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CAPÍTULO 0

METODOLOGÍAS EN EL LABORATORIO
CLÍNICO: EL INMUNOENSAYO

Analia Andradc



El innunocnsayo cs una iccnica analíiica quc sc lasa cn la rcaccion dc
conjugacion aniígcno-aniicucr¡o (Ag-Ac}. Su gran scnsililidad y
cs¡ccificidad ¡crniic la cuaniificacion dc con¡ucsios ¡rcscnics cn
líquidos organicos cn conccniracion rcducida, dcl ordcn dc ng/nl o
¡g/nl. El dcsarrollo dcl innunocnsayo Ia icnido gran in¡acio cn cl
can¡o dc la quínica clínica y dc la cndocrinología.

TIPOS DE INMUNOENSAYO

Inmunoensayo competItIvo.
El aniígcno dc la nucsira y cl aniígcno narcado (Ag¯} sc ¡oncn cn
coniacio con un aniicucr¡o cs¡ccífico cn conccniracion liniianic,
con¡iiicndo ¡or los siiios dc union dcl Ac (figura .1}. Cuanio nas Ag
Iaya cn la nucsira, ncnos Ag¯ sc unira al Ac, ¡or lo quc la ncdida dc
la narca dc la fraccion ligada cs invcrsancnic ¡ro¡orcional a la
conccniracion dc analiio.

Ka
Ag + Ag* + Ac Ag-Ac + Ag*-Ac + Ag + Ag*
Kd


Sicndo Ag cl aniígcno frío (analiio}, Ag¯ cl aniígcno narcado (caniidad
consianic}, Ac cl aniicucr¡o cs¡ccífico cn conccniracion liniianic, Ka
la consianic dc asociacion y Kd la consianic dc disociacion.

FIgura .1. Innunocnsayo con¡ciiiivo


Inmunoensayo no competItIvo (tIpo sandwIcb).
Sc narca cl Ac quc, adcnas, sc anadc cn c×ccso al ncdio dc rcaccion.

Ag + Ac* + Ac Ac-Ag-Ac* + Ac*

El Ag dc la nucsira rcacciona con dos Ac difcrcnics quc sc fijan a
disiinias ¡arics dcl Ag (dollc rcconocinicnio y ¡or lo ianio nayor
scnsililidad} (figura .2}. Uno dc los Ac gcncralncnic csia cn so¡oric
solido ¡ara faciliiar la sc¡aracion dc la fraccion ligada, y cl oiro Ac llcva
la narca.










FIgura 2. Innunocnsayo no con¡ciiiivo (ii¡o sandwicI}

ku
kd
ß=frucción Iigudu
Ag
+
Ac
Ag*
Ag Ac
Ac Ag*
+
Ag
Ag*
F=frucción Iibre
ku
kd
ß=frucción Iigudu
Ag Ag
+
Ac Ac
Ag* Ag*
Ag Ac
Ac Ag*
Ag Ac Ag Ag Ac Ac
Ac Ag*Ac Ac Ag* Ag*
+
Ag Ag
Ag* Ag*
F=frucción Iibre
fuse sóIidu
fuse sóIidu
Anticuerpo A Anticuerpo ß
Anticuerpo A Anticuerpo ß
Anticuerpo C
Anticuerpo ß
A
ß
fuse sóIidu
fuse sóIidu
Anticuerpo A Anticuerpo ß
Anticuerpo A Anticuerpo ß
Anticuerpo C
Anticuerpo ß
A
ß
Los innunocnsayos ii¡o sandwicI son nas scnsillcs quc los
con¡ciiiivos dclido al dollc rcconocinicnio y la ncdida dc la narca dc
la fraccion ligada cs dircciancnic ¡ro¡orcional a la conccniracion dc
analiio. El ¡rinci¡al inconvcnicnic dc un cnsayo innunoncirico ii¡o
sandwicI cs cl ¡osillc cfccio Hool a clcvadas conccniracioncs dc
analiio; consisic cn quc a ncdida quc auncnia la conccniracion dcl
analiio sc ¡roducc una caída ¡aradojica dc la radiaciividad fijada.
En la ialla .1 sc rccogcn los disiinios ii¡os dc innunocnsayo
dc¡cndicndo dc la narca uiilizada. El oljciivo dc csic curso cs csiudiar
con dcicninicnio los innunocnsayos quc uiilizan cono narca un
isoio¡o radioaciivo, ianio los con¡ciiiivos (radioinnunoanalisis} cono
los no con¡ciiiivos o ii¡o sandwicI (IFMA}.

TabIa.1. Ti¡os dc innunocnsayo dc¡cndicndo dc la narca uiilizada.

Marca utIIIzada Inmunoensayo
Isoio¡o radioaciivo Fadioinnunocnsayo / IFMA
Enzina Enzinoinnunoanalsis
Pariícula fluorcsccnic Fluoruroinnunoanalisis
Quinioluninisccnic Ensayo Innunoquinioluninisccnic



RADIOINMUNOANÅLISIS
El radioinnunoanalisis (FIA} Ia sido sin lugar a dudas uno dc los
dcsculrinicnios quc nas Ia coniriluido al ¡rogrcso dc la
cndocrinología. Tccnica iniroducida ¡or Fosalind Yalow y Solonon
Dcrson cn 1956, y ¡ullicada cn 1960 con rclacion a la ncdida dc los
nivclcs circulanics dc insulina cn ¡lasna Iunano. Su dcsculrinicnio
fuc un IccIo foriuiio, al inicniar dcicrninar si ¡acicnics dialciicos
dcsiruían nas ra¡ida o lcniancnic la insulina quc lcs cra
suninisirada. Inycciaron vía iv insulina narcada con un radioisoio¡o
¡ara dcicrninar cl riino dc dcgradacion y clininacion dc la Iornona.
Olscrvaron quc la insulina ¡crnanccía cn cl ¡lasna un iicn¡o nucIo
nayor quc cn sujcios nornalcs, dclido a la ¡rcscncia cn ¡lasna dc
aniicucr¡os aniiinsulina, quc sc unían a la Iornona cn circulacion
in¡idicndo cl ¡aso dc las nolcculas a iravcs dc las ¡arcdcs ca¡ilarcs.
Con los rcsuliados dc csias invcsiigacioncs sc dcnosiro quc la rcaccion
aniígcno-aniicucr¡o ¡odía scrvir dc lasc ¡ara ncdir susiancias
circulanics cn ¡lasna.
El FIA cs un cnsayo dc union con¡ciiiiva quc conlina la
cs¡ccificidad dc una innunorcaccion (con¡lcjo Ag-Ac} con la
scnsililidad dc un nciodo radioquínico. El Ac sc cncucnira cn
conccniracion liniianic.

Isotopos usados en RIA
La vida ncdia dc un isoio¡o cs cl iicn¡o quc iarda cl nuclco original cn
dcsinicgrarsc a la niiad. En la ialla .2 sc indica la vida ncdia y cl ii¡o
dc cnision dc los ¡rinci¡alcs isoio¡os.

TabIa .2. Isoio¡os usados cn FIA.

Isoio¡o Vida ncdia Ti¡o dc cnision
Iodo 131
Iodo 125
Triiio
Colalio 57
Carlono 14
8 días
60 días
12 anos
270 días
5736 anos
β
γ
β
γ
β

CreacIón de una curva estándar.
Sc rcaliza con csiandarcs dc conccniracioncs conocidas y crccicnics
quc sc ¡oncn cn coniacio con la nisna caniidad dc Ag¯ y Ac quc la
nucsira a analizar.
A ncdida quc auncnianos la conccniracion dc Ag csiandar ncnos
caniidad dc Ag narcado sc unc al Ac, ¡or lo quc disninuyc la
radioaciividad. (figura 3A}.

Parámetros de una curva estándar.
Lígudo íncs¡ccì¡íco (NSH).
Es la caniidad dc Ag narcado quc sc unc a oira susiancia cn auscncia
dc Ac. Es cl ligado dcl csiandar dc conccniracion ccro cn auscncia dc
Ac y sc cסrcsa cono %NSD/AT sicndo AT la aciividad ioial. En gcncral
cs dclido a quc cs nuy difícil conscguir una ¡crfccia sc¡aracion cnirc
la fraccion ligada y lilrc

Lígudo nuxíno (Ho).
Es la caniidad dc Ag narcado quc sc unc al Ac cn auscncia dc Ag frío.
Es cl ligado dcl csiandar dc conccniracion ccro y sc cסrcsa cono
%Do/AT. En FIA sc uiilizan Ac con un iíiulo ial quc ligucn
a¡ro×inadancnic alrcdcdor dcl 50% dcl Ag narcado ¡rcscnic con un
rango o¡iino dc union dc cnirc 30-60%. (figura 3l}









FIgura .3. A} Curva csiandar. D} Ligado na×ino


Componentes básIcos deI RIA
Antícuc¡¡o.
Es una ¡roicína dcl sucro ¡roducida ¡or la scric linfoidc, quc ¡cricnccc
a la fanilia dc las innunoglolulinas y quc cs siniciizada cn rcs¡ucsia a
una susiancia ajcna (Ag}. Ticnc la ca¡acidad dc rcaccion con cl Ag o
configuracion aniigcnica rcs¡onsallc dc su ¡roduccion. Podcnos
disiinguir.
• Aniicucr¡os ¡oliclonalcs; siniciizados ¡or nulii¡lcs ¡ollacioncs
dc cclulas ¡roducioras dc Ac y, ¡or ianio, con ligcras difcrcncias
cn sus afinidadcs y cs¡ccificidadcs ¡or cl Ag.
cpm
10000
õ000
7õ00
Zõ00
Concentrución de untígeno
4 ß 1Z 1ó
concentrución
deI unuIito
Cpm
deI unuIito
%ßo/AT
%ßo
100
õ0
0
1
Concentrucion de Ag
Z 3 4 õ
Rungo optimo puru eI Iigudo
má×imo {ßo} entre 30-ó0%
cpm
10000
õ000
7õ00
Zõ00
Concentrución de untígeno
4 ß 1Z 1ó
concentrución
deI unuIito
Cpm
deI unuIito
cpm
10000
õ000
7õ00
Zõ00
Concentrución de untígeno
4 ß 1Z 1ó
concentrución
deI unuIito
Cpm
deI unuIito
%ßo/AT
%ßo
100
õ0
0
1
Concentrucion de Ag
Z 3 4 õ
Rungo optimo puru eI Iigudo
má×imo {ßo} entre 30-ó0%
%ßo/AT
%ßo
100
õ0
0
1
Concentrucion de Ag
Z 3 4 õ
Rungo optimo puru eI Iigudo
má×imo {ßo} entre 30-ó0%
Rungo optimo puru eI Iigudo
má×imo {ßo} entre 30-ó0%
• Aniicucr¡os nonoclonalcs; siniciizados ¡or una ¡ollacion dc
cclulas idcniicas (clon} quc, ¡or ianio ¡roduccn Ac c×aciancnic
igualcs frcnic a un Ag. Esian doiados dc nayor cs¡ccificidad.

Antìgcno.
Es cualquicr susiancia ca¡az dc ¡rovocar la ¡roduccion dc aniicucr¡os.
El gru¡o quínico rcconocido ¡or cl Ac sc dcnonina dcicrninanic
aniigcnico o c¡iio¡o. Es cl analiio quc va a scr ncdido

Antìgcno nu¡cudo.
Es un analiio cscncialncnic idcniico al Ag quc va a scr ncdido, y quc
csia narcado con uno o nas aionos dc un dcicrninado radionuclcido


VaIoracIón de un antIcuerpo.

Tìtuío dcí untícuc¡¡o.
Es aquclla dilucion dcl aniicucr¡o quc liga cl 50% dcl Ag narcado lajo
unas condicioncs dcicrninadas (figura 4}. Sc calcula Iacicndo
dilucioncs scriadas dcl Ac c inculandolas con una caniidad fija dc Ag
narcado, nanicnicndo consianic cl voluncn dc ian¡on, la T y cl
iicn¡o dc inculacion; dcs¡ucs dc la inculacion sc sc¡aran las fascs
lilrc y ligada y sc rcaliza cl coniajc. Sc rc¡rcscnia cl ¡orccniajc dc
ligado (%D/Do} frcnic a las dilucioncs dcl Ac y sc cligc aquclla dilucion
quc liguc cnirc cl 30-50% o licn un cocicnic (D/F} dc 0.7 a 1.5.

A¡ínídud dcí untícuc¡¡o
Es la fucrza con la quc cl Ac liga al Ag y nornalncnic sc cסrcsa cono
consianic dc asociacion. Sc dcfinc la consianic dc afinidad cono la
invcrsa dc la conccniracion nolar dc Ag quc liga o saiura cl 50% dcl Ac,
y ¡ucdc calcularsc ¡or la grafica dc ScaicIard o ¡or la Ii¡crlola dc
MicIaclis-Mcnicn (figura 4}.

K
afinidad
= 1/[Ag].

La avidcz con la quc cl Ac liga al Ag varía dircciancnic con la
consianic dc afinidad dcl Ac.










FIgura .4 Valoracion dc un aniicucr¡o
(iíiulo, afinidad y cs¡ccificidad}



Es¡ccí¡ícídud untícuc¡¡o
Es la ca¡acidad dc un Ac dc disiinguir cnirc varios Ag dc csiruciuras
sinilarcs. Sc ¡rucla ncdianic csiudios dc rcaccion cruzada con oiros
Ag dc csiruciura quínica ¡arccida o dc sinilar rcaciividad
innunologica (figura 4}. En cl caso dc las glico¡roicinas TSH, LH, FSH y
HCC quc iicncn una sulunidad α conun ¡cro sc difcrcncian cn la
sulunidad β, cs ncccsario clcgir un Ac cs¡ccífico frcnic a csa
sulunidad β y confirnar quc no c×isic rcaccion cruzada con las oiras
ircs Iornonas

TIpos de emIsIones radIoactIvas
• α. Pariícula ¡csada quc consisic cn un nuclco dc Iclio con carga
dollc. Son rarancnic usadas cn FIA
• β. Pariícula ¡roccdcnic dcl nuclco, quc iicnc la nisna carga y
nasa quc un clcciron. El iriiio cs cl nas usado cn FIA
AItu
ufinidud,
sensibiIidud
% cpm
õ0
1
concentrución
100
Afinidud unticuerpo
ßugu ufinidud¸
Menor
sensibiIidud
% ß/ßo
100
õ0
0
1/100 DiIución
unticuerpo
1/1000 1/10000
TítuIo unticuerpo % cpm
Concentrución
Especificidud unticuerpo
FSH
LH
TSH
HCS
Ac generudo frente β ββ βHCS
AItu
ufinidud,
sensibiIidud
% cpm
õ0
1
concentrución
100
Afinidud unticuerpo
ßugu ufinidud¸
Menor
sensibiIidud
% ß/ßo
100
õ0
0
1/100 DiIución
unticuerpo
1/1000 1/10000
TítuIo unticuerpo % cpm
Concentrución
Especificidud unticuerpo
FSH
LH
TSH
HCS
Ac generudo frente β ββ βHCS
• γ: Fadiaccion clccironagnciica sinilar a los rayos X y sc origina
cuando las ¡ariículas dcl nuclco canlian dc csiado cncrgciico.
Sc usan fundancnialncnic cn FIA cl
125
I y cl
57
Co

TIpos de radIoInmunoensayo
Mctodos dc EquíííI¡ío.
Sc rcaliza una sola inculacion cn la quc sc inculan conjuniancnic los
Ag frío y narcado con cl Ac, con¡iiicndo anlos ¡or los siiios dc union
dc csic.

Mctodos dc no cquíííI¡ío
• Mciodo sccucncial. Sc rcaliza cn dos ¡asos. Princro sc incula cl
Ag frío con cl Ac cn c×ccso, y dcs¡ucs sc anadc dcs¡ucs cl Ag¯
¡ara con¡lciar la saiuracion dcl Ac. Sc consiguc nayor
scnsililidad
• Mciodo dc dcs¡lazanicnio. Sc incula cl Ag¯ con cl Ac y
¡osicriorncnic sc anadc cl Ag frío quc dcs¡laza al Ag¯ dcl
con¡lcjo

Métodos de separacIón de Ia IraccIón IIbre y IIgada.
El nciodo dc sc¡aracion idcal scra aqucl quc.
• consiga una con¡lcia sc¡aracion dc las fraccioncs ligada y lilrc
• no csic influcnciado ¡or cl sucro u oiras susiancias no cs¡ccíficas
• sca rc¡roduciillc, scncillo, laraio y iccnicancnic ra¡ido
• no inicrficra con la rcaccion Ag-Ac


Mctodos dc udso¡cíòn dc untìgcno ííI¡c
Los ¡rinci¡alcs nciodos dc adsorcion dcl aniígcno lilrc son los quc
uiilizan cIu¡couí aciivo, cIu¡couí rcvcsiido dc dc×irano, silicaios (ialco,
fluorisil} y rcsinas dc Inicrcanlio ionico
Los nciodos dc cIu¡couí aciivado y cIu¡couí rcculicrio con dc×irano
son nciodos sin¡lcs, ra¡idos y laraios. Consisicn cn la adsorcion dcl
Ag lilrc cn la su¡crficic ¡orosa dcl carlon vcgcial financnic
¡ulvcrizado. La adsorcion cs dc¡cndicnic dcl ¡H, icn¡craiura y iicn¡o
dc coniacio. La sc¡aracion dc anlas fascs sc ¡roducc ¡or
ccnirifugacion. La fraccion lilrc cs adsorlida ¡or cl cIu¡couí y la ligada
qucda cn cl solrcnadanic iras la ccnirifugacion. Cuando ncdinos
cnisorcs β csic nciodo cs nuy uiil ¡orquc cl solrcnadanic ¡ucdc scr
anadido dircciancnic cn los frascos dc ncdida con cl líquido dc
ccnicllco. Al scr un ¡roccso ¡urancnic físico dc adsorcion, no cs
sclcciivo y ¡ucdc ¡rcci¡iiar cl con¡lcjo Ag-Ac. Sc cviia iraiando cl
cIu¡couí cn su su¡crficic con un ¡olíncro cono cl dc×irano quc inIilc
alguna dc sus zonas aciivas. Sc usa con c×iio cuando la fraccion lilrc y
ligada iicncn difcrcncias grandcs dc ianano y carga.
Scgun cl PM dcl dc×irano quc lo rcculrc icndrcnos.
• dc×iran 10, dc PM 10000, adsorlc nolcculas ¡cqucnas cono la
angioicnsina.
• dc×iran 80, dc PM 80000, adsorlc nolcculas dc ianano ncdio
cono la insulina.
• dc×iran 250, dc PM 250000, adsorlc nolcculas cono la Iornona
dc crccinicnio.

Mctodos dc ¡¡ccí¡ítucíòn dcí con¡íc¡o Ag-Ac
Los nciodos dc ¡rcci¡iiacion nas uiilizados son salcs inorganicas
(SO4NH4 - SO4Na2}, ¡oliciilcnglicol (PEC}, cianol, los nciodos dc dollc
aniicucr¡o y cl nciodo dc la ¡roicína A
La ¡rcci¡iiacion dcl con¡lcjo Ag-Ac ¡or salcs inorganicas o ¡or
solvcnics organicos uiiliza salcs ncuiras o solvcnics organicos cono
cianol, PEC y sulfaios organicos. A clcvadas conccniracioncs csios
con¡ucsios quc son Iidrofílicos aira¡an las nolcculas dc agua dc la
solucion, insolulilizando cl con¡lcjo quc ¡rcci¡iia. La sc¡aracion cs
scnsillc a variacioncs cn la nolaridad dc la sal y dc los solvcnics. Las
conccniracioncs o¡iinas dc csios agcnics son. 40-50% dc sulfaio
anonico, 12-20% dc PEC y 30-50% dc cianol. Es un nciodo nuy
dc¡cndicnic dc la conccniracion dc ¡roicínas dc las nucsiras a ncdir y
¡ucdc dar falsos rcsuliados cn casos dc dis¡roicincnias cono la
cnfcrncdad dc Waldcnsiron o cn sucros dc ¡acicnics dializados. Esio
sc con¡cnsa anadicndo sucro c×cnio a iodas las nucsiras anics dc la
sc¡aracion con PEC
El nciodo dcl dollc aniicucr¡o cs la iccnica dc sc¡aracion dc las dc
nayor c×iio cn FIA. Sc ¡rcci¡iia cl con¡lcjo Ag¯-Ac con un scgundo Ac
dirigido conira cl ¡rincro, quc ¡roducc un con¡lcjo insolullc Ag¯-Ac1-
Ac2. Para o¡iinizar la ¡rcci¡iiacion dcl con¡lcjo final c incrcncniar la
nasa dcl ¡rcci¡iiado, sc anadc sucro nornal dc las cs¡ccics dcl Ac1.
E×isicn divcrsas varianics dcl nciodo dcl dollc aniicucr¡o cono son
las iccnicas dc ¡osi¡rcci¡iiacion y las iccnicas dc ¡rc¡rcci¡iiacion. Las
icccnicas dc ¡osi¡rcci¡iiacion uiilizan una dollc inculacion.
• dollc aniicucr¡o cn fasc solida. sc anadc al con¡lcjo Ag¯-Ac1 un
Ac2 unido a una nairiz cn fasc solida dc gran PM (cclulosa o
scfarosa}. Fcquicrc agiiacion coniinua ¡or lo quc cs lcnio, ¡cro
sc¡ara nuy licn.
• dollc aniicucr¡o + PEC. Acoria cl iicn¡o dc inculacion
Las iccnicas dc ¡rc¡rcci¡iiacion uiilizan una sola inculacion. En csic
caso, cl scgundo Ac csia unido a una fasc solida
El nciodo dc la ¡roicina A cs un ¡roccdinicnio sinilar al dcl dollc
aniicucr¡o. Es un nciodo ian scnsillc cono cl dcl dollc aniicucr¡o. La
¡roicina A cs una ¡roicína quc csia adosada a la ¡arcd cclular dc la
lacicria Estu¡ííococus uu¡cus y quc ¡rcscnia cuairo lugarcs dc
rccc¡cion cs¡ccíficos ¡ara la rcgion Fc dc la IgC Iunana, fornando
con¡lcjos csiallcs. Cada lacicria iicnc a¡ro×inadancnic 80.000
¡roicínas A y cada una dc cllas 4 lugarcs dc rccc¡cion ¡or lo quc
icndrcnos cn cada lacicria ccrca dc 320.000 siiios dc union.


Mctodos dc sc¡u¡ucíòn cn ¡usc sòíídu
El radioinnunocnsayo cn fasc solida ¡crniic una sin¡lc sc¡aracion
cnirc las fascs ligada y lilrc, ya quc cl Ac cs adsorlido o ligado
quínicancnic a una nairiz solida insolullc, con lo quc la sc¡aracion dc
las fascs ligada y lilrc no rcquicrc ccnirifugacion. Los sisicnas nas
uiilizados son los iulos rcvcsiidos dc aniicucr¡o (iulos coutcd} y los
aniicucr¡o adsorlidos a csfcras o discos.
Los iulos rcvcsiidos dc aniicucr¡o son iulos dc ¡oli¡ro¡ilcno o
¡olicsiircno quc sc cסoncn a una a¡ro¡iada dilucion dc aniicucr¡o
duranic unas Ioras, sc lavan y sc uiilizan ¡ara cl FIA. El aniicucr¡o sc
adIicrc a la su¡crficic dcl ¡lasiico dclido a las inicraccioncs no
covalcnics, no cs¡ccíficas c Iidrofolicas. Esia union no dclc inicrfcrir
cn la rcaccion ¡rinaria Ag-Ac
Las condicioncs o¡iinas dc adsorcion dcl Ac a las ¡arcdcs dcl iulo
son.
• ¡H. Las inicraccioncs Iidrofolicas ocurrcn cuando la carga ncia
dc la nolccula cs 0, ¡ara la IgC sc da a ¡H cnirc 8.5-10.
• fucrza ionica. Las inicraccioncs Iidrofolicas son ¡ronovidas ¡or
conccniracioncs dc salcs ca¡accs dc ncuiralizar las ¡roicínas
cargadas.
• icn¡craiura. A nayor icn¡craiura nayor vclocidad dc difusion
auncniando la ¡rolalilidad dc quc las nolcculas dc ¡roicínas
cnircn cn coniacio con la su¡crficic dc la fasc solida.
• conccniracion dc ¡roicína.
• alnaccnanicnio dc los iulos. Dclc scr a 4°C.
• iraianicnio ¡rcvio dc los iulos. Los iulos dc ¡lasiico ¡ucdcn
iraiarsc con gluiaraldcIido ¡ara unir covalcnicncnic los Ac a las
¡arcdcs.
• Ticn¡o. Ccncralncnic cs un ¡roccso ra¡ido si sc usan nivclcs
saiuranics dc ¡roicínas.


Mctodos udícíonuícs
• Filiracion cn Ccl. Dclido a quc las nolcculas dcl con¡lcjo Ag-Ac
son dc nayor ianano quc los Ag lilrcs, ¡odcnos sc¡ararlos
uiilizando filiracion cn gcl con rcsinas y dc×iranos (Sc¡Iadc×}.
Esias colunnas cronaiograficas sc¡aran nczclas dc nolcculas
dc¡cndicndo dc su ¡cso nolccular. La fraccion ligada airavicsa
ra¡idancnic la colunna, sin cnlargo la lilrc qucda aira¡ada cn
los ¡oros nicrosco¡icos dcl gcl, sicndo inIilido su flujo.
• Elcciroforcsis
• Ccl dc ¡oliacrilanida

Factores que InIIuyen en eI RIA
• ¡H. Los ¡H c×ircnos disocian cl con¡lcjo Ag-Ac.
• fucrza ionica. cicrias conccniracioncs dc salcs ¡ucdcn inIilir la
rcaccion Ag-Ac, Por cllo cl Iu¡¡c¡ dclc icncr la nisna
conccniracion salina quc los ¡rollcnas.
• icn¡craiura. La rcaccion Ag-Ac cs dc¡cndicnic dc icn¡craiura,
gcncralncnic sc oliicncn nayorcs ligados si las nucsiras sc
inculan a 4°C y sc rcaliza la sc¡aracion dc fascs a csa
icn¡craiura.
• aniicoagulanics. Pucdcn inIilir la rcaccion Ag-Ac y la sc¡aracion
dc las fascs lilrc y ligada.

CrIterIos de vaIIdez deI RIA.
P¡ccísíòn.
Crado cn quc una scric dc ncdidas dc una nisna nucsira dificrcn dc
la ncdia. Sc cסrcsa cono CV, y dclc csiudiarsc a difcrcnics nivclcs dc
la curva.
• Fc¡roduciililidad iniracnsayo. sc acc¡ia 5-10%
• Fc¡roduciililidad inicrcnsayo. sc acc¡ia 5-15%

Exuctítud.
Crado cn quc una caniidad ncdida corrcs¡ondc con la caniidad
¡rcscnic cn la nucsira. Sc Iaccn dos csiudios dc c×aciiiud.
• Fccu¡cracion: dclc cvaluarsc cn los rangos críiicos dcl cnsayo.
lajo, ncdio y alio. A un sucro lilrc dc susiancia o dc
conccniracion conocida sc lc anadcn conccniracioncs crccicnics
dc susiancia ¡ura, rcalizandosc cl FIA y calculando la dosis
cs¡crada.
% recuperación = % dosis observada / % dosis esperada

• Paralclisno: La conducia innunoquínica dc csiandarcs y
nucsiras dclc scr idcniica, aunquc ¡ucdan scr disiinios
csiruciuralncnic. Sc Iaccn dilucioncs scriadas dc la nucsira, sc
rcaliza cl cnsayo FIA. Si las dos curvas son idcniicas o ¡aralclas
indica quc cl aniicucr¡o rcconocc innunologicancnic la nisna
csiruciura ianio ¡ara la nucsira dcsconocida quc ¡ara cl
csiandar. Si no Iay ¡aralclisno indica ¡rcscncia dc susiancias
quc ¡roduccn rcaciividad cruzada, lo quc olliga a ¡asos ¡rcvios
dc ¡urificacion

Es¡ccí¡ícídud.
Ca¡acidad dc discrininar cnirc dos csiruciuras sinilarcs. Los csiudios
dc cs¡ccificidad dc¡cndcn dc la susiancia a ncdir y dc su rango dc
conccniracion y sc Iaccn calculando cl ¡orccniajc dc rcaccion cruzada
con oiras susiancias o fragncnios. La aciividad innunologica dc
Iornonas y ¡rccursorcs cs scncjanic ¡cro no rcflcja la aciividad
liologica y ¡or lo ianio ¡ucdc no rcflcjar cn vivo la funcion dc la
glandula y alicrar la inicr¡rciacion clínica dc los rcsuliados. Para
ncjorar la cs¡ccificidad dc un FIA cs in¡orianic.
• Purificar la nucsira ¡rcviancnic al cnsayo ¡or c×iraccion con
solvcnics, cronaiografía cic.
• Dloqucar los aniicucr¡os ncnos cs¡ccíficos con una susiancia
incluida cn cl aniisucro quc ¡roduzca rcaciividad cruzada

ScnsíIííídud.
La scnsililidad analíiica cs la nas ¡cqucna caniidad dc Ag no narcado
quc ¡ucdc scr disiinguida dcl csiandar 0. Es cl líniic dc dcicccion dcl
cnsayo y sc dcicrnina calculando la ¡rccision dcl csiandar 0, sc
¡roccsa 20 vcccs y sc calcula la ncdia y ircs dcsviacioncs csiandar (DE}
dc las cucnias ¡or ninuio (c¡n} dcl csiandar dc conccniracion 0. La
scnsililidad dc¡cndc dc.
• la afinidad dcl Ac ¡or cl Ag, ya quc la nínina conccniracion dc Ag
dcicciallc sc a¡ro×ina al rccí¡roco dc la consianic dc afinidad.
• la aciividad cs¡ccífica dcl Ag narcado.
• cl voluncn ncdio dc inculacion, cl ¡H dcl ncdio y la T° dc
inculacion.
• la ¡rccision dcl analisis.
• la rcalizacion dc analisis cn dos cia¡as.
La scnsililidad funcional cs la ncnor conccniracion quc un cnsayo
cs ca¡az dc dcicciar con un cocficicnic dc variacion inicrcnsayo dcl
20%.

TratamIento de datos
Fcalizado cl ¡roccso dcl FIA y la sc¡aracion dc las fascs ligada y lilrc,
sc ¡roccdc al coniajc isoio¡ico. En la nayor ¡aric dc los cnsayos sc
cucnia la fraccion ligada cn c¡n y sc dis¡onc dc una varicdad dc
rcs¡ucsias ¡ara la convcrsion dc daios.
D ÷ c¡n dc la fraccion ligada
F ÷ c¡n dc la fraccion lilrc
Do ÷ c¡n dcl csiandar dc conccniracion 0 (Si 0}
AT ÷ c¡n ioialcs (AT ÷D+F}
%D/AT ÷ (c¡n nucsira - c¡n NSD} / AT
%D/Do ÷ (c¡n nucsira - c¡n NSD} / (c¡n Si 0 - c¡n NSD}
%D/F ÷ ¡orccniajc dc cucnias dc la fraccion lilrc



Métodos manuaIes de ajuste curva RIA
Cu¡uu Ií¡c¡Iòíícu.
Sc rc¡rcscnia cn cl cjc dc ordcnadas %D/AT, %D/Do, o %D/F, y cn cl
cjc dc alscisas la conccniracion dc Ag, sicndo lincalcs las dos cscalas.
El nciodo cs scncillo ¡cro cl crror Iunano al dilujar la curva in¡idc
cualquicr csiadísiica dc conirol dc calidad

Cu¡uu sígnoíduí.
Sc rc¡rcscnia cn cl cjc dc ordcnadas %D/AT, %D/Do, o %D/F y cn cl
cjc dc alscisas cl logariino dc la conccniracion dc Ag. El uso dc la
cscala logaríinica ¡roducc un cndcrczanicnio dc la curva Ii¡crlolica
olicnicndosc una curva signoidal. La ¡rinci¡al vcniaja cs cl ncjor
ajusic ya quc la ¡orcion ccniral cs casi lincal, ¡cro iicnc cl nisno
inconvcnicnic dc la anicrior

Cu¡uu ¡ccì¡¡ocu.
Inicnia lincarizar las dos anicriorcs rc¡rcscniando cn cl cjc dc las
ordcnadas los rccí¡rocos dc %D/AT, %D/Do, o %D/F, frcnic a las
conccniracioncs dc Ag cn cscala lincal. El nciodo cs scncillo, ra¡ido y
lincal ¡cro solo dclcría uiilizarsc ¡ara un FIA cn quc los siiios dc union
al Ac csian saiurados.

ProcesamIento de datos por ordenador
Los coniadorcs dc ccnicllco llcvan incor¡orados un sofiwarc ¡ara cl
¡roccsanicnio dc los daios. A¡oria grandcs vcniajas cono vclocidad,
ncjora cn la c×aciiiud y ¡rccision, conirol dc calidad adicional y
adcnas un analisis dc la curva csiandar a iravcs dc.
• ¡cndicnic, cocficicnic corrclacion y dosis csiinada al 20, 50 y
80%.
• ¡rccision dc du¡licados.
• líniic dc confianza dcl 95%.
• no csiinacion dc ¡unios fucra dc la curva duranic cl irazado.
• con¡aracion con curvas ¡rcvias a iravcs dc la ¡cndicnic y corics.
• csiinacion dc la nínina dosis csiinada.
Hay nucIos nciodos dc convcrsion dc daios FIA, ¡cro los nas
uiilizados son.

Líncuíízucíòn íogít-íog.
Es cl nciodo dc ajusic nas uiilizado cn la aciualidad. Sc rc¡rcscnia cn
cl cjc dc ordcnadas cl logii dc D/Do y cn cl cjc dc alscisas cl logariino
dc la conccniracion dc Ag. El logii cs una fornula naicnaiica quc sc
cסrcsa cono.

logit B/Bo = log [( B/Bo/ (1-B/Bo)].

Hay quc icncr cn cucnia quc auncnia los crrorcs cn los c×ircnos dc
la curva. Dclc usarsc cl ucígItíng, quc cs una iccnica naicnaiica quc
conccdc nas in¡oriancia a los lucnos du¡licados quc a los nalos,
icndicndo a nininizar cl cfccio dc los daios con an¡lia dis¡crsion
duranic cl calculo dc la rcgrcsion lincal.

Cu¡uu dc u¡ustc S¡íínc.
En csic nodclo dc ajusic la curva no cs olligada a airavcsar los ¡unios
dc la curva cono cn cl logii-log y ¡ro¡orciona un lucn ajusic ¡ara
curvas dc forna irrcgular.

Modcío cuut¡o ¡u¡unct¡os íogìstícos.
Es un nodclo nas vcrsaiil quc cl logii-log (dos ¡aranciros}, y quc
ncccsiia cuairo ¡aranciros ¡ara dilujar la curva.

Y = [(a-d) / 1 + (x/c) b]- d
Sicndo × la dosis o conccniracion, a cl facior dc rcs¡ucsia cuando × ÷ 0,
l cl facior dc ¡cndicnic, c cl coric al 50% y d una a¡ro×inacion a los
NSD. Esic nodclo iicnc una gran a¡licalilidad ¡ara un gran nuncro dc
¡roccsos FIA y cl coric al 50% cs uiil ¡ara cl calculo dc daios dc la
rcaciividad cruzada.


FUNDAMENTO DEL CONTADOR GAMMA

Uiiliza un crisial dc ioduro sodico aciivado con irazas dc ialio, cl
dianciro dcl crisial cs nornalncnic cnirc 5 y 7.5 cn. Cuando cl crisial
solido alsorlc la radiacion ionizanic sc ¡roducc un ¡ulso dc luz dc
coria duracion. El nuncro dc ¡ulsos dc luz cs una ncdida dc la
frccucncia dc la dcsinicgracion isoio¡ica (dcsinicgracioncs ¡or ninuio,
d¡n}. El crisial convicric la radiacion ganna cniiida ¡or cl isoio¡o cn
luz visillc con una longiiud dc onda dc 410 nn, algo dc csia luz incidc
cn cl caiodo dc un iulo foionulii¡licador y causa cnision dc clccironcs
quc son an¡lificados ¡or un facior dc 10
5
a 10
8
. Los ¡íusIcs dc luz sc
cucnian cn c¡n.

ControI caIIdad contador gammma
Fondo
El coniajc dc un iulo vacío dclc dar ncnos dc 70 c¡n. Un coniajc dc
fondo alio indicaría conianinacion dc la fucnic ¡or isoio¡os, vial o iulo
conianinado, siiuacion ina¡ro¡iada dcl coniador o ¡osillcs fallos cn cl
con¡oncnic clccironico

P¡ccísíòn
El coniador dclc scr rc¡roducillc y ¡ara cllo cl CV dc una nucsira
coniada 20 vcccs dclc scr ncnor dcl 1%

E¡ícucíu
La cficacia sc conirola ncdianic cl coniajc dc una fucnic dc
radioaciividad dc unas d¡n conocidas.

% de eficiencia = (cpm / dpm)x100

Para cl
125
I la cficacia dclc scr dcl 80-90%
Para cl iriiio la cficacia dclc dc scr dcl 35-45%.


ENSAYO INMUNORADIOMÉTRICO (IRMA)

Ensayo no con¡ciiiivo o ii¡o sandwicI, nas scnsillc y ¡rcciso quc cl
FIA. El Aniígcno (Ag} dc la nucsira rcacciona con dos Aniicucr¡os (Ac}
difcrcnics quc sc fijan a disiinias ¡arics dcl Ag (dollc rcconocinicnio y
¡or lo ianio nayor scnsililidad}. Uno dc los Ac gcncralncnic cn so¡oric
solido ¡ara faciliiar la sc¡aracion dc la fraccion ligada, y cl oiro Ac
narcado con un isoio¡o radioaciivo (gcncralncnic
125
I} quc adcnas sc
anadc cn c×ccso al ncdio dc rcaccion.

Ag + Ac* + Ac Ac-Ag-Ac* + Ac*

La radiaciividad dc la fraccion ligada cs dircciancnic ¡ro¡orcional a
la conccniracion dcl analiio cn la nucsira (figura .5A}. El ¡rinci¡al
inconvcnicnic dc un cnsayo innunoncirico ii¡o sandwicI cs cl ya
ncncionado cfccio Hool (figura. 5D}.














FIgura. S A} Curva dc calilrado ¡ara un IFMA. D} Efccio Hool cn un IFMA.


BIBLIOGRAFIA
Berson SA, YaIow RS, Bauman A, RotbscbIId MA 1956 Insulin-I-131 ncialolisn in
Iunan suljcis; dcnosiraiion of insulin linding glolulin in iIc circulaiion of insulin
iraicd suljcis. J Clin Invcsi 35.170.
Berson SA, YaIow RS 1957 linciics of rcaiion lciwccn insulin and insulin-linding
aniilody. J Clin Invcsi 36.873.
Burrows BA, Peters T, LoweII FC 1957 PIysical linding of insulin ly ganna
glolulins of insulin-rcsisianis suljccis. J Clin Invcsi 36.393.
EkIns RP, Newman CB 1968 TIc o¡iinisaiion of ¡rccision and scnsiiivy in iIc
radioinnunoassay nciIod. In ¡roicin and ¡oly¡c¡iidc Iornoncs ¡ar 2. E×ccr¡ia
Mcdica.
Greenwood FC, Hunter WM, GIover JS 1963 TIc ¡rc¡araiion of 131-I-lalcllcd
Iunan growiI Iornonc of IigI s¡ccific radioaciiviiy. DiocIcn J 89.114.
Hurn BAL, Landon J 1971 Aniiscra for radioinnunoassay. In Fadioinnunoassay
MciIods. Livingsionc.
Nugent CA, Mayes DM 1966 Plasna coriicosicroids dcicrnincd ly usc of
coriicosicroids-linding glolulin and dc×iran-coaicd cIarcoal. J Clin Endocrinol Mcial
26.1116.
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0¸õ õ0¸0 õ¸0 1¸õ 1õ¸0
hSH {ng/mL}
OdeII WD, Abrabam G, Raud HR, SwerdoII RS, FIsber DA 1969 Influcncc of
innunizaiion ¡roccdurcs on iIc iiicr, affiniiy, and s¡ccificiiy of aniiscra io
glyco¡oly¡c¡iidcs. Acia Endocrinol 142.54.
Rodbard D, RayIord PL, Cooper JA, Ross GT 1968 Siaiiscal qualiiy conirol of
radioinnunoassay. J Clin Endocrinol Mcial 28.1412.
YaIow RS, Berson SA 1957 A¡¡arcni inIiliiion of livcr insulinasa aciiviiy ly scrun
and scrun fraciions coniaining insulin-linding aniilody J Clin Invcsi 36.648,
Dcrson SA, Yalow FS 1968 Ccnaral ¡rinci¡lcs of radioinnunoassay. Clin CIin Acia
22.51.
Werner CK, CargIIIe CM 1971 Fadioinnunoassay a sin¡lificd ¡roccdurc for dosc
inicr¡olaiion. J Lal Clin Mcd 77.661.
Fodcar D, Dridson W, Fayford P 1969 Fa¡id calculaiion of radioinnunoassay rcsulis.
J Lal Clin Mcd 74.770.




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