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apunte de PCR

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  • INTRODUCCIÓN
  • HISTORIA Y DESARROLLO
  • Componentes de la reacción
  • Primers
  • Especificidad
  • Contenido de G/C
  • Secuencia de los extremos 3'
  • Temperatura de Asociación
  • Cálculo de la temperatura de fusión (Tm)
  • Programas de Diseño de Primers
  • Templado
  • La polimerasa
  • Concentración de Magnesio
  • Otros componentes de la reacción
  • Parámetros de la reacción
  • Desnaturalización
  • Alineamiento
  • Termocicladores
  • Identificación de los productos de PCR
  • RT PCR
  • PCR EN TIEMPO REAL
  • Técnicas de detección
  • SYBR greenTM
  • Hairpin probes (Molecular BeaconsTM
  • Hybridization probes
  • Scorpions
  • Cuantificación
  • Genes estándares
  • El efecto de limitar los reactivos
  • PCR competitivos cuantitativos
  • Máquinas para PCR en tiempo real
  • Ventajas del tiempo Real
  • PRIMERS DEGENERADOS
  • Uso de los primers degenerados
  • Diseño de los primers degenerados
  • Alineación de la secuencia
  • Información de la secuencia terminal de aminoácidos
  • Degeneración de primers
  • La Reacción de PCR
  • El cóctel de PCR
  • Problemas Comunes
  • Secuenciación
  • Controles
  • Aspectos Generales
  • Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600
  • Hot Start
  • PCR in situ
  • Nested PCR
  • CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR
  • Clonación TA
  • Clonación de extremos romos
  • Clonación direccional a través de primers modificados
  • Clonación de fragmentos largos de DNA
  • MUTAGÉNESIS POR PCR
  • Mutagénesis con PCR-extensión solapada
  • Mutagénesis sitio dirigida
  • APLICACIONES ESPECIALES DE LA PCR
  • BIBLIOGRAFÍA

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS EN BIOTECNOLOGÍA PCR ALUMNOS: CORTAZAR MARTÍNEZ ADRIANA

SILVA RINCÓN ELSA PATRICIA JUNIO, 2004

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ÍNDICE Introducción Historia y Desarrollo Metodología básica Componentes de la reacción Nucleótidos Primers Especificidad Secuencias complementarias Contenido de G/C Secuencia de los extremos 3’ Temperatura de asociación Cálculo de la temperatura de fusión (Tm) Programas de Diseño de Primers Templado Polimerasa Concentración de Magnesio Otros componentes de la reacción Parámetros de la reacción Desnaturalización Alineamiento Extensión Número de ciclos Termocicladores Identificación de los productos de PCR RT PCR PCR en tiempo real Técnicas de detección SYBR greenTM Hydrolysis probes Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Hybridization probes Scorpions Cuantificación Genes estándares El efecto de limitar los reactivos PCR competitivos cuantitativos Máquinas para PCR en tiempo real Ventajas del tiempo Real Primers Degenerados Uso de los primers degenerados Diseño de los primers degenerados Alineación de la secuencia Información de la secuencia terminal de aminoácidos Degeneración de primers 1 2 4 4 4 5 6 6 6 6 6 7 7 8 8 9 9 9 10 10 11 11 12 13 15 16 17 17 18 18 19 20 21 24 24 25 26 27 28 28 29 29 29 29

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La reacción de PCR El cóct el de PCR Los ciclos de PCR (el termociclador) Problemas comunes Secuenciación Controles Long PCR Aspectos Generales Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 Hot Start PCR in situ Principios y Métodos Otras variantes de la PCR Multiplex PCR Nested PCR Clonación de productos de PCR Clonación TA Clonación de extremos romos Clonación direccional a través de primers modificados. Clonación de fragmentos largos de DNA Mutagénesis por PCR Mutagénesis con PCR-extensión solapada Mutagénesis sitio dirigida Aplicaciones especiales de la PCR Bibliografía

29 29 29 30 30 30 30 31 32 32 32 32 33 33 34 34 35 36 36 37 37 37 38 39 40

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INTRODUCCIÓN La biotecnología, en un sentido amplio se puede definir como la aplicación de organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y servicios. La Ingeniería Genética (I.G.), conocida como tecnología del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho. No cabe ninguna duda de que la técnica más revolucionaria de los últimos 15 años ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propia Ingeniería genética y a toda la biología molecular. Fue inventada por Kary Mullis a mediados de los años 80. Muchas de las técnicas clásicas de la Ingeniería genética estaban encaminadas a resolver el complejo problema de cómo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN. Sin embargo, esas técnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no den resultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en principio producir in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la clonación en un organismo huésped. Esencialmente la técnica permite la amplificación selectiva de cualquier segmento de ADN, conociendo las secuencias que lo flanquean. Como alguien ha dicho, "es una técnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un pajar de agujas por amplificación selectiva". Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son prácticamente ilimitadas:
• • • • • • • •

simplifica muchos experimentos de I.G. permite muchos estudios de expresión genética secuenciación directa de secuencias amplificadas detección de mutaciones seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades diagnósticos de enfermedades genéticas e infecciosas en ciencia forense: identificación de restos biológicos, determinación de paternidad, pruebas periciales en criminalística en arqueología y paleontología

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etcétera. Estas técnicas. Su uso se extendió rápidamente a miles de laboratorios. K.HISTORIA Y DESARROLLO Kary Mullis Hasta mediados de la década del ochenta. han permitido el aislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de microorganismos. Este método revolucionaría en corto tiempo el conjunto de técnicas de la biología molecular. se pueden diseñar métodos para identificar qué bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. sino que también se puede estudiar su expresión (la manera en que dirige la síntesis de la proteína correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares. En este caso se reconoce la bacteria portadora porque fabrica la proteína codificada por el fragmento de interés. Éstos son moléculas de ADN (plásmidos o ADN de bacteriófagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de multiplicarlos dentro de bacterias. Este reconocimiento también se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la proteína resultante del gen que se desea clonar. Una vez aislado el gen no sólo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de bases o analizar en detalle la información de la que es portador. no sólo de investigación básica. Se trata de la reacción en cadena de la polimerasa. animales y plantas. la única estrategia posible para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". introducido en células en cultivo o en animales de experimentación. Si se conoce un pequeño tramo de la secuencia de aminoácidos de una proteína cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar). sino también de diagnóstico clínico. ya clásicas. siglas provenientes del inglés Polymerase Chain Reaction. lo que provocó un cambio cualitativo en la comprensión del funcionamiento de la célula. Este método se basa en la introducción de fragmentos de ADN. la cual se une específicamente al anticuerpo. inventó un método para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores y su replicación en bacterias. 2 . uno de los cuales contendrá el gen de interés. un investigador de la Corporación Cetus. Mullis. En 1985. ya muy conocida como PCR. en vectores.

"Mr. poniendo el fundamento para la PCR en tiempo real o PCR "cinético" (pruebas TaqMan). actúa eficientemente entre los 75°C y los 80°C y resiste más de dos horas a 93°C. Cetus se asoció con la corporación Perkin-Elmer e introdujo la DNA Termal Cycler. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro. Cuando el proceso era manual la técnica de PCR era lenta y requería de trabajo intensivo. Por lo tanto. adquiere los derechos y las patentes mundiales de la PCR. por lo cual debía agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. El Dr. En 1990. este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplazó por su equivalente de la bacteria "termófila" Thermus aquaticus. La purificación de la polimerasa de Taq dio lugar a la necesidad de una máquina que realizara un ciclo más rápidamente entre diversas temperaturas. En efecto. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura requerida para desnaturalizar la doble cadena del ADN. 3 . los científicos de Cetus comenzaron a buscar las maneras de automatizar el proceso. la ADN polimerasa de este microrganismo. Para replicar el ADN. Cycle" fue creada por los ingenieros de Cetus para tratar esa necesidad de agregar la enzima fresca a cada tubo de prueba después del calentamiento y del proceso de enfriamiento. en realidad. Cetus anunció un acuerdo de colaborar con Hoffman-LaRoche en el desarrollo y la comercialización de productos de diagnóstico humanos in vitro y de servicios basados en tecnología de PCR. En 1989. Kary Mullis comparte el premio Nobel de Química en 1993 por inventar la tecnología de PCR. la técnica PCR hizo uso.Esta técnica permite multiplicar ("amplificar" es. En 1985. denominada Taq polimerasa. el término que se ha impuesto) pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. de la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. Sin embargo. De esta manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reacción en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarán los ciclos térmicos programados. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. los científicos alcanzan la primera amplificación y detección simultánea de las secuencias específicas de DNA usando un colorante fluorescente. en un principio. En 1991 Hoffmann-La Roche Inc. La primera máquina termocicladora. sino que puede ser parte de mezclas complejas.

concentración final) . la solución debe ser protegida (por ejemplo con el 10mM Tris pH 7. Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP. 4 .7-8.0 . alicuotados y almacenados a -20 ºC.METODOLOGÍA BÁSICA Componentes de la reacción Los nucleótidos Los nucleótidos se diluyen en agua. un pH ácido promoverá la hidrólisis del dNTP en dNDP y dNMP y los hará inútiles para las reacciones de polimerización de la DNA enzimática. La estabilidad de los dNTP durante ciclos repetidos de PCR es tal que aproximadamente el 50% permanece como dNTP después de 50 ciclos. Los stocks son diluidos a 10 mM. Si no.

La selección de oligonucleótidos iniciadores es muy importante en la reacción en cadena de la polimerasa.Concentraciones entre 20 y 200 µM resultan en un balance óptimo entre rendimiento. o secuencias promotoras en la secuencia blanco. Los productos no específicos y los dímeros de primers son por si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por la enzima. Altas concentraciones de primer pueden promover “mispriming” y acumulación de producto no específico y puede incrementar la probabilidad de generar un templado independiente llamado dímero de primer. Los cuatro dNTP deben ser usados en concentraciones equivalentes para minimizar errores de incorporación de bases. un codón de inicio ATG.6 µg de DNA o 100 pM de una secuencia de 400 bp. 20 µM de cada dNTP en una reacción de 100 µl es suficiente para sintetizar 2. Por ejemplo. Es recomendable que el cebador "forward" se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia que codifica. Tabla 1. Pueden ser usados primers degenerados para extraer genes nuevos en base a su similitud o su secuencia de aminoácidos. de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb despues de la región que codifica. resultando en un bajo rendimiento del producto deseado. Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5’ o “mismatches” para incorporar sitios de enzimas de restricción. De este paso depende el éxito en el laboratorio. Se debe decidir la mas baja concentración adecuad de dNTP para la longitud y composición de la secuencia blanco. Criterios Principales Tamaño Base en el extremo 3' Tamaño ideal: 20-25 nucleótidos de longitud generalmente: 18-30 nucleótidos de longitud Debe ser una G o una C Temperaturas de fusión 50-65 ºC (Tm) contenido GC auto-complementariedad Similaridad 40-60% Debe ser evitada Para minimizar la formación de estructuras secundarias y los dimeros de primer Debe tener un 100% de apareamiento con el molde Cuando el objetivo a amplificar es un locus. Primers Los oligonucleótidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN. Las concentraciones óptimas de los primers son generalmente entre 0. dNTPs y primers. En la tabla 1 se muestran los criterios principales a considerar para la selección adecuada de los primers.5 µM. 5 .1 y 0. especificidad y fidelidad. la posición de los iniciadores debe ser relativa a los codones de inicio y terminación.

El primer tendrá un contenido de G/C del 50% y ~20 bases de largo. 6 . a menudo. ocurrirá la formación de dímeros de primer que. después de efectuado el cálculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociación cercanas a la temperatura de fusión para determinar la temperatura óptima para cada reacción. La inclusión de un residuo de G o de C en el extremo 3' de los primers ayuda a asegurar el correcto enlace en el extremo terminal 3' debido al enlace de hidrógeno más fuerte de los residuos G/C.62°C. Si un primer tiene tal región de homología se formarán estructuras parciales de doble cadena que interferirán con el alineamiento. Temperatura de Asociación La temperatura de asociación de los primers es uno de los factores más determinantes de la reacción. Los primers deben ser elegidos de modo que tengan una secuencia única dentro del DNA que será amplificado. Si la homología ocurre en el extremo 3' de cualquier primer. el mismo primer puede dar una sola banda si se amplifica una sola clona de una biblioteca genómica. Secuencias Complementarias del primer Los primers necesitan ser diseñados con menos de 3 pares de bases de homología entre ellos.Una razón menos obvia por la que los primers fallan es la presencia de estructuras secundarias en el templado de DNA. Esto pondrá la Tm en la gama de 56°C . Esto puede bajar la eficacia de la amplificación. Contenido de G/C La composición base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. También ayuda a mejorar la eficacia de la reacción reduciendo al mínimo la respiración que pudo ocurrir. Sin embargo. prevendrá la formación del producto deseado por competición. Existen muchos métodos para calcular la temperatura de fusión. La secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de poliC que pueden promover el reconocimiento no específico. Secuencia de los extremos 3' Es establecido que la posición terminal 3' en primers de PCR es esencial para el control del “mispriming”. Se recomienda que se emplee como temperatura de asociación la temperatura de fusión -5ºC. Las regiones poliA y poliT deben también ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Un primer diseñado con una secuencia altamente repetida dará lugar a productos no deseados. En este caso la substitución de dGTP por 7-deazo-2’deoxiGTP ha sido muy usada Especificidad La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. pero siempre. aproximadamente.

html 7 . Para secuencias de 20 bp o menos. Programas de Diseño de Primers Existen programas disponibles en la red que ayudan al diseño de primers.9M.wi.umn. típica de "dot blot" y otros ensayos de hibridización A continuación tenemos otra expresión para el cálculo de Tm Tm = 81.Cálculo de la temperatura de fusión (Tm) Existen muchos métodos para estimar el valor de la temperatura de fusión. Por ejemplo: http://frodo. existe la siguiente aproximación: Tm = 2ºC (A + T) + 4ºC (G + C) donde se asume una concentración de sal de 0. y [M] es la concentración de cationes monovalentes.5 + 0.cgi http://alces.6 log[M]. Esta fórmulas es únicamente aplicable a secuencias polinucleotídicas largas. y C es la concentración molar del oligonucleótido. R es la constante molar de los gases (1.41(%GC) . Se puede adicionar un segundo término a la ecuación anterior para tener en cuenta el efecto estabilizante de la sal sobre el dúplex: Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los márgenes del error experimental. donde L se refiere a la longitud del oligonucleótido. Los cambios en la entalpía ( ) y la entropía ( ) de la formación del dúplex se calculan a partir de parámetros termodinámicos de vecindades.mit.500/L + 16.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www. El método mas preciso para estimar la Tm de oligornucleótidos está basado en el análisis termodinámico del proceso de fusión del cual se puede mostrar que.987 cal.edu/rawprimer.K-1mol-1).med.

5 unidades (SA = 20 unidades/pmol) por 100 µl de reacción cuando los otros parámetros son óptimos. se recomienda probar rangos de concentración de enzima de 0.d. n. c Número promedio de nucleótidos adicionados antes de la disociación. d Número promedio de nucléotidos adicionados por segundo.d. La polimerasa Un rango de concentración recomendado para Taq polimerasa (Perkin-Elmer CETUR) es entre 1 y 2. El criterio esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que abarque la región que va a ser amplificada y que las impurezas sean suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerización. Frecuencia de error por pares de bases incorporadas. Una sola célula o un lisado celular crudo o especimenes con una longitud promedio de unos pocos cientos de pares de bases son usualmente adecuadas para una amplificación exitosa. 60 3’ a 5’ exo no si si no 5’ a 3’ exo si no no si Porcentaje de conversión de templado a producto por ciclo. los requerimientos de enzima pueden variar con respecto a la secuencia blanco o los primers. Procesividad 55 7 n. Cuando se optimiza un PCR. Sin embargo. 30 c Tasa de Extensiónd 75 67 n. Si la concentración de la enzima es muy alta se acumulan productos no específicos.d.Templado Una de las características más atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad de la muestra de DNA sujeta a amplificación no necesita ser alta. Características de algunas polimerasas termoestables de DNA Enzima Taq Pol Tli Pol (Vent) Pfu Pol Ruth a Eficiencia Relativaa 88 70 60 n.d. y si es muy baja se formara una cantidad insuficiente del producto deseado.5 a 5 unidades/100 µl. = no determinado b 8 . Tasa de errorb 2x10-4 4x10-5 7x10-7 n.d. Tabla 2.

3 a 20ºC) varia entre 7.Concentración de Magnesio Es benéfico optimizar la concentración del ión magnesio.8 durante las condiciones típicas del termociclador. la especificidad del producto.8 y 6.5 a 2.3 a 20ºC y un _ pKa de -0. se hace la amplificación del fragmento deseado. La PCR es un proceso que consta de tres pasos.8). tanto del templado como del producto de PCR. Esto hace posible.021/ºC sin embargo el verdadero pH de una buffer 20mM de Tris (pH 8.3 -8. a través de la acción de la polimerasa. se unirá después de la desnaturalización de la doble cadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3´ del DNA por aposición de los nucleótidos correspondientes suministrados y.1% ) son incluidos para ayudar a estabilizar la enzima. Los PCR deben contener 0. y desde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. Está basado en la acción de la polimerasa. ya que afecta: el alineamiento de los primers.05 a 0. La presencia de EDTA u otros quelantes en el stock del primer o del templado puede alterar la concentración óptima aparente de magnesio. que como se sabe es la enzima que dirige la síntesis de ADN. La gelatina o la albúmina bovina (100 µg/ml) y detergentes no iónicos como el tween 20 o laureth 12 (0. si de forma voluntaria le proponemos una pequeña fracción de oligonucleótidos que sean complementarios de una porción. Tris es un buffer iónico bipolar que tiene un pKa de 8.5 mM de magnesio sobre el total de la concentración de dNTP. 9 . Parámetros de la reacción Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicación del ADN. Hasta 50 mM de KCl puede ser incluido en la mezcla de reacción para facilitar el alineamiento de los primers. NaCl a 50 mM o KCl arriba de 50 mM inhibe la actividad de la Taq polimerasa. la formación de dímeros de primer y la actividad y fidelidad de la enzima. Para ello necesita al menos una pequeña fracción de cadena doble de ADN para iniciar la síntesis. Otros componentes de la reacción Un buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl (pH entre 8. los primers y los dNTPs. La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unión con el templado. la temperatura de disociación de las cadenas. sin embargo muchos protocolos trabajan bien sin estos componentes.

En contraste. separándose las dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno. 10 . tamaño y concentración de los primers amplificadores. Debido a que las DNA polimerasas son activas en un amplio rango de temperaturas. El rango de actividad de las enzimas varia en dos ordenes de magnitud entre 20 y 85ºC.Desnaturalización. Para ello se baja la temperatura y las condiciones serán tales que se facilitará la unión de los primers a las cadenas. Alineamiento. sin embargo temperaturas más altas pueden ser apropiadas especialmente para templados ricos en G + C. o 97ºC por 15 segundos. Las condiciones típicas de desnaturalización son 95ºC por 30 segundos. la extensión de los primers puede ocurrir a bajas temperaturas incluyendo el paso de alineamiento. Una temperatura de alineamiento óptima es 5ºC por debajo de la Tm de los primers. La primera reacción consiste en la desnaturalización del DNA. Las temperaturas de alineamiento en el rango de 55 a 72ºC genera buenos resultados. los pasos de desnaturalización a altas temperaturas o por mucho tiempo provocan perdida de la actividad de la enzima. La desnaturalización incompleta permite el apareamiento de las hebras de DNA y por lo tanto se reduce el rendimiento el producto. La segunda reacción consiste en la hibridación de los primers. La temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers depende de la composición.

ya que esto puede incrementar la cantidad y complejidad de productos no específicos. después de 3 ciclos . Sin embargo. permite obtener. pH. millones de copias del fragmento de interés. así que después de dos ciclos tenemos 2 x 2 veces. la polimerasa lleva a cabo su acción. El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuencia blanco y de la temperatura. Así. después de N ciclos tendremos 2N. Un error común es el de ejecutar demasiados ciclos. concentración de sales y la naturaleza del templado. Número de ciclos.2 x 2 x 2 veces u 8 (23) veces la cantidad inicial. la cantidad de DNA es dos veces la anterior. temperatura a la cual. después de 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 veces o 16 (24). El número óptimo de ciclos dependerá principalmente de la concentración inicial del templado cuando los otros parámetros son optimizados. Pocos ciclos dan como resultado un bajo rendimiento del producto. La tercera reacción se efectúa a 72º C. La extensión del primer se realiza tradicionalmente a 72ºC. por ejemplo. tiempos mayores de extensión pueden ser útiles cuando la concentración del sustrato es muy pequeña o cuando la concentración del producto excede la concentración de la enzima. Un tiempo de extensión de un minuto es considerado suficiente para productos de hasta 2 kb de longitud. como resultado de un experimento de amplificación. Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. 11 . según lo demostrado en la Tabla 3. La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR. Después de cada ciclo. La repetición de este ciclo unas 40 veces. insertando los diferentes nucleótidos complementarios en el orden que le va indicando la cadena que actúa como molde. Las estimaciones para la tasa de incorporación de nucleótidos a 2ºC varia de 35 a 100 nucleótidos por segundo dependiendo del buffer.Extensión.

con posibilidad de programar las temperaturas y los tiempos. aunque las características principales son las siguientes: • Constan de un bloque térmico. Las rampas de subida y bajada de temperatura son importantes para trasladar los protocolos entre termocicladores. básicamente. Termocicladores El termociclador es el aparato que permite llevar a cabo de forma automática y reproducible la sucesión de ciclos de temperatura necesarios para la PCR.Tabla 3. Existen multitud de termocicladores en el mercado. de un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado. Relación entre cantidad de DNA y el número de ciclos. Los actuales constan. Los primeros termocicladores eran robots que movían una gradilla de tubos entre varios baños termostáticos a tiempos preestablecidos. y 12 . gracias al denominado sistema Peltier. cuyo calentamiento y enfriamiento se produce a gran velocidad.

cuya secuencia de bases esté contenida en el fragmento de interés. También es posible colocar el ADN directamente en la membrana en forma de pequeñas manchas (dot blot) para su posterior hibridación con la 13 . El rango de temperaturas suele abarcar de 4ºC a 110ºC. Identificación de los productos de PCR • El hecho de que las moléculas de ADN obtenidas al finalizar la reacción en cadena correspondan efectivamente al fragmento de interés queda asegurado por la intervención de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese fragmento. a un proceso de separación por difusión bajo la acción de un campo eléctrico. de forma habitual. las rampas. Actualmente. Es importante el perfecto ajuste del tubo en el bloque. lo que hace que deban ajustarse de nuevo las condiciones de tiempos y temperaturas. Son muy útiles cuando se realiza ajuste continuo de programas de PCR. • Tapa térmica: los más antiguos no la poseen. al menos. Respecto a llegar a 100ºC o más.2 ml aunque aún existen también para 0. En este caso se procede así: el ADN fraccionado por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon. el tamaño del fragmento multiplicado puede determinarse sometiendo los productos de la reacción a una electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida. Los 4ºC se utilizan para refrigerar muestras tras una PCR. Software para programación de tiempos y temperaturas: se denomina programa a cada conjunto de datos térmicos y temporales de un protocolo de PCR. es decir. Puede ajustarse también la velocidad de subida y bajada de temperaturas. Es preferible emplear termobloques para llevar a cabo esta labor. tampoco es aconsejable. que se unirá al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta ser complementaria del mismo. Existen bloques que permiten ajustar distintas temperaturas en función de las zonas del mismo. aunque el rango habitual debe ser de 15ºC a 95ºC. se recomienda utilizar los de la misma marca que el fabricante. pero es un elemento indispensable para evitar la evaporación de la muestra. o cuando se necesitan realizar diversos protocolos de forma simultánea. especialmente de temperaturas de hibridación. están diseñados mayoritariamente para tubos de 0. la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridación (unión complementaria) con una sonda marcada radiactivamente. que actúa como soporte sólido (Southern blot). pero 15ºC también es una temperatura apta para ello. una vez que la reacción ha finalizado. Por ello. Cada termociclador tiene su propio software.5 ml. Así.uno de los factores de falta de reproducibilidad. y luego es puesto en contacto con la sonda. No debe sobrecargarse al aparato con temperaturas extremas para prolongar su supervivencia. Por otra parte. al contactar totalmente con la tapa del tubo. es decir. Se dice que tienen función gradiente.

El ADN es desnaturalizado (separación de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridación (unión) con una sonda radiactiva. la filiación de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de que poseen tamaños previsibles. En algunos casos. conocida como nested PCR (PCR anidada). carril M: marcadores de ADN de tamaño conocido. pero practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente desnaturalizados. los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por ciertas enzimas llamadas en endonucleasas de restricción. La localización de las sondas radiactivas se logra.) B: Southern blot. A: visualización directa. en ambos casos. C: dot blot. La determinación del tamaño al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos en contacto con la enzima de restricción adecuada indica que nos encontramos ante los segmentos de interés.sonda. Mediante el empleo de esta metodología. Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la técnica PCR. Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. mediante autorradiografías Figura 1. Método análogo al anterior. (Carriles 1-8: productos de distintas PCRs. Al finalizar la primera. 14 . una alícuota de la misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicación tras haber colocado dos primers internos. Ésta quedará fijada donde se encuentre el tramo de ADN de interés y su presencia se revelará a través de una autorradiografía (placa fotográfica sensible a la emisión radiactiva de la sonda). Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la acción de un campo eléctrico (electroforesis) migran de una manera característica que se puede visualizar por tinción (coloreado) del ADN.

pero esta copia es DNA complementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología PCR. La transcripción reversa genera una copia de la hebra de RNA. Los pasos de la RT-PCR son: 1. Los sitios de unión a los primers deben estar separados 400 bases. las dos hebras se separan. pero generalmente se encuentran a 100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real A 72ª la polimerasa extiende el DNA desde los primers. El mRNA es copiado a cDNA por la transcriptasa reversa usando un primer dT (los primers al azar se pueden también utilizar)(Figura 2). A 50 o 60º los primers específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Se obtienen 4 cadenas de cDNA. Se adiciona una mezcla de PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa). Esto elimina el mRNA permitiendo que la segunda hebra de DNA sea formada. es necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. se utiliza generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. PCR. 2. Figura 2. 3. Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del primer mediante la incorporación de nucleótidos complementarios.RT PCR Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor. se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA. Transcripción reversa: Unión del primer a la secuencia de RNA objetivo. 4. los primers específicos para el gen de interés. los deoxinucleótidos y un buffer conveniente. En PCR en tiempo real. 15 . Fin de transcripción reversa. Conversión de mRNA a cDNA por la transcriptasa reversa El cDNA se desnaturaliza a mas de 90º (~94º).

Así la PCR en tiempo real fue desarrollado debido a: • • La necesidad de cuantificar diferencias en la expresión del mRNA La disponibilidad de cantidades pequeñas de mRNA en algunos procedimientos.Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de cDNA. Sin embargo. Figura 3. Hay una variedad de métodos para la cuantificación del mRNA. El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de DNA intercalandose entre los pares de bases. Otros colorantes. Éstos incluyen: − − − − northern blotting análisis de protección de ribonucleasa (RPA) hibridación in situ PCR 16 . hay maneras más sensibles de detectar el producto). Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos permite la cuantificación ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la etapa logarítmica de amplificación. en parte por la insensibilidad del bromuro de etidio (sin embargo. como el SYBR green. El gel se tiñe con bromuro de etidio. se utilizan en el PCR en tiempo real (Figura 3). El SYBR green fluoresce brillantemente solo cuando se une a DNA de doble cadena. PCR EN TIEMPO REAL La RT-PCR es solamente semicuantitativa en el mejor de los casos. los productos de reacción son analizdos usualmente por electroforesis en gel de agarosa. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro. Los protocolos de PCR competitivos se han desarrollado para hacer el método más cuantitativo pero son a menudo complicados. que son mucho más fluorescentes que el bromuro de etidio. la fluorescencia no es muy brillante.

mientras que la hibridación in situ es cualitativo más que cuantitativo. Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la relativa facilidad y conveniencia de su uso comparadas a algunos métodos más viejos. puesto que no hay amplificación implicada. fácil de usar. Las técnicas tales como el northern blotting y los RPAs trabajan muy bien. sensible. Técnicas de detección La química de la detección está dada por: • • • • Agentes intercalantes fluorescentes (SYBR Green) Sondas hidrolizadas Hairpin probes (Molecular Beacons. Sin embargo. Scorpions) Sondas de hibridización. Es simple y económico. Está basado en: • • la detección y cuantificación de un reportero fluorescente. el empleo de un termociclador que tiene acoplado un sistema de detección que es capaz de adquirir y cuantificar la señal emitida por el reportero al final de cada ciclo para cada muestra. SYBR greenTM Es un agente intercalante que se une al ADN de doble cadena dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR. El northern blotting y RPAs son patrones excelentes. la PCR en tiempo real da resultados cuantitativos. Sin embargo durante la reacción de PCR puede unirse a dímeros de primers 17 . Los productos de amplificación se observan a medida que transcurren los ciclos de la PCR. cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR en la reacción.La PCR es el método más sensible y puede discriminar entre mRNAs cercanamente relacionados. Es una técnico simple pero es difícil conseguir resultados verdaderamente cuantitativos usando PCR convencional. puesto que el hecho de que la PCR implica un paso amplificación significa que es más sensible. pero requieren más RNA del que a veces se dispone. Los métodos de PCR son por lo tanto particularmente valiosos cuando las cantidades de RNA son bajas. En contraste con la RT-PCR y el análisis de los geles de agarosa. versátil y no se necesitan sondas específicas. la PCR tradicional es solamente semicuantitativa en parte debido a las dificultades de observar la reacción durante la parte verdaderamente linear del proceso de la amplificación.

cuando la sonda hibrida con la secuencia de interés durante la reacción de PCR. Figura 4. el reportero no emite señal. Cuando ambos fotocromos están unidos a la sonda. resultando en una sobreestimación de la concentración del DNA blanco. Se monitorea la señal fluorescente del reportero que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR. Hydrolysis probes (TaqManTM) Se emplea una sonda que tiene unidos un fotocromo reportero y un fotocromo quencher. 18 . Hydrolysis probes Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Estas sondas poseen secuencias repetidas invertidas (ITR) en sus extremos 5´y 3´. la actividad exonucleasa de la Taq polimerasa corta al fotocromo reportero del resto de la sonda. Este diseño permite que se forme una estructura de horquilla (hairpin) por complementariedad de las dos regiones ITR. en ausencia de la secuencia blanco. dirigiendo así la hibridación específica. La secuencia interna de la sonda es complementaria al blanco.y a otros productos inespecíficos. permitiendo la emisión una señal fluorescente (Figura 4). Pero. resultando en una eficiente separación del quencher y del reportero y la consecuente emisión de este último (Figura 5).

Las dos sondas están diseñadas para hibridar en sus blancos específicos en un arreglo cabeza-cola que permite que ambos fluoróforos estén en estrecha proximidad entre sí. cada una marcada con un fluoróforo diferente. Se requiere de un riguroso diseño de las regiones tallo y asa de la horquilla. Así. Funcionamiento de las Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Entre sus ventajas están el que son más específicas que las sondas TaqMan (deben tener un cambio conformacional para hibridar con el blanco). siendo la distancia óptima de 1 a 5 bases entre las sondas. permiten distinguir dos secuencias blanco muy similares entre sí y que se pueden combinar varias Molecular Beacons en una única reacción empleando diferentes compuestos fluorescentes para identificar secuencias blanco específicas distintas (Múltiplex PCR).Figura 5. Hybridization probes El diseño implica el uso de dos secuencias de oligonucleótidos específicos como sondas. comúnmente. el extremo 3´de la sonda donadora con fluoresceína y el extremo 5´de la sonda aceptor con LC Red 640 o LC Red 705 (Figura 6). 19 . la transferencia de energía de resonancia sólo ocurre cuando ambas sondas se hibridan al blanco muy próximas entre sí.

los primers de scorpions se amplifican para formar productos de PCR. estas sondas están marcadas con un único fluorocromo. Scorpions Los scorpions son primers de PCR con una cola tallo y asa ("Stem-Loop") que contiene un fluoróforo y un quencher. 20 . La secuencia blanco se elige típicamente para estar 3 bases dentro del extremo 3' del primer scorpion. En la etapa apropiada del ciclo de PCR (la fase de alineamiento). Hybridization probes En comparación con las otras dos técnicas. Durante la PCR. y que el control de calidad sea más sencillo que para las sondas doblemente marcadas. la secuencia de la sonda en la cola del Scorpion se enrosca para hibridarse a la secuencia blanco en el producto de PCR.Figura 6. la interacción es intermolecular. La estructura de tallo y asa es separada de la secuencia de del primer de PCR por una modificación química que evita que se copie la secuencia de tallo y asa del scorpion (Figura 7). Esto hace que sean más fáciles de sintetizar y caracterizar. Como la cola del scorpion y del producto de PCR es ahora parte de la misma hebra de DNA.

Las reacciones son caracterizadas en el momento en el que la amplificación de un producto de PCR se detecta después de un número fijo de ciclos.Figura 7. Esto define la línea de fondo para el diagrama de la amplificación. más pronto se observa el aumento significativo en la fluorescencia. Un diagrama de amplificación es una gráfica de la señal de la fluorescencia contra el número de ciclos. En la figura 8 se muestra un diagrama representativo de la amplificación. Cuanto más alto es el número de copias del blanco. En los ciclos iniciales de PCR. Diagrama de Amplificación 21 . Scorpions Cuantificación La capacidad de monitorear el progreso en tiempo real de la PCR revolucionó totalmente la manera de cuantificación basada en la PCR de DNA y de RNA. Un aumento en fluorescencia sobre la línea de fondo indica la detección del producto acumulado de PCR. Figura 8. hay un pequeño cambio en señal de fluorescencia.

Ciclo Umbral (Ct) La gráfica del logaritmo del número inicial de copias del blanco para un sistema de estándares contra Ct es una línea recta (Figura 10). de preparar una curva estándar. Esto está determinado por la identificación del número de ciclo al cual la intensidad de emisión del fluoróforo aumenta con respecto al ruido de fondo (background). Este número de ciclo se llama ciclo umbral (Ct: threshold cycle). El Ct es inversamente proporcional al número de copias del DNA blanco: a mayor concentración de blanco. Figura 9.Se adquieren los datos cuando la amplificación está todavía en la fase exponencial. La cuantificación de la cantidad de blanco en muestras desconocidas es lograda midiendo Ct y usando la curva estándar para determinar el inicio del número de copias. y de la determinación del número de copias iniciales para las muestras es realizado por el software del sistema 5700 y 7700. Figura 10. El Ct está determinado en la fase exponencial de la reacción y es más confiable que las mediciones en el punto final convencionales (Figura 9). El proceso entero de calcular los Cts. menor Ct medido. Curva Estándar 22 .

del gen humano de la β-actinia en diluciones de DNA genómico. En esta figura. el cambio en la fluorescencia del SYBR Green se grafica contra el número de ciclos. Los valores de Ct son reproducibles en las réplicas porque el umbral se escoge en la fase exponencial de la PCR.La figura 11a muestra la amplificación. pero graficando el logaritmo del cambio en la fluorescencia contra el número de ciclos. En la fase exponencial. Estos tres diagramas ilustran los principios básicos de la cuantificación en tiempo real de PCR. Esto se demuestra en la figura 11b donde el umbral intersecta la gráfica de amplificación en la región donde hay una relación lineal entre el logaritmo del cambio en fluorescencia y el número del ciclo. La figura 11b muestra los mismos datos. Amplificación de la β-actinia. Cuanto más alta es la cantidad inicial de DNA genómico. El software del sistema 5700 calcula el Ct para cada reacción. Los valores de Ct se trazan contra el logaritmo de la cantidad inicial de DNA genómico para dar la curva estándar mostrada en la figura 11c Figura 11. 23 . usando el sistema 5700. Se corrieron seis réplicas para cada cantidad de DNA. y más bajo es el valor de Ct. los componentes de la reacción no están limitados y las reacciones de replicación exhiben resultados reproducibles y uniformes. mas pronto se detecta el producto acumulado en el proceso de PCR.

Si es posible. Si los componentes de la reacción llegan a ser limitantes. También es conocida como 36B4. Ésta es la razón principal por la que el Ct es una medida más confiable del número de copias que comienza. se debe ser capaz de demostrar que la expresión del estándar no cambia significativamente cuando las células o tejidos son sujetos a las variables experimentales que se planean usar. 60S proteína ribosomal ácida P0. los valores de Ct son muy reproducibles para las reacciones que comienzan con el mismo número de copias. P0). Debe expresarse en todas las células Un número de copias intermedio es ventajoso Sin embargo. 24 . Esto conduce a una mayor precisión en la cuantificación del DNA y del RNA. P0. Un gen que puede ser usado como “loading control” (o estándar interno) debe tener varias características: • • • El gen estándar debe tener el mismo número de copias en todas las células. ninguno de los componentes de la reacción está limitado. Durante la fase exponencial.Genes estándares Un control interno consiste en utilizar un gen cuya expresión no cambie. Por ejemplo RPLP0 (proteína ribosomal larga. L10E. Arbp o fosfoproteína ribosomal ácida P0. consecuentemente. Estándares usados comúnmente: • • • • • • mRNA de Gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa mRNA de Beta actina mRNA de MHC I (complejo de mayor histocompatibilidad I) mRNA de Ciclofilina mRNAs para ciertas proteínas ribosomales. por tanto lo que se decida usar como estándar o estándares debe ser validado para su muestra. el índice de la amplificación del blanco disminuye hasta que se alcanza una meseta y hay poco o nada de aumento neto en producto de PCR. proteína ribosomal L10. el estándar perfecto no existe. rRNAs 28S o 18S (RNAs ribosomales) El efecto de limitar los reactivos Los ciclos iniciales de PCR se caracterizan por un aumento exponencial en la amplificación del blanco. La detección de la fluorescencia de los sistemas 5700 y 7700 permite que el Ct sea observado cuando la amplificación de PCR esta aún en la fase exponencial. RPPO. que una medida de la cantidad de producto acumulado en el punto final de la PCR. PRLP0.

Una cantidad conocida de competidor es colocada en la muestra. Así. determinando el cociente del blanco y 25 . Una característica distinguible es hacer al blanco y los amplicones competidores de diferentes tamaños para poder utilizar la electroforesis en gel para discriminar los dos productos. Diferencias entre el punto final y la detección en tiempo real PCR competitivos cuantitativos Para compensar los problemas con las medidas en el punto final. El cambio total en la señal del reportero. Sin embargo. la cantidad de producto de PCR observada en el final de la reacción es muy sensible a variaciones leves en los componentes de la reacción. Figura 12. como la formación de dímeros de primer.Por otra parte. durante los cuales se determinan los valores de Ct (Figura 12b). los diagramas de la amplificación son notablemente similares entre los ciclos 22 y 25. es posible que una muestra que comienza con un número más alto de copias termine con menos producto acumulado que una muestra que comienza con un número más bajo de copias. en el ciclo 40. pueden consumir los reactivos a diversos grados de tubo a tubo. Se construye un amplicon competidor que contiene los mismos sitios de unión que el primer y tiene la misma eficiencia de amplificación que el blanco. el cociente del blanco y el competidor seguirá siendo constante a través del proceso de PCR. las reacciones laterales. se han desarrollado una variedad de técnicas de PCR competitivo cuantitativo. después el blanco y el competidor son amplificados en la misma reacción. pero es de alguna manera distinguible del blanco. que demuestra la amplificación de 96 muestras idénticas. Esto es porque las medidas en el punto final se hacen generalmente cuando la reacción esta más allá de la fase exponencial y una diferencia leve en un componente limitante puede tener un efecto drástico en la cantidad final de producto. Si la eficiencia de amplificación del blanco y del competidor es idéntica. Las diferencias entre el punto final y la detección en tiempo real se ilustran gráficamente en la figura 12. Por ejemplo. Así. varía ampliamente entre las réplicas (Figura 12a).

La mayor exactitud es obtenida encontrando el punto de equivalencia en el cual el cociente del blanco y el competidor es 1:1. se deben realizar estudios cuidadosos de la validación para verificar que las eficiencias de la amplificación del blanco y del competidor son iguales antes de que la cuantificación de muestras experimentales pueda comenzar. el software lo convierte posteriormente en una representación gráfica. se deben probar varias diluciones para alcanzar un cociente conveniente. Incluso una diferencia leve en eficiencia compromete seriamente la exactitud de la cuantificación por PCR competitivo. Se registran las emisiones de fluorescencia de forma continua. y preestablece un valor de Ct que puede ser modificado con posterioridad. Para lograr esto. El que se muestra en la figura 13 es el ICycler® de BioRad. Figura 13. La tapa se desliza para acomodar las muestras en una placa de formato 96-pozos (96-well). PCR competitivo requiere la cuantificación exacta de los amplicones del blanco y del competidor. aunque se ajusta y se controla desde un ordenador que posee el software específico. En el final de la reacción. pero su rango dinámica se limita a un cociente del blanco/competidor cercano de 1:10 a 10:1. ICycler® de BioRad El sistema ABI PRISM 7700. en función del análisis del usuario (Figura 14). 26 . Cada pocillo tiene una forma similar a la de los tubos de 0.del competidor en el final de la reacción y conociendo la cantidad inicial de competidor agregada. que exige generalmente pasos de proceso laboriosos de post-PCR. en cuanto a tiempos y temperaturas. de Applied Biosystems (antes. con tapas ópticas para su adaptación al lector de fluorescencia. PCR competitivo se ha utilizado con éxito para cuantificar DNA y RNA. Máquinas para PCR en tiempo real Hay muchas máquinas para PCR en tiempo real disponibles. Perkin Elmer) se basa en el empleo de placas especiales. La máquina contiene una cámara fotográfica sensible que supervisa la fluorescencia en cada pozo de la placa en intervalos frecuentes durante la reacción de PCR. Otra desventaja es la necesidad de construir y de caracterizar un diferente competidor para que cada blanco sea cuantificado. la cantidad de blanco puede ser calculada. Además. El funcionamiento es semejante al de un termociclador convencional.2 µL. Esto significa que podemos mirar varias muestras simultáneamente.

lo que requiere de nuevas optimizaciones. que permite obtener resultados. denominado carrusel. ya que los capilares y otros materiales son específicos para este sistema. 27 . El sistema LightCycler de Roche (Figura 15).El software 7700 muestra una representación de una placa con 96 pozos. La cuantificación se puede realizar por el método más básico que es preparar una curva estándar y determinar cantidad desconocida por comparación con curva estándar. Sin embargo. y en un mecanismo de giro.Figura14 . donde se pueden identificar fácil y rápidamente los estándares y las muestras no conocidas. Después de una corrida de PCR el número inicial de copias se muestra para cada muestra en el pozo. el uso de los valores de Ct también amplía la gama dinámica de la cuantificación porque los datos se colectan para cada ciclo de PCR. y bastante caros. se basa en el empleo de capilares de vidrio para la contención de las muestras. similar a una centrífuga. La principal ventaja es la rapidez. en muchos casos. presenta un alto costo. Comparado a las medidas del punto final. Todo ello tiene ventajas e inconvenientes. Además. El calentamiento y el enfriamiento se llevan a cabo mediante un sistema de aire. los protocolos de tiempos y temperaturas no son intercambiables con otros sistemas de PCR cuantitativa. en menos de 1 hora. Figura 15. LightCycler de Roche Ventajas del tiempo Real La determinación de valores de Ct siguiendo la cinética en tiempo real de PCR elimina la necesidad de un competidor que debe de ser amplificado con el blanco.

etc. Se puede realizar un mayor número de reacciones por día. El producto de PCR se cuantifica en cada ciclo. Existe un amplio rango de aplicación. La secuencia del aminoácido se puede 28 . También hay la posibilidad de PCR múltiplex. PRIMERS DEGENERADOS Son primers que tienen un número de opciones en varias posiciones en la secuencia para permitir el alineamiento y la amplificación de una variedad de secuencias relacionadas. Por ejemplo: 5’-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3’ Y = pirimidinas = C / T (degeneración = 2X) R = purines = A / G (degeneración = 2X) I  = inosinas  = C / G / A / T  N = nucléotido = C / G / A / T (degeneración = 4X) Uso de los primers degenerados Los primers degenerados se pueden utilizar: • • Para amplificar secuencias conservadas de un gen o de genes del genoma de un organismo. Las primers degeneradas se pueden utilizar para amplificar estas secuencias. El diseño de primers y sondas tiene que ser más exigente. estas regiones pueden ser conservadas entre especies. No requiere de análisis posterior a la PCR (electroforesis. El sistema a “tubo cerrado” sirve como control de contaminación. Hay una alta correlación entre la señal (Ct) y la cantidad de blanco. Con esta técnica se tiene alta precisión y exactitud. Las secuencias amplificadas de esta manera se pueden secuenciar para confirmar que la secuencia esté correcta.La PCR en tiempo real permite una amplificación confiable con alta especificidad y sensibilidad. Esto reduce la posibilidad de contaminación y elimina fuentes potenciales de error.). Para conseguir la secuencia de nucleótido después de secuenciar algunos aminoácidos de una proteína de interés Hay evidencia de regiones o motivos altamente conservados de aminoácidos que se pueden diseñar utilizando primers degeneradas. Cuando se ha aislado exitosamente una proteína de interés. Pueden entonces ser utilizadas como sondas para amplificar el gen de interés de una biblioteca geonómica (procariótica) o de una biblioteca de DNA (eucariótica). el final de esta proteína (o algunos aminoácidos) pueden ser secuenciados.

pueden ser utilizadas como sondas. se pueden utilizar 50 pmoles como punto de partida y optimizar a partir de ahí. Si una base se conserva a través de la alineación se puede suponer que esta base particular será la misma en el caso de interés. la concentración de un primer específico disminuirá. Información de la secuencia terminal de aminoácidos Si estos datos están disponibles pueden ser utilizados como un punto de partida para el diseño de los primers. Estas secuencias entonces se alinean. simplemente se multiplican todos los valores de la degeneración incorporados en la secuencia del primer. Por lo menos 2 bloques de aminoácidos conservados deben estar presentes para permitir el diseño de los primers de PCR. Diseño de los primers degenerados Alineación de la secuencia Las secuencias de aminoácidos de proteínas similares u homólogas se pueden recuperar de una base de datos tal como GenBank. Para conseguir la degeneración. El producto de PCR puede ser secuenciado. Los primers deben tener 20-30 nucléotidos de longitud. Si los primers usados son absolutamente degeneradas. una excepción se observa para las concentraciones de primers. Degeneración de primers La degeneración de los primers depende de una multiplicidad de factores incluyendo el templado. Otro factor que se toma en consideración es que conforme la degeneración de los primers aumenta. Si los primers producen una secuencia truncada (del gen) o parcial. Las substituciones de las bases son solamente las substituciones comunes.utilizar para diseñar primers degenerados. Otra alineación se puede hacer en el nivel del nucleótido si se desea. La degeneración se puede bajar con el uso de las inosinas para sustituir 4 bases “wobbles” en vez de usar las 4 substituciones de bases. La alineación de la secuencia también dará el tamaño previsto del producto de PCR. Un aumento de la concentración puede ser necesario para compensar la degeneración. aunque se han utilizado otras opciones dependiendo de la secuencia La Reacción de PCR El cóctel de PCR Una mezcla estándar del cóctel de PCR será un buen inicio. Sin embargo. 29 .

Problemas Comunes Algunos problemas que se pueden presentar cuando se utilizan primers degenerados son: • • • • Inhibición competitiva debido a la alta degeneración del primer (los primers se alinean al DNA correcto pero no son extendidos por la polimerasa debido a los extremos 3 ' inestables dando como resultado que los primeros ciclos de PCR sean altamente ineficaces. BLASTX). DNA templado.   Controles Si se amplifica un gen usando los primers diseñadas de un alineamiento es conveniente hacer un dot blot que consiste en un control positivo. Aunque los primers degenerados se pueden utilizar directamente para secuenciar. Se comienza con 35 ciclos y se aumenta a 50 en caso de ser necesario. Esto puede ser superado aumentando ciclos de PCR o utilizando 25-30 ciclos estándares seguidos por otra reacción de 30-35 ciclos usando el primer producto como templado Concentración baja del primer específico debido a la alta degeneración. algo de gDNA relacionado y un gDNA distante para comprobar una posible contaminación. 30 . La secuenciación de los productos permite el uso de los sitios del primer situados generalmente en los flancos del vector. pueden dar lugar al apareamiento no específico dependiendo del templado. Se puede intentar la optimización de la temperatura del alineamiento o el reajuste de los primers Secuenciación Después de que la banda del tamaño previsto se haya extraído del gel de agarosa. después se procede optimizando la temperatura de alineamiento del primer. Esto debe ser hecho después de secuenciar y asegurar que se tiene la secuencia deseada haciendo un búsqueda en la base de datos (por ejemplo.Los ciclos de PCR (el termociclador) Se requiere de mucha experimentación y optimización. 4-5 de los primeros ciclos de PCR se pueden correr con una temperatura de alineamiento 5-10 o C más bajo que la temperatura de alineamiento para amplificar los primers con múltiples “mismatches”. esto puede ser corregido fácilmente aumentando la concentración del primer La DNA polimerasa con actividad exonucleasa 3'-5’ no debe ser utilizada ya que degradan los primers (la Taq polimerasa trabajará muy bien) Apareamiento falso o no específico debido a los primers altamente degenerados o al templado que contiene muchos sitios de alineamiento. Se debe considerar la viabilidad de la polimerasa para 50 ciclos. Se comienza con las condiciones estándar. el producto se puede secuenciar o clonar directamente.

el alineamiento no específico pueden superar la amplificación del producto deseado. Mientras que altas concentraciones se prefieren para templados de poca complejidad tales como DNA de plásmido. o para cantidades limitadas de DNA templado. Por lo tanto. o para altas concentraciones de DNA templado. incluyendo concentraciones de dNTPs. la amplificación de fragmentos largos de DNA puede llevarse a cabo (Figura 16). El exceso de Mg2+ tiende a causar productos no específicos que se observan como un barrido de bandas en el gel. el producto de la amplificación puede ser pobre. de los primers y los agentes quelantes que contenga el templado. tal como DNA genómico humano. que esté presente en una concentración más baja. y una polimerasa que posea una actividad exonuclease 3’-5’. en una concentración más alta. mientras que el Mg2+ escaso puede generar menos productos amplificados. Figura 16. Long PCR Aspectos Generales Al usar la PCR para amplificar fragmentos de más de 10 kbp es esencial la preparación de muestras intactas (libre de mellas) y completamente purificadas con varios pasos de extracción y purificación.LONG PCR Para llevar a cabo esta técnica de manera eficiente es necesario el uso de dos polimerasas: una polimerasa principal en la reacción que no tenga actividad de proofreading. La actividad exonucleasa 3’-5’ elimina estos errores en las bases y hace que la reacción posterior proceda. La concentración óptima del magnesio se puede afectar por las características y propiedades de la mezcla de reacción. Bajas concentraciones de primer se recomiendan para DNA altamente complejo. Las concentraciones del primer se pueden fijar dependiendo de las características y las cantidades de DNA.1 a 1. La concentración óptima de los primers está en un rango de 0.0 mM. La eficiencia disminuye drásticamente cuando se incorporan las bases incorrectas. En una concentración más baja que la óptima. Por otra parte. 31 .

Un tiempo de la desnaturalización demasiado corto o una temperatura demasiado baja puede causar una eficiencia pobre en la amplificación. un obstáculo de la detección que pueda ahora ser superado gracias a las nuevas tecnologías. La fracción de la polimerasa contiene solamente la polimerasa.Para establecer la concentración de enzima deben ser consideradas la cantidad o la complejidad del DNA templado y de la longitud del fragmento amplificado. 10 segundos. Después se agrega la fracción de la polimerasa durante el primer paso de alineamiento y extensión. 68ºC por n minutos +15 segundos/ciclo (15 veces) Los 15 segundos por ciclo para los ciclos 16-30 puede ser necesaria para solamente fragmentos más largos (20 Kb). Cada fracción contiene la misma concentración de buffer. La reacción se divide en dos partes: una fracción de templado/primer que es 3/4 o 4/5 del volumen de la reacción. o incrementando la cantidad de sondas de hibridación usando cócteles del oligonucléotido o múltiples sondas de cRNA. Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 • • • Inicial desnaturalizando a 94ºC durante 10-15 segundos. PCR in situ La hibridación in situ (ISH) ha demostrado ser una herramienta molecular muy importante en diagnóstico y la investigación y ha avanzado perceptiblemente el estudio de la estructura y de la expresión del gen a nivel de células individuales. la utilidad de ISH es limitada por la sensibilidad de cerca de 20 copias del mRNA por la célula. En años recientes. Exceso de la enzima puede causar reacciones no específicas. La temperatura óptima de alineamiento experimental se determina en un rango de 45-68°C. para desnaturalizar. 68ºC por n minutos (15 veces) Ciclos 16-30 94ºC. Se pone la fracción de templado/primer en el tubo y se calienta en la máquina de PCR a 94ºC por 10 segundos. y una fracción de la polimerasa que constituye el resto. Un tiempo de la desnaturalización demasiado largo o una temperatura de la desnaturalización demasiado alta puede no generar ningún producto identificable. Hot Start Se puede utilizar el método de hot start para hacer una Long PCR. las estrategias para mejorar los límites de detección en estudios de ISH han incluido protocolos que amplifican la detección de la señal. Sin embargo. Ciclos 1-15 94ºC 10 segundos. La eficacia de la amplificación puede ser disminuida cuando la concentración de la enzima es baja. Se recomiendan condiciones de desnaturalización de 20 segundos en 98°C o 30 segundos en 94°C. el buffer y agua. El número óptimo de ciclos es alrededor 25 a 30 ciclos considerando la cantidad o la complejidad del DNA templado y la longitud de los fragmentos amplificados de la DNA. el resto de los componentes se incluyen en la fracción de templado/primer. Una tercera estrategia que emplea la PCR es la amplificación basada en las 32 .

un mecanismo para ciclación y el material celular en la solución o en laminillas de cristal Antes de llevar a cabo la PCR in situ. 3H-CTP o biotina-16-dUTP) que se han incorporado en los productos de PCR (PCR in situ directa) 33 . Un ciclo térmico se completa poniendo las laminillas de cristal sobre los bloques de calentamiento de un termociclador convencional o diseñado especialmente o usando hornos que completan un ciclo térmico. Esta estrategia fue desarrollada independientemente por varios laboratorios en 1980 Principios y métodos Los aspectos importantes para la PCR in situ incluyen la fijación y la permeabilización durante la preparación de la muestra. Figura 17.secuencias de nucleótidos del blanco. PCR in situ Las células en la mezcla de reacción de PCR son termocicladas en tubos microEppendorf usando cicladores convencionales de bloque. La detección de los productos de PCR intracelular se realiza por dos técnicas diferentes: 1) Indirectamente por ISH con sondas específicas para el producto de PCR (PCR in situ indirecto) 2) Sin ISH con la detección directa de los nucleótidos etiquetados (digoxigenina-11dUTP. fluoresceina-dUTP. La amplificación de PCR de las secuencias blanco se realiza después en las células intactas en tubos micro-Eppendorf o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas de cristal (Figura 17). Después de la PCR las células son citocentrifugadas sobre las laminillas de cristal con la visualización de los productos intracelulares de PCR por ISH o inmunohistoquímica. las células o las muestras del tejido fino son fijadas y permeabilizadas para preservar la morfología y permitir el acceso de los reactivos de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. La PCR in situ en las laminillas de cristal es realizada sobreponiendo las muestras con la mezcla de PCR debajo de una tira que se sella con cera o aceite mineral para prevenir la evaporación de la mezcla de reacción.

34 . preparación de sondas marcadas para hibridización) los productos de PCR se clonan a menudo en vectores apropiados (Figura 19). la transcripción in vitro. Ahorra templado.OTRAS VARIANTES DE LA PCR Multiplex PCR Es una PCR en la cual hay múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Nested PCR CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR Para conseguir una mayor eficiencia en varios usos del “downstream” (por ejemplo. el producto de amplificación de la primera PCR es el molde de la segunda. apareciendo un barrido. Requiere una cuidadosa optimización Nested PCR Consiste en dos procesos de amplificación sucesivos. especialmente en el caso de muestras de baja calidad o con un pequeño númerode copias de la secuencia a amplificar. Figura 18. de forma que en la segunda PCR se utilizan unos primers contenidos en la secuencia amplificada en la primera reacción (Figura 18). Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco más internamente que los primeros. la expresión de genes. Se usa frecuentemente en diagnóstico médico. Se aplica cuando se quiere mejorar la sensibilidad y especificidad de la técnica. tiempo y gastos. Éstos pueden verse como múltiples bandas en un gel de azarosa. A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a partir de un templado complejo. Es decir. Se obtiene un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers. secuenciación.

y la longitud del producto de PCR. debido a que Xcm I tiene una secuencia de reconocimiento poco común. Los productos de PCR con esa extensión del adeninas en el extremo 3' se pueden clonar en un vector que contiene timidinas 3' complementarias (clonación TA). un método que permita la clonación direccional es útil. varias DNA polimerasas (por ejemplo. Clonación TA La Taq polimerasa tiene una actividad transferasa terminal que agrega preferencialmente adenina a los extremos 3' de los productos de PCR. Alternativamente. Los vectores T pueden ser hechos usando una enzima de restricción como la XcmI. para la expresión de proteínas. el tipo de polimerasa usado. 35 . el sitio de restricción de Xcm I tiene que ser introducido por inserción de un oligonucleótido sintético en el sitio de clonación. Sin embargo. si se utiliza una polimerasa con actividad de “proofreading” para un estudio mutagénesis sitio-dirigido. Las polimerasas usadas para el método de clonación TA deben exhibir actividad de transferasa terminal y carecer de actividad exonucleasa 3'-5’. Además de la Taq polimerasa. se han desarrollado varias técnicas. se deben considerar varios factores. Para facilitar la clonación de los productos de PCR. los vectores T se pueden preparar por la adición enzimática de un solo residuo de timidilato con la transferasa terminal y el ddTTP o la Taq polimerasa y el dTTP. la Tth polimerasa) tienen estas características y por lo tanto se pueden utilizar para la clonación TA. Por ejemplo. como el propósito de la clonación. Clonación de productos de PCR La clonación del DNA amplificado es a menudo un paso difícil en el análisis de los productos de PCR.Figura 19. Por otra parte. la clonación en vectores con extremos romos (blunt end) puede ser conveniente. Para elegir un método.

Varios métodos de clonación requieren la modificación de los primers de PCR para mejorar la eficacia de la clonación y facilitar la clonación direccional de los productos de PCR. una enzima de restricción poco común se agrega a la mezcla de ligación para linearizar cualquier vector ligado a sí mismo formado durante la reacción. Existen técnicas que permiten remover una sola extensión de nucleótidos de los productos de PCR generados con la Taq polimerasa. el fragmento de DNA amplificado se digiere con la enzima de restricción apropiada y se liga en un vector linearizado. Algunas enzimas de restricción no pueden cortar en las secuencias localizadas cerca de los extremos del DNA de doble cadena lineal. Además. 36 . Después de la PCR. Los extremos 3' de una sola cadena que resultan se pueden entonces alinear a los extremos complementarios del vector y las moléculas quiméricas de DNA que resultan se transforman sin ligación in vitro. los extremos 5' de los primers de PCR son parcialmente complementarios a las secuencias del vector y contienen varios residuos de dUMP. puesto que la secuencia del producto de PCR es a menudo desconocida. estos primers se incorporan en el producto de PCR. Otro método que utiliza los primers modificados es la clonación con ligaduraindependiente En la clonación mediada por la uracil glicosilasa. En este método. Clonación direccional a través de primers modificados.Clonación de extremos romos Las DNA polimerasas con actividad exonucleasa 3'-5' remueve los nucleótidos mal apareados de los extremos 3' del DNA de doble cadena y genera productos con extremos romos. Un método común para una clonación direccional eficiente es introducir sitios de restricción adicionales en el extremo 5' de cada uno de los primers. Los productos de PCR generados por estas polimerasas se pueden clonar en vectores con extremos romos. Por lo tanto se ha desarrollado una variación más eficiente del método de clonación de extremos romos. Mientras que procede la amplificación. Después de que los residuos de dUMP sean quitados por uracil DNA glicosilasa. La incorporación de estos primers durante la PCR da lugar a la colocación selectiva de los residuos de dUMP en el extremo 5' de los productos de la amplificación. Generalmente la clonación de extremos romos de los productos de PCR (o de cualquier DNA) en plásmidos es menos eficiente que la clonación extremos cohesivos. los lados apirimídicos que resultan son susceptibles a ser cortados por las condiciones alcalinas. la enzima de restricción elegida podría potencialmente reconocer y cortar los sitios dentro del producto. estos productos de PCR se pueden también clonar por la ligación de extremos romos en un vector conveniente.

Bajo condiciones controladas de reacción. Para la clonación de productos grandes de PCR (mayor de 10 KB) el uso de vectores basados en plásmidos es difícil porque la capacidad de clonación en vectores es limitada.Un ejemplo de clonación direccional que no requiere primers especiales es la clonación direccional basada en la Exonucleasa III. Método de extensión solapada 37 . Se utilizan los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa. El producto modificado de PCR que resulta se puede clonar fácilmente en un vector linearizado con las bases complementarias. un método basado en cósmidos se ha desarrollado para clonar fragmentos de hasta 36 KB con alta eficiencia. Figura 20. Mutagénesis con PCR-extensión solapada El método de extensión solapada (Figura 20) requiere 2 primers mutagénicos y otros 2. La clonación eficiente de fragmentos largos de DNA se puede alcanzar solamente con vectores cosmidos y sistemas de empaquetado. Ambos portan la mutación. la actividad exonucleasa 3'-5' de la Exonucleasa III se puede utilizar para degradar el producto de PCR de los extremos 3' de ambas cadenas. Clonación de fragmentos largos de DNA Usando mezclas de diversas polimerasas se ha podido amplificar blancos largos de DNA. Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´ que se solapan. MUTAGÉNESIS POR PCR Consiste en introducir cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Recientemente.

Para combinar varias mutaciones deseables. cada mutación puede ser recombinada y propagada individual e independientemente de otras mutaciones. mientras que triptofano está codificado por un solo codón). En principio. La razón de esto. Este iniciador se sintetiza químicamente para llevar una mezcla al azar de nucleótidos en uno o más codones y la proteína codificada lleva. una enzima que corta en forma inespecífica. un producto de PCR. Varios métodos de los métodos reportados requieren de DNA de una sola cadena como templado. solamente con baja probabilidad y muchas mutaciones beneficiosas serán enmascaradas por las deletéreas. la expresión del gen y la modificación del vector. el aminoácido serina es codificado por seis codones diferentes. Dado que la mayoría de las mutaciones no son beneficiosas. un conjunto de aminoácidos al azar. 38 . El gen de interés es amplificado con una ADN polimerasa en condiciones donde la fidelidad transcripcional es baja y se introducen errores en las copias generadas. donde el conjunto de fragmentos de ADN generado por la PCR es digerido por DNasa I. en esta posición particular. Desafortunadamente. Luego. por ejemplo. La solución a este problema es usar trinucleótidos presintetizados (codones) para todos los 20 aminoácidos como bloques de construcción para la síntesis de ADN de los oligonucleótidos. en lugar de utilizar los mononucleótidos convencionales. El fragmento de ADN conteniendo el punto mutado es recortado en dos sitios de restricción flanqueantes.Mutagénesis sitio dirigida La mutagénesis sitio-dirigida in vitro es una técnica invaluable para estudiar relaciones de la estructura-función de proteínas. Para introducir mutaciones solamente en una región particular de un gen. se utiliza un segundo método. dos mutaciones favorables se acumularán en el mismo gen. por lo tanto. y se reensamblan los trozos por PCR. un codón completamente formado al azar exhibirá una fuerte desviación hacia algunos aminoácidos que son codificados por más de un codón. Los métodos de PCR sitio-dirigidos permiten así que las mutaciones sitio-específicas sean incorporadas en cualquier plasmido de doble cadena. El uso de PCR en mutagénesis sitio-dirigida logra la separación de las hebras usando un paso de desnaturalización que separa las hebras complementarias y permitiendo la polimerización eficiente de las primers de PCR. puede utilizarse la mutagénesis en cassette por PCR. Este proceso se asemeja al “crossingover” que tiene lugar en los cromosomas de los organismos vivientes. que puede ligarse exactamente en estos sitios de restricción. ha sido históricamente la necesidad de separar los filamentos complementarios para evitar el realineamiento. siendo también difícil evitar la incorporación de un codón de terminación. se genera con un primer degenerado. Estos bloques pueden ser mezclados en cualquier proporción y solamente se necesita agregar aquellos trinucleótidos que el investigador desea en esta posición en la secuencia proteica (Figura 21).

por lo tanto. generalmente. la PCR se ha convertido en una herramienta importante para analizar el genoma humano. Las mutaciones quedan. cruzadas y los genes con el mayor número de mutaciones favorables pueden ser enriquecido por selección. Así. por lo tanto. utilizando la enzima ADNasa I y se reensamblan. Amplificar e identificar las secuencias blanco in situ. Por ejemplo. En ciclos sucesivos de PCR. completamente. Se muestran dos tipos de mutaciones. la PCR se ha utilizado para el mapeo de cromosomas y para analizar cambios grandes y pequeños en estructura cromosómica. En el panel (A) se muestra en forma esquemática el proceso de PCR “sujeto a error”. El producto de PCR se corta en pequeños trozos. mediante PCR. Genere sondas de hibridación específicas para cromosoma. Además de generar cantidades grandes de templado para secuenciar.Figura 21. con el fin de obtener las modificaciones localizadas o en genes enteros. Estrategias para mutagénesis.   APLICACIONES ESPECIALES DE LA PCR Durante los últimos años. Una posible solución a este problema. por la presencia de las desfavorables. El panel (C) muestra el principio de PCR utilizando un “primer degenerado”. una mezcla de codones ensamblados a partir de trinucleótidos. el efecto benéfico de las mutaciones favorables puede ser opacado. Este “primer” o iniciador contiene una mezcla de todos los cuatro posibles nucleótidos (abreviados en la letra N) en una posición determinada o. las moléculas contendrán alguna de cualquier tipo. alternativamente. Estudiar la evolución de las secuencias de un gen y los efectos de variabilidad de la secuencia en la función del cromosoma. se muestra en el panel (B) y se conoce como “mezclado de ADN”. 39 . Las proteínas sintetizadas a partir de este gen llevarán. se introducen más mutaciones de cada tipo y. un grupo “randomizado” de aminoácidos en esta posición. las favorables (cuadrados) y las desfavorables (círculos). la PCR lo ha hecho posible: • • • • Usar las secuencias repetidas en el genoma como marcadores genéticos. como una estrategia para la distribución no dirigida de mutaciones en un gen de interés. subsecuentemente.

med. Estados Unidos. 25.. Academic Press Inc..BIBLIOGRAFÍA 1.espanol.169-193.com/ http://folk.pdf 40 .htm http://www. Journal of Molecular Endocrinology. Innis M.pcrlinks.no/kristban/realtime/pfaffl. 1994.roche-applied-science. Griffin H.uio. PCR Technology: Current Innovations. White T. A.. PCR Protocols. 2000. M.com/PROD_INF/MANUALS/pcr_man/index. 1990. J. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Bustin S. http://www. CRC Press Inc. Gelfand D.edu:85/pcr/realtime-home. A.sc. 3. G. 2..htm http://www. Sninsky J. J. H. Estados Unidos. Griffin A.

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