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anticoagulantes

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS ASIGNATURA HEMATOLOGIA

Métodos del laboratorio hematológico
PRIMERA PARTE

Docentes

Dra. Nilda E. Fink Dra. María Elena Chiesa Dra. Ma. Alejandra Fernández Alberti Bioq. Fernando Ventimiglia Bioq. Mariana González Bioq. José Luis Casali

La Plata, 2007

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Contenido
Página Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa Descripción de los anticoagulantes usados en hematología Recuento de hematíes Hematocrito Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina Velocidad de sedimentación globular Recuento de reticulocitos Cuantificación de hierro sérico Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls Separación electroforética de hemoglobina Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs Determinación de anticuerpos inmunes 3 5 7 12 15 21 26 29 34 42 45 47 57

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presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco. 4. descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin. En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja. evitando hacer espuma. Antes de iniciar la toma de muestra. 8. 5. 6. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresión del músculo no mayor a 1 mm. una vez manipulado. Elegir una vena bien visible en el antebrazo. 12.Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa A) EN ADULTOS 1. dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. los cuales se mantendrán puestos durante todo el procedimiento. Después de la toma. 13. 14. limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol. LA AGUJA SE DESCARTARÁ EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN. Los recipientes que contienen algodón y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirán solamente al momento de usar. La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba. 9. localizándola visualmente y por palpación. 2. Una vez realizada la toma de muestra. 3. se la colocará en la jeringa sin tocar con los dedos. se le indica al paciente que abra la mano. Colocar el lazo y volver a palpar la vena. Dejar secar perfectamente. no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo. controlando el correcto funcionamiento del émbolo. 11. 4 . tener todo el material preparado pero sin abrir. El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y. indicarle al paciente que abra y cierre el puño para facilitar la extracción. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes. se retira el torniquete y luego la aguja. 10. Una vez identificada la vena. 15. En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más sangrado. Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba). 7. Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables.

aclararlo en el registro de muestras. 17. En el caso de niños menores de 6 meses. NO REUTILIZARLOS NUEVAMENTE. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante. pidiéndole a un adulto que colabore en mantener inmóvil al niño. Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento. 4.16. 2. en particular el brazo. La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. En niños mayores de 6 meses. colocar una curita o apósito. se procederá a extraer la muestra del talón con una lanceta descartable. en la zona del talón indicada en el dibujo adjunto. Desinfectar con un trozo de algodón embebido en alcohol. B) EN NIÑOS 1. se recomienda hacer la extracción del brazo como en adultos. dejar evaporar y punzar con la lanceta. Antes de la extracción conviene calentar el talón frotándolo entre las manos para favorecer la irrigación de la zona. Las flechas indican los lugares de punción 5 . 3. Secar la zona con un trozo de algodón seco y una vez que no haya sangrado.

Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio. HEPARINA SÓDICA. las tres sales afectan el tamaño del eritrocito. posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C). impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. El K2EDTA .3 g/L de C6H5O7Na3. por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido.106 mol/l (31.1g. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos. actuando mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca+ + ). es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. CITRATO TRISÓDICO. especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El citrato sódico se utiliza a una concentración de 0. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0.Descripción de los anticoagulantes usados en Hematología Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares.1-0. HEPARINA DE LITIO. Los anticoagulantes más utilizados son: • EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica. sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas.2H2O). Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares.2 mg) de heparina por ml de sangre. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1. ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes.2H2O posee un peso molecular relativo de 404. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria. dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético. C6H5O7Na3.0. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos.8+/-1.5-2. 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4. el tamaño eritrocitario. de sangre total.2 mg/ml. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. sin embargo . Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro • • • 6 . así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1. evitando así la coagulación. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico. actúa impidiendo que el calcio se ionice. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1.

Citrato disódico 2 g.9 g. Dextrosa 2 g. La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0. H2O destilada 120 ml. 7 .volúmenes de sangre.

se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeños. Es un método poco usado debido al elevado error que presenta.02 ml El recuento se realiza en la cámara de Neubauer cuyo esquema es el siguiente: El recuento de hematíes se realiza en el cuadrado central. como se muestra a continuación: 8 . La dilución empleada es de 1/200.8%. Líquido diluyente: solución fisiológica o citrato de sodio 3.98 ml Sangre (con pipeta automática): 0.Recuento de hematíes A) RECUENTO MANUAL Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. para lo cual se mide exactamente: Solución fisiológica o citratada: 3.

4. ST: Total de cuadrados pequeños en la superficie de 1 mm2 (400). TC: Total de cuadrados pequeños contados. 5. 8. que el retículo tiene 400 cuadrados pequeños en total. no rígido. evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente. sucio o húmedo. luego de agitar adecuadamente en un agitador de rodillos. 1. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. o triples. Hemólisis. 2. Utilización de material mal calibrado. 3. 7. Falta de suficiente agitación de la sangre diluida. Con la dilución indicada. sucia o mojada. sirven únicamente como límites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeños. D: Título de la dilución realizada (200). 9 . Coagulación parcial. 6. Errores al efectuar los cálculos. Empleo de cubreobjetos deformable. Causas de error en el recuento en cámara cuentaglóbulos El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%.1 mm. La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0. Se deben contar 5 de estos cuadrados. para llevar a 1 mm3 (10). Células mal distribuidas en el fondo de la cámara. Errores del operador al realizar el recuento.Recuadro central: Las líneas reforzadas. se carga la cámara y se cuentan los glóbulos rojos de los 80 cuadrados pequeños (zona sombreada). FC: Factor de corrección de la profundidad. Llenado incompleto de la cámara cuentaglóbulos. La cámara puede ser cargada con un capilar. Considerando entonces. el cálculo que se debe hacer es el siguiente: N x D x FC x ST = nº de glóbulos rojos/mm3 TC Donde: N: número de eritrocitos contados. Cámara cuentaglóbulos mal ajustada. el cual puede deberse a: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración.

El diámetro del orificio de apertura: debe estar en relación al tamaño de las partículas que se analizan. Los sistemas de recuento celular por estos medios se basan en la medida del tamaño u otras propiedades físicas de las células suspendidas en medio líquido de acuerdo con uno de los dos principios siguientes: 1. Cuando una célula pasa a través del orificio. las células sanguíneas así diluidas se hacen pasar por un orificio de apertura con un área prefijada.1 Método de la impedancia o de la resistencia eléctrica Es el más empleado en los autoanalizadores hematológicos. 2. La sangre total es diluida en una solución de conductividad estable. B. 3. es decir. Existen distintos tipos de instrumentos: los semiautomatizados que requieren algunos pasos previos. se genera una resistencia entre ambos electrodos que se registra como un impulso.B) RECUENTO AUTOMATIZADO La automatización ha contribuido de manera decisiva al aumento de la rapidez y la fiabilidad del recuento de las células sanguíneas. Es importante realizar periódicamente una limpieza de este orificio. La concentración de la suspensión analizada: debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia. como por ejemplo diluciones de la muestra antes de ser procesada y. 2. Dispersión de luz o campo oscuro. Las condiciones más importantes que deben tenerse en cuenta son: 1. Impedancia o resistencia eléctrica. 10 . El número de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular y como la amplitud del impulso es directamente proporcional al tamaño de la célula. Si es muy elevada puede dañar las células y producir interferencias originadas por ruido electrotérmico. los aparatos totalmente automatizados sólo requieren que se les suministre la muestra obtenida en condiciones apropiadas (por ejemplo: con el anticoagulante adecuado). Se basa en la propiedad de las células sanguíneas de no conducir la electricidad. La intensidad de corriente entre ambos electrodos: debe ser lo suficientemente sensible para detectar la resistencia que genera la partícula cuando atraviesa el orificio. por lo general poseen un monitor de visualización que permite observar su permeabilidad durante el recuento. que varias células atraviesen el orificio al mismo tiempo. para cada población celular que se quiera estudiar se deben seleccionar las condiciones para que sean analizadas sin error. Por dentro y fuera del orificio se disponen electrodos que establecen una diferencia de potencial. Este método tiene algunas limitaciones. Debe ser perfectamente permeable. Como los impulsos eléctricos que van a determinar el volumen celular se generan en el orificio de apertura del sistema. es posible determinar también el volumen celular.

7x1012/L . el error debido al propio método de recuento electrónico.5. suele ser inferior al 1%.1x1012/L . c) Obstrucción de los capilares u orificios de recuento. d) Dilución incorrecta de la muestra por el liquido diluyente. Coagulación parcial. Estos sistemas permiten medir la concentración y el volumen celulares.0x1012/L . f) Contaminación por arrastre de un especimen con el siguiente. que son contadas como células. pero puede incrementarse por: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. Uso de un diluyente incorrecto.6x1012/L .2x1012/L 4. Cada vez que una célula se interpone en el haz de luz se produce una sombra que.5. Defectos en el sistema electrónico de recuento: a) Lisis incompleta de los eritrocitos en el orificio de leucocitos. cuando se realiza en óptimas condiciones.B. C.3x1012/L 4. será analizada por los sensores. e) Presencia de microburbujas. proyectada sobre un campo oscuro.5.2 Método de dispersión de luz Se analiza la dispersión de luz producida por las células desde dos dimensiones gracias a sensores ubicados en ángulos diferentes. Presencia de partículas extrañas en el diluyente.5x1012/L .9x1012/L D) INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 11 . b) Presencia de agregados celulares a nivel del orificio de recuento. las células se someten a tinciones citoquímicas se pueden detectar midiendo la intensidad de dicha reacción los diferentes tipos de leucocitos. 4. 1. Hemólisis. Las células se hacen pasar individualmente a lo largo de una cámara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz que puede ser halógena o láser.6. VALORES DE REFERENCIA Edad Recién nacidos Niños (2-12 años) Adultos jóvenes (12-18 años) Adultos jóvenes (19-60 años) Sexo ambos ambos mujeres hombres mujeres hombres Intervalo de referencia 4. En general. Si además.5. 3. g) Presencia de interferencias electrónicas y averías de los componentes electrónicos del instrumento.5. 2.3x1012/L 4.1x1012/L . Causas de error en el recuento automatizado Con el empleo de métodos automatizados se puede cometer grandes errores si se olvida el control periódico y el calibrado diario de los instrumentos.3x1012/L 4.1x1012/L 4.

El descenso en la concentración de eritrocitos en la sangre se acompaña siempre de una disminución en la concentración de hemoglobina (anemia) y puede deberse a diferentes causas como las hemorragias. la cual puede acompañarse de microcitosis como en la talasemia. 12 . la hemólisis o fallas en su formación a nivel de la medula ósea. se habla de seudopoliglobulia.Un aumento de la concentración de eritrocitos con contenido hemoglobínico normal suele acompañarse de un aumento de la concentración de hemoglobina y recibe el nombre de poliglobulia. Cuando el aumento de la concentración de eritrocitos va acompañado de una disminución de la hemoglobina.

Ambos métodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la acción de una fuerza centrífuga. puede ser normal o alto. Así. entre sus factores de error está el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura. El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración. un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. Debe excluirse la columna de leucocitos y plaquetas. El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo).Hematocrito DEFINICION El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre. tubo de Wintrobe con diámetro interno de 3mm . Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas. mientras que el aumento lo es de poliglobulia.1 Macrométodo (macrohematocrito) Utiliza 0. Tanto el Hto. Centrifugamos durante 30 minutos a 2.2-0. En la actualidad. Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina.p. Aunque también puede emplearse un tubo de Wintrobe (macrométodo). barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia. Por ej..3 %). A) METODOS MANUALES A. dentro del contexto del hemograma automatizado. aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión. que corresponde a una fracción de la longitud original de la columna sanguínea (100 mm). es una técnica sencilla. obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados. expresado como porcentaje. un descenso del Hto es indicativo de anemia. Por ello. son un buen parámetro del estado de la serie eritroide.m.000 r. este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisión. el Hto. todos los autoanalizadores hematológicos suministran. por lo que es siempre algo inferior (0.000-3. La lectura del resultado se realiza extrayendo los tubos de la centrífuga y valorando la altura en milímetros de la columna eritrocitaria. 13 .6 ml de sangre entera anticoagulada con EDTA.

provoca que el sedimento de hematíes vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal. Se centrifugan durante cinco minutos a 12. B. dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar).000 rpm. La lectura no inmediata de los capilares. produce una mezcla con los líquidos tisulares que provoca hemodilución. aplicando la siguiente regla de tres: A------. METODO AUTOMATIZADO: CONTADORES HEMATOLOGICOS El método automático de determinación se basa en el cálculo matemático a partir del Volumen Corpuscular Medio (VCM) y el número de hematíes. Tan pronto se detiene la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Si se utiliza sangre capilar. Hto = n° de hematíes x VCM 14 . favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. En muestras de sangre venosa. muy sencilla y poderse realizar en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo. o con una regla milimetrada.A. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota. el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentración.x x : hematocrito en tanto por ciento A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0. Causas de error • • • • • Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor. por necesitar muy poca cantidad de sangre. El llenado de los tubos se realiza por capilaridad. se desechará la primera gota después de la punción.01.2 Micrométodo (microhematocrito) Es una técnica muy utilizada. Heparinizados o no. Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7. de diámetro interno. al perderse mayor proporción de células que de plasma. de longitud por 1mm. que nos darán el resultado directamente.100 B------. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito. Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 µl). Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada.5 cm.

39 ± 0.45 ± 0.05 0.05 0.05 15 .05 0.VALORES DE REFERENCIA ( x ± 2 DE) El valor de Hto varía con la edad y el sexo. Edad y sexo Recién Nacidos Niños (hasta 10 años) Mujeres (18-50 años) Embarazadas Hombres (18-50 años) Hematocrito % 54 ± 10 38 ± 5 42 ± 5 39 ± 5 45 ± 5 Fracción 0.42 ± 0.38 ± 0.1 0.54 ± 0.

debidamente calibradas. Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo). Este reactivo debe tener un color amarillo pálido. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1. 6. Pipetas automáticas: de 20 µl. Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados periódicamente mediante la solución patrón de HiCN. 3. preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) 2. Tubos: 12 x 100 mm. Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 ml. Nonic 218.Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina FUNDAMENTO Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN). Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina. Puede emplearse sangre capilar.5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). Los distintos compuestos de hemoglobina. Quolac Nic 218. de forma que aquella se completa en 3 min.4. 4. ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7. 16 . se transforman en HiCN según el siguiente proceso: Hemoglobina + Ferricianuro potásico → metahemoglobina Metahemoglobina + Cianuro potásico → cianmetahemoglobina MATERIAL 1. 7. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración). excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa. Reactivo de Cianmetahemoglobina: Composición (pH 7-7. Nonidet/40. 5. Todo patrón de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN. El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la transformación de la hemoglobina en HiCN.4) Ferricianuro potásico [K3 Fe(CN) 6] Cianuro potásico [CNK] Fosfato monopotásico [KH2PO4] Detergente no iónico* Agua destilada hasta 200 mg 50 mg 140 mg 1 ml 1000 ml Detergentes no iónicos: Tritón X-100.

significa que dicha solución patrón posee la misma absorbancia que la de una solución de hemoglobina de 143 g/l. es una solución muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y características fisicoquímicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64. Mediante la micropipeta añadir 20 µl de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin.. Este patrón. si la sangre total se ha diluido 250 veces.0) de la hemoglobina ( por ej. la absorbancia de una solución que contenga 4 x 55.62. 6.1 . Así. METODO Por un lado. utilizando agua destilada como blanco. Agitar el tubo mediante inversión ( 4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina. Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión del tubo 20 veces. y a 504 nm entre 0. Al realizar esta operación. La concentración de hemoglobina también puede calcularse aplicando la siguiente fórmula: 17 .458) y el coeficiente de extinción (44. según el lote y el instrumento de lectura utilizados.8. si la dilución ha sido de 200 veces. 2. Leer la A de la solución a 540 nm. se efectuará el espectro de absorción de la solución de referencia internacional y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig. 7.251. 5.60 y 1. o de 114 g/l. donde también se incluye la curva del reactivo.1). El cociente A540/A504 oscila generalmente entre 1.404. si en el frasco se indica una concentración de 572 mg/l. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibración (ver más adelante). La curva de longitud de onda versus A desde λ=750 nm a λ=460 nm se observa en la Fig. La concentración exacta de hemoglobina de cada lote se indica siempre en la ampolla. Patrón primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarización y el control de calidad. El patrón primario posee un espectro de absorción característico con un pico de máxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexión a 504 nm. Por otro lado se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuación: 1. es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta. El valor de la A a 540 nm varía entre 0.El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendría una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimétrica.8 mg de hierro hemoglobínico por litro a 540 nm). 4.248 y 0. 8. Conectar el espectrofotómetro. 3.400 y 0. Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio. El patrón primario de HiCN se suministra en ampollas cerradas al vacío que contienen 10 ml de una solución de HiCN correspondiente a una concentración de hemoglobina entre 550 y 850 mg/l.

5 1.5 3 1:6 24 5 0 3. partiendo de la solución de HiCN más diluida (tubo 5) se leen las restantes soluciones patrón.0 0 3 0 145 2 1. Una vez preparadas las soluciones patrón. La concentración de hemoglobina en milimoles por litro de sangre (mmol/l) puede calcularse multiplicando el valor en g/l por 0.0 2.5 2.5 3 1:2 72 3 1.621. Finalmente. ELABORACION DE LA CURVA DE CALIBRACION La gráfica de calibración tiene como finalidad calibrar el espectrofotómetro para una lectura determinada calculando la corrección existente entre los valores de A leídos en el aparato y los correspondientes valores de concentración de hemoglobina. 2). se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene sólo reactivo (tubo 5) y se ajusta la A (100% de transmitancia). Reactivo de Drabkin Volumen Dilución Hb Tubo (modificado) final (ml) (g/l) (g/l)* (ml) 1 3. Para trazar este gráfico se preparan 5 soluciones de concentración de HiCN conocida y decreciente a partir del patrón de HiCN mediante diluciones sucesivas en reactivo de cianmetahemoglobina (véase tabla 1).0 3 0 0 * El valor de esta concentración dependerá del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN que se emplee en el Trabajo Práctico.Hemoglobina (g/l)= A540 (muestra) A540 (patrón) x HiCN patrón (mg/l x F 1000 Siendo A= absorbancia F= factor de dilución de la sangre total en el reactivo de Van Kampen y Zylstra (251). 18 .0 3 1:3 48 4 0. la relación entre los valores de A obtenidos y los correspondientes de concentración de hemoglobina se representan en un gráfico con los valores de A en las coordenadas y la concentración de hemoglobina en las abscisas (Fig. Luego. Patrón de referencia de HiCN (ml) La concentración de hemoglobina correspondiente a cada tubo se determina a partir del grado de dilución y del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN.

Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la Hb en HiCN Errores de la determinación: 1. Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formación exclusiva de metahemoglobina. 19 . Empleo de instrumentos no calibrados 2. No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo 2. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN: Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido 1. Empleo de anticoagulantes no recomendados 2. No obstante. con lo que los valores de concentración de Hb obtenidos son inferiores a los reales. Congelación del reactivo.Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. la mayoría de las veces los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen. en vez de HiCN. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (>50 x 109/l). Cubetas sucias o deterioradas 3. Coagulación parcial de la sangre Errores de la dilución: Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o húmedas 1. 2. Errores en la obtención del espécimen de sangre: Errores de extracción 1. lo que produce transformación de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y una oxidación parcial de la Hb. Soluciones turbias de HiCN Errores en la conservación del reactivo: 1.

Espectro de absorción de la solución de HiCN y del reactivo usado 20 .

Curva de calibración elaborada a partir de una solución de cianmetahemoglobina de concentración conocida. 21 .

MECANISMO El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado. VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea. como se mencionó más arriba.Velocidad de sedimentación globular FUNDAMENTO El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo. este fenómeno depende de los siguientes factores: a. Dado que. éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis. Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. b. pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células. 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante. Desde el punto de vista físico. linfomas y mieloma múltiple). c. ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin. el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR. Así. cuanto más pequeños sean los agregados. d. Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad η a una velocidad v: R = 6ηvr La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas". Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico. más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa. Viscosidad del plasma. Tamaño de los G Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma. polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia. Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. 22 . y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. La etapa más importante es la primera o de aglutinación. Temperatura.

Sin embargo. De acuerdo con este mecanismo. MÉTODO DE WESTERGREN Es el método de referencia para medir la VSG. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias. 23 . el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. y un bajo hematocrito causa un aumento no específico de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre los agregados en sedimentación. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina. Tradicionalmente. las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. METODOLOGIA Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el método de Wintrobe. aunque reproducen exactamente el método de Westergren. El método de Wintrobe. Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación entre el plasma y los GR en la muestra. El método de Westergren es menos sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y así puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening. pero no resultaron confiables. mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta. se diferencian de éste por su carácter cerrado (recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisión del llenado de las pipetas. por el otro lado. globulinas y fibrinógeno. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR. La albúmina retarda la VSG. lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones de albúmina. puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. lo que explica que estas células se mantengan separadas. la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH). El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. como es la necesidad de prediluir la sangre. han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable.La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. Estos sistemas. Ambos métodos poseen limitaciones. continua siendo un método poco reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar. Durante los últimos años. Así.

Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. manteniéndolo exactamente 60 min.5 ml de anticoagulante. La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solución de citrato de sodio. D) El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25°C). por ejemplo 2 ml de sangre en 0. y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. B. A. si es mantenida a 4°C.15 mm. C) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente. Algunos plásticos resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de taponamiento. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza. A. TÉCNICA B) La sangre se obtiene por punción venosa. libre de vibraciones y corrientes de aire.55 + 0. los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las especificaciones. se mezcla por inversión repetidas veces.08 g/l.5 mm y de un diámetro de 2. Si utiliza citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre. o dentro de las 6 hs. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países.2 Tubo de sedimentación Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1. MATERIALES. 24 . El nivel de la sangre se ajusta a cero. sin exposición a la luz del sol directa.3 Gradillas Las gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición vertical inmóvil. El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0. evitando contaminación con materiales utilizados para la higiene de la piel.2H2O) prepare una solución acuosa de 32. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1°.05 mm) todo a lo largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. La misma debe estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en ella.A.1 Anticoagulante Citrato trisódico 109 mM en solución acuosa. A.

expresado en mm. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda. INTERPRETACION DE RESULTADOS Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia). y las medicaciones (corticosteroides.E) Una vez transcurrido el tiempo. Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs. contraconceptivos orales. se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. el ciclo menstrual. han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica. VALORES DE REFERENCIA EDAD (años) Niños mayores y jóvenes Hombres adultos Mujeres adultas 0-15 17-50 51-60 61-70 17-50 51-60 61-70 X + 2 DE 5 + 10 4+3 6+3 6+4 6+3 9+5 10 + 5 Límite superior de la normalidad 15 10 12 14 12 19 20 Factores técnicos capaces de modificar la VSG Causas de aumento • Desviación de verticalidad de la pipeta • Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta • Elevación de la temperatura ambiente • Dilución de la sangre • Causas de disminución: • Reducción del diámetro de la pipeta • Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido) • Cambio de anticoagulante D. El valor de esta distancia.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos. corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora). Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas. 25 . muy utilizadas anteriormente. y también en el embarazo normal y el puerperio. C. etc. por lo que no se recomienda su empleo.

por ende.La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia. esferocitosis hereditaria. anormalidades de GR (hemoglobinopatías. anemia falciforme. Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG. 26 . etc.). y ocasionalmente sin causa aparente. hipofibrinogenemia. un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgánica. es inusual obtener falsos negativos. defectos cardíacos congestivos.

Su tamaño es el de los demás hematíes y se caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando un retículo granulofilamentoso observable al ser teñido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. se toma una pequeña gota de la suspensión y se extiende sobre un portaobjetos. una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersión (x1000).Recuento de reticulocitos Los reticulocitos. el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción. Si se mantiene a 4º C. En caso de valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solución colorante. una vez ya en la sangre periférica. mientras que cuando el número es normal o disminuido se denomina arregenerativa. El recuento se efectúa contando en donde los eritrocitos estén distribuidos homogéneamente. 2. Cuando una anemia se acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa. En condiciones normales. Transcurrido este tiempo. El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. MÉTODO DE LA TINCIÓN VITAL (MÉTODO DE REFERENCIA) Este método usa como colorante el azul de metileno nuevo: 1 g cada 100 ml de solución citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de ClNa 9 g/L). aproximadamente. existen en la sangre en una proporción de cinco a diez por mil hematíes. dentro de las 24 primeras horas de la extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. pero sobretodo a los errores de índole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito. Es necesario realizar el recuento sobre un mínimo de 1000 eritrocitos. Mediante una pipeta Pasteur se añaden a un tubo de hemólisis tres gotas de solución colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada.. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula. siendo 100-125 el número óptimo de hematíes por campo de los cuales distinguimos cuales son 27 . El método manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variación >20%). Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida. los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3 días y terminan su maduración en 24 horas. eritrocitos inmaduros. El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA)y a ser posible. Citometría de flujo. Tinción vital y microscopio óptico. La suspensión sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a terapéuticas agresivas.

De esta forma puede calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente: IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente Período de maduración en días x Hto normal Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia regenerativa). el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la siguiente fórmula: Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto del paciente Hto normal (El hematocrito normal es el que le corresponde según edad y sexo). Este valor será valido si se trata de una concentración normal de eritrocitos en sangre total.45 0. Este fenómeno se caracteriza por la aparición en el examen morfológico de la extensión de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y tonalidad azulada (policromasia) Existe una relación inversa. el número de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneración eritroblástica.25 0. RECUENTO AUTOMATIZADO 28 0.30 0. que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la médula a la sangre periférica. aproximadamente lineal. entre el hematocrito y el período de maduración periférica de los reticulocitos.20 0.35 0. Ello obedece a que la anemia se acompaña siempre de un estímulo eritropoyético compensador.3 9 10 ± 1 día 1 2 5 5 ± 2 día 7. cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la anemia. En caso de anemia intensa. mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética (anemia arregenerativa) Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia Hematocrito Niveles de Hemoglobina (g/L) Recuento de reticulocitos (%) Recuento de reticulocitos corregido (%) Tiempo de maduración estimado Índice de reticulocitos OTRA TECNICA Utiliza como colorante Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el método de referencia.reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje.5 10 3 días 10 . La mezcla sangre/colorante se incubará durante 15 minutos a 37º C. y un acortamiento de su período de maduración intramedular. lo que supone un aumento del período de maduración periférica.8 4 7 8.15 150 133 117 110 83 66 50 1 2 5 10 15 20 30 1 1. Luego de este tiempo se realizará el extendido y se realiza el recuento como se indicó antes. Por ello.40 0. siendo el cien porciento el número total de hematíes contado.

5 0.5-2.2.2.2-2.8 Valor absoluto (x109 /L) 110-330) 25-89 25-86 32-97 Recién nacido (sangre de cordón) Niños y adultos jóvenes de 4 a 19 años Adultos (20-50 años) Mujeres Hombres Variaciones patológicas Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Período neonatal Anemias hemolíticas Anemias posthemorrágicas Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula ósea) Mielofibrosis idiopática 29 .Estos equipos realizan un recuento muy fiable de reticulocitos a partir de sangre total. mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubación previa y el análisis se realiza directamente. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitución del criterio morfológico inherente al método visual por el análisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante citometría de flujo y luz láser.2 0. Para la tinción del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o Auramina.0 (4-19 años) 0.2-6. En los equipos semiautomáticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo. VALORES DE REFERENCIA Valor relativo (%) 3.

Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab. en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas. REACTIVOS PROVISTOS Solución saturante: solución estabilizada de Fe (III). Adsorbente: el frasco debe volver a taparse inmediatamente después de retirar las porciones necesarias para el momento. INSTRUCCIONES PARA SU USO Solución saturante: lista para usar. Su función es captar el hierro de los sitios de absorción (mucosa intestinal) o depósito (sistema retículo endotelial) y llevarlo a los órganos hematopoyéticos donde es utilizado. nefropáticas.Agua destilada.Tubos de Kahn. MUESTRA Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. REACTIVOS NO PROVISTOS . FUNDAMENTOS DEL METODO La transferrina o proteína transportadora específica del hierro. . CONDICIONES DE REACCION 30 . Disminuye en cambio en la hemocromatosis. el hierro circula como Fe (III) unido a una proteína transportadora específica: la transferrina o siderofilina.Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. etc. y ferropénicas en general.Cuantificación de hierro sérico Fer-color Transferrina Método colorimétrico para la determinación de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) del suero SIGNIFICACION CLINICA En el organismo humano. estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte. Adsorbente: carbonato de magnesio granulado. La actividad fisiológica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijación de hierro (TIBC). en insuficiencias hepáticas y fisiológicamente en los últimos meses del embarazo. La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrágicas. La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que está saturada. En el individuo normal sólo la tercera parte de la transferían se satura con hierro. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimétricamente según la técnica de Fer-color o Fer-color AA. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". y en las grandes pérdidas proteicas del síndrome nefrótico. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso.) en las hepatopatías crónicas. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. Adsorbente: listo para usar. . se determina por su actividad fisiológica de captar Fe (III) a pH mayor que 7. neoplásicas. El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitación con carbonato de magnesio.

AACC Press.Dixon. Toxicol. por la dilución del suero. Biochem. En ese caso se informan tres valores: Hierro Sérico. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. multiplicando por dos el resultado final. no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos. Path. 1990. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.Am.p. Wiener lab. . M. comenzar con la Saturación de la Transferrina 30 minutos antes. Epstein.H. . Habitualmente se realiza la determinación de hierro sérico juntamente con la de transferrina. Centrifugar 10-15 minutos a 3. E. K.Clin. b) Colorimetría: seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA. .I. G. .Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.2 ug/dl +28. VALORES DE REFERENCIA La literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturación de la Transferrina en personas normales: Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl.9 ug/dl C. puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml. Transferrina y Porcentaje de Saturación de la Transferrina. Olguín de Mariani.29% 5. La agitación insuficiente producirá valores falsamente aumentados de Transferrina. A. . D.S.V. que se calcula de la siguiente manera: Hierro sérico (ug/dl) Transferían (ug/dl) Saturación % = x 100 Si se desea efectuar simultáneamente la determinación de hierro sérico para el cálculo del Porcentaje de Saturación.. La concentración de Fe (III) de la Solución saturante es 10 veces mayor que la del Standard.Rojkín. PROCEDIMIENTO a) Saturación de la transferrina: en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solución saturante."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".S.M.16% PRESENTACION Reactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) (Cód. Baginski.. La agitación deberá ser vigorosa y en sentido longitudinal. Clin. 3rd ed.. Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente.Ann. Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes datos: Nivel 280 ug/dl 560 ug/dl D. y Wiener. .C. Además. 4/4:621 (1971). Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. E.III Congreso Argentino de Bioquímica .Buenos Aires (1975).Young. Por lo tanto. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas y efectuar los cálculos de la misma manera que en la determinación de hierro sérico. y Albarracín. M. 56/4:543 (1971).. +23.000-4. 1492002).. Drappo. L. 10/5:127 (1973). . B..S. BIBLIOGRAFIA . J.000 r. . como la medida exacta de esta solución no es crítica. Saturación de la Transferrina: 20-55%. 31 . Clin.m. hasta obtener sobrenadante límpido o con la opalescencia propia del suero. Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente.S. 8.Zak.

C.A. Téc.ar Dir. Nº: 1287/77 .Rosario . Disp.220/00 32 . Riobamba 2944 2000 .wiener-lab.Argentina http://www.2000 Rosario .Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.I.: Viviana E.com. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S.

a veces imperceptible.7 y en presencia de un reductor. es la pérdida de sangre a través del tracto gastrointestinal. La mioglobina. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de mañana) ya que las fluctuaciones fisiológicas son significativas durante el día. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo PBTS: listo para usar. A veces se asocian a terapia transfusional. y carcinomas de estómago y colon. el ácido mercaptoacético. Buffer succinato: solución de succinato 0. etc. Un aumento en el valor de los Blancos indicará una contaminación con hierro. 33 . y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las células del sistema reticuloendotelial de hígado. Antes de usar llevar a 18-30oC. sexo.7. material de vidrio. que se mide a 560 nm. formando parte de la hemoglobina. en buffer succinato de pH 3. pigmento más importante de las células musculares. Posteriormente reacciona con el reactivo de color. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.25 mol/l para pH 3. Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia.). Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta. MUESTRA Suero a) Recolección: debe usarse únicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reacción. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo PBTS: solución estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l. Ocurre con frecuencia en mujeres. Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato. Standard: listo para usar. médula ósea y parénquima hepático. debida a hernia de hiato. hábitos alimenticios y actividad eritropoyética). vertiéndolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversión. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". contiene hierro en su grupo hemo. particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto. La otra causa más común de anemia ferropénica. indican contaminaciones ocasionales (agua. bazo. la transferrina. Anotar en el rótulo la fecha de preparación. Standard: solución de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl. Buffer/Reductor: en refrigerador (2-10oC) es estable durante un año a partir de la fecha de su preparación. edad. FUNDAMENTOS DEL METODO El hierro sérico se libera de su unión con su proteína transportadora específica. b) Aditivos: no se requieren. y otras veces a desórdenes caracterizados por una síntesis defectuosa de hemoglobina o fenómenos hemolíticos.Fer-color Método colorimétrico para la determinación de hierro sérico sin desproteinización SIGNIFICACIÓN CLINICA El hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos. úlceras gástricas o duodenales. La anemia por pérdida de hierro representa uno de los trastornos orgánicos más frecuentemente encontrados en la clínica médica. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Variaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard. Reductor: ampolla autorrompible conteniendo ácido mercaptoacético al 70 %.

PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando la misma muestra en 10 días diferentes.5 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco de Reactivos). A. debiendo ser además. Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinación de hierro.150 D. .150 D.O. es indicio de contaminación grosera de los reactivos. Caso contrario.5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2.Clin. . E.Dixon. M.M.Volumen total de reacción: 2.Longitud de onda: 560 nm en espectrofotómetro o 540-560 nm en fotocolorímetro con filtro verde.III Congreso Argentino de Bioquímica Buenos Aires (1975).Ann. . Efectuar este control periódicamente.Temperatura de reacción: temperatura ambiente . Clin.Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.2%.Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla o por agitación suave.Tiempo de reacción: 10 minutos . PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cód.S. 4/4:621 (1971). para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p. 3rd ed. G. . LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO . se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0. AACC Press.Volumen de muestra: 500 ul . ..Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro. Clin. L. se recuperó entre 90 y 103%. . . MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . los cuales deberán desecharse. B. eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro.. b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alícuotas de un mismo suero. El Blanco de Reactivos. Y Albarracín. Baginski. 10-15%.H.Rojkín. c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 500 ug/dl. BIBLIOGRAFIA .. Secar el material preferentemente a no más de 80°C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plásticos. S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Agua bidestilada Standard Suero 500 ul S 500 ul D 500 ul 34 .C.5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer. . Path. si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0. Olguín de Mariani. Drappo. 1492001).Valores de Blanco aceptables: la determinación de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos. para un nivel de Fe sérico de 129 ug/dl. el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemólisis. . . L. C. No invertir para evitar contaminaciones. Por otra parte.O. J.a. M. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. se obtuvo un coeficiente de variación del 4.02 uOhms). . despreciable la contribución del agua en dicho Blanco.Zak. . Toxicol. D. A...Am. Epstein. reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0. 56/4:543 (1971). K. no debe ser superior a 0."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".Tubos de fotocolorímetro. Si bien hemólisis ligeras no interfieren con este método. . d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl. y Wiener. hiperlipemia.Espectrofotómetro o fotocolorímetro. ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones.Young. 1990. E.S.c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl. CONDICIONES DE REACCION .I. Biochem. 10/5:127 (1973).. Para controlar esto último.S.

2000 Rosario . 100 ug/dl S corregida Wiener lab.ar Dir.com. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas de S y D. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Los tubos deben ser leídos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento.6 ug/dl Mujeres: 103.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. con edades oscilando entre los 18 y 51 años. Agregar.I.S.(B + BS) = D corregida Fe (ug/dl) = D corregida x f Donde: f = METODO DE CONTROL DE CALIDAD Standatrol S-E 2 niveles. Nº: 1287/77 .A.3 ug/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. se halló un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios: Varones: 114. manteniendo el frasco gotero en posición vertical. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos. Téc.Búfer/reductor 2 ml 2 ml 2m Mezclar.B = S corregida D .: Viviana E. VALORES DE REFERENCIA En un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos. 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo.C.198/00 35 . Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de Suero BS) en espectrofotómetro a 560 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua.Rosario .Argentina http://www. llevando el aparato a cero con agua. Disp. Riobamba 2944 2000 . restándoles los Blancos correspondientes: S .wiener-lab.

como la esferocitosis hereditaria. Solución de contraste eosina (1 g/L de H2O) o safranina(1 g/L de H2O. que se observan normalmente a nivel de las zonas de abundantes macrófagos. Se han establecido scores para la semicuantificación de la reacción. La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina. mientras que se ve disminuida en la anemia con células S (sickle cells). Normalmente. 3. anemias por deficiencia de hierro y talasemias. MEDICIÓN DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA La fragilidad osmótica mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio. Solución clorhídrica de ferricianuro potásico. Introducir los frotis fijados en la solución clorhídrica durante 1 hora a temperatura ambiente. INTERPRETACION Y EVALUACIÓN DE RESULTADOS La hemosiderina teñida mediante la tinción de Perls aparece bajo la forma de gránulos de intenso color azul. Refleja la habilidad de la eritrocitos para captar agua sin lisar. MATERIAL 1. Lavar los frotis colocándolos en la solución de contraste durante 30 minutos. 36 . METODO 1. constituye el hierro no hemínico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las células del sistema mononuclear fagocítico. que se considera el resultado de la precipitación de varias moléculas desnaturalizadas de apoferritina. 4. Este test ha sido muy usado experimentalmente como medida de la viabilidad del glóbulo rojo y clínicamente con fines diagnósticos. fijar los frotis en vapores de formol durante 30 minutos (algodón empapado de formol en el fondo de un vaso de Coplin). La fragilidad osmótica se ve aumentada en anemias hemolíticas. 3. 2. luego del tratamiento con drogas. Microscopio óptico. como la indometacina.Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls La coloración de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de célula pudiendo ser aplicada a las células presentes en un frotis o extensión de sangre o médula ósea. Frotis de la médula ósea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. La tinción de Perls permite valorar también el hierro no hemínico presente en el citoplasma de los eritroblastos y determinar el número de los que presenten uno o más gránulos de hemosiderina (sideroblastos).2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente(24ºC). Debe prepararse extemporáneamente mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de ferricianuro potásico al 2% en agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0. 2.

fundamentalmente a través de los capilares esplénicos.0. Este test es por lo tanto. diferenciadas de acuerdo a la resistencia de su membrana. Luego se grafican las curvas de % de hemólisis vs.0.0.0. 6. a alguna alteración de las proteínas del citoesqueleto de la membrana eritrocitaria. 4. Las diluciones se realizan por duplicado. Para preparar las soluciones de ClNa se parte de una solución 10 g/L y se realizan diluciones de la misma. 37 .0. 2.0 y 1. [ClNa] y de las mismas se extrae el valor de [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. se deben mezclar 50 µl de sangre con 5 ml de soluciones con diferentes concentraciones de ClNa : 10. El grado de hemólisis es determinado midiendo la hemoglobina liberada a partir de las células. La concentración de ClNa que produce el 50 % de hemólisis puede ser determinada calculando el % de hemólisis según la siguiente ecuación: % de hemólisis = (DOs -DObl) x 100/ DOo donde: DOs= densidad óptica del sobrenadante DObl= densidad óptica del blanco DOo= densidad óptica de la solución de 1 g/L de ClNa. luego de mezclar por inversión. mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio. indicador del estado de la membrana eritrocitaria. Si se produce un desbalance en el equilibrio entre la producción de eritrocitos por la médula ósea y su eliminación esplénica.En este test se mide la capacidad de deformación o elasticidad de la membrana del glóbulo rojo. Se centrifugan.0 g/L es usada como blanco. 5. la membrana del glóbulo rojo pierde su capacidad de deformación . La solución de 10.0. 7.0 g/L. 9. La forma de la curva que muestra el grado de hemólisis en función de la [ClNa] sugiere que ésta puede ser el resultado de la distribución de las poblaciones de GR. posiblemente. 3. La fragilidad osmótica.5. Para realizar la medición. el mismo es quitado de circulación. la cual es imprescindible para que el eritrocito pueda circular libremente.0. Las variaciones en la fragilidad osmótica son definidas como cambios en las curvas de hemólisis y son establecidos por determinación de la [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. nos encontraremos ante la presencia de una anemia hemolítica debida. a 2500 rpm por 15 minutos y se realizan lecturas de los sobrenadantes a 540 nm. Si por alguna alteración del citoesqueleto. 4. 8.0.

..LDH-P AA Método UV optimizado (SFBC) para la determinación de lactato deshidrogenasa (LDH) en suero o plasma SIGNIFICACION CLINICA La determinación de la actividad de lactato deshidrogenada (LDH) en suero.. pH 7.......72 horas y permanece elevada hasta el séptimo o décimo día. Fechar. FUNDAMENTOS DEL METODO Basado en el siguiente esquema de reacción: LDH Piiruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+ Las concentraciones del ensayo están optimizadas de acuerdo a la Sociedad Francesa de Biología Clínica (SFBC)... ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.... pielonefritis.. REACTIVOS PROVISTOS Buffer: solución de buffer Tris....... 1.... d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca............... No congelar........800 D...................O... debe usarse heparina como anticoagulante............ Sustrato: viales conteniendo NADH.. 0...... la actividad de LDH total (junto con las de CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnóstico................. (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo.. Sustrato reconstituido: estable 21 días en refrigerador (2-10oC) o 3 días a temperatura ambiente a partir del momento de su reconstitución...O. 80 mM............ pH 7.. c) Sustancias interferentes conocidas: las muestras con hemólisis visible o intensa pueden producir valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usadas... o superiores a 1.... alcanza un pico entre las 48 ........................ También puede usarse plasma...2 Piruvato . PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método....... Concentraciones finales (según SFBC) Tris ... En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM).... MUESTRA Suero o plasma a) Recolección: se debe obtener suero de la manera usual y separar del coágulo dentro de las dos horas de su obtención...6 mmol/l NADH . Por otra parte......... INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada...... 38 .......... Sustrato: agregar el volumen de Buffer indicado en el rótulo a un vial de Sustrato...................... La LDH es estable hasta 24 horas en refrigerador.....800 D....... 200 mmol/l INSTRUCCIONES PARA SU USO Buffer: listo para usar....... lecturas de absorbancia del Sustrato reconstituido inferiores a 0........ b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma.............2 mmol/l ClNa .. Tapar y agitar suavemente por inversión hasta disolución completa......... también se registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis hepática (producida por agentes tóxicos o por infecciones agudas como la hepatitis viral) e incluso acompañando a necrosis tubular renal.......2 conteniendo piruvato y cloruro de sodio... La misma comienza a aumentar de 12 a 24 horas después de producido el infarto..... tiene una gran variedad de aplicaciones clínicas.

. estando el sustrato en condiciones. Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada temperatura.MACROTECNICA Emplear 50 ul de Muestra. B) 30-37oC I. .683 9.Material volumétrico adecuado. II.Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.095 8. .0 ml de Sustrato reconstituido siguiendo el procedimiento indicado en A). se obtienen los siguientes valores: 39 . .O.Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero.871 17. Leer la absorbancia inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1. siguiendo el procedimiento indicado en A).Cronómetro.921 5.941 25ºC 4.Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366) .00 (*) Calculados Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. En este caso.Espectrofotómetro.Los volúmenes de muestra y reactivo se pueden reducir proporcionalmente sin que varíen los factores de cálculo.La humectación es causa de deterioro del Sustrato. CALCULO DE LOS RESULTADOS LDH (U/l) = ∆A/min x factor En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción seleccionada (30-37oC o 25oC) y a la técnica empleada (micro o macrotécnica) como se indica en la siguiente tabla de factores: Longitud de onda 340 nm 334 nm 366 nm VALORES DE REFERENCIA Temperatura Valores (U/I) 25ºC 120-240 30ºC* 160-320 37ºC* 230-460 Temperatura I (30-37ºC) 9.Temperatura de reacción: 25.MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .118 II (30-37ºC) 8. . la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0.Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir. . colocar: Sustrato reconstituido 3 ml Preincubar unos minutos. repetir la determinación con muestra diluida 1/10 con solución fisiológica y multiplicar el resultado por la dilución efectuada. luego agregar: Muestra 100 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra.016 9. . 30 ó 37oC. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. PROCEDIMIENTO A) 25oC En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo.MICROTECNICA Emplear 20 ul de muestra y 1.253 15. 2 y 3 minutos de la primera lectura. Utilizar este promedio para los cálculos.Tiempo de reacción: 3 minutos y 30 segundos. indica una muestra con muy alta actividad de LDH (que consume NADH aún antes de esta lectura). Esperar 30 segundos. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (∆A/min). restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. . CONDICIONES DE REACCION (Disminución de absorbancia) .800 D.

......"Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests"..... PRESENTACION ...................... 40:160. 3rd ed....700 D.100 D.5% y semiancho de banda ≤ 8 nm......com........S................ Disp............ cinética Dirección de la reacción ..wiener-lab........... Si la ∆A/min es superior a 0.... en espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366)......... Biol...... corrigiendo consecuentemente los resultados...3 x 20 ml (Cód....... (340-334 nm y 25oC) o 0............. 2....S..............095 Coef..I.Argentina http://www.000 D............14 U/l +7.... ... para un ∆A/min de 0.. 460 U/l Linealidad ..............Quim...Ann...... 1982.. Riobamba 2944 2000 .....Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S......Comité Científico.. 37oC Relación muestra/reactivo . PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Longitud de onda primaria . 1.... Nº: 3330/97 Cert............ Clin........... (366 nm y 25oC)............S. BIBLIOGRAFIA .....C.. De acuerdo con la sensibilidad requerida.. 1989. repetir la determinación con muestra diluida 1/5 ó 1/10 con solución fisiológica.................... el mínimo cambio de actividad detectable será de 5 U/l (a 340 nm y a 25oC)...Societé Française de Biologie Clinique (SFBC) ........ 3 segundos Tiempo de retardo ............... Cétola Bioquímica Producto Inscripto M......O.................... ∆A/min (a 340 nm y 25oC)......... reproducibilidad ± 2 nm... 1521303). 6... con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor.... 40 segundos Tiempo de lectura ...A............17% b) Límite de detección: depende del espectrofotómetro empleado y de la longitud de onda....... Límite de absorbancia .200 D... luz espuria ≤ 0....O........3 [l x mmol-1 x cm-1] Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso.. disminuye Temperatura de reacción .. D...: Viviana E........Sociedad Española de Química Clínica ..............ar Dir.. Comisión de Enzimas ....... +5.................. 340 nm Longitud de onda secundaria (bicromática) .......... 60 segundos Absorbancia de blanco .................001....... 1000 U/l Factor (paso de luz 1 cm) ..........200 D...... ............. 1990.............17% 1... 8........ Téc.. Valor normal inferior ... Wiener lab.......... 380 nm Tipo de reacción .......... extinción molar (∑340) ...........Rosario ..... c) Rango dinámico: el rango útil de lectura se extiende hasta 0..... 1:50 Tiempo de equilibrio .............. 2000 Rosario ...............O..............99 U/l C.O........ 57-61.........V.......... Clin...Nivel 438 U/l 683 U/l D.........O........ Nº: 2114/97 40 ....... > 0.... AACC Press.. ............Young....... 230 U/l Valor normal superior ..........

mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo Sulfanílico. También es posible realizar la determinación en líquido amniótico. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento. plasma o líquido amniótico a) Recolección: obtener suero o plasma de la manera usual. envolviendo el tubo con papel negro. debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción. De forma tal que. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La presencia de sedimento y/o cambio de coloración de los reactivos. REACTIVOS NO PROVISTOS .Agua destilada.07 mol/l. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina sérica con el consecuente riesgo de difusión del pigmento al sistema nervioso central. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente (< 25oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. La eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido es una patología provocada por incompatibilidad maternofetal en la que se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. el suero debe conservarse hasta 48 horas en el refrigerador (2-10oC) y la 41 . Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo. Reactivo Sulfanílico: listo para usar. para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra.17 mol/l. MUESTRA Suero.Bilirrubina Standard provisto separadamente por Wiener lab. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias. c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis moderada o intensa inhiben la reacción directa. REACTIVOS PROVISTOS Desarrollador: solución acuosa de benzoato de cafeína 0. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". pueden ser indicio de deterioro de los mismos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo. para efectuar la calibración periódica del equipo. compuesto de degradación de la hemoglobina. Proteger de la luz natural o artificial. por lo que la determinación de la bilirrubina en estos niños recién nacidos resulta sumamente importante. Rotular y fechar.13 mol/l. Reactivo Sulfanílico: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0. INSTRUCCIONES PARA SU USO Desarrollador: listo para usar. debe usarse heparina para su obtención. . Nitrito de Sodio: solución de nitrito de sodio 0. Diazorreactivo: en refrigerador (2-10oC) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3 meses a partir de la fecha de su preparación. la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reacción. es captada por el hígado para su conjugación y excreción en la bilis. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. tamponada y estabilizada.Bilirrubina Método colorimétrico para la determinación de bilirrubina directa y total en suero y otros líquidos biológicos SIGNIFICACION CLINICA La bilirrubina. FUNDAMENTOS DEL METODO La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. obteniéndose valores de bilirrubina total falsamente aumentados.

Longitud de onda: 530 nm en espectrofotómetro o 520-550 nm en fotocolorímetro con filtro verde.Tubos de fotocolorímetro. II.B) x f Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total .2 ml T 1 ml 1. de acuerdo a la severidad de la ictericia.79 y 9.5 ml 0.Temperatura de reacción: temperatura ambiente .5 ml 0.Frasco de vidrio color caramelo. llevando el aparato a cero con agua destilada.37. Luego de 5 minutos. Si se lee antes.Volumen de muestra: 200 ul . Es por tal motivo que debe protegerse cuidadosamente.9 ml PROCEDIMIENTO I.Espectrofotómetro o fotocolorímetro. El líquido amniótico es conveniente mantenerlo congelado hasta el momento de efectuar el ensayo. . Si se lee después. CALCULO DE LOS RESULTADOS Bilirrubina total (mg/l) = (T . CONDICIONES DE REACCION .Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.sangre entera no más de 24 horas en refrigerador o 12 horas a temperatura ambiente.5 ml 200 ul D 200 ml 2.38 respectivamente.5 ml 200 ul T 200 ml 2. excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos.Tiempo de reacción: 5 minutos .BRB directa El factor colorimétrico (f) debe calcularse con el Standard de Bilirrubina de Wiener lab. En dos tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco) y T (Total) colocar: B Muestra (líquido amniótico) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 1 ml 1.2 ml Proceder de la misma manera que en la técnica I. Dividir el resultado final por 5.B) x f Bilirrubina directa (mg/l) = (D . Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. leer en espectrofotómetro a 530 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520-550 nm). habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. . Multiplicar los resultados obtenidos por 3. habrá sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre.TECNICA PARA LIQUIDO AMNIOTICO Se determina bilirrubina total. en caso de ictericia moderada se usarán 50 ul de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren sólo 20 ul. METODO DE CONTROL DE CALIDAD 42 .TECNICA PARA SUERO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco). .5 ml 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. D (Directa) y T (Total) colocar: B Muestra (suero) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 200 ml 2.Volumen final de reacción: 2. . De tal forma.Reloj o timer. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . Sueros ictéricos: debe emplearse la técnica descripta pero con menores cantidades de muestra. La acción de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra. .

VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina en suero o plasma .Standatrol S-E 2 niveles.5 mg/l la muerte fetal es inminente.Recién nacidos: Nacidos a término Sangre de cordón Hasta las 24 hs Hasta las 48 hs Del 3º al 5º día 25 mg/l 60 mg/l 75 mg/l 120 mg/l Prematuros 80 mg/l 120 mg/l 240 mg/l Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. Los niveles por encima de 2. mientras que entre 1 y 2. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.7 mg/l el feto ya se encuentra afectado y tiene probablemente algún tipo de falla circulatoria. En los prematuros. Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4.Adultos: Directa: hasta 2 mg/l Total: hasta 10 mg/l .7 mg/l sólo se encuentran en presencia de eritroblastosis fetal. 43 .7 mg/l sugieren la posibilidad de un feto afectado. Bilirrubina en líquido amniótico Valores menores de 1 mg/l son considerados normales. Si la cantidad de bilirrubina sobrepasa los 9. los niveles de bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad. dependiendo del grado de inmadurez hepática.

4% 4. 45/1:70 (1966). et al .4a Ed. . Chim. Riobamba 2944 2000 .“Laboratory manual of pediatric microbiochemical techniques”.Clin. R. T. .Young. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día. M. . J.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. AACC Press. .5347/98 44 . Nobuoka. . 1990. c) Recuperación: agregando cantidades conocidas de bilirrubina a distintos sueros. D.7% 1.1% b) Linealidad: la reacción es lineal hasta 150 mg/l. D.Watson. . Path.Botwell.LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.S.47 mg/l +1. PRESENTACION Equipo para 200 determinaciones (Cód.45 mg/l C.ar Dir. .O’Brien.wiener-lab. . +0. se obtuvo lo siguiente: Bilirrubina directa Bilirrubina total Nivel 2..Clin.1 mg/l 26. Nº: 252/75 . Wiener lab.Ichida.5% 2. 3rd ed.. La acción de la luz. BIBLIOGRAFIA .18 mg/l +0.Zaroda.7 mg/l D. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S. Téc.62 mg/l +0.Argentina http://www. ."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".V.0 mg/l 9. D. es capaz de destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente.C. 1120001). 2000 Rosario .8 mg/l 127. Chem. J.Clin. H. Disp. Harper & Row Pub .Am. Acta 19/2:249 (1968). tanto sobre los sueros como sobre las soluciones standard. 10/3:197 (1964).: Viviana E. se obtuvo una recuperación entre 100 y 106%. 7/6:603 (1961).com. . Chem. Clin. 8.A.Rosario .S.I. (1968).

.... 6.... Las tiras deben conservarse en posición vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%... Colorear durante 5 minutos. FUNDAMENTO Las diferentes hemoglobinas se separan por migrar a diferentes velocidades. REACTIVOS 1) Solución buffer: Tris........ 5) Solución de transparentización: Metanol .. queda en la HbA migrando juntas.. 14 ml Glicerol .1 g Glicina .... 3. 1 ml 6) Solución disolvente: Ácido acético 80% Técnica: 1... Conectar la fuente de poder.. Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos 2.. 22. 5..6)... En este medio la HbA migra hacia el ánodo.....Separación electroforética de hemoglobina SOPORTE Acetato de celulosa gelatinizado.... Decolorar con 3-4 baños de solución decolorante.5 g en 100 ml de ácido tricloroacético 5% (dosis para 20 tiras) 3) Solución decolorante: Ácido acético 5%....... mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades).. Las tiras secas pierden las dimensiones y las características del gel.... 8... La superficie de las tiras que es penetrable a las proteínas se reconoce porque es más opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro. en medio alcalino (pH= 8.6 g H2O destilada. Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética. La tira debe estar bien tiesa y plana. realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts............... Desconectar la corriente y retirar las tiras. a continuación se las coloca en la solución 45 .. 14..... 7....... La HbA2 tiene una velocidad menor que la A. Sembrar las muestras con el hemolizado obtenido (ver más adelante).. Leer a 520 nm si se usó colorante Ponceau S. Operar rápidamente para evitar evaporaciones. 1000 ml 2) Solución colorante: Ponceau S: 0....... 4.. Determinación cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solución disolvente y agitar..... hasta ver el fondo blanco de la tira. 85 ml Ácido acético ...... durante 90 minutos................ La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba..... Eliminar el exceso de líquido secando entre 2 papeles de filtro.. 4) Solución deshidratante: Metanol puro... 9. Transparentización: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos...

variable según tipo de Th homocigota HbS 50% HbC 50% HbF HbA 46 .transparentadora durante 1 minuto como mínimo. Se colocan luego en una placa de vidrio. El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatías: TIPO Normal Polo negativo Anhidrasas Carbónicas Recién nacido Anhidrasas Carbónicas Drepanocitosis homocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Drepanocitosis heterocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Hemoglobinopatía C homocigota Anhidrasas carbónicas Hemoglobinopatía C heterocigota Anhidrasas HbC Carbónicas β-talasemia heterocigota β-talasemia homocigota Doble Heterocigota S/C Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbC HbS Carbónicas HbA HbC HbA HbF HbA HbA2 Polo positivo HbA ACLARACIONES HbA 98% HbA2 2% HbF 90% HbA 10% HbA2 2% HbS 98% HbA < 50% HbS > 50% HbA2 2% HbC 98% HbA2 2% HbC > 50% HbA < 50% HbA2 entre 4-8% HbA HbA2 normal % de HbF y HbA. Así se conserva para leer en densitometría. hasta la transparencia completa. eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos.

5. aunque se recomienda la heparina.PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO Técnica 1. Se determina la concentración de hemoglobina en el bemolizado obtenido. usando cualquier anticoagulante. desechando los sobrenadantes. recoger con pipeta Pasteur el infranadante y filtrar. 47 . 4. 3. Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm. mediante el método de la cianmetahemoglobina. Se lava tres veces con solución fisiológica. se lleva la concentración hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada. agitar vigorosamente durante 1 minuto. 2. Colocar en heladera (favorece la hemólisis). 6.8 ml de tolueno (rompe los glóbulos blancos). se agrega un volumen de agua destilada igual al del paquete globular y 0. Obtener 5 ml de sangre por punción venosa. dejar 24 horas.

Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke
FUNDAMENTO La hemoglobina fetal (HbF o α2γ 2) es ácido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos. REACTIVOS 1. Alcohol etílico al 80% 2. Buffer de ácido cítrico, pH 3,4 Solución A: Ácido cítrico............................ 4,2 g Agua destilada......................... 100 ml Solución B: Citrato de sodio........................ 5,9 g Agua destilada......................... 100 ml Solución Buffer pH 3,4: Solución A ................ 84 ml Solución B................. 16 ml 3. Eritrosina o eosina al 0,1 % en agua. DESARROLLO 1. Extendidos de sangre secos de no más de una hora de obtención, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etílico al 80% 2. Lavado rápido con agua y secado. 3. Inmersión en una cápsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37°C un mínimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rápidamente en agua común y secar en posición vertical. 4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solución de eritrosina o eosina. Lavar con agua y secar. RESULTADOS Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras. El análisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hematíes coloreados e incoloros.

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DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA FETAL: METODO DE SINGER FUNDAMENTO Debido a la muy semejante movilidad de la hemoglobina normal (HbA) y la hemoglobina fetal (HbF), cuando usamos los métodos electroforéticos de rutina para el estudio de hemoglobinas, es necesario valerse de la propiedad de la HbF (y la Hb Bart( de ser resistentes a la desnaturalización en medio alcalino. REACTIVOS 1. Solución de hemoglobina (véase obtención de bemolizado) 2. OHNa 1/12 N (recién preparado) 3. Reactivo precipitante SO4(NH4)2 .............................. 38 g ClH 1N ..................................... 2,5 ml H2O destilada ........................... 100 ml TÉCNICA Se preparan tres tubos: • • • • Tubo 1: Blanco: 3,2 ml de OHNa 1/12 N, agregar 6,8 ml de reactivo precipitante y filtrar. Tubo 2: Hb 100: 5 ml de agua destilada, agregar 0,02 ml de la solución de hemoglobina Tubo 3: Hb álcali-resistente: 3,2 ml de oHNa 1/12 N, agregar 0,2 ml de solución de hemoglobina y disparar en el momento un crónometro, a los 60 segundos agregar 6,8 ml de reactivo precipitente, invertir varias veces y filtrar. Leer en un espectrofotómetro a 540 nm, llevar a cero con el tubo blanco (Tubo 1).

CÁLCULO % de Hb álcali-resistente = VALOR NORMAL Menos de 2%. DO tubo 3 x 20 DO tubo 2

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Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs
A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION a) Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2 % en salina fresca (véase más abajo el apartado C. Preparación de la suspensión globular al 2%). b) Agregar una gota de la suspensión globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn. c) Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A1, B y O al 2% d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. e) Leer primero los controles y luego los problemas microscópicamente en visor y microscópicamente. f) Scores de lectura: +++ un gran aglutinato ++± varios aglutinatos grandes ++ muchos aglutinatos pequeños +± pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo + aglutinatos visibles pero solo microscópicamente aglutinatos conteniendo muy pocas células tr trazas - negativo B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO a) Tomar una muestra de suero libre de hematíes. b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los siguientes hematíes: 1) hematíes A conocidos 2) hematíes B conocidos 3) hematíes del propio individuo 4) hematíes O conocidos c) Incubar 1 hora a ta o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. d) Leer primero los controles y luego los problemas , microscópicamente en visor y microscópicamente. C. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2% Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn. a) Llenar el tubo con solución fisiológica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. b) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución fisiológica. c) Tomar una gota de culot (50 µl) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la suspensión al 2%.

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e) Proceda de la misma manera con los tubos controles. E. b) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra.2 Reacciones • • Positiva: los hematíes D(Rho) positivos permanecerán aglutinados al querer desprender el culot globular. Negativa: los hematíes (Rh-rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar aglutinación. Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados: Glóbulos rojos problema Anti A + + GR A + + Anti B + + GR B + + Anti AB + + + GR AB + + + Grupo ABO A B O AB Grupo ABO A B O AB Suero problema E. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn. E. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA a) b) c) d) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota. d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. F. disparar el cronómetro. Al terminar de mezclar.1 Controles a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D c) Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB. La lectura se hará microscópicamente con un visor y microscópicamente.D. PRUEBA PARA DETECTAR Du 1 También se puede utilizar un monoclonal anti-A1 51 . Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto. c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm. Agregar una gota de anti-A absorbido1 y mezclar bien con una varilla de punta fina.

F. Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Coloque dos gotas de suero anti –D(Rho) en un tubo de Kahn2.1 Reacciones • • Positiva: los hematíes Du (Rhou) positivos permanecerán aglutinados luego de intentar desprender el culot globular. 2 La detección de Du también se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du. desprenda suavemente el culot globular y lea. 5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana. Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en salina . 1) 2) 3) 4) F. Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs. Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda falsear los resultados. Negativa: los hematíes Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspenderán y no aglutinarán. La lectura se hará macro y microscópicamente. Centrifugue y elimine el sobrenadante.Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti –D. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du. es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti –D por suero de persona de grupo sanguíneo AB. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS.dado que. G. Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con el antígeno E(rh”) presente . El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparación del suero). Para seudoaglutinación Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados.2 Controles utilizados Se utilizan tres controles para 1. Comprobar su especificidad 3. El tercer control. Probar la bondad del suero 2. 52 . en tales hematíes el factor D(Rho) es mas reactivo. 6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm. Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C.

9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. eliminando completamente el sobrenadante en el último lavado. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm.G. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%. quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente.2 4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.2 8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. G. 53 .1 Prueba de Coombs indirecta 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes de grupo O Rh+ al 2%. 3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2 Prueba de Coombs directa 6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. 2) Centrifugar. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de 1 hora a 37 °C. 7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F. 5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%.

ACD (ácido cítrico. implica grupo O. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. adenina). deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . Las muestras recogidas con ACD.B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. REACTIVOS PROVISTOS Anti-A. dextrosa. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los demás ensayos pretransfusionales.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS) .Solución fisiológica . Anti-B o Anti-A. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos altamente reactivos en su superficie. La ausencia de aglutinación en todos los casos.Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".Tubos de hemólisis . fosfato.B monoclonal. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. También demostró que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee.Centrífuga . B. Si se utilizó heparina o EDTA.Albúmina Bovina 30% de Wiener lab.Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS) . Anti-B o Anti A. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes. heparina. dextrosa) CPD (citrato.B Monoclonal Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en A. AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A. Anti-B o Anti-A.Placas . REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: . fosfato. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA. Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. citrato. dextrosa) o CPDA-1 (citrato. B.Anti-A. con o sin anticoagulante. PROCEDIMIENTO 54 . Si se emplean coágulos. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional. Por este motivo. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente.

colorantes. Standard 57:49-59. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%.B monoclonal colocada en una placa limpia. Anti-B o Anti-A. Washington.Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas.Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías. Symp. 9th Edition. . Como control. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. BIBLIOGRAFIA . Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. 1443153). Observar aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use”. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos. S. París. F. se coloca una gota de estas células con 2 gotas de solución fisiológica. III.TECNICA EN TUBO (por centrifugación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A. II.Widman.B + + + + Grupo sanguíneo A B 0 AB Variants débiles del grupo A como Ax METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados.Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idéntico. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación. D. 1983. sobre todo en los prematuros. Anti-B o Anti-A. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. France. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción positiva. . I.C. resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la tipificación. Anti-B o Anti-A.TECNICA EN TUBO (por sedimentación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. “Int.500 rpm.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera. PBS o LISS.Leucemias u otros desórdenes malignos. . 55 . “Technical Manual”. Anti-B: frasco x 10 ml (Cód.Moore.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A.En las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solución fisiológica. American Association of Blood Banks 1985. 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. . No debe producirse aglutinación. Antisuero Anti-A + + +/Anti-B + + Anti-A. Biol.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. No debe emplearse microscopio.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. Develop. 1443154). 2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. et al.K. . Chapter 8.Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones: . PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cód. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica. compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. 1443152). Por esta razón deben extremarse los cuidados.

Nº: 1071/89 (Anti-A.B) 56 . Disp. Nº: 1073/89 (Anti-B) Disp. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.A.I. Nº: 1076/89 (Anti-A) Disp.ar Dir.C.Argentina http://www.wiener-lab.Rosario . Riobamba 2944 2000 .S. 2000 Rosario .Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Téc.: Viviana E.com.Wiener lab.

FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). CPD (citrato. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente. dextrosa) o CPDA-1 (citrato. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. dextrosa. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido. EDTA. adenina). la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Dependiendo de la técnica que se emplee. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días.Anti-D (Rho) monoclonal Reactivo para la detección de antígeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en el laboratorio de los anticuerpos anti-D. Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. Cuando se sospecha esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. .Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). ACD (ácido cítrico. podrán ser necesarios: . INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.Solución fisiológica. fosfato. c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas.Centrífuga . Si se utilizó heparina o EDTA. Sin embargo. ya sea por transfusión o durante el parto. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente: . produciendo anti-D. citrato. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro". Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno. Si se emplean coágulos. es el antígeno D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. dextrosa). Las muestras recogidas con ACD. INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes.Placa de vidrio 57 . REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos. fosfato.Tubos de hemólisis .

2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 1975. Exp.. Unger. Chapter 9. II. 3) 5) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos.C.500 rpm. . 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. Biol. mezclar. 1959. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.. 2000 Rosario .Proc.R. Ed. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. o solución fisiológica.K. 1443155). 43: 223. F. 6) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente. . Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos. 4) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.“Blood Groups in Man” . Wiener lab. A. R. Med. Riobamba 2944 2000 .Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.I. Soc. . La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-50oC. .6 th Ed. 1940.A. R.JAMA 169:696.Argentina 58 . o solución fisiológica. . 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. 178.“Technical Manual” .TECNICA EN TUBO Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico).C. .Landsteiner. BIBLIOGRAFIA . 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. . Oxford Blackwell Scientific Publications. American Association of Blood Banks. Las muestras que aún en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du.. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. luego centrifugar y volver a leer como se describió en 4).S. A.Rosario . 1985.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos.Race . o en solución fisiológica.9 th. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos sensibilizados. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. L.Widman. 4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica. Washington D. III. and Sanger. Wiener. También puede emplearse sangre entera. descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las células luego de cada lavado. 3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos.S. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. K.J. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis.Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I..Wiener. pág.

com. Disp. Téc. Nº: 1074/89 59 .ar Dir.http://www.wiener-lab.S. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.: Viviana E.

Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica. dextrosa) CPD (citrato. .Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. . FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminación del mismo.Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS). 60 .Suero Anti-humano (poliespecífico) Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs.Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. produce una aglutinación de los glóbulos rojos visible macroscópicamente. C3bi.Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. . ACD (ácido cítrico. PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro". Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. heparina. REACTIVOS NO PROVISTOS . C3dg o C3d). . fosfato. Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA.Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glóbulos rojos. citrato. MUESTRA Glóbulos rojos a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente. .Solución fisiológica.Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos. con o sin anticoagulante. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. adenina). dextrosa) o CPDA-1 (citrato. siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prueba Antiglobulina Indirecta . De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente: . .Fenotipo de glóbulos rojos. fosfato. REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3. INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar. El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a antígenos del sistema Rh. dextrosa.Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS). .Identificación y titulación de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. Prueba Antiglobulina Directa .

and Race. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas.Tiempo o temperatura de incubación inadecuados. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: . 1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. Las muestras recogidas con ACD. Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS.E. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I). Descartar completamente el sobrenadante luego del último lavado. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos.R. 1443156).c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. 1945. R. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. 2) Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS. . Finalmente preparar con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%.Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. . Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. III. Mourant. 4) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado.Centrífuga . 61 .PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica). CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días.Lancet. .. 3) Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua. Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas. Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos.Coombs. Si se utilizó heparina o EDTA. ii:15. la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extracción).A. Si los glóbulos provienen de coágulos.Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal). PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód.Lavado inadecuado de las células. . 2) Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS. 1) En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar. 6) Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente.Baño de agua a 37oC . 2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7) de la técnica I). II.Tubos de hemólisis PROCEDIMIENTO I. A..500 rpm. BIBLIOGRAFIA . R.Concentración inadecuada de glóbulos rojos. .R. 1) Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar. .Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados. 3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos. Si se emplean coágulos. 7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados con IgG débiles.

Coombs.E.: Viviana E.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. . 1985. American Association of Blood Banks.R. Téc. Nº: 2503/91 62 .I. J.C. Disp.S. 9th ed.R. Mourant. 1945. Wiener lab.K. Path. . 26:225.C. Washington D. R.Brit.ar Dir.A. 376.A.. pág. Exp. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. 2000 Rosario . A.Widman.Rosario .Argentina http://www. Riobamba 2944 2000 . R.“Technical Manual”. F..com. .wiener-lab. and Race.

b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%.100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. con aglutinación. colocar 0. TITULACIÓN DE ANTICUERPOS A. c) Tomar 0. el tiempo requerido. El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación ± .1. 63 .300 ml de suero a titular en el tubo N°1. c) Incubar a la temperatura apropiada . Colocar 0. a) Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de hematíes a usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes. Preparación de diluciones madres. el título se determinará promediando dicha dilución con la precedente. d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16. Con una pipeta Pasteur para cada dilución.1. a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario). Luego se toman 0.100 ml de solución fisiológica (SF). d) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del suero.1.1 Técnica básica de titulación A. El grado de aglutinación se considerará según los scores anteriormente indicados. Si en la última dilución. Agitar la mezcla. el título será (16+8)/2=12. Homogeneizar y repetir la operación hasta completar las diluciones. colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos. b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O con dos gotas del suero a titular. b) En los tubos 2 al 10. el tipo de aglutinato es tr.100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2.Determinación de anticuerpos inmunes A. Por ejemplo. el tipo de aglutinato es tr. A. e) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilución. numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla.2 Titulación a) Se toman 10 tubos de Kahn.

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