P. 1
Espectrofotometría

Espectrofotometría

|Views: 1.142|Likes:

More info:

Published by: Dayane Rivera Contreras on May 13, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/23/2013

pdf

text

original

Espectrofotometría, Curva de Calibración y Determinación de Proteínas por el método de Biuret.

María José Astorga; Daniela Soto; Dayane Rivera

Fecha: 01 mayo 2012

La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución, basados en sus propiedades fisicoquímicas. Como es el caso de las propiedades de compuestos como proteínas, que absorben cierta intensidad de luz (cromóforos) en el espectro UV- visible. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución, con lo cual, a partir de ello se realiza una curva de calibración con las absorbancias medidas por el aparato a concentraciones exactamente conocidas de un tipo en un mismo volumen. Se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida. visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas.  Espectrofotómetro La determinación de proteínas se efectuara por el método de biuret. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. . La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución.Introducción Todas las sustancias pueden absorber energía radiante. en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. además de determinar la misma en una muestra desconocida. además de obtener los niveles precisos de proteínas en solución y la concentración exacta de proteínas presentes. Para colocar a prueba todo lo indicado se pretende construir una curva de calibración para la determinación de proteínas plasmáticas mediante el método de biuret. Los resultados esperados son demostrar que las soluciones que tienen mayor concentración de proteínas sean las que tengan un valor de absorbancia mayor en comparación a las que su concentración estándar de proteínas es menor. se medirá en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 546 nm. La absorbancia que es la cantidad de luz absorbida por una solución de determinada concentración a una longitud fija. en donde el valor de la absorbancia es proporciona a la concentración de proteínas presentes en la solución. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro. La absorción de las radiaciones ultravioleta. y es característica para cada sustancia química. en donde las proteínas y péptidos dan positiva a esta reacción.

Material volumétrico. . Cubetas de plástico de 1. Muestra de suero y estándar de proteínas totales.Materiales Espectrofotómetro ajustado a 546 nm.5 ml.  Micro-pipetas de 100µl y de 1000µl  Tubos de ensayo. Reactivo Biuret. Agua destilada. Timer o cronometro.

Tubo 7: Añadimos 50 µl de concentración estándar de proteínas. Añadimos 25 µl de agua destilada y 25 µl suero normal. .  Tabla 1: Tubo 1 Blanco (µl) 50 ------------------2000 Tubo 2 Normal (µl) 25 ------25 ------2000 Tubo 3 Patológico (µl) 25 ------------25 2000 Tubo 4 (µl) 30 20 ------------2000 Tubo 5 (µl) 20 30 ------------2000 Tubo 6 (µl) 10 40 ------------2000 Tubo 7 (µl) ------50 ------------2000 Agua Destilada Estándar Proteínas Suero Normal Suero patológico Reactivo Biuret 3) Mezclamos por agitación todos los tubos con sus respectivos agregados.Métodos 1) Rotulamos 7 tubos de ensayo y los situamos en la gradilla. Tubo 6: Añadimos 10 µl de agua destilada y 40 µl de concentración estándar de proteínas. Añadimos 25 µl de agua destilada y 25 µl de suero patológico. 5) Leímos la absorbancia de cada uno de los tubos a 546 nm. Añadimos 30 µl de agua destilada y 20 µl de concentración estándar proteínas. 4) Incubamos los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tubo 5: Añadimos 20 µl de agua destilada y 30 µl de concentración estándar de proteínas. 2) Preparamos los 7 tubos de ensayo tal cual se nos indico y se resumen en la tabla 1:      Tubo 1: Tubo 2: Tubo 3: Tubo 4: Añadimos 50 µl de agua destilada.   Nota: Luego de realizado el paso anterior se les agrego a todos los tubos 2000 µl del reactivo de biuret.

652 0.9 18.Absorbancia y concentración de proteínas real de tubos 4.8 18.3 21.5 Absorbancia 0.98 (g/dl) Tubo N° Absorbancia Concentración de proteínas (g/dl) Tubo N°4 Tubo N°5 40 x 20 = x 2050 = 0.59 (g/dl) 6 0.Resultados de Absorbancia y Transmitancia a 546 nm tal como se muestra en tabla 2:  Tabla 2: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 T% 29.733 0.659 0.1 20.730 0.659 0.586 0.78 (g/dl) 7 0.733  2).59 mg/ml . 6 y 7 como se indica en tabla 3:  Tabla 3: 4 0.586 0.0 22.536 0..683 0. 5..652 0.39 mg/ml 40 x 30 = x 2050 = 0.6 26.39 (g/dl) 5 0.Resultados  1).

197 Tubo N°4 Tubo N°5 = 0.05 0.123 0.78 mg/ml  3).123 = 0. 5. ∆absorbancia:  Tabla 4: Tubo 4 5 6 7 ─ ∆absorbancia (∆A) 0.05 = 0.197 ..116 0.Tubo N°6 Tubo N°7 40 x 40 = x 2050 40 x 50 = x 2050 = 0.116 Tubo N°6 Tubo N°7 = 0.98 mg/ml = 0. 6 y 7 según se indica en tabla 4 para realización de posterior grafico.Calcular ∆A de los tubos 4.

05 0.05 0 0.123 0. 6 y 7. 5 . 4).15 0.  Tabla 5: [ ] de proteínas (eje x) 0.1 0.59 0.78 0.116 0.116 0. realice grafico (grafico 1).39 0.98 0.98 ∆A (eje y) 0.25 0..78 0.De acuerdo a los resultados obtenidos de ∆A para los tubos 4.197 Tubo 4 5 6 7  Grafico 1: Curva de calibración 0.59 0.05 0.2 0.197 0. según lo indicado en Tabla 5: Concentración de proteínas (eje x) vs ∆absorbancia (eje y).39 0.123 curva de calibración ∆ Absorbancia Concentracion de Proteinas .

x: concentración. m: pendiente. n: coeficiente de posición.  Ecuación de la recta: Siendo la ecuación de la recta: Donde: y: absorbancia. Tubo 4: Tubo 7: .Determinación de nivel de proteínas y muestras de suero a través de la ecuación de la recta con los datos conocidos de los patrones.  Calculo de la pendiente: Utilizando los datos extremos medidos de absorción y concentración del patrón.  Calculo del coeficiente de variación: Reemplazando los datos determinados de manera experimental en la ecuación de los valores extremos.

la ecuación de la recta para la curva de calibración es:  Calculo de concentración de proteínas para la muestra suero normal: -Absorbancia del suero normal: 0.730 .683  Calculo de concentración de proteínas para la muestra con el suero patológico: -Absorbancia del suero patológico: 0.Por lo tanto.

Discusión Al concluir este trabajo y obtener los resultados. . pero si se presentan sustancias no coloreadas. Al realizar la curva de calibración nos muestra una representación ascendente en cuanto a la concentración de proteínas y la variación de absorbancia de una solución. ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no coloradas? No se podrá construir una curva de calibración. construyéndose la curva de calibrado. se emplean reactivos (reactivo de Biuret) que le proporcionen color a estas sustancias para que puedan ser estudiadas y así realizar la curva de calibración.  Preguntas guía: 1. Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A. Se emplea en trabajos cuantitativos en los cuales hay que calcular la concentración del absorbente. su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema en la curva de calibración. ¿Qué es una curva de calibración? ¿Qué características debe cumplir? Una curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). lo que se traduce en lo antes ya señalado. ya que los tubos con mayor concentración de proteínas fueron los que obtuvieron valores de absorbancia mayor. y obtener resultados para la determinación de proteínas totales en solución. efectivamente la lectura de la absorbancia y la relación absorbanciaconcentración es directamente proporcional. ya que nos permitió cuantificar de manera muy precisa. es importante señalar que tal como se pensaba. que es una recta. Tal como se ha realizado con anterioridad en nuestro trabajo y en trabajos anteriores se ocupo en particular el “reactivo de biuret” a pesar de la existencia de otros para los mismos fines. 2. La elaboración de la curva de calibración es la fase principal al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico. Una vez ensayadas las soluciones problemas.

¿Cuál es la proteína plasmática más abundante? La Albúmina. Es responsable principalmente por la presión coloidoosmótica del plasma.3. Otra de sus funciones consiste en el transporte de sustancias. vitaminas. bilirrubina. La intensidad de este color se mide en el espectrofotómetro y es proporcional a la cantidad de proteínas presentes. si bien en menor cantidad.) se forma predominantemente en el hígado. En fin.5 y 5 g/100 ml. y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta). etc. Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos. medicamentos. en otros tejidos. Presenta un máximo de absorción a 540 nm. . Sus valores normales oscilan entre 3. existe una comparación colorimétrica con la muestra tratada. siendo este tubo una base (solución tipo) de absorbancia que presenta esta técnica. con aparición de una coloración azulada (cambia a violeta luego en presencia de proteínas. es la proteína más abundante en el plasma (50% aprox. las lleva por la circulación a sus órganos efectores. ¿Cuál es el fundamento del reactivo de Biuret? Por el método de Biuret se puede determinar la presencia de proteínas totales en una mezcla.. pero también. ¿Cuál es objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas? El fin de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas se debe a comparaciones que se logran realizar. Al unirse con las hormonas. 5. Las soluciones deben prepararse simultáneamente. 4. llegando a establecer por una diferencia el valor real de la absorbancia de la muestra y poder realizar los cálculos pertinentes a exponer.

ar/contratapa/calibracion/calibracion.Conclusión El método ocupado en esta oportunidad es tan efectivo como preciso para la determinación de proteínas en solución.unlp.htm http://perso.es/sergioram1/espectrofotometria.fcen.htm http://www.es/spanish/practicas/p29.qb.pdf http://adolfoneda. Referencias y Bibliografía http://catedras.panreac. no siendo difícil manipular los materiales y trabajar con el espectrofotómetro para obtener dichos resultados.htm .es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE %20PROTE%C3%8DNAS. y además muestra pocas interferencias.edu.htm http://www. Que si pensamos en ocuparlos para fines de mayor índole como puede ser en el área de salud es primordial evitar los posibles errores que mas que nada podrían ser de manipulación.wanadoo.ar/qo3/Apuntes/Biuret.edu.unne. lo cual podría modificar los resultados.sisib.med.uco.pdf http://www. este nos permitió obtener lo que se pensaba.uchile.uba.ar/catedras/bioquimica/pdf/proteinas.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/steinera/part e02/07b. es por eso que se prefiere.ucn.com/proteinas-plasmaticas/ http://www3.pdf http://www.cl/FacultadesInstitutos/laboratorio/colorT3. y además mediante este método obtuvimos valores exactos de la contracción de proteínas real en cada tubo.quimica.quimicaviva.pdf http://mazinger. en cuanto a que la absorbancia es proporcional a la concentración de proteínas en una muestra.

You're Reading a Free Preview

Descarga
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->