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Jesús Alejandro Cornejo Toledo
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 ¿Por qué secuenciar el ADN? Jesús Alejandro Cornejo Toledo
 ¿Por qué secuenciar el ADN? Jesús Alejandro Cornejo Toledo

¿Por qué secuenciar el ADN?

 ¿Por qué secuenciar el ADN? Jesús Alejandro Cornejo Toledo
 ¿Por qué secuenciar el ADN? Jesús Alejandro Cornejo Toledo
 ¿Por qué secuenciar el ADN? Jesús Alejandro Cornejo Toledo

Jesús Alejandro Cornejo Toledo

FINALIDAD  La secuenciación nos proporcionará la información básica necesaria para el estudio de un organismo.

FINALIDAD

La secuenciación nos proporcionará la información básica necesaria para el estudio de un organismo. El análisis de la secuencia del ADN es información crítica

FINALIDAD  La secuenciación nos proporcionará la información básica necesaria para el estudio de un organismo.

para predecir la secuencia de aminoácidos de los

productos proteicos, tanto de genes ya conocidos como de los nuevos genes aislados, así como en la detección de mutaciones individuales en enfermedades genéticas

FINALIDAD  La secuenciación nos proporcionará la información básica necesaria para el estudio de un organismo.

y en el diseño de iniciadores los cuales son utilizados

en procedimientos de diagnostico molecular. Además

es un pre-requisito para la obtención del ADN

recombinante y en su manipulación posterior.

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Métodos no automatizados

Son el método enzimático didedoxy descrito por Sanger y colaboradores y el método químico descrito por Maxam y Gilbert, difiriendo entre sí en la técnica

para generar la escalera de oligonucleótidos. En el

método enzimático se utiliza ADN polimerasa que sintetiza un copia marcada complementaria de un

molde de ADN. En el método químico una hebra de

ADN marcada es sujeta a un juego de reactivos químicos específicos de bases.

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  • Ambas técnicas están basadas en procedimientos

electroforéticos en geles desnaturalizantes de

poliacrilamida de alta resolución (geles de secuenciación) son capaces de resolver hebras de hasta 500 pb.

 Ambas técnicas están basadas en procedimientos electroforéticos en geles desnaturalizantes de poliacrilamida de alta resolución
 Ambas técnicas están basadas en procedimientos electroforéticos en geles desnaturalizantes de poliacrilamida de alta resolución

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Método químico

  • Se basa en la degradación de las cadenas de ADN. Los cuatro juegos de desoxioligonucleótidos son generados al exponer un desoxioligonucleótido purificada y marcado en el extremo 3o 5’, a un reactivo que funciona como base química específica, hidroliza el ADN en uno o dos nucleótidos específicos al azar.

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  • Se basa en la habilidad de la hidrazina, dimetilsulfato, o ácido fórmico para modificar específicamente a las bases dentro de la molécula de ADN. Cuando estas moléculas son expuestas a la piperidina, se cataliza un rompimiento de la hebra en el sitio donde los nucleótidos han sido modificados. La especificidad reside en la primera reacción con hidrazina, DMS o ácido fórmico que reaccionan sólo con un porcentaje de las bases. La segunda reacción, es decir la exposición a piperidina, hidroliza la cadena de manera cuantitativa.

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G

G H C 3 O O N CH R NH + N N O O S

H C

3

O

O

N
N

CH 3

R

NH + N N O
NH
+
N
N
O
O S O O
O
S
O
O
G H C 3 O O N CH R NH + N N O O S

R

O

H C 3 NH N + N N R O NH 2 NH R
H C
3
NH
N +
N
N
R
O
NH 2
NH
R

NH 2

G H C 3 O O N CH R NH + N N O O S
N O R H C R O 3 N NH N N
N
O
R
H C
R
O
3
N
NH
N
N

NH 2

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G+A

H

NH 2 O N N O + R R N N O H
NH 2
O
N
N
O
+
R
R
N
N
O
H

R

NH 2 N N N + N O H R HN
NH 2
N
N
N +
N
O
H
R
HN

R

N O R
N
O
R
NH 2 N N N N H
NH 2
N
N
N
N
H

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C+T

C+T O H C 3 NH H H N N + HO N O O H
O H C 3 NH H H N N + HO N O O H H
O
H C
3
NH
H
H
N
N
+
HO
N
O
O
H
H
OH
O
NH
H
C
NH
3
R
NH
O
N
NH 2
O
R

-

O

H C 3 NH + N O H N 2 H R NH 2 R
H C
3
NH
+
N
O
H
N
2
H
R
NH 2
R
O H C 3 NH N O HN H R NH 2 R -
O
H C
3
NH
N
O
HN
H
R
NH 2
R
-
O H C 3 NH N O HN H + R H N 2 R
O
H C
3
NH
N
O
HN
H
+ R
H
N
2
R

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C

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Método enzimático

Utiliza

terminadores

específicos de la elongación

de la cadena de ADN

denomindaos

23

didedoxinucleotidostrifosfata

dos (ddNTP’s).

Son

incorporados normalmente en

una cadena de ADN que está creciendo. Debido a que no

tienen

3’OH

no

pueden

formar un enlace fosfodiester

Método enzimático Utiliza terminadores específicos de la elongación de la cadena de ADN denomindaos 2 ’

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Nuevas tecnologías de

secuenciación

Nuevas tecnologías de secuenciación Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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Pyrosequencing

  • Un primer es hibridado a una ampliación

de

cadena sencilla por PCR que sirve como base, y es incubado con las

enzimas,

DNA

polimerasa,

ATP

sulfurilasa,

luciferasa y

apyrase

ademas

de

los

sustratos

adenosina

5

fosfosulfato

(APS)

y

luciferin.

Pyrosequencing  Un primer es hibridado a una ampliación de cadena sencilla por PCR que sirve

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 El primer dNTP es agregado a la reacción. La ADN polimerasa cataliza su incorporación a

El

primer

dNTP

 

es

agregado a la reacción. La

ADN

polimerasa

cataliza

su

incorporación

a

la

cadena,

si

este

es

complementario.

 

Cada

imcorporación

 

es

acompañada

 

de

la

liberación de un grupo PPi

en una cantidad equimolar

a

la

cantidad

 

de

nucleótidos incorporados.

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  • La ATP

sulfurilasa

convierte el PPi en ATP en presencia de APS. Este ATP va hacia la luciferasa promoviendo la conde luciferin a oxyluciferin, la cual genera una luz que es

proporcional a la cantidad de ATP. La luz es detectada

por un detector (CCD) y lo

muestra como un pico, su altura es proporcional al número de nucleótidos incorporados.

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 La ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP en presencia de APS. Este ATP va
  • Apyrase,

una

enzima

 Apyrase, una enzima degradadora nucleótidos, posteriormente los dNTP de degrada no incorporados. Cuando la degradación

degradadora

nucleótidos,

posteriormente

los

dNTP

de

degrada

no

incorporados. Cuando la

degradación

es

completa,

otro

nucleótido es agregado

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  • La adición de los dNTPs es hecha secuencialmente.

 La adición de los dNTPs es hecha secuencialmente. Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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Resumen

  • Tiempo de corrida ~8 horas.

  • Produce cientos de Mb se secuencias.

  • Lee segmentos de 300-400pb.

  • Es la mas “madura” de las nuevas tecnologías.

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Ilumina Genome Analyzer

Ilumina Genome Analyzer Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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Secuenciación Ilumina/Solexa

Secuenciación Ilumina/Solexa Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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Sequencing By Synthesis (SBS)

Sequencing By Synthesis (SBS) Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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Imagen mayor en Pseudo-color

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Rendimiento

  • Cada línea puede secuenciar de 20-30 millones de moléculas

  • - 8 líneas, es igual a mas de 240 millones de lecturas.

    • Lecturas propicias para el recuento de experimentos basados en 36 pb.

    • Capacidad de lectura de mas de 100pb

  • - 50Gb de secuencia por corrida

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    Hiseq2000

    Hiseq2000  Misma química  Celdas más grandes  Hardware mejorado - Mejor laser, detector 
    • Misma química

    • Celdas más grandes

    • Hardware mejorado

      • - Mejor laser, detector

        • 8 días de corrida para las 2 celdas.

      • - Todo el genoma en 8 dias

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    SOLiD from Applied Biosystems

    SOLiD from Applied Biosystems Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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    Two-base encoding

    Two-base encoding Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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    Ligation-based extension

    Primera detección

    Ligation-based extension Jesús Alejandro Cornejo Toledo
    Ligation-based extension Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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    Pacific Biosiences

    Pacific Biosiences Jesús Alejandro Cornejo Toledo
    Pacific Biosiences Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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    Novedades

    Novedades Jesús Alejandro Cornejo Toledo

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    USOS  Detección de mutaciones  Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

    USOS

    • Detección de mutaciones

    • Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

    • Secuenciación de ADNs fósiles

    • Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias

    • Diagnóstico de enfermedades genéticas

    • Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de fecundación in vitro

    • Identificación de especies y control de cruces entre animales

    • Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más

    • barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

    • Secuenciación de genomas

    • Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

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    7millons-thousands Jesús Alejandro Cornejo Toledo
    7millons-thousands Jesús Alejandro Cornejo Toledo

    7millons-thousands

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