UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS ASIGNATURA HEMATOLOGIA

Métodos del laboratorio hematológico
PRIMERA PARTE

Docentes

Dra. Nilda E. Fink Dra. María Elena Chiesa Dra. Ma. Alejandra Fernández Alberti Bioq. Fernando Ventimiglia Bioq. Mariana González Bioq. José Luis Casali

La Plata, 2007

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Contenido
Página Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa Descripción de los anticoagulantes usados en hematología Recuento de hematíes Hematocrito Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina Velocidad de sedimentación globular Recuento de reticulocitos Cuantificación de hierro sérico Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls Separación electroforética de hemoglobina Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs Determinación de anticuerpos inmunes 3 5 7 12 15 21 26 29 34 42 45 47 57

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11. 3. una vez manipulado. localizándola visualmente y por palpación. 13. limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol. se la colocará en la jeringa sin tocar con los dedos. 2. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba). 8. controlando el correcto funcionamiento del émbolo. Colocar el lazo y volver a palpar la vena. Elegir una vena bien visible en el antebrazo. LA AGUJA SE DESCARTARÁ EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN. En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más sangrado. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresión del músculo no mayor a 1 mm. 15. El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y. descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin. 9. dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. 6. Una vez realizada la toma de muestra. 14. presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco. Después de la toma. Dejar secar perfectamente. 10. Los recipientes que contienen algodón y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirán solamente al momento de usar. se retira el torniquete y luego la aguja. La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba. evitando hacer espuma. se le indica al paciente que abra la mano. los cuales se mantendrán puestos durante todo el procedimiento. 12. indicarle al paciente que abra y cierre el puño para facilitar la extracción. En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja. Antes de iniciar la toma de muestra. Una vez identificada la vena. tener todo el material preparado pero sin abrir. Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables. La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes. no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo. 5. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. 4 . 7.Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa A) EN ADULTOS 1. Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene. 4.

3. Secar la zona con un trozo de algodón seco y una vez que no haya sangrado. dejar evaporar y punzar con la lanceta. se procederá a extraer la muestra del talón con una lanceta descartable. NO REUTILIZARLOS NUEVAMENTE. 17. En niños mayores de 6 meses. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante. Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento. Antes de la extracción conviene calentar el talón frotándolo entre las manos para favorecer la irrigación de la zona. en particular el brazo. Desinfectar con un trozo de algodón embebido en alcohol. Las flechas indican los lugares de punción 5 . aclararlo en el registro de muestras. en la zona del talón indicada en el dibujo adjunto. 2. 4. B) EN NIÑOS 1. colocar una curita o apósito.16. En el caso de niños menores de 6 meses. pidiéndole a un adulto que colabore en mantener inmóvil al niño. La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. se recomienda hacer la extracción del brazo como en adultos.

Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares. por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido. posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C). El citrato sódico se utiliza a una concentración de 0. sin embargo . como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo.1-0. Los anticoagulantes más utilizados son: • EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica. HEPARINA SÓDICA. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico. el tamaño eritrocitario.3 g/L de C6H5O7Na3. especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro • • • 6 .2 mg/ml.106 mol/l (31. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.1g. El K2EDTA . Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos.2 mg) de heparina por ml de sangre. las tres sales afectan el tamaño del eritrocito. HEPARINA DE LITIO. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos.2H2O). así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1.5-2. de sangre total.0. no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria.8+/-1. C6H5O7Na3. impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo.2H2O posee un peso molecular relativo de 404. ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes. evitando así la coagulación. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1.Descripción de los anticoagulantes usados en Hematología Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares. CITRATO TRISÓDICO. es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. actúa impidiendo que el calcio se ionice. actuando mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca+ + ). dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares.

La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0. Citrato disódico 2 g. 7 .9 g. Dextrosa 2 g.volúmenes de sangre. H2O destilada 120 ml.

como se muestra a continuación: 8 .Recuento de hematíes A) RECUENTO MANUAL Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. Líquido diluyente: solución fisiológica o citrato de sodio 3. se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeños. La dilución empleada es de 1/200.8%.02 ml El recuento se realiza en la cámara de Neubauer cuyo esquema es el siguiente: El recuento de hematíes se realiza en el cuadrado central.98 ml Sangre (con pipeta automática): 0. para lo cual se mide exactamente: Solución fisiológica o citratada: 3. Es un método poco usado debido al elevado error que presenta.

FC: Factor de corrección de la profundidad. Con la dilución indicada. Causas de error en el recuento en cámara cuentaglóbulos El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%. el cálculo que se debe hacer es el siguiente: N x D x FC x ST = nº de glóbulos rojos/mm3 TC Donde: N: número de eritrocitos contados. se carga la cámara y se cuentan los glóbulos rojos de los 80 cuadrados pequeños (zona sombreada). que el retículo tiene 400 cuadrados pequeños en total. 1. Considerando entonces. el cual puede deberse a: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. D: Título de la dilución realizada (200). Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. Coagulación parcial. sucia o mojada. 4. Empleo de cubreobjetos deformable. Utilización de material mal calibrado. Errores del operador al realizar el recuento. 7. 2. sucio o húmedo. Cámara cuentaglóbulos mal ajustada. TC: Total de cuadrados pequeños contados. 8. Falta de suficiente agitación de la sangre diluida. 9 . Hemólisis. Errores al efectuar los cálculos. evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente. 6. sirven únicamente como límites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeños. Células mal distribuidas en el fondo de la cámara. no rígido. o triples.Recuadro central: Las líneas reforzadas.1 mm. 3. Llenado incompleto de la cámara cuentaglóbulos. 5. Se deben contar 5 de estos cuadrados. luego de agitar adecuadamente en un agitador de rodillos. La cámara puede ser cargada con un capilar. ST: Total de cuadrados pequeños en la superficie de 1 mm2 (400). para llevar a 1 mm3 (10). La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0.

La intensidad de corriente entre ambos electrodos: debe ser lo suficientemente sensible para detectar la resistencia que genera la partícula cuando atraviesa el orificio. 10 . es decir. Debe ser perfectamente permeable. El número de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular y como la amplitud del impulso es directamente proporcional al tamaño de la célula. por lo general poseen un monitor de visualización que permite observar su permeabilidad durante el recuento. 2.1 Método de la impedancia o de la resistencia eléctrica Es el más empleado en los autoanalizadores hematológicos. Impedancia o resistencia eléctrica. Dispersión de luz o campo oscuro. La sangre total es diluida en una solución de conductividad estable. las células sanguíneas así diluidas se hacen pasar por un orificio de apertura con un área prefijada. B.B) RECUENTO AUTOMATIZADO La automatización ha contribuido de manera decisiva al aumento de la rapidez y la fiabilidad del recuento de las células sanguíneas. Es importante realizar periódicamente una limpieza de este orificio. Este método tiene algunas limitaciones. Cuando una célula pasa a través del orificio. como por ejemplo diluciones de la muestra antes de ser procesada y. Existen distintos tipos de instrumentos: los semiautomatizados que requieren algunos pasos previos. 2. Se basa en la propiedad de las células sanguíneas de no conducir la electricidad. Como los impulsos eléctricos que van a determinar el volumen celular se generan en el orificio de apertura del sistema. que varias células atraviesen el orificio al mismo tiempo. La concentración de la suspensión analizada: debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia. Si es muy elevada puede dañar las células y producir interferencias originadas por ruido electrotérmico. para cada población celular que se quiera estudiar se deben seleccionar las condiciones para que sean analizadas sin error. El diámetro del orificio de apertura: debe estar en relación al tamaño de las partículas que se analizan. se genera una resistencia entre ambos electrodos que se registra como un impulso. es posible determinar también el volumen celular. los aparatos totalmente automatizados sólo requieren que se les suministre la muestra obtenida en condiciones apropiadas (por ejemplo: con el anticoagulante adecuado). 3. Las condiciones más importantes que deben tenerse en cuenta son: 1. Los sistemas de recuento celular por estos medios se basan en la medida del tamaño u otras propiedades físicas de las células suspendidas en medio líquido de acuerdo con uno de los dos principios siguientes: 1. Por dentro y fuera del orificio se disponen electrodos que establecen una diferencia de potencial.

3x1012/L 4. VALORES DE REFERENCIA Edad Recién nacidos Niños (2-12 años) Adultos jóvenes (12-18 años) Adultos jóvenes (19-60 años) Sexo ambos ambos mujeres hombres mujeres hombres Intervalo de referencia 4.5. Coagulación parcial. proyectada sobre un campo oscuro.2x1012/L 4. Presencia de partículas extrañas en el diluyente. 1.3x1012/L 4. Defectos en el sistema electrónico de recuento: a) Lisis incompleta de los eritrocitos en el orificio de leucocitos. que son contadas como células. f) Contaminación por arrastre de un especimen con el siguiente. Si además. 2.2 Método de dispersión de luz Se analiza la dispersión de luz producida por las células desde dos dimensiones gracias a sensores ubicados en ángulos diferentes.1x1012/L . e) Presencia de microburbujas. será analizada por los sensores.5. pero puede incrementarse por: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración.0x1012/L .1x1012/L . Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre.B. c) Obstrucción de los capilares u orificios de recuento. Las células se hacen pasar individualmente a lo largo de una cámara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz que puede ser halógena o láser. las células se someten a tinciones citoquímicas se pueden detectar midiendo la intensidad de dicha reacción los diferentes tipos de leucocitos. Estos sistemas permiten medir la concentración y el volumen celulares. Uso de un diluyente incorrecto. En general. suele ser inferior al 1%. Causas de error en el recuento automatizado Con el empleo de métodos automatizados se puede cometer grandes errores si se olvida el control periódico y el calibrado diario de los instrumentos. cuando se realiza en óptimas condiciones. 4.3x1012/L 4.6x1012/L . C.5.5x1012/L . el error debido al propio método de recuento electrónico. 3. Cada vez que una célula se interpone en el haz de luz se produce una sombra que.7x1012/L . Hemólisis. b) Presencia de agregados celulares a nivel del orificio de recuento.1x1012/L 4.9x1012/L D) INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 11 .6.5. g) Presencia de interferencias electrónicas y averías de los componentes electrónicos del instrumento.5. d) Dilución incorrecta de la muestra por el liquido diluyente.

se habla de seudopoliglobulia.Un aumento de la concentración de eritrocitos con contenido hemoglobínico normal suele acompañarse de un aumento de la concentración de hemoglobina y recibe el nombre de poliglobulia. 12 . la hemólisis o fallas en su formación a nivel de la medula ósea. la cual puede acompañarse de microcitosis como en la talasemia. Cuando el aumento de la concentración de eritrocitos va acompañado de una disminución de la hemoglobina. El descenso en la concentración de eritrocitos en la sangre se acompaña siempre de una disminución en la concentración de hemoglobina (anemia) y puede deberse a diferentes causas como las hemorragias.

mientras que el aumento lo es de poliglobulia. dentro del contexto del hemograma automatizado. 13 . Debe excluirse la columna de leucocitos y plaquetas.1 Macrométodo (macrohematocrito) Utiliza 0.6 ml de sangre entera anticoagulada con EDTA. Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados. un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. Así. Por ej. un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración. el Hto. este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisión. En la actualidad. El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos.000-3. aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre.000 r. Por ello. entre sus factores de error está el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura.m.Hematocrito DEFINICION El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre.. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión. Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina. Aunque también puede emplearse un tubo de Wintrobe (macrométodo). es una técnica sencilla. que corresponde a una fracción de la longitud original de la columna sanguínea (100 mm). tubo de Wintrobe con diámetro interno de 3mm . por lo que es siempre algo inferior (0. un descenso del Hto es indicativo de anemia. La lectura del resultado se realiza extrayendo los tubos de la centrífuga y valorando la altura en milímetros de la columna eritrocitaria. son un buen parámetro del estado de la serie eritroide.2-0.3 %). Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas. El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo).p. Ambos métodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la acción de una fuerza centrífuga. por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia. expresado como porcentaje. todos los autoanalizadores hematológicos suministran. Centrifugamos durante 30 minutos a 2. barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. puede ser normal o alto. A) METODOS MANUALES A.

A. produce una mezcla con los líquidos tisulares que provoca hemodilución. favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. al perderse mayor proporción de células que de plasma.x x : hematocrito en tanto por ciento A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0. Hto = n° de hematíes x VCM 14 . Heparinizados o no. se desechará la primera gota después de la punción.2 Micrométodo (microhematocrito) Es una técnica muy utilizada. Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 µl).5 cm. El llenado de los tubos se realiza por capilaridad. aplicando la siguiente regla de tres: A------. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7. de diámetro interno. que nos darán el resultado directamente. Tan pronto se detiene la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. En muestras de sangre venosa. El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota. La lectura no inmediata de los capilares. por necesitar muy poca cantidad de sangre. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito. METODO AUTOMATIZADO: CONTADORES HEMATOLOGICOS El método automático de determinación se basa en el cálculo matemático a partir del Volumen Corpuscular Medio (VCM) y el número de hematíes. muy sencilla y poderse realizar en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo. el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentración. Causas de error • • • • • Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor. Si se utiliza sangre capilar. provoca que el sedimento de hematíes vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal. dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). de longitud por 1mm. B.01.100 B------. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12. o con una regla milimetrada.000 rpm.

39 ± 0.1 0.05 0.VALORES DE REFERENCIA ( x ± 2 DE) El valor de Hto varía con la edad y el sexo.45 ± 0.05 0.42 ± 0. Edad y sexo Recién Nacidos Niños (hasta 10 años) Mujeres (18-50 años) Embarazadas Hombres (18-50 años) Hematocrito % 54 ± 10 38 ± 5 42 ± 5 39 ± 5 45 ± 5 Fracción 0.54 ± 0.38 ± 0.05 0.05 15 .

Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo). 4. Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina.4) Ferricianuro potásico [K3 Fe(CN) 6] Cianuro potásico [CNK] Fosfato monopotásico [KH2PO4] Detergente no iónico* Agua destilada hasta 200 mg 50 mg 140 mg 1 ml 1000 ml Detergentes no iónicos: Tritón X-100. El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la transformación de la hemoglobina en HiCN. preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) 2. Quolac Nic 218. Puede emplearse sangre capilar. 3. Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados periódicamente mediante la solución patrón de HiCN. Nonic 218. Los distintos compuestos de hemoglobina. Este reactivo debe tener un color amarillo pálido. excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa. de forma que aquella se completa en 3 min. Nonidet/40. debidamente calibradas. Todo patrón de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN. Pipetas automáticas: de 20 µl. Tubos: 12 x 100 mm. 6. 5.5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración). Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 ml. Reactivo de Cianmetahemoglobina: Composición (pH 7-7. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1. ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7.4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. 7. se transforman en HiCN según el siguiente proceso: Hemoglobina + Ferricianuro potásico → metahemoglobina Metahemoglobina + Cianuro potásico → cianmetahemoglobina MATERIAL 1.Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina FUNDAMENTO Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN). 16 .

Leer la A de la solución a 540 nm. Agitar el tubo mediante inversión ( 4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina. utilizando agua destilada como blanco. La curva de longitud de onda versus A desde λ=750 nm a λ=460 nm se observa en la Fig. El patrón primario posee un espectro de absorción característico con un pico de máxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexión a 504 nm.404.El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendría una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimétrica. La concentración de hemoglobina también puede calcularse aplicando la siguiente fórmula: 17 . Mediante la micropipeta añadir 20 µl de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. se efectuará el espectro de absorción de la solución de referencia internacional y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig. Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión del tubo 20 veces.8 mg de hierro hemoglobínico por litro a 540 nm). es una solución muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y características fisicoquímicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64. Conectar el espectrofotómetro.458) y el coeficiente de extinción (44. El cociente A540/A504 oscila generalmente entre 1.248 y 0. según el lote y el instrumento de lectura utilizados. METODO Por un lado. significa que dicha solución patrón posee la misma absorbancia que la de una solución de hemoglobina de 143 g/l. La concentración exacta de hemoglobina de cada lote se indica siempre en la ampolla. Patrón primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarización y el control de calidad. donde también se incluye la curva del reactivo. El valor de la A a 540 nm varía entre 0. si la dilución ha sido de 200 veces. 2. si la sangre total se ha diluido 250 veces. es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta.251. 5..8. El patrón primario de HiCN se suministra en ampollas cerradas al vacío que contienen 10 ml de una solución de HiCN correspondiente a una concentración de hemoglobina entre 550 y 850 mg/l. Al realizar esta operación.1). Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio. Por otro lado se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuación: 1. o de 114 g/l. Así. Este patrón.62. 8.0) de la hemoglobina ( por ej. 3.1 . la absorbancia de una solución que contenga 4 x 55. 7. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibración (ver más adelante).400 y 0. 6.60 y 1. 4. y a 504 nm entre 0. si en el frasco se indica una concentración de 572 mg/l.

5 1. 2). Para trazar este gráfico se preparan 5 soluciones de concentración de HiCN conocida y decreciente a partir del patrón de HiCN mediante diluciones sucesivas en reactivo de cianmetahemoglobina (véase tabla 1). Reactivo de Drabkin Volumen Dilución Hb Tubo (modificado) final (ml) (g/l) (g/l)* (ml) 1 3.5 3 1:2 72 3 1.0 3 1:3 48 4 0.5 3 1:6 24 5 0 3. Patrón de referencia de HiCN (ml) La concentración de hemoglobina correspondiente a cada tubo se determina a partir del grado de dilución y del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN.621.Hemoglobina (g/l)= A540 (muestra) A540 (patrón) x HiCN patrón (mg/l x F 1000 Siendo A= absorbancia F= factor de dilución de la sangre total en el reactivo de Van Kampen y Zylstra (251).0 0 3 0 145 2 1. La concentración de hemoglobina en milimoles por litro de sangre (mmol/l) puede calcularse multiplicando el valor en g/l por 0. la relación entre los valores de A obtenidos y los correspondientes de concentración de hemoglobina se representan en un gráfico con los valores de A en las coordenadas y la concentración de hemoglobina en las abscisas (Fig. 18 . ELABORACION DE LA CURVA DE CALIBRACION La gráfica de calibración tiene como finalidad calibrar el espectrofotómetro para una lectura determinada calculando la corrección existente entre los valores de A leídos en el aparato y los correspondientes valores de concentración de hemoglobina. Luego.5 2. Finalmente. Una vez preparadas las soluciones patrón.0 3 0 0 * El valor de esta concentración dependerá del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN que se emplee en el Trabajo Práctico. se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene sólo reactivo (tubo 5) y se ajusta la A (100% de transmitancia). partiendo de la solución de HiCN más diluida (tubo 5) se leen las restantes soluciones patrón.0 2.

Empleo de instrumentos no calibrados 2. 2. Empleo de anticoagulantes no recomendados 2. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (>50 x 109/l). la mayoría de las veces los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la Hb en HiCN Errores de la determinación: 1.Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. en vez de HiCN. Coagulación parcial de la sangre Errores de la dilución: Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o húmedas 1. 19 . lo que produce transformación de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y una oxidación parcial de la Hb. Errores en la obtención del espécimen de sangre: Errores de extracción 1. No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo 2. No obstante. Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formación exclusiva de metahemoglobina. con lo que los valores de concentración de Hb obtenidos son inferiores a los reales. Congelación del reactivo. Cubetas sucias o deterioradas 3. Soluciones turbias de HiCN Errores en la conservación del reactivo: 1. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN: Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido 1.

Espectro de absorción de la solución de HiCN y del reactivo usado 20 .

Curva de calibración elaborada a partir de una solución de cianmetahemoglobina de concentración conocida. 21 .

La etapa más importante es la primera o de aglutinación. c. Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico. cuanto más pequeños sean los agregados. el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR. Viscosidad del plasma. como se mencionó más arriba. Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad η a una velocidad v: R = 6ηvr La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas". MECANISMO El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado. Tamaño de los G Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma. VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea. pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células. más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa. Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. b. 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante. linfomas y mieloma múltiple). este fenómeno depende de los siguientes factores: a. polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia. d. 22 . Desde el punto de vista físico. y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis. ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. Así. Temperatura. por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin.Velocidad de sedimentación globular FUNDAMENTO El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo. Dado que.

Así. y un bajo hematocrito causa un aumento no específico de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre los agregados en sedimentación. De acuerdo con este mecanismo. lo que explica que estas células se mantengan separadas. las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable. METODOLOGIA Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el método de Wintrobe. continua siendo un método poco reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar. puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. por el otro lado. Estos sistemas. como es la necesidad de prediluir la sangre. El método de Wintrobe. se diferencian de éste por su carácter cerrado (recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisión del llenado de las pipetas. el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina. mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta. MÉTODO DE WESTERGREN Es el método de referencia para medir la VSG. lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH). Ambos métodos poseen limitaciones. El método de Westergren es menos sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y así puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening. Tradicionalmente. Sin embargo. aunque reproducen exactamente el método de Westergren. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones de albúmina. Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación entre el plasma y los GR en la muestra. globulinas y fibrinógeno. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias. La albúmina retarda la VSG. 23 . pero no resultaron confiables. Durante los últimos años.La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas.

A. sin exposición a la luz del sol directa. Si utiliza citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7.3 Gradillas Las gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición vertical inmóvil.2 Tubo de sedimentación Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1. los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. MATERIALES. La misma debe estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en ella. El nivel de la sangre se ajusta a cero. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.08 g/l. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1°. o dentro de las 6 hs. 24 . Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las especificaciones.A. C) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente. A. libre de vibraciones y corrientes de aire. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza. manteniéndolo exactamente 60 min.2H2O) prepare una solución acuosa de 32. y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad.15 mm. se mezcla por inversión repetidas veces.1 Anticoagulante Citrato trisódico 109 mM en solución acuosa. TÉCNICA B) La sangre se obtiene por punción venosa. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países. evitando contaminación con materiales utilizados para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solución de citrato de sodio. B. D) El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25°C). El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.5 ml de anticoagulante. A.05 mm) todo a lo largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm.5 mm y de un diámetro de 2. Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. por ejemplo 2 ml de sangre en 0. si es mantenida a 4°C. Algunos plásticos resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de taponamiento.55 + 0.

y las medicaciones (corticosteroides. El valor de esta distancia. INTERPRETACION DE RESULTADOS Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia).) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos. C. expresado en mm. Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. y también en el embarazo normal y el puerperio. etc. por lo que no se recomienda su empleo. muy utilizadas anteriormente.E) Una vez transcurrido el tiempo. corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora). han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica. VALORES DE REFERENCIA EDAD (años) Niños mayores y jóvenes Hombres adultos Mujeres adultas 0-15 17-50 51-60 61-70 17-50 51-60 61-70 X + 2 DE 5 + 10 4+3 6+3 6+4 6+3 9+5 10 + 5 Límite superior de la normalidad 15 10 12 14 12 19 20 Factores técnicos capaces de modificar la VSG Causas de aumento • Desviación de verticalidad de la pipeta • Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta • Elevación de la temperatura ambiente • Dilución de la sangre • Causas de disminución: • Reducción del diámetro de la pipeta • Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido) • Cambio de anticoagulante D. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda. el ciclo menstrual. 25 . contraconceptivos orales. Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs. Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas.

etc. un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgánica. es inusual obtener falsos negativos. anemia falciforme. defectos cardíacos congestivos. y ocasionalmente sin causa aparente. anormalidades de GR (hemoglobinopatías. 26 . esferocitosis hereditaria.La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia.). Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG. por ende. hipofibrinogenemia.

Transcurrido este tiempo. La suspensión sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. Si se mantiene a 4º C. mientras que cuando el número es normal o disminuido se denomina arregenerativa. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida.. los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3 días y terminan su maduración en 24 horas. El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. Cuando una anemia se acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa.Recuento de reticulocitos Los reticulocitos. Tinción vital y microscopio óptico. eritrocitos inmaduros. aproximadamente. Mediante una pipeta Pasteur se añaden a un tubo de hemólisis tres gotas de solución colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. se toma una pequeña gota de la suspensión y se extiende sobre un portaobjetos. dentro de las 24 primeras horas de la extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula. El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA)y a ser posible. El método manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variación >20%). MÉTODO DE LA TINCIÓN VITAL (MÉTODO DE REFERENCIA) Este método usa como colorante el azul de metileno nuevo: 1 g cada 100 ml de solución citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de ClNa 9 g/L). Su tamaño es el de los demás hematíes y se caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando un retículo granulofilamentoso observable al ser teñido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción. 2. Citometría de flujo. pero sobretodo a los errores de índole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito. existen en la sangre en una proporción de cinco a diez por mil hematíes. una vez ya en la sangre periférica. siendo 100-125 el número óptimo de hematíes por campo de los cuales distinguimos cuales son 27 . En caso de valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solución colorante. una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersión (x1000). Es necesario realizar el recuento sobre un mínimo de 1000 eritrocitos. En condiciones normales. El recuento se efectúa contando en donde los eritrocitos estén distribuidos homogéneamente. lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a terapéuticas agresivas.

3 9 10 ± 1 día 1 2 5 5 ± 2 día 7. De esta forma puede calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente: IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente Período de maduración en días x Hto normal Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia regenerativa). que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la médula a la sangre periférica.25 0. lo que supone un aumento del período de maduración periférica. Este fenómeno se caracteriza por la aparición en el examen morfológico de la extensión de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y tonalidad azulada (policromasia) Existe una relación inversa. La mezcla sangre/colorante se incubará durante 15 minutos a 37º C. En caso de anemia intensa. Este valor será valido si se trata de una concentración normal de eritrocitos en sangre total. cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la anemia.40 0. Luego de este tiempo se realizará el extendido y se realiza el recuento como se indicó antes. Por ello.8 4 7 8. siendo el cien porciento el número total de hematíes contado.35 0.reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje. y un acortamiento de su período de maduración intramedular. el número de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneración eritroblástica. el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la siguiente fórmula: Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto del paciente Hto normal (El hematocrito normal es el que le corresponde según edad y sexo). RECUENTO AUTOMATIZADO 28 0. Ello obedece a que la anemia se acompaña siempre de un estímulo eritropoyético compensador.5 10 3 días 10 .30 0. aproximadamente lineal.15 150 133 117 110 83 66 50 1 2 5 10 15 20 30 1 1. entre el hematocrito y el período de maduración periférica de los reticulocitos. mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética (anemia arregenerativa) Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia Hematocrito Niveles de Hemoglobina (g/L) Recuento de reticulocitos (%) Recuento de reticulocitos corregido (%) Tiempo de maduración estimado Índice de reticulocitos OTRA TECNICA Utiliza como colorante Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el método de referencia.45 0.20 0.

0 (4-19 años) 0. mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubación previa y el análisis se realiza directamente. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitución del criterio morfológico inherente al método visual por el análisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante citometría de flujo y luz láser. VALORES DE REFERENCIA Valor relativo (%) 3.2.2-2.Estos equipos realizan un recuento muy fiable de reticulocitos a partir de sangre total. Para la tinción del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o Auramina.5 0. En los equipos semiautomáticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo.2-6.8 Valor absoluto (x109 /L) 110-330) 25-89 25-86 32-97 Recién nacido (sangre de cordón) Niños y adultos jóvenes de 4 a 19 años Adultos (20-50 años) Mujeres Hombres Variaciones patológicas Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Período neonatal Anemias hemolíticas Anemias posthemorrágicas Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula ósea) Mielofibrosis idiopática 29 .2 0.5-2.2.

CONDICIONES DE REACCION 30 . PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Adsorbente: carbonato de magnesio granulado. se determina por su actividad fisiológica de captar Fe (III) a pH mayor que 7.Tubos de Kahn.Agua destilada. estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte. REACTIVOS PROVISTOS Solución saturante: solución estabilizada de Fe (III). MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . MUESTRA Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Solución saturante: lista para usar. . REACTIVOS NO PROVISTOS . El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitación con carbonato de magnesio. . nefropáticas. Su función es captar el hierro de los sitios de absorción (mucosa intestinal) o depósito (sistema retículo endotelial) y llevarlo a los órganos hematopoyéticos donde es utilizado. el hierro circula como Fe (III) unido a una proteína transportadora específica: la transferrina o siderofilina. neoplásicas. etc. Adsorbente: listo para usar.Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. Adsorbente: el frasco debe volver a taparse inmediatamente después de retirar las porciones necesarias para el momento. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab. FUNDAMENTOS DEL METODO La transferrina o proteína transportadora específica del hierro. en insuficiencias hepáticas y fisiológicamente en los últimos meses del embarazo. La actividad fisiológica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijación de hierro (TIBC). y ferropénicas en general. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimétricamente según la técnica de Fer-color o Fer-color AA. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Cuantificación de hierro sérico Fer-color Transferrina Método colorimétrico para la determinación de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) del suero SIGNIFICACION CLINICA En el organismo humano.) en las hepatopatías crónicas. La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrágicas. Disminuye en cambio en la hemocromatosis. y en las grandes pérdidas proteicas del síndrome nefrótico. La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que está saturada. en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas. En el individuo normal sólo la tercera parte de la transferían se satura con hierro.2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso.

. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.000 r. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes datos: Nivel 280 ug/dl 560 ug/dl D.Rojkín. Saturación de la Transferrina: 20-55%..Young. J.I. G. Baginski. Clin. hasta obtener sobrenadante límpido o con la opalescencia propia del suero. K. B.C.2 ug/dl +28. 1990."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". 4/4:621 (1971).S. +23. . . La concentración de Fe (III) de la Solución saturante es 10 veces mayor que la del Standard.Dixon. Centrifugar 10-15 minutos a 3.Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. E. D. M.V.Clin. Drappo. PROCEDIMIENTO a) Saturación de la transferrina: en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solución saturante. y Albarracín.p. AACC Press.. BIBLIOGRAFIA .000-4. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.. Biochem. A. Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC. Transferrina y Porcentaje de Saturación de la Transferrina. Además.S. . La agitación deberá ser vigorosa y en sentido longitudinal.. Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente.Zak.III Congreso Argentino de Bioquímica . Epstein. En ese caso se informan tres valores: Hierro Sérico.29% 5. comenzar con la Saturación de la Transferrina 30 minutos antes.H.. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos. Por lo tanto. La agitación insuficiente producirá valores falsamente aumentados de Transferrina. 31 . b) Colorimetría: seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA. L. . Path. 3rd ed. Habitualmente se realiza la determinación de hierro sérico juntamente con la de transferrina. E. que se calcula de la siguiente manera: Hierro sérico (ug/dl) Transferían (ug/dl) Saturación % = x 100 Si se desea efectuar simultáneamente la determinación de hierro sérico para el cálculo del Porcentaje de Saturación.S.Ann. 8. por la dilución del suero.9 ug/dl C. . Olguín de Mariani. .M.Buenos Aires (1975). 1492002). M.16% PRESENTACION Reactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) (Cód. . como la medida exacta de esta solución no es crítica. 56/4:543 (1971).m. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas y efectuar los cálculos de la misma manera que en la determinación de hierro sérico. Clin. Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados.S. puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml. Toxicol. 10/5:127 (1973). . Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente. Wiener lab. VALORES DE REFERENCIA La literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturación de la Transferrina en personas normales: Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl. multiplicando por dos el resultado final. y Wiener.Am.

A.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.Argentina http://www. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S.2000 Rosario . Nº: 1287/77 .I.com.220/00 32 . Riobamba 2944 2000 .C.Rosario .wiener-lab.: Viviana E. Disp.ar Dir. Téc.

PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". sexo. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo PBTS: listo para usar. Standard: solución de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl. el ácido mercaptoacético. Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia. en buffer succinato de pH 3. Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas. FUNDAMENTOS DEL METODO El hierro sérico se libera de su unión con su proteína transportadora específica. vertiéndolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversión. y carcinomas de estómago y colon. 33 . que se mide a 560 nm. material de vidrio. bazo.25 mol/l para pH 3. piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta. particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto. indican contaminaciones ocasionales (agua. edad. MUESTRA Suero a) Recolección: debe usarse únicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reacción. hábitos alimenticios y actividad eritropoyética). úlceras gástricas o duodenales. La otra causa más común de anemia ferropénica. Reductor: ampolla autorrompible conteniendo ácido mercaptoacético al 70 %. Ocurre con frecuencia en mujeres. b) Aditivos: no se requieren. Buffer/Reductor: en refrigerador (2-10oC) es estable durante un año a partir de la fecha de su preparación.7 y en presencia de un reductor. debida a hernia de hiato. médula ósea y parénquima hepático. Standard: listo para usar. La anemia por pérdida de hierro representa uno de los trastornos orgánicos más frecuentemente encontrados en la clínica médica. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de mañana) ya que las fluctuaciones fisiológicas son significativas durante el día. A veces se asocian a terapia transfusional. Anotar en el rótulo la fecha de preparación. pigmento más importante de las células musculares. y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las células del sistema reticuloendotelial de hígado. a veces imperceptible.Fer-color Método colorimétrico para la determinación de hierro sérico sin desproteinización SIGNIFICACIÓN CLINICA El hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Variaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo PBTS: solución estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l. es la pérdida de sangre a través del tracto gastrointestinal. Posteriormente reacciona con el reactivo de color.). contiene hierro en su grupo hemo. Antes de usar llevar a 18-30oC. Buffer succinato: solución de succinato 0. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato. la transferrina. etc. Un aumento en el valor de los Blancos indicará una contaminación con hierro. formando parte de la hemoglobina. La mioglobina. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada.7. y otras veces a desórdenes caracterizados por una síntesis defectuosa de hemoglobina o fenómenos hemolíticos.

debiendo ser además.02 uOhms). y Wiener. . es indicio de contaminación grosera de los reactivos. se recuperó entre 90 y 103%. para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p.Tubos de fotocolorímetro. despreciable la contribución del agua en dicho Blanco. M. . Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinación de hierro. Efectuar este control periódicamente. E.Longitud de onda: 560 nm en espectrofotómetro o 540-560 nm en fotocolorímetro con filtro verde.. S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Agua bidestilada Standard Suero 500 ul S 500 ul D 500 ul 34 . d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando la misma muestra en 10 días diferentes.. hiperlipemia. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cód. Y Albarracín.Temperatura de reacción: temperatura ambiente . . LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO . . G.150 D.2%.Volumen total de reacción: 2.Dixon. Epstein. Clin. E.M. 3rd ed. .Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla o por agitación suave.Tiempo de reacción: 10 minutos .S.5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2. los cuales deberán desecharse.Am.. Baginski. Path. se obtuvo un coeficiente de variación del 4. Drappo. b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alícuotas de un mismo suero. BIBLIOGRAFIA .. AACC Press.O.Volumen de muestra: 500 ul . .Young. Olguín de Mariani. J. . Si bien hemólisis ligeras no interfieren con este método.5 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco de Reactivos).. D. 56/4:543 (1971). no debe ser superior a 0. No invertir para evitar contaminaciones. el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemólisis. Clin. Biochem.Espectrofotómetro o fotocolorímetro. 10/5:127 (1973). . se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0.Ann. Para controlar esto último.Zak. Secar el material preferentemente a no más de 80°C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plásticos.Rojkín.S. si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0.c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl. . reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0.Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. K. B. M. . . L.III Congreso Argentino de Bioquímica Buenos Aires (1975).Clin. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . Por otra parte.5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer. ."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". CONDICIONES DE REACCION . C. El Blanco de Reactivos.a. A. 10-15%. iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl. Toxicol. L. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.C.H. . ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones. para un nivel de Fe sérico de 129 ug/dl.O. 1492001). c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 500 ug/dl.. A.S.Valores de Blanco aceptables: la determinación de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos.Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro.I. 4/4:621 (1971). Caso contrario.150 D. 1990.

manteniendo el frasco gotero en posición vertical.C.com. Téc. Agregar.198/00 35 .B = S corregida D . CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas de S y D. 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo.I.(B + BS) = D corregida Fe (ug/dl) = D corregida x f Donde: f = METODO DE CONTROL DE CALIDAD Standatrol S-E 2 niveles. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. Nº: 1287/77 .wiener-lab.S.Búfer/reductor 2 ml 2 ml 2m Mezclar. con edades oscilando entre los 18 y 51 años.ar Dir. 100 ug/dl S corregida Wiener lab.: Viviana E.A. Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de Suero BS) en espectrofotómetro a 560 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua.Argentina http://www. restándoles los Blancos correspondientes: S . llevando el aparato a cero con agua. Disp.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.3 ug/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. VALORES DE REFERENCIA En un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Los tubos deben ser leídos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento.6 ug/dl Mujeres: 103. 2000 Rosario .Rosario . Riobamba 2944 2000 . se halló un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios: Varones: 114.

4. MATERIAL 1. luego del tratamiento con drogas. como la esferocitosis hereditaria. MEDICIÓN DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA La fragilidad osmótica mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio. La fragilidad osmótica se ve aumentada en anemias hemolíticas.Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls La coloración de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de célula pudiendo ser aplicada a las células presentes en un frotis o extensión de sangre o médula ósea. 36 . 2. Solución de contraste eosina (1 g/L de H2O) o safranina(1 g/L de H2O. 3. Lavar los frotis colocándolos en la solución de contraste durante 30 minutos. que se considera el resultado de la precipitación de varias moléculas desnaturalizadas de apoferritina. anemias por deficiencia de hierro y talasemias. 2. La tinción de Perls permite valorar también el hierro no hemínico presente en el citoplasma de los eritroblastos y determinar el número de los que presenten uno o más gránulos de hemosiderina (sideroblastos). 3.2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente(24ºC). METODO 1. Debe prepararse extemporáneamente mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de ferricianuro potásico al 2% en agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0. que se observan normalmente a nivel de las zonas de abundantes macrófagos. Refleja la habilidad de la eritrocitos para captar agua sin lisar. Microscopio óptico. INTERPRETACION Y EVALUACIÓN DE RESULTADOS La hemosiderina teñida mediante la tinción de Perls aparece bajo la forma de gránulos de intenso color azul. Frotis de la médula ósea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. Este test ha sido muy usado experimentalmente como medida de la viabilidad del glóbulo rojo y clínicamente con fines diagnósticos. fijar los frotis en vapores de formol durante 30 minutos (algodón empapado de formol en el fondo de un vaso de Coplin). La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina. Introducir los frotis fijados en la solución clorhídrica durante 1 hora a temperatura ambiente. Solución clorhídrica de ferricianuro potásico. Se han establecido scores para la semicuantificación de la reacción. constituye el hierro no hemínico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las células del sistema mononuclear fagocítico. como la indometacina. mientras que se ve disminuida en la anemia con células S (sickle cells). Normalmente.

5. el mismo es quitado de circulación. Las variaciones en la fragilidad osmótica son definidas como cambios en las curvas de hemólisis y son establecidos por determinación de la [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. 7. a 2500 rpm por 15 minutos y se realizan lecturas de los sobrenadantes a 540 nm. luego de mezclar por inversión.0. La concentración de ClNa que produce el 50 % de hemólisis puede ser determinada calculando el % de hemólisis según la siguiente ecuación: % de hemólisis = (DOs -DObl) x 100/ DOo donde: DOs= densidad óptica del sobrenadante DObl= densidad óptica del blanco DOo= densidad óptica de la solución de 1 g/L de ClNa. 4. 2. [ClNa] y de las mismas se extrae el valor de [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. nos encontraremos ante la presencia de una anemia hemolítica debida. Se centrifugan.En este test se mide la capacidad de deformación o elasticidad de la membrana del glóbulo rojo. diferenciadas de acuerdo a la resistencia de su membrana. posiblemente. Si se produce un desbalance en el equilibrio entre la producción de eritrocitos por la médula ósea y su eliminación esplénica. 6. Para preparar las soluciones de ClNa se parte de una solución 10 g/L y se realizan diluciones de la misma. mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio.5. Las diluciones se realizan por duplicado. La fragilidad osmótica. a alguna alteración de las proteínas del citoesqueleto de la membrana eritrocitaria. la cual es imprescindible para que el eritrocito pueda circular libremente.0. 9. 3. Para realizar la medición. La forma de la curva que muestra el grado de hemólisis en función de la [ClNa] sugiere que ésta puede ser el resultado de la distribución de las poblaciones de GR.0. Luego se grafican las curvas de % de hemólisis vs. se deben mezclar 50 µl de sangre con 5 ml de soluciones con diferentes concentraciones de ClNa : 10. fundamentalmente a través de los capilares esplénicos.0. la membrana del glóbulo rojo pierde su capacidad de deformación .0 g/L.0. 4. indicador del estado de la membrana eritrocitaria. 8.0. 37 . Si por alguna alteración del citoesqueleto.0 g/L es usada como blanco.0. La solución de 10. El grado de hemólisis es determinado midiendo la hemoglobina liberada a partir de las células.0 y 1.0. Este test es por lo tanto.

.. 38 ........ pH 7. Fechar.... Tapar y agitar suavemente por inversión hasta disolución completa.............2 conteniendo piruvato y cloruro de sodio... Por otra parte.................... alcanza un pico entre las 48 .............. REACTIVOS PROVISTOS Buffer: solución de buffer Tris................ Sustrato: agregar el volumen de Buffer indicado en el rótulo a un vial de Sustrato.....2 mmol/l ClNa ................ pH 7..... también se registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis hepática (producida por agentes tóxicos o por infecciones agudas como la hepatitis viral) e incluso acompañando a necrosis tubular renal................ MUESTRA Suero o plasma a) Recolección: se debe obtener suero de la manera usual y separar del coágulo dentro de las dos horas de su obtención. En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM).. la actividad de LDH total (junto con las de CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnóstico................. La LDH es estable hasta 24 horas en refrigerador..... 200 mmol/l INSTRUCCIONES PARA SU USO Buffer: listo para usar... Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.800 D.. Sustrato reconstituido: estable 21 días en refrigerador (2-10oC) o 3 días a temperatura ambiente a partir del momento de su reconstitución......... pielonefritis.. Concentraciones finales (según SFBC) Tris ...........72 horas y permanece elevada hasta el séptimo o décimo día... d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca... No congelar.................... o superiores a 1..... b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma...LDH-P AA Método UV optimizado (SFBC) para la determinación de lactato deshidrogenasa (LDH) en suero o plasma SIGNIFICACION CLINICA La determinación de la actividad de lactato deshidrogenada (LDH) en suero......6 mmol/l NADH ..O.... 0.800 D.... INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada.. Sustrato: viales conteniendo NADH....... PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja... La misma comienza a aumentar de 12 a 24 horas después de producido el infarto............2 Piruvato . (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo........ También puede usarse plasma... FUNDAMENTOS DEL METODO Basado en el siguiente esquema de reacción: LDH Piiruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+ Las concentraciones del ensayo están optimizadas de acuerdo a la Sociedad Francesa de Biología Clínica (SFBC)....... c) Sustancias interferentes conocidas: las muestras con hemólisis visible o intensa pueden producir valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usadas.... 80 mM............. debe usarse heparina como anticoagulante. 1. tiene una gran variedad de aplicaciones clínicas..... lecturas de absorbancia del Sustrato reconstituido inferiores a 0...O.....

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Leer la absorbancia inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1.Cronómetro. . . . Esperar 30 segundos. .941 25ºC 4. II.00 (*) Calculados Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra. CALCULO DE LOS RESULTADOS LDH (U/l) = ∆A/min x factor En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción seleccionada (30-37oC o 25oC) y a la técnica empleada (micro o macrotécnica) como se indica en la siguiente tabla de factores: Longitud de onda 340 nm 334 nm 366 nm VALORES DE REFERENCIA Temperatura Valores (U/I) 25ºC 120-240 30ºC* 160-320 37ºC* 230-460 Temperatura I (30-37ºC) 9. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (∆A/min). 2 y 3 minutos de la primera lectura.MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . indica una muestra con muy alta actividad de LDH (que consume NADH aún antes de esta lectura).MACROTECNICA Emplear 50 ul de Muestra.921 5. . B) 30-37oC I. 30 ó 37oC.Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero.Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.Espectrofotómetro. estando el sustrato en condiciones. PROCEDIMIENTO A) 25oC En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo. .016 9.118 II (30-37ºC) 8. luego agregar: Muestra 100 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro.MICROTECNICA Emplear 20 ul de muestra y 1.Temperatura de reacción: 25.800 D. CONDICIONES DE REACCION (Disminución de absorbancia) .871 17. siguiendo el procedimiento indicado en A).O. En este caso. Utilizar este promedio para los cálculos. . repetir la determinación con muestra diluida 1/10 con solución fisiológica y multiplicar el resultado por la dilución efectuada.253 15.Los volúmenes de muestra y reactivo se pueden reducir proporcionalmente sin que varíen los factores de cálculo. restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. colocar: Sustrato reconstituido 3 ml Preincubar unos minutos.683 9. .0 ml de Sustrato reconstituido siguiendo el procedimiento indicado en A).La humectación es causa de deterioro del Sustrato. se obtienen los siguientes valores: 39 . la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0.095 8.Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366) .Material volumétrico adecuado. Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada temperatura.Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir.Tiempo de reacción: 3 minutos y 30 segundos.

Disp... 1990..... Valor normal inferior ..095 Coef.... reproducibilidad ± 2 nm.......17% b) Límite de detección: depende del espectrofotómetro empleado y de la longitud de onda...... Clin.....ar Dir....... .........3 x 20 ml (Cód.................Rosario ..... 2000 Rosario ....... luz espuria ≤ 0............... 1...... para un ∆A/min de 0........ corrigiendo consecuentemente los resultados..... 1989.. 6..............S....100 D........ extinción molar (∑340) ................O.......... 40:160........ disminuye Temperatura de reacción .Young..... . 3 segundos Tiempo de retardo .........3 [l x mmol-1 x cm-1] Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso... el mínimo cambio de actividad detectable será de 5 U/l (a 340 nm y a 25oC)......... De acuerdo con la sensibilidad requerida...... Nº: 3330/97 Cert......... AACC Press.Quim........... c) Rango dinámico: el rango útil de lectura se extiende hasta 0...........99 U/l C.. 1521303). Biol................com..."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".... PRESENTACION ...C........ (340-334 nm y 25oC) o 0.Ann....Societé Française de Biologie Clinique (SFBC) ............. 8....... BIBLIOGRAFIA .... > 0......Argentina http://www... Wiener lab.... 2...wiener-lab...17% 1.700 D. 460 U/l Linealidad . 230 U/l Valor normal superior .. Riobamba 2944 2000 ......................A. 1:50 Tiempo de equilibrio ....... Límite de absorbancia ..... repetir la determinación con muestra diluida 1/5 ó 1/10 con solución fisiológica..............................Sociedad Española de Química Clínica .O.Comité Científico.................. Si la ∆A/min es superior a 0............... cinética Dirección de la reacción .... 57-61.000 D...001. +5.........200 D................. Comisión de Enzimas ............V..... Nº: 2114/97 40 .............5% y semiancho de banda ≤ 8 nm............................ 380 nm Tipo de reacción ........Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S... 40 segundos Tiempo de lectura .........O. 3rd ed.. .......... Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.... Clin. 37oC Relación muestra/reactivo .200 D............................ 60 segundos Absorbancia de blanco ........Nivel 438 U/l 683 U/l D.....: Viviana E.............14 U/l +7... con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor...........O..........S....................S... D..... 1982...... 340 nm Longitud de onda secundaria (bicromática) ..... ∆A/min (a 340 nm y 25oC)..I.... en espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366).............. 1000 U/l Factor (paso de luz 1 cm) .....O...... (366 nm y 25oC). Téc. PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Longitud de onda primaria ...........

el suero debe conservarse hasta 48 horas en el refrigerador (2-10oC) y la 41 . Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina sérica con el consecuente riesgo de difusión del pigmento al sistema nervioso central. c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis moderada o intensa inhiben la reacción directa. Reactivo Sulfanílico: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0. INSTRUCCIONES PARA SU USO Desarrollador: listo para usar. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.Agua destilada. por lo que la determinación de la bilirrubina en estos niños recién nacidos resulta sumamente importante. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". FUNDAMENTOS DEL METODO La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. debe usarse heparina para su obtención. para efectuar la calibración periódica del equipo. debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción. Nitrito de Sodio: solución de nitrito de sodio 0. es captada por el hígado para su conjugación y excreción en la bilis. obteniéndose valores de bilirrubina total falsamente aumentados. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente (< 25oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.13 mol/l. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. De forma tal que. Proteger de la luz natural o artificial. REACTIVOS PROVISTOS Desarrollador: solución acuosa de benzoato de cafeína 0. tamponada y estabilizada. También es posible realizar la determinación en líquido amniótico. MUESTRA Suero.17 mol/l. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento. Reactivo Sulfanílico: listo para usar. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias. para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra. mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo Sulfanílico. pueden ser indicio de deterioro de los mismos. REACTIVOS NO PROVISTOS . . Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo. la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reacción. La eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido es una patología provocada por incompatibilidad maternofetal en la que se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. Diazorreactivo: en refrigerador (2-10oC) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3 meses a partir de la fecha de su preparación. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma. Rotular y fechar.07 mol/l. plasma o líquido amniótico a) Recolección: obtener suero o plasma de la manera usual.Bilirrubina Standard provisto separadamente por Wiener lab. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La presencia de sedimento y/o cambio de coloración de los reactivos.Bilirrubina Método colorimétrico para la determinación de bilirrubina directa y total en suero y otros líquidos biológicos SIGNIFICACION CLINICA La bilirrubina. envolviendo el tubo con papel negro. compuesto de degradación de la hemoglobina.

. II.TECNICA PARA LIQUIDO AMNIOTICO Se determina bilirrubina total. leer en espectrofotómetro a 530 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520-550 nm). Si se lee después.BRB directa El factor colorimétrico (f) debe calcularse con el Standard de Bilirrubina de Wiener lab. . MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .37.5 ml 0.Tubos de fotocolorímetro. Multiplicar los resultados obtenidos por 3.TECNICA PARA SUERO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco).sangre entera no más de 24 horas en refrigerador o 12 horas a temperatura ambiente.5 ml 0. En dos tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco) y T (Total) colocar: B Muestra (líquido amniótico) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 1 ml 1. de acuerdo a la severidad de la ictericia.9 ml PROCEDIMIENTO I. Si se lee antes.Volumen final de reacción: 2. excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos.2 ml Proceder de la misma manera que en la técnica I. La acción de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra. Sueros ictéricos: debe emplearse la técnica descripta pero con menores cantidades de muestra. Dividir el resultado final por 5.B) x f Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total .Volumen de muestra: 200 ul .5 ml 200 ul T 200 ml 2. METODO DE CONTROL DE CALIDAD 42 .Tiempo de reacción: 5 minutos . Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. De tal forma.Temperatura de reacción: temperatura ambiente .Frasco de vidrio color caramelo. .Espectrofotómetro o fotocolorímetro. Es por tal motivo que debe protegerse cuidadosamente. CONDICIONES DE REACCION . El líquido amniótico es conveniente mantenerlo congelado hasta el momento de efectuar el ensayo.Longitud de onda: 530 nm en espectrofotómetro o 520-550 nm en fotocolorímetro con filtro verde. llevando el aparato a cero con agua destilada.B) x f Bilirrubina directa (mg/l) = (D . . habrá sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre. habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. D (Directa) y T (Total) colocar: B Muestra (suero) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 200 ml 2.38 respectivamente.2 ml T 1 ml 1.79 y 9.5 ml 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión.Reloj o timer.5 ml 200 ul D 200 ml 2.Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados. . CALCULO DE LOS RESULTADOS Bilirrubina total (mg/l) = (T . en caso de ictericia moderada se usarán 50 ul de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren sólo 20 ul. Luego de 5 minutos.

VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina en suero o plasma .Recién nacidos: Nacidos a término Sangre de cordón Hasta las 24 hs Hasta las 48 hs Del 3º al 5º día 25 mg/l 60 mg/l 75 mg/l 120 mg/l Prematuros 80 mg/l 120 mg/l 240 mg/l Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. 43 .7 mg/l el feto ya se encuentra afectado y tiene probablemente algún tipo de falla circulatoria. Bilirrubina en líquido amniótico Valores menores de 1 mg/l son considerados normales.5 mg/l la muerte fetal es inminente. Si la cantidad de bilirrubina sobrepasa los 9. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. dependiendo del grado de inmadurez hepática. Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4.Standatrol S-E 2 niveles.Adultos: Directa: hasta 2 mg/l Total: hasta 10 mg/l . los niveles de bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad. En los prematuros.7 mg/l sugieren la posibilidad de un feto afectado. Los niveles por encima de 2. mientras que entre 1 y 2.7 mg/l sólo se encuentran en presencia de eritroblastosis fetal.

O’Brien.Argentina http://www.S. Disp. .5347/98 44 . . .Clin.“Laboratory manual of pediatric microbiochemical techniques”. Nº: 252/75 . Wiener lab.A. Path. D.Botwell. Harper & Row Pub .S. Chem. . Riobamba 2944 2000 . R. . . 10/3:197 (1964).62 mg/l +0.wiener-lab. se obtuvo una recuperación entre 100 y 106%. H. Chem. 45/1:70 (1966).Ichida.4a Ed. PRESENTACION Equipo para 200 determinaciones (Cód. (1968).1 mg/l 26. Nobuoka.V.8 mg/l 127.LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Zaroda.: Viviana E.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. 8. 2000 Rosario . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. Clin. 3rd ed.1% b) Linealidad: la reacción es lineal hasta 150 mg/l. .com. M.ar Dir... PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día.S. D. c) Recuperación: agregando cantidades conocidas de bilirrubina a distintos sueros.Am.4% 4. Chim. tanto sobre los sueros como sobre las soluciones standard.Young.18 mg/l +0.I.45 mg/l C.Watson. 1120001). La acción de la luz. +0. T. J. 1990.Clin."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".5% 2. Acta 19/2:249 (1968).Rosario .Clin. . AACC Press. .7 mg/l D. BIBLIOGRAFIA . 7/6:603 (1961).C. J. se obtuvo lo siguiente: Bilirrubina directa Bilirrubina total Nivel 2.7% 1.47 mg/l +1. D. Téc.0 mg/l 9. et al . . es capaz de destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente.

. 4) Solución deshidratante: Metanol puro. La HbA2 tiene una velocidad menor que la A.6 g H2O destilada. Leer a 520 nm si se usó colorante Ponceau S. 1000 ml 2) Solución colorante: Ponceau S: 0......1 g Glicina ... FUNDAMENTO Las diferentes hemoglobinas se separan por migrar a diferentes velocidades....Separación electroforética de hemoglobina SOPORTE Acetato de celulosa gelatinizado. Sembrar las muestras con el hemolizado obtenido (ver más adelante). La tira debe estar bien tiesa y plana... Eliminar el exceso de líquido secando entre 2 papeles de filtro.... 14 ml Glicerol .. a continuación se las coloca en la solución 45 . La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba... durante 90 minutos. Conectar la fuente de poder. 5..........5 g en 100 ml de ácido tricloroacético 5% (dosis para 20 tiras) 3) Solución decolorante: Ácido acético 5%....... Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos 2...... 3..... 8.. Transparentización: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos... Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética. hasta ver el fondo blanco de la tira. Las tiras deben conservarse en posición vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%.........6).. queda en la HbA migrando juntas...... REACTIVOS 1) Solución buffer: Tris....... 4...... 6. Colorear durante 5 minutos. 1 ml 6) Solución disolvente: Ácido acético 80% Técnica: 1. 9............ 14.. Determinación cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solución disolvente y agitar.. La superficie de las tiras que es penetrable a las proteínas se reconoce porque es más opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro. Decolorar con 3-4 baños de solución decolorante.. 7. mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades).. 5) Solución de transparentización: Metanol . 85 ml Ácido acético .......... 22... Las tiras secas pierden las dimensiones y las características del gel. realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts........ Operar rápidamente para evitar evaporaciones... en medio alcalino (pH= 8.... Desconectar la corriente y retirar las tiras. En este medio la HbA migra hacia el ánodo.....

transparentadora durante 1 minuto como mínimo. eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos. El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatías: TIPO Normal Polo negativo Anhidrasas Carbónicas Recién nacido Anhidrasas Carbónicas Drepanocitosis homocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Drepanocitosis heterocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Hemoglobinopatía C homocigota Anhidrasas carbónicas Hemoglobinopatía C heterocigota Anhidrasas HbC Carbónicas β-talasemia heterocigota β-talasemia homocigota Doble Heterocigota S/C Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbC HbS Carbónicas HbA HbC HbA HbF HbA HbA2 Polo positivo HbA ACLARACIONES HbA 98% HbA2 2% HbF 90% HbA 10% HbA2 2% HbS 98% HbA < 50% HbS > 50% HbA2 2% HbC 98% HbA2 2% HbC > 50% HbA < 50% HbA2 entre 4-8% HbA HbA2 normal % de HbF y HbA. hasta la transparencia completa. variable según tipo de Th homocigota HbS 50% HbC 50% HbF HbA 46 . Se colocan luego en una placa de vidrio. Así se conserva para leer en densitometría.

Se determina la concentración de hemoglobina en el bemolizado obtenido. Obtener 5 ml de sangre por punción venosa. 2. se agrega un volumen de agua destilada igual al del paquete globular y 0. 3. agitar vigorosamente durante 1 minuto. Colocar en heladera (favorece la hemólisis). dejar 24 horas. usando cualquier anticoagulante. recoger con pipeta Pasteur el infranadante y filtrar. aunque se recomienda la heparina. desechando los sobrenadantes. Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm. Se lava tres veces con solución fisiológica.PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO Técnica 1. 47 . mediante el método de la cianmetahemoglobina. se lleva la concentración hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada. 4.8 ml de tolueno (rompe los glóbulos blancos). 5. 6.

Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke
FUNDAMENTO La hemoglobina fetal (HbF o α2γ 2) es ácido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos. REACTIVOS 1. Alcohol etílico al 80% 2. Buffer de ácido cítrico, pH 3,4 Solución A: Ácido cítrico............................ 4,2 g Agua destilada......................... 100 ml Solución B: Citrato de sodio........................ 5,9 g Agua destilada......................... 100 ml Solución Buffer pH 3,4: Solución A ................ 84 ml Solución B................. 16 ml 3. Eritrosina o eosina al 0,1 % en agua. DESARROLLO 1. Extendidos de sangre secos de no más de una hora de obtención, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etílico al 80% 2. Lavado rápido con agua y secado. 3. Inmersión en una cápsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37°C un mínimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rápidamente en agua común y secar en posición vertical. 4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solución de eritrosina o eosina. Lavar con agua y secar. RESULTADOS Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras. El análisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hematíes coloreados e incoloros.

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DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA FETAL: METODO DE SINGER FUNDAMENTO Debido a la muy semejante movilidad de la hemoglobina normal (HbA) y la hemoglobina fetal (HbF), cuando usamos los métodos electroforéticos de rutina para el estudio de hemoglobinas, es necesario valerse de la propiedad de la HbF (y la Hb Bart( de ser resistentes a la desnaturalización en medio alcalino. REACTIVOS 1. Solución de hemoglobina (véase obtención de bemolizado) 2. OHNa 1/12 N (recién preparado) 3. Reactivo precipitante SO4(NH4)2 .............................. 38 g ClH 1N ..................................... 2,5 ml H2O destilada ........................... 100 ml TÉCNICA Se preparan tres tubos: • • • • Tubo 1: Blanco: 3,2 ml de OHNa 1/12 N, agregar 6,8 ml de reactivo precipitante y filtrar. Tubo 2: Hb 100: 5 ml de agua destilada, agregar 0,02 ml de la solución de hemoglobina Tubo 3: Hb álcali-resistente: 3,2 ml de oHNa 1/12 N, agregar 0,2 ml de solución de hemoglobina y disparar en el momento un crónometro, a los 60 segundos agregar 6,8 ml de reactivo precipitente, invertir varias veces y filtrar. Leer en un espectrofotómetro a 540 nm, llevar a cero con el tubo blanco (Tubo 1).

CÁLCULO % de Hb álcali-resistente = VALOR NORMAL Menos de 2%. DO tubo 3 x 20 DO tubo 2

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Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs
A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION a) Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2 % en salina fresca (véase más abajo el apartado C. Preparación de la suspensión globular al 2%). b) Agregar una gota de la suspensión globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn. c) Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A1, B y O al 2% d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. e) Leer primero los controles y luego los problemas microscópicamente en visor y microscópicamente. f) Scores de lectura: +++ un gran aglutinato ++± varios aglutinatos grandes ++ muchos aglutinatos pequeños +± pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo + aglutinatos visibles pero solo microscópicamente aglutinatos conteniendo muy pocas células tr trazas - negativo B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO a) Tomar una muestra de suero libre de hematíes. b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los siguientes hematíes: 1) hematíes A conocidos 2) hematíes B conocidos 3) hematíes del propio individuo 4) hematíes O conocidos c) Incubar 1 hora a ta o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. d) Leer primero los controles y luego los problemas , microscópicamente en visor y microscópicamente. C. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2% Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn. a) Llenar el tubo con solución fisiológica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. b) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución fisiológica. c) Tomar una gota de culot (50 µl) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la suspensión al 2%.

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b) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra. La lectura se hará microscópicamente con un visor y microscópicamente. E. F. PRUEBA PARA DETECTAR Du 1 También se puede utilizar un monoclonal anti-A1 51 . c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm. e) Proceda de la misma manera con los tubos controles. E. Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados: Glóbulos rojos problema Anti A + + GR A + + Anti B + + GR B + + Anti AB + + + GR AB + + + Grupo ABO A B O AB Grupo ABO A B O AB Suero problema E. Al terminar de mezclar. Agregar una gota de anti-A absorbido1 y mezclar bien con una varilla de punta fina. Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto. Negativa: los hematíes (Rh-rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar aglutinación. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn.2 Reacciones • • Positiva: los hematíes D(Rho) positivos permanecerán aglutinados al querer desprender el culot globular. disparar el cronómetro.D.1 Controles a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D c) Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB. d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA a) b) c) d) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota.

Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du. Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda falsear los resultados. El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparación del suero). 6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm. Negativa: los hematíes Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspenderán y no aglutinarán.dado que. G.2 Controles utilizados Se utilizan tres controles para 1. Centrifugue y elimine el sobrenadante. La lectura se hará macro y microscópicamente. desprenda suavemente el culot globular y lea. F. 52 . 5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana. El tercer control. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS. Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en salina . Probar la bondad del suero 2. Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con el antígeno E(rh”) presente .Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti –D. 2 La detección de Du también se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du. se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados.1 Reacciones • • Positiva: los hematíes Du (Rhou) positivos permanecerán aglutinados luego de intentar desprender el culot globular. en tales hematíes el factor D(Rho) es mas reactivo. 1) 2) 3) 4) F. Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs. Comprobar su especificidad 3. es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti –D por suero de persona de grupo sanguíneo AB. Para seudoaglutinación Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C. Coloque dos gotas de suero anti –D(Rho) en un tubo de Kahn2.

Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm.2 4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de 1 hora a 37 °C. G.2 8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%. quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica. eliminando completamente el sobrenadante en el último lavado.G. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. 5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. 9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana.2 Prueba de Coombs directa 6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%. 2) Centrifugar. 53 . 7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.1 Prueba de Coombs indirecta 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes de grupo O Rh+ al 2%. 3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente.

la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . dextrosa.Placas . Si se emplean coágulos. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A. Anti-B o Anti A. con o sin anticoagulante. la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los demás ensayos pretransfusionales. AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A. adenina).B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón. citrato. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: . Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS) .Centrífuga . c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Por este motivo.Tubos de hemólisis . Anti-B o Anti-A. ACD (ácido cítrico. B. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente.Albúmina Bovina 30% de Wiener lab. Las muestras recogidas con ACD. heparina. REACTIVOS PROVISTOS Anti-A. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. También demostró que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA.Anti-A. B. dextrosa) o CPDA-1 (citrato. Anti-B o Anti-A. fosfato. dextrosa) CPD (citrato.B Monoclonal Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en A. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente. implica grupo O. Si se utilizó heparina o EDTA.Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. fosfato. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. La ausencia de aglutinación en todos los casos. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional. o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos altamente reactivos en su superficie.Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS) . PROCEDIMIENTO 54 .Solución fisiológica .B monoclonal.

. Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. sobre todo en los prematuros. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción positiva. Symp. S. No debe producirse aglutinación. Standard 57:49-59. American Association of Blood Banks 1985. PBS o LISS. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cód. Develop.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. Washington. . .En las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solución fisiológica. 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Observar aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones: . . Como control.B monoclonal colocada en una placa limpia. 1983. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. 1443154).Moore.K. resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la tipificación. III. . et al. Anti-B o Anti-A. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use”. colorantes.500 rpm. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica. Antisuero Anti-A + + +/Anti-B + + Anti-A.TECNICA EN TUBO (por sedimentación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis.Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idéntico.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Biol. “Int. France.TECNICA EN TUBO (por centrifugación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A. Por esta razón deben extremarse los cuidados. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. “Technical Manual”.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A.C.Leucemias u otros desórdenes malignos.Widman.B + + + + Grupo sanguíneo A B 0 AB Variants débiles del grupo A como Ax METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados.Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías. 1443152). Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido. Chapter 8. Anti-B o Anti-A. París. D. BIBLIOGRAFIA . No debe emplearse microscopio. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas. 2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. 9th Edition. se coloca una gota de estas células con 2 gotas de solución fisiológica. 55 . II. 1443153). Anti-B o Anti-A. compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos. I. Anti-B: frasco x 10 ml (Cód. F.

Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Nº: 1071/89 (Anti-A.B) 56 .Wiener lab.ar Dir. Nº: 1073/89 (Anti-B) Disp.Argentina http://www. Disp.S. Riobamba 2944 2000 .A.I.C. 2000 Rosario .: Viviana E.com. Nº: 1076/89 (Anti-A) Disp.wiener-lab. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.Rosario . Téc.

Anti-D (Rho) monoclonal Reactivo para la detección de antígeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en el laboratorio de los anticuerpos anti-D. c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. ya sea por transfusión o durante el parto. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido. fosfato. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). podrán ser necesarios: . CPD (citrato. Las muestras recogidas con ACD. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. Sin embargo. fosfato. citrato. produciendo anti-D. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno.Placa de vidrio 57 . d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas.Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab.Solución fisiológica. . REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente: . deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Dependiendo de la técnica que se emplee. Si se utilizó heparina o EDTA. REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos. Si se emplean coágulos. Cuando se sospecha esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar. adenina). dextrosa) o CPDA-1 (citrato. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. dextrosa). dextrosa.Centrífuga . EDTA. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro". MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes. ACD (ácido cítrico.Tubos de hemólisis . es el antígeno D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. . 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. 43: 223.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos. . 4) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos.. descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las células luego de cada lavado. luego centrifugar y volver a leer como se describió en 4). . 3) 5) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. III.JAMA 169:696. 1443155). 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 2000 Rosario .Race . Biol. K.Proc. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos sensibilizados.I. Soc. BIBLIOGRAFIA . centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. and Sanger. 3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Wiener. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.Landsteiner..“Blood Groups in Man” .J.R. . Chapter 9.S.K. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-50oC. A. . Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico).C. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. R.Argentina 58 . II. Unger. Wiener lab. Washington D.6 th Ed. 6) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente. Las muestras que aún en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. 1959. 178. Exp.. o solución fisiológica. 4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica. 1975. American Association of Blood Banks. o solución fisiológica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. L. Riobamba 2944 2000 . 1985.9 th. Med. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino.TECNICA EN TUBO Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos.Wiener. También puede emplearse sangre entera. mezclar.A.500 rpm.S. R.Rosario . INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. . Ed. pág. 1940.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos.Widman. Oxford Blackwell Scientific Publications..Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I. .C. A. F. o en solución fisiológica.“Technical Manual” .

: Viviana E.S. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.wiener-lab.ar Dir. Disp.http://www. Nº: 1074/89 59 . Téc.com.

PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro". FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b. adenina).Solución fisiológica. REACTIVOS NO PROVISTOS . con o sin anticoagulante.Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glóbulos rojos.Identificación y titulación de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. citrato. dextrosa. .Fenotipo de glóbulos rojos. 60 . De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente: . fosfato.Suero Anti-humano (poliespecífico) Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs. . MUESTRA Glóbulos rojos a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente.Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido.Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. C3bi. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminación del mismo.Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. . . produce una aglutinación de los glóbulos rojos visible macroscópicamente. . fosfato. dextrosa) o CPDA-1 (citrato. . ACD (ácido cítrico. El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a antígenos del sistema Rh. .Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS). Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. C3dg o C3d).Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica. INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar.Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. heparina. Prueba Antiglobulina Directa . dextrosa) CPD (citrato. siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prueba Antiglobulina Indirecta . b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA. REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3.

E.Tubos de hemólisis PROCEDIMIENTO I. R. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días.. .Coombs.. Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos.Tiempo o temperatura de incubación inadecuados. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica). PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. 4) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. II. A.Concentración inadecuada de glóbulos rojos. BIBLIOGRAFIA .Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. Descartar completamente el sobrenadante luego del último lavado. Si los glóbulos provienen de coágulos. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. 2) Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I). 7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados con IgG débiles. 2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7) de la técnica I).R. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. 6) Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente. . la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extracción).PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos. 1) En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar. III.Centrífuga . 1) Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar. Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas. El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos. Finalmente preparar con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%. 1443156). Si se utilizó heparina o EDTA. 61 .Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados. 3) Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua. R.500 rpm. Si se emplean coágulos. Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles.c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). . INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. 1945. . 1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: . No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. ii:15.Lancet.Lavado inadecuado de las células. .PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal). Mourant. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . Las muestras recogidas con ACD.Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados. and Race. 2) Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS. .Baño de agua a 37oC . no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas.A. 3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.R.

Exp.E. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. American Association of Blood Banks.S. Disp.Coombs.C. 1985. Nº: 2503/91 62 . 9th ed.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.Brit..K. Wiener lab. . pág. A.com. J. and Race. 26:225. F. 1945.: Viviana E.Widman. Mourant. Path.Rosario . Washington D.A.ar Dir. R. Téc.“Technical Manual”. R. Riobamba 2944 2000 .A.I. ..R.wiener-lab. 376.R. 2000 Rosario . .C.Argentina http://www.

Luego se toman 0.2 Titulación a) Se toman 10 tubos de Kahn. a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario).1. TITULACIÓN DE ANTICUERPOS A. d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos.1.1. Colocar 0. con aglutinación. el título se determinará promediando dicha dilución con la precedente. el tiempo requerido. c) Tomar 0. el título será (16+8)/2=12. el tipo de aglutinato es tr. Preparación de diluciones madres. El grado de aglutinación se considerará según los scores anteriormente indicados. b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O con dos gotas del suero a titular. numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla.100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. Agitar la mezcla.100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2. d) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del suero. Por ejemplo. Con una pipeta Pasteur para cada dilución. Homogeneizar y repetir la operación hasta completar las diluciones. 63 . Si en la última dilución. A. si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16. El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación ± . colocar 0. b) En los tubos 2 al 10. a) Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de hematíes a usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes. c) Incubar a la temperatura apropiada .300 ml de suero a titular en el tubo N°1. el tipo de aglutinato es tr.Determinación de anticuerpos inmunes A.100 ml de solución fisiológica (SF). b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%. e) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilución.1 Técnica básica de titulación A.

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