6.

1 OBTENCIN DE LOS GENES Construccion de librerias de cDNA de Larrea Tridentata En el centro de investigacin del Desierto de Nevada, fue aislado el ARN de las hojas de la Gobernadora (L. Tridentata) con el reactivo TRIzol (Invitrogen). Posteriormente se sintetizo la cadena sencilla de cDNA se sintetizo por medio del siguiente primer 5-GACTAGTTCT AGATCGCGAG CGGCCGCCCT TTTTTTTTTTTTTT-3. Este primer contiene cuatro sitios de restriccin: SpeI, XbaI, NruI y NotI. Una vez que fueron sintetizados los cDNA de doble cadena, sus extremos fueron pulidos con el fragmento Klenow. Despus de esto se realiz la digestin con la enzima Notl dejando un sticky end en el extremo 3 y un extremo romo en 5. Los extremos digeridos fueron clonados en el vector pCMVSport6
(Invitrogen) cortado por EcoRV y Notl (Cita).

El fragmento del gen especfico de LtWRKY21 fue amplificado por PCR usando los siguientes primers: CCTCTTAGGG CATCTAATGA AGCTTCACC y CTCTTATCGT CTTTGTCGGT TCGGACATAA TC. (Cita)
The LtWRKY21 effector gene was amplified from a cDNA clone by PCR using two primers: TTAGGCGCGC CATGGCATAT CCTTCTTGG and TTAGGCGCGC CTCACCAATT TCCTCCAGG, which contain an AscI site to facilitate cloning. The PCR product was confirmed by sequencing and then cloned into the AscI site of the intermediate construct containing the UBI promoter and NOS terminator (72), generating UBI-LtWRKY21.

Estos mtodos fueron utilizados en la investigacin titulada con el objetivo de analizar la relacin entre el gen LtWRKY y el promotor inducible HVA22. Debido a los buenos resultados que estos presentaron, haremos uso de ellos en este trabajo para obtener el gen LtWRKY.

Obtencin del gen AtHVA22 Por otra parte el clon de cDNA del gen AtHVA22d fue proporcionado a los autores del artculo por el Dr. Kazuo Shinozaki del centro de investigacin RIKEN ubicado en Tsukuba, Japn. El clon original fue nombrado FL-49 y su secuencia se encuentra disponible en GenBank (AI995946). La secuencia genmica del gen AtHVA22d fue amplificada por medio de PCR con el siguiente par de primers: 22dF: 5-CCCAGTAAGTAAGCCATTGTTC-3 y 22dR: 5-ATT GATTCGCCTCGAAATTTAC-3. La secuencia flanqueadora del AtHVA22d fue amplificada por medio de PCR inverso. Las secuencias de los cinco clones de cDNA fueron confirmadas y completadas. Las cinco secuencias completas de cDNA fueron reportadas en GeneBank. AF141662 es el nmero de acceso para la secuencia de AtHVA22d. Utilizando esta informacin podremos hacer uso del gen de Arabidopsis thaliana mencionado anteriormente.

Homologia