Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Qumica Licenciatura Ciencias mencin Qumica

Informe de Laboratorio N1 Determinacin de parmetros cromatogrficos

Autores:

lvaro Etcheverry Mariana Montanares Daniela Bobadilla Nicols Faras aetcheverry@ug.uchile.cl mariana.montanares@gmail.com danii.bobadilla@gmail.com nicolasfariasr@gmail.com

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Fecha de entrega: 13/04/2012 RESUMEN Este laboratorio consisti en familiarizarse con un instrumento de HPLC, y analizar las distintas variables que afectan un estudio utilizando este equipo. Se realizaron distintas mediciones utilizando cafena y fenol como analitos, tiourea como especie no retenida y una mezcla de metanol-agua 60/40 como fase mvil. Se fue variando la velocidad de flujo para poder calcular la velocidad de flujo ptima, que result ser de 0.53 mL/min, se calcul el factor de capacidad de la cafena siendo de 0.306, y la resolucin y factor de selectividad para una mezcla de cafena y fenol, siendo de 2.31 y 2.12 respectivamente. INTRODUCCIN El HPLC o cromatografa liquida de alta resolucin es un sistema cerrado que funciona a altas presiones, consiste en una fase estacionaria al interior de una columna y una fase mvil que fluye con ayuda de altas presiones. El equipo de HPLC nos arroja un anlisis de la muestra el cual se llama cromatograma el cual nos indica informacin muy valiosa a cerca de los analitos de nuestra muestra. Un cromatograma cuenta con la informacin directa que se puede obtener como lo son el tiempo de retencin (tR) y el ancho de la banda en la base (W). A partir de estos parmetros se puede realizar la determinacin del flujo ptimo para una muestra a travs de una grafica de la altura del plato terico (H) versus el flujo (). Para la construccin de la grafica altura del plato terico (H) versus el flujo () es necesario determinar el nmero de platos tericos de la columna utilizada en la inyeccin para diferentes velocidades de flujo de la fase mvil con un mismo analito, esto se puede calcular con la ecuacin:

(1)
luego ingresamos la cantidad de platos obtenidos en la ecuacin:

(2)
y obtenemos una grafica como se indica:

donde el mnimo de la curva nos indica el flujo optimo . Tambin existen otros parmetros que se pueden obtener de un cromatograma, por ejemplo al inyectar una sustancia no retenida por la columna se obtiene un parmetro denominado tiempo muerto (tM), este tiempo coincide con la velocidad promedio del movimiento de las molculas de la fase mvil, con este parmetro es posible calcular la razn de reparto, con la ecuacin:

(3)
La razn de reparto (k) describe las velocidades de migracin de los analitos en la columna, corresponde al tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir en comparacin con un soluto no retenido. Cuando nuestro cromatograma es ms complejo y es posible observar ms de una banda cromatogrfica, debemos recurrir a otros parmetros para poder determinar si las condiciones de la inyeccin son las correctas, tenemos el factor de selectividad () el cual nos indica la distancia que existe entre los mximos de las bandas cromatogrficas, este parmetro se puede calcular mediante la ecuacin:

(4)
el valor ptimo de corresponde a 1,2. Otro parmetro es la resolucin que nos indica la separacin de las bases de las bandas cromatogrficas, el cual se calcula utilizando la ecuacin:

(5)
con un valor optimo de 1,5. En este practico utilizaremos como muestra una solucin de cafena que posee una estructura polar que interaccin con la columna de C-18 utilizada en el HPLC y con la fase mvil de metanol/agua, como sustancia no retenida se utilizara tiourea que posee una estructura apolar la 3

cual no interacciona con la fase estacionaria y como segundo analito utilizaremos fenol tambin una sustancia apolar pero que se ve ms retenida por la columna que la cafena.
CH3 N N H3C N N O Cafena O H2N Fenol OH

S NH2

CH3

Tiourea

Figura N1: Estructuras de la cafena, fenol y tiourea. PARTE EXPERIMENTAL 1. Datos brutos obtenidos: En primer lugar se realizaron 5 inyecciones de una muestra de cafena utilizando como eluyente una mezcla de metanol/agua 60:40, variando el flujo en cada ocasin. El software conectado al equipo de HPLC, arroj distintos valores para el tiempo de retencin (tR) y para el ancho de la seal (W), como se muestra en la Tabla N1. Tabla N1: Tiempos de respuesta y ancho de la seal para distintas velocidades de flujo. Velocidad de flujo () [mL/min] 1 0.8 0.6 0.4 0.2 tR [min] 1.622 2.353 3.101 4.667 9.297 W [seg] 10 13 16 25 45

Posteriormente, se utiliz una mezcla de cafena y tiourea utilizando como fase mvil una mezcla de metanol/agua 60:40 y un flujo de 1.0 mL/min. Se obtuvo un tiempo de retencin (t R) para la cafena de 1.858 min. y un tiempo muerto (tM) de 1.423 mn., correspondiente a la especie no retenida, en este caso la tiourea. Finalmente, se inyect una mezcla de cafena, fenol y tiourea, bajo las mismas condiciones de la inyeccin anterior, obtenindose unos tiempos de retencin de 1.906 min. y 2.404 min. para la cafena y para el fenol, respectivamente; y, un tiempo muerto de 1.462 min. para la tiourea.

Todas las mediciones se realizaron en una columna de 15 cm con un relleno de siloxanoC18; fase mvil metanol/agua en una proporcin de 60:40; manteniendo la temperatura constante a 25C; y utilizando un detector espectrofotomtrico de arreglo de diodos. 2. Tratamiento de datos: Utilizando las ecuaciones (1) y (2), se obtuvieron los siguientes valores para el nmero de platos tericos (N) y la altura de cada uno (H), segn se muestra en la Tabla N2. Tabla N2: Nmero de platos tericos y la altura de cada uno, a distintas velocidades de flujo. Velocidad de flujo () [mL/min] 1 0.8 0.6 0.4 0.2 N 1509 1881 2158 2004 2459 H [cm] 9.94E-03 7.97E-03 6.95E-03 7.48E-03 6.10E-03

En base a los datos obtenidos, estos fueron graficados en el software OriginPro 8.5, y se estim la mejor curva para ajustar a la ecuacin de van Deemter, como se muestra en el Grfico N1.

Grfico N1: Flujo versus altura del plato terico. 5

Ntese que no se consider el valor obtenido para el flujo a 0.2 mL/min, debido a que no se ajusta al comportamiento esperado, adems de que el tiempo de retencin obtenido para la cafena es demasiado grande (9.297 min), lo que implica poca eficiencia analtica. Luego, utilizando el mismo software, se deriv la ecuacin obtenida anteriormente y se obtuvo que la velocidad de flujo ptima es de alrededor de 0.53 mL/min. Para el caso en que se inyect cafena con tiourea, se utiliz la ecuacin (3), para calcular el factor de capacidad (k) para la cafena, obtenindose un valor de 0.306. Finalmente, utilizando las ecuaciones (4) y (5), se calcul la resolucin (RS) y el factor de selectividad () para la cafena y el fenol, dando como resultado un de 2.12 y una resolucin de 2.31. DISCUSIN Analizando los valores del grafico N1 podemos corroborar la influencia del flujo en la separacin cromatogrfica; si bien no se consider el valor del flujo a 0.2 mL/min, la curva muestra la forma esperada con un mnimo en el valor de H que representa el flujo optimo. Un valor tan bajo de flujo aumenta la difusin dentro de la columna (difusin longitudinal y de remolino), lo cual es congruente con la teora cintica cromatografica; adems, un valor tan alejado del plato terico, correspondiente a este flujo, podra relacionarse con errores de inyeccin de la muestra. El factor de capacidad (k) obtenido fue de 0.306 lo cual se aleja bastante del rango ptimo, entre 2 y 5. El factor de capacidad se calcula por medio de el tiempo de retencin del analito y el tiempo muerto de la especie no retenida, por lo que un valor tan bajo indica que ambas seales presentan tiempos muy ajustados debido a que el flujo de la muestra era muy alto (1mL/min) y no permite una separacin eficiente de tiourea y cafena. Con respecto a la resolucin, si bien se obtiene un valor alto, lo que indicara una separacin eficiente de los componentes, esto no es congruente con el valor obtenido del factor de capacidad; por lo que un valor alto de resolucin no indicara necesariamente una buena separacin de los componentes. Esto mismo sucede para el factor de selectividad. CONCLUSIONES Se aprendi el funcionamiento y manejo de cada una de las partes que componen el HPLC Se confirm la importancia del flujo en la eficiencia de separacin. Si bien una columna puede tener factores que indicaran una buena separacin (resolucin y factor de selectividad), un flujo demasiado alto afecta de manera notable en la separacin de stos, lo que se observa en un factor de capacidad pequeo. BIBLIOGRAFA 6

SKOOG, Douglas A. y West, Donald M. Anlisis Instrumental, 2da Edicin. Mxico, McGraw-Hill, 1992.