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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA

PSEUDOMONAS

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Ingeniera Bioqumica
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INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ


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MICROBIOLOGIA

PSEUDOMONAS
(EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA)

ALUMNOS: DOMINGUEZ FLORES LAURA PATRICIA GUTIERREZ SARMIENTO WILBERT

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TUXTLA GUTIERREZ, CHIAPAS A 8 DE NOVIEMBRE DEL 2011

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INDICE
I. II. III. INTRODUCCION. OBJETIVO MARCO TEORICO. III.I PSEUDOMONAS III.I.I CULTIVO III.I.II HABITAT III.I.III.CARACTERISTICAS GENERALES III.I.IV.GRUPOS DE BACTERIAS DE Pseudomonas ssp III.I.V PATOGENIA a. Patgenos animales b. Patgenos de plantas III.I.VI IMPORTANCIA DE PSEUDOMONAS a. b. c. d. Su actividad como patgeno de animales Su actividad como patgeno de vegetales Su actividad como agentes alterantes de alimentos Su actividad como agentes descontaminantes ambientales

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III.II.AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE PSEUDOMONAS III.II.I CARACTERISTICAS MINIMAS DE IDENTIFICACION III.II.III IDENTIFICACION CON PRUEBAS BIOQUIMICAS III.II.IV IDENTIFICACION POR PCR III.I.V ESPECIES DE PSEUDOMONAS a. b. c. d. e. f. g. h. i. P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. maltophilia P. cepacia P. stutzeri P. alcaligenes y P. pseudoalcalagenes P. mallei P.pseudomallei

III.III HIDROCARBUROS III.III.I CLASIFICACION III.III.II CONTAMINACION DE HIDROCARBUROS III.III.III DEGRADACION DE HIDROCARBUROS III.III.IVCATABOLISMO DE LOS COMPUESTOS AROMATICOS a. Catabolismo aerobio b. Catabolismo anaerobio III.IV.PETROLEO III.IV.I CARACTERISTICAS ING. BIOQUIMICA ITTG QFB. AURA FLORES

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III.IV.III FORMACION III.IV.IV PRINCIPALES FUENTES DE CONTAMINACION

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III.IV.V PSEUDOMONAS DEGRADADORAS DE PETROLEO IV. METODOLOGIAS. *Aislamiento de la diversidad microbiana de la rizosfera del suelo *Identificacin de bacterias Gram positivas y Gram negativas *Identificacin de Pseudomonas spp. mediante pruebas bioqumicas Prueba de oxidasa Prueba de triple azcar hierro (TSI) Prueba de Fluorescena Prueba de Piocianina: Prueba de Nitrato (MMM) *Extraccin de ADN de las Pseudomonas spp.aisladas para anlisis de PCR *Identificacin de Pseudomonas spp. por anlisis de PCR *Determinacin cualitativa de la capacidad de biodegradacin de hidrocarburos aromticos por Pseudomonas spp. aisladas *Determinacin cuantitativa de la capacidad de biodegradacin de hidrocarburos alifticos por Pseudomonas spp. aisladas *Descripcin para la identificacin de Pseudomonas spp. V. VI. VII. VIII. IX. RESULTADOS

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32 DISCUSION DE RESULTADOS 40 CONCLUSION.. 41 BIBLIOGRAFIA. 42 ANEXOS 43

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I. INTRODUCCION
El estudio de las Pseudomonas ssp en las ultima dcadas se debe que tiene ciertas caractersticas importantes; ya que es capaz de utilizar compuestos orgnicos como fuentes de carbono y energa. Esto ha permitido mediante su estudio la comprobacin de la capacidad de inhibir los coliformes, siendo los indicadores de contaminacin de agua ms usados en el mundo, pero no solo esa rea ha sido de gran inters, puesto que en los ltimos aos se ha encontrado que es capaz de biorremediar el medio contaminado con ciertos hidrocarburos presentes en el petrleo. El petrleo es una mezcla homognea de compuestos orgnicos, principalmente hidrocarburos insolubles en agua, estos compuestos estn conformados de hidrgeno y carbono, en su mayora parafinas, naftenos y aromticos. Los hidrocarburos de este tipo llegan a se de gran problema para los ecosistemas, ya que contaminan fuentes de agua y suelos, ocasionando un gran impacto ecolgico. Por tanto es la gran importancia que adquieren las Pseudomonas ssp para lograr la remocin de estos contaminantes del ambiente. Es por ello la importancia de poder aislar este tipo de bacterias presentes en el suelo El manejo inadecuado de los materiales y residuos peligrosos ha generado a escala mundial, un problema de contaminacin de suelos, aire y agua. Entre las ms severas contaminaciones se destacan las que se produjeron y todava se producen a causa de la extraccin y el manejo del petrleo en todos los pases productores de hidrocarburos. Las Pseudomonas ssp son una un grupo de bacterias que se encuentran constituido por bacilos aerobios gran negativos y mviles, algunos de los cuales producen pigmentos solubles en agua. Las especies de este gnero se identifican sobre la base de varias caractersticas fisiolgicas. El aislamiento de esta bacteria nos permitir un mayor anlisis de su capacidad degradadora de los hidrocarburos. Es por ello que en la realizacin de este trabajo, aislaremos a Pseudomonas ssp a partir de muestras de la tierra llevndolas a un crecimiento selectivo, para de esta manera poder separarlas debido a sus caractersticas taxonmicas , trabajado con ciertas pruebas bioqumicas adems de PCR (Reaccin de Cadena Polimerasa), y as ya una vez identificadas poderlas poner a prueba en la minimizacin de los hidrocarburos policclicos y heterocclicos, con esto poder medir su potencial biodegradativo que presentan las bacterias Pseudomonas ssp. a fin de seleccionar cepas bacterianas con una amplia capacidad degradadora, que garanticen de esta forma la remocin de los hidrocarburos complejos presentes en el suelo.

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II. OBJETIVO

General:

Aislar e identificar la bacteria pseudomonas a partir de la extraccin de una muestra del medio

Especficos:

Diferenciar la familia de pseudomonas en una muestra de fuente natural (tierra), segn las caractersticas que se presentan Diferenciar a partir de tcnicas de taxonmicas la presencia de la bacteria pseudomonas ssp. Utilizar la tcnica de PCR para una clara y concisa diferenciacin de la bacteria pseudomonas ssp, segn su ADN. Aislar la bacteria pseudomonas obtenida de la muestra Permitir el crecimiento de la bacteria a partir de igualar las condiciones necesarias de la misma

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III. MARCO TEORICO III.I PSEUDOMONAS


Los organismos de este gnero son bacilos gran negativos o esporulados, de unos 3 Mm x 5 Mm, que se mueven mediante flagelos polares, que pueden producir un pigmento fluorescente, son oxidasa positivos, utilizan glucosa oxidativamente y no forman gas. Se hallan corrientemente en el suelo y el agua. Algunas especies se identifican como patgenas para el hombre y animales pero algunos otros, considerados al principio como saprofitos y comensales, se han implicado como patgenos oportunistas en infecciones adquiridas en hospitales y han llegado a colonizar aportes de agua destilada, jabones, desinfectantes, infusiones intravenosas y otros productos farmacuticos. Las especies que colonizan las piscinas se han incriminado en infecciones del odo. (Collins & Lyne, 1989) III.I.I CULTIVO Las Pseudomonas crecen en medios simples (Tabla 1). En caldo crecen abundantemente formando un anillo y un sedimento de color verde azulado. En agar simple forman colonias brillantes, confluentes, de borde continuo y a veces ondulado con un centro opaco. El pigmento (piocianina) se difunde en el medio dndole una tonalidad verdosa. Este pigmento tiene cualidades bactericidas sobre otras bacterias Gram positivas y Gram negativas. III.I.II HBITAT Las especies del gnero Pseudomonas son organismos ubicuos, bacterias gram negativas que se encuadran dentro del grupo de las proteobacterias. Se han aislado bacterias de este gnero tanto en suelos limpios como en suelos contaminados por productos biognicos y xenobiticos. Tambin son microbiota predominante en la rizosfera y en la filosfera de plantas; del mismo modo, se han aislado de ambientes acuticos, tanto de agua dulce como de aguas marinas. En general inocuas para el hombre tambin existen: patgenos oportunistas como P.aeruginosa; patgenos de animales y patgenos de plantas como P.syringae. Este gnero es uno de los ms proclives a la degradacin de compuestos orgnicos, especialmente cepas de la especie Pseudomonas putida. El amplio potencial catablico de los componentes del gnero viene dado en muchos casos por la presencia de determinantes plasmdicos y transposones autotransmisibles. La ubicuidad de las bacterias del gnero Pseudomonas y su capacidad para explotar una amplia variedad de nutrientes refleja un sistema de

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adaptacin al medio ambiente que no encuentra parangn en las bacterias de otros gneros. Las cepas del gnero Pseudomonas son capaces de procesar, integrar y reaccionar a una amplia variedad de condiciones cambiantes en el medio ambiente, y muestran una alta capacidad de reaccin a seales fsico-qumicas y biolgicas. Se han descrito cepas capaces de adquirir resistencia a metales pesados, disolventes orgnicos y detergentes, lo cual les permite explotar una amplia gama de fuentes de carbono como nutrientes, as como colonizar ambientes y nichos que difcilmente son colonizables por otros microorganismos. Por ello no es sorprendente que se considere a las bacterias del gnero Pseudomonas un paradigma de versatilidad metablica, y microorganismos claves en el reciclado de materia orgnica en los compartimentos aerbicos de los ecosistemas, jugando, por tanto, un papel esencial en la mejora y el mantenimiento de la calidad medioambiental. Adems de su uso en biodegradacin las especies del gnero Pseudomonas se emplean en distintos procesos industriales, tales como la fabricacin de bioplsticos o en tcnicas de biocontrol. La posicin taxonmica de las distintas especies del gnero se encuentra sujeta a revisin. III.I.III CARACTERSTICAS GENERALES Las pseudomonas son bacilos rectos o curvados pero no vibroides, son bacterias Gram negativas con flagelos polares , normamente aislados, no envainadas o con yemas, constan de un tamao de 0,5 -1,0 Mm por 1,5-4,0 Mm, sin esporas. Dentro de su metabolismo respiratorio, nunca fermentativo aunque pueden producir cierta cantidad de acido a partir de glucosa en condiciones de aerobiosis; utilizan compuestos orgnicos de bajo peso molecular pero no polmeros; algunos son quimilitrotofos, utilizando H2 o CO como nico donador de electrones en anaerobiosis, algunos pueden utilizar arginina anaerbicamente (madigan, martinko, & parker, 2008) (madigan, martinko, & parker, 2008) III.I.IV. GRUPOS DE BACTERIAS DEL GNERO PSEUDOMONAS El grupo de bacterias relacionadas con el gnero Pseudomonas es muy amplio y comprende especies patgenas para humanos Pseudomonas cepacia (patgeno oportunista que puede causar infecciones muy serias con alta tasa de mortalidad en pacientes comprometidos, especialmente han aumentado los datos de infecciones producidas en los pulmones de pacientes con fibrosis cstica) y Ps. aeruginosa. Hay especies patgenas vegetales como Ps. solanacearum que produce marchitacin, Ps. syringae causante de manchas clorticas en ciertas plantas y Ps. marginalis causante de pudriciones blandas en las races de las plantas.

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Por otra parte, existen varios gneros bacterianos estrechamente relacionados con el de Pseudomonas que tambin tienen una importancia especial: el gnero Xanthomonas comprende varias especies patgenas vegetales que producen necrosis del follaje. El gnero Zooglea comprende varias especies capaces de producir agregados celulares de gran tamao que intervienen de forma importante en la digestin de las aguas orgnicas de ciudades e industrias, y los gneros Acetobacter y Gluconobacter, de los que hablaremos ms adelante, que son capaces de oxidar alcoholes y tienen importancia industrial en la fabricacin de vinagre III.I.V PATOGENIA a. Patgenos animales P. aeruginosa es un patgeno oportunista humano, ms comnmente afecta a los inmunosuprimidos, tales como aquellos con fibrosis qustica o sida. Estas infecciones pueden afectar a muchas partes del cuerpo, pero tpicamente afectan las vas respiratorias, causando 50 % de las pulmonas bacterianas nosocomiales. (Salazar Rodriguez, Gonzales Rizo, & Palma Monroy, (Mayo-ago. 2002) Rev Cubana Med Trop. [online]. 54) El tratamiento de dichas infecciones puede ser difcil debido a la frecuente y repetitiva resistencia antibitica. P. oryzihabitans puede tambin ser un patgeno humano, aunque las infecciones son raras. Puede causar peritonitis, endoftalmitis, septicemia y bacteremia. Sntomas similares, aunque poco frecuentes, pueden ser vistos con P. luteola. P. plecoglossicida es una especie patgena de peces, causando ascitis hemorrgica en los peces Ayu (Plecoglossus altivelis). P. anguilliseptica es tambin un patgeno en los peces. Debido a su actividad hemoltica, las especies que no son patgenas pueden ocasionalmente causar problemas clnicos, en particular en la infeccin de transfusiones de sangre. Las Pseudomonas, por ser bacterias hidrfilas, han estado involucradas en otitis externa en particular asociada al agua, como es el caso del odo de nadador crnico o aquellas provocadas por la insercin de objetos penetrantes en el odo. b. Patgenos de plantas P. syringae es un patgeno prolfico de plantas. Existe en ms de 50 variantes, muchas de las cuales muestran un alto grado de especificidad en las plantas. Hay numerosas especies de otras Pseudomonas que pueden actuar como patgenos de las plantas, aunque la P. syringae es la ms distribuida y mejor estudiada.

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Aunque no es un patgeno estrictamente de plantas, P. tolaasii puede ser un gran problema agrcola, debido a que causa manchas bacterianas de setas cultivadas. Similarmente, P. agarici puede causar laminillas gotosas en ciertos setas. III.I.VI. IMPORTANCIA DE LAS PSEUDOMONAS La importancia aplicada de las bacterias del grupo de Pseudomonas se debe a una serie de factores entre los que destacan:

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a. Su actividad como patgenos de animales

Las patologas asociadas a Pseudomonas suelen presentarse en animales afectados por algn tipo de disminucin, permanente o transitoria, del sistema de defensa inmune. Por esto, se denominan patgenos oportunistas. El tratamiento de estas infecciones suele ser difcil debido a la alta resistencia de estas bacterias a la mayora de los antibiticos usados normalmente en clnica. Desde el punto de vista humano, el patgeno principal es Ps. aeruginosa. La especie Ps. mallei es la causante de la enfermedad conocida como muermo en los caballos y Ps. pseudomallei es causante de la melioidosis humana.

b.

Su actividad como patgenos vegetales

La especie Ps. syringae es un verdadero parsito vegetal. Las especies del gnero Xanthomonas tambin son todas patgenos vegetales.

c.

Su actividad como agentes alterantes de alimentos

Las Pseudomonas son el grupo de bacterias ms frecuente en los alimentos frescos. Debido a su gran potencial metablico, las bacterias de estos grupos son agentes importantes en la alteracin de alimentos. Sin considerar los aspectos de deterioro de vegetales producidos por especies antes citadas, las Pseudomonas son uno de los principales grupos responsables de la alteracin de productos crnicos almacenados incorrectamente en condiciones de aerobiosis. Algunas bacterias del grupo son psicrfilas por lo que la alteracin de los alimentos que producen tambin tiene lugar durante la conserva en refrigenracin. Cuando piezas de alimentos crnicos son conservadas en refrigeracin en ambientes impermeables al gas o en vaco, las Pseudomonas pueden producir H2S que reacciona con la hemoglobina dando lugar a la aparicin de manchas verdes.

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Su aplicacin como agentes descontaminantes ambientales

La gran versatilidad metablica de las bacterias del gnero Pseudomonas las han hecho candidatas para el tratamiento de contaminaciones ambientales producidas por la acumulacin de metales pesados o por la acumulacin de compuestos xenobiticos. Varias especies del Pseudomonas contienen plsmidos en los que se encuentran codificadas enzimas capaces de degradar, al menos parcialmente, compuestos orgnicos derivados del petrleo o compuestos organoclorados u organofosfatados. Estas enzimas suelen ser inducibles y la seleccin de las cepas adecuadas puede permitir reducir los niveles de contaminacin por estos compuestos xenobiticos. La biodegradacin de hidrocarburos y de otros compuestos orgnicos es realizada con eficiencia variable dependiendo de la estructura del hidrocarburo (lineal o ramificado, aliftico o aromtico) y de la presencia de tomos sustituyentes. Algo similar ocurre con la biodegradacin de compuestos insecticidas, herbicidas y detergentes y emulgentes. Por otra parte, el tratamiento de la contaminacin originada por la acumulacin de metales pesados tambin es posible mediante la utilizacin de bacterias de este gnero. El efecto txico de los metales pesados suele estar asociado a la presencia de formas ionizadas (cationes) de los metales en cuestin. Ciertas bacterias de este gnero presentan enzimas capaces de reducir los cationes metlicos a las formas neutras que son mucho menos txicas. Los operones que controlan la produccin de estos enzimas reductores suelen ser inducibles por la presencia del metal pesado. Otra forma de intervencin en la eliminacin de metales pesados por bacterias de este grupo la desarrollan las bacterias del gnero Zooglea que son capaces de acumular los metales pesados y formar agregados de gran tamao que precipitan mediante floculacin. La utilizacin dirigida de bacterias para la descontaminacin de ambientes naturales se denomina biorremediacin. III.II. AISLAMIENTO E IDENTIFICACION Se siembran en agar nutritivo, en McConkey, agar nutritivo con 0,1% de cetrimida o algunos de los medios para pseudomonas y se incuban a 20-25 C (materiales animales). Las colonias en agar nutritivo son generalmente grandes (2-4 mm), desarrollndose planas y pigmentadas. Pueden difundirse en el medio un
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pigmento fluorescente amarillo verdoso o amarillo azulado. En ocasiones se encuentran cepas melanogenicas. Se forma un pigmento pardo alrededor de las colonias. Se hallan a veces cepas mucoides (encapsuladas) en material clnico y puede confundirse con klebsiellas. Se hace la prueba de la oxidasa, reaccin en el medio de Hugh y Leifson, siembras en caldo de arginina de Thornely (el mtodo de Moeller es demasiado anaerobio), agar de McConkey y prueba de licuacin de la gelatina(incubacin durante cinco das). Se siembran caldos de nutritivos y se incuban a 4 y 42 C. se utiliza para esta prueba de subcultivo de una cepa lisa. Las pseudomonas son mviles (en ocasiones pueden hallarse cepas inmviles), oxidativas, no reaccionan y producen lcali en medio de Hugh y Leifson. La reaccin de la oxidasa es positiva, excepto posiblemente con P.maltophilia. La reaccin de arginina de Thornley es positiva salvo para P.maltophilia, P. cepacia, P. stutzeri y P. alcaligensis, que no son frecuentes. Aquellas pseudomonas que dan positivas a la arginina lo hacen mas rpidamente que otros bacilos Gram negativos y esta prueba es muy til para identificar las cepas no pigmentadas. Alcaligenses, Achromobacterium y Vibrio ssp. no hidrolizan la arginina. Las pseudomonas varan en su capacidad para licuar la gelatina y crecen a 4 y 42 C (vase tabla 2), pueden ser tiles para las pruebas de sensibilidad a discos de penicilina. (Collins & Lyne, 1989) La formacin de pigmento se observa mejor en un medio sinttico basal con 4% de gluconato clcico o en un medio comercial para pseudomonas. Algunas cepas fluorescentes producen una opalescencia (reaccin yema de huevo) en el medio de Willis y Hoob y tambin una lipasa (capa perlada). Para demostrar la ltima, se inunda la placa con solucin saturada de sulfato de cobre; los cidos grasos liberados por lipolisis forman un precipitado azul verdoso de jabones de cobre. Algunas variedad se relacionada con la alteracin de alimentos son psicrofilas y pueden ser lipoliticas. No son raras las cepas tolerantes a la salmuera y las cepas fosforescentes III.II.I CARACTERSTICAS MNIMAS PARA LA IDENTIFICACIN Gran negativas, bacilos rectos o ligeramente curvados, sin esporas, siempre mviles por flagelos polares; metabolismo oxidativo en medio para oxidacinfermentacin con glucosa, el tubo sin vaselina produce acido(amarillo) y el tubo sin vaselina no produce acido (neutro); no se produce gas de la glucosa (se distinguen fcilmente de las bacterias entricas y de Aeromona); la oxidasa es casi siempre positiva (las entricas son negativas); la catalasa siempre es positiva

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no presentan pigmentos fotosintticos (lo distingue de las bacterias rojas no del azufre); el indol y el rojo de metilo son siempre negativos (Collins & Lyne, 1989). IIII.II.II.IDENTIFICACION POR PRUEBAS BIOQUIMICAS Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Prueba de oxidasa

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El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa, esto a partir de que el citocromo xido acepte electrones artificial: tetrametil (o dimetil) p fenilendiamina. Las colonias oxidasa positivas en agar pueden detectarse sumergiendo la placa en un reactivo y buscando colonias azuladas o marrones, da positivo para Pseudomonas.

Se evala la capacidad de las bacterias para oxidar o fermentar produciendo acido que se detecta gracias al azul de bromotinol (pH), da positiva para pseudomonas. (Anexo 2) Reduccin de Nitrato Las Pseudomonas son positivos a estas pruebas, que trata acerca de la reduccin de nitrato a nitrito.(Anexo 3). Gelatina Se usa para valorar la licuefaccin o licuacin de la gelatina por accin de las gelatinasas bacterianas producidas. La reaccin positiva hace que el medio permanezca lquido despus de la incubacin an despus de dejarse en refrigeracin durante media hora. La reaccin negativa permite nuevamente la solidificacin; da positivo para pseudomonas. III.II.III. IDENTIFICACION POR PCR Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Oxidacin-Fermentacin (O-F)

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El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros. stos incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la temperatura de unin de los cebadores, as como la longitud del ADN que se desea amplificar. III.II.IV. IDENTIFICACION DE ESPECIES DE PSEUDOMONAS a. P. aeruginosa Las colonias en medio agar, 18-24 horas a 25-30 C, son grandes de superficie plana e irregular, de coloracin verde grisacea. El pigmento verdoso se difunde en el medio. Los cultivos en caldo son de color azul verdoso. Se forman dos pigmentos, piocianina y fluorescencia: ambos son hidrosolubles,aunque solamente la piocianina es soluble al cloroformo. Laarginina es hidrolizada rpidamente. Licuan la gelatina. El crecimiento tiene lugar a 42C pero no a 5C.la reaccin de la yema de huevo es negativa. Los organismos son muy resistentes a los antibiticos, salvo a la polimixina, gentamicina y cabernicilina. Es un saprofito, que se halla en el suelo y en el agua, producen alteraciones de los alimentos, entre ellas las leche azul, es patgeno para el hombre y los animales (pus azul), a menudo como infeccin secundaria y se halla con frecuencia ne material clnico. Esta frecuentemente asociada a infecciones de los tractos respiratorios y urinario en humanos. Las infecciones por Pseudomona aeruginosa son frecuentes en grandes quemados u otros traumatismos severos que afecten a amplias zonas de la piel o bien en pacientes con fibrosis qustica. Sin embargo, no es un parasito estricto, sino un oportunista tpico, iniciando una infeccin cuando el individuo se encuentra bajo de defensas. Tambin pueden causar infecciones sistemticas, de nuevo con individuos con amplias lesiones de piel. Este microorganismo es naturalmente resistente a muchos de los antibiticos utilizados rutinariamente de modo que la quimioterapia es difcil. Frecuentemente la resistencia se debe a la transferencia de plsmidos R, que es un plsmido que se lleva genes para la descodificacin de diversos antibiticos. Pseudomona aeruginosa se asla fundamentalmente en medios hospitalarios y pueden enfermar a pacientes que estn en tratamiento por otras causas. la polimixina, es un antibitico poco utilizado en la terapia humana debido a su toxicidad, es sin

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embargo efectivo frente a Pseudomona aeruginosa, y puede utilizarse con precaucin por los efectos laterales severos.

b. P. fluorescens Las colonias sobre el agar y sus propiedades bioqumicas son similares a las de P. aeruginosa, pero produce solamente un pigmento (flourescencia). El crecimiento tiene lugar a 5C pero no a 42C. la reaccin de yema de huevo es positiva. Este organismo es un saprofito que se hallan frecuentemente en el suelo, agua y en vertidos de alcantarillado. Es alterante de los alimentos. Pueden gelificar la leche UTH si se conserva por encima de 5C. c. P. putida Las colonias recuerdan a las de P. aeruginosa, pero nicamente forman fluorescencia. Es un psicrotofo que puede no crecer a 37 C, pero crece a 22 C. hay dos biotipos: uno crece a 4 C y el otro no; los dos hidrolizan la arginina. Es negativa la reaccin de la yema de huevo, no licua la gelatina y los cultivos viejos tiene un marcado olor a trimetilamina (a pescado podrido). Es un organismo patgeno importantes para los peces y alterante del pescado y ha sido aislado de materiales humanos.

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d. P. maltophilia Las colonias recuerdan a las de P. aeruginosa, aunque pueden producir pigmento difusible amarillo o pardo. Esta especie se ha sealado como oxidasanegativa por Gilardi, quien utilizo discos de oxidasa de Difco, aunque Snell observo cepas oxidasa-positivas cuando se hizo la prueba con clorhidrato de tatrametil-1-fenilendiamina. Parece importante para agar cetrimida. Es la nica pseudomona que da una reaccin lisina descarboxilasa positiva. Se ha aislado de una gran diversidad de fuentes y parece un organismo patgeno oportunista. e. P. cepacia Las colonias producen un pigmento amarillo, hidrosoluble, no fluorescente, que en ocasiones puede ser purpura o pueden ser no pigmentadas. Se ha sealado crecimientos a 42C.esta ampliamente distribuido en la naturaleza presentndose como infeccin hospitalaria.

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f.

P.stutzeri

Las colonias son duras, secas y rugosas y pueden extraerse enteras del medio. Las colonias viejas se vuelven pardas. Pueden no hidrolizar arginina y pueden crecer o no a 4 o a 42Co en un medio de cetrimida. Se ha hallado en materiales clnicos g. P.alcaligenes y P.pseudo-alcaligenes Se ha indicado que estos organismos crecen a 42C pero no a 4C. no licuan la gelatina y pueden o no crecer en agar cetrimida. P.alcaligenes no hidrolizan arginina. h. P. mallei Estos organismos pueden aparecer en los exudados de aspecto granuloso perlado y pueden presentar tincin bipolar. Forma colonias de 1mm, brillante, lisas, convexas, amarillo verdosa, cremosas o ligeramente viscosas, que pueden ser adherentes en agar nutritivo, no hemolizan el agar sangre y no crecen en agar McConkey en cultivo primario. El crecimiento en el aislamiento primario puede ser pobre. Crece a temperatura ambiente, no lo hace en el medio de Hugh y Leifson, no producen acido en los carbohidratos, es nitrato positivo, da reaccin variable a la ureasa y pueden crecer o no en medio con KCN. La prueba de la oxidasa da resultados variables. Es el agente causal de muermo. i. P.pseudomallei

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Los cultivos en agar sangre o en agar nutritivo a 37C dan colonias mucoides o rugosas, secas, en 1-2 diasy pueden producir un pigmento anaranjado. No hay crecimiento en agar cetrimida. Este organismo no se identifica fcilmente. Debe diferenciarse de cepas no pigmentadas de P.aeruginosa, P.stutzer y P.mallei. Es un patgeno importante el hombre (meliodosis)y de los animales domsticos en el SE de Asia, en donde es endmico en los roedores y se halla en la mayora de los suelos, sobre las verduras y frutas. III.III HIDROCARBUROS Son los compuestos orgnicos ms simples y pueden ser considerados como las sustancias principales de las que se derivan todos los dems compuestos orgnicos. Los hidrocarburos se clasifican en dos grupos principales, de cadena abierta y cclicos. En los compuestos de cadena abierta que contienen ms de un tomo de carbono, los tomos de carbono estn unidos entre s formando una

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cadena lineal que puede tener una o ms ramificaciones. En los compuestos cclicos, los tomos de carbono forman uno o ms anillos cerrados. Los dos grupos principales se subdividen segn su comportamiento qumico en saturados e insaturados. III.III.I CLASIFICACIN De acuerdo al tipo de estructuras que pueden formar, los hidrocarburos se pueden clasificar como:

Hidrocarburos acclicos, los cuales presentan sus cadenas abiertas. A su vez se clasifican en: o Hidrocarburos lineales a los que carecen de cadenas laterales (Ramificaciones). o Hidrocarburos ramificados, los cuales presentan cadenas laterales. Hidrocarburos cclicos cicloalcanos, que se definen como hidrocarburos de cadena cerrada. stos a su vez se clasifican como: o Monocclicos, que tienen una sola operacin de ciclizacin. o Policclicos, que contienen una sola operacin de ciclizacin.

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Los sistemas policclicos se pueden clasificar por su complejidad en:


o

Fusionados, cuando al menos dos ciclos comparten un enlace covalente. (Imagen 1) Espiroalcanos, cuando al menos dos ciclos tienen un slo carbono en comn.(Imagen 2) Puentes o Estructuras de von Baeyer, cuando una cadena lateral de un ciclo se conecta en un carbono cualquiera. Si se conectara en el carbono de unin del ciclo con la cadena, se tendra un compuesto espiro. Si la conexin fuera sobre el carbono vecinal de unin del ciclo con la cadena, se tendra un compuesto fusionado. Una conexin en otro carbono distinto a los anteriores genera un puente.(Imagen 3) Asambleas, cuando dos ciclos indepencientes se conectan por medio de un enlace covalente. Ciclofanos, cuando a partir de un ciclo dos cadenas se conectan con otro ciclo.(imagen 4)

Segn los enlaces entre los tomos de carbono, los hidrocarburos se clasifican en:

Hidrocarburos alifticos, los cuales carecen de un anillo aromtico, que a su vez se clasifican en:

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o

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Hidrocarburos saturados, (alcanos o parafinas), en la que todos sus carbonos tienen cuatro enlaces simples (o ms tcnicamente, con hibridacin sp3). Hidrocarburos no saturados o insaturados, que presentan al menos un enlace doble (alquenos u olefinas) o triple (alquino o acetilnico) en sus enlaces de carbono.

Hidrocarburos aromticos, los cuales presentan al menos una estructura que cumple la regla de Hckel (Estructura cclica, que todos sus carbonos sean de hibridacin sp2 y que el nmero de electrones en resonancia sea par no divisible entre 4).

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Los hidrocarburos extrados directamente de formaciones geolgicas en estado lquido se conocen comnmente con el nombre de petrleo, mientras que los que se encuentran en estado gaseoso se les conoce como gas natural. La explotacin comercial de los hidrocarburos constituye una actividad econmica de primera importancia, pues forman parte de los principales combustibles fsiles (petrleo y gas natural), as como de todo tipo de plsticos, ceras y lubricantes. Segn los grados API, se clasifican en:

Si es:

> 40 - condensado 30-39.9 - liviano 22-29.9 - mediano 10-21.9 - pesado < 9.9 - extrapesado

Los hidrocarburos sustituidos son compuestos que tienen la misma estructura que un hidrocarburo, pero que contienen tomos de otros elementos distintos al hidrgeno y el carbono en lugar de una parte del hidrocarburo. La parte de la molcula que tiene un ordenamiento especfico de tomos, que es el responsable del comportamiento qumico de la molcula base, recibe el nombre de grupo funcional.

III.III.II CONTAMINACION POR HIDROCARBUROS La creciente utilizacin de hidrocarburos en actividades cotidianas deriva en un constante problema de contaminacin. Sin embargo existen microorganismos que han desarrollado la capacidad de degradar este tipo de compuestos, siendo este un mtodo prctico que pudiera ser eficaz para disminuir el problema en los

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sitios contaminados. En este trabajo se pretende marcar la atencin a la biorremediacin, dando especial atencin a un grupo de genes catablicos capaces de remover hidrocarburos aromticos bajo condiciones aerobias y anaerobias. La extraordinaria versatilidad de las bacterias para utilizar diferentes hidrocarburos como nica fuente de carbono y de energa se evidenci debido a su potencial por oxidar diferentes compuestos xenobiticos. Estos compuestos son de origen natural o qumicamente sintetizados por las actividades humano-industriales, sin embargo, estos compuestos diariamente son descargados al medio ambiente, generando un gran problema de contaminacin. Para tratar de disminuir la contaminacin de estos compuestos aromticos se han utilizado bacterias, estas bacterias contienen una amplia variedad de rutas catablicas. Sin embargo, hay limitaciones para aislar microorganismos con capacidad de crecer en diferentes compuestos orgnicos y en la comprensin acerca de los genes que codifican para las protenas relacionadas con la degradacin de los compuestos xenobiticos. Diferentes estudios han determinado el efecto de la contaminacin con hidrocarburos en la germinacin y crecimiento vegetativo de diferentes especies de pastos sometidos a diferentes concentraciones de hidrocarburo, concluyendo que hay una inhibicin en la germinacin del trbol comn y un marcado retras en el crecimiento de todas las plantas evaluadas. As mismo, otros estudios evaluaron el efecto de los hidrocarburos poliaromticos (PHA) en ecosistemas forestales y plantas madereras, demostrando un efecto de necrosis foliar y reportando que aproximadamente 3200 hectreas son afectadas por los derrames y el 90% de estos son pantanos o zonas inundables aledaas a plantas con tuberas corrodas por tener mas de 50 aos de antigedad, al igual que se emplean pozos sin crudo para almacenamiento de los cules un 30% estn contaminados con desechos aceitosos. Sin embargo, lo que complica la problemtica actual de los sitios contaminados con hidrocarburos, es que hasta hace pocos aos, prcticamente no exista una conciencia del grado de dificultad y del enorme costo de la remediacin de suelos, cuerpos de agua y atmsfera contaminados, lo que representa hoy para la sociedad un gran costo econmico. Dicha contaminacin esta ocasionando el deterioro progresivo de la calidad del medio ambiente y genera una amenaza real a la salud publica, as como la extincin de gran cantidad de especies vegetales y animales. III.III.III DEGRADACIN DE LOS HIDROCARBUROS La presencia de los compuestos aromticos en la biosfera a travs de la historia, explica por qu los microorganismos han desarrollado diferentes vas metablicas usando estos compuestos como un sustrato y una fuente de energa para su crecimiento, consiguiendo as que una gran variedad de microorganismos puedan mineralizar los compuestos de inters. Las primeras investigaciones

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acerca de este tema se enfocaron en el medio ambiente que rodeaba a los microorganismos que se localizaban en los depsitos de petrleo (Chakraborty y Coates, 2004). Diferentes procesos han sido diseados para la remocin de compuestos aromticos, como: mtodos fsicos (adsorcin por carbono activado), qumicos (por extraccin con solventes, oxidacin qumica) y biolgicos (utilizando microorganismos aerobios y/o anaerobios. Siendo, los procesos microbiolgicos, por su versatilidad bioqumica y molecular, as como por razones de proteccin ambiental, la mejor alternativa para la remocin de los compuestos aromticos, ya sea en condiciones aerobias o anaerobias (Cuadro 1) (Kleerebezem y cols., 1999). III.III.IV CATABOLISMO DE LOS COMPUESTOS AROMTICOS a. CATABOLISMO AEROBIO. En los procesos aerobios, la remocin de los compuestos aromticos puede llevarse a cabo por hongos, actinomicetos y bacterias que contienen mono o dioxigenasas, utilizando el oxgeno para la activacin y ruptura del anillo aromtico. El oxgeno sirve tambin como aceptor final de electrones para la oxidacin completa de estos compuestos. Sin embargo, la disminucin del oxgeno disuelto de los sitios contaminados limita la biodegradacin del Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno (BTEX). Los estudios por la va aerobia para el catabolismo de los compuestos aromticos han demostrado que estas enzimas (mono-oxigenasas y di-oxigenasas), llevan a cabo el primer paso que es la activacin para la conversin de los compuestos aromticos. Posteriormente, los compuestos son transformados a un nmero ilimitado de productos intermedios como son el protocatecuate y catecol. La ruptura del catecol es catalizada por la 1, 2 dioxigenasa y la del protocatecuate por la 3,4 di-oxigenasa, convirtindolos en piruvato o acetaldehdo. Cuando el anillo del catecol o protocatecuate se rompe en su posicin meta u orto, se convierten a -Cetoadipato. Dos pasos adicionales completan la conversin de -Cetoadipato a productos intermedios del ciclo de los cidos tricarboxlicos. Si el anillo se rompe en su posicin para, se convierte en piruvato o acetaldehdo y entran directamente al ciclo de los cidos tricarboxlicos (Heinaru y cols., 2000). Los estudios filogenticos de la secuencia de aminocidos de las protenas relacionadas con la biodegradacin de los BTEX demostraron una alta similitud en sus secuencias, lo cual indica que estas protenas provienen de un gen ancestral comn.

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b. CATABOLISMO ANAEROBIO La biodegradacin anaerobia es un simple pero efectivo proceso biolgico para el tratamiento de diferentes residuos orgnicos y la produccin de energa en

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forma de biogs CH4 (Karakashev y cols., 2005). Adems es un proceso mediado por la asociacin sintrfica (consorcios) de grupos de bacterias (tabla) como las: 1) 2) 3) 4) fermentativas (Acidognicas y Acetognicas) Desnitrificantes (BD) Sulfato Reductoras (BSR) Metanognicas (BM)

III.IV PETROLEO

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Es un lquido oleoso bituminoso de origen natural compuesto por diferentes sustancias orgnicas. Se encuentra en grandes cantidades bajo la superficie terrestre y se emplea como combustible y materia prima para la industria qumica. El petrleo y sus derivados se emplean para fabricar medicinas, fertilizantes, productos alimenticios, objetos de plstico, materiales de construccin, pinturas o textiles y para generar electricidad. III.IV.I CARACTERSTICAS Todos los tipos de petrleo se componen de hidrocarburos, aunque tambin suelen contener unos pocos compuestos de azufre y de oxgeno. El petrleo contiene elementos gaseosos, lquidos y slidos. La consistencia vara desde un lquido tan poco viscoso como la gasolina hasta un lquido tan espeso que apenas fluye. Existen categoras de petrleos crudos los de tipo parafnico, los de tipo asfltico y los de base mixta. III.IV.II FORMACIN El petrleo se forma bajo la superficie terrestre por la descomposicin de organismos marinos. Los restos de animales minsculos que viven en el mar se mezclan con las arenas y limos que caen al fondo en las cuencas marinas tranquilas. Estos depsitos, ricos en materiales orgnicos, se convierten en rocas generadoras de crudo. El proceso comenz hace muchos millones de aos, cuando surgieron los organismos vivos en grandes cantidades, y contina hasta el presente. Los sedimentos se van haciendo ms espesos y se hunden en el suelo marino bajo su propio peso. A medida que van acumulndose depsitos adicionales, la presin sobre los situados ms abajo se multiplica por varios miles, y la temperatura aumenta en varios cientos de grados. El cieno y la arena se endurecen y se convierten en esquistos y arenisca; los carbonatos precipitados y los restos de caparazones se convierten en caliza, y los tejidos blandos de los organismos muertos se transforman en petrleo y gas natural. Una vez formado el petrleo, ste fluye hacia arriba a travs de la corteza terrestre porque su densidad es menor que la de las salmueras que saturan los intersticios de los esquistos, arenas y rocas de carbonato que constituyen dicha

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corteza. El petrleo y el gas natural ascienden a travs de los poros microscpicos de los sedimentos situados por encima. Con frecuencia acaban encontrando un esquisto impermeable o una capa de roca densa: el petrleo queda atrapado, formando un depsito. Sin embargo, una parte significativa del petrleo no se topa con rocas impermeables sino que brota en la superficie terrestre o en el fondo del ocano. Entre los depsitos superficiales tambin figuran los lagos bituminosos y las filtraciones de gas natural. III.IV.III PRINCIPALES FUENTES DE CONTAMINACIN Una investigacin realizada en 1981 por el Instituto Americano de Petrleo (API) identifico entre las principales fuentes de contaminacin: a. Lodos de perforacin de tipo inversa y recortes Estos lodos contienen un tipo de aceite muy similar a diesel en concentraciones de aproximadamente 10% y son sumamente arcillosos. Este material se deposita en presas, las cuales anteriormente eran construidas con materiales permeables y filtraban los hidrocarburos al medio ambiente. b. Suelo contaminado por derrames de tuberas corrodas Existen campos petroleros con alrededor de cincuenta de 50 aos de antigedad, ubicados enzonas pantanosas, manglares u otras selvas inndales. Los ductos de estos se instalaron conectando los pozos individuales a bateras de separacin y desde ah hasta las petroqumicas y refinera, generndose corrosin anaerobia, debido principalmente a bacterias reductoras de sulfato dando como resultado ductos corrodos y derramamientos. Los tipos de suelos afectados son de zonas bajas con altos contenidos de materia orgnica y arcilla y los menos afectados, son por lo general los ms aptos para la agricultura por poseer texturas menos finas y alta fertilidad. Los sitios que se encuentren en la planicie costera, son los que ms preocupan en caso de contaminacin por el impacto que puede tener sobre los acuferos, debido a su alta permeabilidad. c. Tiraderos de desechos aceitosos semislidos Se utilizan pozos que nunca produjeron petrleo o un pozo antiguo que no produce y esta tapado, puesto que nunca fueron diseados para dicho fin y son construidos de materiales impermeables, muchas veces se termina el espacio disponible y se sigue depositando el relleno sobre la plataforma lo que resulta en escurrimientos e infiltraciones de hidrocarburos al medio ambiente cercano. d. Sitios contaminados por descargas petroqumicas y refineras Estos tienen sistemas antiguos de tratamiento de aguas residuales, las cuales generalmente contienen sales de los yacimientos de petrleo, lo que puede afectar los pantanos y cuerpos de agua.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA III.IV.IV PSEUDOMONAS DEGRADADORAS DE PETROLEO

PSEUDOMONAS

Las bacterias del gnero Pseudomonas poseen la habilidad para utilizar diversos substratos, incluyendo aquellos creados por el petrleo. Las Pseudomonas son bacterias Gram negativas, obicuas, que pertenecen a la subclase gamma de las Proteobacterias. Las Pseudomonas son bacterias productoras de biosurfactantes como los ramnolipidos involucrados en procesos de remocin de aceites y productos relacionados, Bushnell y Hass fueron de los primeros en describir bacterias productoras de biosurfactantes, como el Corynebacterium simplex y cepas de Pseudomonas. Algunos microorganismos productores de biosurfactantes extracelulares que solubilizan y facilitan la penetracin de los hidrocarburos a travs de la pared celular hidroflica; contienen adems enzimas degradadoras de hidrocarburos en la membrana citoplasmtica. La Pseudomonas aeruginosa, es otro de los microorganismos ms usado y estudiado en biorremediacin y presenta una serie de actividades naturales sobre xenobiticos. Lamentablemente, tambin es conocida por ser un patgeno oportunista en humanos y causante de complicaciones graves en personas inmunosuprimidas, con quemaduras severas o con fibrosis qustica. Por estas razones existe mucho inters en el estudio de las relaciones filogenticas entre serotipos clnicos y ambientales. Estudios con relacin al desempeo metablico de la Pseudomonas aeruginosa ha permitido identificarla como degradadota de gran cantidad de sustratos como el n-hexadecano, mineralizacin de compuestos alifticos en condiciones anaerobias, y degradadora de hidrocarburos aromticos y poli aromticos, as como del pireno en estudios in vitro. La P. aeruginosa tiene la capacidad de sintetizar ramnolipidos cuando se encuentra en la fase estacionaria de su crecimiento, por tal razn esto slo se puede realizar en la primera fase del proceso de biorremediacion y contribuyendo as con la movilizacin y solubilizacin de los contaminantes durante la fase siguiente de mineralizacin. Al mismo tiempo que pueden tranformarse bajo microcosmos en el suelo con un tratamiento fsico o qumico especifico, carcter stica que comparte con el Agrobacterium tumefasciens. La Pseudomona putida es un saprofito del suelo ,oportunista, cosmopolita, metablicamente verstil, por poseer una dioxigenasa inicial, una tolueno dioxigenasa, aunque no presenta la dioxigenasa especfica para los PAHs por lo cul es una buena candidata para las aplicaciones biotecnolgicas, tales como agricultura, biocatlisis, biorremediacin, biocontrol en proteccin de las plantas y produccin de bioplsticos. La P. putida posee la capacidad de colonizar la rizosfera de plantas de cosecha y una gran capacidad metablica que facilita el desarrollo de biopesticidas y promotores de crecimiento de la planta. La degradacin de los alcanos por Pseudomona putida se ha estudiado por secuenciacin en el plsmido OCT que codifica una enzima dioxigenasa que convierte alcanos a aldehdos a travs del hidroperoxidasa del n-alkyl sin un intermediario del alcohol, conocido como la va
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PSEUDOMONAS

de Finnerty; un proceso similar lo presentan los gneros Acinetobacter sp y Nocardiodes sp. aunque ellos no poseen este plsmido. La Pseudomonas fluorescens es degradadora de naftaleno y fenantreno, ventaja que tiene frente a las otras Pseudomonas, que solo metabolizan naftaleno y asfaltenos. Estudios realizados demuestran que Flavobacterium y Pseudomonas son los microorganismos ms aislados en la fase de degradacin de los TPH (Hidrocarburos Totales). La Pseudomonas stutzeri es una degradadora de PHAs.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA IV. METODOLOGIAS

PSEUDOMONAS

Aislamiento de la diversidad microbiana de la rizosfera del suelo

1 gr. de muestra de la rizosfera.

Suspender en 99 ml de agua destilada estril.

Realizar diluciones en serie

25 Inocular 1ml de la ltima dilucin sobre medio agar nutritivo.

Determinacin de colonias puras.

Incubar a 20-25C por 24 horas.

Aislamiento por diferente morfologa colonial en medio agar nutritivo.

Analizar todas las colonias resultantes.

Incubar a 20-25C por 24 horas.

Descripcin macroscpica de las bacterias aisladas.

Identificacin de bacterias Gram positivas y Gram negativas

Fijacin de cada una de las muestra de bacterias.

Tincin de Gram

Descripcin microscpica de las bacterias aisladas.


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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA Identificacin de Pseudomonas spp. mediante pruebas bioqumicas Prueba de la Oxidasa

PSEUDOMONAS

Colocar un disco OX sobre portaobjeto y humedecer con agua esteril.

Agregar una muestra de cultivo sobre el disco

Analizar los resultados

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Prueba de Triple azcar y hierro (TSI)

Agar TSI solido inclinado

Siembra por estra sobre superficie inclinada y picadura en la columna.

Incubar a 37C por 24 horas.

Analizar los resultados.

Prueba de Fluorescena

Siembra por estra de colonias puras en medio King B.

Incubar a 20-30C por 72 horas.

Anlisis bajo luz visible de colinas desarrolladas.

Anlisis bajo luz UV de colinas fluorescentes.

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PSEUDOMONAS

Prueba de Piocianina

Siembra por estra de colonias puras en medio King A.

Incubar a 20-30C por 72 horas.

Determinacin de la produccin de piocina.

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Prueba de Nitrato (MMM)

Medio Glucosa Nitrato

Inoculacion directa por asa.

Incubar a 37C por 24 horas.

Agregar reactivos Griess A y B

Analizar resultados

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PSEUDOMONAS

Extraccin de ADN de las Pseudomonas spp.aisladas para anlisis de PCR

Medio Centrimide agar tras 18 horas de inoculo puro.

Tomar 200 l de suspensin bacteriana.

Agregar a un tubo eppendorf esterilizado.

Centrifugar por 2min a 28 10,000 rpm.

Vortexear la mezcla.

Agregar 3 l de Proteinasa K.

Vortexear la mezcla.

Agregar 30 l de SDS al 10%.

Resuspender el pellet con 0.567 ml de TE buffer.

Retirar el sobrenadante con una micropipeta.

Incubar a 37C por una hora.

Agregar 1000 l d NaCl 5 M.

Mezclar perfectamente.

Agregar 80 l de CTAB 10% y NaCl 0.7 M.

Vortexear la mezcla.

Incubar a 65C por 10 min.

Agregar a un tubo nuevo eppendorf esterilizado.

Extraer el sobrenadante que contiene el ADN.

Centrifugar por 7 min a 10,000 rpm

Vortexear la mezcla

Agregar 40 l de fenol y 40 l de cloroformo.

ING. BIOQUIMICA alcohol isoamilico.

Agregar 50 l de

Mezclar perfectamente.

Centrifugar por 5 min ITTG a 10,000 rpm

Extraer el Agregar a un tubo sobrenadante nuevo eppendorf que contiene el QFB. AURAesterilizado. FLORES ADN.

EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA

PSEUDOMONAS

Agregar 200 l de isopropanol.

Mantener a temperatura ambiente por 30 min.

Centrifugar por 7 min a 12,000 rpm

Drenar el sobrenadante y dejar secar por 30 min.

Disolver en TE (10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8)

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Identificacin de Pseudomonas spp. por anlisis de PCR

Realizar la mezcla PCR 15 muestras de DN

Agregar 20 l de H2O mQ.

Agregar 2 l de 10X buffer.

Agregar 2mM de MgCl2.

Agregar 0.2mM de dNTPs.

Agregar 5 l de ADN a cada tubo.

Tubos eppendorf con carga para PCR.

Distribuir la mezcla en tubos pequeos.

Agregar 1l de taq polimerasa.

Agregar 1l de primer especfico.

Productos de PCR Programar al termociclador.

Cada producto de PCR mezclar con colorante.

Observar al transiluminador.

Revelar gel con bromuro de etidio.

Programar la cmara de electroforesis.

Agregar a cada pozo.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA

PSEUDOMONAS

Determinacin cualitativa de la capacidad de biodegradacin de hidrocarburos aromticos por Pseudomonas spp. aisladas

Placas de MMM y agar al 1.5%

Rociar las placas con hidrocarburos.

Incubar por 24 hr. Para eliminar solvente por evaporacin.

Inoculacin de las cepas aisladas sobre placas con hidrocarburos.

30

Observar la presencia de halos que confirmen la biodegradacin de hidrocarburos.

Incubar a 37C por 15 dias.

Determinacin cuantitativa de la capacidad de biodegradacin de hidrocarburos alifticos por Pseudomonas spp. aisladas

Maztraz Erlenmeyer con hidrocarburos como nica fuente de carbono.

Tomar en un vial una muestra al principio y al final del experimento.

Extraer los gases mediante jeringa Hamilton e inyectar al espectrofotmetro para analizar.

CE GC 8000 TOP cromatografa de gases equipado con una llama detector de ionizacin y un 0,75 mm x 30 m de vidrio capilar columna (ZB-Cera). El horno, inyector y detector de temperatura se fija en 50, 250 y 200 C, respectivamente.

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Maztraz Klett con hidrocarburos como nica fuente de carbono.

Tomar 1ml del caldo inoculado a cada dia.

Colocarlo la muestra en una celda de 5mm para fotmetrootometro.

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Medir la transmitancia y/o absorbancia cada da a 550nm para determinar la biomasa presente.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA Descripcin para la identificacin de Pseudomonas spp.

PSEUDOMONAS

AISLAMIENTO
Tincin de Gram

+ Gram positivas

Bacilos Gram negativas


Prueba de Oxidasa

31 Enterobacterias

+ Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio


Prueba de TSI Acido (+) Acido (-)

Vibrio spp., Aeromonas spp.

Pseudomonas
Prueba de fluorescena

Otras especies de Pseudomonas

P. aeruginosa, P. chlororaphis, P. cichorii, P. fluorescens, P. putida, P. syringae


Prueba de piocianina

+ P. aeruginosa

P. chlororaphis, P. cichorii, P. fluorescens, P. putida, P. syringae


Prueba reduccin del nitrato

P. cichorii, P. putida, P. syringae

+ P. chlororaphis, P. fluorescens

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA V .RESULTADOS

PSEUDOMONAS

IDENTIFICACIN TAXONOMICA DE Pseudomonas spp. Aislamiento de la diversidad bacteriana de la rizosfera del suelo:

Fig. 1. Desarrollo de las diversas bacterias que componen la rizosfera del suelo.

Fig. 2. Desarrollo de colonias puras aisladas.

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Tincin de Gram:

Fig. 3. Pseudomonas spp. Bacilos cortos, Gram negativos, rectos o ligeramente curvados.

Prueba de la Oxidasa:

Fig. 4. Prueba positiva de la Oxidasa para Pseudomonas spp.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA Prueba de fermentacin de azucares (TSI):

PSEUDOMONAS

Fig. 5. Pseudomonas spp. no fermenta ninguno de los tres azucares presentes en la prueba, tampoco produce cido sulfrico, y no produce gas.

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Prueba de Fluorescena en King B agar:

Fig 6. Desarrollo de colonias puras de Pseudomonas spp.

Fig 7. Fluorescena identificada bajo luz UV producida por Pseudomonas spp. .

Prueba de Piocianina en King A agar:

Fig 8. Produccin de Piocianina por Pseudomonas aeruginosa.

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PSEUDOMONAS

Prueba Reduccin del Nitrato:

Fig 9.(Tubo a la izquierda) Resultado positivo con Pseudomonas putida, (Tubo a la derecha) Resultado negativo con Pseudomonas fluorescens.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA

PSEUDOMONAS

PCR de cepas identificadas por pruebas bioqumicas como Pseudomonas spp.


DNA marker Fig 10. Perfiles de PCRBOX de Pseudomonas spp. aisladas. Carriles 1-9: cepas aisladas DmZI1, DZI2, DZI3, SQ2a, SQ2b, DmZI6, DBP1, DBP2, DBP3. Carril 10 Marcador molecular de ADN.

DmZ11 DZ12 DZ13

SQ2a SQ2b DmZ16 DBP1 DBP2 DBP3

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PSEUDOMONAS

Comparacin de huella gentica de una Pseudomonas aeruginosa con dos cepas problemas.

Fig 12. HaeIII patrones de restriccin. Carriles: 1. Marcador molecular (GeneRuler 100bp ADN); 2. SQ2a; 3. SQ2b; 4. P. aeruginosa ATCC 27583; RsaI patrones de restriccin. Carriles: 5. SQ2a; 6. SQ2b; 7. P. aeruginosa ATCC 27583; AluI patrones de restriccin. Carriles: 8. SQ2a; 9. SQ2b; 10. P. aeruginosa ATCC 27538

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Fig 13. DdeI patrones de restriccin. Carriles: 1. Marcador molecular (GeneRuler 100bp ADN); 2. SQ2a; 3. SQ2b; 4. P. aeruginosa ATCC 27583; MspI patrones de restriccin. Carriles: 5. SQ2a; 6. SQ2b; 7. P. aeruginosa ATCC 27583; HinfI patrones de restriccin. Carriles: 8. SQ2a; 9. SQ2b; 10. P. aeruginosa ATCC 27538

Fig 14. NotI patrones de restriccin. Carriles: 1. Marcador molecular (GeneRuler 100bp ADN); 2. SQ2a; 3. SQ2b; 4. P. aeruginosa ATCC 27583; Sau3AI patrones de restriccin. Carriles: 5. SQ2a; 6. SQ2b; 7. P. aeruginosa ATCC 27583; CfoI patrones de restriccin. Carriles: 8. SQ2a; 9. SQ2b; 10. P. aeruginosa ATCC 27538

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PSEUDOMONAS

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Fig 15. rbol filogentico que muestra la posicin de SQ2a y SQ2b de acuerdo a la secuencia del gen 16S rDNA afiliados dentro del grupo de Pseudomonas spp. construido con el mtodo de mximas verosimilitud y un filtro (50%) de la secuencia de datos. Las barras de escala representan el 10% de diferencia de secuencia.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA

PSEUDOMONAS

Determinacin de la capacidad de degradacin de Hidrocarburos alifticos:

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Fig 16. Tazas de crecimiento de Pseudomonas spp. sobre octadecano, dodecano y octano, como nica fuente de carbono a 30 C.

Fig 17. Tazas de crecimiento de Pseudomonas spp. sobre hexano, catecol y fuel oil, como nica fuente de carbono a 30 C.

Fig 18. Tazas de crecimiento de Pseudomonas spp. sobre ciclohexano, heptano y pentano, como nica fuente de carbono a 30 C.

Fig 19. Comparacin en los tiempos de desarrollo de Pseudomonas spp en los diferentes sustratos.

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Fig 20. Perfil de cromatografa de gases de hidrocarburos antes de la biodegradacin por Pseudomonas spp.

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Fig 21. Perfil de cromatografa de gases de hidrocarburos despus de la biodegradacin por Pseudomonas spp.

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PSEUDOMONAS

Determinacin de la capacidad de degradacin de Hidrocarburos aromticos:

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Fig . Crecimiento de cepas de Pseudomonas spp. en hidrocarburos aromticos policclicos y heterocclicos como nica fuente de carbono y energa.

Fig . Crecimiento de cepas de Pseudomonas spp. en hidrocarburos aromticos policclicos y heterocclicos como nica fuente de carbono y energa.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA VI.DISCUSION DE RESULTADOS

PSEUDOMONAS

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA V. CONCLUSION

PSEUDOMONAS

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BIBLIOGRAFA
Collins, C., & Lyne, P. M. (1989). METODOS MICROBIOLOGICOS. Zaragosa: ACRIBIA. madigan, m., martinko, j., & parker, j. (2008). biologia de los microorganismo. madrid: pearson, prentice hall. Salazar Rodriguez, D., Gonzales Rizo, A., & Palma Monroy, S. ( (Mayo-ago. 2002) Rev Cubana Med Trop. [online]. 54). SALASAR RODRIGUEZ, Daniel, G Susceptibilidad antimicrobiana y serotipaje de Pseudomonas aeruginosa aisladas de pacientes VIH/SIDA. Habana, Cuba: Rev Cubana Med Trop. [online]. 54. Karakashev, D., D. J. Batstone, y I. Angelidaki. 2005. Influence of Environmental Conditions on Methanogenic.Compositions in Anaerobic Biogas Reactors. Appl. Environ. Microbiol. 71:331-338. Heinaru E., J. Truu, U. Stottmeister y A. Heinaru. 2000. Three types of phenol and p-cresol catabolism in phenol and p-cresol.degrading bacteria isolated from river water continuously polluted with phenolic compounds. FEMS Microbiology Ecology, 31:195-205 Chakraborty R. y J. D. Coates. 2004. Anaerobic degradation of monoaromatic hydrocarbons. Applied Microbiology and Biotechnology, 64:437-446. Kleerebezem R., L. W. H. Pol y G Lettinga. 1999. Anaerobic degradation of phthalate isomers by methanogenic consortia. Applied and Environmental Microbiology, 65:1152-1160.

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BIOREMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS DERIVADOS DEL PETRLEO: 82 90 www.unicolmayor.edu.co 84 NOVA - PUBLICACIN CIENTFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5 ENERO - JUNIO DE 2006:1-116 http://www.micromadrid.org/pdf/tomo1_tema25.pdf http://www.itescham.com/Syllabus/Doctos/r1985.PDF http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/17-bacterias%20grampositivas%20aerobias.htm

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA

PSEUDOMONAS

ANEXOS Anexo 1. Fermentacin de la lactosa (Mc Conkey) El agar Mc Conkey es un medio slido, diferencial y selectivo. Se usa para la discriminacin de bacterias con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y ).Composicin g/l : - Peptona 20.0 : fuente de nitrgeno y carbono para las Lac -. - Lactosa 10.0 : fuente de carbono para las Lac +. - Sales biliares 2.5 : le confiere carcter selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram +. - Cloruro sdico 5.0 : para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis). - Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el medio vire de coloracin. Si las bacterias son Lac +, producirn cidos derivados de la fermentacin que darn al medio un aspecto rosceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificar por el uso de la peptona y se tornar amarillo. - Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio. - Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

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Anexo 2. OXIDACIN-FERMENTACIN (PRUEBA DE HUGH Y LEIFSON)


Esta prueba realiza para la determinacin del metabolismo oxidativo o fermentativo de los carbohidratos.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA MEDIO DE CULTIVO Medio base de Hugh y Leifson Triptona Extracto de levadura Prpura de Bromocresol Agar Agua destilada 10,0 1,0 0,04 2,0 1000,0

PSEUDOMONAS

g g g g mL

Ajuste el pH a 7,2. Esterilice a 121C (15 libras de presin) por 15 minutos. Dispense en tubos 9 mL por tubo. Agregue la solucin de glucosa al 10% esterilizada por filtracin

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En el caso de los cocos gram positivos su forma de metabolizar la glucosa es una caracterstica importante para su identificacin, por eso en este caso el glcido aadido al medio base es la glucosa. PROCEDIMIENTO Para cada microorganismo a identificar,se inoculan por puncin dos tubos de medio. En uno de los dos tubos se cubre la superficie con parafina estrilpara crear condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 35C hasta por 14 das. RESULTADOS La produccin de cido se evidencia por el cambio de color de prpura a amarillo. Los microorganismos fermentadores producen cido en ambos tubos, los microorganismos oxidadores (respiradores) slo lo producen en el tubo sin parafina.

Anexo 3.

Reduccin de Nitratos
Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas respectivamente. Tras 24 h. aadimos 2 o 3 gotas del reactivo "AB", si aparece coloracin rojo cereza indica que es positivo, si no aparece coloracin es un presunto negativo, para confirmarlo
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PSEUDOMONAS

basta con aadir una punta de esptula de Zinc y si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo da (72 h.) la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad que no tiene capacidad para reducir los nitratos.

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Anexo 1. Fermentacin de la lactosa (Mc Conkey) El agar Mc Conkey es un medio slido, diferencial y selectivo. Se usa para la discriminacin de bacterias con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y -).Composicin g/l : - Peptona 20.0 : fuente de nitrgeno y carbono para las Lac -. - Lactosa 10.0 : fuente de carbono para las Lac +. - Sales biliares 2.5 : le confiere carcter selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram +. - Cloruro sdico 5.0 : para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis). - Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el medio vire de coloracin. Si las bacterias son Lac +, producirn cidos derivados de la fermentacin que darn al medio un aspecto rosceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificar por el uso de la peptona y se tornar amarillo. - Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio. - Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

Anexo 2. OXIDACIN-FERMENTACIN (PRUEBA DE HUGH Y LEIFSON)

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Esta prueba realiza para la determinacin del metabolismo oxidativo o fermentativo de los carbohidratos. MEDIO DE CULTIVO Medio base de Hugh y Leifson Triptona Extracto de levadura Prpura de Bromocresol Agar Agua destilada 10,0 1,0 0,04 2,0 1000,0 g g g g mL

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Ajuste el pH a 7,2. Esterilice a 121C (15 libras de presin) por 15 minutos. Dispense en tubos 9 mL por tubo. Agregue la solucin de glucosa al 10% esterilizada por filtracin

En el caso de los cocos gram positivos su forma de metabolizar la glucosa es una caracterstica importante para su identificacin, por eso en este caso el glcido aadido al medio base es la glucosa. PROCEDIMIENTO Para cada microorganismo a identificar,se inoculan por puncin dos tubos de medio. En uno de los dos tubos se cubre la superficie con parafina estrilpara crear condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 35C hasta por 14 das. RESULTADOS La produccin de cido se evidencia por el cambio de color de prpura a amarillo. Los microorganismos fermentadores producen cido en ambos tubos, los microorganismos oxidadores (respiradores) slo lo producen en el tubo sin parafina.

Anexo 3.

Reduccin de Nitratos
Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas
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respectivamente. Tras 24 h. aadimos 2 o 3 gotas del reactivo "AB", si aparece coloracin rojo cereza indica que es positivo, si no aparece coloracin es un presunto negativo, para confirmarlo basta con aadir una punta de esptula de Zinc y si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo da (72 h.) la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad que no tiene capacidad para reducir los nitratos.

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TABLAS Reaccin Oxidasa Hidrlisis Licuacion Crecimiento HL Arginina gelatina en McConkey P.mallei Ox v + V P.pseudomallei Ox + + + + Pseudomonas Ox ssp o ninguna + v v + Tabla 1.Clave para pseudomonas que crecen en agar nutritivo. Motilidad + +

P.aeruginosa Ox P.fluorescens Ox P.putida Ox P.alkaligenes Alk P.pseudoAlk alkaligenes P.maltophilia Alk P.cepacia Ox P.mallei Ox P.pseudomallei Ox P.stutzeri Ox Tabla 2. Pseudomonas ssp (Collins & Lyne, 1989)

Pigmento fluoresce nte + + + -

Prueba HL

Hidrlisis arginina + + + + + + V

Licuacin gelatina + + + + V + -

Crecimient oa 4C/42C -/+ +/v/-/+ -/v -/-/v -/-/+ v/v

*Todos estos organismos son oxidasa positivos. (Ox, oxidativos; Alk, reaccin alcalina: v, variable)
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CUADROS Cuadro 1. Comparacin de los procesos aerobios y anaerobios en la degradacin de compuestos aromticos. AEROBIO O2 O2 Mayor produccin Menor Catecol, protocatecuate ANAEROBIO CH3, H2O, COOH NO-3, SO2-4 , Fe (III) y CO2-3 Menor produccin Mayor Benzoil CoA, Floroglucinol, resorcinol CoA ligasa, Benzoil CoA CH4, CO2, H2S/N2

Activacin del anillo aromtico Aceptador final de electrones Produccin de biomasa Requerimientos nutricionales Productores intermedios

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Enzimas Productos finales IMAGENES

Mono, di-oxigenasas CO2, H2O

Imagen 1. Cicloalcano bicclico de fusin

Imagen 2. Cicloalcano bicclico espiro

Imagen 3. Cicloalcanos tipo puente ("Bridged cycloalkanes")

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Imagen 4. Ciclofanos

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