UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS ASIGNATURA HEMATOLOGIA

Métodos del laboratorio hematológico
PRIMERA PARTE

Docentes

Dra. Nilda E. Fink Dra. María Elena Chiesa Dra. Ma. Alejandra Fernández Alberti Bioq. Fernando Ventimiglia Bioq. Mariana González Bioq. José Luis Casali

La Plata, 2007

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Contenido
Página Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa Descripción de los anticoagulantes usados en hematología Recuento de hematíes Hematocrito Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina Velocidad de sedimentación globular Recuento de reticulocitos Cuantificación de hierro sérico Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls Separación electroforética de hemoglobina Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs Determinación de anticuerpos inmunes 3 5 7 12 15 21 26 29 34 42 45 47 57

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Después de la toma. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba). El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresión del músculo no mayor a 1 mm. 4. presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco. no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo. 14. Antes de iniciar la toma de muestra. localizándola visualmente y por palpación. El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y. 13. los cuales se mantendrán puestos durante todo el procedimiento. En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más sangrado. se retira el torniquete y luego la aguja. 7. Una vez identificada la vena. Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables. 8. 9. 5. 12. Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene. descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin. 15.Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa A) EN ADULTOS 1. 11. evitando hacer espuma. indicarle al paciente que abra y cierre el puño para facilitar la extracción. se le indica al paciente que abra la mano. limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol. dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. tener todo el material preparado pero sin abrir. La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes. 10. 4 . LA AGUJA SE DESCARTARÁ EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN. Colocar el lazo y volver a palpar la vena. se la colocará en la jeringa sin tocar con los dedos. En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja. Dejar secar perfectamente. 6. La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba. 2. Los recipientes que contienen algodón y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirán solamente al momento de usar. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. controlando el correcto funcionamiento del émbolo. Una vez realizada la toma de muestra. Elegir una vena bien visible en el antebrazo. 3. una vez manipulado.

17. se recomienda hacer la extracción del brazo como en adultos. dejar evaporar y punzar con la lanceta. 3. Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento. Secar la zona con un trozo de algodón seco y una vez que no haya sangrado. NO REUTILIZARLOS NUEVAMENTE. En el caso de niños menores de 6 meses. 2. en la zona del talón indicada en el dibujo adjunto. aclararlo en el registro de muestras. En niños mayores de 6 meses. Desinfectar con un trozo de algodón embebido en alcohol. La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. B) EN NIÑOS 1. se procederá a extraer la muestra del talón con una lanceta descartable. colocar una curita o apósito.16. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante. en particular el brazo. Las flechas indican los lugares de punción 5 . 4. pidiéndole a un adulto que colabore en mantener inmóvil al niño. Antes de la extracción conviene calentar el talón frotándolo entre las manos para favorecer la irrigación de la zona.

Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico. HEPARINA DE LITIO. dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético. sin embargo . Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo.2H2O posee un peso molecular relativo de 404. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1. por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos. C6H5O7Na3. es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. las tres sales afectan el tamaño del eritrocito.2H2O). 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4.1-0.0. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares.2 mg/ml. actuando mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca+ + ). La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1. así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1. actúa impidiendo que el calcio se ionice.2 mg) de heparina por ml de sangre. Los anticoagulantes más utilizados son: • EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica. de sangre total. sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos. El citrato sódico se utiliza a una concentración de 0.106 mol/l (31. HEPARINA SÓDICA. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro • • • 6 .8+/-1. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0. evitando así la coagulación. posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C). CITRATO TRISÓDICO.1g.5-2. el tamaño eritrocitario. El K2EDTA . Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio.3 g/L de C6H5O7Na3. no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria. especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas.Descripción de los anticoagulantes usados en Hematología Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares.

La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0. H2O destilada 120 ml.volúmenes de sangre. Citrato disódico 2 g. Dextrosa 2 g.9 g. 7 .

Recuento de hematíes A) RECUENTO MANUAL Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada.98 ml Sangre (con pipeta automática): 0. Líquido diluyente: solución fisiológica o citrato de sodio 3.02 ml El recuento se realiza en la cámara de Neubauer cuyo esquema es el siguiente: El recuento de hematíes se realiza en el cuadrado central. para lo cual se mide exactamente: Solución fisiológica o citratada: 3.8%. La dilución empleada es de 1/200. como se muestra a continuación: 8 . Es un método poco usado debido al elevado error que presenta. se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeños.

Falta de suficiente agitación de la sangre diluida. el cálculo que se debe hacer es el siguiente: N x D x FC x ST = nº de glóbulos rojos/mm3 TC Donde: N: número de eritrocitos contados. 1.1 mm. Células mal distribuidas en el fondo de la cámara. 3. La cámara puede ser cargada con un capilar. Llenado incompleto de la cámara cuentaglóbulos. sucio o húmedo. Errores al efectuar los cálculos. 9 . luego de agitar adecuadamente en un agitador de rodillos. 4. FC: Factor de corrección de la profundidad. TC: Total de cuadrados pequeños contados. Errores del operador al realizar el recuento. el cual puede deberse a: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. sucia o mojada. 2. para llevar a 1 mm3 (10). 5. Empleo de cubreobjetos deformable. Causas de error en el recuento en cámara cuentaglóbulos El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%. Utilización de material mal calibrado. ST: Total de cuadrados pequeños en la superficie de 1 mm2 (400). no rígido. sirven únicamente como límites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeños. Se deben contar 5 de estos cuadrados. 8. evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente. que el retículo tiene 400 cuadrados pequeños en total. se carga la cámara y se cuentan los glóbulos rojos de los 80 cuadrados pequeños (zona sombreada). Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0. D: Título de la dilución realizada (200). o triples. Coagulación parcial. Con la dilución indicada.Recuadro central: Las líneas reforzadas. Considerando entonces. Hemólisis. 6. Cámara cuentaglóbulos mal ajustada. 7.

3. La concentración de la suspensión analizada: debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia. Las condiciones más importantes que deben tenerse en cuenta son: 1. 10 . para cada población celular que se quiera estudiar se deben seleccionar las condiciones para que sean analizadas sin error. Si es muy elevada puede dañar las células y producir interferencias originadas por ruido electrotérmico. los aparatos totalmente automatizados sólo requieren que se les suministre la muestra obtenida en condiciones apropiadas (por ejemplo: con el anticoagulante adecuado). 2. La intensidad de corriente entre ambos electrodos: debe ser lo suficientemente sensible para detectar la resistencia que genera la partícula cuando atraviesa el orificio. Como los impulsos eléctricos que van a determinar el volumen celular se generan en el orificio de apertura del sistema. Debe ser perfectamente permeable. Los sistemas de recuento celular por estos medios se basan en la medida del tamaño u otras propiedades físicas de las células suspendidas en medio líquido de acuerdo con uno de los dos principios siguientes: 1. es decir. se genera una resistencia entre ambos electrodos que se registra como un impulso. Existen distintos tipos de instrumentos: los semiautomatizados que requieren algunos pasos previos. como por ejemplo diluciones de la muestra antes de ser procesada y.B) RECUENTO AUTOMATIZADO La automatización ha contribuido de manera decisiva al aumento de la rapidez y la fiabilidad del recuento de las células sanguíneas. que varias células atraviesen el orificio al mismo tiempo. B. Dispersión de luz o campo oscuro. Es importante realizar periódicamente una limpieza de este orificio. Cuando una célula pasa a través del orificio. 2. El número de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular y como la amplitud del impulso es directamente proporcional al tamaño de la célula. es posible determinar también el volumen celular. Se basa en la propiedad de las células sanguíneas de no conducir la electricidad. Por dentro y fuera del orificio se disponen electrodos que establecen una diferencia de potencial. las células sanguíneas así diluidas se hacen pasar por un orificio de apertura con un área prefijada. por lo general poseen un monitor de visualización que permite observar su permeabilidad durante el recuento. Impedancia o resistencia eléctrica. Este método tiene algunas limitaciones. El diámetro del orificio de apertura: debe estar en relación al tamaño de las partículas que se analizan. La sangre total es diluida en una solución de conductividad estable.1 Método de la impedancia o de la resistencia eléctrica Es el más empleado en los autoanalizadores hematológicos.

1x1012/L .2x1012/L 4.5. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. Presencia de partículas extrañas en el diluyente. f) Contaminación por arrastre de un especimen con el siguiente. Uso de un diluyente incorrecto.5.7x1012/L .6. g) Presencia de interferencias electrónicas y averías de los componentes electrónicos del instrumento. será analizada por los sensores. En general. Causas de error en el recuento automatizado Con el empleo de métodos automatizados se puede cometer grandes errores si se olvida el control periódico y el calibrado diario de los instrumentos. Coagulación parcial.3x1012/L 4. Cada vez que una célula se interpone en el haz de luz se produce una sombra que.5. suele ser inferior al 1%.6x1012/L . 4.3x1012/L 4. Defectos en el sistema electrónico de recuento: a) Lisis incompleta de los eritrocitos en el orificio de leucocitos. C. pero puede incrementarse por: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. c) Obstrucción de los capilares u orificios de recuento. d) Dilución incorrecta de la muestra por el liquido diluyente. Hemólisis. b) Presencia de agregados celulares a nivel del orificio de recuento.0x1012/L .1x1012/L . 1. que son contadas como células. 2.2 Método de dispersión de luz Se analiza la dispersión de luz producida por las células desde dos dimensiones gracias a sensores ubicados en ángulos diferentes. el error debido al propio método de recuento electrónico.1x1012/L 4. e) Presencia de microburbujas.9x1012/L D) INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 11 .5. Estos sistemas permiten medir la concentración y el volumen celulares. proyectada sobre un campo oscuro. Si además.5.3x1012/L 4.B. 3. Las células se hacen pasar individualmente a lo largo de una cámara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz que puede ser halógena o láser. las células se someten a tinciones citoquímicas se pueden detectar midiendo la intensidad de dicha reacción los diferentes tipos de leucocitos. VALORES DE REFERENCIA Edad Recién nacidos Niños (2-12 años) Adultos jóvenes (12-18 años) Adultos jóvenes (19-60 años) Sexo ambos ambos mujeres hombres mujeres hombres Intervalo de referencia 4. cuando se realiza en óptimas condiciones.5x1012/L .

se habla de seudopoliglobulia. la cual puede acompañarse de microcitosis como en la talasemia.Un aumento de la concentración de eritrocitos con contenido hemoglobínico normal suele acompañarse de un aumento de la concentración de hemoglobina y recibe el nombre de poliglobulia. Cuando el aumento de la concentración de eritrocitos va acompañado de una disminución de la hemoglobina. 12 . la hemólisis o fallas en su formación a nivel de la medula ósea. El descenso en la concentración de eritrocitos en la sangre se acompaña siempre de una disminución en la concentración de hemoglobina (anemia) y puede deberse a diferentes causas como las hemorragias.

El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas. Tanto el Hto. La lectura del resultado se realiza extrayendo los tubos de la centrífuga y valorando la altura en milímetros de la columna eritrocitaria.1 Macrométodo (macrohematocrito) Utiliza 0. un descenso del Hto es indicativo de anemia. son un buen parámetro del estado de la serie eritroide.3 %). aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia.6 ml de sangre entera anticoagulada con EDTA.Hematocrito DEFINICION El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre. obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados. puede ser normal o alto. A) METODOS MANUALES A. entre sus factores de error está el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura. por lo que es siempre algo inferior (0.000-3. mientras que el aumento lo es de poliglobulia. Aunque también puede emplearse un tubo de Wintrobe (macrométodo). Por ello. el Hto. tubo de Wintrobe con diámetro interno de 3mm . dentro del contexto del hemograma automatizado. expresado como porcentaje. un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos.p. este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisión. Por ej. un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración. barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión. Debe excluirse la columna de leucocitos y plaquetas. 13 . El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo). todos los autoanalizadores hematológicos suministran. Así. Centrifugamos durante 30 minutos a 2.2-0. En la actualidad.m. Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina. es una técnica sencilla.. que corresponde a una fracción de la longitud original de la columna sanguínea (100 mm). Ambos métodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la acción de una fuerza centrífuga.000 r.

que nos darán el resultado directamente. al perderse mayor proporción de células que de plasma. el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentración.5 cm. METODO AUTOMATIZADO: CONTADORES HEMATOLOGICOS El método automático de determinación se basa en el cálculo matemático a partir del Volumen Corpuscular Medio (VCM) y el número de hematíes. provoca que el sedimento de hematíes vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal. La lectura no inmediata de los capilares.A. de longitud por 1mm. Hto = n° de hematíes x VCM 14 . Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7. se desechará la primera gota después de la punción. favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. Se centrifugan durante cinco minutos a 12. El llenado de los tubos se realiza por capilaridad.x x : hematocrito en tanto por ciento A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0.000 rpm. En muestras de sangre venosa. Causas de error • • • • • Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito. Si se utiliza sangre capilar. de diámetro interno. dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada.100 B------. por necesitar muy poca cantidad de sangre. o con una regla milimetrada. B. Heparinizados o no. aplicando la siguiente regla de tres: A------.01.2 Micrométodo (microhematocrito) Es una técnica muy utilizada. El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota. produce una mezcla con los líquidos tisulares que provoca hemodilución. Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 µl). Tan pronto se detiene la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. muy sencilla y poderse realizar en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo.

39 ± 0.05 0.45 ± 0.VALORES DE REFERENCIA ( x ± 2 DE) El valor de Hto varía con la edad y el sexo. Edad y sexo Recién Nacidos Niños (hasta 10 años) Mujeres (18-50 años) Embarazadas Hombres (18-50 años) Hematocrito % 54 ± 10 38 ± 5 42 ± 5 39 ± 5 45 ± 5 Fracción 0.05 15 .42 ± 0.54 ± 0.05 0.38 ± 0.05 0.1 0.

Los distintos compuestos de hemoglobina.5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). 4. 6. Todo patrón de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN. de forma que aquella se completa en 3 min.4) Ferricianuro potásico [K3 Fe(CN) 6] Cianuro potásico [CNK] Fosfato monopotásico [KH2PO4] Detergente no iónico* Agua destilada hasta 200 mg 50 mg 140 mg 1 ml 1000 ml Detergentes no iónicos: Tritón X-100. Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados periódicamente mediante la solución patrón de HiCN. Este reactivo debe tener un color amarillo pálido. ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7. 16 . Reactivo de Cianmetahemoglobina: Composición (pH 7-7. 5. Nonidet/40. Tubos: 12 x 100 mm. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1. Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina. se transforman en HiCN según el siguiente proceso: Hemoglobina + Ferricianuro potásico → metahemoglobina Metahemoglobina + Cianuro potásico → cianmetahemoglobina MATERIAL 1. Pipetas automáticas: de 20 µl. debidamente calibradas. preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) 2. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 ml. Nonic 218. Puede emplearse sangre capilar.Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina FUNDAMENTO Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN). El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la transformación de la hemoglobina en HiCN. Quolac Nic 218. Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo).4. 7. excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa. 3. que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración).

1). 5. Así. si la dilución ha sido de 200 veces. según el lote y el instrumento de lectura utilizados. Mediante la micropipeta añadir 20 µl de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operación. La concentración de hemoglobina también puede calcularse aplicando la siguiente fórmula: 17 . si en el frasco se indica una concentración de 572 mg/l..8 mg de hierro hemoglobínico por litro a 540 nm). es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta. significa que dicha solución patrón posee la misma absorbancia que la de una solución de hemoglobina de 143 g/l. El patrón primario de HiCN se suministra en ampollas cerradas al vacío que contienen 10 ml de una solución de HiCN correspondiente a una concentración de hemoglobina entre 550 y 850 mg/l. La curva de longitud de onda versus A desde λ=750 nm a λ=460 nm se observa en la Fig. METODO Por un lado. Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio.404. Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión del tubo 20 veces. Conectar el espectrofotómetro. la absorbancia de una solución que contenga 4 x 55. El cociente A540/A504 oscila generalmente entre 1.251. 4. El valor de la A a 540 nm varía entre 0. y a 504 nm entre 0. si la sangre total se ha diluido 250 veces.0) de la hemoglobina ( por ej. Leer la A de la solución a 540 nm. Patrón primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarización y el control de calidad. 6.458) y el coeficiente de extinción (44. utilizando agua destilada como blanco.62.1 .El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendría una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimétrica. 3. 7.248 y 0. 2.8.60 y 1. 8. Este patrón. La concentración exacta de hemoglobina de cada lote se indica siempre en la ampolla. Agitar el tubo mediante inversión ( 4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina. es una solución muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y características fisicoquímicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64. Por otro lado se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuación: 1.400 y 0. donde también se incluye la curva del reactivo. se efectuará el espectro de absorción de la solución de referencia internacional y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig. o de 114 g/l. El patrón primario posee un espectro de absorción característico con un pico de máxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexión a 504 nm. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibración (ver más adelante).

Reactivo de Drabkin Volumen Dilución Hb Tubo (modificado) final (ml) (g/l) (g/l)* (ml) 1 3.0 3 1:3 48 4 0. Para trazar este gráfico se preparan 5 soluciones de concentración de HiCN conocida y decreciente a partir del patrón de HiCN mediante diluciones sucesivas en reactivo de cianmetahemoglobina (véase tabla 1).5 3 1:6 24 5 0 3.0 3 0 0 * El valor de esta concentración dependerá del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN que se emplee en el Trabajo Práctico. La concentración de hemoglobina en milimoles por litro de sangre (mmol/l) puede calcularse multiplicando el valor en g/l por 0.5 1. partiendo de la solución de HiCN más diluida (tubo 5) se leen las restantes soluciones patrón. Patrón de referencia de HiCN (ml) La concentración de hemoglobina correspondiente a cada tubo se determina a partir del grado de dilución y del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN. la relación entre los valores de A obtenidos y los correspondientes de concentración de hemoglobina se representan en un gráfico con los valores de A en las coordenadas y la concentración de hemoglobina en las abscisas (Fig. se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene sólo reactivo (tubo 5) y se ajusta la A (100% de transmitancia). Finalmente.621. Una vez preparadas las soluciones patrón.5 3 1:2 72 3 1.0 2. ELABORACION DE LA CURVA DE CALIBRACION La gráfica de calibración tiene como finalidad calibrar el espectrofotómetro para una lectura determinada calculando la corrección existente entre los valores de A leídos en el aparato y los correspondientes valores de concentración de hemoglobina. Luego. 18 .5 2.0 0 3 0 145 2 1. 2).Hemoglobina (g/l)= A540 (muestra) A540 (patrón) x HiCN patrón (mg/l x F 1000 Siendo A= absorbancia F= factor de dilución de la sangre total en el reactivo de Van Kampen y Zylstra (251).

Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formación exclusiva de metahemoglobina. Soluciones turbias de HiCN Errores en la conservación del reactivo: 1. Congelación del reactivo. Coagulación parcial de la sangre Errores de la dilución: Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o húmedas 1. con lo que los valores de concentración de Hb obtenidos son inferiores a los reales. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (>50 x 109/l). Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la Hb en HiCN Errores de la determinación: 1. Empleo de instrumentos no calibrados 2. lo que produce transformación de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y una oxidación parcial de la Hb. Empleo de anticoagulantes no recomendados 2.Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. 19 . No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo 2. No obstante. la mayoría de las veces los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN: Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido 1. Errores en la obtención del espécimen de sangre: Errores de extracción 1. Cubetas sucias o deterioradas 3. 2. en vez de HiCN.

Espectro de absorción de la solución de HiCN y del reactivo usado 20 .

Curva de calibración elaborada a partir de una solución de cianmetahemoglobina de concentración conocida. 21 .

c. Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Desde el punto de vista físico. Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico. Dado que. este fenómeno depende de los siguientes factores: a. polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia. Tamaño de los G Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma. el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR. por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin. Temperatura. ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante. b. 22 . cuanto más pequeños sean los agregados. éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis. La etapa más importante es la primera o de aglutinación. Viscosidad del plasma. más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa. como se mencionó más arriba. d. VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea. linfomas y mieloma múltiple). pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células. MECANISMO El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado. Así. y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad η a una velocidad v: R = 6ηvr La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas".Velocidad de sedimentación globular FUNDAMENTO El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo.

El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable. lo que explica que estas células se mantengan separadas. continua siendo un método poco reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar. Ambos métodos poseen limitaciones. puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. Estos sistemas. Sin embargo. 23 .La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. globulinas y fibrinógeno. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones de albúmina. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR. Tradicionalmente. METODOLOGIA Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el método de Wintrobe. mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta. la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH). lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. MÉTODO DE WESTERGREN Es el método de referencia para medir la VSG. La albúmina retarda la VSG. El método de Wintrobe. Así. Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación entre el plasma y los GR en la muestra. el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas. pero no resultaron confiables. por el otro lado. El método de Westergren es menos sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y así puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias. las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. como es la necesidad de prediluir la sangre. De acuerdo con este mecanismo. se diferencian de éste por su carácter cerrado (recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisión del llenado de las pipetas. y un bajo hematocrito causa un aumento no específico de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre los agregados en sedimentación. Durante los últimos años. aunque reproducen exactamente el método de Westergren. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina.

Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1°. los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. C) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente. o dentro de las 6 hs.3 Gradillas Las gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición vertical inmóvil. La misma debe estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en ella. evitando contaminación con materiales utilizados para la higiene de la piel. Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0. se mezcla por inversión repetidas veces.55 + 0. B.1 Anticoagulante Citrato trisódico 109 mM en solución acuosa.08 g/l. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.A. D) El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25°C). La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solución de citrato de sodio. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza. A.15 mm. A. libre de vibraciones y corrientes de aire. por ejemplo 2 ml de sangre en 0.05 mm) todo a lo largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm.2H2O) prepare una solución acuosa de 32. Si utiliza citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7. El nivel de la sangre se ajusta a cero. sin exposición a la luz del sol directa. si es mantenida a 4°C. Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las especificaciones.5 ml de anticoagulante. A. MATERIALES. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente.5 mm y de un diámetro de 2. Algunos plásticos resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de taponamiento. TÉCNICA B) La sangre se obtiene por punción venosa. 24 .2 Tubo de sedimentación Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1. manteniéndolo exactamente 60 min.

Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs. expresado en mm. corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora). C. muy utilizadas anteriormente. y también en el embarazo normal y el puerperio. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda. etc. Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas. el ciclo menstrual. contraconceptivos orales. han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica. INTERPRETACION DE RESULTADOS Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia). El valor de esta distancia. VALORES DE REFERENCIA EDAD (años) Niños mayores y jóvenes Hombres adultos Mujeres adultas 0-15 17-50 51-60 61-70 17-50 51-60 61-70 X + 2 DE 5 + 10 4+3 6+3 6+4 6+3 9+5 10 + 5 Límite superior de la normalidad 15 10 12 14 12 19 20 Factores técnicos capaces de modificar la VSG Causas de aumento • Desviación de verticalidad de la pipeta • Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta • Elevación de la temperatura ambiente • Dilución de la sangre • Causas de disminución: • Reducción del diámetro de la pipeta • Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido) • Cambio de anticoagulante D. por lo que no se recomienda su empleo. se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada.E) Una vez transcurrido el tiempo. 25 . Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos. y las medicaciones (corticosteroides.

por ende. hipofibrinogenemia. anemia falciforme. y ocasionalmente sin causa aparente. un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgánica.La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia. anormalidades de GR (hemoglobinopatías. es inusual obtener falsos negativos. 26 . esferocitosis hereditaria. Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG.). defectos cardíacos congestivos. etc.

eritrocitos inmaduros. los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3 días y terminan su maduración en 24 horas. El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA)y a ser posible. En condiciones normales.Recuento de reticulocitos Los reticulocitos. El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. dentro de las 24 primeras horas de la extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Cuando una anemia se acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. El método manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variación >20%). El recuento se efectúa contando en donde los eritrocitos estén distribuidos homogéneamente. La suspensión sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a terapéuticas agresivas. MÉTODO DE LA TINCIÓN VITAL (MÉTODO DE REFERENCIA) Este método usa como colorante el azul de metileno nuevo: 1 g cada 100 ml de solución citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de ClNa 9 g/L). se toma una pequeña gota de la suspensión y se extiende sobre un portaobjetos. Citometría de flujo. el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción. mientras que cuando el número es normal o disminuido se denomina arregenerativa. pero sobretodo a los errores de índole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito. En caso de valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solución colorante. una vez ya en la sangre periférica. Tinción vital y microscopio óptico. Mediante una pipeta Pasteur se añaden a un tubo de hemólisis tres gotas de solución colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida. Es necesario realizar el recuento sobre un mínimo de 1000 eritrocitos.. Su tamaño es el de los demás hematíes y se caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando un retículo granulofilamentoso observable al ser teñido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersión (x1000). siendo 100-125 el número óptimo de hematíes por campo de los cuales distinguimos cuales son 27 . aproximadamente. Si se mantiene a 4º C. 2. Transcurrido este tiempo. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula. existen en la sangre en una proporción de cinco a diez por mil hematíes.

3 9 10 ± 1 día 1 2 5 5 ± 2 día 7. siendo el cien porciento el número total de hematíes contado. RECUENTO AUTOMATIZADO 28 0. el número de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneración eritroblástica. que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la médula a la sangre periférica. Este valor será valido si se trata de una concentración normal de eritrocitos en sangre total.40 0.30 0. Este fenómeno se caracteriza por la aparición en el examen morfológico de la extensión de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y tonalidad azulada (policromasia) Existe una relación inversa.reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje.20 0.8 4 7 8. entre el hematocrito y el período de maduración periférica de los reticulocitos.35 0.45 0. Ello obedece a que la anemia se acompaña siempre de un estímulo eritropoyético compensador. En caso de anemia intensa. mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética (anemia arregenerativa) Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia Hematocrito Niveles de Hemoglobina (g/L) Recuento de reticulocitos (%) Recuento de reticulocitos corregido (%) Tiempo de maduración estimado Índice de reticulocitos OTRA TECNICA Utiliza como colorante Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el método de referencia. Por ello.25 0. La mezcla sangre/colorante se incubará durante 15 minutos a 37º C. y un acortamiento de su período de maduración intramedular. aproximadamente lineal. De esta forma puede calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente: IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente Período de maduración en días x Hto normal Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia regenerativa). lo que supone un aumento del período de maduración periférica. el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la siguiente fórmula: Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto del paciente Hto normal (El hematocrito normal es el que le corresponde según edad y sexo).15 150 133 117 110 83 66 50 1 2 5 10 15 20 30 1 1. cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la anemia. Luego de este tiempo se realizará el extendido y se realiza el recuento como se indicó antes.5 10 3 días 10 .

2 0.0 (4-19 años) 0.2-6.8 Valor absoluto (x109 /L) 110-330) 25-89 25-86 32-97 Recién nacido (sangre de cordón) Niños y adultos jóvenes de 4 a 19 años Adultos (20-50 años) Mujeres Hombres Variaciones patológicas Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Período neonatal Anemias hemolíticas Anemias posthemorrágicas Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula ósea) Mielofibrosis idiopática 29 . mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubación previa y el análisis se realiza directamente.2-2.5-2. VALORES DE REFERENCIA Valor relativo (%) 3.Estos equipos realizan un recuento muy fiable de reticulocitos a partir de sangre total.2. En los equipos semiautomáticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo.2. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitución del criterio morfológico inherente al método visual por el análisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante citometría de flujo y luz láser. Para la tinción del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o Auramina.5 0.

Su función es captar el hierro de los sitios de absorción (mucosa intestinal) o depósito (sistema retículo endotelial) y llevarlo a los órganos hematopoyéticos donde es utilizado. REACTIVOS NO PROVISTOS . El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitación con carbonato de magnesio. el hierro circula como Fe (III) unido a una proteína transportadora específica: la transferrina o siderofilina.Cuantificación de hierro sérico Fer-color Transferrina Método colorimétrico para la determinación de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) del suero SIGNIFICACION CLINICA En el organismo humano. .Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.Agua destilada. La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que está saturada. CONDICIONES DE REACCION 30 . . REACTIVOS PROVISTOS Solución saturante: solución estabilizada de Fe (III). ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte. se determina por su actividad fisiológica de captar Fe (III) a pH mayor que 7. INSTRUCCIONES PARA SU USO Solución saturante: lista para usar. La actividad fisiológica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijación de hierro (TIBC). etc. La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrágicas.) en las hepatopatías crónicas.2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimétricamente según la técnica de Fer-color o Fer-color AA. y en las grandes pérdidas proteicas del síndrome nefrótico. en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". neoplásicas. En el individuo normal sólo la tercera parte de la transferían se satura con hierro. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.Tubos de Kahn. Adsorbente: carbonato de magnesio granulado. Disminuye en cambio en la hemocromatosis. nefropáticas. en insuficiencias hepáticas y fisiológicamente en los últimos meses del embarazo. FUNDAMENTOS DEL METODO La transferrina o proteína transportadora específica del hierro. Adsorbente: el frasco debe volver a taparse inmediatamente después de retirar las porciones necesarias para el momento.Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab. MUESTRA Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. y ferropénicas en general. Adsorbente: listo para usar.

.. Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente. La agitación insuficiente producirá valores falsamente aumentados de Transferrina. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes datos: Nivel 280 ug/dl 560 ug/dl D. +23. 8. Por lo tanto. .. A. Olguín de Mariani.S. 1990.Young. L.. Habitualmente se realiza la determinación de hierro sérico juntamente con la de transferrina. AACC Press.000 r.000-4. Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente. M. . Transferrina y Porcentaje de Saturación de la Transferrina. 4/4:621 (1971). Toxicol. .M. J.Zak.S. no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos. Epstein. D. .Buenos Aires (1975). multiplicando por dos el resultado final. 56/4:543 (1971).16% PRESENTACION Reactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) (Cód. por la dilución del suero. Centrifugar 10-15 minutos a 3. puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml. Biochem."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. Además.Clin.. Drappo..m. 3rd ed. G.Rojkín.V.29% 5. Clin.p. La concentración de Fe (III) de la Solución saturante es 10 veces mayor que la del Standard. Saturación de la Transferrina: 20-55%. Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados. y Albarracín. BIBLIOGRAFIA .S. 10/5:127 (1973). K. VALORES DE REFERENCIA La literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturación de la Transferrina en personas normales: Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl.C.. Baginski. hasta obtener sobrenadante límpido o con la opalescencia propia del suero.Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. 31 . que se calcula de la siguiente manera: Hierro sérico (ug/dl) Transferían (ug/dl) Saturación % = x 100 Si se desea efectuar simultáneamente la determinación de hierro sérico para el cálculo del Porcentaje de Saturación. Wiener lab. b) Colorimetría: seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA.I. y Wiener. Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC.S. como la medida exacta de esta solución no es crítica.Am.Dixon. PROCEDIMIENTO a) Saturación de la transferrina: en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solución saturante.2 ug/dl +28.III Congreso Argentino de Bioquímica . .Ann. 1492002). .H. . comenzar con la Saturación de la Transferrina 30 minutos antes. En ese caso se informan tres valores: Hierro Sérico. E. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. E. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas y efectuar los cálculos de la misma manera que en la determinación de hierro sérico. M. Clin. Path. B. La agitación deberá ser vigorosa y en sentido longitudinal.9 ug/dl C.

ar Dir.com. Riobamba 2944 2000 . Disp. Nº: 1287/77 . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.I.A.2000 Rosario .S.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.220/00 32 .Rosario .: Viviana E. Téc.C.wiener-lab.Argentina http://www.

PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo PBTS: listo para usar. Standard: solución de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl. b) Aditivos: no se requieren. el ácido mercaptoacético. particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto. Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas. médula ósea y parénquima hepático. contiene hierro en su grupo hemo. y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las células del sistema reticuloendotelial de hígado. Un aumento en el valor de los Blancos indicará una contaminación con hierro. pigmento más importante de las células musculares. A veces se asocian a terapia transfusional. piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta. úlceras gástricas o duodenales. 33 .). Buffer/Reductor: en refrigerador (2-10oC) es estable durante un año a partir de la fecha de su preparación. Standard: listo para usar. Antes de usar llevar a 18-30oC.25 mol/l para pH 3. La anemia por pérdida de hierro representa uno de los trastornos orgánicos más frecuentemente encontrados en la clínica médica. Buffer succinato: solución de succinato 0. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo PBTS: solución estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l. edad. hábitos alimenticios y actividad eritropoyética). en buffer succinato de pH 3. La mioglobina. Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato. a veces imperceptible. material de vidrio. FUNDAMENTOS DEL METODO El hierro sérico se libera de su unión con su proteína transportadora específica. sexo.7. que se mide a 560 nm. Anotar en el rótulo la fecha de preparación. MUESTRA Suero a) Recolección: debe usarse únicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reacción.7 y en presencia de un reductor. vertiéndolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversión. La otra causa más común de anemia ferropénica. indican contaminaciones ocasionales (agua. la transferrina. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Variaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard. Posteriormente reacciona con el reactivo de color.Fer-color Método colorimétrico para la determinación de hierro sérico sin desproteinización SIGNIFICACIÓN CLINICA El hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos. debida a hernia de hiato. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. y carcinomas de estómago y colon. bazo. Reductor: ampolla autorrompible conteniendo ácido mercaptoacético al 70 %. Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia. Ocurre con frecuencia en mujeres. y otras veces a desórdenes caracterizados por una síntesis defectuosa de hemoglobina o fenómenos hemolíticos. es la pérdida de sangre a través del tracto gastrointestinal. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. formando parte de la hemoglobina. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de mañana) ya que las fluctuaciones fisiológicas son significativas durante el día. etc.

3rd ed.S. Clin. . El Blanco de Reactivos. 1492001).Longitud de onda: 560 nm en espectrofotómetro o 540-560 nm en fotocolorímetro con filtro verde. B. . ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones. D. .a. E. Y Albarracín. A.Tubos de fotocolorímetro. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cód. . es indicio de contaminación grosera de los reactivos. se recuperó entre 90 y 103%. y Wiener. Clin. Path.150 D. . despreciable la contribución del agua en dicho Blanco. Drappo.M.III Congreso Argentino de Bioquímica Buenos Aires (1975). M."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0.Volumen de muestra: 500 ul . 10-15%. Baginski.. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. 4/4:621 (1971).S. .Young. eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro. L. No invertir para evitar contaminaciones. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO . BIBLIOGRAFIA . . Olguín de Mariani. C.C. . Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinación de hierro. 10/5:127 (1973). PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando la misma muestra en 10 días diferentes. el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemólisis. los cuales deberán desecharse. para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p.H.Zak..O. Caso contrario.5 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco de Reactivos). c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 500 ug/dl.5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer.2%. . se obtuvo un coeficiente de variación del 4. 56/4:543 (1971). . K.Am. G.. .Espectrofotómetro o fotocolorímetro. debiendo ser además. E. M.O.Ann. Toxicol.Dixon.Rojkín.Tiempo de reacción: 10 minutos . iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl. Si bien hemólisis ligeras no interfieren con este método.Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro.Clin.c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl. J.. Para controlar esto último. Epstein. CONDICIONES DE REACCION . Biochem. para un nivel de Fe sérico de 129 ug/dl. b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alícuotas de un mismo suero.Valores de Blanco aceptables: la determinación de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos. 1990. .Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.02 uOhms).5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2. Efectuar este control periódicamente. A. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .I.150 D. se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0.. reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0. AACC Press. hiperlipemia. no debe ser superior a 0.Volumen total de reacción: 2..Temperatura de reacción: temperatura ambiente . d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). L. Secar el material preferentemente a no más de 80°C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plásticos.Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla o por agitación suave. .S. S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Agua bidestilada Standard Suero 500 ul S 500 ul D 500 ul 34 . Por otra parte.

Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.3 ug/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. llevando el aparato a cero con agua. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos.B = S corregida D . 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo. Agregar.wiener-lab.(B + BS) = D corregida Fe (ug/dl) = D corregida x f Donde: f = METODO DE CONTROL DE CALIDAD Standatrol S-E 2 niveles.6 ug/dl Mujeres: 103.198/00 35 . 2000 Rosario .Argentina http://www. manteniendo el frasco gotero en posición vertical. se halló un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios: Varones: 114.C. VALORES DE REFERENCIA En un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Los tubos deben ser leídos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento.com.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de Suero BS) en espectrofotómetro a 560 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua.: Viviana E. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas de S y D.Rosario . Riobamba 2944 2000 . restándoles los Blancos correspondientes: S . Téc.S. con edades oscilando entre los 18 y 51 años.I. Nº: 1287/77 . Disp.Búfer/reductor 2 ml 2 ml 2m Mezclar. 100 ug/dl S corregida Wiener lab.A.ar Dir.

Solución de contraste eosina (1 g/L de H2O) o safranina(1 g/L de H2O. La tinción de Perls permite valorar también el hierro no hemínico presente en el citoplasma de los eritroblastos y determinar el número de los que presenten uno o más gránulos de hemosiderina (sideroblastos). luego del tratamiento con drogas. Frotis de la médula ósea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. mientras que se ve disminuida en la anemia con células S (sickle cells). INTERPRETACION Y EVALUACIÓN DE RESULTADOS La hemosiderina teñida mediante la tinción de Perls aparece bajo la forma de gránulos de intenso color azul. 4. 2. 36 . MATERIAL 1. que se considera el resultado de la precipitación de varias moléculas desnaturalizadas de apoferritina. constituye el hierro no hemínico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las células del sistema mononuclear fagocítico. Debe prepararse extemporáneamente mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de ferricianuro potásico al 2% en agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0. La fragilidad osmótica se ve aumentada en anemias hemolíticas. La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina. 2. Solución clorhídrica de ferricianuro potásico. Refleja la habilidad de la eritrocitos para captar agua sin lisar. Introducir los frotis fijados en la solución clorhídrica durante 1 hora a temperatura ambiente. 3. Se han establecido scores para la semicuantificación de la reacción. como la esferocitosis hereditaria. anemias por deficiencia de hierro y talasemias. 3. Este test ha sido muy usado experimentalmente como medida de la viabilidad del glóbulo rojo y clínicamente con fines diagnósticos. Normalmente. METODO 1. fijar los frotis en vapores de formol durante 30 minutos (algodón empapado de formol en el fondo de un vaso de Coplin). Microscopio óptico.Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls La coloración de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de célula pudiendo ser aplicada a las células presentes en un frotis o extensión de sangre o médula ósea. Lavar los frotis colocándolos en la solución de contraste durante 30 minutos. como la indometacina.2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente(24ºC). que se observan normalmente a nivel de las zonas de abundantes macrófagos. MEDICIÓN DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA La fragilidad osmótica mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio.

fundamentalmente a través de los capilares esplénicos. Si se produce un desbalance en el equilibrio entre la producción de eritrocitos por la médula ósea y su eliminación esplénica. 5.0. 6. mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio. Las diluciones se realizan por duplicado. a 2500 rpm por 15 minutos y se realizan lecturas de los sobrenadantes a 540 nm. 8. 7. posiblemente.0.0. luego de mezclar por inversión. Para preparar las soluciones de ClNa se parte de una solución 10 g/L y se realizan diluciones de la misma.0. Si por alguna alteración del citoesqueleto. la cual es imprescindible para que el eritrocito pueda circular libremente. 3. 4. nos encontraremos ante la presencia de una anemia hemolítica debida.0. Este test es por lo tanto. Para realizar la medición. Luego se grafican las curvas de % de hemólisis vs. la membrana del glóbulo rojo pierde su capacidad de deformación . El grado de hemólisis es determinado midiendo la hemoglobina liberada a partir de las células. La fragilidad osmótica.0. se deben mezclar 50 µl de sangre con 5 ml de soluciones con diferentes concentraciones de ClNa : 10. La solución de 10. el mismo es quitado de circulación.5. [ClNa] y de las mismas se extrae el valor de [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. La forma de la curva que muestra el grado de hemólisis en función de la [ClNa] sugiere que ésta puede ser el resultado de la distribución de las poblaciones de GR. diferenciadas de acuerdo a la resistencia de su membrana. a alguna alteración de las proteínas del citoesqueleto de la membrana eritrocitaria. Las variaciones en la fragilidad osmótica son definidas como cambios en las curvas de hemólisis y son establecidos por determinación de la [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. 37 .0 g/L es usada como blanco. 4. indicador del estado de la membrana eritrocitaria.0. 2.En este test se mide la capacidad de deformación o elasticidad de la membrana del glóbulo rojo. La concentración de ClNa que produce el 50 % de hemólisis puede ser determinada calculando el % de hemólisis según la siguiente ecuación: % de hemólisis = (DOs -DObl) x 100/ DOo donde: DOs= densidad óptica del sobrenadante DObl= densidad óptica del blanco DOo= densidad óptica de la solución de 1 g/L de ClNa. 9. Se centrifugan.0 g/L.0.0 y 1.

.... Sustrato reconstituido: estable 21 días en refrigerador (2-10oC) o 3 días a temperatura ambiente a partir del momento de su reconstitución... (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo..... 200 mmol/l INSTRUCCIONES PARA SU USO Buffer: listo para usar.... MUESTRA Suero o plasma a) Recolección: se debe obtener suero de la manera usual y separar del coágulo dentro de las dos horas de su obtención.... 1............ Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método... La LDH es estable hasta 24 horas en refrigerador.......800 D..........2 mmol/l ClNa .. debe usarse heparina como anticoagulante........... 0............. lecturas de absorbancia del Sustrato reconstituido inferiores a 0......... c) Sustancias interferentes conocidas: las muestras con hemólisis visible o intensa pueden producir valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usadas.......... No congelar..... PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".........6 mmol/l NADH .......O.............. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.. REACTIVOS PROVISTOS Buffer: solución de buffer Tris...... pH 7..2 conteniendo piruvato y cloruro de sodio.... d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca.... INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada.............. o superiores a 1... Sustrato: viales conteniendo NADH.......... alcanza un pico entre las 48 .............72 horas y permanece elevada hasta el séptimo o décimo día....................... 80 mM.. 38 . La misma comienza a aumentar de 12 a 24 horas después de producido el infarto...... También puede usarse plasma..800 D....... la actividad de LDH total (junto con las de CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnóstico............. FUNDAMENTOS DEL METODO Basado en el siguiente esquema de reacción: LDH Piiruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+ Las concentraciones del ensayo están optimizadas de acuerdo a la Sociedad Francesa de Biología Clínica (SFBC).....LDH-P AA Método UV optimizado (SFBC) para la determinación de lactato deshidrogenasa (LDH) en suero o plasma SIGNIFICACION CLINICA La determinación de la actividad de lactato deshidrogenada (LDH) en suero.... Por otra parte.. Tapar y agitar suavemente por inversión hasta disolución completa... pH 7. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma.... En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM). Sustrato: agregar el volumen de Buffer indicado en el rótulo a un vial de Sustrato............ tiene una gran variedad de aplicaciones clínicas.2 Piruvato ..... pielonefritis........O... Concentraciones finales (según SFBC) Tris .. Fechar...... también se registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis hepática (producida por agentes tóxicos o por infecciones agudas como la hepatitis viral) e incluso acompañando a necrosis tubular renal...

Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada temperatura. la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0.118 II (30-37ºC) 8.La humectación es causa de deterioro del Sustrato.941 25ºC 4.Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir.921 5.871 17.683 9.Cronómetro.Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. indica una muestra con muy alta actividad de LDH (que consume NADH aún antes de esta lectura). luego agregar: Muestra 100 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro. . En este caso. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.095 8.O.Material volumétrico adecuado. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (∆A/min).Los volúmenes de muestra y reactivo se pueden reducir proporcionalmente sin que varíen los factores de cálculo. CONDICIONES DE REACCION (Disminución de absorbancia) . Leer la absorbancia inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1. repetir la determinación con muestra diluida 1/10 con solución fisiológica y multiplicar el resultado por la dilución efectuada. colocar: Sustrato reconstituido 3 ml Preincubar unos minutos. CALCULO DE LOS RESULTADOS LDH (U/l) = ∆A/min x factor En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción seleccionada (30-37oC o 25oC) y a la técnica empleada (micro o macrotécnica) como se indica en la siguiente tabla de factores: Longitud de onda 340 nm 334 nm 366 nm VALORES DE REFERENCIA Temperatura Valores (U/I) 25ºC 120-240 30ºC* 160-320 37ºC* 230-460 Temperatura I (30-37ºC) 9. siguiendo el procedimiento indicado en A). .MACROTECNICA Emplear 50 ul de Muestra. 2 y 3 minutos de la primera lectura. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra. .0 ml de Sustrato reconstituido siguiendo el procedimiento indicado en A).800 D. . B) 30-37oC I. .Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero.Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366) . II. Utilizar este promedio para los cálculos.Tiempo de reacción: 3 minutos y 30 segundos.MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .016 9.253 15. . . . se obtienen los siguientes valores: 39 .Temperatura de reacción: 25. PROCEDIMIENTO A) 25oC En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo. 30 ó 37oC. Esperar 30 segundos.MICROTECNICA Emplear 20 ul de muestra y 1. restando cada lectura de la anterior y promediando los valores.00 (*) Calculados Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.Espectrofotómetro. estando el sustrato en condiciones.

...............O.. c) Rango dinámico: el rango útil de lectura se extiende hasta 0. extinción molar (∑340) ...............C........ repetir la determinación con muestra diluida 1/5 ó 1/10 con solución fisiológica...... . Riobamba 2944 2000 .100 D. luz espuria ≤ 0.... 380 nm Tipo de reacción ..O... 1521303)..... BIBLIOGRAFIA . Si la ∆A/min es superior a 0..... Disp.......O..200 D........I..Nivel 438 U/l 683 U/l D................... Clin.......... PRESENTACION ....... Wiener lab. 57-61.....99 U/l C.......................... Biol... Nº: 3330/97 Cert............095 Coef........................200 D........Ann.S.... 60 segundos Absorbancia de blanco ...........ar Dir....A.. PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Longitud de onda primaria ... +5...........3 [l x mmol-1 x cm-1] Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso.......................... en espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366).. 6...: Viviana E........Societé Française de Biologie Clinique (SFBC) ..... 1990.....Rosario ...wiener-lab.............. 3rd ed... 2.................. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.3 x 20 ml (Cód......Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S..... 40:160....Argentina http://www..000 D........... disminuye Temperatura de reacción . De acuerdo con la sensibilidad requerida..001.....................14 U/l +7. corrigiendo consecuentemente los resultados... Límite de absorbancia ........Sociedad Española de Química Clínica ..... .. > 0...... 340 nm Longitud de onda secundaria (bicromática) .. 1000 U/l Factor (paso de luz 1 cm) ..Comité Científico..... el mínimo cambio de actividad detectable será de 5 U/l (a 340 nm y a 25oC)...O..........................Young....S............ 1982.. 3 segundos Tiempo de retardo .... Clin.. .........5% y semiancho de banda ≤ 8 nm. Valor normal inferior .... (366 nm y 25oC).. D.. 1989...............17% b) Límite de detección: depende del espectrofotómetro empleado y de la longitud de onda..........O......... 2000 Rosario . 40 segundos Tiempo de lectura .......... 460 U/l Linealidad .................. AACC Press. 1:50 Tiempo de equilibrio ........... Téc........... 8..............V......700 D............. Comisión de Enzimas .. Nº: 2114/97 40 ................... reproducibilidad ± 2 nm..com....... ∆A/min (a 340 nm y 25oC). 1... con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor.17% 1.... (340-334 nm y 25oC) o 0......... 230 U/l Valor normal superior ..."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".....................S...Quim.................... para un ∆A/min de 0.............. cinética Dirección de la reacción ...... 37oC Relación muestra/reactivo ...

REACTIVOS NO PROVISTOS . FUNDAMENTOS DEL METODO La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. envolviendo el tubo con papel negro. obteniéndose valores de bilirrubina total falsamente aumentados. Rotular y fechar. por lo que la determinación de la bilirrubina en estos niños recién nacidos resulta sumamente importante.17 mol/l.Agua destilada. plasma o líquido amniótico a) Recolección: obtener suero o plasma de la manera usual.13 mol/l. debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción. para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. compuesto de degradación de la hemoglobina. MUESTRA Suero. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias. Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo. También es posible realizar la determinación en líquido amniótico.Bilirrubina Método colorimétrico para la determinación de bilirrubina directa y total en suero y otros líquidos biológicos SIGNIFICACION CLINICA La bilirrubina. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La presencia de sedimento y/o cambio de coloración de los reactivos. De forma tal que. pueden ser indicio de deterioro de los mismos. REACTIVOS PROVISTOS Desarrollador: solución acuosa de benzoato de cafeína 0. INSTRUCCIONES PARA SU USO Desarrollador: listo para usar. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina sérica con el consecuente riesgo de difusión del pigmento al sistema nervioso central. Reactivo Sulfanílico: listo para usar. la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reacción. Nitrito de Sodio: solución de nitrito de sodio 0. Proteger de la luz natural o artificial. La eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido es una patología provocada por incompatibilidad maternofetal en la que se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. Diazorreactivo: en refrigerador (2-10oC) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3 meses a partir de la fecha de su preparación. es captada por el hígado para su conjugación y excreción en la bilis.Bilirrubina Standard provisto separadamente por Wiener lab. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente (< 25oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Reactivo Sulfanílico: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento. .07 mol/l. el suero debe conservarse hasta 48 horas en el refrigerador (2-10oC) y la 41 . c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis moderada o intensa inhiben la reacción directa. tamponada y estabilizada. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. para efectuar la calibración periódica del equipo. debe usarse heparina para su obtención. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo. mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo Sulfanílico.

.5 ml 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión.5 ml 200 ul T 200 ml 2.2 ml Proceder de la misma manera que en la técnica I.38 respectivamente. de acuerdo a la severidad de la ictericia.sangre entera no más de 24 horas en refrigerador o 12 horas a temperatura ambiente.BRB directa El factor colorimétrico (f) debe calcularse con el Standard de Bilirrubina de Wiener lab.5 ml 0.Frasco de vidrio color caramelo. Sueros ictéricos: debe emplearse la técnica descripta pero con menores cantidades de muestra.5 ml 200 ul D 200 ml 2. Si se lee antes. llevando el aparato a cero con agua destilada. De tal forma.5 ml 0.Espectrofotómetro o fotocolorímetro.37. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . En dos tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco) y T (Total) colocar: B Muestra (líquido amniótico) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 1 ml 1.TECNICA PARA SUERO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco).Tiempo de reacción: 5 minutos . .Longitud de onda: 530 nm en espectrofotómetro o 520-550 nm en fotocolorímetro con filtro verde. en caso de ictericia moderada se usarán 50 ul de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren sólo 20 ul.TECNICA PARA LIQUIDO AMNIOTICO Se determina bilirrubina total. Luego de 5 minutos.B) x f Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total . CALCULO DE LOS RESULTADOS Bilirrubina total (mg/l) = (T . Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. Si se lee después. METODO DE CONTROL DE CALIDAD 42 .B) x f Bilirrubina directa (mg/l) = (D . habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. Multiplicar los resultados obtenidos por 3.Tubos de fotocolorímetro.Volumen final de reacción: 2. excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos.2 ml T 1 ml 1. CONDICIONES DE REACCION .79 y 9. Es por tal motivo que debe protegerse cuidadosamente. .Temperatura de reacción: temperatura ambiente . habrá sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre.Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados. . La acción de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra.9 ml PROCEDIMIENTO I. leer en espectrofotómetro a 530 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520-550 nm).Reloj o timer. II. . Dividir el resultado final por 5. El líquido amniótico es conveniente mantenerlo congelado hasta el momento de efectuar el ensayo.Volumen de muestra: 200 ul . D (Directa) y T (Total) colocar: B Muestra (suero) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 200 ml 2.

Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4. los niveles de bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad.5 mg/l la muerte fetal es inminente.7 mg/l el feto ya se encuentra afectado y tiene probablemente algún tipo de falla circulatoria. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. dependiendo del grado de inmadurez hepática.Recién nacidos: Nacidos a término Sangre de cordón Hasta las 24 hs Hasta las 48 hs Del 3º al 5º día 25 mg/l 60 mg/l 75 mg/l 120 mg/l Prematuros 80 mg/l 120 mg/l 240 mg/l Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. Si la cantidad de bilirrubina sobrepasa los 9. En los prematuros.7 mg/l sugieren la posibilidad de un feto afectado. VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina en suero o plasma .7 mg/l sólo se encuentran en presencia de eritroblastosis fetal. 43 .Standatrol S-E 2 niveles. Los niveles por encima de 2. mientras que entre 1 y 2. Bilirrubina en líquido amniótico Valores menores de 1 mg/l son considerados normales.Adultos: Directa: hasta 2 mg/l Total: hasta 10 mg/l .

.Ichida. La acción de la luz. 3rd ed. D. .Argentina http://www. Riobamba 2944 2000 .I.O’Brien.4% 4. Clin.1 mg/l 26.LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Watson. . J. J..C. .5347/98 44 . PRESENTACION Equipo para 200 determinaciones (Cód.S.Young. .ar Dir.Botwell.Clin. . T.S.com. .47 mg/l +1. Chem.Clin. Chim."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". M.Zaroda.45 mg/l C.62 mg/l +0. c) Recuperación: agregando cantidades conocidas de bilirrubina a distintos sueros. BIBLIOGRAFIA . AACC Press. 1120001). se obtuvo una recuperación entre 100 y 106%.7% 1. 7/6:603 (1961).1% b) Linealidad: la reacción es lineal hasta 150 mg/l.18 mg/l +0.7 mg/l D. se obtuvo lo siguiente: Bilirrubina directa Bilirrubina total Nivel 2. Wiener lab.5% 2. Path.A. es capaz de destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente.Clin.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. 45/1:70 (1966).“Laboratory manual of pediatric microbiochemical techniques”.0 mg/l 9.wiener-lab. D. Téc. .4a Ed. Nobuoka. D.Rosario . R. 1990. tanto sobre los sueros como sobre las soluciones standard.Am. Disp. H. 2000 Rosario . Harper & Row Pub . Acta 19/2:249 (1968). . Nº: 252/75 . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.8 mg/l 127. et al . 8..V.S. . (1968). Chem. 10/3:197 (1964). +0. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día.: Viviana E.

......1 g Glicina ... FUNDAMENTO Las diferentes hemoglobinas se separan por migrar a diferentes velocidades. 14.. Decolorar con 3-4 baños de solución decolorante.. Colorear durante 5 minutos.... 5) Solución de transparentización: Metanol ... 4) Solución deshidratante: Metanol puro.. en medio alcalino (pH= 8.. REACTIVOS 1) Solución buffer: Tris...... Las tiras secas pierden las dimensiones y las características del gel.. Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética... Operar rápidamente para evitar evaporaciones. queda en la HbA migrando juntas. La superficie de las tiras que es penetrable a las proteínas se reconoce porque es más opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro. 22. La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba... realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts..... Sembrar las muestras con el hemolizado obtenido (ver más adelante)........ mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades).. Eliminar el exceso de líquido secando entre 2 papeles de filtro... 14 ml Glicerol .......... Desconectar la corriente y retirar las tiras. 9..... Las tiras deben conservarse en posición vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%... 6.. 8... 1 ml 6) Solución disolvente: Ácido acético 80% Técnica: 1.. Transparentización: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos. La tira debe estar bien tiesa y plana.6).... 4.... Determinación cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solución disolvente y agitar...Separación electroforética de hemoglobina SOPORTE Acetato de celulosa gelatinizado.. 7...... Leer a 520 nm si se usó colorante Ponceau S..........6 g H2O destilada.5 g en 100 ml de ácido tricloroacético 5% (dosis para 20 tiras) 3) Solución decolorante: Ácido acético 5%.. 1000 ml 2) Solución colorante: Ponceau S: 0.... durante 90 minutos... 85 ml Ácido acético ..... Conectar la fuente de poder........... 5...... La HbA2 tiene una velocidad menor que la A. Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos 2... a continuación se las coloca en la solución 45 . En este medio la HbA migra hacia el ánodo. 3. hasta ver el fondo blanco de la tira....

El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatías: TIPO Normal Polo negativo Anhidrasas Carbónicas Recién nacido Anhidrasas Carbónicas Drepanocitosis homocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Drepanocitosis heterocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Hemoglobinopatía C homocigota Anhidrasas carbónicas Hemoglobinopatía C heterocigota Anhidrasas HbC Carbónicas β-talasemia heterocigota β-talasemia homocigota Doble Heterocigota S/C Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbC HbS Carbónicas HbA HbC HbA HbF HbA HbA2 Polo positivo HbA ACLARACIONES HbA 98% HbA2 2% HbF 90% HbA 10% HbA2 2% HbS 98% HbA < 50% HbS > 50% HbA2 2% HbC 98% HbA2 2% HbC > 50% HbA < 50% HbA2 entre 4-8% HbA HbA2 normal % de HbF y HbA. hasta la transparencia completa.transparentadora durante 1 minuto como mínimo. Se colocan luego en una placa de vidrio. variable según tipo de Th homocigota HbS 50% HbC 50% HbF HbA 46 . Así se conserva para leer en densitometría. eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos.

Se lava tres veces con solución fisiológica. Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm. Colocar en heladera (favorece la hemólisis). aunque se recomienda la heparina. 6. 4. 2. Se determina la concentración de hemoglobina en el bemolizado obtenido. Obtener 5 ml de sangre por punción venosa. 3. recoger con pipeta Pasteur el infranadante y filtrar. dejar 24 horas. mediante el método de la cianmetahemoglobina. agitar vigorosamente durante 1 minuto. se lleva la concentración hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada.PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO Técnica 1. 47 . se agrega un volumen de agua destilada igual al del paquete globular y 0. 5. desechando los sobrenadantes.8 ml de tolueno (rompe los glóbulos blancos). usando cualquier anticoagulante.

Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke
FUNDAMENTO La hemoglobina fetal (HbF o α2γ 2) es ácido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos. REACTIVOS 1. Alcohol etílico al 80% 2. Buffer de ácido cítrico, pH 3,4 Solución A: Ácido cítrico............................ 4,2 g Agua destilada......................... 100 ml Solución B: Citrato de sodio........................ 5,9 g Agua destilada......................... 100 ml Solución Buffer pH 3,4: Solución A ................ 84 ml Solución B................. 16 ml 3. Eritrosina o eosina al 0,1 % en agua. DESARROLLO 1. Extendidos de sangre secos de no más de una hora de obtención, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etílico al 80% 2. Lavado rápido con agua y secado. 3. Inmersión en una cápsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37°C un mínimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rápidamente en agua común y secar en posición vertical. 4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solución de eritrosina o eosina. Lavar con agua y secar. RESULTADOS Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras. El análisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hematíes coloreados e incoloros.

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DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA FETAL: METODO DE SINGER FUNDAMENTO Debido a la muy semejante movilidad de la hemoglobina normal (HbA) y la hemoglobina fetal (HbF), cuando usamos los métodos electroforéticos de rutina para el estudio de hemoglobinas, es necesario valerse de la propiedad de la HbF (y la Hb Bart( de ser resistentes a la desnaturalización en medio alcalino. REACTIVOS 1. Solución de hemoglobina (véase obtención de bemolizado) 2. OHNa 1/12 N (recién preparado) 3. Reactivo precipitante SO4(NH4)2 .............................. 38 g ClH 1N ..................................... 2,5 ml H2O destilada ........................... 100 ml TÉCNICA Se preparan tres tubos: • • • • Tubo 1: Blanco: 3,2 ml de OHNa 1/12 N, agregar 6,8 ml de reactivo precipitante y filtrar. Tubo 2: Hb 100: 5 ml de agua destilada, agregar 0,02 ml de la solución de hemoglobina Tubo 3: Hb álcali-resistente: 3,2 ml de oHNa 1/12 N, agregar 0,2 ml de solución de hemoglobina y disparar en el momento un crónometro, a los 60 segundos agregar 6,8 ml de reactivo precipitente, invertir varias veces y filtrar. Leer en un espectrofotómetro a 540 nm, llevar a cero con el tubo blanco (Tubo 1).

CÁLCULO % de Hb álcali-resistente = VALOR NORMAL Menos de 2%. DO tubo 3 x 20 DO tubo 2

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Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs
A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION a) Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2 % en salina fresca (véase más abajo el apartado C. Preparación de la suspensión globular al 2%). b) Agregar una gota de la suspensión globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn. c) Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A1, B y O al 2% d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. e) Leer primero los controles y luego los problemas microscópicamente en visor y microscópicamente. f) Scores de lectura: +++ un gran aglutinato ++± varios aglutinatos grandes ++ muchos aglutinatos pequeños +± pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo + aglutinatos visibles pero solo microscópicamente aglutinatos conteniendo muy pocas células tr trazas - negativo B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO a) Tomar una muestra de suero libre de hematíes. b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los siguientes hematíes: 1) hematíes A conocidos 2) hematíes B conocidos 3) hematíes del propio individuo 4) hematíes O conocidos c) Incubar 1 hora a ta o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. d) Leer primero los controles y luego los problemas , microscópicamente en visor y microscópicamente. C. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2% Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn. a) Llenar el tubo con solución fisiológica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. b) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución fisiológica. c) Tomar una gota de culot (50 µl) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la suspensión al 2%.

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b) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra. La lectura se hará microscópicamente con un visor y microscópicamente. F. c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm. d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. disparar el cronómetro. Agregar una gota de anti-A absorbido1 y mezclar bien con una varilla de punta fina. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA a) b) c) d) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn. E. Negativa: los hematíes (Rh-rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar aglutinación.D.1 Controles a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D c) Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB. Al terminar de mezclar. e) Proceda de la misma manera con los tubos controles. E. PRUEBA PARA DETECTAR Du 1 También se puede utilizar un monoclonal anti-A1 51 .2 Reacciones • • Positiva: los hematíes D(Rho) positivos permanecerán aglutinados al querer desprender el culot globular. Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto. Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados: Glóbulos rojos problema Anti A + + GR A + + Anti B + + GR B + + Anti AB + + + GR AB + + + Grupo ABO A B O AB Grupo ABO A B O AB Suero problema E.

dado que.Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti –D. Coloque dos gotas de suero anti –D(Rho) en un tubo de Kahn2.2 Controles utilizados Se utilizan tres controles para 1. Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en salina . Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C. F. El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparación del suero). Para seudoaglutinación Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du. se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados. Centrifugue y elimine el sobrenadante. es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti –D por suero de persona de grupo sanguíneo AB. desprenda suavemente el culot globular y lea. El tercer control. Negativa: los hematíes Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspenderán y no aglutinarán. 2 La detección de Du también se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du. 5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana. en tales hematíes el factor D(Rho) es mas reactivo. G. Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con el antígeno E(rh”) presente .1 Reacciones • • Positiva: los hematíes Du (Rhou) positivos permanecerán aglutinados luego de intentar desprender el culot globular. 1) 2) 3) 4) F. La lectura se hará macro y microscópicamente. Probar la bondad del suero 2. Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs. Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda falsear los resultados. 6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS. Comprobar su especificidad 3. 52 .

Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica. 2) Centrifugar. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm.2 4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 53 .1 Prueba de Coombs indirecta 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes de grupo O Rh+ al 2%. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%. G. 9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana.G. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente.2 8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de 1 hora a 37 °C. 7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F. 5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana.2 Prueba de Coombs directa 6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%. eliminando completamente el sobrenadante en el último lavado. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. 3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.

Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS) . Por este motivo. Anti-B o Anti-A. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA. dextrosa) CPD (citrato.Placas . También demostró que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee. La ausencia de aglutinación en todos los casos. fosfato.Tubos de hemólisis . dextrosa) o CPDA-1 (citrato. citrato. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Anti-B o Anti A. REACTIVOS PROVISTOS Anti-A. con o sin anticoagulante.Albúmina Bovina 30% de Wiener lab. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .B Monoclonal Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en A. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS) . Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. ACD (ácido cítrico. Las muestras recogidas con ACD. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. implica grupo O. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional.B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón. B. AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A. fosfato. Si se utilizó heparina o EDTA. heparina. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A. o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos altamente reactivos en su superficie. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los demás ensayos pretransfusionales. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes. dextrosa.Solución fisiológica .Anti-A.B monoclonal. PROCEDIMIENTO 54 . deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. Si se emplean coágulos.Centrífuga . B.Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. adenina). Anti-B o Anti-A. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: .

Develop. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. Como control. .C. PBS o LISS. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. D. Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera. . 1443154). No debe producirse aglutinación. colorantes. 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías. S. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use”. Symp. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos. 1443153).Widman. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción positiva. France.Moore.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A.Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idéntico. .B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación. 9th Edition. . American Association of Blood Banks 1985. Anti-B: frasco x 10 ml (Cód. el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica. F.Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido. se coloca una gota de estas células con 2 gotas de solución fisiológica. París. BIBLIOGRAFIA . Biol. sobre todo en los prematuros. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cód. “Int.TECNICA EN TUBO (por sedimentación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A. resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la tipificación. Washington. Por esta razón deben extremarse los cuidados. 1983. II.En las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solución fisiológica. 2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Antisuero Anti-A + + +/Anti-B + + Anti-A. Chapter 8. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%.K. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. III. 1443152). Anti-B o Anti-A.Leucemias u otros desórdenes malignos.Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas. Anti-B o Anti-A. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones: .TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. I. . Standard 57:49-59. 55 .500 rpm. No debe emplearse microscopio. Anti-B o Anti-A. Observar aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. “Technical Manual”.B + + + + Grupo sanguíneo A B 0 AB Variants débiles del grupo A como Ax METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados.TECNICA EN TUBO (por centrifugación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A.B monoclonal colocada en una placa limpia. et al.

Téc.A. Disp.I.S. 2000 Rosario .ar Dir. Nº: 1073/89 (Anti-B) Disp. Nº: 1076/89 (Anti-A) Disp.Wiener lab.wiener-lab.B) 56 .com. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. Riobamba 2944 2000 . Nº: 1071/89 (Anti-A.C.Rosario .Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.: Viviana E.Argentina http://www.

ACD (ácido cítrico. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente: .Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente.Anti-D (Rho) monoclonal Reactivo para la detección de antígeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en el laboratorio de los anticuerpos anti-D.Solución fisiológica. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar. Sin embargo. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho).Placa de vidrio 57 . b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina. Si se utilizó heparina o EDTA. Cuando se sospecha esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. Las muestras recogidas con ACD.Centrífuga . es el antígeno D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO. fosfato. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro". ya sea por transfusión o durante el parto. Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. EDTA. adenina). dextrosa. c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. produciendo anti-D. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Dependiendo de la técnica que se emplee. Si se emplean coágulos. REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos. dextrosa). podrán ser necesarios: . citrato.Tubos de hemólisis . fosfato. CPD (citrato. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. . Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno. dextrosa) o CPDA-1 (citrato.

. American Association of Blood Banks. and Sanger. 3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos.Argentina 58 . PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. F. Exp.K. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. Oxford Blackwell Scientific Publications. . Ed. o en solución fisiológica. 3) 5) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. Washington D. luego centrifugar y volver a leer como se describió en 4). 1959.9 th..Widman. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. A. 1940. 43: 223. También puede emplearse sangre entera. 1443155). 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia.A. R..Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.500 rpm.J. 4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica.I.Rosario . 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. L. Riobamba 2944 2000 . 2000 Rosario . 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. o solución fisiológica.JAMA 169:696. o solución fisiológica. BIBLIOGRAFIA . 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. Las muestras que aún en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico). 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos.C.S.. 6) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente. K. centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. Unger. . 1985. Wiener lab. A. .TECNICA EN TUBO Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos. 4) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.6 th Ed. Biol. Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-50oC.“Technical Manual” . La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. III. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Chapter 9.Proc. pág.Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I.C. 1975.Race . Med. Wiener. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos sensibilizados. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.S.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos.. . 178. mezclar.Wiener. R. . Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos. . Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.R. descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las células luego de cada lavado. II.“Blood Groups in Man” . Soc.Landsteiner.

ar Dir.wiener-lab. Nº: 1074/89 59 . Téc.S. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.: Viviana E. Disp.http://www.com.

adenina). PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro". C3dg o C3d). FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b. 60 . . fosfato. con o sin anticoagulante. dextrosa) o CPDA-1 (citrato. citrato.Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar.Solución fisiológica.Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. REACTIVOS NO PROVISTOS . dextrosa) CPD (citrato. heparina. C3bi.Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. ACD (ácido cítrico. Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. MUESTRA Glóbulos rojos a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente.Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glóbulos rojos. siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prueba Antiglobulina Indirecta . fosfato. Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a antígenos del sistema Rh. dextrosa. .Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS).Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos.Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido. . Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica.Suero Anti-humano (poliespecífico) Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminación del mismo. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Identificación y titulación de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. . . . produce una aglutinación de los glóbulos rojos visible macroscópicamente. REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS). b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA.Fenotipo de glóbulos rojos. De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente: . . Prueba Antiglobulina Directa .

A. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas.Baño de agua a 37oC .Tiempo o temperatura de incubación inadecuados. Mourant. 2) Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS. III. 1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%. 7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados con IgG débiles.Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. 2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7) de la técnica I). Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: . PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód.Centrífuga .. 3) Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua.Lancet. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. Si se emplean coágulos. no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. 1) Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar. and Race. BIBLIOGRAFIA .c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Finalmente preparar con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%. Descartar completamente el sobrenadante luego del último lavado. R. 4) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. . Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. .R. 61 . R. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I). 1443156). 1) En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar. la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extracción).Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados. II. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles. . 6) Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente.Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados. Las muestras recogidas con ACD. 2) Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica). Si los glóbulos provienen de coágulos. . Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos.Tubos de hemólisis PROCEDIMIENTO I. 3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.Lavado inadecuado de las células.R. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . ii:15.500 rpm..Concentración inadecuada de glóbulos rojos.PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos. El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. 1945. Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS.E. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. . Si se utilizó heparina o EDTA. .Coombs.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal).A.

Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Disp.Widman. 1985. Téc.R. 26:225. and Race. 376.C. . . Wiener lab. J..E.Brit. Washington D.ar Dir.com.C. Mourant.“Technical Manual”.R. 1945. American Association of Blood Banks.Coombs. Nº: 2503/91 62 .Argentina http://www.wiener-lab.Rosario . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S. 2000 Rosario . .K.A.. pág.A. F. Riobamba 2944 2000 .: Viviana E. Exp. R. A.I. Path. R. 9th ed.

b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%. a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario). c) Incubar a la temperatura apropiada . colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos.1. b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O con dos gotas del suero a titular.1.1 Técnica básica de titulación A. el tipo de aglutinato es tr. b) En los tubos 2 al 10. e) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilución. si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16. numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla.Determinación de anticuerpos inmunes A. El grado de aglutinación se considerará según los scores anteriormente indicados. d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta.1. con aglutinación.2 Titulación a) Se toman 10 tubos de Kahn. el tipo de aglutinato es tr. Agitar la mezcla. TITULACIÓN DE ANTICUERPOS A. el tiempo requerido. el título se determinará promediando dicha dilución con la precedente. Por ejemplo.100 ml de solución fisiológica (SF). Preparación de diluciones madres. Luego se toman 0. d) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del suero.100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2. El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación ± . a) Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de hematíes a usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes. A.100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. 63 . el título será (16+8)/2=12. Con una pipeta Pasteur para cada dilución. Colocar 0. Si en la última dilución.300 ml de suero a titular en el tubo N°1. Homogeneizar y repetir la operación hasta completar las diluciones. colocar 0. c) Tomar 0.

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