SUMARIO

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Artculo Especial

Induccin de muestras de esputo para el estudio citolgico y de qumicos presentes en la fase fluida (II): Descripcin de la tcnica de induracin y procesado de las muestras de esputo
V. Gutirrez Vall de Cabres
Seccin de Alergologa. Hospital Dr. Peset. Valencia

INTRODUCCIN La tcnica del recuento citolgico de las extensiones de esputo en el asma fue descrita inicialmente por Gibson y cols.1 hace relativamente poco tiempo. Posteriormente y con el fin de solventar el problema que supone que muchos asmticos no expectoran espontneamente, Pin y cols2. sistematizaron el mtodo de induccin de esputo mediante la inhalacin de soluciones salinas hipertnicas. Sin embargo, el procedimiento se mostr laborioso: para que los recuentos pudieran considerarse reproducibles se precisaba una media de cuatro recuentos de la laminilla a estudiar, lo que supona el empleo de ms de 1 hora. Por este motivo, Popov y cols.3 en 1994 modificaron el mtodo para mejorar la definicin de las extensiones y hacer ms rpido el recuento citolgico de las mismas, adems de posibilitar la obtencin de una fase lquida en la que es posible cuantificar ciertos mediadores solubles. Bsicamente, las modificaciones consisten en la homogeneizacin de la muestra de esputo por medio de un mucoltico hasta hacerla fluida, y el empleo de citocentrifugados de la suspensin de clulas de la muestra.

DESCRIPCIN DE LA TCNICA DE INDUCCIN. PROCESADO Y ANLISIS DEL ESPUTO A) Induccin El mtodo de induccin de esputo con salino hipertnico ofrece una serie de ventajas que lo hacen practicable para su uso en clnica: El equipamiento que se precisa es sencillo y est al alcance de todos los centros. El mtodo se ha mostrado seguro y bien tolerado4, por lo que puede realizarse a la mayora de los pacientes sin excesivos riesgos. Sin embargo, debe llevarse a cabo con precauciones puesto que la inhalacin de soluciones hipertnicas puede producir broncoconstriccin5. Si el paciente con asma se halla en situacin inestable o con afectacin significativa del FEV1 deben extremarse las precauciones. En el protocolo de nuestro Centro4,5 se exige un FEV1 70% del terico para proseguir con la exploracin. Se precisa la colaboracin del sujeto, por lo que no es practicable en nios muy pequeos. El procedimiento de induccin se basa en la administracin de una solucin salina hipertnica, mediante un nebulizador ultrasnico, durante la

Miembros del Comit de Estudio del Asma SEAIC: Dr. Miguel Hinojosa Macas (Coordinador), Dr. Jos M. Olaguibel Rivera (Coordinador), Dra. Pilar Barranco Sanz, Dra. Teresa Carrillo Daz, Dr. Carlos Cols Sanz, Dra. Valentina Gutirrez Vall de Cabres, Dr. Belen de la Hoz Caballer, Dr. Marcel Ibero Iborra, Dr. Santiago Quirce Gancedo, Dra. M ngeles Rico Daz, Dr. Carlos Senent Snchez (Secretario), Dr. Jos M Vega Chicote.

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Vol. 13, Nm. 5, pp. 252-258

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Induccin de muestras de esputo para el estudio citolgico (II)

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cual se anima al paciente para que expectore. Previamente, los pacientes reciben 200 g de salbutamol inhalado para prevenir el broncoespasmo. Tras cada perodo de inhalacin debe registrarse el PEF para detectar cadas de la funcin pulmonar. Como la contaminacin abundante con clulas de origen orofarngeo dificulta el recuento diferencial de las muestras, se debe adiestrar al paciente para que se suene la nariz y se enjuague la boca y la garganta antes de proceder a la emisin del esputo. Es muy importante dar confianza al paciente, comunicarle que se trata de un proceso activo y a veces lento, y tener grandes dosis de paciencia. Parece que factores dependientes del sujeto (hbito de fumar, grado de inflamacin) o del procedimiento (concentracin del salino, dbito del nebulizador, pre-tratamiento con -agonistas, habilidad del tcnico para estimular al paciente) podran condicionar la rentabilidad (porcentaje de xitos) del mtodo3. Ante la posibilidad de que la induccin de salino hipertnico pudiera alterar los componentes (celulares o solubles) del esputo, algunos autores8 han comparado muestras de esputo espontneo e inducido de los mismos pacientes con asma y parece que, si bien las muestras inducidas contienen menor proporcin de clulas escamosas que las espontneas, mejorando la calidad de los citocentrifugados sin alterar su composicin celular, la induccin s que podra alterar las concentraciones de ciertos marcadores solubles. Estos autores sugieren8 que para obviar este problema la proporcin de clulas no escamosas y reconocibles debe superar el 50%. Material necesario Para proceder a la induccin de una muestra de esputo las necesidades de material son las siguientes: 1. Espirmetro y medidores de Flujo Espiratorio Mximo (FEM) porttil Mini-Wright o similar (Clement-Clarke International. Londres). 2. -agonistas inhalados de accin corta (Salbutamol o Terbutalina) y cmaras espaciadoras. 3. Un nebulizador ultrasnico del tipo del Ultraneb 2000 (De Vilbiss Co. Somerset), Mistogen (Mistogen Equipment. Oakland), Fisoneb
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(Fisons. Londres), o similar. Debe estar provisto de boquilla para inhalacin oral y de los filtros adecuados. El nebulizador que se emplea en nuestro Centro (Ultraneb 2000) proporciona un flujo entre 2.1 y 5.9 ml/min y el dimetro medio de las partculas es de 4.14 m. 4. Placas de Petri, vasos y pauelos desechables. 5. Pinzas de diseccin, tijeritas y capilares de Pasteur con aspiradores. 6. Tubos de ensayo de plstico 10 ml, gradillas. 7. Solucin salina hipertnica: Mientras que algunos investigadores emplean soluciones progresivamente ms concentradas de salino que varan entre el 3 y el 10%2,6,7,9, otros autores nebulizan la misma concentracin (3,5 a 5%) durante todo el procedimiento10-12. Se desconoce qu concentracin es la ideal puesto que los mtodos de induccin de los distintos grupos difieren en otros aspectos y no son estrictamente comparables. 8. Cronmetro y calculadora. 9. La medicacin habitual para la atencin de una emergencia respiratoria, en previsin de eventuales accidentes: -adrenrgicos inhalados de accin corta, adrenalina 1/1000 o bien salbutamol o terbutalina en ampollas, aminofilina para uso parenteral, fluidos y sistemas de perfusin i.v., esteroides i.v. (metilprednisolona o hidrocortisona), ventimask y sondas nasales para administracin de O2. Personal Un ATS debidamente entrenado. Procedimiento para la induccin del esputo Es muy importante explicar al paciente la finalidad de la exploracin, en qu consiste, y la necesidad de colaboracin por su parte. Hay que transmitirle confianza y tranquilidad e informarle de que el procedimiento puede ser lento, por lo que no debe tener prisa. En primer lugar, se realiza una espirometra basal para constatar la estabilidad del funcionalismo pulmonar del sujeto y prevenir accidentes, puesto que las soluciones no isotnicas son capaces de desencadenar episodios de broncoespasmo en pacientes con asma13,14. A continuacin se debe administrar un -adrenrgico de accin corta (salbutamol o terbutalina) por medio de una cmara espaciadora.

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Volumen 13 MODELO DE FORMULARIO DE RECOGIDA DE DATOS DURANTE LA INDUCCIN MODELO DE FORMULARIO DE RECOGIDA DE DATOS DURANTE LA INDUCCIN FEV1 BASAL..................CC. % TERICO..............% ADMINISTRAR 200 MCG DE SALBUTAMOL INHALADO. PEF (15 minutos despus)*.....................L/min NEBULIZAR EL SALINO HIPERTNICO MEDIANTE ULTRANEB 2000, DURANTE 5 MINUTOS Y CON INTERVALOS DE 10 MINUTOS. REALIZAR DETERMINACIONES DE PEF TRAS CADA PERODO DE NEBULIZACIN. DOSIS 1 (5 %) PEF..................l/min % CADA..............% SNTOMAS................................................. OBTENCIN ESPUTO S NO DOSIS 2 (5%) PEF..................l/min % CADA..............% SNTOMAS................................................. OBTENCIN ESPUTO S NO DOSIS 3 (5%) PEF..................l/min % CADA..............% SNTOMAS................................................. OBTENCIN ESPUTO S NO DOSIS 4 (5%) PEF..................l/min % CAIDA..............% SNTOMAS................................................. OBTENCIN ESPUTO S NO * = mejor de tres maniobras obtenidas con mini-Wright

Tras un intervalo de 15 minutos se registra el FEV1 o bien el FEM basal (la mejor de tres determinaciones). Con este valor se debern comparar los obtenidos despus de nebulizar las distintas dosis de salino. Los descensos respecto del basal suelen expresarse en %. Posteriormente se nebulizan las soluciones salinas durante perodos de 5 minutos y con intervalos de 5-10 minutos. Tras cada dosis de salino, el paciente se sonar la nariz y se enjuagar la boca y faringe. A continuacin, hay que estimularle para que tosa y expectore en placa de Petri. Antes de pasar al siguiente perodo de nebulizacin se debe controlar la funcin pulmonar mediante la determinacin del PEF. A continuacin se detalla la sistemtica que se emplea actualmente en nuestra Seccin6: Procedimiento por pasos 1. Registrar el FEV1 basal y el PEF (los mejores de tres maniobras correctas). Proceder a la induccin slo en el caso de FEV1 70% del terico. 2. Administrar 200 mcg de salbutamol inhalado (Ventoln. Glaxo S.A. Madrid) mediante una cmara espaciadora (Volumatic. Glaxo). Registrar el PEF al cabo de 15 minutos. Este valor se considerar como PEF-basal. 3. Rellenar el depsito del nebulizador ultrasnico Ultraneb 2000 (De Vilbiss) con 150 ml de solucin salina al 5%. Aplicar la pinza nasal y nebulizar el salino, con boquilla, durante un mximo de 4 perodos de 5 minutos y con intervalos de 10 minutos. 4. Determinar y registrar el valor del FEV1 (o del FEM) despus de cada perodo de nebulizacin. Suspender la induccin: A. Si se detectan cadas del FEV1 (o del FEM) > 30% con respecto al obtenido 15 minutos despus de la beta2. Si el deterioro del FEV1 es del 15-29%, administrar una nueva dosis de beta 2, confirmar mejora a los 10 minutos y seguir. B. Cuando el paciente refiera molestias subjetivas intensas. C. Cuando se obtenga muestra de esputo adecuada. 5. Durante el intervalo entre dosis, estimular al paciente para que expectore. Recordarle que debe sonarse y enjuagarse la boca y faringe para minimizar la contaminacin salivar de la muestra.

6. Recoger la muestra en una placa de Petri de plstico. B) Dispersin del esputo y preparacin de la suspensin celular Se realiza segn la tcnica descrita por Popov y cols3: La muestra de esputo se recoge en placas de Petri de plstico y se registran las caractersticas macroscpicas de la misma. Posteriormente se seleccionan los acmulos densos y viscosos mediante pinzas y se transvasan a un vial graduado de poliestireno. Si estas porciones no pueden identificarse a simple vista es til depositar la placa de Petri sobre una superficie oscura o una fuente de transiluminacin (negatoscopio porttil). A continuacin se aade un agente dispersante (ditiotreitol 0.1%) con el fin de homogeneizar la muestra y la suspensin celular fluida se filtra a travs de una malla de polipropileno que retiene las fibras y permite el paso de las clulas.
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Induccin de muestras de esputo para el estudio citolgico (II)

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Fig. 1. Se representa un esquema del proceso de induccin de esputo.

Las muestras deben procesarse dentro de las 2 horas siguientes a su obtencin. La solucin de ditiotreitol es estable durante 24 horas. 2.1 Material necesario 1. Placas de Petri desechables. 2. Pinzas de diseccin y de filatelia. 3. Capilares de Pasteur. 4. Viales graduados de poliestireno. 5. Ditiotreitol liofilizado (Sputasol, Unipath Ltd, Hampshire. UK). 6. Agitador vortex. 7. Bandeja agitadora. (IKA Minishaker. Ika Werke. Staufen. Dinamarca). 8. Portafiltros y filtros de 45 9 mm de poro (Millipore Co. EE.UU.)
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2.2. Procedimientos por pasos 1. Anotar las caractersticas de la muestra entera de esputo recogida en la placa de Petri. 2. Sobre una superficie oscura, seleccionar los acmulos de esputo por medio de unas pinzas y unas tijeras o bien un capilar de Pasteur. Transferirlos a un vial graduado y registrar el volumen de esputo a procesar despus de que se sedimente (A). 3. Aadir un volumen igual de solucin de trabajo (0.1 mg/ml) de Sputasol. Agitar con vortex 30 seg. 4. Poner el tubo en la bandeja y agitar durante 20 minutos para permitir la accin del dispersante. Vortex 30 seg. 5. Montar un filtro en el portafiltros y depositar la muestra a travs del mismo. Anotar el volumen de la suspensin filtrada de clulas (B).

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Volumen 13

Fig. 2. Se representa el procedimiento para el anlisis de las muestras de esputo inducido.

C) Preparacin y recuento de los citocentrifugados Aunque no se trata de un paso indispensable, y algunos investigadores lo obvian15, el clculo de la celularidad total de la suspensin y su posterior ajuste a una celularidad aproximada de 1.0 x 103 celulas/ml parece conveniente3,4,9,10,12,16-18. La finalidad de este paso intermedio, adems de dar informacin acerca de la riqueza celular de la muestra, es obtener citocentrifugados ptimos para el recuento, puesto que la superposicin de elementos celulares que se produce en suspensiones demasiado concentradas dificulta y hace menos fiable su reconocimiento y recuento. El clculo de la celularidad total se realiza mediante un hemocitmetro convencional y su ajuste con salino tamponado con fosfato (PBS).

Posteriormente se preparan dos citocentrifugados de la suspensin por medio de una citocentrfuga. Las laminillas se secan al aire y se tien con un tricrmico. Un citopatlogo entrenado debe realizar los recuentos diferenciales de eosinfilos, macrfagos, linfocitos, clulas epiteliales y neutrfilos, sobre al menos 400 clulas no escamosas. Se recomienda realizar el recuento de clulas metacromticas (mastocitos y basfilos) sobre 1.500 clulas no escamosas2,17. El recuento diferencial se debe realizar de forma sistemtica empezando por la parte superior izquierda y siguiendo en zig-zag hasta la parte inferior derecha. Aunque es motivo de controversia, se consideran no adecuadas para anlisis las muestras con ms del 50 % de total de clulas escamosas3.
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Induccin de muestras de esputo para el estudio citolgico (II)

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PACIENTE.......................HC............ FECHA............................ HORA RECOGIDA....................REGISTRO A.P........................

INSPECCIN: COLOR incolor blanco CONTAMINACIN SALIVAR

amarillo menor

verdoso mayor

RECUENTO TOTAL DE CLULAS (RTC) Volumen de esputo a procesar (A)....................................... ..ml Peso del mismo.................................................................... .mg Volumen de la suspensin tras filtracin (B)....................... .ml RTC de la suspensin (C).............................................x 103 c/l Nmero absoluto de clulas recuperadas (D) = B x C.. .x 103 c RTC por volumen de esputo (D/A)........................... .x 103 c/l

RECUENTO DIFERENCIAL DE CLULAS (RDC) NEUTRFILOS.................................. % EOSINFILOS.................................... % MACRFAGOS................................. % LINFOCITOS..................................... % C.EPIT. BRONQUIAL......................... % C. METACROMTICAS % C. INDETERMINADAS...................... %

Material necesario 1. Capilares de Pasteur 2. Citmetros de Neubauer y cubreobjetos adecuados. 3. Microscopio con objetivos 10, 40 y 100 X. (Olimpus CHS 213E o similar). 4. Salino tamponado con fosfato (PBS). 5. Pipetas de 2 y 5 ml. Aspirador. 6. Citocentrfuga del tipo Shandon III (Shandon Scientific, Sewickley. EE.UU.). 7. Copas, portas, papel secante, cubres y otros fungibles necesarios para el uso de la citocentrfuga. 8. Soluciones I, II y Reveladora del tricrmico rpido (Diff-Quick, DADE Diagnostika, Unterschleissheim. Alemania). 9. Resina acrlica (Diatex. Cornwell Corp. Riverdale. EE.UU.). 10. (Opcional). Contador de clulas.
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Procedimiento por pasos 1. Por medio de un capilar de Pasteur llenar la cmara del citmetro de Neubauer con la suspensin filtrada de clulas. Realizar el recuento total de clulas de la suspensin por ml (C). 2. Calcular el nmero absoluto de clulas recuperadas (Bx C) y registrarlo (D). 3. Obtener el recuento total de clulas como el nmero de clulas recuperadas por unidad de volumen de esputo (D/A). 4. Ajustar la suspensin celular con PBS a una concentracin aproximada de 1.0 x 103 celulas/l. 5. Preparar dos extensiones aadiendo 3 gotas (75 l) de la muestra a sendas copas de la citocentrfuga. Centrifugar a 450 rpm durante 6 minutos. 6. Centrifugar la parte restante de la suspensin celular a 4000 rpm durante 10 minutos y reservar el sobrenadante que se almacenar a 80C. 7. Secar al aire los citocentrifugados, fijar con metanol y teir con Diff Quick. 8. Realizar un recuento diferencial de 400 clulas no escamosas. Diferenciar las clulas como neutrfilos, eosinfilos, macrfagos, linfocitos, clulas del epitelio bronquial e indeterminadas. No se consideran los fragmentos subcelulares. El recuento de clulas metacromticas debe realizarse sobre 1.500 clulas no escamosas. Registrar el la hoja de recuento. 9. Hacer un segundo recuento diferencial de clulas no escamosas. Para facilitar la implantacin de la tcnica reproducimos un formulario de recogida de los datos para la fase de induccin de la muestra de esputo y para la fase de procesado de la misma. En las figuras 1 y 2 se representan en forma esquemtica ambos procesos. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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V. Gutirrez Vall de Cabres

Volumen 13

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V. Gutirrez Vall de Cabres Seccin de Alergologa Hospital Dr. Peset Juan de Garay, 21 46017 Valencia

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Artculo Especial

Induccin de muestras de esputo para el estudio citolgico y de qumicos presentes en la fase fluida (III): Perspectivas de investigacin en la tcnica del esputo inducido. El estudio de muestras mediante citometra de flujo
S. Quirce Gancedo1, J. Villarubia2, A. Pacheco3
1

Servicio de Alergia. Fundacin Jimnez Daz. Madrid. 2Servicio de Hematologa. Hospital Ramn y Cajal. Madrid. 3 Servicio de Neumologa. Hospital Ramn y Cajal. Madrid.

ESTUDIO DE MUESTRAS DE ESPUTO INDUCIDO Y MARCADORES MOLECULARES Las tcnicas inmunohistoqumicas constituyen un mtodo verstil y adecuado para detectar antgenos y marcadores celulares que slo recientemente se han aplicado al estudio del esputo. Tras la dispersin del esputo con DTT pueden obtenerse muestras (cytospins) aptas para su procesamiento y marcaje con tcnicas inmunocitoqumicas que permiten la deteccin de ciertos antgenos celulares. Girgis-Gabardo et al1 han utilizado esta tcnica para detectar la protena EG-2+ (producto de conversin de la ECP) en eosinfilos as como la protena GM-CSF en macrfagos y eosinfilos del esputo. El sobrenadante del esputo puede ser procesado para medir marcadores moleculares que reflejan determinados aspectos de la inflamacin de las vas respiratorias2, incluyendo reclutamiento y activacin eosinoflica (ECP, MPO, EDN, BPM), activacin de mastocitos (triptasa, histamina), produccin de citocinas (ej. IL-5), y permeabilidad microvascular (albmina, fibringeno). En la tabla I se muestran los principales marcadores de inflamacin que pueden medirse en la fase lquida del esputo2. No obstante, el nmero de marcado-

res solubles estudiados en el esputo va aumentando rpidamente, habindose ampliado recientemente a molculas de adhesin (ICAM-1), RANTES, IgA, y determinacin de actividad quimiotctica para eosinfilos3. Un problema aadido en la determinacin de estos marcadores es la tcnica empleada en el procesamiento del esputo, bien seleccionando los tapones o grumos mucosos del esputo o bien procesando toda la expectoracin de esputo y saliva. En este ltimo caso el inconveniente fundamental es que el esputo se diluye con la saliva y el factor de esta dilucin es muy difcil de determinar. En un estudio reciente se ha observado que la concentracin de ECP es 5-6 veces mayor en las porciones seleccionadas del esputo que en la fraccin residual4, indicando el importante factor diluyente de la saliva. Tambin se ha descrito que los niveles de ECP y otros marcadores de la inflamacin son considerablemente mayores en el esputo que en el fluido del LBA5. Las concentraciones de ECP, triptasa, fibringeno y albmina son mayores en el esputo de pacientes asmticos que en controles sanos y las determinaciones de las mismas son reproducibles2. Como era previsible, se ha encontrado una buena correlacin entre la ECP y la triptasa con el recuento diferencial de eosinfilos y clulas meta-

Miembros del Comit de Estudio del Asma SEAIC: Dr. Miguel Hinojosa Macas (Coordinador), Dr. Jos M. Olaguibel Rivera (Coordinador), Dra. Pilar Barranco Sanz, Dra. Teresa Carrillo Daz, Dr. Carlos Cols Sanz, Dra. Valentina Gutirrez Vall de Cabres, Dr. Belen de la Hoz Caballer, Dr. Marcel Ibero Iborra, Dr. Santiago Quirce Gancedo, Dra. M ngeles Rico Daz, Dr. Carlos Senent Snchez (Secretario), Dr. Jos M Vega Chicote.

Rev. Esp. Alergol Inmunol Cln, Octubre 1998

Vol. 13, Nm. 5, pp. 261-265

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S. Quirce Gancedo, et al

Volumen 13

Tabla I. Principales marcadores de fase lquida en el esputo (ref. 9) Marcador ECP EDN MBP Triptasa Albmina Fibringeno Expresa Activacin eosinoflica Activacin eosinoflica Activacin eosinoflica Activacin mastocitaria Permeabilidad vascular Permeabilidad vascular Rango normal* 288 (338) g/L 448 (376) g/L 304 (602) g/L 13 (11,2) U/L 288 (318) mg/l 440 (756) ng/l

* Rango normal obtenido en 10 controles sanos y expresado como la mediana (rango inter-cuartlico).

cromticas, respectivamente. Adems se ha observado un aumento en el nmero de eosinfilos y clulas metacromticas y en las concentraciones de ECP y triptasa en esputo tras la provocacin bronquial especfica con alergeno6, 7 y una disminucin tras el tratamiento con corticosteroides8. CITOMETRA DE FLUJO EN EL ESTUDIO DEL ESPUTO INDUCIDO Otra posibilidad muy interesante es resuspender el pellet de clulas del esputo para estudiar las subpoblaciones linfocitarias y marcadores de activacin mediante citometra de flujo. La citometra de flujo representa un mtodo rpido y cuantitativo de anlisis de clulas u otras partculas en suspensin y consiste en hacer pasar a las mismas, alineadas y de una en una, por delante de un haz luminoso. La interaccin de las clulas o las partculas con el rayo luminoso genera seales que se llevan a los detectores adecuados y estas seales luminosas detectadas se transforman en impulsos elctricos que se amplifican y se convierten en seales digitales que se procesan en el ordenador. La informacin generada procede de un lado de la dispersin de la luz y de otro de la emisin de luz por los fluorocromos presentes en la clula o la partcula al ser excitada por el rayo luminoso. De las diferentes aplicaciones de la citometra de flujo en el diagnstico clnico, destaca por su uso y relevancia la determinacin de antgenos celulares, molculas presentes en las clulas capaces de unir anticuerpos dirigidos especficamente contra ellas. Las combinaciones de diversos anticuerpos monoclonales contra antgenos celulares pueden utilizarse para identificar poblaciones celulares especficas. Adems el marcaje simultneo de diferentes antgenos celulares ha permitido obtener importantes logros en el diagnstico clnico, tal como la identi-

ficacin de las subpoblaciones linfocitarias en distintas patologas9. Esta tcnica ha sido empleada previamente en el anlisis de las clulas inflamatorias contenidas en el LBA10, 11 pero hasta el momento son escasos los estudios que han analizado los linfocitos en el esputo mediante citometra de flujo. El primer antecedente de la utilizacin de la citometra de flujo en el esputo se aplic nicamente al estudio de eosinfilos12. Se estudiaron 11 pacientes asmticos y se compar la presencia de diversos marcadores de superficie en eosinfilos de sangre perifrica y del esputo mediante citometra de flujo con doble fluorescencia (eosinfilos identificados como granulocitos CD9+). Los eosinfilos provenientes del esputo pero no los de sangre perifrica expresaban ICAM-1 y HLA-DR. Posteriormente, Kidney y col. 13 del grupo de Ontario investigaron la validez y reproducibilidad de las determinaciones de subpoblaciones linfocitarias en el esputo de 11 pacientes con asma en fase estable y en 10 fumadores no asmticos. Los anticuerpos monoclonales utilizados para el estudio de las subpoblaciones linfocitarias en el esputo fueron: CD3/CD19 (linfocitos T y B), CD3/CD4 (T cooperadores) y CD3/CD8 (T supresores), as como el marcador de activacin linfocitaria CD25 (receptor de IL-2) junto a CD4 (T cooperadores activados) o CD8 (T supresores activados). Los linfocitos eran detectados por fluorescencia ajustada a las caractersticas de los linfocitos del BAL. El nmero total de linfocitos se expresaba como la suma de clulas B y T, calculndose los porcentajes respectivos a partir de esta cifra. En los pacientes con asma se observ un porcentaje significativamente mayor de linfocitos B que en los no asmticos as como un incremento en los linfocitos T cooperadores activados (CD25+). Adems se encontr una correlacin significativa entre el recuento diferencial de eosinfilos con los linfocitos B en el esputo de los asmticos. La reproducibilidad de dos determinaciones en una semana de subpoblaciones de linfocitos en el esputo fue buena, pero la tcnica no est exenta de inconvenientes, principalmente: Necesidad de disponer de una cantidad suficiente de linfocitos (ms de 1 milln de clulas) y por tanto de un volumen suficiente de esputo. Autofluorescencia de los macrfagos, especialmente en fumadores. Posible interferencia del DTT con los marcadores celulares, aunque no se han encontrado
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Induccin de muestras de esputo para el estudio citolgico (III)

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cambios en linfocitos de sangre perifrica, y quiz nicamente pueda verse alterado HLA-DR por presentar puentes disulfuro. Louis y col.3 aplicaron la citometra de flujo para determinar subpoblaciones linfocitarias en el esputo mediante un nuevo mtodo que requiere menor cantidad de clulas y que se efecta con un cocktail de 5 anticuerpos monoclonales en un nico tubo as como inmunofluorescencia tricolor (fluoerescein isotiocianato -FITC-, ficoeritrinaPE-, y peridinin clorofil protena conjugadoPerCP-)14. Los anticuerpos monoclonales empleados fueron: CD3-PerCP para identificar el nmero total de linfocitos T, CD4-FITC y CD8-PE para linfocitos T CD4+ y CD8+, respectivamente, CD16-PE para clulas asesinas (NK) y CD19FITC para los linfocitos B. Adems se realiz citometra de flujo bicolor estndar con CD3FITC/CD25-PE, CD3-FITC/HLA-DR-PE, CD3FITC/VLA-4-PE, ICAM-1-FITC/CD3-PE, LFA1-FITC/CD3-PE. En el estudio realizado por estos autores en 22 pacientes asmticos y 14 controles no atpicos utilizando la citometra de flujo referida encontraron un aumento significativo de los linfocitos CD4+ en el esputo de los pacientes asmticos, as como un aumento de la expresin de ICAM-1 en los linfocitos T de los asmticos. Por el contrario, el porcentaje de clulas asesinas (CD16+ NK) estaba reducido significativamente en los asmticos. En la fase lquida del esputo de los asmticos tambin encontraron un aumento significativo de los niveles de ECP, triptasa y de ICAM-1 soluble, pero no de histamina ni de MPO. Tambin se encontr un aumento significativo en el porcentaje de linfocitos con expresin de los marcadores de activacin CD25, HLA-DR e ICAM-1 en el esputo comparado con la sangre perifrica tanto en asmticos como no asmticos3. En el Hospital Ramn y Cajal hemos realizado un estudio preliminar aplicando citometra de flujo en 15 muestras de esputo inducido de pacientes con asma15. Utilizamos un mtodo fluorescente con triple marcaje (FITC, PE y PerCP) en un citmetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson) realizando una adquisicin de 10.000 clulas y con los anticuerpos monoclonales CD45, CD3 y CD33, obtenindose un contaje celular basado en la expresin antignica celular en todos los casos. La puesta en marcha de la tcnica an est pendiente de solucionar algunos problemas, como la degeneracin celular pre35

sente en el 27% de las muestras de esputo de los asmticos, la autofluorescencia de macrfagos, y las dificultades en la correcta identificacin fenotpica de las subpoblaciones linfocitarias por las diferencias existentes entre los linfocitos de sangre perifrica y de las vas respiratorias13. EXPRESIN DE CITOCINAS Se ha descrito que los pacientes asmticos muestran un aumento en la expresin de RNAm que codifica diversas citocinas, incluyendo IL-5 en el BAL16 en muestras de biopsia bronquial17 y linfocitos CD4+ en sangre perifrica18. Por primera vez Gelder y col.19 estudiaron la expresin de RNAm para citocinas en el esputo inducido en pacientes normales, atpicos y asmticos mediante la tcnica de la PCR (polymerase chain reaction). Para ello, el RNA de la muestra de esputo se extrajo mediante la tcnica previamente descrita20 y se aplic el mtodo de la transcripcin inversa. El DNAc resultante se utiliz como plantilla para la reaccin de la PCR, utilizando cebadores especficos para las diversas interleucinas. El anlisis de los resultados mostr que el RNAm para IL-5 se detectaba en la mayora de los pacientes asmticos (80% en los asmticos moderados y 40% en los leves), mientras que se detect en el 33% de los atpicos no asmticos y en el 10% de los controles no atpicos. Los autores concluyen que la obtencin de esputo inducido en combinacin con la tcnica de PCR permite identificar la expresin de citocinas que pueden intervenir en el proceso inflamatorio crnico de las vas respiratorias en pacientes asmticos. Sin embargo, tambin existen algunos problemas en esta tcnica, ya que el mtodo utilizado es cualitativo pero no cuantitativo, y que la demostracin de la implicacin de una determinada citocina debe basarse en la identificacin de la protena real y no nicamente en el RNAm que lo codifica. CONSIDERACIONES FINALES Los nuevos mtodos de obtencin y procesamiento del esputo que se han comenzado a aplicar al estudio del asma muestran una gran fiabilidad. En concreto, la tcnica del esputo inducido con salino hipertnico puede aportar interesantes posibilidades

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clnicas y de investigacin, ya que la obtencin de marcadores celulares y moleculares de la inflamacin de forma directa y no invasiva proporciona una alternativa prctica y viable para estudiar muestras seriadas en un gran nmero de pacientes. Una aplicacin clara es utilizar los ndices de inflamacin en el esputo para incrementar nuestro conocimiento de las complejas interrelaciones entre clulas, mediadores y citocinas en el asma, y de stos con alteraciones en la reactividad bronquial y en la respuesta teraputica a distintos frmacos. Por ejemplo, un estudio muy reciente muestra la utilidad de las determinaciones secuenciales de los marcadores de inflamacin en el esputo en el seguimiento de las agudizaciones graves del asma, y que stos podran constituir una mejor gua teraputica que los ndices clnicos o en sangre perifrica en el control de la inflamacin21. Por otro lado, la incorporacin de la tcnica del esputo inducido para medir la inflamacin de las vas respiratorias tras la provocacin especfica con alergeno abre interesantes perspectivas de futuro en la investigacin sobre las complejas interrelaciones entre la fisiopatologa e histopatologa del asma bronquial.

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