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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Laboratorio de Microbiología Agrícola. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Prolongación


de Carpio y Plan de Ayala, Col. Santo Tomás C.P. 11340. México D.F., México.

CULTIVO DE Bacillus thuringiensis Y SU USO COMO


BIOINSECTICIDA

Por:
Lara Vega Israel

Entrega: Noviembre 3, 2008.

Objetivo general

El alumno desarrollara el cultivo de Bacillus thuringiensis para identificar y


describir su morfología colonial y microscópica con sus esporas y cuerpos
paraesporales. Evaluará su capacidad de bioinsecticida.

Objetivos particulares

1. Cultivar Bacillus thuringiensis y describir su morfología colonial.

2. Estimular la esporulación del Bacillus thuringiensis cultivado y describir


la morfología de sus esporas y cuerpos paraesporales.

3. Evaluar su capacidad de bioinsecticida contra Tenebrios (Coleópteros).


Introducción

Las plagas tanto urbanas como rurales son una amenaza constante para la
salud y la calidad de vida humana (Dulmage, et al., l990), son también la causa
de grandes pérdidas económicas en los cultivos (Kaelin , et al., l994). Hasta
ahora la única forma eficaz de controlar estos insectos plaga se basa en la
aplicación de pesticidas químicos, aunque ello trae en consecuencia problemas
ecológicos; por tanto el uso irracional de los agroquímicos ha sido causa de
contaminación ambiental, en especial a finales de la segunda guerra mundial
con el surgimiento de plaguicidas de origen órgano-sintético, que al
desequilibrar el balance ecológico, han disminuido la biodiversidad, mientras
que sus residuos tóxicos han contaminado los alimentos e inducido resistencia
en los insectos plaga (Dulmage. et al., l990 ; Karamanlidou, et al., l991 y Badii,
et al., l996),en la actualidad 500 insectos son resistentes a uno o mas
pesticidas y el numero puede aumentar notablemente en pocos años (Rowe y
Margaritis, 1987 citados por Macías, 1995). Una posible alternativa para
solucionar este problema es el control biológico, definido como el uso de un
organismo natural o modificado genéticamente y/o sus productos para reducir
los efectos de insectos plaga (Galán et al., l996). Ignoffo y Hink , citados por
Badii en 1996 , reportan la existencia de más de 1500 especies de
microorganismos entomopatógenos con potencial para el control microbiano de
insectos, en relación a su diversidad se señalan: hongos, virus, protozoarios y
bacterias, en donde las últimas son las de mayor importancia. De las bacterias
la más sobresaliente pertenece al género Bacillus. Falcón citado por Badii en
1996, clasificó a las bacterias en dos grupos a) las esporuladas y b) las no
esporuladas. En donde las bacterias entomotóxicas con mayor potencial para
la producción de bioinsecticida es Bacillus thuringiensis (Bth), la que más se ha
explotado comercialmente, mientras que en segundo lugar se ubica a B.
popillae y más recientemente B. sphaericus y B. morati que tiene valor
reconocido en el control de plagas urbanas como los mosquitos, vectores de
paludismo, dengue, etc. (Badii, et al., 1996).

Bacillus thuringiensis
La bacteria Bacillus thuringiensis (Bth) es un bacilo gram-positivo, flagelado y
esporulado que se caracteriza por la formación de un cuerpo paraesporal o
cristal de proteína, conocido como delta-endotoxina, estos cristales se forman
durante la esporulación y tienen actividad tóxica para larvas de insectos (Shieh,
l988). A Bth se le considera cosmopolita, pues sus esporas se han aislado de
suelo (Meadows, et al., l992) , de larvas de insectos enfermos (Kaelin P., et al.,
1994), de productos almacenados (Karamanlidou, et al., 1991), y hojas de
árboles (Meadows, et al., 1992; Sánchez-Yáñez y Peña-Cabriales, 1995),
aunque es más frecuente aislarla de productos almacenados, pues las
condiciones ambientales del almacén permiten la persistencia de sus esporas
(Martínez y Sánchez- Yáñez,1998) incluyendo la rizosfera de plantas (Medrano,
et al., 1998).
La delta-endotoxina puede variar en tamaño y en forma, ya que según la
variedad de Bth, pueden producir en el medio de cultivo más de una forma de
cristales. B.thuringiensis var. Israelensis es efectiva frente a mosquitos
chupadores de sangre transmisores de un amplio espectro de enfermedades
animales causadas por virus, bacterias, helmintos o protozoos. B.thuringiensis
var. Tenebrosis descubierta en 1983, posee un patotipo efectivo contra larvas
de coleópteros. Puede infectar a la larva del escarabajo de la patata, causante
de la mayor peste de las patatas en Europa y Norte América, que ha
desarrollado resistencia a muchos insecticidas químicos. B.thuringiensis var.
kurstaki cepa HD-1 es la cepa básica usada en muchas preparaciones para el
control de orugas. Su gen de la proteína insecticida (Cry) fue el primero en
clonarse.

Kaelin et al., l994, mencionan que encontraron cristales de formas romboidal


(de proteínas de 65 kDa), de tipo amorfo entre (130 y 140 kDa) y heterogéneo
(de aproximadamente 63 kDa) y también de la clase bipiramidal (l30 y 65 kDa )
. Mientras Karamanlidou, et al., 1991, reportan el aislamiento de cristales
irregulares, cuboidales, bipiramidales y esféricos, aunque Meadows, et al.,
1992, señalan que la forma más común es la bipiramidal. Mientras que Kaelin,
et al., l994, proponen una forma de clasificación de los cristales más práctica
en base a su espectro de actividad insecticida, en donde los cristales tipo Cry I
son tóxicos para lepidópteros, los Cry II para lepidópteros y dípteros, los tipo
Cry III para coleópteros y los Cry IV para dípteros.

Mecanismo de acción de la delta-endotoxina.


Cuando el cristal es ingerido por un insecto susceptible en fase larvaria llega
a su intestino medio, se disuelve por la acción de los jugos intestinales a pH
alcalino, aquí la delta-endotoxina sufre una proteolisis enzimática y da origen a
la toxina activa, la cual se une a un receptor específico de las membranas
epiteliales de las células del intestino, lo que genera poros que desequilibran su
balance osmótico y provocan la lisis celular de esta parte del aparato digestivo,
posteriormente causa diarrea y vómitos en el insecto, lo que puede provocar
eventualmente su muerte por una deshidratación severa (Hugutte,l989, citado
por Leal 1995; Shieh, 1988).

Fig. 1. Mecanismo
de acción de la
delta-endotoxina de
Bacillus
thuringiensis
Material

Material biológico:

• Cepa de Bacillus thuringiensis


• 250 larvas de Tenebrios (Coleópteros)
• 5 zanahorias
• 1 papa

Equipo:

• Balanza analítica
• Microscopio
• Potenciómetro
• Centrifuga

Cristalería

• Matraz erlenmeyer de 500 y 1000 mL


• Pipetas de 5 y 10 mL
• Vaso de precipitados de 250 y 1000 mL
• 20 tubos de vidrio con tapón de rosca

Utensilios:

• Aguja de disección
• Asa y porta-asa microbiológica
• Espátula
• Mechero o lámpara de alcohol
• Barra magnética
• Pinzas de disección
• Porta y cubre objetos
• Bisturí y tijeras

Varios:

• Algodón
• Gasa
• Papel aluminio
• Papel estraza
• Atomizador
• 25 vasos de unisel
• Ligas

Reactivos:

• Agar nutritivo
• Reactivo de Bradford
• Colorantes para tinción de Gram
• Glucosa
• Extracto de levadura
• (NH4)2SO4
• K2HPO4
• FeSO47H2O
• H2O desionizada
• H2O2
• MgSO47H2O
• MnSO4
• CaCl2.2H2O
• ZnSO47H2O
• CuSO4

Procedimiento

A. CULTIVO DE LA BACTERIA

1. A partir de la cepa tipo Bacillus thuringiensis, hacer su siembra en tubo


con agar nutritivo e incubar a 28°C por 24 o 48 hor as.
2. Pasado el tiempo de incubación, observar las características
morfológicas de las colonias desarrolladas. Tomar una muestra de estas
para teñir con Gram y registrar sus características microscópicas.

B. OBTENCION DE ESPORAS

1. Cultivar B. thuringiensis en medio G para obtener endosporas.


2. Incubar durante 48 o 72 horas hasta lisis celular.
3. Hacer un frotis del cultivo lisado y teñir con el colorante de Bradford para
observar las endosporas y los cuerpos paraesporales producidos por la
bacteria.

--CULTIVO DE MEDIO G (Bechtel y Bulla 1976)

Nutriente Cantidad
1 Glucosa 1g
2 Extracto de levadura 2g
3 (NH4)2SO4 2g
4 CuSO4 0.005g
5 MgSO47H2O 0.2g
6 FeSO47H2O 0.0005g
7 CaCl2.2H2O 0.025g
8 ZnSO47H2O 0.005g
9 MnSO4 0.05g
10 K2HPO4 0.5g
11 H2O 1L
pH 7.0
--TINCIÓN DE LAS ESPORAS CON EL COLORANTE DE BRADFORD

1. Hacer una preparación fija con una gota del medio de cultivo
2. Colocar una gota del colorante durante 5 minutos.
3. Lavar la preparación y dejar secar al aire.
4. Observar al microscopio los cristales paraesporales de color azul.

NOTA: Con las endosporas se llevará a cabo un bioensayo en el que se pondrán en


contacto con larvas de Tenebrios que son plagas de plantas.

C. BIOENSAYO

1. Comprobar la existencia de esporas y cuerpos paraesporales en el frotis


del cultivo de la bacteria en medio G.
2. Realizar 5 diluciones (10-1, 10-2,…,10-5) del cultivo de la bacteria en
medio G.
3. Cortar las zanahorias y la papa en piezas pequeñas suficientes para
colocar 1 pieza de cada una por vaso.
4. Colocar 10 larvas de Tenebrios por vaso.
5. Etiquetar los vasos de unisel como sigue:
-- 3 como Testigo Negativo (agua)
-- 3 como Testigo Positivo (cultivo bacteria original)
-- 3 como Dilución 10-1
-- 4 como Dilución 10-2
-- 4 como Dilución 10-3
-- 4 como Dilución 10-4
-- 4 como Dilución 10-5

6. Separar las piezas cortadas de verdura por tratamiento y colocarlos


sobre papel estraza.
7. Con ayuda del atomizador bañar las piezas con la solución
correspondiente a cada tratamiento de forma que queden totalmente
bañadas.
8. Colocar las piezas en los vasos correspondientes.

9. Cortar gasas para cubrir todos los vasos y cerrar con ligas.

10. Dejar los vasos en lugar fresco por 5 días y observar resultados.

Resultados

A. CULTIVO DE LA BACTERIA.

Figura 2. Cultivo de la cepa de Bacillus thuringiensis utilizada.


Como puede observase en la Fig. 2. B. thuringiensis presenta una morfología
colonial cremosa con bordes aserrados, las colonias son planas y de color
blanquesino.

Bacilos

Figura 3a y b. Tinción de Gram de Bacillus Thuringiensis tras cultivar en agar


nutritivo.

Al realizar la tinción de Gram a la bacteria podemos observar su morfología


microscopica (Fig. 3). Los bacilos se tiñen de color violeta lo que indica que B.
thuringiensis es Gram+, ademas el bacilo presenta bordes rectos y se observan
en general formando cadenas largas de varios bacilos.

B. OBTENCIÓN DE ESPORAS.

Bacilo

Endospora

Cuerpos
paraesporales

Figura 4. Tinción de Gram de B. thuringiensis durante esporulación tras cultivar


en medio G.
Con la tinción de Gram realizada a la bacteria después de cultivar en medio G
(Fig. 4) podemos observar como se ha inducido la esporulación del bacilo
Gram +, pues se observan endosporas de color rosa en bacilos aun no lisados
y cuerpos paraesporales igualmente de color rosa, los cuales presentan en su
mayoría una forma bipiramidal.

Bacilo

Figura 5. Tinción con el colorante de Bradford de B. thuringiensis durante


esporulación tras cultivar en medio G.

En la Fig. 5 observamos como los bacilos que aun no se han lisado durante la
esporualción se tiñen de color azul marino utilizando el colorante de Bradford.

Espora

Cuerpos
paraesporales

Figura 6. Tinción con el colorante de Bradford de B. thuringiensis durante


esporulación tras cultivar en medio G.
En la Fig. 6 observamos como el colorante de Bradford tiñe también de azul
marino tanto las esporas como los cuerpos paraesporales, y a diferencia de la
tinción de Gram, aquí, puede observarse con mas claridad la forma bipiramidal
que la mayoría de los cuerpos paraesporales presentan.

C. BIOENSAYO

Tabla 1. Número de larvas de Tenebrios vivas y muertas 5 días después de


suministrar B. thuringiensis.

TRATAMIENTO TOTAL DE TENEBRIOS TENEBRIOS


TENEBRIOS VIVOS MUERTOS
POR
TRATAMIENTO
(repeticiones)
Testigo (-) 10/10/10 10/10/10 0
Testigo (+) 10/10/10 10/10/9 1
D 10-1 10/10/10 10/10/9 1
D 10-2 10/10/10/10 10/10/10/9 1
D 10-3 10/10/10/10 10/10/10/8 2
D 10-4 10/10/10/10 10/10/10/10 0
D 10-5 10/10/10/10 10/10/10/9 1

TOTAL 250 244 6


% 100 97.6% 2.4%

Alimento

Unisel
rasgado

Figura 7. Larvas vivas encontradas en el tratamiento Testigo +.

Como lo muestra la tabla, solo 6 de las 250 larvas utilizadas murieron. Se


observa en la Fig. 7 como las larvas han consumido gran parte del alimento
suministrado y permanecen muy activas pues incluso han rasgado el vaso de
unisel.
LARVA
PUPA
ADULTO

Figura 8. Larvas, pupas y 1 ejemplar adulto encontrados vivos tras observar


resultados en todos los tratamiento.

Espora

Figura 9. Tinción de Bradford al macerado de intestino de una larva encontrada


viva.

Para comprobar que B. thuringiensis había sido suministrado correctamente se


macero el intestino de una larva viva y se logro encontrar una espora.

Discusión

Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los géneros


Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces), disponen de una
notable estrategia adaptativa cuando se ven sometidas a privación de
nutrientes en su medio ambiente: si los niveles de fuentes de C, N, o P caen
por debajo de un umbral, esto constituye una señal a la célula de que se
avecina un largo período de privación de nutrientes. Entonces, la célula se
implica en una serie de complejos cambios genéticos, metabólicos y
estructurales (proceso de esporulación o esporogénesis), que conducen a la
diferenciación, en el interior de la célula vegetativa original, de una célula
durmiente (la endospora). La célula-madre, la célula vegetativa original que
generó la endospora finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capaz
de permanecer en estado criptobiótico, durmiente, varios decenios, incluso
siglos.
En el laboratorio tras lograr el cultivo de Bacillus thuringiensis nosotros
logramos inducir la esporulación de B. thuringiensis al cambiarla de un medio
rico en nutrientes (Agar nutritivo) a un medio de cultivo pobre en nutrientes
(medio G), además de que para asegurar que la mayoría de los bacilos
lograran la esporulación y lisado celular, se mantuvieron en este medio durante
5 días.
Tras comprobar la esporulación y la producción de cuerpos paraesporales
mediante la técnica de tinción de Gram Y Bradford (Fig. 4, 5 y 6) se procedió a
realizar un bioensayo con Tenebrios (Coleópteros) suministrándoles la solución
que contenía las esporas y cuerpos paraesporales en diferentes
concentraciones para comprobar la capacidad insecticida de éstos.
Sin embargo, como podemos observar en la Tabla 1 los resultados tras 5 días
de observación nos muestran que no hubo efecto significativo sobre la
sobrevivencia de los tenebrios al suministrarle el B. thuringiensis. Los
resultados nos muestran que a pesar de que hay 6 larvas muertas (2.4% del
total) que corresponden a diferentes tratamientos, es muy probable que estas
larvas hayan muerto por causas totalmente distintas a la suministración de B.
thuringiensis.
Además un dato mas importante es que no ninguna diferencia en cuanto al
tratamiento Testigo (–) y Testigo (+), pues mientras en el Testigo (-)
sobrevivieron las 30 larvas utilizadas, en el Testigo (+) donde se suministro el
concentrado de B. thuringiensis a las zanahorias y papas, de los 30 tenebrios
utilizados solo 1 murió.
Durante el análisis de resultados surgió la posibilidad de que hubiese existido
una falla en la suministración del bacilo al alimento sin embargo esta
posibilidad se eliminó pues al decidir realizar una tinción con el colorante de
Bradford al intestino de una larva sobreviviente se logro encontrar en su interior
una espora, lo que nos comprueba que las larvas lograron consumir las
esporas y por tanto los cuerpos paraesporales obtenidos durante la
esporulación.
Es importante mencionar que al inicio del bioensayo cuando recién
suministramos el alimento con bacilos a los tenebrios la mayoría de éstos
mostraron algunos síntomas típicos de larvas afectadas descritos por Lamborot
y Araya (1986): en las larvas se percibió una disminución del apetito hasta
dejar de alimentarse, permaneciendo inactivas e inmóviles. Sin embargo tras
los 5 días de observación estos síntomas desaparecieron.
La razón de esta observación pudo ser la siguiente:
Casi todas las variedades de B. thuringiensis son capaces de formar mas de un
tipo de cuerpos de inclusión distinto. Cada variedad de Bt puede tener un
número variable de plásmidos responsables de la síntesis de diferentes d-
endotoxinas. Estos plásmidos portan varios genes de toxina (genes cry), a
veces idénticos. Además, Bt puede tener diferentes transposones que
contribuyen a aumentar la diversidad genética de estas toxinas.
Las diferentes variedades de Bt pueden intercambiar fácilmente sus plásmidos
mediante un proceso semejante a la conjugación, fenómeno que ha sido
demostrado en el intestino de larvas de mosquito. De este modo, las
variedades de Bt pueden también intercambiar plásmidos que contienen genes
de d-endotoxina (los genes cry), y así aumentar su espectro de acción contra
más especies de insectos.
Entonces es posible que la variedad de B. thuringiensis que utilizamos en el
bioensayo, si bien no es específica para coleópteros, es decir, no es la
variedad Tenebrosis, sea capaz de producir, aunque de forma mínima, el tipo
de endotoxina especifica para los coleópteros lo que produjo los síntomas
iniciales y posiblemente tras la adquisición de una inmunidad por parte de larva
dada la baja densidad de la d-entoxina específica para coleopteros, se haya
eliminado el efecto insecticida por completo. Las especies de insectos
resistentes a varios tipos de B. thuringiensis ha sido demostrada (Rodcharoen
J, Mulla MS.1994).

Al termino de la práctica comprobamos que la variedad utilizada de B.


thuringiensis no esa la Tenebronis, la variedad especifica para matar larvas de
coleópteros lo que será de gran ayuda para posteriores prácticas pudiéndose
así utilizar una larva distinta para realizar el bioensayo.

Por último cabe mencionar que para obtener mejores resultados se sugiere que
los vasos utilizados sean de plástico con tapa y no de unisel pues varias larvas
lograron salirse de ellos.

Conclusiónes

Se logró cultivar a Bacillus thuringiensis y describir su morfología colonial y


microscópica. Su morfología colonial es blanca, cremosa y plana con bordes
aserrados y su morfología microscópica corresponde a un bacilo de bordes
rectos, Gram + y esporulado.

B. thuringiensis lleva a cabo la esporogénesis al sembrarla en un medio pobre


de nutrientes.

Durante la esporogénesis, B. thuringiensis produce cuerpos paraesporales, la


mayoría de éstos con forma bipiramidal.

La variedad de B. thuringiensis utilizada en la práctica no era especifica para


las larvas de Tenebrios (Coleópteros), es decir, no corresponde a la variedad
Tenebrosis.

Referencias bibliográficas

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Lic. Zulema Menéndez DíazIV; Lic. Aileen González RizoV; Lic. Yenín
Hernández GonzálezVI; Dr. Israel García ÁvilaVII. Estudio de resistencia de
Aedes aegypti a Bacillus thuringiensis var. Israelensis. Revista Cubana
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http://scieloprueba.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0375-
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• Mario Soberón y Alejandra Bravo. Bacillus thuringiensis y sus toxinas


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http://www.microbiologia.org.mx/mic
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http://eap.mcgill.ca/MagRack/JPR/JPR_22.htm

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http://www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/bacteria.html