quantitative polymerase chain reaction

La reaccin en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en ingls son PCR ("polymerase chain reaction"), es una tcnica que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los aos 80. Con esta metodologa se pueden producir en el laboratorio mltiples copias de un fragmento de ADN especfico, incluso en presencia de millones de otras molculas de ADN.

Es una variante de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificacin de cido desoxirribonucleico (ADN). Para llevar a cabo esta basado en la utilizacin de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos amplificar.

Esta sonda lleva adherida una molcula fluorescente y otra molcula que inhibe esta fluorescencia ("quencher"), de tal forma que slo cuando la sonda es desplazada de su sitio por accin de la ADN polimerasa la molcula fluorescente se libera de la accin del "quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con un lser.

La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rpidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoqumicas de los cidos nucleicos y las enzimticas de la ADN polimerasa.

Podemos clasificar las tcnicas de PCR cuantitativa segn el empleo de fluorocromos no especficos o bien de sondas moleculares dependientes de la secuencia.

En las tcnicas basadas en fluorocromos inespecficos se detecta la generacin exponencial de ADN de doble cadena empleando un fluorocromo que se une inespecficamente a aqul. Un ejemplo de colorante que permite esta deteccin es el SYBR Green), que excitado mediante luz azul (max = 488 nm) emite luz verde (max = 522 nm).

Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan al menos un oligonucletido marcado fluorescentemente. Tpicamente esta sonda est unida a dos fluorocromos e hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); esto es, en el amplicn. De este modo, cuando la sonda est intacta, presentan una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET).

Las sondas de hidrlisis, frecuentemente empleadas en esta tcnica, son oligonucletidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del fragmento de ADN que se quiere amplificar.

Uno de los fluorocromos acta como donador de fluorescencia en el extremo 5 y el otro como aceptor de esta fluorescencia en el extremo 3.

La ADN polimerasa se desplaza sobre la cadena de ADN sintetizando la cadena complementaria a partir de un fragmento de ADN que sirve de molde (cebador). Al llegar al punto en el que la sonda se ha hibridado, la hidroliza. El fluorocromo del extremo 5 de la sonda (el donador) es liberado.

El fluorocromo aceptor no puede entonces absorber la fluorescencia del donador por estar alejado de l espacialmente. Un detector realiza la medida de esta emisin de fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de ADN presente, y la representa grficamente.