies ir kit

279

neorganini element buvim lemia katalitini oksiduojanij ferment (oksidazs, peroksidazs, katalazs) btinyb. [20] 1.4. Alaus mieli pigmentai, vitaminai ir fermentai Mielse yra daug mediag, turini didel fiziologin reikm. I i mediag reikt iskirti pigmentus: citochrom ir geltonj pigment. Mieli lstels turi visus tris skirting spektr citochromo komponentus, kurie vadinami a, b ir c. Citochromo veikla mieli lstelse labai panai hemoglobino veikl kraujyje. Citochrom hemo struktros geleies atomas, atlikdamas biologin vaidmen, keiia valentingum (nuo Fe++ iki Fe+++, ir atvirkiai). Kvpavimo grandinje citochromai yra tarp dehidrogenazi ir galinio elektron akceptoriaus. Geltonasis fermentas susideda i bespalvio baltymo (apofermento) ir geltonojo fermento, vadinamo flavonu. Flavono pagrind sudaro riboflavinas (vitaminas B2), suritas su fosforo rgtimi ir adenozinnukleotidu. Jungdamasis su baltymine mediaga, flavonas sudaro fermentin sistem, kuri vadinama geltonuoju fermentu. Flavoproteinas sutinkamas oksiduotos formos, geltonos spalvos ir neoksiduotos formosbespalvis. Flavoprotein funkcijos o ksidaciniai ir redukciniai procesai. Flavoproteinas dalyvauja vykstant ne tik kvpavimo, bet ir rgimo procesams. Taip pat fiziologikai svarbs cisteinas ir glutationas. Glutationas yra tripeptidas, -gliutaminilciseinilglicinas, dalyvauja oksidacinseredukcinse reakcijose. Cisteinas baltym amino rgtis, -amino--tiopropiono rgtis. Nuo sulfhidrilini grupi priklauso kai kuri baltym, hormon ir ferment biologinis aktyvumas. [12] emutinio rgimo mielms normaliai augti ir daugintis reikalingi vitaminai. Miels labai blogai auga mineralinse, sintetinse terpse, neturiniose vitamino B6. Mielse yra vitamino B kompleksas, nikotino rgties, pantotenins rgties, inozito, biotino, vitamino E ir kit. Alaus mielse vitamino B yra deimt kart daugiau nei kepimo mielse. Kai kurie vitaminai eina fermentini sistem sudt ir dalyvauja vykstant rgimo bei kvpavimo procesams. Vitaminas B1 yra fermento piruvatdekarboksilazs sudtin dalis, ardantis pirovynuogin rgt vykstant alkoholiniam rgimui, o vitaminas B2 vianas i kvpavimo ferment. Mielse taip pat yra vitamino B6, kuris labai svarbus biokatalizatorius. Vitaminas C dalyvauja oksidaciniuose procesuose. [20] Miels turi vairiausi ferment, kurie priskiriami dviem edoferment grupms: hidrolazms ir desmolazms. Hidrolazs katalizuoja substrato molekuls skaldym dalyvaujant vandeniui. Veikiant desmolazms, gaunama laisvoji energija. Hidrolitiniams fermentams priskiriami: karbohidrolazs (skaldo angliavandenius): amilazs, invertazs, gliukogenazs, melibiazs ir kiti; amidazs (skaldo asparagin ir gliutamin): asparaginaz ir gliutaminaz; proteazs (skaldo arba sintetina baltymus): peptidazs ir proteinazs; lipazs (katalizuoja riebal skaldymo ir sintezs reakcijas). Vienas i svarbiausi ferment yra maltozidaz (-gliukozidaz). Ji skaldo disacharid maltoz ir susidaro dvi gliukozs molekuls: C12H22O11 + H2O = 2C6H12O6. io fermento mielse esti labai daug, bet kiekis priklauso nuo mieli rass. Fermentas invertaz (sacharozidaz) suskaldo sacharoz ir susidaro gliukoz bei fruktoz: C12H22O11 + H2O = C6H12O6 + C6H12O6. io fermento mielse taip pat yra daug, jis stabilesnis nei maltozidaz. Melibizidaz (-galaktozidaz) disacharid melibioz skaldo gliukoz ir galaktoz. Melibizidaz randama emutinio rgimo mielse. Auktutinio rgimo miels danai jos neturi. Mielse taip pat randama daug kitoki ferment, kurie disacharidus daniausiai skaldo monosacharidus. Asparaginas suskaldomas vykstant asparaginazei. Gaunamas amoniakas ir asparagino rgtis: NH2 CO CH2 CHNH2 COOH + HOH NH3 + HOOC CH2 CHNH2 COOH. Gliutaminas suskaldomas veikiant gliutaminazei. Gaunamas amoniakas ir gliutamino rgtis: NH2 CO CH2 CH2 CHNH2 COOH + HOH NH3 + HOOC CH2 CH2 CHNH2 COOH. Desmolazs grup ferment, dalyvaujani kvpavimo ir rgimo procesuose. ie fermentai vykdo organini jungini skaldymo proces (desmoliz). Desmolizs procesas suprantamas kaip angliavandeni skilimas. Veikiant desmolazms, vyksta jungi tarp dviej anglies atom skilimas arba organins molekuls struktros pakitimas. Desmolazs desmolizs metu paruoia, vykdo ir ubaigia anglies atom grandins skilim. [12]

280

1.5. Mieli kokybs vertinimas Svarbiausi mieli kokybs rodikliai yra j biologinis grynumas, morfologins (lsteli forma, dydis) ir fiziologins (sugebjimas rauginti, sudaryti dribsnius, daugintis ir t. t.) savybs. Mieli grynumas nustatomas stebint mikroskopu ir sjant mitybines terpes, o lsteli forma bei dydis stebint mikroskopu. Jeigu randama daug morfologikai pakitusi lsteli ir kartu susilpnjs j fermentinis aktyvumas, miels yra degeneruotos. Tokios miels alaus gamybai netinka. Senas mieles reikt atjauninti 46 val. paauginant vieioje misoje. Gerose sjamosiose mielse gali bti ne daugiau kaip 10 % negyv lsteli. Mieli kultroje esant daug negyv lsteli, gali ltai vykti alkoholinis rgimas, daugintis paaliniai mikrobai, o negyvosios lstels gali autolizuotis ir suteikti alui specifin prieskon. Negyvosios lstels paalinamos gerai praplaunant altu tekaniu vandeniu, nes jos lengvesns u gyvas. Apie mieli gebjim gerai rauginti cukr sprendiama i glikogeno buvimo j lstelse. Apie 7075 % lsteli turt bti glikogeno. Jeigu toki lsteli kultroje yra maiau, tai rodo, kad jos yra senos arba blogai maitinosi. Glikogeno maja mielse, laikomose po vandeniu auktesnje kaip 0C temperatroje. Mis pradjus rauginti mielmis, turiniomis maai glikogeno, pagrindinis rgimas bna ilgesnis. Todl tokias mieles reikia atjauninti. Mieli fiziologinis aktyvumas nustatomas i cukraus surauginimo laipsnio, rgimo energijos, gebjimo daugintis, sudaryti dribsnius ir nussti. Cukraus surauginimo laipsnis nustatomas i sausj mediag likuio po dviej par rauginimo 2025 C temperatroje. Mieli rgimo energija apskaiiuojama pagal susidariusio anglies dioksido arba alkoholio kiekio ir misos trio santyk. Gebjimas daugintis nustatomas pagal lsteli pumpuravim, dauginimosi greit ir koeficient. Jaunose mielse turi bti 4070 % pumpuruojani lsteli. Mieli dauginimosi greitis ir koeficientas nustatomas skaiiuojant lsteles per tam tikr laiko tarp standartinje terpje. Mieli dauginimosi greitis matuojamas pasjus jas mis su apyni ekstraktu (11 % sausj mediag) ir tris paras auginant 68 C temperatroje. Lsteli dauginimosi koeficientas tai kiekio santykis su pradiniu kiekiu. Jis apskaiiuojamas po septyni augimo par. Mieli sugebjimas sudaryti dribsnius ir nussti daniausiai nustatomas vizualiai. Tam tikslui mieli suspensija supilama graduot mgintuvl ir stebima, per kiek laiko miels nusda ant dugno. Dribsnius sudaranios miels paprastai nusda per 10 min., o smulkialstelins per 30 min. [4] 2. Alaus mieli gamybos technologija 2.1. Mieli dauginimas laboratorinmis slygomis 2.1.1. Grynosios mieli kultros dauginimas Alaus gamybai naudojamos grynosios alaus mieli kultros. Mikrobiologikai gryna alaus mieli kultr mons gauna i centrins grynj kultr kolekcijos mokslini tyrim institut, mikrobiologini laboratorij ar kit moni grynosios kultros skyri, paprastai mgintuvlyje. emutinio rgimo miels skiriasi dauginimosi greiiu, rauginimo energija, diacetilo kaupimo ir jo redukavimo aktyvumu, flokuliaciniais sugebjimais, galutiniu surauginimo laipsniu, taip pat sugebjimu formuoti tam tikr alaus skon. Alaus rass pasirinkimas priklauso nuo daugelio veksni: 1) pasirinktos alaus gamybos technologijos specifikos; 2) alaus gamybai naudojam rengini; 3) gamybinio pajgumo, naumo; 4) subalansavimo tarp alaus virimo, rauginimo ir ilaikymo skyri. Daniausiai naudojamos ios mieli rass Saccharomyces carlsbergensis 11, 36, 41, greitai rauginantis tamas 8A(M) arba f-2. Alaus darykloje ivedant grynj kultr, reikia laikytis toki slyg: naudoti sterili mis ir indus, pamau prijaukinti mieles prie emos temperatros. Ivedimas tai mieli dauginimas nuo mgintuvlio, gaunamo i muziejaus kolekcijos, iki rauginimo talpoms reikalingo kiekio. Visas procesas susideda i dviej stadij: laboratorins ir cechins. Laboratorijoje, bokse i mgintuvlio (1) nuo misos agaro terps miels steriliai perkeliamos kolb (2), kurios talpa 300 mL. Sjimai laikomi esant 1825 C temperatrai apie 24 36 val. iki energingo rgimo momento. Vliau i rgstanti misa perpilama kolb (3), kurios talpa 35 l. Joje

281

yra apie 23 l sterilios misos su apyniais, temperatra 1518 C, paliekama 2436 valandoms. Vliau rgstanti misa perkeliama butel (4), kurio talpa 30 l. Jame yra apie 2025 litrus misos, paimtos i virimo katilo, rauginama 1215 C temperatroje 48 valandas. Paruoiama 4000 litr talpa (5), kuri supilama apie 1000 litr gerai apcukrintos misos su apyniais, temperatra 12 C, dedamos miels i butelio (4), kad j koncentracija susidaryt apie 10 %. Garban stadijoje talpa pripildoma misos. Pirmin rgimo stadija vykdoma 12 C temperatroje, toliau 68 C temperatroje. Visas procesas pavaizduotas 4 pav.

4 pav. Alaus mieli dauginimas laboratorinmis slygomis. 1 mgintuvlis, 2 300 mL kolba, 3 butelis su 23 l misos, 4 butelis su 2025 l misos, 5 kubilas su 5001000 l misos ir apyniais

2.2. Alaus mieli dauginimas pusiau gamybinmis ir gamybinmis slygomis 2.2.1. Mieli dauginimas Genzeno sistemos aparatuose Ganzeno sistemos aparatas sudarytas i rauginimo cilindro ir sterilizatoriaus. Abu indai yra cilindrins formos, pagaminti i raudonojo vario, j vidus padengtas alavu. Kiekvienas cilindras turi dangt, kurie prisukami vartais, o kad bt sandars turi gumines iedines tarpines. Rauginimo cilindre yra maiykl, kurios ais nuleista per dangio vidur, maiykls ments idstytos prie pat dugno. Maioma rankiniu bdu. Ant rauginimo cilindro dangio pritvirtintas lenktas vamzdis (skirtas angliargts dujoms ir orui nuleisti), kurio kitas galas nuleistas ind (1) su vandeniu, taip sukuriamas hidraulinis utvaras. Rauginimo cilindro one pritvirtintas vandens lygio matavimo stiklas, kurio virutin dalis sujungta su vatiniu filtru (2). Oras vatin filtr patenka i oro komunikacij. Rauginimo cilindro dugne yra vamzdis (geleinis arba guminis), kuris sujungia su sterilizatoriumi. Grynai mieli kultrai pilti yra speciali anga. Alaus mielms ir alui ipilti padarytas specialios konstrukcijos ileidimo kranas (4). Krano vamzdelis cilindro viduje yra lenktas emyn ir yra 3,5 centimetro nuo dugno. Tai padaryta tam, kad nuleidiant al (mis) ir mieles nepatekt ukratas i iors. Sterilizatorius skirtas steriliai misai ruoti. Jis turi gyvatuk, or tiekia per steril filtr. Priklausomai nuo to, ko reikia, gyvatuku leidiamas vanduo arba garai: jei reikia paildyti garai, jei ataldyti vanduo. Sterilus oras puiamas, kad misa pakankamai sisavint deguonies ir misos, reikalingos perpumpuojant. Sterilizatorius yra didesns talpos nei rauginimo cilindras. Misa perpumpuojama i sterilizatoriaus geleiniu vamzdiu arba gumine arna. Rauginimo cilindras prie pirm pakrovim, o sterilizatorius prie kiekvien pakrovim sterilizuojami atriais garais. Oro vatinis filtras sterilizuojamas sausais garais. Visi aparatai prie paleidiant tikrinami, ar yra hermetiki. I pradi rauginimo cilindras upildomas misa iki 1/10 arba 1/20 jo trio ir leidiama mielms rgti. Po vienos, dviej par pripilama misos iki 1/3 cilindro trio ir paliekama rgti. Vliau aparatas pripildomas iki darbinio trio. Baigiantis rgimui (710 par, priklausomai, kokia temperatra buvo palaikoma, daniausiai nuo 6 iki 12 C) panaudota misa (alus) paalinama, o miels, kurios tankiu sluoksniu nusdusios rauginimo cilindro viduje, vl upilamos sterilia misa, maiomos steriliu oru. Didioji dalis (0,80,9) misos ir mieli siuniamos rauginimo skyri. Liks nedidelis kiekis naudojamas tolesniam dauginimui. Taip procesas kartojamas nepertraukiamai. Past maistingojoje terpje mieli kokyb tikrinama per mikroskop. Aptikus infekcij arba mieli isigimim, procesas stabdomas ir imama vieia mieli kultra [12].

282

5 pav. Ganzeno aparatas: rauginimo cilindras (kairje) ir sterilizatorius (deinje). 1 indas su vandeniu, 2 vatinis oro filtras, 3, 4 kranas

2.2.2 Mieli dauginimas Greinerio sistemos aparatuose Didelio kiekio mielms pagaminti ir dauginti naudojamas Greinerio sistemos aparatas. Greinerio sistemos aparatas susideda (6 pav.) i: dviej sterilizatori (1) ir (3), dviej rauginimo cilindr (2), naudojam rauginimo pradioje, ir talpos (4), kurioje laikoma pasta kultra tolesniam naudojimui. Sterilizatoriai ir rauginimo cilindrai gaminami i vario, o vidus padengiamas alavu arba nerdijaniu plienu. Sterilizatoriuose rengti apsauginiai votuvai, manometrai, du gyvatukai (vienas ant kito), naudojami kaitinti arba aldyti (apatinis naudojamas ildyti ir aldyti, virutinis aldyti), dvigubi sterilaus oro filtrai ir kontrols matavimo prietaisai. Rauginimo aparatuose (2) rengti nedideli indai (4) grynai kultrai palaikyti aparato darbo metu. Puiamas oras yra sterilus, jis komunikacijomis patenka sterilizatori. Mao sterilizatoriaus talpa yra 650 litr, didelio 4000 litr, rauginimo cilindr 360 litr. Laboratorijoje i mgintuvli atliekami keli persjimai, kurie ubaigiami Kalsbergo kolbos usjimu. Misa Kalsbergo kolboje rauginima 56 paras, 78 C temperatroje, paskui kolbos patenka I cech. Aparatai prie paleidiant sterilizuojami garais, paskui sterilizatori (1) dedama gatava misa su apyniais, kuri sterilizuojama suspaustais garais, naudojant gyvatuk ir ataldoma. Misa dedama rauginimo aparat (2), kuriame per fakel usjama gryna kultra i Kalsbergo kolbos, tris paras rauginima, iuo metu vyksta ir mieli dauginimasis, temperatra 8 C, tuo metu paruoiamas sterilizatorius (3), upildomas misa, sterilizuojama ir ataldoma iki 8 C. Tada sterilizatori (3) pilama i talpos (2) irauginta mieli biomas (500 litr). Dalis raugintos misos (po 10 litr i kiekvieno aparato (2)) nupilama indus (4), kuriuose laikoma kaip sjamoji kultra tolesniam rauginimui. Sterilizatoriuje (3) tris paras raugiama, todl sterilizatorius (3) atlieka dvi funkcijas: kaip sterilizavimo talpa ir kaip parengiamojo rauginimo rezervuaras. Rauginimo aparatas (2), itutintas po rauginimo, vl upildomas sterilia misa i sterilizatoriaus (1) ir usjamas mielmis, laikomomis induose (4). Mieli auginimo procesas Greinerio sistemos aparatuose vyksta nepertraukiamai, kol aptinkamas kultros utertumas. Rauginta misa su mielmis i didiojo sterilizatoriaus perduodama rauginimo talp (10 000 litr), upilama apie 3 000 litr gamybins alaus misos, o po 12 valand dar pilama 4 000 litr, po 36 valand rauginta misa su mielmis naudojama sjimui pagrindinio rauginimo talpoje. Darbin talpa upildoma misa iki 50 % ir procesas tsiamas iki normalaus surgimo ir paviesjimo, toliau vieias alus perpumpuojamas laikymo (brandinimo) rs. Jei naudojamos pirmos generacijos miels, jas galima naudoti 1012 generacij [12]. Misai rauginti naudojami mieli kiekiai: 1. Atvirose rauginimo talpose 0,5 litro mieli /100 litr misos. 2. Udarose rauginimo talpose 1 litras mieli /100 litr misos.

283

6 pav. Greinerio aparatas. 1 maasis sterilizatorius, 2 rgimo cilindrai, 3 didysis sterilizatorius, 4 indai grynai kultrai palaikyti

2.2.3. Mieli pamimas, laikymas ir regeneracija Mieli pamimas. Nupylus jaun al brandinimo skyriuje nuimamos miels. Jos yra tankiu sluoksniu nusdusios ant rauginimo tanko dugno sien. Mieli nuosdos susideda i trij sluoksni. Apatiniame sluoksnyje, susidariusiame ant dugno, yra mirusios miels ir nuosd dalels. Sluoksnis tamsios spalvos. Viduriniame, viesesns spalvos, yra gyvybingos miels, pamau nusdusios rgimo metu. io sluoksnio miels turi geras rauginimo savybes ir naudojamos kitam rauginimui. Virutinis rudas sluoksnis susideda i lengv, nesubrendusi mieli lsteli, nusdusi pagrindinio rgimo gale. Jame yra daug mirusi mieli, paalini mikroorganizm, nuosd, alaus ir apyni derv. Virutinis ir apatinis sluoksniai gamybins atliekos. Atsargiai atskirtos viduriniojo sluoksnio miels nuo virutinio ir apatinio sluoksni surenkamos vonel. Vonel naudojama mieliems praplauti ir laikyti. Ji pavaizduota 7 pav. Vonels gaminamos i aliuminio. Jomis patogu naudotis, nes turi dvigub dugn (altam vandeniui laikyti), special mechanizm, naudojam ipilant (vonel palenkiama) [12].

284

7 pav. Praplovimo ir laikymo vonel. 1 nupylimo nosel, 2 ais, 3 stovas, 4 dvigubas dugnas, 5 vandens ileidimas, 6 aldymo vanduo, 7 vandens pylimo iaupas

Pagrindinis mieli apdirbimo, paruoimo ir perpumpavimo aparatas pavaizduotas 8 pav. Virutinis liukas naudojamas vidinei ertmei praplauti ir dezinfekuoti. Aparatas gaminamas i aliuminio.

8 pav. Apdirbimo, paruoimo ir perpumpavimo aparatas. 1 manometras, 2 dangio iedas, 3 nupylimo iaupas, 4 barboteris, 5 padklas, 6 liuko dangtis, 7 udarymo mechanizmas, 8 fiksatorius

Praplautos miels atsilaisvina nuo nereikalingo ekstrakto, baigia rgti ir gerai nusda. Miels labai jautrios ioriniams poveikiams, todl jos plaunamos atsargiai, tam tikros temperatros ir sudties vandeniu. Jei praplovimo vanduo nra biologikai varus, jis valomas dezinfekuojamomis mediagomis. Miels praplaunamos altu vandeniu (12 C). Jas kiekvien dien upilamos altu vandeniu (12 C), praplauti naudojami vibraciniai sietai (nuo baltymini dribsni ir apyni. Tokios praplautos miels naudojamos 1012 generacij, kol mirusi lsteli kiekis nevirija 5 % ir jo neuteria mikrobais. Mieli apdorojimas rgtimi. Pastebjus darbinse mielse bakterijas (koncentracija didesn kaip 1 %) ir pilant mieles i tanko tank rekomenduojama mieles apdoroti rgtimi ne reiau kaip kas 34 mieli generacijas. Darbins miels apdorojamos 8,5 % ortofosforo rgties tirpalu. J temperatra turi bti ne auktesn kaip 2 C, esant iai temperatrai ltai pridedama rgties nuolat maiant 2 C temperatroje iki pH 2,2. Rgties koncentracija masje neturi viryti 0,2 %. Tuo atveju, kai pH yra maiau kaip 2,2, rekomenduojama pridti papildom kiek mieli. Apdorotos rgtimi miels paliekamos apie dvi valandas, periodikai maiant ir stebint temperatr, kuri neturi bti auktesn kaip 2 C. Apdorotas mieles reikia i karto pilti mis. Apdorojimas rgtimi nerekomenduojamas mielms, kuriose bakterij koncentracija

285

didesn kaip 10 % ir kurios yra nusilpusios po ilgo rauginimo ir laikymo. Tokios miels apdorojamos esant didesnms pH reikmms (daugiau kaip 2,5 pH), apdorojimo laikas sutrumpinamas iki 4060 minui. Mieles galima regeneruoti 10 % sieros rgtimi, sulfidine rgtimi, arba 0,35 %, 3,5, amonio disulfatu (pH 3,5). Tuo atveju mieli santykis su vandeniu 1 : 3 [10]. Mieli aktyvacijai rekomenduojama naudoti preparat Alkoten, praskiest nedideliame (0,51 litre) misos kiekiu. Reguliariai naudojant preparat naudojimo doz yra 0,9 gramai 100 litr misos, naudojamos rauginti. Gerokai pablogjus mieli bklei rekomenduojama naudoti 3,5 gramo 100 litr. Naudoti preparat rekomenduojama ir apdorojus mieles rgtimi (35 g/100 l). 2.3. Gamybos kontrols objektai ir metodai Grdai turi bti apirimi. Ant j pastebjus pelsi ymi tiriama mikroskopu. Jei grdai ir salyklas smarkiai ukrsti pelsiniais grybais, jie brokuojami. Alaus salyklo misoje nustatomas bendras mikroorganizm skaiius, pelsini gryb, rgtis gaminani bakterij ir arnyno lazdeli buvimas bei j stabilumas. Bendras mikroorganizm skaiius nustatomas giluminiu metodu MPA pasjus 1 cm3 misos. Grybai ir rgtis gaminanios bakterijos nustatomos po 0,1 0,5 cm3 misos usjant paviriniu metodu ant SMA su kreida. Pasliai inkubuojami 6975 valandas, esant 2931 C temperatrai. arnyno lazdeli titras nustatomas rgimo metodu. Misoje neturi bti pelsini gryb ir rgtis gaminani bakterij. Stabilumas nustatomas salyklo mis supylus kelias sterilias kolbas ir jas laikant 25 C temperatroje. Kasdien kolbos tikrinamos ir registruojamas nuosd ikritimo, plvels susidarymo ir drumstimosi pradios laikas. Tiriant mikroskopu skysio, nuosd, plvels, drumzli mginius, nustatomas mikroorganizm buvimas. Jeigu salyklo misa daugiau nei keturias paras lieka nepakitusi, vadinasi, ji yra biologikai vari. Mieli grynoje kultroje nustatomas paalini mikroorganizm (bakterij, laukini mieli) buvimas. Nesacharomicetins laukins miels nustatomos misos mginius sjant ant sietins terps su lizinu, o sacharomicetins ant speciali terpi su vyno rgtimi. Grynos kultros miels brokuojamos, jei randama iek tiek bakterij arba paalini mieli lsteli. Sjam mieli kokyb tikrinama vien kart per par mikroskopu ar yra bakterij, laukini mieli, o rauginimo metodu tiriamas arnyno lazdeli titras. Leidiamas bakterij kiekis ne daugiau kaip 0,5 % bendro kultrini mieli skaiiaus, o laukini mieli neturi bti i viso. Be to, kultrini mieli lstelse nustatomas glikogeno buvimas, taip pat negyv lsteli skaiius. Glikogeno turini lsteli turi bti ne maiau kaip 70 %, o negyv ne daugiau kaip 5 % bendro sjam mieli skaiiaus. Alus tiriamas rgimo pradioje, pabaigoje, irgs ir supilstytas butelius. Rgimo pradioje alus vadinamas jaunu. Mginiai imami i pagrindinio rgimo fermentatoriaus 23 dien sutrikus fermentacijos procesui: susilpnjus arba sustiprjus rgimui, kur rodo kylantys burbuliukai, ir t. t. Mikroskopu nustatomas paalins mikrofloros buvimas. Esant reikalui mginiai sjami terpes laukinms mielms, lazdelinms bakterijoms, kokams, pediokokams itirti. Likus septynioms paroms iki rauginimo pabaigos, kai fermentoriaus dugn nusda visos miels, alus supilamas sterilius butelius, kurie laikomi 25 C temperatroje. Kai mikroorganizm yra per daug, po dviej, trij par alaus paviriuje atsiranda plvel, skystyje matomi dribsniai, jauiamas puvimo arba rgtus kvapas. Galima tarti, kad blogai buvo iplauti ir dezinfekuoti fermentatoriai arba misa buvo labai uterta mikroorganizmais. Nustatomas stabilumas, bendras mikroorganizm ir arnyno lazdeli skaiius. Kiekvienos ries alaus stabilumui nustatyti kasdien atsitiktinai atrenkama po du butelius, kurie laikomi ir stebimi 20 C temperatroje septynias ar deimt par. Bendras mikroorganizm skaiius nustatomas paviriniu metodu usjant po 0,20,5 cm3 alaus ant SMA su nistatinu. arnyno lazdels aluje nustatomos panaiai kaip ir geriamajame vandenyje. Pagal sanitarines normas speciali ri aluje arnyno lazdeli negali bti 10 cm3 alaus, 3 cm3 masinio vartojimo ir 1 cm3 i statini pilstomo alaus.[3] 3. Optimali alaus mieli gamybos technologija ir j naudojimas alaus gamyboje Alaus gamyboje optimaliausia naudoti emutinio (lager) rgimo mieles. ios miels priklauso Saccharomyces carlsbergensis riai. Jos skiriasi nuo auktutinio rgimo mieli geromis flokuliacinmis savybmis. Tai altojo rgimo miels, kurias dauginasi +5 +10 C temperatroje. Daugumos emutinio

286

rgimo mieli ilgis yra 911 mikrono, o plotis 47 mikron. Apatinio rgimo miels trisacharid rafinoz suskaido fruktoz ir melibioz, o i, veikiama fermento melibiazs, suskyla gliukoz ir galaktoz. Todl apatinio rgimo miels rafinoz visikai suraugina, o virutinio tiktai vien tredal, nes neturi fermento melibiazs. Alaus darykloje norint gauti gryn kultr reikia laikytis toki slyg: naudoti sterili mis ir indus, pamau pripratinti mieles prie emos temperatros. Grynoji kultra tai mieli, esani mgintuvlyje, gaunamame i muziejaus kolekcijos, dauginimas iki kiekio, reikalingo rauginimo talpoms. Visas procesas susideda i dviej stadij: laboratorins ir cechins. Laboratorijoje, bokse i mgintuvlio nuo misos agaro terps miels steriliai perkeliamos kolb, kurios talpa 300 mL. Sjimui jos laikomos esant 1825 C temperatrai apie 2436 valandas iki greito rgimo momento. Vliau i rgstanti misa perpilama kolb, kurios talpa 35 ir joje yra apie 23 litrus sterilios misos su apyniais; temperatra 1518 C, paliekama 2436 valandoms. Paskui rgstanti misa perpilama talpos 30 litr butel, kuriame yra apie 2025 litrus misos, paimtos i virimo katilo; rauginama 1215 C temperatroje 48 valandas. Ceche paruoiama 4000 litr talpa, kuri supilama apie 1000 litr gerai paruotos misos su apyniais, temperatra 12 C, supilamos miels i butelio, kad koncentracija susidaryt apie 10 % mieli ( 500 litr misos pilama 50 litr). Garban stadijoje talpa pripildoma misos, pirmin rgimo stadija vyksta 12 C temperatroje, toliau 68 C temperatroje. Didelio kiekio mielms pagaminti ir dauginti naudojamas Greinerio sistemos aparatas. Greinerio sistemos aparatas (9 pav.) susideda i: dviej sterilizatori (1) ir (3), rauginimo cilindr (2), naudojam rauginimo pradioje, ir talp (4), kuriose laikoma sjimo kultra tolesniam naudojimui. Sterilizatoriai ir rauginimo cilindrai gaminami i vario, o vidus padengiamas alavu arba nerdijaniu plienu. Sterilizatoriuose rengti apsauginiai votuvai, manometrai, du gyvatukai (vienas ant kito) naudojami kaitinti arba aldyti (apatinis naudojamas ildyti ir aldyti, virutinis aldyti), dvigubi sterilaus oro filtrai ir kontrols matavimo prietaisai. Rauginimo aparatuose (2) rengti nedideli indai (4) grynai kultrai palaikyti aparato darbo metu. Puiamas oras yra sterilus, jis komunikacijomis sujungtas su sterilizatoriumi. Mao sterilizatoriaus talpa 650 litr, didelio 4000 litr, rauginimo cilindr 360 litr. Laboratorijoje i mgintuvli atliekami keli persjimai, kurie ubaigiami Kalsbergo kolbos usjimu. Misa Kalsbergo kolboje rauginama 56 paras, 78 C temperatroje, paskui kolbos perkeliamas cech. Aparatai prie paleidiant sterilizuojami garais, paskui sterilizatori (1) dedama gatava misa su apyniais, kuri sterilizuojama suspaustais garais naudojant gyvatuk ir ataldoma. Misa supilama rauginimo aparat (2), kuriame per fakel usjama gryna kultra i Kalsbergo kolbos. Misa rauginama tris paras, kartu vyksta ir mieli dauginimasis, temperatra 8 C. Tuo metu paruoiamas sterilizatorius (3), upildomas misa, viskas sterilizuojama ir ataldoma iki 8 C. Paskui sterilizatori (3) perpumpuojama i talpos (2) irauginta mieli biomas (500 litr). Dalis raugintos misos (po 10 litr i kiekvieno aparato (2)) nupilama indus (4), kuriuose laikoma kaip sjamoji kultra tolesniam rauginimui. Sterilizatoriuje (3) tris paras rauginama, todl sterilizatorius (3) atlieka dvi funkcijas: kaip sterilizacijos talpa ir parengiamojo rauginimo rezervuaras. (2) Itutintas po rauginimo rauginimo aparatas vl upildomas sterilia misa i sterilizatoriaus (1) ir usjamas laikomomis induose (4) mielmis. Mieli auginimo procesas Greinerio sistemos aparatuose vyksta nepertraukiamai, kol aptinkamas kultros utertumas. Rauginta misa su mielmis i didiojo sterilizatoriaus nukreipiama rauginimo talp (10 000 litr), upilama apie 3 000 litr gamybins alaus misos, o po 12 valand dar pilama 4 000 litr, po 36 valand rauginta misa su mielmis naudojama usti pagrindinio rauginimo talpoje. Darbin talpa upildoma misa iki 50 % ir procesas tsiamas iki normalaus surgimo ir viesjimo, o jaunas alus perpumpuojamas laikymo (brandinimo) rs, miels naudojamos kaip pirmos generacijos, mieles galima naudoti 1012 generacij. Skaidri ataldyta misa patenka rauginimo talp, kurioje miels logaritminje fazje gali bti laikomos nuo penki iki septyni savaii. iuo metu turi bti palaikoma pastovi mieli koncentracija, kad nesikeist mieli kiekis rauginimo metu. Terp nuolat maioma. Mieli norma yra 0,5 1/hl. Misa rauginama septynias paras rauginimo talpose. Pagrindinis rauginimas vyksta rauginimo talpose arba rezervuaruose. Rauginimo patalpoje palaikoma 68 C temperatra. Pagrindinis rgimas skirstomas kelias stadijas, kurios skiriasi rauginamos misos paviriaus kitimu ir ekstrakt majimo lygiu. Pagrindin rgimo stadija trunka 11,5 paros. iuo metu dauginasi miels ir misos paviriumi susidaro lengvos putos. O misos koncentracija per par sumaja 0,10,2 %. Antroji rgimo stadija trunka 23 paras ir vadinama apatini garban stadija. ioje stadijoje susidaro tirtos kompaktikos garbanotos putos. Misoje per par sumaja 0,50,8 % ekstrakto.

287

Treioji stadija trunka 34 paras. Ji vadinama auktj garban stadija. iuo metu misa rauginama intensyviausiai. Ekstrakt nuostoli per par esti 0,81,5 %. Ketvirtojoje stadijoje pamau nusda putos, susidaro mieli dribsniai, alus nuskaidrja. ioje stadijoje per par ekstrakt sumaja 0,50,2 %, tai trunka dvi paras. Kai ekstrakt per par sumaja 0,10,2 %, pagrindinis rgimas baigiasi. Pagrindinis raugimas vyksta rauginimo tankuose, talpose. Rauginimo talpoje palaikoma 68 C temperatra. Ataldyta misa pilama rezervuarus iki 1/3 trio. Vienam dekalitrui pridedama 0,5 litro misos. Priklausomai nuo pradins misos, patenkanios rauginimo aparatus koncentracijos, rgimas trunka 710 par. 1113 % misos rauginama 7 paras, 1418 % misos 810 par. Pasiekus nustatyt rauginimo laipsn (viesiajam alui 5860 %; tamsiajam alui 5055 %) pagrindinio rgimo procesas baigiasi ir gaunamas 56 C temperatros jaunas alus. Siurbliu jaunas alus varomas pirminio filtravimo rengin, o separatoriuje i jauno alaus atskiriamos miels. Prirauginimui pridedama viei arba surinkt ir perplaut mieli. Prirauginimo (ilaikymo) skyrius rengiamas emiau rauginimo skyriaus, kad galima bt naudotis savitaka. Prirauginimo patalpoje palaikoma 12 C temperatra. Plokteliniame aldytuve alus ataldomas ir varomas karbonizavimo talpas, kuriose yra prisotinamas anglies dioksido dujomis (0,2 %). Susidariusios anglies dioksido dujos itirpsta aluje, esant rezervuaruose 0,130,15 MPa slgiui. Toliau alus perpompuojamas laikymo tankus, kuriuose laikomas 15 par iki surauginimo 7678 %, laipsnio esant 1 C temperatrai. Gatavo alaus kokybs analiz atliekama cheminse laboratorijose, kuriose nustatomas alkoholio, angliargtes kiekis aluje, rgtingumas, spalva ir stabilumas.

9 pav. Greinerio aparatas: 1 maasis sterilizatorius, 2 rgimo cilindrai, 3 didysis sterilizatorius, 4 indai grynai kultrai palaikyti

Atsiskaitymas 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Mieli charakteristika. Alaus mieli charakteristika. Alaus mieli chemin sudtis. Alaus mieli pigmentai, vitaminai ir fermentai. Mieli dauginimas laboratorinmis slygomis. Alaus mieli dauginimas pusiau gamybinmis ir gamybinmis slygomis. Gamybos kontrols objektai ir metodai. Optimali alaus mieli gamybos technologija ir jos panaudojimas alaus gamyboje.

Literatra 1. Grinien, E. Biochemija. Kaunas: Technologija, 1998. 181 p. 2. Gailinien, A. Biochemija. Kaunas: KMU. 1999

288

3. Peiulis, J. Mikrobiologiniai maisto produkt kokybs tyrimo metodai. Vilnius: Leidybos centras. 1995, p. 5763. 4. Peiulis, J. Mikrobiologija. Vilnius: Mokslas. 1983, p. 1421; 4043; 147 p. 5. Holum, J. R. Fundamentals of general, organic and biological chemistry. USA, 1997. 745 p. 6. Devlin, T. M. Biochemistry, New York, 1997. 7. Baneviius, J. Alus ir stiprs grimai. Kaunas: Aura. 2000. 41 p. 8. , .; , .; , . // rauwelt, . 1999. Nr. 11. c. 2429. 9. , . . // rauwelt, . 1999. Nr. 11. C. 2223. 10. AB Vilniaus Tauras technologins instrukcijos. 11. , . .;. , . . . , 1985. 12. , . .. . . 1964. 571 c. 13. Bernatonis, J.; Venskaviius, J. Bendroji maisto produkt technologija. Vilnius: Mokslas, 1977. 14. Kundre, W. Technology Brewing and Malting. T: Wainwright, 1996. 15. Lietuvos standartas LST 44: -1993. Alus. Bendrosios slygos. 16. Dagys, V. Darau savo al. kininko patarjas. 2000. 17. Velika, A. Kaip kartumas virsta saldumu. http://www.alutis.lt

5. Alaus filtravimo ir ipilstymo technologija


Darbo tikslas Susipainti ir sisavinti alaus filtravimo, separavimo bei ipilstymo technologijas. Tyrimo objektas Alaus separavimo, filtravimo bei ipilstymo cechai. Naudojamos priemons ir renginiai Separatorius, kizelgrinis filtrpresas, buteli plovimo bei ipilstymo renginiai. Darbo eiga Alaus filtravimas Mieli liekanoms atskirti nuo alaus, prekinei ivaizdai suteikti ir stabilumui ilaikyti alus filtruojamas (skaidrinamas). iandien alaus filtravimas neatsiejamas nuo alaus pramons, taiau plaiau filtravimas buvo pradtas naudoti tik XX a. pradioje. Alaus filtravimas sukl ios pramons akos atstov diskusijas. Buvo tvirtinama, kad filtruojant kartu su mielmis i alaus yra paalimos mediagos, kurios yra svarbios jo skoniui bei kitoms savybms. Dar buvo tvirtinama, kad nuolatinis filtr naudojimas sudaro galimybes slpti technologines problemas, o tai sudaro slygas mati viso personalo darbo atlikimo kruoptumui. Nepaisant vis i prietaravim, filtruotas alus dl iskirtini savo savybi peln daugelio vartotoj pripainim ir filtras tapo neatskiriama alaus pramons dalimi [1]. Filtravimas vyksta kizelgriniuose filtruose, separatoriuose, rminiuose filtruose su filtravimo mase. Daniausiai dl gero efektyvumo bei rezultat yra naudojami kizelguriniai filtrai. Juos naudojant pasiekiamas didesnis skaidrumo laipsnis, ilaikoma spalva, skonis ir putojimas [1, 3]. Prie filtruojant al, rezervuaras sujungiamas su suspausto oro ar angliargts linija, kad sudaryt reikiam slg, o prie rezervuaro nuleidiamojo iaupo prijungiama alaus arna, kuria alus tiekiamas filtr. Paskui atidaromas rezervuaro iaupas ir oro linijos ventilis ir tik tada paleidiamas siurblys, kuriuo atiteka alus. Filtravimo metu rezervuaruose palaikomas slgis ne maesnis nei ilaikymo metu. Taip pat btina palaikyti virslg induose saikikliuose, kuriuos filtruojamas alus, norint isaugoti jame itirpusi

289

angliargt. Visose gamybos stadijose turi bti vengiama putojimo, susijusio su angliargts praradimu [1, 4]. Alaus arnos ir vamzdiai turi bti vienodo skersmens ir su lygiu vidiniu paviriumi. Alus vamzdiais tiekiamas tolygiai; virslgio negalima keisti staigiai nutraukiant or ar angliargt. Maiomas skirtingo tankio alus tiekiamas filtracijai i dviej ar trij rezervuar vienu metu per maiytuv. Prie filtrus rekomenduojama rengti saugiklius ir ataldyti al iki 0,51 C temperatros. Prie prijungiant arn prie filtro, pirma alaus porcija renkama nedidel ind ir perduodama perdirbti. Tik paskui, kai i arnos prads tekti alus be mieli, arna prijungiama prie filtro. Vanduo, istumtas i filtro, paalinamas kanalizacij. Pirmos porcijos atskiesto alaus, itekanio i filtro, surenkamos atskir ind ir nukreipiamos perdirbti. Tik paskui, kai i filtro pradeda tekti pilnavertis alus (tikrinama organoleptikai), jis yra nukreipiamas filtruoto alaus rinktuv. Filtruoto alaus rezervuarus btina rengti aldomoje patalpoje, kad alus bt emos temperatros. iuose rezervuaruose iki pilstymo pabaigos turi bti palaikomas 0,40,5 atm slgis, kuris daniausiai sudaromas naudojant angliargt [2]. Alaus filtravimo metu vis laik turi bti grietai palaikomas virslgis. Alus filtr turi bti tiekiamas tolygiai ir nenutrkstamai. Filtravimo metu stebimas perfiltruoto alaus skaidrumas. Jis stebimas per filtro stebjimo langel arba tiesiog stebimas alaus pavyzdys stiklinje. Alaus separavimas Alui nuskaidrinti separuojant plaiai naudojamas hermetikas lktelinis icentrinis separatorius, i kurio periodikai ikraunamos nuosdos. Tokio separatoriaus schema pateikta (1, 2 pav.).

1 pav. Icentrinis separatorius su nuosd ikrovimo renginiu: 1 perdavimo mechanizmas; 2 korpusas; 3 rotorius; 4 droselis; 5 lki paketas; 6 dangtis; 7 velenas; 8 paskirstymo

2 pav. 1 lkts; 2 lki paketas; 3 bgnas; 4 misos anga; 5 iedas; 6 nuosdos

Judaniame tarp lkteli aluje pakibusios nuosd dalels, veikiamos icentrins jgos, imetamos ant emutini lki paviriaus ir juo nuiuoia erdv 6, sudarydamos tank sluoksn prie vertikalaus bgno paviriaus. viesesnis alus paalinamas i bgno per ileidiamj rang, o nuosdos periodikai praplaunant bgn [2]. Prie paleidiant separatori, reikia apirti ir patikrinti rang, tepalus vonioje, stabdi ijungim. Separatorius upildomas vandeniu ir tik paskui jungiamas. Prie jungiant nustatomas 0,10,15 MPa slgis, toliau jis po truput didinamas iki 0,5 MPa. Vanduo i separatoriaus iteka kanalizacij. Kai separatoriaus

290

bgnas gauna reikiam apsisukim dan, vandens tiekimas ijungiamas ir jungiamas alaus. Pasirodius alui kontroliniame lange, tiekiamj ir ileidiamj separatoriaus rang sujungiame su alaus vamzdiu. Darbo metu palaikomas normalus slgis: einant 0,07 MPa, o ieinant 0,5 MPa. Darbinis rotoriaus apsisukim danis yra apie 5000 aps/min. Darbo pradioje separatoriaus naumas yra apie 20 h/l per valand. Jeigu alus ieina gerai nuviesintas, separatoriaus naumas padidinamas iki maksimalaus (45 h/l) ir palaikomas viso darbo metu. Separatoriaus naumo sumainti nerekomenduojama, nes nuo to alus nepaviesja. Kadangi procesas yra nepertraukiamas, nutraukti alaus tiekimo srovs, pavyzdiui, per perjim nuo vieno tanko prie kito, negalima. Prie separatori turi stovti maiiklis, o naujas tankas jungiamas tada, kai alus dar yra pradiniame tanke. Prie sustabdant separatori vietoje alaus j tiekiamas vanduo, kuris nuteka kanalizacij ir tik paskui separatorius ijungiamas nenutraukiant vandens tiekimo. Kai separatoriaus nuosd erdv upildoma nuosdomis, jis sustabdomas ir bgnas perplaunamas kartu vandeniu (ne daugiau kaip 70 C) bei dezinfikuojaniu tirpalu. Vandens cirkuliacijos metu separatorius trumpam jungiamas. Plovimo pabaigoje jis perplaunamas altu vandeniu, kol vanduo tampa visikai skaidrus. Valdant bgn draudiama naudoti arminius tirpalus [1]. Alaus filtravimas kizelgriniuose filtruose Aukto skaidrumo laipsnio alui gaminti separuotas alus dar ir filtruojamas. Alus filtruojamas per filtruojamj milteli sna sluoksn. Toki filtr ypatumas yra tas, kad ant kartono ploktels sukuriamas sluoksnis i mediagos (diatomito), iplautos ant t plokteli. Diatomitas, dar vadinamas kizelgru, yra lengvas, viesiai pilkos, geltonos ar baltos spalvos, daniausiai i vienalsi dumbli sudaryta mediaga. Filtravimo milteliai gaunami iuo bdu: grubiai suskaldytas diatomitas apdeginamas esant 8001100 C temperatrai, paskui sumalamas ir frakcionuojamas pagal daleli dyd. Milteli tankis 0,450,37 kg/l. Milteliai labai porti, dl to daleli paviriaus plotas siekia net iki 20 m2 vienam kilogramui milteli mass. Daleli dydis svyruoja nuo 2 iki 100 m. Prie filtravim reikia paruoti filtr darbui. Jei filtras paleidiamas pirm kart, visa sistema upildoma 2 % 60 C temperatros sodos tirpalu. jungiant siurbl, tirpalas cirkuliuoja ne maiau kaip 15 min, paskui jis paalinamas, o filtras plaunamas kartu vandeniu (6070 C) tol, kol ileidiamos praplovimo vanduo taps neutralus. Filtras upildomas milteliais taip: ant filtro plokteli udedamas atraminis kartonas, prie tai 20 30 min. imirkytas kartame vandenyje. Paskui filtras surenkamas ir upildomas vandeniu. Kai vanduo prads tekti per oro iaupus, jungiamas siurblys ir stebima, kad slgis bt 4 atm. Tai atliekama siekiant patikrinti hermetikum. maiytuv iki puss pripilama vandens ir nepertraukiamai maiant pilamas kizelgras. Pirmojo sluoksnio pabaiga nustatoma, kai kizelgro nerandama vandenyje, einaniame pro stebjimo langel. Po pirmojo sluoksnio sudaromas antrasis. Sudarant filtravimo sluoksnius, btina stebti oro paalinim i filtro, dl to reikia kiek atidaryti oro kranus. Prie tiekiant al filtr, btina sitikinti, kad dozavimo siurblys veikia normaliai ir siunia suspensij magistralin vamzdyn. Normaliai dirbant stebjimo langelyje aikiai matoma purkiamo kizelgro porcija. Istmus vanden alumi filtre, alus nukreipiamas filtruoto alaus rezervuar, kur rekomenduojama statyti vienu lygiu su filtru. Filtruojama tol, kol slgis filtro plokteles pasiekia 5 atm, paskui jungiamas siurblys dozatorius ir alus i filtro istumiamas vandeniu. Filtras atidaromas, nuosdos nuplaunamos alto vandens srove. Filtras vl surenkamas ir per j prieinga alaus tekjimo kryptimi (filtravimo metu) paleidiamas vanduo. Siekiant ivengti sluoksnio paeidimo filtravimo procese negalima stabdyti siurblio, tiekianio al filtr. Darbo pabaigoje filtras, maiytuvas, dozatorius ir vamzdiai praplaunami altu vandeniu. Ne reiau kaip 2 kartus per mnes filtras dezinfekuojamas 20 % kartu sodos tirpalu [4]. Po filtravimo alus pilstomas.

291

Buteli plovimo technologin instrukcija Alus btinai turi bti pilstomas tik vari tar, kuri gaminama i tvirto, permatomo stiklo, nepraleidianio alui kenksming sauls spinduli. ie spinduliai gali sukelti chemines reakcijas, kuri pasekm produktai, skleidiantys nemalon kvap. Atrenkant butelius i taros cecho pilstymo cech plovimui, nauji ir naudoti buteliai yra tikrinami prie viesin ekran. Atmetami nestandartiniai, defektiniai ar stipriai uterti buteliai. Tie buteliai, kurie atitinka kontrols keliamus reikalavimus, toliau keliauja automatin buteli plovykl [1]. Buteli plovimo aparato AMM 6 schema (3 pav.):

3 pav. 1, 2, 3, 4 buteli plovimo renginiai, 5 sukimo grandins, 6 korpusas, 8, 13 ildytuvai, 9, 14 vonios, 11, 12 vonios skysiui po plovimo, 16 krovimo mechanizmas, 21 ikrovimo mechanizmas

Buteli kasets, pritvirtintos ant dviej grandini (5), sudaro nesibaigiant konvejer. ios konvejerio grandins sukamos 5 vaigdui por. Apatinje automato korpuso dalyje yra 2 vonios (9) ir (14). iose voniose buteliai mirkomi. Virutinje korpuso dalyje yra idstyti buteli apiplovimo renginiai (1), (2), (3) ir (4), skirti buteliams apdoroti arminiu tirpalu, iltu ir altu vandeniu, taip pat (11) ir (12) vonios, kurias teka plovimo skystis po apiplovimo. Apatinse voniose su armu taisyti ildytuvai (8) ir (13). Taip pat yra tinklinis bgnas, i tirpalo surenkantis nuplautas etiketes. Vanduo, esantis virutinje vonioje, yra ildomas garais. krovimo mechanizmas susideda i eils voleli (16), kurie sukasi viena kryptimi. kaset telpa 16 buteli. vars buteliai ikraunami ikrovimo mechanizm (21). iuo mechanizmu buteliai yra pastatomi vertikali padt ir stumiami plastikin transporter (20). Buteli plovimo aparate yra automatikai reguliuojamas temperatros reimas palaikant nedidel plaunam skysi temperatros svyravim. Nuo dideli temperatros svyravim padidja suduusi ar suskilusi buteli. Buteliai plovimo automate plaunami taip: ant pakrovimo stalo jie skalaujami iltu 25 30 C vandeniu, kuris teka i vonios (12) aplakstymo vamzd (18); buteliai yra paildomi ir dalis nevarum nusiplauna; prie pirmj plovimo voni buteliai apipilami silpnu arminiu vandeniu i vamzdio (22), kuris j patenka i vonios (11). Vanduo, naudojamas pakrovimo stale, prie pirmj voni yra labai nevarus, todl jis patenka kanalizacij; vonioje (14) vyksta nevarum mirkymas. Mirkoma 12 % arminiame tirpale (NaOH su NaCo priedu) esant 6065 C temperatrai, ijusios i vonios kasets rieda bgnu. ia vyksta buteli apiplovimas arminiu 6065 C temperatros tirpalu, tam kad nusiklijuot etikets.

292

Vonioje (9) nevars buteliai yra mirkomi 12 % arminiame tirpale esant 7580 C temperatrai; virutinje horizontaliojoje dalyje buteliai daug kart apiplaunami i vidaus ir iors kartu arminiu tirpalu (6065 C), paskui iltu ir altu vandeniu. Iplauti ir atvsinti buteliai dar pereina kelis etapus, kad vanduo nutekt. Vliau buteliai i kasets yra perduodami pakrovimo stal [2]. Buteli plovimo automatai AMM 6 yra skirti 0,5 l ir 0,33 l talpos buteliams. Alaus ipilstymas butelius Alus ipilstomas taras izobarinmis slygomis, t. y. kai jo slgis yra pastovusis ir perteklinis. Pilstomas nesuslgtas alus putot ir taip bt prarandama angliargt bei nesandariai upildoma tara. Pilstyti naudojamos izobarins pilstymo mainos. Prie upildant, butelis hermetikai udaromas. Taigi talpos susisiekia tik su pilstymo aparato alaus rezervuaro duj erdve, taigi nustatomas slgis, lygus slgiui alaus rezervuare ir tik paskui talp pradeda tekti alus. Taip pat alaus istumiamos CO2 dujos vl nukreipiamos rezervuar. Izobarikai pilstomas alus beveik neputoja. Angliargts praradimas yra minimalus. Alus pilstomas butelius automatinse linijose automatikai, sujungtais tarpusavyje plokteliniais transporteriais. Linijoje vyksta buteli plovimo, alaus pilstymo, ukimimo, brokavimo ir etiketavimo procesai. Alaus temperatra pilstant palaikoma ne auktesn kaip 3 C. Alaus vamzdiai iki pilstymo main turi bti su ilumos izoliacija. Buteliai ukemami metaliniais kamteliais, kuriuose yra hermetikum utikrinanti tarpin. Tarpin turi bti vari, o kamtelio lako danga nepaeista. Prie ukemant kamteliai garinami arba dezinfekuojami 2 % formalino tirpalu, o vliau gerai praplaunami vandeniu. Brokuoti buteliai nustatomi viesos ekranu. Nepilni, blogai udaryti ar su mechaninmis priemaiomis buteliai atrenkami, atkemami ir taip alus grinamas atgal gamykl. Patikrinus brok tolesnis automatas uklijuoja etiket, ant kurios nurodyta alaus ris, ipilstymo data, gamyklos pavadinimas, alaus stiprumas. Etiketms klijuoti naudojami klijai, pasiymintys geru gebjimu klijuoti ir greitu atmirkimu iltame vandenyje. Alus gali bti pilstomas ne tik butelius, bet ir statines bei cisternas. Pilstyti naudojamos statins gaminamos i aliuminio bei kit mediag, kurios atitikt reikalavimus, keliamus pilstymo, transportavimo bei pardavimo metu. Grainamos i prekybos statins turi bti kruopiai patikrinamos, ar nra mechanini paeidim, paalini kvap, likusi daikt ir pan. Statins gali bti plaunamos plovimo mainose naudojant virktus. Aliuminini statini karto vandens temperatra turi bti 6570 C, jei neatliekama dezinfekcija. Iplautos statins perduodamos pilstyti. Pilnas, alaus pripildytas statines draudiama stumdyti ir ridinti grindimis. Upildytos statins usukamos metaliniais kamiais, dezinfekuotais 3 % formalino tirpalu [5, 3]. Atsiskaitymas 1. 2. 3. 4. 5. Alaus filtravimo technologija. Alaus separavimo technologija. Alaus filtaravimas kizelgriniuose filtruose. Buteli plovimo technologija. Alaus ipilstymo technologija.

Literatra 1. , . .; ; . . : , 1985. 146 c. 2. , .; , . , Moa, 1977. 468 c. 3. Puslapis alaus megjams internet: www.alutis.lt 4. Ma, . M. e . . 1984. 516 c. 5. Peiulis, J. Mikrobiologiniai maisto produkt kokybs tyrimo metodai. Vilnius, 1995. 254 p.

293

6. Alaus gamyba cilindriniuose kginiuose tankuose (CKT)


Darbo tikslas sisavinti alaus gamyb cilindriniuose konusiniuose tankuose. Tyrimo objektas Cilindrini konusini tank alaus gamybos baras. Naudojamos priemons ir renginiai: Cilindriniai konusiniai tankai. Darbo eiga Pradjus naudoti dirbtin alt alaus virimo monse atsirado galimyb reguliuoti numatyt temperatrin reim atskiruose rauginimo aparatuose, kartu betarpikai ataldant al. Tai sudaro galimyb rauginti ir nokinti viename vertikaliame cilindrokonusins formos aparate. Toki aparat talpa yra nuo 50 (auktis 8 m) iki 400 m3 (auktis 15 m). Esant tokiam dideliam aukiui cilindrokonusiniame rauginimo aparate vyksta stipri misos konvekcija (persimaiymas i apaios vir, ir atvirkiai), sukelta anglies dioksido burbuliuk isiskyrimo ir j judjimo vir; taip pat dl ilumini skysio srovi, kuri stiprumas priklauso nuo rgimo intensyvumo, reguliuojamo tam tikros temperatros palaikymu aldant. Kartu su misa aparat sudedamos miels ir rauginama 810 par. Pasiekus reikiam rgimo lyg konusin dalis stipriai ataldoma ir miels nusda. Intensyviai aeruojant mis pagrindinis rgimas 1214 C temperatroje vyksta 712 par. Po pagrindinio rgimo alus nokinamas. Jaunas alus ataldomas aparate iki 12 C ir leidiamas varus anglies dioksidas. Paskui alus karbonizuojamas. Jis atliekamas esant 0 C ir padidintam slgiui. Karbonizuotas alus naudojamas likusioms mielms nussti. Visas rauginimo ir nokinimo procesas tsiasi 1014 par. Cilindrinis kginis rauginimo aparatas gaminamas i korozijai atsparaus plieno su poliruotu vidiniu paviriumi (r. 1 pav.). Aparatas turi keturis aldanius markinius: tris ant cilindrins dalies ir vien ant kgins dalies. Apatin kginio dugno dalis nuimama (valant ir plaunant, taip pat vizualiai apirint po dezinfekcijos). Per liuk virutiniame dangtyje aparato vid eina vamzdis su plovimo galvute, vamzdyn sistema sujungta su dezinfekcini tirpal siurbliais ir talpykloms. Apatin cilindrinio korpuso dalis baigiasi atraminiu iedu. Ivols aparatas apskaiiuotas 0,07 MPa slgiui, vakuumo pertraukiklis iki 0,4 MPa. Pastarasis hidrauliniu uraktu jungiasi su antvamzdiu. Aparate yra renginys su armatra, naudojama misai, mielms, anglies dioksidui, plovimo skysiams, alio agentui tiekti, taip pat yra rengti temperatros, apytikrio virutinio lygio kontrols ir reguliavimo davikliai, apsauginis votuvas. Iimam mieli kontrolei konusins aparato dalies ijime yra taisytas stiklinis langelis. Alaus lygis aparate, slgis ir temperatra reguliuojami atomatikai. Vertikals cilindriniai konusiniai rauginimo aparatai gaminami 100 m3 talpos (darbinis tris 80 m3). aldomo paviriaus plotas 44,3 m2, maksimalus slgis aparate 0,07 MPa, o aldaniuosiuose markiniuose 0,4 MPa. Neupildytas aparatas be ilumins izoliacijos sveria apie 12 ton. Cilindriniai konusiniai rauginimo aparatai turi ilumos izoliacin apvalkal, kuris leidia juos rengti ne tik pastate, bet ir lauke. Alaus paruoimo cilindriniame konusiniame aparate technologija yra tokia: nuskaidrinta misa, ataldyta iki 6 C temperatros, nukreipiama konusin aparato dal per atidaryt ventil, sujungiant aparat su atmosfera. Aparatas pildomas kelias paras vienu ar dviem etapais, priklausomai nuo misos atjimo i virimo cecho. Pirmieji 50 % misos aeruojami steriliu oru. Intensyvi aeracija dar prie rgim leidia gauti misoje 46 mg/mL itirpusio deguonies. I pradi, kai misa upildyta tik 23 % darbinio trio, aparat naudojant siurbl dedamos stipriai rauginanios miels. Tuo paiu metu dedami ir fermentai. Po to aparatas upildomas misa 85 % jo trio. Rgimo proceso trukm pradedama skaiiuoti nuo misos nukreipimo aparat momento.

294

Per pirmsias dvi paras misos temperatra dl spiritinio rgimo pakyla nuo 6 C iki 1214 C ir tokia palaikoma (dl aldymo agento naudojimo virutinje aldaniojoje dalyje) iki galutins rgimo stadijos. Ataldyta per pavirinius markinius rauginama misa leidiasi emyn, o iltesn kyla vir taip utikrinamas geras natralus rauginamos misos susimaiymas. Kai ekstraktini mediag kiekis sumaja iki 3,53,2 %, aparatas puntuojamas ir toliau procesas vyksta esant 0,040,06 MPa slgiui. Taip alus geriau prisisotina anglies dvideginio ir pagreitinamas mieli nusodinimas. Kad rauginama misa neprialt prie aparato sieneli, aldymo agento temperatra turi bti ne emesn kaip +6 C. Kaip aldymo agentas naudojimas rasalas (pavirintas druskos tirpalas). Baigiantis intensyviam raugimui, kai ekstraktini mediag koncentracija aluje sumaja iki 2,62,2 %, konusin aparato dalis ataldoma iki 0,51,5 C temperatros. Pasiekus toki temperatr aldymo agento tiekimas aldanius markinius nutraukiamas. Cilindrinje aparato dalyje 1214 C temperatr palaikoma dar 1,52 paras, kad pagreitt rgimo procesas. Kginje aparato dalyje esant emai temperatrai vyksta mieli nusdimas ir tanki nuosd susidarymas. Tuo baigiasi pagrindinis rgimas, kuris vyko 712 par. Paskui visus aldaniuosius markinius (iskyrus kgins dalies) nukreipiamas aldymo agentas ir alus ataldomas iki 0,51,5 C temperatros. Prasiseda nokinimo stadija. Po 1011 par nuo rauginimo pradios i kgins aparato dalies ltai pirm kart nuimamos miels. Prie nuskaidrinant al vyksta antrasis mieli numimo specialias talpas etapas. Mieli numimo pabaiga nustatoma vizualiai per langel stebint alaus be mieli atsiradim. 0,06 MPa slgio erdv, esani vir skysio, alus nukreipiamas nuskaidrinti separavimo ir filtravimo bdu. Tuias aparatas plaunamas taip: 1 etapas: plaunama 2 % NaOH ir HNO 3 tirpalu, kurio temperatra 40 C. Plovimo trukm 45 min. 2 etapas: perplauname kambario temperatros vandeniu. Plauname 10 min. 3 etapas: plauname 1 % HNO 3 tirpalu. Temperatra 1215 C, trukm 45 min. 4 etapas: perplauname kambario temperatros vandeniu. Plauname 10 min. 5 etapas: plauname dezinfekatu, kurio pagrindas yra acto rgtis ir peroksidas, trukm 30 min. 6 etapas: perplauname kambario temperatros vandeniu. Plauname 10 min. Lyginant su klasikine alaus gamyba, CKT metodas turi privalum: 1. Rgimo ir nokinimo procedra sutrumpja du kartus. 2. Geresn aparato prieira. 3. Alus rgsta ir noksta vienoje patalpoje (nereikia jo perpumpuoti). Karta misa i hidrociklono yra nukreipiama ploktelin aldytuv, kuriame ataldoma iki 910 C temperatros. Misos tiekimo vamzdynas sujungiamas cilindrine kgine talpa, kurioje ir prasideda misos aldymas. aldant misa aeruojama suspaustu oru iki 0,30,4 g O 2 /l misos. Paskui aeruot mis yra dozuojamos miels, 0,51 l/hl misos. Misa pradedama rauginti 910 C temperatroje, paskui ji pakeliama iki 14 C. Rgimas vyksta 58 paras 14 C temperatroje. Temperatra yra palaikoma automatikai. 58 par nuo rauginimo pradios yra palaikomas 0,040,05 MPa slgis. Rauginimo proceso pabaigoje tanko konusin dalis yra ataldoma iki 1,5 C temperatros. Per 2 paras 1,5 C temperatroje yra nusodinamos miels. Miels yra surenkamos ir rauginamos, jas kiekvien dien priirint mikrobiologui. Miels naudojamos 58 operacij, t. y. tol, kol mirusi lsteli kiekis nevirija 810 %, ir jei jos neukrstos paaliniais mikroorganizmais. Nusodinant ir paalinant mieles virutinje cilindro dalyje palaikoma 1314 C temperatra. Kada miels paalinamos, pradedamas nokinti alus. Tam visas tris per 2 paras ataldomas iki 1,5 C temperatros. ioje temperatroje alus ilaikomas 1014 par. Likus 12 paroms iki alaus nokinimo pabaigos paimamos alaus pavyzdys. Jis yra patikrinamas nustatant juslinius ir fizikocheminius rodiklius, kurie turi atitikti nurodytus receptrose. Inokintas ir laboratorijoje patikrintas alus yra siuniamas alaus nuskaidrinimo bar.

295

Atsiskaitymas 1. Alaus gamybos technologija cilindriniuose kginiuose tankuose. Literatra 1. , P. A.; , . . , 1985. 468 c. 2. , . . . M. 1974, 620 c. 3. Alaus rauginimo ir nokinimo cilindrinse konusinse talpose technologin instrukcija. (Vilniaus Tauras) 4. Alus, internetas: http: //www. utenosalus.lt 5. Alaus gamyba, internetas: http: //www. alutis.lt

296

1 pav. Cilindrinis kginis tankas: 1. Produkto jimas ir ijimas; 2 3 aldymo agento jimas ir ijimas; 4 termometras; 5 Plovimo galvut; 6 mgini pamimas; 7 vandens ir dezinfekcinio skysio iaupas; 8 puntas; 9 sklend; 10 CO2 ijimas.

297

7. Alaus gamybos technologin kontrol


Darbo tikslas Atlikti alaus gamybos technologin kontrol. Tyrimo objektas Salyklo ir alaus gamybos cechai. Darbo eiga 1. Chemin laboratorija Chemin laboratorija yra skirta alaus, aliav, nutekamj vanden analizei. gamykl atvetos aliavos (mieiai, ryiai) tiriamos cheminje laboratorijoje. Laboratorijoje nustatomas grd drgnumas, natrinis svoris, ekstraktingumas ir svarbiausia grd gyvybingumas. Visa tai nustatoma grdus gavus i kinink ir ems kio bendrovi. Idaiginus mieius gautas salyklas taip pat tiriamas cheminje laboratorijoje. ia nustatomas ekstraktingumas, drgnumas, baltym kiekis. Taip pat ia nustatomas ir apcukrinimo laikas. Toliau sumalus salykl, nustatomas gautos misos rgtingumas. Cheminje laboratorijoje nustatoma ir nutekamj vanden kokyb. Remiamasi iais rodikliais: nutekamj vanden kvapas, skaidrumas, vairios priemaios. Laboratorijoje atliekami ir vandentiekio tyrimai: nustatomas geleies kiekis vandenyje, vandens kietumas. Kietas vanduo minktinamas leidiant j per katijon kolonl, taip pat filtruojant bei virinant. Prie parduodant tikrinamas alaus rgtingumas, sausj mediag kiekis bei alkoholis (%) ir vertinama alaus spalva. Visi ie rodikliai turi grietai atitikti mons nustatytus standartus. 2. Alaus gamyklos kontrols schema
2.1. aliavos

Kontrols objektas Mieiai Miei primimas

Miei prabos, primimo metu Kontrols objektas Salyklo pakaitalai

Kontrols rodiklis Organoleptinis vertinimas Miei temperatra vagone Drgms kiekis Kenkj paeisti grdai Natrinis svoris ir 1000 grd svoris Homogenikumas Utertumas piktolmis ir grdais paimtos Ekstraktingumas Baltymo kiekis Grdo apvalkalo kiekis Kontrols rodiklis Organoleptini savybi vertinimas Drgms kiekis Ekstraktingumas Riebal kiekis (kukurz miltuose) Grd temperatra Kenkj paeisti grdai Dygimo rodikliai Drgms kiekis Grd temperatra

Tikrinimo periodikumas Miei primimo diena kiekviename vagone. Miei primimo gamykl metu ir nustatant saugojimo viet

Vidutinse kiekvienos miei partijos, paimtos gamykl, prabose i vienos ikrovimo vietos per nustatyt laik Tikrinimo periodikumas Tikrinama kiekviena priimta partija Kiekvienoje grd saugojimo vietoje ne maiau, kaip vien kart per mnes; defekt atradimo atvejais daniau Po papildomo apdorojimo

Miei saugojimas

Mieiai papildomo apdorojimo

298

metu, saugojimo metu (maiymas, transportavimas i vienos saugojimo vietos kit) Mieiai prie perduodant gamyb

Apyniai

Vanduo, skirtas technologiniams tikslams

Natrinis svoris Drgnumas Grd utertumas piktolmis Grd uterimas kenkjais Natrinis svoris Drgms kiekis Grd utertumas piktolmis Grd utertumas vabalais ir kenkjais Organoleptinis vertinimas Lupulino bkl Skl kiekis Priemaios Bendras karij mediag kiekis Peleningumas Minktos dervos Alfa-rgtys Organoleptinis vertinimas Amoniako, azoto rgi ir laisvojo chloro kokybins prabos Oksidacijos laipsnis Kietumas Liekamasis armingumas

Ne reiau kaip vien kart perdavimo metu

Kiekviena priimta gamykl partija. Esant specialiai aparatrai

vien kart per ketvirt. Periodikai yra nustatomas pagaminto vandens kietumas ir chloro kiekis. Galima atlikti tyrimus specialiose laboratorijose

2.2. Technologinio proceso ir pusfabrikaio kontrol Kontrols objektas Salyklo gamyba. Miei valymas ir riavimas prie mirkym Mirkomi mieiai Kontrols rodiklis Grd riavimas Fogelio sietuose Vandens temperatra Mirkymo laipsnis Praktikai nustatytas mirkymo laipsnis Salyklo temperatra. Oro, einanio dygimo talpas, ir salyklo temperatra. Oro, ieinanio i salyklo dygimo bgno, temperatra. Daig kiekis procentais. Auganio lapelio ilgis. Praktikai nustatomas alio salyklo tirpumo laipsnis. Drgms kiekis Salyklo ir oro temperatra. Salyklo drgms kiekis, nuo virutinio groto pereinant apatin 1000 grd svoris Drgms kiekis Ekstraktingumas Apcukrinimo laikas Laboratorins misos kokyb: skaidrumas, spalva, rgtingumas Grdo pjvis arba pervietimas Tikrinimo periodikumas Kasdien vidutiniuose mginiuose Periodikai visuose mirkymo kubiluose Periodikai kiekviena dygstani miei partija

Daiginami mieiai

Diovinamas salyklas

Gatavas salyklas

Kiekviena diovinamo salyklo partija Periodikai visos diovinimo vietos, nustatant diovinimo reim Po kiekvienos salyklo laikymo talpos upildymo

299

diafanoskopu Purumo laipsnis Smulkaus ir stambaus malimo skirtumas ekstrakte Galutinis laboratorins misos rgimo laipsnis Kontrols objektas Kontrols rodiklis Karamelinis salyklas Organoleptinis vertinimas. Drgms kiekis Ekstraktingumas Spalvos rodikliai Misos paruoimas. Poliravimo Salyklo grd bvimas atliekose mainos darbas Salyklas, ne salyklo mediagos Drgms kiekis ir pakaitalai Ekstraktingumas Salyklo apcukrinimo laikas Salyklo malimas Trynimas Filtravimas

Tikrinimo periodikumas Kiekviena gaunama gaminama partija Periodikai

arba

Paruota misa

Susmulkinto salyklo frakcija Susmulkint apyni frakcija Rgimas Ataldyta misa Kontrols objektas alias alus

Sjamos miels Papildomas rgimas alaus talpose Alus, skirtas ileisti (duomenys pasui irayti)

Vidutiniuose mginiuose, kurie apima visas naudojamas mediagas (per kelet dien, savaii, dekad) Isisklaidymo praba: miltai, rengiant salyklo smulkintuv kruopos, luktas valcus ir toliau periodikai Pertrkio ir vandens temperatra Per kiekvien pertrk Apcukrinimo laipsni. Pertrkio pargtinimo pH Per kiekvien pertrk Organoleptinis misos vertinimas Misos koncentracija atskirose filtracins sistemos sekcijose Vandens temperatra veikiant armu Pirmins misos ir praplovimo vandenyje koncentracija Periodikai, kiek manoma Koncentracija daniau Apcukrinimas Periodikai (turint Spalva spektrofotometr) Rgtingumas (pH) Galutinio surgimo laipsnis Karij mediag kiekis Bendras, iplaunamas ir liks vien kart per savait ekstraktas kiekviename agregate Iplaunamas ekstraktas vien kart per savait kiekviename agregate Koncentracija pagal sacharometr Kiekviename pertrkyje Temperatra Kontrols rodiklis Tikrinimo periodikumas Sacharometro rodmenys Menamas Kiekvienas rgimo kubilas surgimo laipsnis Skaidrinimas bandymo stiklinje. Temperatra transportuojant rs Vandens temperatra vonelse Kiekviena mieli vonel Mikroskopavimas Slgis Kiekviena talpa Patalpos temperatra Alaus skaidrinimas Ilaikymo dien skaiius Kiekvien dien vidutin Organoleptiniai rodikliai kiekvienos pilstomos partijos Tikras ekstrakto kiekis praba

300

Alaus ipilstymas Alus filtruoto alaus rinktuvuose Filtravimo mas Buteli plovimas

Pradins misos koncentracija Tikras surgimo laipsnis Rgtingumas Spalva Upylimo slgis Kiekvienas surinktuvas Temperatra Vandens temperatra mass plovimo Kiekviena maina mainoje Plovimo main bakai Kiekvienoje plovimo mainoje Aluje, paimtame i kiekvienos mainos Pasterizuojant kiekvien partij

arminio tirpalo temperatra. Tirpalo temperatra Statini plovimas Vandens temperatra Alaus ipilstymas ir buteli bei pylimo pilnumas statini udarymas Buteli bei statini udarymo hermetikumas. Alaus temperatra buteliuose. Butelio su alumi ivaizda Alaus pasterizavimas Temperatra atskiruose etapuose ir etap trukm 2.3. Gatavas alus Kontrols objektas Ipilstyto alaus kontrol Kontrols rodiklis Ivaizda Aromatas ir skonis Putojimas ir put stabilumas Spirito kiekis Tikro ekstrakto kiekis Pradins misos koncentracija Rgtingumas (pH) Spalva Angliargts kiekis Stabilumas Oro nustatymas buteliniame aluje Izohumulono nustatymas Brinkimas Filtravimo savybs Paalini prieskoni bei kvap buvimas Brinkimas Filtravimo savybs Paalini prieskoni bei kvap buvimas Ivaizda. Elastingumas Lydymosi temperatra Prieskoni bei kvap buvimas Bendras rgtingumas Tirpumas Aktyviosios dalies kiekis LST rodikliai LST rodikliai

Periodikumas Kiekviena ris tris kartus per savait Visos ipilstyto alaus partij prabos Periodikai, turint atitinkam aparatr

Filtravimo mas

Kiekviena gaunama partija

Filtravimo milteliai

Kiekviena gaunama partija

Alaus derva Pieno rgtis Dezinfekcijos priemons Buteliai Alaus statins

Kiekviena gaunama partija Kiekviena gaunama partija Kiekviena gaunama partija Kiekviena gaunama partija

Gatavo alaus kokyb yra vertinama organoleptiniais arba jusliniais ir fizikiniais-cheminiais parametrais. Organoleptiniai (jusliniai): skonis, aromatas,

301

spalva, skaidrumas. putos fizikiniai-cheminiai parametrai: alkoholio kiekis (svorio ar trio %), sausos mediagos (svorio %), rgtingumas arba pH, CO2 kiekis aluje, O2 kiekis aluje, spalva. Pagrindiniai ie kokybs vertinimo parametrai yra aprayti pagrindiniame Lietuvos standarte LST 44 Alus. Bendrosios technins slygos. Pagrindiniai privalomi parametrai kokyb reglamentuojaniuose dokumentuose yra ie: 1. Sausos mediagos (svorio % balingai). 2. Alkoholis (trio %). 3. Spalva. 4. Juslins savybs (skonis, kvapas, puta). 5. Alus turi atitikti HN 26 (didiausias leistinas mikrobiologinis utertumas) ir HN 54 (apie kenksming mediag naudojim: metalai, radioaktyvieji elementai) higienos normas. Fizikin-chemin alaus analiz Fizikini-chemini parametr analiz atliekama gamybinje laboratorijoje, gamyboje (saikininkuose). 1.1. Alkoholio kiekio aluje nustatymas Klasikinis metodas alkoholiui aluje nustatyti yra distiliacijos metodas.

1 pav. Distiliavimo renginys alkoholio kiekiui aluje nustatyti

renginys sudarytas i kolbos 4, aldytuvo 2, la surinktuvo 3 ir kolbos 1, naudojamas distiliatui surinkti. Prie analiz kolba 1 pasveriama 0,1 g tikslumu ir sujungiama su aldytuvu. kolb 4 pilama 200 g alaus be CO2. CO2 dujos paalinamos purtant kambario temperatroje. kolb 1 pilama 10 mL distiliuoto H2O. Alus ltai kaitinamas iki virimo, o spiritas garuodamas eina per aldytuv, auta, kondensuojasi ir nuteka priimtuv 1. Kai tik prilaa 2/33/4 skysio nuo paimto alaus, distiliacija baigiama. Kolba 1 su turiniu ataldoma, atjungiama nuo aldytuvo, statoma ant svarstykli ir pripilama distiliuoto H2O iki 200 g skysio mass. Paskui kolbos turinys imaiomas ir piktnometru nustatomas santykinis tankis, o pagal lentel, kuri nurodyta Lietuvos standarte LST 1572 : 1999, randamas atitinkamas alkoholio kiekis aluje. Dabar alkoholio kiek aluje galima nustatyti daug greiiau ir paprasiau naudojant alaus analizatori A PAAR. Duomenys apdoruojami kompiuteriu.

302

1. 2. CO2 kiekio aluje nustatymas CO2 kiekis aluje nustatomas pagal i schem:

1 pav. renginys CO2 kiekiui aluje nustatyti

Virutinje prietaiso ploktelje yra pritvirtinta plienin adata 1, sujungta vidiniu kanalu su manometru M. Adatos galas eina per gumin sandarinimo ied 2. Prie nustatant CO2, butelis su alumi termostatuojamas vandens vonioje vien valand 25 C temperatroje, paskui iimamas i vonios, sausai nuluostomas, paymimas alaus lygis ir butelis statomas ant prietaiso apatins judanios ploktels 3 taip, kad kamtelio centras bt po adatos smaigaliu 1. Pasukant vart 4 butelis pakeliamas vir, sandariai prispaudiant j kamteliu prie sandarumo iedo 2 ir adatos 1. Butelio kamtelis praduriamas adata ir butelio ertm per adatos kanal susisiekia su monometro kamera. Butelis supurtomas rankomis iki pastovios manometro rodykls padties ir paymimi prietaiso rodmenys. Butelis iimamas, alus ipilamas, praplaunamas vandeniu ir iki tos paios yms pilamas nustatytas kiekis vandens. Paskui i sugraduoto cilindro butel pilamas vanduo iki viraus. inodami i cilindro (mL) pilto vandens tr, gausime duj erdvs tr butelyje:

C = (P + 1)(0,122 + A ) , C CO2 kiekis aluje, %, P manometro rodmenys, A koeficientas, kurio dydis priklauso nuo duj erdvs trio, nustatomas i lentels. Taip pat yra specialus CO2 matuoklis Haffmans, naudojamas CO2 koncentracijai saikikliuose nustatyti.
1.3. Rgtingumo nustatymas

Prie analiz CO2 paalinti 50 mL filtruoto alaus ilaikoma 30 min. konusinje siaurakaklje kolboje esant 40 C temperatrai, periodikai supurtant. Paskui ataldoma ir titruojama 0,1 N natrio hidroksido (NaOH) tirpalu. Sunaudotas armo kiekis dauginamas i 0,2 ir gaunamas alaus rgtingumas mL armo 100 mL alaus.
1.4. Spalvos nustatymas

Anksiau spalvai nustatyti buvo naudojamas toks renginys:

303

1 pav. renginys alaus spalvai nustatyti


1 plastmasin, laidi viesai pertvara, 2 stiklin su alumi (100 mL), 3 stiklin su vandeniu (100 mL), 4 stebjimo langeliai

stiklin su vandeniu po truput lainama 0,1 N jodo tirpalo, kol spalva ioje stiklinje susivienodins su spalva stiklinje su alumi. Sunaudotas jodo tirpalo kiekis (mL) ir bt spalvos parametras. Dabar spalva nustatoma spektrofotometru SPECTRONIC GENESYS 5: bangos ilgis yra dauginamas i tam tikro koeficiento, pvz., 430 0,026 = 11,18.
1.5. Stabilumo nustatymas

Stabilumui nustatyti 2 buteliai alaus laikomi tamsoje, 20 C temperatros patalpoje (termostate) ir stebimas drumstumas. Kiekvien dien buteliai apveriami ir stebimi prie vies. Pagal drumstumo atsiradimo laik, ireikt paromis nuo ipilstymo momento, nustatomas alaus stabilumas. Pagrindiniame Lietuvos standarte LST 44 Alus. Bendrosios technins slygos yra nurodyta alaus laikymo trukm. Pagrindiniai higienos reikalavimai, keliami alaus gamybai, yra vardyti Higienos normose.
1.6. Sausj mediag nustatymas

Sausosios mediagos aluje nustatomos naudojant sacharometr esant 20 C temperatrai. LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

Maisto aliavos ir produktai. Didiausias leidiamas mikrobinio utertumo lygis.


1. Taikymo sritis

1.1. i higienos norma skirta reglamentuoti teikiam rinkai maisto aliav ir produkt nekenksmingum moni sveikatai. 1.2. i higienos norma netaikoma apdorojant maisto aliavas ir produktus asmeniniams ar nam kio poreikiams bei per Lietuvos Respublik tranzitu gabenant maisto aliavas ar produktus, jeigu jie nekelia grsms moni ar gyvn sveikatai bei aplinkai. 1.3. Jeigu Lietuvos Respublikos tarptautinse sutartyse nustatyti kitokie reikalavimai, negu ioje higienos normoje, taikomi tarptautini sutari reikalavimai. 1.4. ioje normoje nurodyti didiausi leidiami maisto mikrobinio utertumo lygiai ir mikrobiologinei analizei naudojam bandini kiekiai, taikomi moni ileidiamos produkcijos ir importuojamo maisto utertumui vertinti. Prekybos tinkle ir kitose vartojimo srityse naudojam maisto produkt mikrobiniam utertumui vertinti gali bti tiriami kitokie maisto produkto bandini kiekiai, pagrsti bandini atrinkimo metod statistikos reikalavimais, taiau j mikrobinis utertumas bet kuriuo atveju neturi bti didesnis negu didiausias leidiamas lygis (M).
2. Nuorodos

ioje higienos normoje yra nuorodos tokius dokumentus:

304

2.1. LST ISO 4831 : 1998. Mikrobiologija. Koliformini bakterij skaiiavimas. Labiausiai tiktino skaiiaus nustatymas. 2.2. LST ISO 4832 : 1998. Mikrobiologija. Koliformini bakterij skaiiavimas. Kolonij skaiiaus nustatymas. 2.3. LST ISO 4833 : 1998. Mikrobiologija. Mikroorganizm skaiiaus nustatymas. Kolonij skaiiavimas 30C temperatroje. 2.4. LST ISO 6888 : 1998. Mikrobiologija. Auksini stafilokok (Staphylococcus aureus) ir j kolonij skaiiaus nustatymas. LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

2.5. LST ISO 6610 : 1996. Pienas ir pieno produktai. Mikroorganizm kolonijas sudarani vienet skaiiavimas. Kolonij skaiiaus nustatymas 30 C temperatroje. 2.6. LST ISO 6611 : 1996. Pienas ir pieno produktai. Mieli ir/ar pelsini gryb kolonijas sudarani vienet skaiiavimas. Kolonij skaiiaus nustatymas 25 C temperatroje. 2.7. LST ISO 6887 : 1998. Mikrobiologija. Skiedini mikrobiologiniams tyrimams ruoimas. Bendrieji nurodymai. 2.8. LST ISO 7218 : 1996. Mikrobiologija. Mikrobiologiniai tyrimai. 2.9. LST ISO 7932 : 1998. Mikrobiologija. Vakini bacil (Bacillus cereus) ir j kolonij skaiiaus nustatymas. 2.10. LST ISO 7937 : 1998. Maisto ir paar mikrobiologija. Lini klostridij (Clostridium perfringens) ir j kolonij skaiiaus nustatymas. 2.11. LST ISO 7954 : 1998. Mikrobiologija. Mieli ir/ar pelsini gryb skaiiavimas 25 C temperatroje. Bendrieji nurodymai. 2.12. LST ISO 8261 : 1996. Pienas ir pieno produktai. Bandini ir skiedini laboratoriniams tyrimams paruoimas. 2.13. LST ISO 10560 : 1998. Pienas ir pieno produktai. Monocitogenini listerij (Listeria monocytogenes) nustatymas. 2.14. LST ISO 7251 : 1996. Mikrobiologija. Eerichi (Escherichia coli) skaiiavimas. Bendrieji nurodymai. Labiausiai tiktino skaiiaus nustatymas. 2.15. LST ISO 6222 : 1998. Vandens kokyb. Gyvybingj mikroorganizm skaiiaus nustatymas. Kolonij standioje mitybinje terpje skaiiavimas. 2.16. LST ISO 6461 1 : 1998. Vandens kokyb. Sulfitus redukuojani sporini anaerob skaiiaus nustatymas 1 dalis: Pagausinimo skystoje terpje metodas. 2.17. LST ISO 6461 2 : 1998. Vandens kokyb. Sulfitus redukuojani sporini anaerob (klostridij) skaiiaus nustatymas 2 dalis: Membraninio filtravimo metodas. 2.18. LST ISO 7899 1 : 1998. Vandens kokyb. Fekalini streptokok nustatymas. 1 dalis: Pagausinimo skystoje terpje metodas. 2.19. LST ISO 7899 2 : 1998. Vandens kokyb. Fekalini streptokok nustatymas ir skaiiavimas. 2 dalis: Membraninio filtravimo metodas. 2.20. LST ISO 8360 1 : 1998. Vandens kokyb. aliamli pseudomon (Pseudomonas aeruginosa) nustatymas ir skaiiavimas 1 dalis: Pagausinimo skystoje terpje metodas. 2.21. LST ISO 8360 2 : 1998. Vandens kokyb. aliamli pseudomon (Pseudomonas aeruginosa) nustatymas ir skaiiavimas 2 dalis: Membraninio filtravimo metodas. LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

2.22. LST ISO 9308 1 : 1998. Vandens kokyb. Koliformini bakterij, atspari ilumai koliformini bakterij ir arnyno lazdeli (E. coli) kiekio nustatymas ir skaiiavimas. 1 dalis: Membraninio filtravimo metodas. 2.23. LST ISO 9308 2 : 1998. Vandens kokyb. Koliformini bakterij, atspari ilumai koliformini bakterij ir arnyno lazdeli (E. coli) kiekio nustatymas ir skaiiavimas. 2 dalis: Mgintuvli (labiausiai tiktino skaiiaus) metodas.

305

2.24. LST ISO 1429 : 1996. Auksini stafilokok (Staphylococcus aureus) ir j kolonij skaiiaus nustatymas. 2.25. LST ISO 1432 : 1996. Bendrieji salmoneli (Salmonella) iskyrimo metodai.
3. Terminai ir apibrimai

ioje higienos normoje pavartoti terminai ir apibrimai: 3.1. maisto aliava ir produktas. Maisto mediaga ar produktas, apdorotas, pusiau apdorotas ar neapdorotas, skirtas moni mitybai. iai svokai taip pat priklauso geriamasis vanduo, grimai ir kitos mediagos bei gaminiai, skirti mogui praryti ar kramtyti, iskyrus medicinos ir tabako gaminius. 3.2. bendras mikroorganizm skaiius. Bakterij, mieli ir pelsi, tyrimo metodu nustatytomis slygomis galini daugintis ir sudaryti kolonijas, skaiius viename grame (viename cm3) produkto. 3.3. koliformins bakterijos. Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis slygomis, esant (3037) C temperatrai skaidanios laktoz dujas ar mitybinje terpje sudaranios bdingas kolonijas. 3.4. arnyno lazdel (Escherichia coli). Bakterijos, esant 45 C temperatrai, tyrimo metodu nustatytomis slygomis skaldanios laktoz dujas ir sintezuojanios indol i triptofano. 3.5. auksinis stafilokokas (Staphylococcus aureus). Mikroorganizmai, kurie tyrimo metodu nustatytomis slygomis formuoja tipikas ir (arba) netipikas kolonijas ant selektyvios mitybins terps paviriaus ir rodo stipriai teigiam koaguliazs reakcij. 3.6. lin klostridija (Clostridium perfringens). Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis slygomis sudaranios bdingas kolonijas ir pasiyminios bdingu biocheminiu aktyvumu. LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

3.7. vakin bacila (Bacillus cereus). Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis slygomis sudaranios bdingas kolonijas ir pasiyminios bdingu biocheminiu aktyvumu. 3.8. sulfitus redukuojanios bakterijos. Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis slygomis selektyvioje terpje sudaranios tipikas kolonijas. 3.9. pelsiniai grybai. Mikroorganizmai, esant 25 C temperatrai tyrimo metodu nustatytomis slygomis selektyvioje terpje formuojantys tipikas kolonijas. 3.10. miels. Mikroorganizmai, esant 25C temperatrai, tyrimo metodu nustatytomis slygomis selektyvioje terpje formuojantys tipikas kolonijas. 3.11. aliamli pseudomona (Pseudomonas aeruginosa). Aerobins bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis slygomis formuojantys tipikas kolonijas. 3.12. monocitogenin listerija (Listeria monocytogenes). Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis slygomis selektyvioje terpje formuojanios tipikas kolonijas ir pasiyminios bdingomis morfologinmis, fiziologinmis ir biocheminmis savybmis. 3.13. salmonels (Salmonella). Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis slygomis selektyvioje terpje formuojanios tipikas kolonijas ir pasiyminios bdingomis biocheminmis ir serologinmis savybmis.
4. Bendrosios nuostatos

4.1. Didiausi leidiami mikrobinio utertumo lygiai nustatyti vadovaujantis iais principais: 4.1.1. galutinis, vartotojui teikiamas produktas turi bti nekenksmingas mogaus sveikatai: produktai, kuriuose yra patogenini mikroorganizm, neturi patekti rink;

306

4.1.2. vartoti skirtame produkte neturi bti toki mikrobins kilms toksin ar metabolit kieki, kurie gali kelti pavoj vartotojo sveikatai. 4.2. Maisto mikrobins taros lygiai ioje higienos normoje nurodyti valgomojoje maisto dalyje, fasuotuose produktuose visame tryje. 4.3. Visais atvejais, oficialiai vertinant maisto produkt utertum, bandiniai turi bti atrinkti galiot asmen, forminti bandini atrinkimo akte ir nurodyti visos siuntos, i kurios jie paimti, utertum. LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

4.4. Mikrobinio maisto aliavos ar maisto produkt, skirt monms vartoti, utertumo lygiai nustatomi Lietuvoje nustatyta tvarka teisintais laboratoriniais tyrimo metodais [2.12.25]. 4.5. ioje higienos normoje nenurodytais atvejais galutinis sprendimas dl leidiamo maisto produkto mikrobinio utertumo priimtas Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministerijos nustatyta tvarka.
5. Didiausi leidiami mikrobinio utertumo lygiai maisto produktuose
1 lentel. Nealkoholini grim ir alaus didiausias leidiamas mikrobinis utertumas

Produkto pavadinimas 1. Centralizuotai tiekiamas vanduo

Analits pavadinimas E. coli Bendras mikroorganizm skaiius 22 C Bendras mikroorganizm skaiius 37 C Fekaliniai streptokokai E. coli Fekaliniai streptokokai P. aeruginosa

MikroorganizAnalizs metodas mo tipas h LST ISO 9308 1, LST ISO 9308 2 i LST ISO 6222 i h h h i LST ISO 6222 LST ISO 7899 1, LST ISO 7899 2 LST ISO 9308 1, LST ISO 9308 2 LST ISO 7899 1, LST ISO 7899 2 LST ISO 8360 1, LST ISO 8360 2 HN 26 : 1998

n 5 5 5 5 5 5 5

c 0 0 0 1 0 1 1

m 0c 100 20 0c 0a 0a 0a

M 0c 100 20 1c 0a 1a 1a

2. Mineralinis vanduo

LIETUVOS HIGIENOS NORMA


1 lentels tsinys

Produkto pavadinimas 3. Fasuotas geriamasis vanduo

Analits pavadinimas E. coli Fekaliniai streptokokai Sulfitus redukuojanios klostridijos P. aeruginosa

MikroorganizAnalizs metodas mo tipas h LST ISO 9308 1, LST ISO 9308 2 h LST ISO 7899 1, LST ISO 7899 2 i LST ISO 6461 1, LST ISO 6461 2 i i LST ISO 8360 1, LST ISO 8360 2 LST ISO 9308 1, LST ISO 9308 2

n 5 5 5 5 5

c 0 1 1 1 2

m 0a 0a 0b 0a 1c

M 0a 1a 1b 1a 10c

4. Vaisvandeniai

Koliformins bakterijos

307

E. coli 5. Gazuoti grimai Bendras mikroorganizm skaiius Koliformins bakterijos E. coli

LST ISO 9308 1, LST ISO 9308 2 LST ISO 6222 LST ISO 9308 1, LST ISO 9308 2 LST ISO 9308 1, LST ISO 9308 2 LST ISO 9308 1, LST ISO 9308 2 LST 1432

5 5 5 5 5 5

0 0 2 0 2 0

0c 100 1c 0c 1 0

0c 100 10c 0c 10 0

i h i p

6. Nepasterizuotas Koliformins alus bakterijos Salmonella a 250 mL trio b 50 mL trio c 100 mL trio LIETUVOS HIGIENOS NORMA
6. Sutrumpinimai

HN 26 : 1998

6.1. n bandini, reikaling mikrobiologinei analizei atlikti, skaiius. 6.2. c bandini, kuriuose mikrobinis utertumas gali bti didesnis kaip m, skaiius. 6.3. m didiausias leidiamas mikrobinis utertumas visuose tyrimui paimtuose bandiniuose, ireikiamas indikuojam mikroorganizm kiekiu konkreiame tiriamo maisto produkto kiekyje (L. monocytogenes ir Salmonella 25 gramuose, visi kiti mikroorganizmai 1 grame ar 1 m3 (jei nenurodytas kitoks kiekis)), kai c = 0. 6.4. M didiausias leidiamas mikrobinis utertumas visuose tyrimui paimtuose bandiniuose, ireikiamas indikuojam mikroorganizm kiekiu konkreiame tiriamo maisto produkto kiekyje (L. monocytogenes ir Salmonella 25 gramuose, visi kiti mikroorganizmai 1 grame ar 1 m3 (jei nenurodytas kitoks kiekis)). M vert negali bti virijama nei viename bandinyje. 6.5. p patogeniniai mikroorganizmai. 6.6. h mikroorganizmai, rodantys netinkamas higienines produkto gamybos slygas. 6.7. i mikroorganizmai, kuri ioje higienos normoje ribojami kiekiai gali bti panaudojami kaip orientaciniai, diegiant maisto gamybos proceso vidins kontrols sistemas. LIETUVOS HIGIENOS NORMA
Maisto aliavos ir maisto produktai

HN 54 : 1998

Didiausias leidiamas chemini radioaktyviaisiais izotopais lygiai.


1. Taikymo sritis

teral

koncentracijos

ir

didiausi

leidiami

utertumo

1.1. i higienos norma skirta reglamentuoti tiekiam rinkai maisto aliav ir produkt nekenksmingum moni sveikatai. 1.2. i higienos norma netaikoma apdorojant maisto aliavas ir produktus asmeniniams ar nam kio poreikiams bei per Lietuvos Respublik tranzitu gabenant maisto aliavas ar produktus, jeigu ie nekelia grsms moni ar gyvn sveikatai bei aplinkai. 1.3. Jeigu Lietuvos Respublikos tarptautinmis sutartimis nustatyti kitokie reikalavimai, negu ia idstyti, taikomi tarptautini sutari reikalavimai.

308

2. Bendrosios nuostatos

2.1. Maisto aliavos ir maisto produktai, kuriuose teral kiekis visuomens sveikatos poiriu ir ypa toksikologiniu poiriu virija leidiamas ribas, neturi patekti rink. 2.2. Teral koncentracijos ir utertumo radioaktyviaisiais izotopais lygiai ioje higienos normoje nurodyti valgomojoje maisto dalyje, konservuose visame tryje, skaitant bet kok skyst, sirup, riebalus ir pan. Koncentruotuose ir sausuose produktuose, kdiki bei vaik maiste, jeigu atskirai nenurodyta, didiausios leidiamos koncentracijos ir didiausi leidiami utertumo radioaktyviais izotopais lygiai nustatomi paruotame vartoti produkte. 2.3. Visais atvejais, oficialiai vertinant maisto aliav ar maisto produkt tar, bandiniai turi bti atrinkti teiss normini akt nustatyta tvarka, galiot asmen ir forminti bandini atrinkimo aktu. 2.4. Teral analizs rezultatai gyja teisin gali tik tada, kai tyrimai atlikti akredituotoje arba arbitrainje laboratorijoje. LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 54 : 1998

3. Didiausios leidiamos chemini teral koncentracijos ir didiausi leidiami utertumo radioaktyviais izotopais lygiai maisto aliavose ir maisto produktuose
1 lentel

Produkto pavadinimas

Teralo pavadinimas

Grd produktai (grdai, vinas kruopos, miltai, anktini Kadmis darovi sklos, rieutai ir kt.); salyklas, mieiai, ryiai Alfatoksinas B1 Alfatoksin B1,2, G1,2 suma Ochratoksinas A LIETUVOS STANDARTAS

DLK, mg/kg 0,1 0,1 0,002 0,004 0,005

Pastaba Iskyrus rieutus Iskyrus rieutus, slenas ir grd gemalus Iskyrus anktini darovi sklas

LST 44 : 1993

is standartas nustato bendruosius techninius reikalavimus, keliamus alui, jo pakavimui, enklinimui, primimui, tyrimo bdams, gabenimui, laikymui.
Alus Bendrosios technins slygos 1. Taikymo sritis

1.1. is standartas taikomas alui, kuris yra silpnas alkoholinis grimas, prisodrintas angliargte, gaunamas fermentuojant alaus mis mielmis.
2. Nuorodos

2.1. iame standarte duotos nuorodos LST 1416 95, HN 26 94, HN 54 95, GOST 10846 74, GOST 10967 90, GOST 12786 80, GOST 12787 81, GOST 12788 87, GOST 12789 87, GOST 21948 76, GOST 26928 86, GOST 26929 86, GOST 29272 92.
3. Techniniai reikalavimai

3.1. Alus turi atitikti io standarto reikalavimus ir turi bti gaminamas pagal moni patvirtintas receptras ir technologijos instrukcijas.

309

3.2. Charakteristika. 3.2.1. Pagal spalv alus skirstomas : viesj; pusvies; tamsj. 3.2.2. Sausj mediag kiekis pradinje misoje gali bti nuo 10 % iki 21 % mass. 3.2.3. Alus gaminamas: pasterizuotas; nepasterizuotas; specialiai arba steriliai filtruotas; padidinto stabilumo. 3.3. Reikalavimai, keliami aliavoms, mediagoms. 3.3.1. Alui gaminti naudojamos ios aliavos: mieinis salyklas; irniai; mieiai; LIETUVOS STANDARTAS LST 44 : 1993 ryiai; kukurzai; grd ekstraktai ir kitos nesalyklins mediagos; apyniai ir j produktai; geriamasis vanduo; cukrus; alaus miels. Visos aliavos, naudojamos alaus gamybai, turi atitikti galiojanius normatyvinius dokumentus. 3.4. Alaus gamybai gali bti naudojami fermentiniai preparatai, stabilizatoriai ir kitos pagalbins mediagos, kurias leidia Sveikatos apsaugos ministerija ir kitos numatytos technologijos instrukcijose.

3.5. Alaus jusliniai rodikliai turi atitikti reikalavimus ir normas, pateiktas 1 lentelje.
1 lentel

Rodiklio pavadinimas Ivaizda Puta

Charakteristika ir norma Skaidrus, blizgantis skystis, be nuosd ir priemai Alus, piltas i 25 mm aukio (atstumas nuo butelio kaklelio iki virutinio indo krato) cilindrin var 110 mm aukio stiklin ind, kurio iorinis skersmuo 70 75 mm, esant (12 2) C temperatrai, turi ilaikyti kompaktin put, iskirti angliargts burbuliukus ir atitikti iuos reikalavimus: Putos auktis, mm, ne maesnis kaip: Alaus buteliuose 30 Pilstomojo alaus 15 Putos stabilumas, min., ne maesnis kaip: Alaus buteliuose 3,0 Pilstomojo alaus 1,5

3.6. Alaus fizikiniai ir cheminiai rodikliai turi atitikti nurodytus 2 lentelje. 3.7. Jusliniai, fizikiniai ir cheminiai rodikliai, alfa rgties kiekis kartoje misoje turi bti nurodyti kiekvienos alaus ries receptroje. 3.8. Alaus bakterinio utertumo lygis turi atitikti Lietuvos higienos norm HN 26. LIETUVOS STANDARTAS LST 44 : 1993

3.9. Didiausias leidiamas teral koncentracijos lygis aluje neturi viryti Lietuvos higienos normos HN 54. 3.10. Alus pakuojamas ir enklinamas pagal LST 1416.

310

4. Primimas

4.1. Alaus primimo taisykls pateiktos GOST 12786. 4.2. Toksikosios mediagos ir patogeniniai mikroorganizmai tikrinami Sveikatos apsaugos ministerijos nustatyta tvarka.
5. Tyrimo bdai

Mginiai atrenkami ir paruoiami pagal GOST 12786, GOST 26929 reikalavimus. Arbitainiai alaus fizikiniai ir cheminiai tyrimai atliekami: Etilo alkoholio ir sausj mediag kiekis pradinje misoje nustatomas pagal GOST 12787 arba EBC Analytica 9.1.1 p.; Rgtingumas pagal GOST 12788; Spalva pagal GOST 12789 arba EBC Analytica 9.4 p.; Angliargts kiekis pagal GOST 12790 arba EBC Analytica 9.15 p. 5.3. Mginiai toksikiems elementams nustatyti ruoiami pagal GOST 26929, nustatoma pagal GOST 26932. 5.4. Mikrobiologiniai tyrimai (bendras mikroorganizm skaiius, arnini lazdeli grups bakterij, patogenini mikroorganizm kiekiai) atliekami Sveikatos apsaugos ministerijos patvirtintais bdais.
6. Gabenimas ir laikymas

5.1. 5.2.

6.1.

Alus gabenamas ir laikomas pagal LST 1416.

7. Gamintojo garantijos

7.1. Gamintojas garantuoja, kad alus atitinka io standarto reikalavimus, jeigu laikomasi gabenimo ir laikymo taisykli. 7.2. Alaus laikymo trukm nuo jo pagaminimo datos paymima nustatyta tvarka patvirtintoje kiekvienos alaus ries receptroje ir neturi viryti nurodytos 3 lentelje. LIETUVOS STANDARTAS
3 lentel

LST 44 : 1993

Sausj mediag kiekis pirminje misoje, % 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Nepasterizuoto alaus laikymo trukm, paros viesusis alus Pusviesis alus Tamsusis alus 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

Specialiai arba steriliai filtruoto alaus laikymo trukm ne didesn kaip 45 paros. Pasterizuoto alaus laikymo trukm ne didesn kaip 180 par. Padidinto stabilumo alaus laikymo trukm ne didesn kaip 360 par.

311

Atsiskaitymas

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Sausj mediag nustatymas. Alkoholio nustatymas. Spalvos nustatymas. CO2 kiekio nustatymas. Rgtingumo nustatymas. Stabilumo nustatymas.

Literatra

1. , . .; , . . : , 1985. 146 c. 2. Bernatonis, J.; Venskeviius, J. Bendroji maisto produkt technologija. Vilnius: Mokslas. 1977. 118 p. 3. LST 44 : 1993. Alus. Bendrosios technins slygos. Lietuvos standartizacijos tarnyba. 1993. 13 p. 4. LST 1490 : 1997. Alus. Spalvos nustatymas. Lietuvos standartizacijos tarnyba. 1997. 5 p. 5. HN 26 : 1998. Maisto aliavos ir produktai. Didiausias leidiamas mikrobinio utertumo lygis. Lietuvos standartizacijos tarnyba. 1998. 12 p. 6. HN 54 : 1998. Maisto aliavos ir maisto produktai. Didiausios leidiamos chemini teral koncentracijos ir didiausi leidiami utertumo radioaktyviaisiais izotopais lygiai. Lietuvos standartizacijos tarnyba. 1998. 57 p. 7. Puslapis alaus mgjams internetas: http://www.alutis.lt.

312

Eksperimentini tyrim pagrindai


Pratybos Aurelija virblien

1. Biologini duomen bazs internete. NCBI duomen bazs. Entrez paiekos sistema
iose pratybose studentai supaindinami su Europos bioinformatikos instituto (EBI), Nacionalinio biotechnologins informacijos centro (NCBI) ir kitomis biologini duomen bazmis, Entrez paiekos sistemos galimybmis. Studentai gauna uduot surasti informacij apie savo eksperimentini tyrim objekt iose duomen bazse, pavyzdiui, mokslins literatros altinius, duomenis apie tiriamojo baltymo struktr, j koduojanio geno sek ir pan. Nuorodos: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.embl.org/ http://www.ebi.ac.uk/ http://www.isb-sib.ch/ http://mcb.harvard.edu/BioLinks.html

2. Literatros duomen paieka PubMed duomen bazje. Metod apraym paieka internete
i pratyb metu studentai detaliau supaindinami su mokslins literatros ir metod duomen bazmis. Jie gauna uduot surasti mokslinius straipsnius arba patentus i savo eksperimentinio darbo temos bei darbui reikaling metod apraymus. Literatros altini paiekos nuorodos: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi http://www.biomedcentral.com http://cellbiol.com/journals.htm http://www.bmn.com/ http://ep.espacenet.com/ Metod apraym paiekos nuorodos: http://www.protocol-online.net/ http://www.cellbio.com/ http://wheat.pw.usda.gov/homepage/lazo/methods/ http://www.highveld.com/protocols.html http://research.nwfsc.noaa.gov/protocols.html

3. DNR sek paieka gen banke. DNR sek palyginimas bei koduojam baltym sekos nustatymas, naudojant BLAST kompiuterin program
iose pratybose studentai gauna uduot surasti tam tikr DNR sek gen banke ir j apibdinti: rasti panaum su kitomis sekomis, nurodyti promotoriaus ir terminatoriaus vietas, jeigu jos yra duomen bazje, rasti nuorodas nurodyt baltym ir jo sek. Taikomi vairs paiekos bdai: pagal geno pavadinim, pagal autorius, citavimo altin, prijimo numer . DNR sek paiekos nuorodos: http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html http://golgi.harvard.edu/sequences.html http://nrcbsa.bio.nrc.ca/~nash/genbank.html http://www.tigr.org/tdb/

328

Analizuojama seka lyginama su kitomis DNR sekomis, naudojant BLAST kompiuterin program. Pagal jos variant Parwise BLAST, lyginamos dvi norimos sekos, raius paias sekas arba j prijimo numer. Nuoroda DNR sekoms lyginti: http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/

4. Baltym sekos ir struktros paieka duomen bazse. Baltym sek palyginimas. Baltym struktros modeliavimas, naudojant RasMol kompiuterin program
Studentai supaindinami su baltym struktros ir proteomikos duomen bazmis bei molekulinio modeliavimo rankiais. Praktin uduotis: pagal pateikt amino rgi sek surasti baltymo tretins struktros model, nustatyti baltymo funkcij, analogus eukariotuose ir prokariotuose, galimas glikozilinimo ir fosforilinimo vietas, galimus transmembraninius domenus, lokalizacij lstelje ir pan. Nuorodos baltym struktros ir funkcijos paiekai: http://www.rcsb.org/pdb/ http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html http://mips.gsf.de/ http://smart.embl-heidelberg.de/ http://protomap.cornell.edu/ Nuorodos baltym sekoms lyginti: http://www.sanger.ac.uk/Pfam/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ http://www.ch.embnet.org/software/bBLAST.html http://www.cbs.dtu.dk/ Studentai supaindinami su RasMol programa, skirta baltymams ir kitoms molekulms vizualizuoti. ios programos galimybs rodomos, pasirinkus tam tikro baltymo, pavyzdiui, mogaus augimo hormono, struktros model i baltym banko. Baltymo molekul vaizduojama vairiais grafiniais pavidalais: sukiojama apie pasirinkt a, iskiriamas norimas struktros fragmentas, imatuojami atstumai tarp pasirinkt atom ir pan. Nuorodas RasMol programai (versijos 2.6) sisti: http://www.rayslearning.com/rasmol.htm http://science.glaxowellcome.com/science/rasmol/down.htm

5. Geros laboratorins praktikos taisykls


i pratyb tikslas yra supaindinti studentus su Geros laboratorins praktikos (GLP) reikalavimais, kurie garantuoja eksperimentini laboratorini tyrim kokyb ir leidia juos unifikuoti tarptautiniu mastu. Pratybos organizuojamos seminaro forma. Remiantis Sveikatos apsaugos ministerijos leidiniu Geros laboratorins praktikos taisykls (Vilnius, 1999), idstomi pagrindiniai GLP reikalavimai: tiriamojo darbo organizavimas, tyrim darbo slygos, reikalavimai, keliami aparatrai, pavyzdi atrinkimas ir saugojimas, tyrimo atlikimas ir rezultat apibendrinimas, darbo protokol rengimas ir saugojimas. Esant galimybei, organizuojama ekskursija laboratorij, turini GLP sertifikat.

6. Darbas steriliame bokse. Audini kultros


Pratybos vyksta Biotechnologijos instituto Imunologijos laboratorijoje. Studentai supaindinami su ranga, reikalinga dirbant su auktesnij eukariot lstelmis, sterilumo reikalavimais, lsteli kultivavimo ir saugojimo slygomis.

329

Demonstruojamas darbas steriliame bokse su lsteli kultromis: lsteli atgaivinimas, persjimas, skaiiavimas. Naudojant viesin mikroskopij, parodomi skirtumai tarp vairi tip induoli lsteli, induoli lstels lyginamos su mieli lstelmis. Demonstruojant naudojamas mikroskopas Olympus IX70 ir vaizd analizs programa Image Pro-Plus. Lyginama, kuo skiriasi auktesnij eukariot lsteli ir mikroorganizm kultivavimo slygos: mitybins terps, sterilumo reikalavimai, lsteli ualdymas ir saugojimas.

7. Eksperimentini duomen statistinis apdorojimas


iose pratybose studentai tvirtina inias apie statistini metod taikym eksperimentiniuose tyrimuose. Praktin uduotis: atlikti savo turim eksperimentini duomen statistin analiz ir vertinti j patikimum. Skaiiavimams rekomenduojama naudotis GraphPad, Origin, Excel programomis.

8. Eksperimento rezultat grafinis pateikimas. Duomen apibendrinimas. Demonstruojamosios mediagos paruoimas


iose pratybose studentai supaindinami su reikalavimais, kaip paruoti parodomj mediag pristatant savo eksperimento rezultatus, pavyzdiui, moksliniam seminarui, praneimui konferencijoje ar baigiamajam darbui ginti. Praktin uduotis: parengti demonstruojamj mediag i turim eksperimentini duomen. Darbui rekomenduojama naudotis PowerPoint, Excel, Origin programomis.

9. Eksperimentinio darbo rezultat pristatymas


ios pratybos organizuojamos mokslinio seminaro forma. Pratyb tikslas: imokti apibendrinti eksperimentinio darbo rezultatus, pristatyti juos auditorijai, dalyvauti mokslinje diskusijoje. Praktin uduotis: parengti mokslin praneim ir pristatyti j kolegoms. Praneimas gali bti rengiamas i turim eksperimentini duomen arba pagal mokslin publikacij.

330

Imunologija

Laboratoriniai darbai Aurelija virblien

1. Gama-interferono nustatymas mogaus limfocit kultrose imunofermentiniu metodu


Darbo tikslas Imunofermentiniu metodu nustatyti gama-interferono koncentracij ir vertinti T limfocit aktyvacijos laipsn nestimuliuot ir mitogenu stimuliuot mogaus periferinio kraujo limfocit kultrose. Gama-interferonas (IFN) yra svarbus lstelinio imuninio atsako reguliatorius. Jo pagrindin funkcija yra makrofag aktyvacija. citokin daugiausia sekretuoja Th1 limfocitai, kurie gali bti aktyvuojami imuninio atsako metu arba paveikus specifiniais T lsteli aktyvatoriais, pavyzdiui, T lsteli mitogenu fitohemagliutininu (PHA). Padidjusi IFN sekrecija rodo Th1 limfocit aktyvacijos laipsn. Atliekant klinikinius imunologinius tyrimus, Th1 limfocit aktyvumas gali bti vertinamas pagal j gebjim sekretuoti IFN in vitro. Tam naudojami limfocitai, iskirti i tiriamj ligoni periferinio kraujo. Spontanins ir mitogenu indukuotos IFN sekrecijos lygis nustatomas limfocit auginimo terpje po 1 ar 2 par inkubacijos. Sveik moni limfocit kultrose po stimuliacijos mitogenu IFN sekrecija paprastai padidja. Jeigu nustatoma aukta spontanin IFN sekrecija nestimuliuotose kultrose, tai gali reikti, kad tiriamojo ligonio Th1 limfocitai jau buvo aktyvuoti in vivo, pavyzdiui, esant infekcijai ar udegimui. IFN nustatyti limfocit kultrose taikomas dviepitopins imunofermentins analizs metodas. Monokloniniai antiknai prie IFN (klonas GIF10) imobilizuojami ploktelje. Po to ploktel inkubuojama su IFN standartu ir tiriamaisiais pavyzdiais limfocit auginimo terpe. IFN specifikai prisijungia prie imobilizuot antikn. Prisijungs IFN irykinamas, inkubuojant su kitais monokloniniais antiknais (klonas GIF3), konjuguotais su peroksidaze. Po to pridedamas peroksidazs substrato tirpalas ir irykinama fermentin reakcija. Spalvos intensyvumas (optinis tankis) imatuojamas spektrofotometru. Jis yra tiesiogiai proporcingas IFN koncentracijai. IFN koncentracija tiriamuosiuose pavyzdiuose nustatoma pagal kalibracin kreiv. Palyginama, kaip skiriasi IFN koncentracija nestimuliuotose ir PHA stimuliuotose limfocit kultrose. Tiriamieji pavyzdiai Darbui naudojami anksiau paruoti ir ualdyti limfocit kultr pavyzdiai. Ruoiant iuos pavyzdius, limfocitai buvo iskirti i skirting donor periferinio kraujo ir inkubuoti augimo terpje RPMI su 10 % fetalinio serumo be stimuliacijos arba su 5 g PHA. Lsteli tankis buvo 10 mln/mL. Po 48 valand inkubacijos lsteli augimo terp buvo surinkta ir ualdyta. Limfocit kultr pavyzdiai paymti: 1, 2, 3, 4 ir 1s, 2s, 3s, 4s (ia s PHA stimuliuot limfocit kultr pavyzdiai). Mediagos ir reagentai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Ploktel, naudojama imunofermentinei analizei. IFN standartas (0,2 mg/mL). Monokloniniai antiknai GIF10 prie mogaus IFN. Monokloniniai antiknai GIF3, konjuguoti su peroksidaze (konjugatas). Imobilizacijos buferis (0,05 M Na-karbonatinis buferis, pH 9,5). Buferis PBS (0,05 M K/Na-fosfatinis buferis su 0,15 M NaCl, pH 7,27,4). Buferis PBS-T (PBS su 0,1 % detergento Tween-20). Blokavimo buferis (PBS su 1 % albumino). Peroksidazs substratas 3, 3, 5, 5 tetrametilbenzidinas (TMB). 10 % sieros rgties tirpalas. Spektrofotometras DigiScan 400 (Assys Hitech).

331

Darbo eiga 1. Monoklonini antikn GIF10 imobilizacija: Paruoiamas antikn GIF10 tirpalas: 10 L antikn suspensijos itirpinama 10 mL imobilizacijos buferio. kiekvien ploktels ulinl pilama po 100 L antikn tirpalo. Ploktel inkubuojama 16 valand +48 C temperatroje. 2. Blokavimas. Laisvas ploktels pavirius blokuojamas albuminu. ploktel ipilstoma po 150 L blokavimo buferio, inkubuojama 30 min. 37 C temperatroje. Po to ulinli turinys ipilamas ir ploktel tris kartus praplaunama PBS-T buferiu. 3. Standartini tirpal paruoimas. I IFN standarto (0,2 mg/mL), skiediant PBS-T buferiu, paruoiama po 0,5 mL standartini tirpal, kuriuose IFN koncentracija bt: 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125 ir 62,5 pg/mL. 4. Inkubacija, naudojant standartinius ir tiriamuosius pavyzdius. tris ploktels eilutes pilama po 100 L IFN standartini tirpal. kitus ploktels ulinlius pilama po 100 L tiriamj pavyzdi. Kiekvienas pavyzdys maiausiai dar du kartus pilamas. Tiriamieji pavyzdiai neskiediami. Ploktel inkubuojama 1 valand kambario temperatroje. Paskui ulinli turinys ipilamas, ploktel 5 kartus praplaunama PBS-T buferiu. 5. Inkubacija, naudojant konjugat. Konjugatas GIF3 atskiediamas 1000 kart PBS-T buferiu. visus ploktels ulinlius pilama po 100 L konjugato tirpalo. Ploktel inkubuojama 1 val. kambario temperatroje. Po to ulinli turinys ipilamas, ploktel 10 kart plaunama PBS-T buferiu ir 2 kartus distiliuotu vandeniu. 6. Fermentins reakcijos irykinimas. ploktels ulinlius ipilstoma po 100 L substrato TMB tirpalo. Ploktel inkubuojama tamsoje 510 min., kol irykja spalva. Tada fermentin reakcija sustabdoma, pridedant po 50 L sieros rgties tirpalo. Sugertis imatuojama spektrofotometru DigiScan 400, esant viesos bangos ilgiui 450 nm. 7. IFN koncentracijos nustatymas ir gaut rezultat analiz. Imatavus sugert spektrofotometru DigiScan 400, IFN koncentracija tiriamuosiuose pavyzdiuose apskaiiuojama pagal KIM kompiuterin program. Kalibracin kreiv nubraioma, ordinai ayje atidedant gautas optinio tankio reikmes, abscisi ayje IFN standarto koncentracij (pg/mL). Palyginami analizs rezultatai nestimuliuotose ir stimuliuotose limfocit kultrose.
1100

2.5

2 1.8 Optinis tankis, 450 nm 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

1000

Optinis tankis, 450 nm

900 800 700 600 500 400 300 200

1s

2s

IFNg koncentracija, pg/ml.

4000

IFN nustatymas limfocit kultrose imunofermentiniu metodu: a) kalibracin kreiv (pavyzdys), b) imunofermentins analizs rezultatai: 1, 2 nestimuliuot limfocit kultros; 1s, 2s PHA stimuliuot limfocit kultros (pavyzdys)

Kontroliniai klausimai T limfocitai, j funkcijos, Th1 ir Th2 subpopuliacij skirtumai; citokinai, j funkcijos, nustatymo metodai.

332

Literatra 1. Abbas, A. K.; Lichtman, A. H. Basic immunology. London, W. B. Saunders Co. 2001. 4347, 87108. 2. Roitt, I.; Brostoff, J.; Male, D. Immunology. 5th ed. Philadelphia, USA, Mosby. 2000. 1422, 121135.

2. mogaus alfa-intereferono nustatymas imunoblotingo metodu


Darbo tikslas Imunoblotingo metodu nustatyti rekombinantin alfa-interferon (IFN-) lsteli Ps.putida lizate. Imunoblotingas (dar vadinamas Western blotingu) yra vienas i imunochemins analizs metod. Naudojant specifinius antiknus, iuo metodu galima identifikuoti tiriamj baltym kit baltym miinyje, pavyzdiui, lsteli lizate, kraujo serume ir pan. Todl imunoblotingas plaiai taikomas medicinoje, biotechnologijoje ir moksliniuose tyrimuose. Pavyzdiui, iuo metodu galima nustatyti virus, toki kaip IV, tym, hepatito B, C ir kt., baltymus mogaus kraujo serume ir patvirtinti diagnoz. Be to, iuo metodu galima tirti vairi baltym, net ir netirpi, ekspresij lstelse pavyzdiui, membranoje esani receptori ir pan. Biotechnologijoje is metodas gali bti taikomas rekombinantini baltym ekspresijai tirti. Baltymai poliakrilamidiniame gelyje atskiriami elektroforezs bdu ir perneami ant specialios membranos. Po to membrana inkubuojama su specifiniais antiknais prie tiriamj baltym, iuo atveju pels monokloniniais antiknais prie IFN-. Prisijung antiknai irykinami, inkubuojant su antriniais antiknais prie pels imunoglobulinus, konjuguotais su peroksidaze. Po to pridedamas peroksidazs substrato tirpalas ir irykinama fermentin reakcija. Nusidaiusios baltymo juostels padtis turi atitikti tiriamojo baltymo, iuo atveju IFN-, molekulin mas. Tiriamieji pavyzdiai Darbui naudojami anksiau paruoti ir ualdyti lsteli Ps.putida lizato pavyzdiai: 1 ir 2. Vienas j yra paruotas i netransformuot Ps.putida lsteli, o kitas i lsteli, transformuot rekombinantine plazmide, turinia IFN- gen. Pastarajame pavyzdyje yra apie 0,05 mg/mL rekombinantinio IFN-. Mediagos ir reagentai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. IFN- standartas (0,1 mg/mL). Monokloniniai antiknai 9D3 prie mogaus IFN-. Antriniai antiknai prie pels imunoglobulinus, konjuguoti su peroksidaze (NXA 931, Amersham). Polivinildifluorido (PVDF) membrana (Millipore). Standartins molekulins mass baltym rinkinys blotingui (Fermentas). Buferis PBS: 0,05 M K/Na-fosfatinis buferis su 0,15 M NaCl, pH 7,27,4. Buferis PBS-T: PBS su 0,1 % detergento Tween-20. Blokavimo buferis: PBS su 1 % elatinos. Peroksidazs substratas 3, 3, 5, 5 tetrametilbenzidinas (TMB-blotting, Fermentas). Tirpalai poliakrilamidinio geliui paruoti: 1,5 M Tris/HCl, pH 8,0, 0,5 M Tris/HCl, pH 6,8, 30 % akrilamidas/bisakrilamidas, 10 % natrio dodecilsulfatas (NaDS), TEMED, 10 % amonio persulfatas. 12 % poliakrilamidinis gelis: 12 mL 30 % akrilamido/bisakrilamido, 7,5 mL 1,5 M Tris/HCl, 9,1 mL H2O, 0,3 mL 10 % NaDS, 0,2 mL amonio persulfato, 0,02 mL TEMED. 4 % poliakrilamidinis gelis: 1,3 mL 30 % akrilamido/bisakrilamido, 2,5 mL 0,5 M Tris/HCl, pH 6,8, 6,1 mL H2O, 0,1 mL 10 % NaDS, 0,05 mL amonio persulfato, 0,01 mL TEMED. Elektrodinis buferis: 25 mM Tris, 0,2 M glicino, 0,1 % NaDS, pH 8,3. Daas, naudojamas pavyzdiui: 0,25 M Tris/HCl, pH 6,8, 1 % NaDS, 20 % merkaptoetanolio, 0,05 mg/mL bromfenolio mlio, 1 % glicerolio. Perneimo buferis: 25 mM Tris/glicinas, 10 % metanolis, pH 8,3.

333

16. Srovs altinis (Biometra). 17. Elektroforezs aparatas (Biometra). 18. Blotingo aparatas (Biometra). Darbo eiga 1. Baltym elektroforez poliakrilamidiniame gelyje. 12 % poliakrilamidinis gelis polimerizuojamas stiklinje formoje, kuri surenkama i dviej stikl, tarpini bei laikikli. Polimerizacija vyksta apie 40 min. kambario temperatroje. Ant 12 % gelio upilama 4 % poliakrilamidinio gelio, kur statomos ukuts. Ruoiant pavyzdius elektroforezei, imama po 5 L tiriamj pavyzdi (lsteli lizato) bei IFN- standarto (250 ng/ takeliui), sumaioma su dau santykiu 3 : 1 ir kaitinama verdanio vandens vonelje 58 min. Elektroforezs aparato rezervuarai upildomi elektrodiniu buferiu, pavyzdiai neami ulinlius po elektrodinio buferio sluoksniu. Elektroforez atliekama 40 min. esant nuolatins srovs reimui, kai srovs stiprumas 20 mA. Gelis praplaunamas perneimo buferiu ir naudojamas imunoblotingui. 2. Baltym perneimas ant membranos. I poliakrilamidinio gelio baltymai perneami ant PVDF membranos, naudojant blotingo aparat. I filtrinio popieriaus ir PVDF membranos ikerpami gelio dydio laktai. Jie suvilgomi perneimo buferiu ir sudedami tokia tvarka: filtrinis popierius, PVDF membrana, gelis, filtrinis popierius. Perneimas trunka 1 valand, esant pastovios srovs stiprumui 30 mA. 3. Membranos blokavimas. Membrana perplaunama PBS-T buferiu ir inkubuojama blokavimo buferyje 1 val. kambario temperatroje. 4. Inkubacija su antiknais prie IFN-. Paruoiama 10 mL monoklonini antikn 9D3 tirpalo: antiknai atskiediami 1000 kart PBS-T buferiu. Membrana inkubuojama antikn tirpale 1 val. kambario temperatroje. Po to membrana 3 kartus perplaunama PBS-T buferiu. 5. Inkubacija su antriniais antiknais. Paruoiama 10 mL antrini antikn tirpalo: peroksidazinis konjugatas prie pels Ig atskiediamas 1000 kart PBS-T buferiu. Membrana inkubuojama iame tirpale 1 val. kambario temperatroje. Po to membrana 78 kartus perplaunama PBS-T buferiu. 6. Fermentins reakcijos irykinimas. Membrana inkubuojama peroksidazs substrato TMB-blotting tirpale, kol irykja specifikai nusidaiusios juostels (510 min.). Tada membrana praplaunama dejonizuotu vandeniu, idiovinama ir fotografuojama. 7. Rezultat vertinimas. Imunoblotingo rezultatai vertinami kokybikai: nustatoma, kuriame i tiriamj lizato pavyzdi yra IFN-, o kuris pavyzdys paruotas i netransformuot lsteli. Specifikai nusidaiusios juostels padtis turi atitikti IFN- molekulin mas. Pagal juostels stor ir spalvos intensyvum, lyginant su IFN- standartu, apytikriai vertinamas IFN- ekspresijos lygis tiriamajame lsteli lizate. A. B.

IFN1 2 S 1 2 S 1 2 1 2 S

IFN- nustatymas imunoblotingu (pavyzdys). A elektroforezs vaizdas; B imunoblotingo vaizdas. Membrana buvo inkubuojama su monoklininiais antiknais 9D3 prie mogaus IFN-. 1 lsteli, ekspresuojani IFN-, lizatas; 2 igrynintas IFN-; S molekulins mass standartai. Irykinus membran, lsteli lizate matomos dvi rekombinantinio IFN- izoformos

334

Kontroliniai klausimai imunochemins analizs metodai, j privalumai, taikymo galimybs; fermentins yms.

Literatra 1. Abbas, A. K. Cellular and molecular immunology. London, W. B. Saunders Co, 1996. 4552. 2. Roitt, I.; Brostoff, J.; Male, D. Immunology. 5th ed. Philadelphia, USA, Mosby, 2000, 382388.

3. viesin ir fluorescencin mikroskopija


Darbo tikslas vertinti lsteli CTLL gyvybingum viesins ir fluorescencins mikroskopijos metodais, naudojant inversin mikroskop OLYMPUS IX-70. Tiriant su auktesnij eukariot lsteli kultras, lsteli bkl vertinama, naudojant inversin* mikroskop. viesiniu mikroskopu galima nustatyti bendr lsteli kultros vaizd lsteli tank, dyd, granuliuotum ir pan. Fluorescencin mikroskopija naudojama tuo atveju, kai lstels paymimos fluorescencine yme, pavyzdiui, fluorochromu ymtais antiknais prie tam tikr lstels baltym arba paveikiamos fluorescenciniu dau, kuris specifikai jungiasi prie tam tikro lstels komponento. Vienas i paprast bd vertinti lsteli gyvybingum yra j inkubacija su etidio bromidu (EtBr). is daas neprasiskverbia pro gyv lsteli membran. Lstelei stant, jos membrana tampa pralaidi, todl EtBr lengvai praeina pro negyv lsteli membran ir prisijungia prie DNR. Taigi tiriant fluorescenciniu mikroskopu matomos tik negyvos (vytinios) lstels. Lyginant viesins ir fluorescencins mikroskopijos vaizdus, galima vertinti gyv ir negyv lsteli santyk kultroje. *Inversinio mikroskopo objektyvai idstyti taip, kad lsteli kultr bt galima stebti tiesiog auginimo inde. Tiriamieji pavyzdiai Tiriama limfoidins kilms lsteli CTLL kultra. ios lsteli linijos gyvybingumui ir augimui in vitro btinas citokinas IL-2. Nesant augimo terpje IL-2, vyksta lsteli CTLL apoptoz (programuota tis). Mikroskopiniam tyrimui naudojami du skirtingi CTLL kultros pavyzdiai: viename j lstels buvo auginamos su IL-2, kitame be IL-2. Pirmajame pavyzdyje gyv lsteli yra daugiau. Darbo priemons 1. 2. 3. 4. 5. Lstels CTLL, ustos 24 ulinli ploktel audini kultroms (Nerbe Plus). Lsteli skaiiavimo kamera (Sigma). 4 % etidio bromido (EtBr) tirpalas. Inversinis mikroskopas OLYMPUS IX-70 su skaitmenine vaizdo kamera CoolSnap. Kompiuteris su vaizd analizs programa ImagePro-Plus.

Darbo eiga 1. Lsteli paruoimas. Mikroskopiniam tyrimui ruoiama lsteli CTLL kultra, kuri buvo auginama CO2 termostate (37 C, 5 % CO2) augimo terpje RPMI su 10 % fetalinio serumo. Tiriamieji lsteli pavyzdiai yra paymti 1 ir 2. Lsteli augimo terps tris yra 1 mL. abu tiriamj lsteli pavyzdius steriliomis slygomis pridedama 4 % EtBr tirpalo iki galutins koncentracijos 0,1 %. Inkubuojama 15 minui kambario temperatroje, tamsoje. 2. viesin mikroskopija. jungus mikroskop, nustatomas optimalus stebjimo lauko apvietimas, sureguliuojamas vaizdo rykumas. Nustaius atitinkam objektyv, lsteli kultros stebimos viesos

335

mikroskopu, padidinus 40x, 100x, 200x ir 400x. Tais paiais objektyvais, reguliuojant kondensoriaus ied, stebimas fazi kontrasto vaizdas. 3. Fluorescencin mikroskopija. Likus maiausiai 15 min. iki darbo pradios, jungiama gyvsidabrio gar lempa. Vaizdo rykumas sureguliuojamas viesos lauke, po to viesos lempa ijungiama. Nustatomas filtras WIB, tinkantis etidio bromido fluorescencijai stebti (EtBr sugeriamos viesos bangos ilgis yra 545 nm, ispinduliuojamos 605 nm). Fluorescuojani lsteli vytjimas stebimas, padidinus 40x, 100x, 200x, 400x. 4. Lsteli skaiiavimas. Steriliomis slygomis lsteli skaiiavimo kamer pilama po 50 mkl lsteli suspensijos. Lstels skaiiuojamos, padidinus 40 x. Pirmiausia suskaiiuojamos visos lstels, matomos viesos lauke, po to, nekeiiant objektyvo ir skaiiavimo kameros padties, suskaiiuojamos fluorescuojanios lstels. Apskaiiuojama, kiek procent negyv (fluorescuojani) lsteli yra kiekviename i tiriamj pavyzdi. 5. Lsteli fotografavimas. jungus skaitmenin vaizdo kamer ir kompiuterin program ImageProPlus, viesins ir fluorescencins mikroskopijos vaizdai fotografuojami. Parenkamas optimalus ekspozicijos laikas: viesinei mikroskopijai apie 520 milisekundi, fluorescencinei mikroskopijai apie 13 sekundes. Nufotografuoti vaizdai isaugomi. 6. Vaizd lyginimas ir analiz. Naudojant kompiuterin program ImagePro-Plus, viesins ir fluorescencins mikroskopijos vaizdai modifikuojami, lyginami ir analizuojami, pavyzdiui, padidinamas vaizdo kontrastas bei rykumas, sugretinami fluorescencijos ir viesos lauko vaizdai, automatikai suskaiiuojamos fluorescuojanios lstels ir pan. Sugretinant viesins ir fluorescencins mikroskopijos vaizdus, vertinamas gyv ir negyv (fluorescuojani) lsteli santykis tiriamuosiuose lsteli pavyzdiuose. A. B.

Lsteli CTLL kultros vaizdas, padidinus 40 x (pavyzdys). A viesin mikroskopija; B fluorescencin mikroskopija

Lstels CTLL buvo kultivuojamos 24 val. augimo terpje su 1 ng/mL IL-2. Ruoiant lsteles mikroskopiniam tyrimui, augimo terp buvo pridta etidio bromido. Kontroliniai klausimai lsteli kultros, mitoz ir apoptoz; imunofluorescencin mikroskopija, jos taikymas; fluorescencins yms.

Literatra Abbas, A. K. Cellular and molecular immunology. London, W. B. Saunders Co, 1996. 7687.

336

Gen ininerijos metodai

Laboratoriniai darbai Valerija Chmieliauskait, Meilut Meizeraityt, Gintautas virblis

1. DNR fragmento (geno) klonavimas


Valerija Chmieliauskait, Meilut Meizeraityt, Gintautas virblis Darbo tikslas PGR metodu klonuoti hsp30 gen ir patvirtinti io geno struktr gaut klon restrikcins analizs bdu. Teorinis vadas Gen klonavimas yra vienas svarbiausi metod, taikom gen ininerijoje. Tai leidia ianalizuoti mus dominanio geno struktr, tikslingai j keisti bei reguliuoti. Kiekvienam genui klonuoti gali bti taikomas metodas atsivelgiant jo koduojamo baltymo atliekamas funkcijas (jei jos inomos), gebjim komplementuoti (itaisyti) specifin mutacij (komplementacijos metodas). Gen galima klonuoti pagal panaum su jau inomais genais (hibridizacijos metodas) pagal geno koduojamo baltymo specifin susiriim su antiknais prie pastarj (imuniniai metodai), o dabar dideles galimybes parod ir individualaus organizmo viso genomo pirmins sekos nustatymas ir kai kurie kiti metodai. Jei geno pirmin seka jau inoma, galima taikyti polimerazin grandinin reakcij (PGR) amplifikuoto geno klonavimo metod. Genas klonuojamas, parinkus specifinius pradmenis, atlikus PGR su matricine DNR ir traukus amplifikuot DNR fragment norim plazmidin vektori. DNR fragmento, kuris koduoja hsp30 gen, klonavimo laboratorinis darbas susideda i penki nuosekliai susijusi etap, kai kurie i j reikalauja prisiminti gdius, gytus atliekant gen ininerijos pagrind laboratorinius darbus ir pritaikyti juos klonuojant reikiam gen. Etapai, su kuriais studentai yra susipain anksiau, nra detalizuojami, nurodomi tik svarbs skirtumai ar pakeitimai. PGR metodu gautas DNR fragmentas tikrinamas elektroforetikai ir ekstrahuojamas i agarozinio gelio. Vektorius pUC57T (1 pav.), turintis nesuporuotus ddT galus, liguojamas su gautu DNR fragmentu, besibaigianiu dA nukleotidais, taip pat neturiniais komplementarios poros, ir toks ligatas transformuojamas E. coli JM109. Vektorius pUC57T yra paruoiamas perskeliant pUC57, tam naudojant Eco32I restriktaz, ir taip pat terminalines dezoksinukleotidil-transferazes bdu prijungiant 3-ddT. Toks vektorius gali efektyviai liguotis su Taq polimerazs PGR fragmentais, galuose turiniais nesuporuotus 3-dA nukleotidus (2 pav.).
EcoO109I 2698 Aat II 2641 SspI 2525 XmnI 2318 BcgI 2239 ScaI 2201
2510 146 236

Bst API 179 NdeI 183 EheI 235

la c
493

396

MCS
476

Eco32I 429

Ap R

pUC57
2710 bp
876

SapI 707

GsuI 1808 Cfr 10I 1803 Eco31I 1790 Eam1105I 1718

1650 1490

Afl III, BspLU11I 830

Alw NI 1241

1 pav. Plazmids pUC57 schema

337

ddT dA Vektorius

dA ddT Vektorius

DNR fragmentas

2 pav. PGR bdu gauto DNR fragmento traukimas vektori (pUC57T) per komplementarisias nukleotid dA ir ddT poras

Klon selekcija atliekama ant agaro terps su reagentu X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--Dgalaktopiranozidu), kuris nuspalvina mlyna spalva kolonijas, turinias nepaeist lacZ gen (aktyvi betagalaktozidaz). Klonai, kurie turi traukt DNR fragment vektori pUC57T, lieka balti. Pastarieji klonai analizuojami toliau. I keli toki klon iskirta plazmidin DNR skaidoma keliomis restriktazmis. Jei gaut fragment dydis atitinka apskaiiuotus, laikoma, kad tie klonai turi norimo geno DNR fragment. Laboratorinis darbas susideda i toki etap: a) DNR fragmento paruoimas, naudojant PGR amplifikacij; b) DNR fragmento ekstrakcija i agarozinio gelio; c) DNR fragmento ligavimas su pUC57T vektoriumi ir transformacija E. coli; d) Tinkam klon atranka (selekcija); e) Atrinkt klon plazmidins DNR iskyrimas ir restriktazin analiz. Prietaisai, tirpalai ir reagentai r. gen ininerijos pagrind 14, 6 laboratorinius darbus. Darbo eiga Darbas atliekamas nuosekliai pagal nurodytus etapus. a) DNR fragmento paruoimas, naudojant PGR amplifikacij Etapas atliekamas pagal metodik, aprayt gen ininerijos pagrind 6 laboratoriniame darbe. Naudojami pradmenys: 5' cat atg ttt cct ctc agc ctc gtac 3 5' gaat tca gtc cac ttt ttg gtc tcc 3 PGR slygos: pradin denatracija 4 min. 94 C, toliau 25 ciklai su tokiais ingsniais: 1 min. 94 C, 1 min. 65 C, 1 min. 72 C. Gaunamas 660bp DNR fragmentas, kuris identifikuojamas naudojant elektroforez agarozje. b) DNR fragmento ekstrakcija i agarozinio gelio Po elektroforezs agarozinis gelis 10 min. daomas etidijaus bromido tirpalu (dirbti tik su guminmis pirtinmis!) ir analizuojamas UV viesoje (saugoti akis, naudoti apsaugin stikl!). Ipjaunamas gabaliukas gelio su reikiamu DNR fragmentu. Agaroz susmulkinama ir upilama fenolio tirpalu (pH 8,0) taip, kad apsemt agarozs gabaliukus, ir 10 min. laikoma 80 C. Centrifuguojama 57 min. mikrocentrifugoje, virutin (vandenin) miinio faz nusiurbiama, pripilamas lygus tris fenolio (pH 8,0) chloroformo miinio (1 : 1), purtoma 30 sek. ir centrifuguojama mikrocentrifugoje 1 min. Virutin faz nusiurbiama, pripilamas lygus tris chloroformo, purtoma 30 sek. ir vl centrifuguojama 1 min. Virutin faz nusiurbiama, pripilamas lygus tris butanolio, supurtoma 5 sek. ir centrifuguojama 30 sek. Dmesio! Pasikeiia miinio fazi padtis: apatin faz vandenin, turinti reikiam DNR fragment, o virutin organin (butanolio) faz, kuri yra nusiurbiama ir paalinama. Pastaroji (koncentravimo) stadija kartojama tol, kol vandenin faz sukoncentruojama iki 100200 L. Pridedamas 2 M NaCl tirpalas iki 0,2 M galins koncentracijos, 2 L glikogeno (20 mg/mL) tirpalo bei 2,5 trio 96 % etanolio, supurtoma ir 10 min. laikoma 80 C aldytuve. DNR fragmentas isodinamas centrifuguojant 10 min. mikrocentrifugoje 14000 aps./min. greiiu, nuosdos upilamos 0,5 mL 70 % etanolio, supurtoma 5 sek., centrifuguojama 23 min. DNR nuosd praplovimo procedra kartojama dar kart, etanolio likuiai kruopiai nusiurbiami. Nuosdos diovinamos 1015 min. kambario arba 37 C temperatroje ir DNR tirpinama 1020 L TE buferio.

338

c) DNR fragmento ligavimas su pUC57T vektoriumi ir transformacija kamien E. coli JM109 Etapas atliekamas pagal metodikas, apraytas gen ininerijos pagrind 1 ir 4 laboratoriniuose darbuose. Ligavimui imama 0,1 g DNR fragmento ir 0,05 g pUC57T vektoriaus. Ligavimas atliekamas 2 val. kambario temperatroje ir toliau ligatas ikart sumaiomas su i anksto pasiruota kompetentine E. coli JM109 kultra. Isjimo terp nurodyta tolesniame etape. d) Tinkam klon atranka (selekcija) Transformuotos E. coli lstels isjamos ant agarizuotos LB terps, pridjus j 100 mg/mL ampicilino, 100 mM IPTG ir 200 mM X-gal. Uaugusios baltosios kolonijos (34) usjamos (kiekviena atskirai) mgintuvlius su skysta LB terpe (10 mL) ir auginamos per nakt purtyklje 37 C. Kiekvienos kolonijos usjimas dubliuojamas ant agarizuotos LB terps su ampicilinu. e) Atrinkt klon plazmidins DNR iskyrimas ir restrikcin analiz Plazmidin DNR iskiriama pagal metodik, aprayt gen ininerijos pagrind laboratoriniame darbe Nr. 3. Restrikcin analiz atliekama pagal protokol, aprayt gen ininerijos pagrind laboratoriniame darbe Nr. 2. Restrikcijai imama po 0,2 g individualaus klono plazmidins DNR ir hidrolizuojama restiktazmis HindIII + EcoRI; EcoRI + PstI; EcoRI; PstI. Priklausomai nuo klonuoto hsp30 fragmento orientacijos vektoriuje pUC57, turi bti gauti tokie fragmentai: HindIII + EcoRI (660bp + 2710bp); EcoRI + PstI (660bp + 2710bp); EcoRI (660bp + 2710bp arba 3370bp); PstI (660bp + 2710bp arba 3370bp); Kontroliniai klausimai 1. 2. 3. 4. Kokius inote gen klonavimo metodus? Kodl PGR fragment galima efektyviai traukti vektori pUC57T? Kaip atliekama klon, turini pUC57 vektori traukt fragment, selekcija? Kaip galima patikrinti, ar tikrai buvo klonuotas norimas genas?

Atsiskaitymas Pateikiamas atlikto darbo apraymas, kuriame naudojant vaizdo dokumentacijos sistem gauti tokie elekroforezs geli vaizdai: 1. PGR bdu gautas DNR fragmentas po ekstrakcijos i agarozinio gelio. 2. Atrinkt klon plazmidins DNR restrikcins analizs vaizdas. Literatra 1. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000. 2. , . . . -: - , 1999. 3. Sambrook, J. ; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989. 4. , . . : , 1987. 5. , . . : , 1976. 6. J. Sambrook and D. W. Russell. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. 7. Short protocols in molecular biology. Ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

339

2. Plazmidins DNR sekvenavimas


G. virblis Darbo tikslas Nustatyti pirmin plazmids pUC57-Hsp30 fragmento, koduojanio Hsp30 baltym sek. Teorinis vadas inomi du pagrindiniai DNR pirmins sekos nustatymo (sekvenavimo) metodai Maksamo ir Gilgerto [1] ir Sengerio [2]. Pirmasis metodas (dabartiniu metu maai taikomas) yra pagrstas chemine DNR fragment hidrolize, parenkant specifinius reagentus vienam arba dviems nukleotidams. Didezoksinukleotid, arba Sengerio, metodas danai taikomas rutininiam sekvenavimui. Be to, is metodas yra skmingai automatizuotas ir taikomas didels apimties sekvenavimo darbams, pvz., visam genomui sekvenuoti. is metodas yra pagrstas polimerizaciniu DNR sekos kopijavimu, kai fragment sintez yra terminuojama didezoksinukleotid traukimu j sek. Jei pradmuo arba traukti nukleotidai yra paymti fluorescencine yme, poliakrilamidins elektroforezs bdu atskirti fragmentai registruojami lazeriniu detektoriumi, o duomenys yra fiksuojami kompiuteryje. Geriausia matrica DNR sekvenavimo reakcijoms taikant Sengerio metod yra viengrandin rekombinantinio bakteriofago DNR. Taiau tokios matricos paruoimas danai atima daug laiko, todl dabartiniu metu prasta naudoti dvigrandin plazmidin DNR, kuri reikia paruoti sekvenuoti. Prie atliekant sekvenavimo reakcijas plazmidin DNR yra denatruojama (atskiriamos komplementariosios DNR grandins), naudojant natrio armo tirpal arba paklus temperatr (jei naudojama temostabili DNR polimeraz). DNR sekvenavimo fragmentai idalijami naudojant elektroforez denatruojaniame poliakrilamidiniame gelyje (PAAG). Kadangi reikia atskirti DNR fragmentus, besiskirianius pagal ilg tik vienu nukleotidu, tai naudojami aukti (3080 cm) geliai, kurie leidia atskirti ne tik trumpus, bet ir ilgesnius DNR fragmentus 500800 nukleotid ilgio zonoje. PAAG skiriamoji geba yra ribojantis faktorius skaityti ilgesnes, negu 800900 nukleotid sekas nuo vieno pradmens. Denatravimo slygos (78 M karbamidas PAA gelyje ir 4060 C temperatra) elektroforezs metu naudojamos tam, kad ivengtume artefaktinio DNR fragment judjimo gelyje. Jei DNR fragmentas nevisikai denatravs ar turi vidin komplementari struktr, jis gali judti gelyje anomaliai, lyginant su kitais tokio paties ilgio DNR fragmentais. Dl to galimos sekvenavimo autoradiogramos skaitymo klaidos, o norint j ivengti, rekomenuojama t pai sek perskaityti vairiomis kryptimis, pradedant nuo skirting pradmen. Prietaisai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Mikrocentrifuga. Mikseris. Termocikleris. Vertikalios elektroforezs aparatas Sigma (#Z37, 2269). Auktosios tampos nuolatins srovs altinis. Automatin pipet, 20 L. Automatins pipets antgaliai (geltoni). Ependorfiniai mgintuvliai: 1 mL ir 0,5 mL. Gumins pirtins. Svarstykls. Vaizdo dokumentacijos sistema.

Tirpalai ir reagentai 1. M13/pUC sekvenavimo pradmuo #SO100 arba M13/pUC reverse sekvenavimo pradmuo #SO101 (AB Fermentas).

340

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

23 g (11,5 pmol) plazmids pUC-hsp30 tirpalo (DNR koncentracija apie 1 g/L). AB Fermentas DNR sekvenavimo rinkiniai: Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit , #K1711 arba ReaderTM DNA Sequencing Kit, #K1811, [-33P]dATP. 20 % akrilamido tirpalas (193 g akrilamido, 6,7 g N,N-metilen-bisakrilamido, 467 g karbamido ir H2O iki 1 litro). 46 % karbamido tirpalas. 10xTBE buferis (121 g Tris baz, 7,4 g EDTA, 53,4 g boro rgties, H2O iki 1 litro, pH 8,3). 10 % amonio persulfato tirpalas. TEMED (N,N,N,N-Tetrametiletilendiaminas). Repel-Silane (Pharmacia). Bind-Silane (-methacryloxypropyl-trimethoxysilane, Sigma #M-6514 arba Bind-Silane, Pharmacia) vieiai paruotas tirpalas (5 mL etanolio, 15 L ledins acto rgties, 8 L Bind-Silane).

Darbo eiga Darbas atliekamas tokiais etapais: a) Sekvenavimo mgini paruoimas is darbo etapas atliekamas pagal AB Fermentas DNR sekvenavimo rinkini protokolus (Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit, #K1711 arba ReaderTM DNA Sequencing Kit, #K1811). Paruoti sekvenavimo mginiai analizuojami elektroforezs bdu denatruojaniame poliakrilamidiniame gelyje. b) Sekvenavimo gelio paruoimas Vertikalaus elektroforezs aparato stiklai (33x42 cm) variai nuplaunami ir idiovinami. Vienas j yra itrinamas 5 mL Bind-Silano tirpalu (tai reagentas, chemikai pririantis poliakrilamid prie stiklo paviriaus), idiovinamas ir gerai nuplaunamas 34 kartus etanoliu. Kitas stiklas itrinamas Repel-Silan tirpalu, kuris suteikia stiklo paviriui hidrofobikumo. Spaustukais abu stiklai suspaudiami kartu su oninmis tarpinmis (0,20,4 mm). Gelio apatin dalis hermetizuojama lipnia juosta, o tarpas tarp stikl upilamas 8 % akrilamido tirpalu, kuris ruoiamas taip: 40 mL akrilamido tirpalo, 10 mL 10xTBE buferio, 50 mL 46 % karbamido tirpalo. Miinys degazuojamas 5 min. naudojant vakuumin vandens siurbl. Polimerizacija pradedama pridjus 0,5 mL amonio persulfato tirpalo ir 50 L TEMED. Upylus tirpal, stiklai paguldomi ir statomos gelio paviri formuojanios ukos. c) Elektroforez ir autoradiografija Kai gelio polimerizacija baigiasi (po 3060 min.), ukos iimamos ir stiklai statomi elektroforezs aparat, virutinis ir aparinis rezervuarai upilami 1xTBE buferiu. Suformuoti pavyzdi takeliai praplaunami ir leidiama 1530 min. prieforez (tampa 9001000 V). Ant gelio uneama po 1 L sekvenavimo mgini serijomis po keturis ir leidiama srov (2040 mA, 15002000 V, 4060 W). Po 23 val., kai mgini bromfenolo mlynasis daas pasiekia gelio apai, elektroforez stabdoma ir stiklai atidalijami. Stiklas, prie kurio yra prisiris poliakrilamidas, 20 min. fiksuojamas 10 % acto rgties ir 10 % etanolio tirpale, praplaunamas vandeniu ir 70 % etanoliu ir idiovinamas. Sekvenavimo gelis, idiovintas ant stiklo paviriaus, eksponuojamas tamsoje vis nakt su rentgeno juosta (30x40 cm), prispausta prie gelio ir sutvirtinta kitu stiklu. Po ekspozicijos juosta rykinama, fiksuojama ir idiovinama. d) Rezultat analiz Gauta autoradiograma (1 pav.) skaitoma, vedama kompiuter ir lyginama su jau inomomis gen bank (pvz., GenBank) DNR sekomis, naudojant internetin Blast program.

341

G A T C

Sekvenavimo gelio autoradiograma

Kontroliniai klausimai 1. 2. 3. 4. Kokie yra DNR sekvenavimo metodai? Kuo pagrstas Sengerio metodas? Kas lemia nuo vieno pradmens nuskaitomo fragmento ilg? Kokios sekvenavimo klaid prieastys?

Atsiskaitymas Pateikiamas atlikto darbo apraymas, kuriame pateikiamas naudojant vaizdo dokumentacijos sistem gautas sekvenavimo autoradiogramos vaizdas. Reikia perskaityti DNR sek ir palyginti j su inomomis gen bank sekomis. Literatra 1. Maxam, A. M.; Gilbert, W. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. 74:560564. 2. Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. 74:5463-5467. 3. B. Lewin. Genes VII. Oxford University Press. 2000. 4. , .. . -: - , 1999. 5. Sambrook, J.; Fritsch, E. F;. Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory press. 1989. 6. , . . : , 1987. 7. , . . : , 1976. 8. Sambrook, J. ; Russell; D. W. . Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York. 2001. 9. Short protocols in molecular biology. Ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

342

3. Klonuoto geno ekspresija


Ginautas virblis Darbo tikslas Parodyti klonuoto hsp30 geno ekspresij, naudojant pET28-Hsp30 plazmid. Teorinis vadas Galutinis klonuoto geno funkcionalumo rodymas yra galimyb t gen ekspresuoti, t. y. gauti geno koduojam baltym (kai kuriais atvejais RNR). Be to, tokie eksperimentai leidia sukurti efektyv rekombinantinio baltymo altin, leidiant nesunkiai igryninti ir analizuoti didel kiek tokio baltymo. Yra skiriami du pagindiniai gen ekspresijos tipai: nereguliuojama (konstitutyvioji) ir reguliuojama geno ekspresija. Esant konstitutyviajai ekspresijai lstel gamina geno produkt nuolat. Reguliuojama ekspresija pasireikia tada, kai genas yra traukiamas veikiant induktoriui arba, kai genas pradeda dirbti i terps paalinus represori (ko-represori). Pastarasis ekspresijos tipas bdingas prokariot operonams (tai transkripcijos ir reguliacijos vienetas, sudarytas i keli struktrini gen su vienu promotoriumi, reguliacinio geno ir ekspresijos kontrols element), pvz., laktozs ir triptofano operonai. Norint gauti efektyvi klonuoto geno ekspresij E. coli lstelse, koduojanti geno dalis yra traukiama ekspresin plazmid. Laboratoriniame darbe bus naudojama plazmid pET28a (1 pav.), turinti stipr modifikuot bakteriofago T7 promotori (T7lac, 2 pav.) ir laktozinio operono represoriaus gen (lacI, jo produktas ekspresuojamas nuolat ir slopina tikslinio geno ekspresij tol, kol terp nepridedamas induktorius IPTG ir pradeda labai intensyvi ekspresij). Be to, pET28a plazmid sudaro galimyb prijungti histidinin inkar (ei histidin sek) prie ekspresuojamo baltymo (N- arba C- gale). i seka leidia greitai ir efektyviai iskirti tok baltym metalochelatins chromatografijos bdu i daugiakomponenio biomass lizato. Plazmid yra transformuojama E. coli BL(DE3) kamien, kuris turi genominje DNR integruot T7 bakteriofago RNR polimerazs gen, indukuojam IPTG (indukcijos schema pateikta 3 pav.). Taigi i ekspresin plazmid yra indukuojama per du etapus. Klonuoto geno ekspresijai pradti turi indukuotis T7 bakteriofago RNR polimeraz ir tik po to pastaroji pradeda pET plazmids koduojamo klonuoto geno ekspresij nuo T7lac promotoriaus. Tokia dvipakop sistema leidia ivengti prielaikins ekspresijos (vadinamojo ekspresijos nutekjimo), kuri trukdo padidinti bendr ekspresijos lyg.

1 pav. Ekspresins plazmids pET28a schema

343

2 pav. pET serijos plazmidi promotorinio rajono schema. lacO laktozs operono operatorius, MCS DNR fragmento (inserto) klonavimo vieta (multi-cloning site), T7 prom. ir T7 term. atitinkamai T7 RNR polimerazs promotorius ir terminatorius, RBS seka, koduojanti mRNR ribosom suriimo viet (ribosome binding site)

Ekspresijos efektyvumas yra tikrinamas analizuojant biomass lizatus. Jei pageidaujamo baltymo ekspresija siekia 45 % (arba daugiau) nuo vis lstelini baltym, tai tokiu atveju lizatus galima analizuoti elektroforezs denatruojaniame poliakrilamidiniame gelyje (PAAG) bdu, daant pastarj Kumasi mlio dau. Jei ekspresija siekia ne daugiau kaip 13 % daoma sidabro drusk tirpalais, nes is metodas iki 10 kart jautresnis. Indukuojamos ekspresijos atveju yra lyginami lizatai, gauti iki indukcijos ir po jos. Taip nesunku pastebti naujai ekspresuoto baltymo juostel gelyje.

3 pav. pET-tipo ekspresijos schema E. coli BL(DE3) kamiene

Prietaisai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Laminarinis boksas. Termostatuojama purtykl. Automatins mikropipets su steriliais antgaliais (200 L ir1000 L). Sterilios Petri lktels. Sterilios pipets 2 mL, 10 mL. Sterils mgintuvliai 15 mL. Sterilios stiklins lazdels (glaistikliai). Biometra vertikalus elektroforezs aparatas. Nuolatins srovs altinis.

344

Tirpalai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Sterili skysta LB terp mieli ekstraktas 5 g/L, triptonas 10 g/L, 10 g/L NaCl. Strerili agarizuota LB terp agaras 15 g/L skystoje LB terpje. Kanamicino sulfato tirpalas steriliame H2O 30 mg/mL. TE buferis (50 mM Tris-HCl, pH 7,0; 1mM EDTA). Kumasi dao tirpalas (0,2 g Coomassie Brilliant Blue R-250, 80 mL etanolio, 20 mL ledins acto rgties ir 100 mL H2O). 1,5 M Tris-HCl tirpalas, pH 8,8. 0,5 M Tris-HCl tirpalas, pH 6,8. 30 % poliakrilamido tirpalas (29,2 g akrilamido, 0,8 g N,N-Metilen-bis-akrilamido, 70 mL H2O). Amonio persulfato tirpalas (10 %). TEMED (N,N,N,N-Tetrametiletilendiaminas). IPTG (izopropil--D-tiogalaktopiranozido) tirpalas (100 mM). SDS (natrio dodecilsulfato) tirpalas (10 %). 10x glicininis elektroforezs buferis (30 g Tris-bazs, 144 g glicino, 10 g SDS, vandens iki 1 L). Redukuojantis 4x mginio buferis (0,8 g SDS; 2,5 mL 1 M Tris-HCl, pH 6,8; 4 mL 40 % glicerolio; 0,1 mg bromfenolio mlio; 2 mL 2-merkaptoetanolio; H2O iki 10 mL).

Darbo eiga Darbas atliekamas tokiais etapais: a) Plazmids pET28-Hsp30 transformacija E. coli BL(DE3) kamien is etapas atliekamas pagal metodik, aprayt gen ininerijos pagrind laboratoriniame darbe Nr. 1. Plazmids pET28-Hsp30 schema pateikta 4 pav.(His-tag paymi DNR fragment, koduojant ei histidin inkarin sek, prijungt prie Hsp30 baltymo). Kelios gautos kolonijos sjamos mgintuvlius su 5 mL LB terps ir kanamicinu (galutin koncetracija 20 mg/L) ir auginamos per nakt 37 C purtyklje. b) Plazmids pET28-Hsp30 indukcija 0,2 mL naktins kultros atskiediama 5 mL LB terps ir auginama 23 val. 37 C intensyviai purtant. Pridedama IPTG tirpalo (100 mM) iki 0,1 mM galutins koncentracijos ir indukuojama dar 23 val. 37 C intensyviai purtant. Iki indukcijos ir po jos paimami 1 mL augimo terps mginiai, kurie 1 min. centrifuguojami, supernatantas paalinamas, o biomass nuosdos suspenduojamos 100 L TE buferio ir pridedama 10 L SDS tirpalo (10 %). Mginiai 5 min. virinami vandens vonioje. ie mginiai analizuojami SDS/PAAG elektroforezs bdu.
Nde I
His-tag

EcoRI

Hsp30

PT7/lac f1 ori

Eco RV
lac I

SmaI
Kan

HpaI

pET28-Hsp30

ori

4 pav. Ekspresins plazmids pET28-Hsp30 schema

345

c) Lizat prie ir po indukcijos analiz naudojant SDS/PAAG (daymas Kumasi dau) Denatruotasis SDS/PAAG (15 %) gelis paruoiamas taip: Surenkama kaset geliui i dviej stikl ir gumins tarpins. Paruoiamas miinys apatiniam gelio sluoksniui (skiriamasis gelis, 15 %): 2,5 mL 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8; 2,35 mL H2O; 5 mL 30 % akrilamido tirpalo; 50 L amonio persulfato, 100 L SDS tirpalo, 5 L TEMED. Supylus miin kaset (paliekama 1,5 cm iki jos viraus), atsargiai usluoksniuojama 0,1 mL vandens. Kai gelis susipolimerizuoja (30 40 min.), nupilamas vandens sluoksnis ir pilamas tokios sudties koncentruotojo gelio sluoksnis (4 %): 1,25 mL 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8); 3 mL H2O; 670 L 30 % akrilamido tirpalo; 50 L SDS tirpalo, 25 L amonio persulfato tirpalo; 5 L TEMED. statomos gelio takelius formuojanios ukos ir leidiama polimerizuotis. Po 3040 min. itraukiamos ukos, praplaunami takeliai ir pilami mginiai. Jie paruoiami taip: 15 L lizato sumaioma su 5 L mginio uneimo buferio ir 5 min. pavirinama. Upylus elektroforezs buferio, mginiai neami gelio takelius ir leidiama srov 15 mA (150 V) (bromfenolo mlis leidiamas iki skiriamojo gelio viraus), tada srov padidinama iki 20 mA (200250 V) (bromfenolo mlis leidiamas iki skiriamojo gelio apaios). Pasibaigus elektroforezei, atidalijami kasets stiklai, gelis iimamas ir merkiamas Kumasi dao tirpal. Po 1 val. gelis perkeliamas dejonizuot vanden (200300 mL) ir kaitinamas iki virimo pradios, tada vanduo pakeiiamas. Tokia procedra kartojama 45 kartus, kol pasiekiamas pageidaujamas kontrastas tarp gelio fono ir baltym juosteli (fonas lieka silpnai melsvas). Toks gelis skenuojamas dokumentacijos sistem, jei reikia, diovinamas. Skanuoto gelio pavyzdys pateikiamas 5 pav.

5 pav. Baltymo Hsp30 ekspresija E.coli BL21(DE3), baltym elektroforez SDS/PAAG (15 %). 1 bendras lizatas prie indukcij, 27 bendras lizatas po indukcijos IPTG (ei skirtingi klonai), M baltym molekulins mass standartai (i viraus): 116,0; 66,0; 45,0; 35,0; 25,0; 18,4; 14,4 kDa

Kontroliniai klausimai 1. 2. 3. 4. Kokius inote gen ekspresijos tipus? Kas yra operonas? Kokie pET-tipo ekspresini plazmidi ypatumai? Kaip galima ufiksuoti geno ekspresij?

Atsiskaitymas Pateikiamas atlikto darbo apraymas, kuriame naudojant vaizdo dokumentacijos sistem gautas tiriam baltymini lizat SDS/PAAG elekroforezs gelio vaizdas.

346

Literatra 1. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press. 2000. 2. , . . . -: - , 1999. 3. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989. 4. ; . . : , 1987. 5. , . . : , 1976. 6. Sambrook, J. ; Russell, D. W . Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. 7. Short protocols in molecular biology. Ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

347

Ininerin enzimologija
Pratybos ir laboratoriniai darbai

Juozas Kulys

1. Nestacionarios ferment kinetikos analiz


Darbo tikslas Nestacionarios ferment kinetikos modeliavimas. Tyrimo objektas Michaelio ir Menten (Michaelis-Menten) schema: k2 k1 E + S ES E + P. k-1 Tvarkinga bi-bi kinetin schema: k1 E + S E1 + P, k1 * E1 + S1 E + P1. Modeliavimo priemons Mathematika, Mathcad ir kitos programos. Darbo eiga Sukuriama lygi sistema Michaelio ir Menten schemai: d[E]/dt = k1 [E] [S] + k-1 [ES] + k2 [ES], d[S]/dt = k1 [E] [S] + k-1 [ES], d[ES]/dt = k1 [E] [S] k-1 [ES] k2 [ES], d[P]/dt = k2 [ES]. Tvarkingai bi-bi schemai: d[E]/dt = k1 [E] [S] + k1* [E1] [S1], d[S]/dt = k1 [E] [S], d[E1]/dt = k1 [E] [S] k1* [E1] [S1]. d[P]/dt = k1 [E] [S], d[S1]/dt = k1* [E1] [S1], d[P1]/dt = k1* [E1] [S1]. [E], [E1] ir [ES] fermento, jo tarpins formos ir fermento substrato komplekso koncentracijos, [S], [S1] substrat koncentracijos, [P], [P1] produkt koncentracijos. (2) (1)

(3)

348

Lygi sistemos sprendiamos Rungs ir Kuto (Runge-Kutta) metodu taikant adaptyvin ingsnio kontrols Rungs ir Kuto, Burlicho ir Stojerio (Bulirsch-Stoer), ar Rozenbroko (Rosenbrock) algoritmus. 1 pav. pateiktas sprendinys.

0.001

200

Koncentracija, M

[E] [ES] [S] [P]

0 0 2 4 6 8 10 12 14 Laikas, min

1 pav. Fermento, fermento substratinio komplekso, substrato ir produkto koncentracijos kitimas Michaelio-Menten procese. Skaiiavimai atlikti, kai [E]0 = 10-3 M, [S] = 200 M, k1 = 10 M-1s-1, k-1 = 102 s-1, k2 = 103 s-1

Virelyje parodytas produkto koncentracijos kitimas, apskaiiuotas integruojant Michaelio-Menten lygt, ir nestacionariu atveju. Atsiskaitymas diferencialini lygi sistem skaiiavimo algoritmas; kvazistacionariosios bsenos prielaidos fermentinje kinetikoje pagrstumas; klasikins Michaelio ir Menten iraikos grafikas.

Literatra 1. Brown, D.; Rothery, P. Models in Biology: Mathematics, statistics and computing. John Wiley & Sons, Chister, New York, Brisbane, Toronto, Singapore, 1993. 2. Kulys, J. Modelling biological kinetics by Eulers method: solving mediator stability problem, in Nonlinear Analysis. Modelling and control (Grigelionis B. et al, eds). Vilnius, 1997, 6770 p. 3. Kulys, J. Biologija, 4, 1998, p. 3236.

349

Koncentracija, M

2. Stacionariosios bisubstratins fermentins reakcijos kinetikos tyrimas


Darbo tikslas Stacionariosios bisubstratins fermentins kinetikos eksperimentinis ir analitinis tyrimas. reakcijos
Sugertis

0.16 GO (ox) GO (red) 0.08

0.12

0.04

0 350 400 450 500 550 600

Tyrimo objektas

Bangos ilgis, nm

Tyrimo objektas yra Aspergillus niger gliukozs oksidaz (GO). is fermentas katalizuoja aldozi oksidacij u deguonimi susidarant laktonams. Reakcija vyksta pagal ping-pong veikimo schem: Oksidaz(oks.) + Substratas Oksidaz(red.) + Produktas, Oksidaz(red.) + O2 Oksidaz(oks.) + H2O2. Gliukozs oksidazs sugerties spektrai oksiduota ir redukuota forma pateikti prie darbo pavadinimo. Matavim priemons Prijungtas prie kompiuterizuoto potentiostato deguonies elektrodas, termostatuojama gardel, spektrofotometras, svarstykls, mikropipet, pH-metras. Darbo eiga Reikia paruoti 50 mM acetatin buferin tirpal, pH 5,5. Gliukozs tirpalas ruoiamas atsveriant 1,98 g gliukozs ir tirpinant 10 mL vandens. Gliukozs tirpalas gali bti naudojamas po 24 val., kai vyksta mutarotacija. Fermento tirpalas ruoiamas taip pat vandenyje. Jo koncentracija nustatoma spektrofotometrikai, naudojant skirtumin molins sugerties koeficient 1,31 104 M-1cm-1 esant 450 nm bangos ilgiui. Paruotas fermento tirpalas laikomas lede. Deguonies sunaudojimo kinetins kreivs registruojamos esant vairioms gliukozs koncentracijoms (5, 10, 15, 20, 25, 100 mM) 10 mL trio gardelje, 25 C temperatroje. gardel pilami gliukozs ir buferio tirpalai tokiu santykiu, kad bendras tris bt 10 mL. Gardel kruopiai udaroma dangteliu su elektrodu. Tirpalas termostatuojamas apie 5 min. Deguonies elektrodo potencialas yra 0,6 V pagal Ag/AgCl. Apie 1 min. reikia registruoti nusistovjusios srovs dyd ir virkti fermento tirpal (0,05 mL, fermento koncentracija gardelje turi bti apie 0,020,03 M). Deguonies sunaudojimo kinetika registruojama 10 min. Deguonies elektrodo liekamj srov pamatuoti esant tirpale 0,1 M gliukozs. Gaut reikm naudoti atliekant tolesnius skaiiavimus. Skaiiavimai Gautos srovs kitimo kinetins kreivs perskaiiuojamos deguonies sunaudojimo kreives laikant, kad 0,1 M buferio tirpale, esant 25 C, deguonies soties koncentracija yra 0,253 mM. (1) (2)

350

240 200 160 120 80 40 0 0 200 Laikas, s 400

2 mM 5 mM 10 mM 15 mM 20 mM 25 mM 92 mM

1 pav. 1GO katalizuojamas deguonies sunaudojimas esant skirtingoms gliukozs koncentracijoms, naudojant 50 mM acetatin buferin tirpal, pH 5,5

Reakcijos greitis apskaiiuojamas skaitiniu bdu diferincijuojant kinetines kreives. Greiio priklausomybs nuo deguonies koncentracijos analiz atliekama taikant ping-pong fermento veikimo schem. Pagal i schem reakcijos greiio priklausomyb nuo substrat koncentracijos ireikiama lygtimi (3) arba (4): V = Vmaks. [O2][Glu]/([O2][Glu]+KO2[Glu]+Kglu.[O2]), [E]t/V = 1/kcat. + 1/(kred.][Glu]) + 1/(koks.[O2]). [E]t fermento koncentracija, Vmaks. maksimalus greitis, KO2, Kglu. tariamos Michaelis ir Menten konstantos, taikomos deguoniui ir gliukozei, kcat., koks. ir kred. tariamos greiio konstantos. Ryius tarp i konstant ireikia (5.1), (5.2) ir (5.3) lygtys: kcat. = Vmaks./[E]t, koks. = kcat./KO2, kred. = kcat./Kglu.. (5.1) (5.2) (5.3) (3) (4)

Skaiiavimus naudojant vis duomen masyv (greiio priklausomyb nuo gliukozs ir deguonies koncentracij) rekomenduojama atlikti taikant Mathcad program. Parametrai parenkami remiantis grafiniu vaizdu ir minimalia paklaida.
2 mM 5 mM 4 Reakcijos greitis, M s-1 10 mM 15 mM 20 mM 25 mM 2 92 mM

Deguonies koncentracija, M

2 pav. GO katalizuojamos reakcijos greiio priklausomybs nuo deguonies koncentracijos esant skirtingoms gliukozs koncentracijoms, 50 mM acetatinis buferinis tirpalas, pH 5,5.

0 0 50 100 150 200 250 Deguonies koncentracija, M

351

Atsiskaitymas Pateikiamos reakcijos greiio priklausomybs nuo deguonies koncentracijos ir apskaiiuotos pagal model kreivs esant skirtingoms gliukozs koncentracijoms (kaip 1 ir 2 pav.). Pateikiamos apskaiiuotos tariamos greiio konstantos: kcat., koks. ir kred.. Literatra 1. Weibel, M. K.; Bright, H. J. The glucose oxidase mechanism, interpretation of the pH dependence. J. Biol. Chem., 1971, 246, 27342744. 2. Kulys, J.; Tetianec, L.; Schneider, P. Specificity and kinetic parameters of recombinant Microdochium nivale carbohydrate oxidase. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 2001, 13, 95101.

352

Sugertis

3. Fermentini reakcij tyrimai nestacionarios kinetikos metodu

0,4

Sugertis

0,2

500

550

Bangos ilgis, nm

Darbo tikslas Tikslas susipainimas su sustabdytos srovs (stopped-flow) spektrofotometru, nestacionariosios kinetikos principais; praktinis fermento bei cheminio junginio sugerties pokyio spektr uraymas greito skanavimo (rapid scan) bei sustabdytos srovs (stopped-flow) metodu fermentins ir chemins reakcijos metu, kinetini parametr skaiiavimas. Tyrimo objektas Tiriamas Coprinus cinereus peroksidaz (CiP). is fermentas dvielektroniniu bdu redukuoja vandenilio peroksid, susidarant peroksidazs kompleksui I, kur vienelektroniniu bdu redukuoja mediatorius elektrono donoras iki peroksidazs komplekso II ir natyvaus visikai redukuoto fermento. Reakcija vyksta pagal i schem: k1 Peroksidaz(red) + H2O2 Peroksidaz-I + H2O, k2 Peroksidaz-I + Med Peroksidaz-II + Med(oks.), k3 Peroksidaz-II + Med Peroksidaz(red.) + Med(oks.).

Tarpini peroksidazs kompleks susidarymas (1 ir 2 lygtys) vyksta greitai; limituojanti reakcijos stadija yra peroksidazs komplekso II redukcija (3 lygtis). Nestacionarios kinetikos matavimai leidia apskaiiuoti tarpini reakcij greii konstant reikmes. Sustabdytos srovs spektrofotometro kalibracijai danai naudojama Cl 2,6-dichloroindofenolo (DCIP) redukcija askorbino rgtimi (AR). O OH Reakcijos metu DCIP redukuojamas perneant 2 elektronus ir 1 proton, o askorbatas oksiduojamas iki dehidroaskorbins rgties.
Cl N

Matavim priemons Kompiuterizuotas sustabdytos srovs (stopped-flow) spektrofotometras spektrofotometras LKB Biochrom, Ultrospec II, svarstykls, mikropipets, pH-metras. Darbo eiga Fermentin kinetika. Paruoiami 10 mL 2 M peroksidazs ir 4 mM H2O2 tirpalai 50 mM K-fosfato buferiniame tirpale, pH 7,0. Peroksidazs bei vandenilio peroksido tirpalo koncentracija nustatoma spektrofotometrikai esant atitinkamai 405 nm ( = 109 mM-1cm-1) ir 240 nm ( = 39,4 M-1cm-1) bangos ilgiui. Darbinis H2O2 tirpalas iki reikiamos koncentracijos paruoiamas, praskiediant pradin peroksido (4 mM) tirpal. Nestacionarios kinetikos peroksidazs ir vandenilio peroksido reakcijos matavimai atliekami greito skenavimo metodu. Nustatomi atitinkami spektrofotometro parametrai laiko tarpai tarp skenavim (gate time), intervalas, plyio plotis (slit width), bangos ilgis (420 nm), slgis, matavimo gardels upildomos Otsuka RA-401,

353

( 5 1 3 n m )

0,4 0,3 0,2 0 20 40

Laikas, ms

600

(1)

(2)

(3)

buferiniais tirpalais. Gardels stipriai udaromos dangteliu. Paleidiama kompiuterin valdymo programa, nustatomos tamsos ir bazin linijos. Paskui matavimo gardels upildomos peroksidazs (2 M, 2 mL) ir vandenilio peroksido tirpalu (8 M, 2 mL), standiai udaromos dangteliu ir atidaromi auktojo slgio votuvai. jungiamas gardeli termostatas (25 C) ir kompiuterin matavimo komanda. Reakcija pradedama, paspaudiant spektrofotometro Start mygtuk. Atliekami trys matavimai, keiiant laiko interval tarp spektr. Reakcijos metu registruojamas peroksidazs komplekso I susidarymas. Analogikai atliekami matavimai, naudojant mediatori ir elektron donor. Vienoje gardelje sumaiomi lygios koncentracijos peroksidazs ir vandenilio peroksido tirpalai (po 2 M), kitoje gardelje supilamas mediatoriaus buferinis tirpalas (2050 M). Registruojami peroksidazs sugerties spektr pokyiai, rodantys peroksidazs komplekso I redukcij iki komplekso II ir io komplekso redukcij iki natyvios fermento formos. Chemin kinetika. Paruoiami 1 mL 20 mM (5,8 mg) DCIP ir 250 mM (44 mg) AR vandeniniai tirpalai. Matavimo gardelje galutin DCIP koncentracija lygi 0,2 mM, AR koncentracija 0,65,0 mM. Skiediama 50 mM acetatiniame buferyje, pH 4,7. Greitos kinetikos DCIP ir askorbino rgties reakcijos matavimai atliekami greito skenavimo metodu analogikai kaip fermentins kinetikos atveju. Vienoje gardelje supilamas 0,2 mM DCIP buferinis tirpalas, kitoje gardelje atitinkamas 5 mM AR tirpalas. Nustatomi reikiami spektrofotometro parametrai (bangos ilgis 550 nm) ir atliekami matavimai. Nustaius DCIP sugerties maksimum, esant mintam bangos ilgiui atliekami DCIP/AR kinetikos matavimai sustabdytos srovs (SF) metodu. Nustatomi reikiami spektrofotometro parametrai, bazin linija ir atliekami matavimai. Skaiiavimai Gauti peroksidazs aktyvaus centro sugerties pokyi spektrai transformuojami skaitmenikai ir analizuojami Microsoft Excel ir MathCad program paketais. Natyvios peroksidazs sugerties maksimumo (405 nm) kitimas (1 pav.) reakcijoje su vandenilio peroksidu rodo komplekso-I susidarym (1 lygtis). i reakcija yra labai greita 4060 ms. Esant pseudopirmosios eils slygoms (kai substrato koncentracijos virija fermento koncentracij 10 ir daugiau kart), sugertis ties 405 nm eksponentikai maja laike. Tai leidia apskaiiuoti pseudopirmosios eils greiio konstant (kobs), ir j nustaius, kai yra skirtingos peroksido koncentracijos, apskaiiuojama antrosios eils greiio konstanta k1: kobs = k1[H2O2]. (4)

1 pav. Natyvios peroksidazs ir jos tarpini jungini CiP-I ir CiP-II spektrai

354

Skaiiuojant tarpini peroksidazs jungini reakcij su elektron donorais greiio konstantas (2 ir 3 lygtys), atsivelgiama fermento sugerties spektro pokyius ties 394 nm, 414 nm ir 426 nm (1 pav.). ie bangos ilgiai atitinka izosbestinius peroksidazs ir jos tarpini kompleks takus. iuose takuose keiiasi tik vienos i trij fermento form koncentracija, tai leidia gauti atskirus vis fermento form koncentracijos pokyius reakcijos metu (2 pav.).

0,18

t=6.16 s

t=6.16 s

t=0.44 s

Sugertis

t=0.44 s 0,12
1,8

CiP

C, M

1,2 0,6 0 0

2 pav. Peroksidazs tarpini kompleks koncentracijos kitimai reakcijos su Nhidroksiacetanilidu (HAA) metu. 50 mM fosfatinis buferis, pH 7,0, 2 M CiP, 2 M H2O2, 50 M HAA. Intervalai tarp spektr 440 ms

0,06

CiP-II CiP-I
2 4 6

Laikas, s

350

400

450

Bangos ilgis, nm

Pseudopirmosios eils greiio konstantos k2 ir k3 apskaiiuojamos taikant modifikuotas nuoseklaus proceso lygtis: CiP-I

k2

CiP-II

k3

natyvus fermentas CiP-I koncentracijos kitimo iraika: (5)

[CiP-I] = A0 eksp(k2 t). CiP-II ir natyvaus fermento koncentracij iraikos: [CiP-II] = A0 [(k2/k3 k2) (eksp(k2 t) eksp(k3 t))] + B0 eksp(k3 t), [CiP] = A0 [(k2/k3 k2) eksp(k3 t) (k3/k3 k2) eksp(k2 t) +1] + B0 (1eksp(k3 t)) + C0.

(6) (7)

A0, B0 ir C0 pradins CiP-I, CiP-II ir CiP koncentracijos. Skaiiavimai atliekami Mathcad programa, parametrai parenkami remiantis grafiniu vaizdu ir minimalia aproksimacijos paklaida. Antrosios eils greiio konstantos apskaiiuojamos i tiesins priklausomybs tarp k2 ir k3 nuo substrato koncentracijos. Chemins kinetikos DCIP redukcijos pirmosios eils greiio konstantos apskaiiuojamos pagal eksponentin DCIP sugerties maksimumo majim esant skirtingoms AR koncentracijoms (3 pav.). Nustaius greiio konstantas, apskaiiuojama bimolekulin greiio konstanta (kb) pagal tiesins pirmosios eils greiio konstantos priklausomybs nuo AR koncentracijos nuolyd (3 pav., dtinis grafikas): k = kb[AR]. (8)

Kai yra eksperimentins slygos 0,1 mM DCIP koncentracijos ir buferinio tirpalo pH 4,7, bimolekulin greiio konstanta yra 6,1104 M-1s-1.

355

0,6
120 k, s-1

Sugertis (510 nm)

0,4

60

0,6

1,2

1,8

2,4

Askorbatas, mM

0,2

3 pav. DCIP redukcijos kinetins kreivs esant skirtingoms askorbino rgties koncentracijoms. dtinis grafikas: DCIP redukcijos pirmosios eils greiio konstantos priklausomyb nuo AR koncentracijos

0 0 20 Laikas, ms 40

Atsiskaitymas peroksidazs ir jos tarpini jungini sugerties spektrai, izosbestiniai takai; fermentins reakcijos greiio konstant apskaiiavimas ir reikms; chemini reakcij greiio konstant skaiiavimas.

Literatra 1. Caldin, E. F. Fast reactions in solution. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1964, (knyga iversta rus kalb). 2. Perkampus, H. -H. UV-VIS spectroscopy and its applications. Springer-Verlag, 1992. 3. Fierke, C. A.; Hammes, G. G. Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms. In Methods in enzymology, vol. 249, 1995, p. 337. 4. Brzovic, P. S.; Dunn, M. F. Rapid-scanning ultraviolet/visible spectroscopy applied in stopped-flow studies. In Methods in enzymology, vol. 246, 1995. p. 337.

356

4. Baltym konformacinio stabilumo nustatymas naudojant denatrantus


Darbo tikslas Spektrofotometrinis baltymo konformacinio stabilumo nustatymas naudojant karbamid. Praktinis natyvaus ir denatruoto baltymo sugerties spektr uraymas, denatracijos kreivi uraymas ir termodinamini parametr skaiiavimas. Tyrimo objektas mogaus serumo albuminas (HAS; paveiksllis viruje). Matavim priemons Kompiuterizuotas spektrofotometras LKB Biochrom, Ultrospec II su termostatuotu gardels laikikliu, mikropipet, svarstykls, pH-metras. Darbo eiga Ruoiamas 10 mL 16 mg/mL koncentracijos HSA (molekulin HSA mas yra 68 kDa) tirpalas 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 buferiniame tirpale. 10 mgintuvli*, turini 0,25 mL baltymo tirpalo, pilamas karbamido tirpalas, paruotas tame paiame buferio tirpale. Tirpalai, turintys skirting karbamido koncentracij, ruoiami kaip parodyta lentelje.
Lentel. Tirpal, turini skirting karbamido koncentracij, paruoimas

Mgintuvlio Nr.*

10 M karbamido (mL)

0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 (mL)

Karbamido koncentracija (M)

1 0 2,25 0 2 0,25 2,00 1 3 0,50 1,75 2 4 0,75 1,50 3 5 1,00 1,25 4 6 1,25 1,00 5 7 1,50 0,75 6 8 1,75 0,50 7 9 2,00 0,25 8 10 2,25 0 9 * Tikslesniems matavimams tikslinga paruoti 20 mgintuvli su tarpinmis karbamido koncentracijomis Uraomas baltymo tirpalo sugerties spektras esant 250340 nm bangos ilgiui buferiniame tirpale, ir tirpale, turiniame 9 M karbamido. Apskaiiuojamas skirtuminis sugerties spektras (1 pav.).

357

100 , santykinis

50

1 pav. Denatruoto ir natyvaus HSA skirtumin sugertis

0 240 280 320 360 Bangos ilgis, nm

Skirtuminiai sugerties spektrai matuojami, kai yra tarpins karbamido koncentracijos. Kad bt galima kompensuoti viesos ibarstym, skirtumin () sugertis matuojama esant 288 nm, atitinkaniam maksimal sugerties pokyt ir, esant 300 nm, kai sugert lemia viesos ibarstymas. Skaiiavimai Pieiama skirtumins sugerties pokyio priklausomyb nuo karbamido koncentracijos (2 pav.). Denatruoto baltymo frakcija fd randama pagal formul 1, kurioje Y reikmi skaiiavimas pavaizduotas 2 pav. fd = (YN Y)/(YN YD). (1)

180 YN 150 , santykinis 120 90 60 30 0 2 4 6 8 10 Karbamidas, M YD


2 pav. HSA sugerties pokyio priklausomyb nuo karbamido koncentracijos

358

Skaiiuojant termodinaminius parametrus laikoma, kad HSA denatracija apraoma grtamuoju procesu: Natyvus baltymas (N) Denatruotas baltymas (D). (2)

Termodinaminiai baltymo denatracijos parametrai skaiiuojami remiantis grtamuoju N ir D perjimu bei termodinaminmis priklausomybmis. Gibso (Gibbs) energijos ir pusiausvyros konstantos ryys ireikiama lygtimi 3: Go = R T ln K. Denatruoto baltymo frakcija yra fd, o natyvaus 1 fd. Todl GD = R T ln[fd/(1 fd)]. (4) (3)

Apskaiiavus laisvos energijos pokyt, kai yra skirtingos karbamido koncentracijos, denatracijos laisva energija vandenyje randama ekstrapoliuojant GD esant nulinei denatranto koncentracijai: GD = GD(H2O) + m[karbamidas]. Atsiskaitymas natyvaus ir denatruoto HSA ultravioletins viesos sugerties spektrai; molekulinis HSA sugerties koeficientas; denatracijos koncentracin priklausomyb; denatracijos laisvos energijos ir m reikm. (5)

Literatra 1. Tanford, C. Adv. Prot. Chem. 1968, 3, 121282. 2. Tayyab, S.; Siddiqui, M. U.; Ahmad, N. Biochem. Educ. 1995, 23(3), 162164. 3. Shirley, B. A. In: Stability of protein pharmaceuticals, Part A: Chemical and physical pathways of protein degradation, edited by T. J. Ahern and M. C. Manning. Plenum Press, New York, 1992, pp. 167194 (Shirley.pdf 759 Kb).

359

5. Baltym denatracijos termodinamini parametr nustatymas diferenciniu skenuojamuoju mikrokalorimetru


Darbo tikslas Susipainimas su diferencialiniu skenuojamuoju mikrokalorimetru. Mikrokalorimetro matavimo cels nuotrauka pateikta viruje. Praktinis baltymo denatracijos kreivs uraymas ir termodinamini parametr skaiiavimas. Tyrimo objektas Ribonukleaz arba kiti baltymai. Matavim priemons Diferencialinis skenuojamasis mikrokalorimetras DSM-2M, svarstykls, mikropipet, pH-metras. Darbo eiga Ruoiamas 6 % 0,1 mL ribonukleazs (MW 13,7 kDa) tirpalas acetatiniame buferyje ir hermetinamas aliuminio mikrokonteineryje. Referentinis mikrokonteineris upildomas 0,1 mL buferio. Abu mikrokonteineriai dedami mikrokalorimeto blok ir uraoma skirtumin termograma skleidiant temperatr 1 o/min greiiu. Bazin linija uraoma upildius abu mikrokonteinerius 0,1 mL buferinio tirpalo. Mikrokalorimetro kalibracija atliekama elektroniniu bdu naudojant vidin kalibratori. Pavyzdin ribonukleazs termograma pavaizduota 1 pav.

0.4 Sugertas galingumas. mW 0.3 0.2 0.1 0 0 20 Laikas, min


1 pav. Ribonukleazs termograma. Temperatros skanavimo greitis, 1 /min., pradin temperatra 22 C

40

360

Skaiiavimai I skirtumins termogramos apskaiiuojamas sugertos energijos kiekis (2 pav.).

400

Sugerta energija, mJ

300

200

2 pav. Sugerta baltymo energija

100 Td=41 oC 0 20 30 40 50 60 70 Temperatura, Temperatra, CoC

Skaiiuojant termodinaminius parametrus laikoma, kad ribonukleazs denatracija apraoma grtamu procesu: Natyvus baltymas (N) denatruotas baltymas (D). (1)

Termodinaminiai baltymo denatracijos parametrai skaiiuojami remiantis grtamu N ir D perjimu bei termodinaminmis priklausomybmis. Gibso (Gibbs) energijos ir pusiausvyros konstantos ryys ireikiamas lygtimi 2: G = R T lnK. (2)

Gibso ir Helmholtzo (Gibbs-Helmholtz) lygtis ireikia G/T priklausomyb nuo 1/T esant pastoviam slgiui: [(G/T)/(1/T)]p = H. (3)

Denatruoto baltymo frakcija yra T, o natyvaus 1-T. Kadangi baltymas visikai denatravo esant 50 C temperatrai, sugertos energijos kiekis q323 = 262 mJ (2 pav). Todl T esant iai temperatrai yra 1 arba q323/262. Pusiausvyros konstanta, kai yra emesns temperatros, skaiiuojama: K = ln[T/(1 T)] = ln[qT/(q323 qT)]. (4)

Taikant (2) lygties iraik bei atidedant duomenis (3) lygties koordinatse, randamas entalpijos pokytis baltymo denatracijos metu. Entropijos pokytis esant Td apskaiiuojamas remiantis Gibso lygtimi (5), kai G = 0: G = H T S. (5)

361

Atsiskaitymas DSK schema; integralins termogramos paveiksllis; entalpijos skaiiavimo paveiksllis; molins baltymo denatracijos entalpijos ir entropijos (esant Td) pokyio reikms; entalpinio ir entropinio faktori taka baltymo stabilumui; denatruoto baltymo iluminis talpumas; baltymo denatracijos kooperatyvumo rodymas.

Literatra 1. 2. 3. 4. Privalov, P. L. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1990, 25, 281305. Jones, M. N. Biochem. Educ. 1994, 22(4), 196198. Saboury, A. A.; Moosavi-Movahedi , A. A. Biochem. Educ. 1995, 23(3), 164167. Shirley, B. A. In: Stability of protein pharmaceuticals, Part A: Chemical and physical pathways of protein degradation, edited by T. J. Ahern and M. C. Manning. Plenum Press, New York, 1992 pp. 167 194. (Shirley.pdf 759 Kb).

362

S N

Trumpiniai

SDS natrio dodecyl sulfatas, CTAB cetiltrimetilamonio bromidas, cmc kritin miceli koncentracija. Tyrimo objektas Rekombinantin Coprinus cinereus peroksidaz (rCiP). is fermentas katalizuoja vairi organini ir neorganini molekuli donor (reduktori) oksidacij dalyvaujant reakcijoje vandenilio peroksidui. Reakcija vyksta pagal anso (Chance) pateikiam fermento veikimo schem: Peroksidaz + H2O2 E1 E1 + AH2 E2 + AH E2 + AH2 Peroksidaz + AH Matavim priemons Kompiuterizuotas spektrofotometras LKB Ultrospec II, termostatuojama spektrofotometro gardel, svarstykls, mikropipets, pH-metras. Darbo eiga Paruoiamas 50 mM acetatinis buferinis tirpalas pH 5,5, turintis Triton X-100 (0,3540 mM), CTAB (0,915 mM) ar SDS (8,142 mM). Vandenilio peroksido (H2O2) tirpalo ruoimas: 0,02 mL koncentruoto (~30 %) H2O2 tirpalo itirpinama pridjus tridistiliuoto vandens iki 10 mL. Koncentracija nustatoma spektrofotometrikai, taikant molin sugerties koeficient 39,4 M-1 cm-1 esant 240 nm bangos ilgiui. H2O2 tirpalas gali bti naudojamas tik t pai dien. Fermento tirpalas ruoiamas vandenyje. Jo koncentracija nustatoma spektrofotometrikai, taikant molin sugerties koeficient 1,08 105 M-1cm-1 esant 405 nm bangos ilgiui. Paruotas fermento tirpalas laikomas lede. Sugerties kitimo kinetines kreivs registruojamos esant 514 nm ir vairioms detergento koncentracijoms 2 mL trio kiuvetje 25 C temperatroje. kiuvet pilami H2O2 (100 M), promazinas (50 M) ir buferio tirpalai tokiu santykiu, kad bendras tirpalo tris kiuvetje bt ne didesnis kaip 2,1 mL. Detergent koncentracijos keiiamos: Tritonas X-100 0,3546 mM, SDS 8,141 mM ir CTAB 0,9215 mM. Tirpalas termostatuojamas apie 35 min. virkiamas fermento tirpalas (0,030,05 mL). Jo koncentracija gardelje turi bti apie 0,5 nM. Sugerties didjimas registruojamas apie 23 min. kol nusistovs pastovi sugerties reikm. Matavimai atliekami naudojant: a) 50 mM acetatin bufer, pH 5,5; b) 50 mM acetatin bufer, pH 5,5 su Tritonu X-100; c) 50 mM acetatin bufer, pH 5,5 su SDS; d) 50 mM acetatin bufer, pH 5,5 su CTAB. (1) (2) (3)

363

-O

Detergent takos ferment kinetikai eksperimentinis + tyrimas, taikant spektrofotometrin metod. Pradinio reakcijos greiio priklausomybs nuo detergento koncentracijos bei + substrato pasiskirstymo koeficiento apskaiiavimas.

Darbo tikslas

+ +

+
N

6. Ferment tirpaluose

kinetika

detergent

-O

N S

+ + + + +

Skaiiavimai Katijono radikalo susidarymo kreivs apskaiiuojamos taikant molin sugerties koeficient 8,9 103 M-1cm-1.

0.3 Sugertis (514 nm)

0 mM 0.35 mM 0.7 mM 1.5 mM

0.2

3 mM 6 mM 12 mM

0.1

23 mM 35 mM 46 mM

1 pav. Sugerties kitimas oksiduojant promazin rCiP peroksidaze ir esant skirtingoms Tritono X-100 koncentracijoms. 50 mM acetatinis buferinis tirpalas, pH 5,5. Tritono X-100 koncentracijos, paymtos alia grafiko

0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Laikas, min

Pradinis reakcijos greitis skaiiuojamas taikant tiesin arba polinomin kinetins kreivs aproksimacij. Grafikai pateikiama pradinio reakcijos greiio (V) priklausomyb nuo ivestins detergento koncentracijos (c-cmc) (2 pav.).
40

Reakcijos greitis, M/min

30
2 pav. rCiP katalizuojamos reakcijos pradinio greiio priklausomyb nuo detergento Tritono X-100 koncentracijos

20 Tritonas x-100

10

0 0 20 c-cmc, mM 40

Reakcijos greiio (V) priklausomyb nuo detergento koncentracijos apraomos ia lygtimi (5): V = Vw/[1 + P m (c-cmc)], ia: Vw reakcijos greitis buferiniame tirpale, P substrato pasiskirstymo koeficientas, m micels moliarinis tris (0,3 M-1 [1]), (5)

364

c bendra detergento koncentracija, cmc kritin miceli koncentracija. Kritins miceli koncentracijos (cmc) yra 0,3, 8,1 ir 0,92 mM atitinkamai Tritono X-100, SDS ir CTAB [1]. Skaiiavimus bendram duomen masyvui (sugerties kitimas laike, pradinio reakcijos greiio priklausomyb nuo detergent koncentracijos) rekomenduojama atlikti taikant GRAFIT program. Parametrai parenkami pagal grafin vaizd ir minimali paklaid. Atsiskaitymas nubraiyti promazino katijono radikalo susidarymo kinetines kreives, vykstant promazino oksidacijai peroksidaze ir esant skirtingoms detergent koncentracijoms; apskaiiuoti pradin produkto susidarymo greit esant skirtingoms detergent koncentracijoms; apskaiiuoti kw ir P kiekvieno detergento atveju.

Literatra 1. Kulys, J.; Vidinait, R. The role of micelles in mediator-assisted peroxidase catalysis. Progress in Colloid and Polymer Science. 2000. Vol. 116, p. 137142 (PCPS_micelles.pdf).

365

7. Imobilizuot ferment kinetikos ir difuzijos modeliavimas


Darbo tikslas Stacionarios ir nestacionarios imobilizuot ferment kinetikos ir difuzijos modeliavimas. Tyrimo objektas ir modelis Fermentin membrana, turinti homogenikai paskirstyt ferment. Katalizuojant fermentui i substrato (S) susidaro produktas (P). Reakcija apraoma Michaelio ir Menten (Michaelis-Menten) schema, o stacionarus pradinis greitis (V) yra: V = Vmaks.[S]/(Km + [S]). (1) merkus membran subtrato tirpal, katalitiniai procesai membranoje vyksta tuo paiu metu kaip ir difuzija. Substrato koncentracijos pokytis ireikiamas: [S]/t = D2[S]/x2 V. Produkto koncentracijos pokytis membranoje: [P]t = D2[P]x2 + V. Modeliavimo priemons Analitiniai diferencialini lygi sprendimo bdai programomis Mathematika, Mathcad 5. Darbo eiga Analitikai iprendiama lygi sistema (2,3) esant stacionariam bviui, kai [S] < Km ir [S] = [S]0 membranoje, kurios paviriaus ir jos iors storis yra d, , o mediag difuzijos koeficientas D. Analizuojama stacionaraus substrato ir produkto koncentracijos pasiskirstymo priklausomyb nuo kinetin ir difuzini parametr. Substrato virsmas nestacionariu atveju ir esant vairioms substrato koncentracijoms skaiiuojamas skaitmeniniu Eulerio metodu. Keiiamas tiek laikas, tiek ir ilgio kordinat. Skaiiavimams parenkamos pradins slygos: i pradi mediag koncentracija membranoje lygi nuliui. Toliau substrato koncentacija membranos iorje paviriuje yra fiksuota. Skaiiavimo algoritmas, kuriame Vmaks. paymtas raide r, o difuzijos koeficientas raide c, uraomas taip: (3) (2)

366

Stacionarus substrato pasiskirstymas membranoje pateikas 1 pav.


1 pav. Stacionarus substrato pasiskirtymas membranoje. Analitinis sprendimas (takai) ir skaimeninis bdas (kreiv)

1 0.8 [S]/[S]0 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Membranos storis, mm Skaitinis sprendimas Analitinis sprendimas

367

Santykine koncentracija

0.6

[S] [P]

0.4

0.2

0 0 10 Laikas, min
2 pav. Substrato ir produkto koncentracijos kitimas membranos viduryje. Skaiiavimai atlikti skaitmeniniu bdu ir naudojant tuos paius parametrus kaip ir stacionariu atveju

20

30

2 pav. grafikai pavaizduoti, kai Vmaks. = 0,03 mM/s, Km = 10 mM, [S]0 = 1 mM, D = 10-6 cm2/s, d = 1 mm Atsiskaitymas stacionaraus substrato ir produkto koncentracij kitimas membranos viduryje keiiantis maksimaliam greiiui nuo 0 iki 1 mM/s; substrato ir produkto koncentracijos kitimas membranos viduryje, kai Km yra 1 mM, o fermento aktyvumas 10 kart maesnis. Kiti parametrai kaip 1 pav.

Literatra 1. Kulys, J. Analitins sistemos paremtos imobilizuotais fermentais. Vilnius: Mokslas, 1981. 2. Kulys, J. Modelling biological kinetics by Eulers method: solving mediator stability problem, in Nonlinear Analysis. Modelling and control (Grigelionis B. et al, eds), Vilnius, 1997, 6770. 3. Difuzija*.avi (460 kb).

368