Está en la página 1de 43

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA MTODOS FSICO-QUMICOS EN BIOTECNOLOGA PCR ALUMNOS: CORTAZAR MARTNEZ ADRIANA SILVA

RINCN ELSA PATRICIA JUNIO, 2004

NDICE Introduccin Historia y Desarrollo Metodologa bsica Componentes de la reaccin Nucletidos Primers Especificidad Secuencias complementarias Contenido de G/C Secuencia de los extremos 3 Temperatura de asociacin Clculo de la temperatura de fusin (Tm) Programas de Diseo de Primers Templado Polimerasa Concentracin de Magnesio Otros componentes de la reaccin Parmetros de la reaccin Desnaturalizacin Alineamiento Extensin Nmero de ciclos Termocicladores Identificacin de los productos de PCR RT PCR PCR en tiempo real Tcnicas de deteccin SYBR greenTM Hydrolysis probes Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Hybridization probes Scorpions Cuantificacin Genes estndares El efecto de limitar los reactivos PCR competitivos cuantitativos Mquinas para PCR en tiempo real Ventajas del tiempo Real Primers Degenerados Uso de los primers degenerados Diseo de los primers degenerados Alineacin de la secuencia Informacin de la secuencia terminal de aminocidos Degeneracin de primers 1 2 4 4 4 5 6 6 6 6 6 7 7 8 8 9 9 9 10 10 11 11 12 13 15 16 17 17 18 18 19 20 21 24 24 25 26 27 28 28 29 29 29 29

La reaccin de PCR El cct el de PCR Los ciclos de PCR (el termociclador) Problemas comunes Secuenciacin Controles Long PCR Aspectos Generales Programa genrico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 Hot Start PCR in situ Principios y Mtodos Otras variantes de la PCR Multiplex PCR Nested PCR Clonacin de productos de PCR Clonacin TA Clonacin de extremos romos Clonacin direccional a travs de primers modificados. Clonacin de fragmentos largos de DNA Mutagnesis por PCR Mutagnesis con PCR-extensin solapada Mutagnesis sitio dirigida Aplicaciones especiales de la PCR Bibliografa

29 29 29 30 30 30 30 31 32 32 32 32 33 33 34 34 35 36 36 37 37 37 38 39 40

INTRODUCCIN La biotecnologa, en un sentido amplio se puede definir como la aplicacin de organismos, componentes o sistemas biolgicos para la obtencin de bienes y servicios. La Ingeniera Gentica (I.G.), conocida como tecnologa del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho. No cabe ninguna duda de que la tcnica ms revolucionaria de los ltimos 15 aos ha sido la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propia Ingeniera gentica y a toda la biologa molecular. Fue inventada por Kary Mullis a mediados de los aos 80. Muchas de las tcnicas clsicas de la Ingeniera gentica estaban encaminadas a resolver el complejo problema de cmo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN. Sin embargo, esas tcnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no den resultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en principio producir in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la clonacin en un organismo husped. Esencialmente la tcnica permite la amplificacin selectiva de cualquier segmento de ADN, conociendo las secuencias que lo flanquean. Como alguien ha dicho, "es una tcnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un pajar de agujas por amplificacin selectiva". Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son prcticamente ilimitadas:

simplifica muchos experimentos de I.G. permite muchos estudios de expresin gentica secuenciacin directa de secuencias amplificadas deteccin de mutaciones seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades diagnsticos de enfermedades genticas e infecciosas en ciencia forense: identificacin de restos biolgicos, determinacin de paternidad, pruebas periciales en criminalstica en arqueologa y paleontologa

HISTORIA Y DESARROLLO

Kary Mullis Hasta mediados de la dcada del ochenta, la nica estrategia posible para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". Este mtodo se basa en la introduccin de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendr el gen de inters, en vectores. stos son molculas de ADN (plsmidos o ADN de bacterifagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeo tramo de la secuencia de aminocidos de una protena cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden disear mtodos para identificar qu bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Este reconocimiento tambin se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la protena resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadora porque fabrica la protena codificada por el fragmento de inters, la cual se une especficamente al anticuerpo. Una vez aislado el gen no slo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de bases o analizar en detalle la informacin de la que es portador, sino que tambin se puede estudiar su expresin (la manera en que dirige la sntesis de la protena correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en clulas en cultivo o en animales de experimentacin, etctera. Estas tcnicas, ya clsicas, han permitido el aislamiento y caracterizacin de decenas de miles de genes de microorganismos, animales y plantas, lo que provoc un cambio cualitativo en la comprensin del funcionamiento de la clula. En 1985, K. Mullis, un investigador de la Corporacin Cetus, invent un mtodo para lograr la multiplicacin in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores y su replicacin en bacterias. Este mtodo revolucionara en corto tiempo el conjunto de tcnicas de la biologa molecular. Su uso se extendi rpidamente a miles de laboratorios, no slo de investigacin bsica, sino tambin de diagnstico clnico. Se trata de la reaccin en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas provenientes del ingls Polymerase Chain Reaction.

Esta tcnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el trmino que se ha impuesto) pequeas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta ms de dos mil nucletidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas. Cuando el proceso era manual la tcnica de PCR era lenta y requera de trabajo intensivo. Por lo tanto, los cientficos de Cetus comenzaron a buscar las maneras de automatizar el proceso. Para replicar el ADN, la tcnica PCR hizo uso, en un principio, de la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura requerida para desnaturalizar la doble cadena del ADN, por lo cual deba agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. La primera mquina termocicladora, "Mr. Cycle" fue creada por los ingenieros de Cetus para tratar esa necesidad de agregar la enzima fresca a cada tubo de prueba despus del calentamiento y del proceso de enfriamiento. Sin embargo, este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplaz por su equivalente de la bacteria "termfila" Thermus aquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este microrganismo, denominada Taq polimerasa, acta eficientemente entre los 75C y los 80C y resiste ms de dos horas a 93C. La purificacin de la polimerasa de Taq dio lugar a la necesidad de una mquina que realizara un ciclo ms rpidamente entre diversas temperaturas. En 1985, Cetus se asoci con la corporacin Perkin-Elmer e introdujo la DNA Termal Cycler. De esta manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reaccin en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarn los ciclos trmicos programados. En 1989, Cetus anunci un acuerdo de colaborar con Hoffman-LaRoche en el desarrollo y la comercializacin de productos de diagnstico humanos in vitro y de servicios basados en tecnologa de PCR. En 1990, los cientficos alcanzan la primera amplificacin y deteccin simultnea de las secuencias especficas de DNA usando un colorante fluorescente, poniendo el fundamento para la PCR en tiempo real o PCR "cintico" (pruebas TaqMan). En 1991 Hoffmann-La Roche Inc. adquiere los derechos y las patentes mundiales de la PCR. El Dr. Kary Mullis comparte el premio Nobel de Qumica en 1993 por inventar la tecnologa de PCR.

METODOLOGA BSICA

Componentes de la reaccin Los nucletidos Los nucletidos se diluyen en agua, la solucin debe ser protegida (por ejemplo con el 10mM Tris pH 7,7-8,0 , concentracin final) . Si no, un pH cido promover la hidrlisis del dNTP en dNDP y dNMP y los har intiles para las reacciones de polimerizacin de la DNA enzimtica. Los stocks son diluidos a 10 mM, alicuotados y almacenados a -20 C. Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP. La estabilidad de los dNTP durante ciclos repetidos de PCR es tal que aproximadamente el 50% permanece como dNTP despus de 50 ciclos.

Concentraciones entre 20 y 200 M resultan en un balance ptimo entre rendimiento, especificidad y fidelidad. Los cuatro dNTP deben ser usados en concentraciones equivalentes para minimizar errores de incorporacin de bases. Se debe decidir la mas baja concentracin adecuad de dNTP para la longitud y composicin de la secuencia blanco. Por ejemplo, 20 M de cada dNTP en una reaccin de 100 l es suficiente para sintetizar 2.6 g de DNA o 100 pM de una secuencia de 400 bp. Primers Los oligonucletidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN. La seleccin de oligonucletidos iniciadores es muy importante en la reaccin en cadena de la polimerasa. De este paso depende el xito en el laboratorio. En la tabla 1 se muestran los criterios principales a considerar para la seleccin adecuada de los primers.
Tabla 1. Criterios Principales

Tamao Base en el extremo 3'

Tamao ideal: 20-25 nucletidos de longitud generalmente: 18-30 nucletidos de longitud Debe ser una G o una C

Temperaturas de fusin 50-65 C (Tm) contenido GC auto-complementariedad Similaridad 40-60% Debe ser evitada Para minimizar la formacin de estructuras secundarias y los dimeros de primer Debe tener un 100% de apareamiento con el molde

Cuando el objetivo a amplificar es un locus, la posicin de los iniciadores debe ser relativa a los codones de inicio y terminacin. Es recomendable que el cebador "forward" se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia que codifica, de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb despues de la regin que codifica. Las concentraciones ptimas de los primers son generalmente entre 0.1 y 0.5 M. Altas concentraciones de primer pueden promover mispriming y acumulacin de producto no especfico y puede incrementar la probabilidad de generar un templado independiente llamado dmero de primer. Los productos no especficos y los dmeros de primers son por si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por la enzima, dNTPs y primers, resultando en un bajo rendimiento del producto deseado. Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5 o mismatches para incorporar sitios de enzimas de restriccin, un codn de inicio ATG, o secuencias promotoras en la secuencia blanco. Pueden ser usados primers degenerados para extraer genes nuevos en base a su similitud o su secuencia de aminocidos. 5

Una razn menos obvia por la que los primers fallan es la presencia de estructuras secundarias en el templado de DNA. En este caso la substitucin de dGTP por 7-deazo-2deoxiGTP ha sido muy usada Especificidad La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. Los primers deben ser elegidos de modo que tengan una secuencia nica dentro del DNA que ser amplificado. Un primer diseado con una secuencia altamente repetida dar lugar a productos no deseados. Sin embargo, el mismo primer puede dar una sola banda si se amplifica una sola clona de una biblioteca genmica. Secuencias Complementarias del primer Los primers necesitan ser diseados con menos de 3 pares de bases de homologa entre ellos. Si un primer tiene tal regin de homologa se formarn estructuras parciales de doble cadena que interferirn con el alineamiento. Si la homologa ocurre en el extremo 3' de cualquier primer, ocurrir la formacin de dmeros de primer que, a menudo, prevendr la formacin del producto deseado por competicin. Contenido de G/C La composicin base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de poliC que pueden promover el reconocimiento no especfico. Las regiones poliA y poliT deben tambin ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Esto puede bajar la eficacia de la amplificacin. El primer tendr un contenido de G/C del 50% y ~20 bases de largo. Esto pondr la Tm en la gama de 56C - 62C. Secuencia de los extremos 3' Es establecido que la posicin terminal 3' en primers de PCR es esencial para el control del mispriming. La inclusin de un residuo de G o de C en el extremo 3' de los primers ayuda a asegurar el correcto enlace en el extremo terminal 3' debido al enlace de hidrgeno ms fuerte de los residuos G/C. Tambin ayuda a mejorar la eficacia de la reaccin reduciendo al mnimo la respiracin que pudo ocurrir. Temperatura de Asociacin La temperatura de asociacin de los primers es uno de los factores ms determinantes de la reaccin. Se recomienda que se emplee como temperatura de asociacin la temperatura de fusin -5C, aproximadamente. Existen muchos mtodos para calcular la temperatura de fusin, pero siempre, despus de efectuado el clculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociacin cercanas a la temperatura de fusin para determinar la temperatura ptima para cada reaccin.

Clculo de la temperatura de fusin (Tm) Existen muchos mtodos para estimar el valor de la temperatura de fusin. Para secuencias de 20 bp o menos, existe la siguiente aproximacin: Tm = 2C (A + T) + 4C (G + C) donde se asume una concentracin de sal de 0.9M, tpica de "dot blot" y otros ensayos de hibridizacin A continuacin tenemos otra expresin para el clculo de Tm Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 500/L + 16.6 log[M], donde L se refiere a la longitud del oligonucletido, y [M] es la concentracin de cationes monovalentes. Esta frmulas es nicamente aplicable a secuencias polinucleotdicas largas. El mtodo mas preciso para estimar la Tm de oligornucletidos est basado en el anlisis termodinmico del proceso de fusin del cual se puede mostrar que,

Los cambios en la entalpa ( ) y la entropa ( ) de la formacin del dplex se calculan a partir de parmetros termodinmicos de vecindades. R es la constante molar de los gases (1.987 cal.K-1mol-1), y C es la concentracin molar del oligonucletido. Se puede adicionar un segundo trmino a la ecuacin anterior para tener en cuenta el efecto estabilizante de la sal sobre el dplex:

Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los mrgenes del error experimental. Programas de Diseo de Primers Existen programas disponibles en la red que ayudan al diseo de primers. Por ejemplo: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi http://alces.med.umn.edu/rawprimer.html

Templado Una de las caractersticas ms atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad de la muestra de DNA sujeta a amplificacin no necesita ser alta. Una sola clula o un lisado celular crudo o especimenes con una longitud promedio de unos pocos cientos de pares de bases son usualmente adecuadas para una amplificacin exitosa. El criterio esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que abarque la regin que va a ser amplificada y que las impurezas sean suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerizacin. La polimerasa

Un rango de concentracin recomendado para Taq polimerasa (Perkin-Elmer CETUR) es entre 1 y 2.5 unidades (SA = 20 unidades/pmol) por 100 l de reaccin cuando los otros parmetros son ptimos. Sin embargo, los requerimientos de enzima pueden variar con respecto a la secuencia blanco o los primers. Cuando se optimiza un PCR, se recomienda probar rangos de concentracin de enzima de 0.5 a 5 unidades/100 l. Si la concentracin de la enzima es muy alta se acumulan productos no especficos, y si es muy baja se formara una cantidad insuficiente del producto deseado.
Tabla 2. Caractersticas de algunas polimerasas termoestables de DNA Enzima Taq Pol Tli Pol (Vent) Pfu Pol Ruth
a

Eficiencia Relativaa 88 70 60 n.d.

Tasa de errorb 2x10-4 4x10-5 7x10-7 n.d.

Procesividad 55 7 n.d. 30

Tasa de Extensind 75 67 n.d. 60

3 a 5 exo no si si no

5 a 3 exo si no no si

Porcentaje de conversin de templado a producto por ciclo. Frecuencia de error por pares de bases incorporadas. c Nmero promedio de nucletidos adicionados antes de la disociacin. d Nmero promedio de nuclotidos adicionados por segundo. n.d. = no determinado
b

Concentracin de Magnesio Es benfico optimizar la concentracin del in magnesio, ya que afecta: el alineamiento de los primers, la temperatura de disociacin de las cadenas, tanto del templado como del producto de PCR, la especificidad del producto, la formacin de dmeros de primer y la actividad y fidelidad de la enzima. La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unin con el templado, los primers y los dNTPs. Los PCR deben contener 0.5 a 2.5 mM de magnesio sobre el total de la concentracin de dNTP. La presencia de EDTA u otros quelantes en el stock del primer o del templado puede alterar la concentracin ptima aparente de magnesio. Otros componentes de la reaccin Un buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl (pH entre 8.3 -8.8). Tris es un buffer inico bipolar que tiene un pKa de 8.3 a 20C y un _ pKa de -0.021/C sin embargo el verdadero pH de una buffer 20mM de Tris (pH 8.3 a 20C) varia entre 7.8 y 6.8 durante las condiciones tpicas del termociclador. Hasta 50 mM de KCl puede ser incluido en la mezcla de reaccin para facilitar el alineamiento de los primers. NaCl a 50 mM o KCl arriba de 50 mM inhibe la actividad de la Taq polimerasa. La gelatina o la albmina bovina (100 g/ml) y detergentes no inicos como el tween 20 o laureth 12 (0.05 a 0.1% ) son incluidos para ayudar a estabilizar la enzima, sin embargo muchos protocolos trabajan bien sin estos componentes. Parmetros de la reaccin

Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicacin del ADN. Est basado en la accin de la polimerasa, que como se sabe es la enzima que dirige la sntesis de ADN, y desde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. Para ello necesita al menos una pequea fraccin de cadena doble de ADN para iniciar la sntesis. Esto hace posible, si de forma voluntaria le proponemos una pequea fraccin de oligonucletidos que sean complementarios de una porcin, se unir despus de la desnaturalizacin de la doble cadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3 del DNA por aposicin de los nucletidos correspondientes suministrados y, a travs de la accin de la polimerasa, se hace la amplificacin del fragmento deseado. La PCR es un proceso que consta de tres pasos.

Desnaturalizacin.

La primera reaccin consiste en la desnaturalizacin del DNA, separndose las dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrgeno. Las condiciones tpicas de desnaturalizacin son 95C por 30 segundos, o 97C por 15 segundos; sin embargo temperaturas ms altas pueden ser apropiadas especialmente para templados ricos en G + C. La desnaturalizacin incompleta permite el apareamiento de las hebras de DNA y por lo tanto se reduce el rendimiento el producto. En contraste, los pasos de desnaturalizacin a altas temperaturas o por mucho tiempo provocan perdida de la actividad de la enzima. Alineamiento.

La segunda reaccin consiste en la hibridacin de los primers. Para ello se baja la temperatura y las condiciones sern tales que se facilitar la unin de los primers a las cadenas. La temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers depende de la composicin, tamao y concentracin de los primers amplificadores. Una temperatura de alineamiento ptima es 5C por debajo de la Tm de los primers. Debido a que las DNA polimerasas son activas en un amplio rango de temperaturas, la extensin de los primers puede ocurrir a bajas temperaturas incluyendo el paso de alineamiento. El rango de actividad de las enzimas varia en dos ordenes de magnitud entre 20 y 85C. Las temperaturas de alineamiento en el rango de 55 a 72C genera buenos resultados.

10

Extensin.

La tercera reaccin se efecta a 72 C, temperatura a la cual, la polimerasa lleva a cabo su accin, insertando los diferentes nucletidos complementarios en el orden que le va indicando la cadena que acta como molde. El tiempo de extensin depende de la longitud y concentracin de la secuencia blanco y de la temperatura. La extensin del primer se realiza tradicionalmente a 72C. Las estimaciones para la tasa de incorporacin de nucletidos a 2C varia de 35 a 100 nucletidos por segundo dependiendo del buffer, pH, concentracin de sales y la naturaleza del templado. Un tiempo de extensin de un minuto es considerado suficiente para productos de hasta 2 kb de longitud. Sin embargo, tiempos mayores de extensin pueden ser tiles cuando la concentracin del sustrato es muy pequea o cuando la concentracin del producto excede la concentracin de la enzima. Nmero de ciclos. Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. La repeticin de este ciclo unas 40 veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de amplificacin, millones de copias del fragmento de inters. El nmero ptimo de ciclos depender principalmente de la concentracin inicial del templado cuando los otros parmetros son optimizados. Un error comn es el de ejecutar demasiados ciclos, ya que esto puede incrementar la cantidad y complejidad de productos no especficos. Pocos ciclos dan como resultado un bajo rendimiento del producto. La cantidad de DNA dobla tericamente con cada ciclo de PCR, segn lo demostrado en la Tabla 3. Despus de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la anterior, as que despus de dos ciclos tenemos 2 x 2 veces, despus de 3 ciclos - 2 x 2 x 2 veces u 8 (23) veces la cantidad inicial, despus de 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 veces o 16 (24). As, despus de N ciclos tendremos 2N.

11

Tabla 3. Relacin entre cantidad de DNA y el nmero de ciclos.

Termocicladores

El termociclador es el aparato que permite llevar a cabo de forma automtica y reproducible la sucesin de ciclos de temperatura necesarios para la PCR. Los primeros termocicladores eran robots que movan una gradilla de tubos entre varios baos termostticos a tiempos preestablecidos. Los actuales constan, bsicamente, de un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado, con posibilidad de programar las temperaturas y los tiempos. Existen multitud de termocicladores en el mercado, aunque las caractersticas principales son las siguientes:

Constan de un bloque trmico, cuyo calentamiento y enfriamiento se produce a gran velocidad, gracias al denominado sistema Peltier. Las rampas de subida y bajada de temperatura son importantes para trasladar los protocolos entre termocicladores, y

12

uno de los factores de falta de reproducibilidad, lo que hace que deban ajustarse de nuevo las condiciones de tiempos y temperaturas. Actualmente, estn diseados mayoritariamente para tubos de 0,2 ml aunque an existen tambin para 0,5 ml. Es importante el perfecto ajuste del tubo en el bloque. Por ello, se recomienda utilizar los de la misma marca que el fabricante. El rango de temperaturas suele abarcar de 4C a 110C, aunque el rango habitual debe ser de 15C a 95C. No debe sobrecargarse al aparato con temperaturas extremas para prolongar su supervivencia. Los 4C se utilizan para refrigerar muestras tras una PCR, pero 15C tambin es una temperatura apta para ello. Respecto a llegar a 100C o ms, tampoco es aconsejable, al menos, de forma habitual. Es preferible emplear termobloques para llevar a cabo esta labor. Existen bloques que permiten ajustar distintas temperaturas en funcin de las zonas del mismo. Se dice que tienen funcin gradiente. Son muy tiles cuando se realiza ajuste continuo de programas de PCR, especialmente de temperaturas de hibridacin, o cuando se necesitan realizar diversos protocolos de forma simultnea.

Tapa trmica: los ms antiguos no la poseen, pero es un elemento indispensable para evitar la evaporacin de la muestra, al contactar totalmente con la tapa del tubo. Software para programacin de tiempos y temperaturas: se denomina programa a cada conjunto de datos trmicos y temporales de un protocolo de PCR. Cada termociclador tiene su propio software. Puede ajustarse tambin la velocidad de subida y bajada de temperaturas, es decir, las rampas. Identificacin de los productos de PCR

El hecho de que las molculas de ADN obtenidas al finalizar la reaccin en cadena correspondan efectivamente al fragmento de inters queda asegurado por la intervencin de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese fragmento. As, una vez que la reaccin ha finalizado, el tamao del fragmento multiplicado puede determinarse sometiendo los productos de la reaccin a una electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, es decir, a un proceso de separacin por difusin bajo la accin de un campo elctrico. Por otra parte, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridacin (unin complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases est contenida en el fragmento de inters. En este caso se procede as: el ADN fraccionado por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon, que acta como soporte slido (Southern blot), y luego es puesto en contacto con la sonda, que se unir al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta ser complementaria del mismo. Tambin es posible colocar el ADN directamente en la membrana en forma de pequeas manchas (dot blot) para su posterior hibridacin con la

13

sonda. La localizacin de las sondas radiactivas se logra, en ambos casos, mediante autorradiografas

Figura 1. Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la tcnica PCR. A: visualizacin directa. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la accin de un campo elctrico (electroforesis) migran de una manera caracterstica que se puede visualizar por tincin (coloreado) del ADN. (Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamao conocido.) B: Southern blot. El ADN es desnaturalizado (separacin de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridacin (unin) con una sonda radiactiva. sta quedar fijada donde se encuentre el tramo de ADN de inters y su presencia se revelar a travs de una autorradiografa (placa fotogrfica sensible a la emisin radiactiva de la sonda). C: dot blot. Mtodo anlogo al anterior, pero practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente desnaturalizados.

Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alcuota de la misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicacin tras haber colocado dos primers internos. Mediante el empleo de esta metodologa, conocida como nested PCR (PCR anidada), la filiacin de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de que poseen tamaos previsibles. En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por ciertas enzimas llamadas en endonucleasas de restriccin. La determinacin del tamao al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos en contacto con la enzima de restriccin adecuada indica que nos encontramos ante los segmentos de inters.

14

RT PCR Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR. La transcripcin reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es DNA complementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodologa PCR. Los pasos de la RT-PCR son: 1. Transcripcin reversa: Unin del primer a la secuencia de RNA objetivo. 2. Transcripcin reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensin del primer mediante la incorporacin de nucletidos complementarios. 3. Fin de transcripcin reversa, se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA. 4. PCR. El mRNA es copiado a cDNA por la transcriptasa reversa usando un primer dT (los primers al azar se pueden tambin utilizar)(Figura 2). En PCR en tiempo real, se utiliza generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. Esto elimina el mRNA permitiendo que la segunda hebra de DNA sea formada. Se adiciona una mezcla de PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa), los primers especficos para el gen de inters, los deoxinucletidos y un buffer conveniente.

Figura 2. Conversin de mRNA a cDNA por la transcriptasa reversa

El cDNA se desnaturaliza a mas de 90 (~94), las dos hebras se separan. A 50 o 60 los primers especficos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de unin a los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a 100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real A 72 la polimerasa extiende el DNA desde los primers. Se obtienen 4 cadenas de cDNA.

15

Despus de 30 o 40 ciclos de sntesis de cDNA, los productos de reaccin son analizdos usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tie con bromuro de etidio. Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos permite la cuantificacin ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la etapa logartmica de amplificacin. El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de DNA intercalandose entre los pares de bases. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro. Sin embargo, la fluorescencia no es muy brillante. Otros colorantes, como el SYBR green, que son mucho ms fluorescentes que el bromuro de etidio, se utilizan en el PCR en tiempo real (Figura 3).

Figura 3. El SYBR green fluoresce brillantemente solo cuando se une a DNA de doble cadena.

PCR EN TIEMPO REAL La RT-PCR es solamente semicuantitativa en el mejor de los casos, en parte por la insensibilidad del bromuro de etidio (sin embargo, hay maneras ms sensibles de detectar el producto). Los protocolos de PCR competitivos se han desarrollado para hacer el mtodo ms cuantitativo pero son a menudo complicados. As la PCR en tiempo real fue desarrollado debido a: La necesidad de cuantificar diferencias en la expresin del mRNA La disponibilidad de cantidades pequeas de mRNA en algunos procedimientos,

Hay una variedad de mtodos para la cuantificacin del mRNA. stos incluyen: northern blotting anlisis de proteccin de ribonucleasa (RPA) hibridacin in situ PCR

16

La PCR es el mtodo ms sensible y puede discriminar entre mRNAs cercanamente relacionados. Es una tcnico simple pero es difcil conseguir resultados verdaderamente cuantitativos usando PCR convencional. El northern blotting y RPAs son patrones excelentes, puesto que no hay amplificacin implicada, mientras que la hibridacin in situ es cualitativo ms que cuantitativo. Las tcnicas tales como el northern blotting y los RPAs trabajan muy bien, pero requieren ms RNA del que a veces se dispone. Los mtodos de PCR son por lo tanto particularmente valiosos cuando las cantidades de RNA son bajas, puesto que el hecho de que la PCR implica un paso amplificacin significa que es ms sensible. Sin embargo, la PCR tradicional es solamente semicuantitativa en parte debido a las dificultades de observar la reaccin durante la parte verdaderamente linear del proceso de la amplificacin. En contraste con la RT-PCR y el anlisis de los geles de agarosa, la PCR en tiempo real da resultados cuantitativos. Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la relativa facilidad y conveniencia de su uso comparadas a algunos mtodos ms viejos. Los productos de amplificacin se observan a medida que transcurren los ciclos de la PCR. Est basado en:

la deteccin y cuantificacin de un reportero fluorescente, cuya seal aumenta en proporcin directa a la cantidad de producto de PCR en la reaccin. el empleo de un termociclador que tiene acoplado un sistema de deteccin que es capaz de adquirir y cuantificar la seal emitida por el reportero al final de cada ciclo para cada muestra. Tcnicas de deteccin

La qumica de la deteccin est dada por:


Agentes intercalantes fluorescentes (SYBR Green) Sondas hidrolizadas Hairpin probes (Molecular Beacons, Scorpions) Sondas de hibridizacin.

SYBR greenTM Es un agente intercalante que se une al ADN de doble cadena dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR. Es simple y econmico, fcil de usar, sensible, verstil y no se necesitan sondas especficas. Sin embargo durante la reaccin de PCR puede unirse a dmeros de primers

17

y a otros productos inespecficos, resultando en una sobreestimacin de la concentracin del DNA blanco. Hydrolysis probes (TaqManTM) Se emplea una sonda que tiene unidos un fotocromo reportero y un fotocromo quencher. Cuando ambos fotocromos estn unidos a la sonda, el reportero no emite seal. Pero, cuando la sonda hibrida con la secuencia de inters durante la reaccin de PCR, la actividad exonucleasa de la Taq polimerasa corta al fotocromo reportero del resto de la sonda, permitiendo la emisin una seal fluorescente (Figura 4). Se monitorea la seal fluorescente del reportero que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR.

Figura 4. Hydrolysis probes

Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Estas sondas poseen secuencias repetidas invertidas (ITR) en sus extremos 5y 3. Este diseo permite que se forme una estructura de horquilla (hairpin) por complementariedad de las dos regiones ITR, en ausencia de la secuencia blanco. La secuencia interna de la sonda es complementaria al blanco, dirigiendo as la hibridacin especfica, resultando en una eficiente separacin del quencher y del reportero y la consecuente emisin de este ltimo (Figura 5).

18

Figura 5. Funcionamiento de las Hairpin probes (Molecular BeaconsTM)

Entre sus ventajas estn el que son ms especficas que las sondas TaqMan (deben tener un cambio conformacional para hibridar con el blanco), permiten distinguir dos secuencias blanco muy similares entre s y que se pueden combinar varias Molecular Beacons en una nica reaccin empleando diferentes compuestos fluorescentes para identificar secuencias blanco especficas distintas (Mltiplex PCR). Se requiere de un riguroso diseo de las regiones tallo y asa de la horquilla. Hybridization probes El diseo implica el uso de dos secuencias de oligonucletidos especficos como sondas, cada una marcada con un fluorforo diferente, comnmente, el extremo 3de la sonda donadora con fluorescena y el extremo 5de la sonda aceptor con LC Red 640 o LC Red 705 (Figura 6). Las dos sondas estn diseadas para hibridar en sus blancos especficos en un arreglo cabeza-cola que permite que ambos fluorforos estn en estrecha proximidad entre s. As, la transferencia de energa de resonancia slo ocurre cuando ambas sondas se hibridan al blanco muy prximas entre s, siendo la distancia ptima de 1 a 5 bases entre las sondas.

19

Figura 6. Hybridization probes

En comparacin con las otras dos tcnicas, estas sondas estn marcadas con un nico fluorocromo. Esto hace que sean ms fciles de sintetizar y caracterizar, y que el control de calidad sea ms sencillo que para las sondas doblemente marcadas. Scorpions Los scorpions son primers de PCR con una cola tallo y asa ("Stem-Loop") que contiene un fluorforo y un quencher. La estructura de tallo y asa es separada de la secuencia de del primer de PCR por una modificacin qumica que evita que se copie la secuencia de tallo y asa del scorpion (Figura 7). Durante la PCR, los primers de scorpions se amplifican para formar productos de PCR. En la etapa apropiada del ciclo de PCR (la fase de alineamiento), la secuencia de la sonda en la cola del Scorpion se enrosca para hibridarse a la secuencia blanco en el producto de PCR. Como la cola del scorpion y del producto de PCR es ahora parte de la misma hebra de DNA, la interaccin es intermolecular. La secuencia blanco se elige tpicamente para estar 3 bases dentro del extremo 3' del primer scorpion.

20

Figura 7. Scorpions

Cuantificacin La capacidad de monitorear el progreso en tiempo real de la PCR revolucion totalmente la manera de cuantificacin basada en la PCR de DNA y de RNA. Las reacciones son caracterizadas en el momento en el que la amplificacin de un producto de PCR se detecta despus de un nmero fijo de ciclos. Cuanto ms alto es el nmero de copias del blanco, ms pronto se observa el aumento significativo en la fluorescencia. En la figura 8 se muestra un diagrama representativo de la amplificacin. Un diagrama de amplificacin es una grfica de la seal de la fluorescencia contra el nmero de ciclos. En los ciclos iniciales de PCR, hay un pequeo cambio en seal de fluorescencia. Esto define la lnea de fondo para el diagrama de la amplificacin. Un aumento en fluorescencia sobre la lnea de fondo indica la deteccin del producto acumulado de PCR.

Figura 8. Diagrama de Amplificacin

21

Se adquieren los datos cuando la amplificacin est todava en la fase exponencial. Esto est determinado por la identificacin del nmero de ciclo al cual la intensidad de emisin del fluorforo aumenta con respecto al ruido de fondo (background). Este nmero de ciclo se llama ciclo umbral (Ct: threshold cycle). El Ct est determinado en la fase exponencial de la reaccin y es ms confiable que las mediciones en el punto final convencionales (Figura 9). El Ct es inversamente proporcional al nmero de copias del DNA blanco: a mayor concentracin de blanco, menor Ct medido.

Figura 9. Ciclo Umbral (Ct)

La grfica del logaritmo del nmero inicial de copias del blanco para un sistema de estndares contra Ct es una lnea recta (Figura 10). La cuantificacin de la cantidad de blanco en muestras desconocidas es lograda midiendo Ct y usando la curva estndar para determinar el inicio del nmero de copias. El proceso entero de calcular los Cts, de preparar una curva estndar, y de la determinacin del nmero de copias iniciales para las muestras es realizado por el software del sistema 5700 y 7700.

Figura 10. Curva Estndar

22

La figura 11a muestra la amplificacin, usando el sistema 5700, del gen humano de la -actinia en diluciones de DNA genmico. En esta figura, el cambio en la fluorescencia del SYBR Green se grafica contra el nmero de ciclos. Se corrieron seis rplicas para cada cantidad de DNA. La figura 11b muestra los mismos datos, pero graficando el logaritmo del cambio en la fluorescencia contra el nmero de ciclos. El software del sistema 5700 calcula el Ct para cada reaccin. Los valores de Ct se trazan contra el logaritmo de la cantidad inicial de DNA genmico para dar la curva estndar mostrada en la figura 11c

Figura 11. Amplificacin de la -actinia.

Estos tres diagramas ilustran los principios bsicos de la cuantificacin en tiempo real de PCR. Cuanto ms alta es la cantidad inicial de DNA genmico, mas pronto se detecta el producto acumulado en el proceso de PCR, y ms bajo es el valor de Ct. Los valores de Ct son reproducibles en las rplicas porque el umbral se escoge en la fase exponencial de la PCR. Esto se demuestra en la figura 11b donde el umbral intersecta la grfica de amplificacin en la regin donde hay una relacin lineal entre el logaritmo del cambio en fluorescencia y el nmero del ciclo. En la fase exponencial, los componentes de la reaccin no estn limitados y las reacciones de replicacin exhiben resultados reproducibles y uniformes.

23

Genes estndares Un control interno consiste en utilizar un gen cuya expresin no cambie. Un gen que puede ser usado como loading control (o estndar interno) debe tener varias caractersticas:

El gen estndar debe tener el mismo nmero de copias en todas las clulas. Debe expresarse en todas las clulas Un nmero de copias intermedio es ventajoso

Sin embargo, el estndar perfecto no existe, por tanto lo que se decida usar como estndar o estndares debe ser validado para su muestra. Si es posible, se debe ser capaz de demostrar que la expresin del estndar no cambia significativamente cuando las clulas o tejidos son sujetos a las variables experimentales que se planean usar. Estndares usados comnmente:

mRNA de Gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa mRNA de Beta actina mRNA de MHC I (complejo de mayor histocompatibilidad I) mRNA de Ciclofilina mRNAs para ciertas protenas ribosomales. Por ejemplo RPLP0 (protena ribosomal larga, P0). Tambin es conocida como 36B4, P0, L10E, RPPO, PRLP0, 60S protena ribosomal cida P0, protena ribosomal L10, Arbp o fosfoprotena ribosomal cida P0. rRNAs 28S o 18S (RNAs ribosomales) El efecto de limitar los reactivos

Los ciclos iniciales de PCR se caracterizan por un aumento exponencial en la amplificacin del blanco. Si los componentes de la reaccin llegan a ser limitantes, el ndice de la amplificacin del blanco disminuye hasta que se alcanza una meseta y hay poco o nada de aumento neto en producto de PCR. La deteccin de la fluorescencia de los sistemas 5700 y 7700 permite que el Ct sea observado cuando la amplificacin de PCR esta an en la fase exponencial. sta es la razn principal por la que el Ct es una medida ms confiable del nmero de copias que comienza, que una medida de la cantidad de producto acumulado en el punto final de la PCR. Durante la fase exponencial, ninguno de los componentes de la reaccin est limitado, consecuentemente, los valores de Ct son muy reproducibles para las reacciones que comienzan con el mismo nmero de copias. Esto conduce a una mayor precisin en la cuantificacin del DNA y del RNA.

24

Por otra parte, la cantidad de producto de PCR observada en el final de la reaccin es muy sensible a variaciones leves en los componentes de la reaccin. Esto es porque las medidas en el punto final se hacen generalmente cuando la reaccin esta ms all de la fase exponencial y una diferencia leve en un componente limitante puede tener un efecto drstico en la cantidad final de producto. Por ejemplo, las reacciones laterales, como la formacin de dmeros de primer, pueden consumir los reactivos a diversos grados de tubo a tubo. As, es posible que una muestra que comienza con un nmero ms alto de copias termine con menos producto acumulado que una muestra que comienza con un nmero ms bajo de copias. Las diferencias entre el punto final y la deteccin en tiempo real se ilustran grficamente en la figura 12, que demuestra la amplificacin de 96 muestras idnticas. El cambio total en la seal del reportero, en el ciclo 40, vara ampliamente entre las rplicas (Figura 12a). Sin embargo, los diagramas de la amplificacin son notablemente similares entre los ciclos 22 y 25, durante los cuales se determinan los valores de Ct (Figura 12b).

Figura 12. Diferencias entre el punto final y la deteccin en tiempo real

PCR competitivos cuantitativos Para compensar los problemas con las medidas en el punto final, se han desarrollado una variedad de tcnicas de PCR competitivo cuantitativo. Se construye un amplicon competidor que contiene los mismos sitios de unin que el primer y tiene la misma eficiencia de amplificacin que el blanco, pero es de alguna manera distinguible del blanco. Una caracterstica distinguible es hacer al blanco y los amplicones competidores de diferentes tamaos para poder utilizar la electroforesis en gel para discriminar los dos productos. Una cantidad conocida de competidor es colocada en la muestra, despus el blanco y el competidor son amplificados en la misma reaccin. Si la eficiencia de amplificacin del blanco y del competidor es idntica, el cociente del blanco y el competidor seguir siendo constante a travs del proceso de PCR. As, determinando el cociente del blanco y 25

del competidor en el final de la reaccin y conociendo la cantidad inicial de competidor agregada, la cantidad de blanco puede ser calculada. PCR competitivo se ha utilizado con xito para cuantificar DNA y RNA, pero su rango dinmica se limita a un cociente del blanco/competidor cercano de 1:10 a 10:1. La mayor exactitud es obtenida encontrando el punto de equivalencia en el cual el cociente del blanco y el competidor es 1:1. Para lograr esto, se deben probar varias diluciones para alcanzar un cociente conveniente. Otra desventaja es la necesidad de construir y de caracterizar un diferente competidor para que cada blanco sea cuantificado. Adems, se deben realizar estudios cuidadosos de la validacin para verificar que las eficiencias de la amplificacin del blanco y del competidor son iguales antes de que la cuantificacin de muestras experimentales pueda comenzar. Incluso una diferencia leve en eficiencia compromete seriamente la exactitud de la cuantificacin por PCR competitivo. En el final de la reaccin, PCR competitivo requiere la cuantificacin exacta de los amplicones del blanco y del competidor, que exige generalmente pasos de proceso laboriosos de post-PCR. Mquinas para PCR en tiempo real Hay muchas mquinas para PCR en tiempo real disponibles. El que se muestra en la figura 13 es el ICycler de BioRad. La tapa se desliza para acomodar las muestras en una placa de formato 96-pozos (96-well). Esto significa que podemos mirar varias muestras simultneamente. La mquina contiene una cmara fotogrfica sensible que supervisa la fluorescencia en cada pozo de la placa en intervalos frecuentes durante la reaccin de PCR.

Figura 13. ICycler de BioRad

El sistema ABI PRISM 7700, de Applied Biosystems (antes, Perkin Elmer) se basa en el empleo de placas especiales, con tapas pticas para su adaptacin al lector de fluorescencia. Cada pocillo tiene una forma similar a la de los tubos de 0,2 L. El funcionamiento es semejante al de un termociclador convencional, en cuanto a tiempos y temperaturas, aunque se ajusta y se controla desde un ordenador que posee el software especfico. Se registran las emisiones de fluorescencia de forma continua, el software lo convierte posteriormente en una representacin grfica, y preestablece un valor de Ct que puede ser modificado con posterioridad, en funcin del anlisis del usuario (Figura 14).

26

Figura14 .El software 7700 muestra una representacin de una placa con 96 pozos, donde se pueden identificar fcil y rpidamente los estndares y las muestras no conocidas. Despus de una corrida de PCR el nmero inicial de copias se muestra para cada muestra en el pozo.

El sistema LightCycler de Roche (Figura 15), se basa en el empleo de capilares de vidrio para la contencin de las muestras, y en un mecanismo de giro, similar a una centrfuga, denominado carrusel. El calentamiento y el enfriamiento se llevan a cabo mediante un sistema de aire. Todo ello tiene ventajas e inconvenientes. La principal ventaja es la rapidez, que permite obtener resultados, en muchos casos, en menos de 1 hora. Sin embargo, presenta un alto costo, ya que los capilares y otros materiales son especficos para este sistema, y bastante caros. Adems, los protocolos de tiempos y temperaturas no son intercambiables con otros sistemas de PCR cuantitativa, lo que requiere de nuevas optimizaciones.

Figura 15. LightCycler de Roche

Ventajas del tiempo Real La determinacin de valores de Ct siguiendo la cintica en tiempo real de PCR elimina la necesidad de un competidor que debe de ser amplificado con el blanco. La cuantificacin se puede realizar por el mtodo ms bsico que es preparar una curva estndar y determinar cantidad desconocida por comparacin con curva estndar. Comparado a las medidas del punto final, el uso de los valores de Ct tambin ampla la gama dinmica de la cuantificacin porque los datos se colectan para cada ciclo de PCR.

27

La PCR en tiempo real permite una amplificacin confiable con alta especificidad y sensibilidad. El producto de PCR se cuantifica en cada ciclo. Hay una alta correlacin entre la seal (Ct) y la cantidad de blanco. Con esta tcnica se tiene alta precisin y exactitud. Tambin hay la posibilidad de PCR mltiplex. No requiere de anlisis posterior a la PCR (electroforesis,etc.). Esto reduce la posibilidad de contaminacin y elimina fuentes potenciales de error. Se puede realizar un mayor nmero de reacciones por da. El sistema a tubo cerrado sirve como control de contaminacin. Existe un amplio rango de aplicacin. El diseo de primers y sondas tiene que ser ms exigente. PRIMERS DEGENERADOS Son primers que tienen un nmero de opciones en varias posiciones en la secuencia para permitir el alineamiento y la amplificacin de una variedad de secuencias relacionadas. Por ejemplo: 5-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3 Y = pirimidinas = C / T (degeneracin = 2X) R = purines = A / G (degeneracin = 2X) I = inosinas = C / G / A / T N = nuclotido = C / G / A / T (degeneracin = 4X) Uso de los primers degenerados Los primers degenerados se pueden utilizar:

Para amplificar secuencias conservadas de un gen o de genes del genoma de un organismo. Para conseguir la secuencia de nucletido despus de secuenciar algunos aminocidos de una protena de inters

Hay evidencia de regiones o motivos altamente conservados de aminocidos que se pueden disear utilizando primers degeneradas; estas regiones pueden ser conservadas entre especies. Las primers degeneradas se pueden utilizar para amplificar estas secuencias. Las secuencias amplificadas de esta manera se pueden secuenciar para confirmar que la secuencia est correcta. Pueden entonces ser utilizadas como sondas para amplificar el gen de inters de una biblioteca geonmica (procaritica) o de una biblioteca de DNA (eucaritica). Cuando se ha aislado exitosamente una protena de inters, el final de esta protena (o algunos aminocidos) pueden ser secuenciados. La secuencia del aminocido se puede

28

utilizar para disear primers degenerados. El producto de PCR puede ser secuenciado. Si los primers producen una secuencia truncada (del gen) o parcial, pueden ser utilizadas como sondas. Diseo de los primers degenerados Alineacin de la secuencia Las secuencias de aminocidos de protenas similares u homlogas se pueden recuperar de una base de datos tal como GenBank. Estas secuencias entonces se alinean. Por lo menos 2 bloques de aminocidos conservados deben estar presentes para permitir el diseo de los primers de PCR. Otra alineacin se puede hacer en el nivel del nucletido si se desea. Si una base se conserva a travs de la alineacin se puede suponer que esta base particular ser la misma en el caso de inters. Los primers deben tener 20-30 nuclotidos de longitud. La alineacin de la secuencia tambin dar el tamao previsto del producto de PCR. Informacin de la secuencia terminal de aminocidos Si estos datos estn disponibles pueden ser utilizados como un punto de partida para el diseo de los primers. Degeneracin de primers La degeneracin de los primers depende de una multiplicidad de factores incluyendo el templado. La degeneracin se puede bajar con el uso de las inosinas para sustituir 4 bases wobbles en vez de usar las 4 substituciones de bases. Para conseguir la degeneracin, simplemente se multiplican todos los valores de la degeneracin incorporados en la secuencia del primer. Otro factor que se toma en consideracin es que conforme la degeneracin de los primers aumenta, la concentracin de un primer especfico disminuir. Las substituciones de las bases son solamente las substituciones comunes, aunque se han utilizado otras opciones dependiendo de la secuencia La Reaccin de PCR El cctel de PCR Una mezcla estndar del cctel de PCR ser un buen inicio. Sin embargo, una excepcin se observa para las concentraciones de primers. Un aumento de la concentracin puede ser necesario para compensar la degeneracin. Si los primers usados son absolutamente degeneradas, se pueden utilizar 50 pmoles como punto de partida y optimizar a partir de ah.

29

Los ciclos de PCR (el termociclador) Se requiere de mucha experimentacin y optimizacin. Se comienza con las condiciones estndar, despus se procede optimizando la temperatura de alineamiento del primer. Se comienza con 35 ciclos y se aumenta a 50 en caso de ser necesario. Se debe considerar la viabilidad de la polimerasa para 50 ciclos. 4-5 de los primeros ciclos de PCR se pueden correr con una temperatura de alineamiento 5-10 o C ms bajo que la temperatura de alineamiento para amplificar los primers con mltiples mismatches. Problemas Comunes Algunos problemas que se pueden presentar cuando se utilizan primers degenerados son:

Inhibicin competitiva debido a la alta degeneracin del primer (los primers se alinean al DNA correcto pero no son extendidos por la polimerasa debido a los extremos 3 ' inestables dando como resultado que los primeros ciclos de PCR sean altamente ineficaces. Esto puede ser superado aumentando ciclos de PCR o utilizando 25-30 ciclos estndares seguidos por otra reaccin de 30-35 ciclos usando el primer producto como templado Concentracin baja del primer especfico debido a la alta degeneracin, esto puede ser corregido fcilmente aumentando la concentracin del primer La DNA polimerasa con actividad exonucleasa 3'-5 no debe ser utilizada ya que degradan los primers (la Taq polimerasa trabajar muy bien) Apareamiento falso o no especfico debido a los primers altamente degenerados o al templado que contiene muchos sitios de alineamiento. Se puede intentar la optimizacin de la temperatura del alineamiento o el reajuste de los primers Secuenciacin

Despus de que la banda del tamao previsto se haya extrado del gel de agarosa, el producto se puede secuenciar o clonar directamente. Aunque los primers degenerados se pueden utilizar directamente para secuenciar, pueden dar lugar al apareamiento no especfico dependiendo del templado. La secuenciacin de los productos permite el uso de los sitios del primer situados generalmente en los flancos del vector. Controles Si se amplifica un gen usando los primers diseadas de un alineamiento es conveniente hacer un dot blot que consiste en un control positivo, DNA templado, algo de gDNA relacionado y un gDNA distante para comprobar una posible contaminacin. Esto debe ser hecho despus de secuenciar y asegurar que se tiene la secuencia deseada haciendo un bsqueda en la base de datos (por ejemplo. BLASTX).

30

LONG PCR Para llevar a cabo esta tcnica de manera eficiente es necesario el uso de dos polimerasas: una polimerasa principal en la reaccin que no tenga actividad de proofreading, y una polimerasa que posea una actividad exonuclease 3-5, que est presente en una concentracin ms baja. La eficiencia disminuye drsticamente cuando se incorporan las bases incorrectas. La actividad exonucleasa 3-5 elimina estos errores en las bases y hace que la reaccin posterior proceda. Por lo tanto, la amplificacin de fragmentos largos de DNA puede llevarse a cabo (Figura 16).

Figura 16. Long PCR

Aspectos Generales Al usar la PCR para amplificar fragmentos de ms de 10 kbp es esencial la preparacin de muestras intactas (libre de mellas) y completamente purificadas con varios pasos de extraccin y purificacin. La concentracin ptima de los primers est en un rango de 0.1 a 1.0 mM. En una concentracin ms baja que la ptima, el producto de la amplificacin puede ser pobre. Por otra parte, en una concentracin ms alta, el alineamiento no especfico pueden superar la amplificacin del producto deseado. Las concentraciones del primer se pueden fijar dependiendo de las caractersticas y las cantidades de DNA. Bajas concentraciones de primer se recomiendan para DNA altamente complejo, tal como DNA genmico humano, o para altas concentraciones de DNA templado. Mientras que altas concentraciones se prefieren para templados de poca complejidad tales como DNA de plsmido, o para cantidades limitadas de DNA templado. La concentracin ptima del magnesio se puede afectar por las caractersticas y propiedades de la mezcla de reaccin, incluyendo concentraciones de dNTPs, de los primers y los agentes quelantes que contenga el templado. El exceso de Mg2+ tiende a causar productos no especficos que se observan como un barrido de bandas en el gel, mientras que el Mg2+ escaso puede generar menos productos amplificados.

31

Para establecer la concentracin de enzima deben ser consideradas la cantidad o la complejidad del DNA templado y de la longitud del fragmento amplificado. Exceso de la enzima puede causar reacciones no especficas. La eficacia de la amplificacin puede ser disminuida cuando la concentracin de la enzima es baja. El nmero ptimo de ciclos es alrededor 25 a 30 ciclos considerando la cantidad o la complejidad del DNA templado y la longitud de los fragmentos amplificados de la DNA. Se recomiendan condiciones de desnaturalizacin de 20 segundos en 98C o 30 segundos en 94C. Un tiempo de la desnaturalizacin demasiado corto o una temperatura demasiado baja puede causar una eficiencia pobre en la amplificacin. Un tiempo de la desnaturalizacin demasiado largo o una temperatura de la desnaturalizacin demasiado alta puede no generar ningn producto identificable. La temperatura ptima de alineamiento experimental se determina en un rango de 45-68C. Programa genrico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600

Inicial desnaturalizando a 94C durante 10-15 segundos. Ciclos 1-15 94C 10 segundos, 68C por n minutos (15 veces) Ciclos 16-30 94C, 10 segundos, 68C por n minutos +15 segundos/ciclo (15 veces)

Los 15 segundos por ciclo para los ciclos 16-30 puede ser necesaria para solamente fragmentos ms largos (20 Kb). Hot Start Se puede utilizar el mtodo de hot start para hacer una Long PCR. La reaccin se divide en dos partes: una fraccin de templado/primer que es 3/4 o 4/5 del volumen de la reaccin, y una fraccin de la polimerasa que constituye el resto. Cada fraccin contiene la misma concentracin de buffer. La fraccin de la polimerasa contiene solamente la polimerasa, el buffer y agua; el resto de los componentes se incluyen en la fraccin de templado/primer. Se pone la fraccin de templado/primer en el tubo y se calienta en la mquina de PCR a 94C por 10 segundos. para desnaturalizar. Despus se agrega la fraccin de la polimerasa durante el primer paso de alineamiento y extensin. PCR in situ La hibridacin in situ (ISH) ha demostrado ser una herramienta molecular muy importante en diagnstico y la investigacin y ha avanzado perceptiblemente el estudio de la estructura y de la expresin del gen a nivel de clulas individuales. Sin embargo, la utilidad de ISH es limitada por la sensibilidad de cerca de 20 copias del mRNA por la clula, un obstculo de la deteccin que pueda ahora ser superado gracias a las nuevas tecnologas. En aos recientes, las estrategias para mejorar los lmites de deteccin en estudios de ISH han incluido protocolos que amplifican la deteccin de la seal, o incrementando la cantidad de sondas de hibridacin usando ccteles del oligonuclotido o mltiples sondas de cRNA. Una tercera estrategia que emplea la PCR es la amplificacin basada en las 32

secuencias de nucletidos del blanco. Esta estrategia fue desarrollada independientemente por varios laboratorios en 1980 Principios y mtodos Los aspectos importantes para la PCR in situ incluyen la fijacin y la permeabilizacin durante la preparacin de la muestra, un mecanismo para ciclacin y el material celular en la solucin o en laminillas de cristal Antes de llevar a cabo la PCR in situ, las clulas o las muestras del tejido fino son fijadas y permeabilizadas para preservar la morfologa y permitir el acceso de los reactivos de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. La amplificacin de PCR de las secuencias blanco se realiza despus en las clulas intactas en tubos micro-Eppendorf o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas de cristal (Figura 17).

Figura 17. PCR in situ

Las clulas en la mezcla de reaccin de PCR son termocicladas en tubos microEppendorf usando cicladores convencionales de bloque. Despus de la PCR las clulas son citocentrifugadas sobre las laminillas de cristal con la visualizacin de los productos intracelulares de PCR por ISH o inmunohistoqumica. La PCR in situ en las laminillas de cristal es realizada sobreponiendo las muestras con la mezcla de PCR debajo de una tira que se sella con cera o aceite mineral para prevenir la evaporacin de la mezcla de reaccin. Un ciclo trmico se completa poniendo las laminillas de cristal sobre los bloques de calentamiento de un termociclador convencional o diseado especialmente o usando hornos que completan un ciclo trmico. La deteccin de los productos de PCR intracelular se realiza por dos tcnicas diferentes: 1) Indirectamente por ISH con sondas especficas para el producto de PCR (PCR in situ indirecto) 2) Sin ISH con la deteccin directa de los nucletidos etiquetados (digoxigenina-11dUTP, fluoresceina-dUTP, 3H-CTP o biotina-16-dUTP) que se han incorporado en los productos de PCR (PCR in situ directa)

33

OTRAS VARIANTES DE LA PCR Multiplex PCR Es una PCR en la cual hay mltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. stos pueden verse como mltiples bandas en un gel de azarosa. Se usa frecuentemente en diagnstico mdico. Ahorra templado, tiempo y gastos. Requiere una cuidadosa optimizacin Nested PCR Consiste en dos procesos de amplificacin sucesivos, de forma que en la segunda PCR se utilizan unos primers contenidos en la secuencia amplificada en la primera reaccin (Figura 18). Es decir, el producto de amplificacin de la primera PCR es el molde de la segunda. Se aplica cuando se quiere mejorar la sensibilidad y especificidad de la tcnica, especialmente en el caso de muestras de baja calidad o con un pequeo nmerode copias de la secuencia a amplificar. A veces 1 ronda de PCR no da un producto nico a partir de un templado complejo, apareciendo un barrido. Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco ms internamente que los primeros. Se obtiene un producto nico porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridizacin para el segundo par de primers.

Figura 18. Nested PCR

CLONACIN DE PRODUCTOS DE PCR Para conseguir una mayor eficiencia en varios usos del downstream (por ejemplo, la expresin de genes, la transcripcin in vitro, secuenciacin, preparacin de sondas marcadas para hibridizacin) los productos de PCR se clonan a menudo en vectores apropiados (Figura 19).

34

Figura 19. Clonacin de productos de PCR

La clonacin del DNA amplificado es a menudo un paso difcil en el anlisis de los productos de PCR. Para facilitar la clonacin de los productos de PCR, se han desarrollado varias tcnicas. Para elegir un mtodo, se deben considerar varios factores, como el propsito de la clonacin, el tipo de polimerasa usado, y la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, si se utiliza una polimerasa con actividad de proofreading para un estudio mutagnesis sitio-dirigido, la clonacin en vectores con extremos romos (blunt end) puede ser conveniente. Por otra parte, para la expresin de protenas, un mtodo que permita la clonacin direccional es til. Clonacin TA La Taq polimerasa tiene una actividad transferasa terminal que agrega preferencialmente adenina a los extremos 3' de los productos de PCR. Los productos de PCR con esa extensin del adeninas en el extremo 3' se pueden clonar en un vector que contiene timidinas 3' complementarias (clonacin TA). Los vectores T pueden ser hechos usando una enzima de restriccin como la XcmI. Sin embargo, debido a que Xcm I tiene una secuencia de reconocimiento poco comn, el sitio de restriccin de Xcm I tiene que ser introducido por insercin de un oligonucletido sinttico en el sitio de clonacin. Alternativamente, los vectores T se pueden preparar por la adicin enzimtica de un solo residuo de timidilato con la transferasa terminal y el ddTTP o la Taq polimerasa y el dTTP. Las polimerasas usadas para el mtodo de clonacin TA deben exhibir actividad de transferasa terminal y carecer de actividad exonucleasa 3'-5. Adems de la Taq polimerasa, varias DNA polimerasas (por ejemplo, la Tth polimerasa) tienen estas caractersticas y por lo tanto se pueden utilizar para la clonacin TA.

35

Clonacin de extremos romos Las DNA polimerasas con actividad exonucleasa 3'-5' remueve los nucletidos mal apareados de los extremos 3' del DNA de doble cadena y genera productos con extremos romos. Los productos de PCR generados por estas polimerasas se pueden clonar en vectores con extremos romos. Existen tcnicas que permiten remover una sola extensin de nucletidos de los productos de PCR generados con la Taq polimerasa; estos productos de PCR se pueden tambin clonar por la ligacin de extremos romos en un vector conveniente. Generalmente la clonacin de extremos romos de los productos de PCR (o de cualquier DNA) en plsmidos es menos eficiente que la clonacin extremos cohesivos. Por lo tanto se ha desarrollado una variacin ms eficiente del mtodo de clonacin de extremos romos. En este mtodo, una enzima de restriccin poco comn se agrega a la mezcla de ligacin para linearizar cualquier vector ligado a s mismo formado durante la reaccin. Clonacin direccional a travs de primers modificados. Varios mtodos de clonacin requieren la modificacin de los primers de PCR para mejorar la eficacia de la clonacin y facilitar la clonacin direccional de los productos de PCR. Un mtodo comn para una clonacin direccional eficiente es introducir sitios de restriccin adicionales en el extremo 5' de cada uno de los primers. Mientras que procede la amplificacin, estos primers se incorporan en el producto de PCR. Despus de la PCR, el fragmento de DNA amplificado se digiere con la enzima de restriccin apropiada y se liga en un vector linearizado. Algunas enzimas de restriccin no pueden cortar en las secuencias localizadas cerca de los extremos del DNA de doble cadena lineal. Adems, puesto que la secuencia del producto de PCR es a menudo desconocida, la enzima de restriccin elegida podra potencialmente reconocer y cortar los sitios dentro del producto. Otro mtodo que utiliza los primers modificados es la clonacin con ligaduraindependiente En la clonacin mediada por la uracil glicosilasa, los extremos 5' de los primers de PCR son parcialmente complementarios a las secuencias del vector y contienen varios residuos de dUMP. La incorporacin de estos primers durante la PCR da lugar a la colocacin selectiva de los residuos de dUMP en el extremo 5' de los productos de la amplificacin. Despus de que los residuos de dUMP sean quitados por uracil DNA glicosilasa, los lados apirimdicos que resultan son susceptibles a ser cortados por las condiciones alcalinas. Los extremos 3' de una sola cadena que resultan se pueden entonces alinear a los extremos complementarios del vector y las molculas quimricas de DNA que resultan se transforman sin ligacin in vitro.

36

Un ejemplo de clonacin direccional que no requiere primers especiales es la clonacin direccional basada en la Exonucleasa III. Bajo condiciones controladas de reaccin, la actividad exonucleasa 3'-5' de la Exonucleasa III se puede utilizar para degradar el producto de PCR de los extremos 3' de ambas cadenas. El producto modificado de PCR que resulta se puede clonar fcilmente en un vector linearizado con las bases complementarias. Clonacin de fragmentos largos de DNA Usando mezclas de diversas polimerasas se ha podido amplificar blancos largos de DNA. Para la clonacin de productos grandes de PCR (mayor de 10 KB) el uso de vectores basados en plsmidos es difcil porque la capacidad de clonacin en vectores es limitada. La clonacin eficiente de fragmentos largos de DNA se puede alcanzar solamente con vectores cosmidos y sistemas de empaquetado. Recientemente, un mtodo basado en csmidos se ha desarrollado para clonar fragmentos de hasta 36 KB con alta eficiencia. MUTAGNESIS POR PCR Consiste en introducir cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Mutagnesis con PCR-extensin solapada El mtodo de extensin solapada (Figura 20) requiere 2 primers mutagnicos y otros 2. Amplifica un fragmento 5 y un fragmento 3 que se solapan. Ambos portan la mutacin. Se utilizan los productos en otra reaccin para producir el ADN mutado de longitud completa.

Figura 20. Mtodo de extensin solapada

37

Mutagnesis sitio dirigida La mutagnesis sitio-dirigida in vitro es una tcnica invaluable para estudiar relaciones de la estructura-funcin de protenas, la expresin del gen y la modificacin del vector. Varios mtodos de los mtodos reportados requieren de DNA de una sola cadena como templado. La razn de esto, ha sido histricamente la necesidad de separar los filamentos complementarios para evitar el realineamiento. El uso de PCR en mutagnesis sitio-dirigida logra la separacin de las hebras usando un paso de desnaturalizacin que separa las hebras complementarias y permitiendo la polimerizacin eficiente de las primers de PCR. Los mtodos de PCR sitio-dirigidos permiten as que las mutaciones sitio-especficas sean incorporadas en cualquier plasmido de doble cadena. El gen de inters es amplificado con una ADN polimerasa en condiciones donde la fidelidad transcripcional es baja y se introducen errores en las copias generadas. Dado que la mayora de las mutaciones no son beneficiosas, dos mutaciones favorables se acumularn en el mismo gen, solamente con baja probabilidad y muchas mutaciones beneficiosas sern enmascaradas por las deletreas. Para combinar varias mutaciones deseables, se utiliza un segundo mtodo, donde el conjunto de fragmentos de ADN generado por la PCR es digerido por DNasa I, una enzima que corta en forma inespecfica, y se reensamblan los trozos por PCR. En principio, cada mutacin puede ser recombinada y propagada individual e independientemente de otras mutaciones. Este proceso se asemeja al crossingover que tiene lugar en los cromosomas de los organismos vivientes. Para introducir mutaciones solamente en una regin particular de un gen, puede utilizarse la mutagnesis en cassette por PCR. El fragmento de ADN conteniendo el punto mutado es recortado en dos sitios de restriccin flanqueantes. Luego, un producto de PCR, que puede ligarse exactamente en estos sitios de restriccin, se genera con un primer degenerado. Este iniciador se sintetiza qumicamente para llevar una mezcla al azar de nucletidos en uno o ms codones y la protena codificada lleva, por lo tanto, un conjunto de aminocidos al azar, en esta posicin particular. Desafortunadamente, un codn completamente formado al azar exhibir una fuerte desviacin hacia algunos aminocidos que son codificados por ms de un codn, por ejemplo, el aminocido serina es codificado por seis codones diferentes, mientras que triptofano est codificado por un solo codn), siendo tambin difcil evitar la incorporacin de un codn de terminacin. La solucin a este problema es usar trinucletidos presintetizados (codones) para todos los 20 aminocidos como bloques de construccin para la sntesis de ADN de los oligonucletidos, en lugar de utilizar los mononucletidos convencionales. Estos bloques pueden ser mezclados en cualquier proporcin y solamente se necesita agregar aquellos trinucletidos que el investigador desea en esta posicin en la secuencia proteica (Figura 21).

38

Figura 21. Estrategias para mutagnesis, con el fin de obtener las modificaciones localizadas o en genes enteros. En el panel (A) se muestra en forma esquemtica el proceso de PCR sujeto a error, como una estrategia para la distribucin no dirigida de mutaciones en un gen de inters. Se muestran dos tipos de mutaciones, las favorables (cuadrados) y las desfavorables (crculos). En ciclos sucesivos de PCR, se introducen ms mutaciones de cada tipo y, generalmente, las molculas contendrn alguna de cualquier tipo. As, el efecto benfico de las mutaciones favorables puede ser opacado, completamente, por la presencia de las desfavorables. Una posible solucin a este problema, se muestra en el panel (B) y se conoce como mezclado de ADN. El producto de PCR se corta en pequeos trozos, utilizando la enzima ADNasa I y se reensamblan, subsecuentemente, mediante PCR. Las mutaciones quedan, por lo tanto, cruzadas y los genes con el mayor nmero de mutaciones favorables pueden ser enriquecido por seleccin. El panel (C) muestra el principio de PCR utilizando un primer degenerado. Este primer o iniciador contiene una mezcla de todos los cuatro posibles nucletidos (abreviados en la letra N) en una posicin determinada o, alternativamente, una mezcla de codones ensamblados a partir de trinucletidos. Las protenas sintetizadas a partir de este gen llevarn, por lo tanto, un grupo randomizado de aminocidos en esta posicin.

APLICACIONES ESPECIALES DE LA PCR Durante los ltimos aos, la PCR se ha convertido en una herramienta importante para analizar el genoma humano. Adems de generar cantidades grandes de templado para secuenciar, la PCR se ha utilizado para el mapeo de cromosomas y para analizar cambios grandes y pequeos en estructura cromosmica. Por ejemplo, la PCR lo ha hecho posible: Usar las secuencias repetidas en el genoma como marcadores genticos. Genere sondas de hibridacin especficas para cromosoma. Estudiar la evolucin de las secuencias de un gen y los efectos de variabilidad de la secuencia en la funcin del cromosoma. Amplificar e identificar las secuencias blanco in situ.

39

BIBLIOGRAFA 1. Innis M. A., Gelfand D. H., Sninsky J. J., White T. J. PCR Protocols. Academic Press Inc. Estados Unidos, 1990. 2. Griffin H. G., Griffin A. M. PCR Technology: Current Innovations. CRC Press Inc. Estados Unidos, 1994. 3. Bustin S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 2000. 25,169-193. http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/pcr_man/index.htm http://www.med.sc.edu:85/pcr/realtime-home.htm http://www.espanol.pcrlinks.com/ http://folk.uio.no/kristban/realtime/pfaffl.pdf

40

También podría gustarte