UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS ASIGNATURA HEMATOLOGIA

Métodos del laboratorio hematológico
PRIMERA PARTE

Docentes

Dra. Nilda E. Fink Dra. María Elena Chiesa Dra. Ma. Alejandra Fernández Alberti Bioq. Fernando Ventimiglia Bioq. Mariana González Bioq. José Luis Casali

La Plata, 2007

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Contenido
Página Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa Descripción de los anticoagulantes usados en hematología Recuento de hematíes Hematocrito Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina Velocidad de sedimentación globular Recuento de reticulocitos Cuantificación de hierro sérico Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls Separación electroforética de hemoglobina Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs Determinación de anticuerpos inmunes 3 5 7 12 15 21 26 29 34 42 45 47 57

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4 . 5. Antes de iniciar la toma de muestra. En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más sangrado. localizándola visualmente y por palpación. Los recipientes que contienen algodón y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirán solamente al momento de usar. En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja. no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo. El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y. 12. limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol. 3. Elegir una vena bien visible en el antebrazo. 10. 14. Colocar el lazo y volver a palpar la vena. se retira el torniquete y luego la aguja. La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes. 2. los cuales se mantendrán puestos durante todo el procedimiento. Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene. 9. 13. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. 4. Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables. dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. LA AGUJA SE DESCARTARÁ EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN. Dejar secar perfectamente. tener todo el material preparado pero sin abrir. 6. Una vez identificada la vena. presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco. La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresión del músculo no mayor a 1 mm.Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa A) EN ADULTOS 1. 15. una vez manipulado. 8. indicarle al paciente que abra y cierre el puño para facilitar la extracción. 11. evitando hacer espuma. descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin. se le indica al paciente que abra la mano. Una vez realizada la toma de muestra. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba). Después de la toma. 7. se la colocará en la jeringa sin tocar con los dedos. controlando el correcto funcionamiento del émbolo.

en la zona del talón indicada en el dibujo adjunto.16. 2. se recomienda hacer la extracción del brazo como en adultos. B) EN NIÑOS 1. 4. pidiéndole a un adulto que colabore en mantener inmóvil al niño. En niños mayores de 6 meses. Desinfectar con un trozo de algodón embebido en alcohol. Antes de la extracción conviene calentar el talón frotándolo entre las manos para favorecer la irrigación de la zona. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante. NO REUTILIZARLOS NUEVAMENTE. 17. aclararlo en el registro de muestras. Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento. dejar evaporar y punzar con la lanceta. La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. En el caso de niños menores de 6 meses. 3. Las flechas indican los lugares de punción 5 . colocar una curita o apósito. en particular el brazo. se procederá a extraer la muestra del talón con una lanceta descartable. Secar la zona con un trozo de algodón seco y una vez que no haya sangrado.

Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares. posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C). C6H5O7Na3. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0.1-0. actúa impidiendo que el calcio se ionice. dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio.3 g/L de C6H5O7Na3. como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1. sin embargo .2H2O). especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1. Los anticoagulantes más utilizados son: • EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica. HEPARINA SÓDICA.5-2.2H2O posee un peso molecular relativo de 404.106 mol/l (31. el tamaño eritrocitario. 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares.Descripción de los anticoagulantes usados en Hematología Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares. no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria.0. El K2EDTA . ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro • • • 6 . HEPARINA DE LITIO. CITRATO TRISÓDICO. de sangre total. las tres sales afectan el tamaño del eritrocito.8+/-1. evitando así la coagulación. El citrato sódico se utiliza a una concentración de 0. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico.2 mg) de heparina por ml de sangre.1g. por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido. sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos.2 mg/ml. actuando mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca+ + ). es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin.

7 .volúmenes de sangre.9 g. H2O destilada 120 ml. La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0. Citrato disódico 2 g. Dextrosa 2 g.

Recuento de hematíes A) RECUENTO MANUAL Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. para lo cual se mide exactamente: Solución fisiológica o citratada: 3. se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeños.02 ml El recuento se realiza en la cámara de Neubauer cuyo esquema es el siguiente: El recuento de hematíes se realiza en el cuadrado central. como se muestra a continuación: 8 .8%. Líquido diluyente: solución fisiológica o citrato de sodio 3.98 ml Sangre (con pipeta automática): 0. Es un método poco usado debido al elevado error que presenta. La dilución empleada es de 1/200.

Considerando entonces. Falta de suficiente agitación de la sangre diluida. 3. Errores del operador al realizar el recuento. 1. sirven únicamente como límites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeños. sucia o mojada. 7. Coagulación parcial. no rígido. La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0. que el retículo tiene 400 cuadrados pequeños en total. Células mal distribuidas en el fondo de la cámara. Errores al efectuar los cálculos. D: Título de la dilución realizada (200). 4. luego de agitar adecuadamente en un agitador de rodillos. Causas de error en el recuento en cámara cuentaglóbulos El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%. Llenado incompleto de la cámara cuentaglóbulos. ST: Total de cuadrados pequeños en la superficie de 1 mm2 (400). o triples. el cual puede deberse a: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. TC: Total de cuadrados pequeños contados. Empleo de cubreobjetos deformable. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. Con la dilución indicada. Hemólisis. Cámara cuentaglóbulos mal ajustada. La cámara puede ser cargada con un capilar. 8. sucio o húmedo. evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente. 9 .Recuadro central: Las líneas reforzadas. FC: Factor de corrección de la profundidad. Se deben contar 5 de estos cuadrados.1 mm. para llevar a 1 mm3 (10). el cálculo que se debe hacer es el siguiente: N x D x FC x ST = nº de glóbulos rojos/mm3 TC Donde: N: número de eritrocitos contados. 6. 2. se carga la cámara y se cuentan los glóbulos rojos de los 80 cuadrados pequeños (zona sombreada). Utilización de material mal calibrado. 5.

las células sanguíneas así diluidas se hacen pasar por un orificio de apertura con un área prefijada. 3. para cada población celular que se quiera estudiar se deben seleccionar las condiciones para que sean analizadas sin error. 2. B. Si es muy elevada puede dañar las células y producir interferencias originadas por ruido electrotérmico. 10 . 2. Como los impulsos eléctricos que van a determinar el volumen celular se generan en el orificio de apertura del sistema. Es importante realizar periódicamente una limpieza de este orificio. los aparatos totalmente automatizados sólo requieren que se les suministre la muestra obtenida en condiciones apropiadas (por ejemplo: con el anticoagulante adecuado). Por dentro y fuera del orificio se disponen electrodos que establecen una diferencia de potencial. La intensidad de corriente entre ambos electrodos: debe ser lo suficientemente sensible para detectar la resistencia que genera la partícula cuando atraviesa el orificio. Dispersión de luz o campo oscuro.B) RECUENTO AUTOMATIZADO La automatización ha contribuido de manera decisiva al aumento de la rapidez y la fiabilidad del recuento de las células sanguíneas. La concentración de la suspensión analizada: debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia. como por ejemplo diluciones de la muestra antes de ser procesada y. La sangre total es diluida en una solución de conductividad estable. por lo general poseen un monitor de visualización que permite observar su permeabilidad durante el recuento. Este método tiene algunas limitaciones.1 Método de la impedancia o de la resistencia eléctrica Es el más empleado en los autoanalizadores hematológicos. Existen distintos tipos de instrumentos: los semiautomatizados que requieren algunos pasos previos. Los sistemas de recuento celular por estos medios se basan en la medida del tamaño u otras propiedades físicas de las células suspendidas en medio líquido de acuerdo con uno de los dos principios siguientes: 1. Las condiciones más importantes que deben tenerse en cuenta son: 1. es posible determinar también el volumen celular. El número de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular y como la amplitud del impulso es directamente proporcional al tamaño de la célula. que varias células atraviesen el orificio al mismo tiempo. es decir. se genera una resistencia entre ambos electrodos que se registra como un impulso. Cuando una célula pasa a través del orificio. Debe ser perfectamente permeable. Impedancia o resistencia eléctrica. Se basa en la propiedad de las células sanguíneas de no conducir la electricidad. El diámetro del orificio de apertura: debe estar en relación al tamaño de las partículas que se analizan.

1x1012/L . 3.3x1012/L 4. 4. las células se someten a tinciones citoquímicas se pueden detectar midiendo la intensidad de dicha reacción los diferentes tipos de leucocitos.5. 2. 1. pero puede incrementarse por: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración.5.2 Método de dispersión de luz Se analiza la dispersión de luz producida por las células desde dos dimensiones gracias a sensores ubicados en ángulos diferentes. b) Presencia de agregados celulares a nivel del orificio de recuento. cuando se realiza en óptimas condiciones. VALORES DE REFERENCIA Edad Recién nacidos Niños (2-12 años) Adultos jóvenes (12-18 años) Adultos jóvenes (19-60 años) Sexo ambos ambos mujeres hombres mujeres hombres Intervalo de referencia 4. Presencia de partículas extrañas en el diluyente.2x1012/L 4.9x1012/L D) INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 11 . Coagulación parcial. Las células se hacen pasar individualmente a lo largo de una cámara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz que puede ser halógena o láser. e) Presencia de microburbujas.1x1012/L . será analizada por los sensores.7x1012/L .5.6.5x1012/L .5. d) Dilución incorrecta de la muestra por el liquido diluyente. Si además. el error debido al propio método de recuento electrónico. g) Presencia de interferencias electrónicas y averías de los componentes electrónicos del instrumento. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. Defectos en el sistema electrónico de recuento: a) Lisis incompleta de los eritrocitos en el orificio de leucocitos.B.5. proyectada sobre un campo oscuro. C. f) Contaminación por arrastre de un especimen con el siguiente. Cada vez que una célula se interpone en el haz de luz se produce una sombra que. Hemólisis. suele ser inferior al 1%. Uso de un diluyente incorrecto. c) Obstrucción de los capilares u orificios de recuento. En general.1x1012/L 4.3x1012/L 4. Causas de error en el recuento automatizado Con el empleo de métodos automatizados se puede cometer grandes errores si se olvida el control periódico y el calibrado diario de los instrumentos. que son contadas como células.6x1012/L .3x1012/L 4. Estos sistemas permiten medir la concentración y el volumen celulares.0x1012/L .

El descenso en la concentración de eritrocitos en la sangre se acompaña siempre de una disminución en la concentración de hemoglobina (anemia) y puede deberse a diferentes causas como las hemorragias. la cual puede acompañarse de microcitosis como en la talasemia. se habla de seudopoliglobulia. 12 .Un aumento de la concentración de eritrocitos con contenido hemoglobínico normal suele acompañarse de un aumento de la concentración de hemoglobina y recibe el nombre de poliglobulia. Cuando el aumento de la concentración de eritrocitos va acompañado de una disminución de la hemoglobina. la hemólisis o fallas en su formación a nivel de la medula ósea.

Por ej. Aunque también puede emplearse un tubo de Wintrobe (macrométodo). obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión. Tanto el Hto. mientras que el aumento lo es de poliglobulia. En la actualidad. por lo que es siempre algo inferior (0. el Hto. son un buen parámetro del estado de la serie eritroide. El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo). un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración. tubo de Wintrobe con diámetro interno de 3mm .000 r.1 Macrométodo (macrohematocrito) Utiliza 0. un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia. dentro del contexto del hemograma automatizado.p. Así. entre sus factores de error está el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura. este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisión.6 ml de sangre entera anticoagulada con EDTA. A) METODOS MANUALES A. Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas. Centrifugamos durante 30 minutos a 2. un descenso del Hto es indicativo de anemia.. barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. que corresponde a una fracción de la longitud original de la columna sanguínea (100 mm). todos los autoanalizadores hematológicos suministran.2-0. Ambos métodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la acción de una fuerza centrífuga. El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. Por ello. La lectura del resultado se realiza extrayendo los tubos de la centrífuga y valorando la altura en milímetros de la columna eritrocitaria. puede ser normal o alto.Hematocrito DEFINICION El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre.3 %). Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina.m.000-3. es una técnica sencilla. expresado como porcentaje. aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. Debe excluirse la columna de leucocitos y plaquetas. 13 .

Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7. muy sencilla y poderse realizar en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo. Heparinizados o no. provoca que el sedimento de hematíes vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal. Se centrifugan durante cinco minutos a 12. Tan pronto se detiene la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. El llenado de los tubos se realiza por capilaridad. que nos darán el resultado directamente. favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. METODO AUTOMATIZADO: CONTADORES HEMATOLOGICOS El método automático de determinación se basa en el cálculo matemático a partir del Volumen Corpuscular Medio (VCM) y el número de hematíes.000 rpm. En muestras de sangre venosa. Causas de error • • • • • Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor.x x : hematocrito en tanto por ciento A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0. o con una regla milimetrada. B. El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota. La lectura no inmediata de los capilares. dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Si se utiliza sangre capilar. el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentración. de longitud por 1mm. aplicando la siguiente regla de tres: A------. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito. por necesitar muy poca cantidad de sangre. Hto = n° de hematíes x VCM 14 .5 cm. de diámetro interno. se desechará la primera gota después de la punción. Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 µl).2 Micrométodo (microhematocrito) Es una técnica muy utilizada.100 B------. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada.A. al perderse mayor proporción de células que de plasma. produce una mezcla con los líquidos tisulares que provoca hemodilución.01.

38 ± 0.54 ± 0.05 0.VALORES DE REFERENCIA ( x ± 2 DE) El valor de Hto varía con la edad y el sexo.05 0.1 0.05 15 .05 0. Edad y sexo Recién Nacidos Niños (hasta 10 años) Mujeres (18-50 años) Embarazadas Hombres (18-50 años) Hematocrito % 54 ± 10 38 ± 5 42 ± 5 39 ± 5 45 ± 5 Fracción 0.39 ± 0.45 ± 0.42 ± 0.

6. se transforman en HiCN según el siguiente proceso: Hemoglobina + Ferricianuro potásico → metahemoglobina Metahemoglobina + Cianuro potásico → cianmetahemoglobina MATERIAL 1. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina. de forma que aquella se completa en 3 min.4) Ferricianuro potásico [K3 Fe(CN) 6] Cianuro potásico [CNK] Fosfato monopotásico [KH2PO4] Detergente no iónico* Agua destilada hasta 200 mg 50 mg 140 mg 1 ml 1000 ml Detergentes no iónicos: Tritón X-100. Pipetas automáticas: de 20 µl. 5. ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7. excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa. Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 ml. 4. Quolac Nic 218.Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina FUNDAMENTO Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN). 16 . Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1. que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración). preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) 2. Tubos: 12 x 100 mm. Este reactivo debe tener un color amarillo pálido. Nonidet/40. Todo patrón de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN. Nonic 218. Los distintos compuestos de hemoglobina. 7. El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la transformación de la hemoglobina en HiCN.5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). Reactivo de Cianmetahemoglobina: Composición (pH 7-7. Puede emplearse sangre capilar. 3. Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo). Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados periódicamente mediante la solución patrón de HiCN.4. debidamente calibradas.

según el lote y el instrumento de lectura utilizados.458) y el coeficiente de extinción (44. es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibración (ver más adelante). Este patrón.404. Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio. 8. 7. El cociente A540/A504 oscila generalmente entre 1.251. es una solución muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y características fisicoquímicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64. 3. 2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión del tubo 20 veces..0) de la hemoglobina ( por ej. Conectar el espectrofotómetro. Patrón primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarización y el control de calidad.62.1). si la dilución ha sido de 200 veces. 5. se efectuará el espectro de absorción de la solución de referencia internacional y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig. El patrón primario de HiCN se suministra en ampollas cerradas al vacío que contienen 10 ml de una solución de HiCN correspondiente a una concentración de hemoglobina entre 550 y 850 mg/l. 6. significa que dicha solución patrón posee la misma absorbancia que la de una solución de hemoglobina de 143 g/l. Por otro lado se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuación: 1. METODO Por un lado. La concentración de hemoglobina también puede calcularse aplicando la siguiente fórmula: 17 . utilizando agua destilada como blanco. Agitar el tubo mediante inversión ( 4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina. si la sangre total se ha diluido 250 veces.8 mg de hierro hemoglobínico por litro a 540 nm). o de 114 g/l.El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendría una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimétrica. Al realizar esta operación.1 . El patrón primario posee un espectro de absorción característico con un pico de máxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexión a 504 nm.8.248 y 0. donde también se incluye la curva del reactivo. Mediante la micropipeta añadir 20 µl de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. la absorbancia de una solución que contenga 4 x 55. La curva de longitud de onda versus A desde λ=750 nm a λ=460 nm se observa en la Fig. 4. La concentración exacta de hemoglobina de cada lote se indica siempre en la ampolla. y a 504 nm entre 0.400 y 0. El valor de la A a 540 nm varía entre 0. Leer la A de la solución a 540 nm. si en el frasco se indica una concentración de 572 mg/l. Así.60 y 1.

Reactivo de Drabkin Volumen Dilución Hb Tubo (modificado) final (ml) (g/l) (g/l)* (ml) 1 3.5 3 1:2 72 3 1.5 3 1:6 24 5 0 3. La concentración de hemoglobina en milimoles por litro de sangre (mmol/l) puede calcularse multiplicando el valor en g/l por 0.0 3 1:3 48 4 0.5 1. Finalmente. se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene sólo reactivo (tubo 5) y se ajusta la A (100% de transmitancia). ELABORACION DE LA CURVA DE CALIBRACION La gráfica de calibración tiene como finalidad calibrar el espectrofotómetro para una lectura determinada calculando la corrección existente entre los valores de A leídos en el aparato y los correspondientes valores de concentración de hemoglobina. Una vez preparadas las soluciones patrón.Hemoglobina (g/l)= A540 (muestra) A540 (patrón) x HiCN patrón (mg/l x F 1000 Siendo A= absorbancia F= factor de dilución de la sangre total en el reactivo de Van Kampen y Zylstra (251). 18 . Patrón de referencia de HiCN (ml) La concentración de hemoglobina correspondiente a cada tubo se determina a partir del grado de dilución y del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN. 2).0 3 0 0 * El valor de esta concentración dependerá del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN que se emplee en el Trabajo Práctico.621. Luego. Para trazar este gráfico se preparan 5 soluciones de concentración de HiCN conocida y decreciente a partir del patrón de HiCN mediante diluciones sucesivas en reactivo de cianmetahemoglobina (véase tabla 1).5 2.0 2. la relación entre los valores de A obtenidos y los correspondientes de concentración de hemoglobina se representan en un gráfico con los valores de A en las coordenadas y la concentración de hemoglobina en las abscisas (Fig.0 0 3 0 145 2 1. partiendo de la solución de HiCN más diluida (tubo 5) se leen las restantes soluciones patrón.

Errores en la obtención del espécimen de sangre: Errores de extracción 1. lo que produce transformación de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y una oxidación parcial de la Hb. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN: Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido 1. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (>50 x 109/l). Cubetas sucias o deterioradas 3. con lo que los valores de concentración de Hb obtenidos son inferiores a los reales. No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo 2. Soluciones turbias de HiCN Errores en la conservación del reactivo: 1. 19 . Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formación exclusiva de metahemoglobina. en vez de HiCN. Empleo de anticoagulantes no recomendados 2. 2.Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. la mayoría de las veces los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen. Congelación del reactivo. No obstante. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la Hb en HiCN Errores de la determinación: 1. Coagulación parcial de la sangre Errores de la dilución: Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o húmedas 1. Empleo de instrumentos no calibrados 2.

Espectro de absorción de la solución de HiCN y del reactivo usado 20 .

21 .Curva de calibración elaborada a partir de una solución de cianmetahemoglobina de concentración conocida.

polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia. Viscosidad del plasma. La etapa más importante es la primera o de aglutinación. linfomas y mieloma múltiple). Desde el punto de vista físico. MECANISMO El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado. ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. 22 . VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea. el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR. Temperatura. este fenómeno depende de los siguientes factores: a. Así. b. pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células. c. más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa. y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. d. Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico.Velocidad de sedimentación globular FUNDAMENTO El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo. 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante. Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad η a una velocidad v: R = 6ηvr La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas". por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin. Tamaño de los G Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma. cuanto más pequeños sean los agregados. como se mencionó más arriba. Dado que. éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.

La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones de albúmina. Sin embargo. el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas.La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. METODOLOGIA Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el método de Wintrobe. Ambos métodos poseen limitaciones. puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. y un bajo hematocrito causa un aumento no específico de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre los agregados en sedimentación. la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH). Estos sistemas. Durante los últimos años. se diferencian de éste por su carácter cerrado (recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisión del llenado de las pipetas. El método de Wintrobe. Así. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. globulinas y fibrinógeno. como es la necesidad de prediluir la sangre. aunque reproducen exactamente el método de Westergren. MÉTODO DE WESTERGREN Es el método de referencia para medir la VSG. lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. De acuerdo con este mecanismo. Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación entre el plasma y los GR en la muestra. mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta. El método de Westergren es menos sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y así puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening. lo que explica que estas células se mantengan separadas. han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable. El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias. las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. Tradicionalmente. por el otro lado. 23 . pero no resultaron confiables. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina. continua siendo un método poco reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar. La albúmina retarda la VSG.

A. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre. La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solución de citrato de sodio. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1°.15 mm.A.05 mm) todo a lo largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. se mezcla por inversión repetidas veces. y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad.5 mm y de un diámetro de 2. Algunos plásticos resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de taponamiento. sin exposición a la luz del sol directa.2 Tubo de sedimentación Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1. A. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente. 24 . por ejemplo 2 ml de sangre en 0. Si utiliza citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7. manteniéndolo exactamente 60 min. evitando contaminación con materiales utilizados para la higiene de la piel. si es mantenida a 4°C. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países. los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. B.2H2O) prepare una solución acuosa de 32. El nivel de la sangre se ajusta a cero.1 Anticoagulante Citrato trisódico 109 mM en solución acuosa. C) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente. La misma debe estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en ella. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza.5 ml de anticoagulante. libre de vibraciones y corrientes de aire. Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las especificaciones. El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0. TÉCNICA B) La sangre se obtiene por punción venosa.3 Gradillas Las gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición vertical inmóvil. Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. MATERIALES. A. D) El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25°C).08 g/l. o dentro de las 6 hs.55 + 0.

E) Una vez transcurrido el tiempo. corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora). se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. el ciclo menstrual. expresado en mm. 25 . Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. contraconceptivos orales. El valor de esta distancia. C. Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas. han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica. INTERPRETACION DE RESULTADOS Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia). muy utilizadas anteriormente. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos. etc. y también en el embarazo normal y el puerperio. por lo que no se recomienda su empleo. y las medicaciones (corticosteroides. Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs. VALORES DE REFERENCIA EDAD (años) Niños mayores y jóvenes Hombres adultos Mujeres adultas 0-15 17-50 51-60 61-70 17-50 51-60 61-70 X + 2 DE 5 + 10 4+3 6+3 6+4 6+3 9+5 10 + 5 Límite superior de la normalidad 15 10 12 14 12 19 20 Factores técnicos capaces de modificar la VSG Causas de aumento • Desviación de verticalidad de la pipeta • Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta • Elevación de la temperatura ambiente • Dilución de la sangre • Causas de disminución: • Reducción del diámetro de la pipeta • Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido) • Cambio de anticoagulante D.

es inusual obtener falsos negativos. etc. hipofibrinogenemia.La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia.). y ocasionalmente sin causa aparente. un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgánica. anormalidades de GR (hemoglobinopatías. 26 . anemia falciforme. defectos cardíacos congestivos. esferocitosis hereditaria. Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG. por ende.

En caso de valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solución colorante. El método manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variación >20%). dentro de las 24 primeras horas de la extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene a 4º C. El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA)y a ser posible. Cuando una anemia se acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa. Tinción vital y microscopio óptico. una vez ya en la sangre periférica. La suspensión sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. Su tamaño es el de los demás hematíes y se caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando un retículo granulofilamentoso observable al ser teñido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. aproximadamente. lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a terapéuticas agresivas. Citometría de flujo. una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersión (x1000). existen en la sangre en una proporción de cinco a diez por mil hematíes. mientras que cuando el número es normal o disminuido se denomina arregenerativa. El recuento se efectúa contando en donde los eritrocitos estén distribuidos homogéneamente. siendo 100-125 el número óptimo de hematíes por campo de los cuales distinguimos cuales son 27 . Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida.. 2. Es necesario realizar el recuento sobre un mínimo de 1000 eritrocitos. MÉTODO DE LA TINCIÓN VITAL (MÉTODO DE REFERENCIA) Este método usa como colorante el azul de metileno nuevo: 1 g cada 100 ml de solución citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de ClNa 9 g/L). La cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula. el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción.Recuento de reticulocitos Los reticulocitos. Mediante una pipeta Pasteur se añaden a un tubo de hemólisis tres gotas de solución colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. Transcurrido este tiempo. los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3 días y terminan su maduración en 24 horas. El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. pero sobretodo a los errores de índole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito. En condiciones normales. eritrocitos inmaduros. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. se toma una pequeña gota de la suspensión y se extiende sobre un portaobjetos.

25 0. Este fenómeno se caracteriza por la aparición en el examen morfológico de la extensión de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y tonalidad azulada (policromasia) Existe una relación inversa.15 150 133 117 110 83 66 50 1 2 5 10 15 20 30 1 1. En caso de anemia intensa.5 10 3 días 10 . La mezcla sangre/colorante se incubará durante 15 minutos a 37º C.8 4 7 8. que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la médula a la sangre periférica. Este valor será valido si se trata de una concentración normal de eritrocitos en sangre total. cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la anemia.35 0. el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la siguiente fórmula: Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto del paciente Hto normal (El hematocrito normal es el que le corresponde según edad y sexo). siendo el cien porciento el número total de hematíes contado.40 0. y un acortamiento de su período de maduración intramedular. el número de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneración eritroblástica. aproximadamente lineal. lo que supone un aumento del período de maduración periférica. mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética (anemia arregenerativa) Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia Hematocrito Niveles de Hemoglobina (g/L) Recuento de reticulocitos (%) Recuento de reticulocitos corregido (%) Tiempo de maduración estimado Índice de reticulocitos OTRA TECNICA Utiliza como colorante Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el método de referencia. Ello obedece a que la anemia se acompaña siempre de un estímulo eritropoyético compensador. De esta forma puede calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente: IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente Período de maduración en días x Hto normal Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia regenerativa). entre el hematocrito y el período de maduración periférica de los reticulocitos. RECUENTO AUTOMATIZADO 28 0.45 0. Luego de este tiempo se realizará el extendido y se realiza el recuento como se indicó antes.30 0.20 0. Por ello.3 9 10 ± 1 día 1 2 5 5 ± 2 día 7.reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje.

0 (4-19 años) 0.Estos equipos realizan un recuento muy fiable de reticulocitos a partir de sangre total. mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubación previa y el análisis se realiza directamente.2. En los equipos semiautomáticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitución del criterio morfológico inherente al método visual por el análisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante citometría de flujo y luz láser.2-6. Para la tinción del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o Auramina.2.5-2.5 0.8 Valor absoluto (x109 /L) 110-330) 25-89 25-86 32-97 Recién nacido (sangre de cordón) Niños y adultos jóvenes de 4 a 19 años Adultos (20-50 años) Mujeres Hombres Variaciones patológicas Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Período neonatal Anemias hemolíticas Anemias posthemorrágicas Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula ósea) Mielofibrosis idiopática 29 .2-2.2 0. VALORES DE REFERENCIA Valor relativo (%) 3.

Tubos de Kahn. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimétricamente según la técnica de Fer-color o Fer-color AA. La actividad fisiológica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijación de hierro (TIBC). El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitación con carbonato de magnesio. .Agua destilada. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . se determina por su actividad fisiológica de captar Fe (III) a pH mayor que 7. REACTIVOS PROVISTOS Solución saturante: solución estabilizada de Fe (III). y ferropénicas en general.) en las hepatopatías crónicas. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Disminuye en cambio en la hemocromatosis. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Adsorbente: listo para usar. FUNDAMENTOS DEL METODO La transferrina o proteína transportadora específica del hierro. en insuficiencias hepáticas y fisiológicamente en los últimos meses del embarazo. y en las grandes pérdidas proteicas del síndrome nefrótico. neoplásicas. INSTRUCCIONES PARA SU USO Solución saturante: lista para usar. etc. Adsorbente: carbonato de magnesio granulado. REACTIVOS NO PROVISTOS . En el individuo normal sólo la tercera parte de la transferían se satura con hierro. en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas. CONDICIONES DE REACCION 30 . La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que está saturada. . nefropáticas. Su función es captar el hierro de los sitios de absorción (mucosa intestinal) o depósito (sistema retículo endotelial) y llevarlo a los órganos hematopoyéticos donde es utilizado. el hierro circula como Fe (III) unido a una proteína transportadora específica: la transferrina o siderofilina.Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. MUESTRA Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. Adsorbente: el frasco debe volver a taparse inmediatamente después de retirar las porciones necesarias para el momento. La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrágicas. estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte.2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab.Cuantificación de hierro sérico Fer-color Transferrina Método colorimétrico para la determinación de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) del suero SIGNIFICACION CLINICA En el organismo humano.

multiplicando por dos el resultado final. 56/4:543 (1971).29% 5. . A. .Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. Path.S.C. no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos.. 4/4:621 (1971). b) Colorimetría: seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA. PROCEDIMIENTO a) Saturación de la transferrina: en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solución saturante. 1492002).p. . +23. por la dilución del suero.Buenos Aires (1975). y Albarracín.m. 3rd ed. puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml.S. Transferrina y Porcentaje de Saturación de la Transferrina. Olguín de Mariani..Rojkín. Por lo tanto. Además. La agitación insuficiente producirá valores falsamente aumentados de Transferrina. Clin.V. B. Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente. Biochem.Zak. 8..H. .Young. Epstein. G. Baginski. Toxicol. Clin. VALORES DE REFERENCIA La literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturación de la Transferrina en personas normales: Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl.Clin.2 ug/dl +28. 31 . y Wiener.III Congreso Argentino de Bioquímica . 1990. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.M. En ese caso se informan tres valores: Hierro Sérico. M.. La concentración de Fe (III) de la Solución saturante es 10 veces mayor que la del Standard. La agitación deberá ser vigorosa y en sentido longitudinal. M. Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente. Drappo. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes datos: Nivel 280 ug/dl 560 ug/dl D.000-4. AACC Press.S. Saturación de la Transferrina: 20-55%.Dixon. BIBLIOGRAFIA . 10/5:127 (1973). comenzar con la Saturación de la Transferrina 30 minutos antes. . Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados.S. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. que se calcula de la siguiente manera: Hierro sérico (ug/dl) Transferían (ug/dl) Saturación % = x 100 Si se desea efectuar simultáneamente la determinación de hierro sérico para el cálculo del Porcentaje de Saturación.16% PRESENTACION Reactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) (Cód. hasta obtener sobrenadante límpido o con la opalescencia propia del suero. J.Ann.I. Habitualmente se realiza la determinación de hierro sérico juntamente con la de transferrina."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas y efectuar los cálculos de la misma manera que en la determinación de hierro sérico. como la medida exacta de esta solución no es crítica.9 ug/dl C. L. K. Centrifugar 10-15 minutos a 3. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. .Am.. E.. Wiener lab. E. . Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC. .000 r. D.

220/00 32 . Disp.Rosario .ar Dir.Argentina http://www.2000 Rosario . Riobamba 2944 2000 .: Viviana E. Nº: 1287/77 .A. Téc.C.com.wiener-lab.I. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.

formando parte de la hemoglobina. Reductor: ampolla autorrompible conteniendo ácido mercaptoacético al 70 %. Antes de usar llevar a 18-30oC. contiene hierro en su grupo hemo. y otras veces a desórdenes caracterizados por una síntesis defectuosa de hemoglobina o fenómenos hemolíticos. sexo. Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato.Fer-color Método colorimétrico para la determinación de hierro sérico sin desproteinización SIGNIFICACIÓN CLINICA El hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos. la transferrina. A veces se asocian a terapia transfusional. indican contaminaciones ocasionales (agua. debida a hernia de hiato. úlceras gástricas o duodenales. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. material de vidrio. La mioglobina. 33 . Un aumento en el valor de los Blancos indicará una contaminación con hierro. que se mide a 560 nm. hábitos alimenticios y actividad eritropoyética). FUNDAMENTOS DEL METODO El hierro sérico se libera de su unión con su proteína transportadora específica. Buffer succinato: solución de succinato 0. edad. piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta. Standard: listo para usar. Ocurre con frecuencia en mujeres. Standard: solución de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl. en buffer succinato de pH 3. etc. particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto. bazo. a veces imperceptible. La anemia por pérdida de hierro representa uno de los trastornos orgánicos más frecuentemente encontrados en la clínica médica. médula ósea y parénquima hepático. y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las células del sistema reticuloendotelial de hígado. y carcinomas de estómago y colon. MUESTRA Suero a) Recolección: debe usarse únicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reacción. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".25 mol/l para pH 3. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. Posteriormente reacciona con el reactivo de color. es la pérdida de sangre a través del tracto gastrointestinal. el ácido mercaptoacético. vertiéndolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversión.7. Anotar en el rótulo la fecha de preparación. La otra causa más común de anemia ferropénica. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo PBTS: listo para usar. Buffer/Reductor: en refrigerador (2-10oC) es estable durante un año a partir de la fecha de su preparación. Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas. Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia.7 y en presencia de un reductor. pigmento más importante de las células musculares. b) Aditivos: no se requieren. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de mañana) ya que las fluctuaciones fisiológicas son significativas durante el día. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Variaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard.). REACTIVOS PROVISTOS Reactivo PBTS: solución estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l.

C.2%. El Blanco de Reactivos. es indicio de contaminación grosera de los reactivos. si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0..Valores de Blanco aceptables: la determinación de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos. b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alícuotas de un mismo suero.150 D.a. .I. . .Clin.Tiempo de reacción: 10 minutos ..O.Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cód. se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0. el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemólisis. .. se recuperó entre 90 y 103%. G. Clin. 3rd ed. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando la misma muestra en 10 días diferentes. Caso contrario. . debiendo ser además. . Path.Volumen de muestra: 500 ul . M. S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Agua bidestilada Standard Suero 500 ul S 500 ul D 500 ul 34 . AACC Press. . Efectuar este control periódicamente.Espectrofotómetro o fotocolorímetro. 10-15%. . A. Secar el material preferentemente a no más de 80°C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plásticos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). 4/4:621 (1971).Zak. L..150 D.5 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco de Reactivos). E. los cuales deberán desecharse.Volumen total de reacción: 2. . B.Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro.Rojkín. E. Olguín de Mariani. A. hiperlipemia.S. 56/4:543 (1971). no debe ser superior a 0. CONDICIONES DE REACCION . para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.Ann.Young. 1492001). para un nivel de Fe sérico de 129 ug/dl. Clin. Epstein. Toxicol. Biochem.Dixon. K.Temperatura de reacción: temperatura ambiente . Y Albarracín. . C. despreciable la contribución del agua en dicho Blanco.H.. ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones.5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2.M.Tubos de fotocolorímetro. . . LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO . Drappo. D.S."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". Baginski. iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl. Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinación de hierro.III Congreso Argentino de Bioquímica Buenos Aires (1975). No invertir para evitar contaminaciones. Por otra parte.02 uOhms). L. Para controlar esto último. J.S. c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 500 ug/dl. M. 10/5:127 (1973).Longitud de onda: 560 nm en espectrofotómetro o 540-560 nm en fotocolorímetro con filtro verde. y Wiener. se obtuvo un coeficiente de variación del 4. eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro. .Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla o por agitación suave.Am. reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0.O. 1990.5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer.c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl. Si bien hemólisis ligeras no interfieren con este método. BIBLIOGRAFIA .

C. Nº: 1287/77 . Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de Suero BS) en espectrofotómetro a 560 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.A. se halló un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios: Varones: 114. 100 ug/dl S corregida Wiener lab. 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo.(B + BS) = D corregida Fe (ug/dl) = D corregida x f Donde: f = METODO DE CONTROL DE CALIDAD Standatrol S-E 2 niveles. 2000 Rosario .ar Dir. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos.I. Disp. Riobamba 2944 2000 .B = S corregida D . manteniendo el frasco gotero en posición vertical. llevando el aparato a cero con agua.Argentina http://www.3 ug/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.wiener-lab. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas de S y D.: Viviana E.S. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Los tubos deben ser leídos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento. con edades oscilando entre los 18 y 51 años.com. Téc.198/00 35 .6 ug/dl Mujeres: 103. restándoles los Blancos correspondientes: S . VALORES DE REFERENCIA En un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Agregar.Rosario .Búfer/reductor 2 ml 2 ml 2m Mezclar.

2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente(24ºC). METODO 1. 3. 36 . Solución clorhídrica de ferricianuro potásico. Normalmente. Se han establecido scores para la semicuantificación de la reacción. anemias por deficiencia de hierro y talasemias. Lavar los frotis colocándolos en la solución de contraste durante 30 minutos. 2. fijar los frotis en vapores de formol durante 30 minutos (algodón empapado de formol en el fondo de un vaso de Coplin). La tinción de Perls permite valorar también el hierro no hemínico presente en el citoplasma de los eritroblastos y determinar el número de los que presenten uno o más gránulos de hemosiderina (sideroblastos). luego del tratamiento con drogas. mientras que se ve disminuida en la anemia con células S (sickle cells). 4. Refleja la habilidad de la eritrocitos para captar agua sin lisar. MATERIAL 1. Debe prepararse extemporáneamente mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de ferricianuro potásico al 2% en agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0. Solución de contraste eosina (1 g/L de H2O) o safranina(1 g/L de H2O. Introducir los frotis fijados en la solución clorhídrica durante 1 hora a temperatura ambiente. La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina. que se observan normalmente a nivel de las zonas de abundantes macrófagos. Microscopio óptico. Este test ha sido muy usado experimentalmente como medida de la viabilidad del glóbulo rojo y clínicamente con fines diagnósticos. 2. como la esferocitosis hereditaria. constituye el hierro no hemínico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las células del sistema mononuclear fagocítico. que se considera el resultado de la precipitación de varias moléculas desnaturalizadas de apoferritina. Frotis de la médula ósea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. La fragilidad osmótica se ve aumentada en anemias hemolíticas.Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls La coloración de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de célula pudiendo ser aplicada a las células presentes en un frotis o extensión de sangre o médula ósea. como la indometacina. MEDICIÓN DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA La fragilidad osmótica mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio. INTERPRETACION Y EVALUACIÓN DE RESULTADOS La hemosiderina teñida mediante la tinción de Perls aparece bajo la forma de gránulos de intenso color azul. 3.

Este test es por lo tanto. mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio.0. 4.0.0.0 y 1. nos encontraremos ante la presencia de una anemia hemolítica debida. 3. Si por alguna alteración del citoesqueleto.0. La solución de 10. Para preparar las soluciones de ClNa se parte de una solución 10 g/L y se realizan diluciones de la misma. el mismo es quitado de circulación.0. se deben mezclar 50 µl de sangre con 5 ml de soluciones con diferentes concentraciones de ClNa : 10.0. diferenciadas de acuerdo a la resistencia de su membrana.0. El grado de hemólisis es determinado midiendo la hemoglobina liberada a partir de las células. [ClNa] y de las mismas se extrae el valor de [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. La fragilidad osmótica. posiblemente. Las variaciones en la fragilidad osmótica son definidas como cambios en las curvas de hemólisis y son establecidos por determinación de la [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. fundamentalmente a través de los capilares esplénicos. 9. 7. la cual es imprescindible para que el eritrocito pueda circular libremente. 5. a 2500 rpm por 15 minutos y se realizan lecturas de los sobrenadantes a 540 nm. 4.5. 6. La concentración de ClNa que produce el 50 % de hemólisis puede ser determinada calculando el % de hemólisis según la siguiente ecuación: % de hemólisis = (DOs -DObl) x 100/ DOo donde: DOs= densidad óptica del sobrenadante DObl= densidad óptica del blanco DOo= densidad óptica de la solución de 1 g/L de ClNa. 8. Para realizar la medición. a alguna alteración de las proteínas del citoesqueleto de la membrana eritrocitaria. Si se produce un desbalance en el equilibrio entre la producción de eritrocitos por la médula ósea y su eliminación esplénica.En este test se mide la capacidad de deformación o elasticidad de la membrana del glóbulo rojo. indicador del estado de la membrana eritrocitaria. 37 .0. Se centrifugan.0 g/L es usada como blanco. Las diluciones se realizan por duplicado. la membrana del glóbulo rojo pierde su capacidad de deformación . Luego se grafican las curvas de % de hemólisis vs. luego de mezclar por inversión.0 g/L. La forma de la curva que muestra el grado de hemólisis en función de la [ClNa] sugiere que ésta puede ser el resultado de la distribución de las poblaciones de GR. 2.

........... Fechar... Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método... pielonefritis........ Sustrato: agregar el volumen de Buffer indicado en el rótulo a un vial de Sustrato.O....O........2 Piruvato .. o superiores a 1. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.... 1................. 200 mmol/l INSTRUCCIONES PARA SU USO Buffer: listo para usar. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada... lecturas de absorbancia del Sustrato reconstituido inferiores a 0...................... b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma.....800 D.............. En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM)........... Por otra parte.....LDH-P AA Método UV optimizado (SFBC) para la determinación de lactato deshidrogenasa (LDH) en suero o plasma SIGNIFICACION CLINICA La determinación de la actividad de lactato deshidrogenada (LDH) en suero........... la actividad de LDH total (junto con las de CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnóstico............ c) Sustancias interferentes conocidas: las muestras con hemólisis visible o intensa pueden producir valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usadas.............. tiene una gran variedad de aplicaciones clínicas.... PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". REACTIVOS PROVISTOS Buffer: solución de buffer Tris.. No congelar......... también se registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis hepática (producida por agentes tóxicos o por infecciones agudas como la hepatitis viral) e incluso acompañando a necrosis tubular renal. FUNDAMENTOS DEL METODO Basado en el siguiente esquema de reacción: LDH Piiruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+ Las concentraciones del ensayo están optimizadas de acuerdo a la Sociedad Francesa de Biología Clínica (SFBC)............. La misma comienza a aumentar de 12 a 24 horas después de producido el infarto... MUESTRA Suero o plasma a) Recolección: se debe obtener suero de la manera usual y separar del coágulo dentro de las dos horas de su obtención.......... debe usarse heparina como anticoagulante.... Tapar y agitar suavemente por inversión hasta disolución completa.72 horas y permanece elevada hasta el séptimo o décimo día............... 80 mM.... Concentraciones finales (según SFBC) Tris ...... (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo. 0. 38 .6 mmol/l NADH ......... alcanza un pico entre las 48 ........ La LDH es estable hasta 24 horas en refrigerador....800 D. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca......... Sustrato reconstituido: estable 21 días en refrigerador (2-10oC) o 3 días a temperatura ambiente a partir del momento de su reconstitución. pH 7....... pH 7... También puede usarse plasma..2 conteniendo piruvato y cloruro de sodio..2 mmol/l ClNa ... Sustrato: viales conteniendo NADH...................

estando el sustrato en condiciones. siguiendo el procedimiento indicado en A).Tiempo de reacción: 3 minutos y 30 segundos. .MACROTECNICA Emplear 50 ul de Muestra. B) 30-37oC I.871 17.683 9. restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. . PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra. se obtienen los siguientes valores: 39 . En este caso. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. 2 y 3 minutos de la primera lectura. Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada temperatura.016 9.Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366) .921 5. . indica una muestra con muy alta actividad de LDH (que consume NADH aún antes de esta lectura).00 (*) Calculados Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. . 30 ó 37oC. repetir la determinación con muestra diluida 1/10 con solución fisiológica y multiplicar el resultado por la dilución efectuada. PROCEDIMIENTO A) 25oC En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo.Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir. II.095 8. luego agregar: Muestra 100 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro. colocar: Sustrato reconstituido 3 ml Preincubar unos minutos.Cronómetro. . .MICROTECNICA Emplear 20 ul de muestra y 1. Leer la absorbancia inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1. la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0.253 15.La humectación es causa de deterioro del Sustrato.O. Utilizar este promedio para los cálculos. .Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.941 25ºC 4. CONDICIONES DE REACCION (Disminución de absorbancia) .Temperatura de reacción: 25. Esperar 30 segundos.Material volumétrico adecuado.MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .800 D. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (∆A/min). .0 ml de Sustrato reconstituido siguiendo el procedimiento indicado en A).Espectrofotómetro.118 II (30-37ºC) 8.Los volúmenes de muestra y reactivo se pueden reducir proporcionalmente sin que varíen los factores de cálculo.Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero. CALCULO DE LOS RESULTADOS LDH (U/l) = ∆A/min x factor En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción seleccionada (30-37oC o 25oC) y a la técnica empleada (micro o macrotécnica) como se indica en la siguiente tabla de factores: Longitud de onda 340 nm 334 nm 366 nm VALORES DE REFERENCIA Temperatura Valores (U/I) 25ºC 120-240 30ºC* 160-320 37ºC* 230-460 Temperatura I (30-37ºC) 9.

Comisión de Enzimas .. 1000 U/l Factor (paso de luz 1 cm) ..5% y semiancho de banda ≤ 8 nm........Sociedad Española de Química Clínica ... Téc...... 2000 Rosario .................. ∆A/min (a 340 nm y 25oC)........ reproducibilidad ± 2 nm........... +5.. Valor normal inferior ........ Riobamba 2944 2000 ............... (366 nm y 25oC).. 6.......3 [l x mmol-1 x cm-1] Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso. cinética Dirección de la reacción ............ 3rd ed..... PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Longitud de onda primaria ......700 D..3 x 20 ml (Cód. ...Societé Française de Biologie Clinique (SFBC) ....... 3 segundos Tiempo de retardo .........S.Ann...... Si la ∆A/min es superior a 0... 380 nm Tipo de reacción ... Disp.O... 60 segundos Absorbancia de blanco . con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor........ corrigiendo consecuentemente los resultados........... 1.. repetir la determinación con muestra diluida 1/5 ó 1/10 con solución fisiológica... 57-61..........O......... (340-334 nm y 25oC) o 0........ AACC Press..... Biol.. 230 U/l Valor normal superior ................... 40:160. 8........ c) Rango dinámico: el rango útil de lectura se extiende hasta 0.. el mínimo cambio de actividad detectable será de 5 U/l (a 340 nm y a 25oC)...........200 D................14 U/l +7............. .... 460 U/l Linealidad ...... Límite de absorbancia ........................"Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".........S.... 340 nm Longitud de onda secundaria (bicromática) ..............100 D.........C...... 2.... > 0.......I........O............ luz espuria ≤ 0............. en espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366). 40 segundos Tiempo de lectura .................. Wiener lab....... para un ∆A/min de 0.............. BIBLIOGRAFIA ... Clin....... 1521303)......Comité Científico......com....Young...S.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.................O......: Viviana E...V...... .. Clin.......... extinción molar (∑340) ... PRESENTACION ......................Nivel 438 U/l 683 U/l D.... 1990.17% b) Límite de detección: depende del espectrofotómetro empleado y de la longitud de onda.........095 Coef.. Nº: 2114/97 40 .... D.... De acuerdo con la sensibilidad requerida...A....... 1:50 Tiempo de equilibrio ..............200 D......001..........wiener-lab...... 37oC Relación muestra/reactivo ................99 U/l C........000 D.Rosario .Argentina http://www............................ 1982....O. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M......... disminuye Temperatura de reacción ......ar Dir. 1989... Nº: 3330/97 Cert......................17% 1.Quim........

es captada por el hígado para su conjugación y excreción en la bilis. La eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido es una patología provocada por incompatibilidad maternofetal en la que se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. el suero debe conservarse hasta 48 horas en el refrigerador (2-10oC) y la 41 . b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma. debe usarse heparina para su obtención. Reactivo Sulfanílico: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0. tamponada y estabilizada. . También es posible realizar la determinación en líquido amniótico. Reactivo Sulfanílico: listo para usar. Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo. pueden ser indicio de deterioro de los mismos. mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo Sulfanílico. Proteger de la luz natural o artificial.Bilirrubina Método colorimétrico para la determinación de bilirrubina directa y total en suero y otros líquidos biológicos SIGNIFICACION CLINICA La bilirrubina. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra. Rotular y fechar. debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La presencia de sedimento y/o cambio de coloración de los reactivos. plasma o líquido amniótico a) Recolección: obtener suero o plasma de la manera usual. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento. MUESTRA Suero. Nitrito de Sodio: solución de nitrito de sodio 0.07 mol/l.17 mol/l.13 mol/l. para efectuar la calibración periódica del equipo. obteniéndose valores de bilirrubina total falsamente aumentados. la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reacción. FUNDAMENTOS DEL METODO La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.Bilirrubina Standard provisto separadamente por Wiener lab. Diazorreactivo: en refrigerador (2-10oC) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3 meses a partir de la fecha de su preparación. envolviendo el tubo con papel negro. c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis moderada o intensa inhiben la reacción directa. REACTIVOS PROVISTOS Desarrollador: solución acuosa de benzoato de cafeína 0. REACTIVOS NO PROVISTOS . INSTRUCCIONES PARA SU USO Desarrollador: listo para usar. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina sérica con el consecuente riesgo de difusión del pigmento al sistema nervioso central. De forma tal que. compuesto de degradación de la hemoglobina. por lo que la determinación de la bilirrubina en estos niños recién nacidos resulta sumamente importante. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente (< 25oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".Agua destilada.

B) x f Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total .Espectrofotómetro o fotocolorímetro.2 ml T 1 ml 1. CONDICIONES DE REACCION .TECNICA PARA LIQUIDO AMNIOTICO Se determina bilirrubina total.5 ml 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión.Temperatura de reacción: temperatura ambiente .Volumen final de reacción: 2. La acción de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . Si se lee después. METODO DE CONTROL DE CALIDAD 42 . CALCULO DE LOS RESULTADOS Bilirrubina total (mg/l) = (T . II.TECNICA PARA SUERO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco). De tal forma. Luego de 5 minutos.Reloj o timer. Dividir el resultado final por 5.Volumen de muestra: 200 ul . .Frasco de vidrio color caramelo.Tiempo de reacción: 5 minutos . habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta.5 ml 200 ul T 200 ml 2. Si se lee antes. En dos tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco) y T (Total) colocar: B Muestra (líquido amniótico) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 1 ml 1.Longitud de onda: 530 nm en espectrofotómetro o 520-550 nm en fotocolorímetro con filtro verde.Tubos de fotocolorímetro.9 ml PROCEDIMIENTO I. leer en espectrofotómetro a 530 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520-550 nm). en caso de ictericia moderada se usarán 50 ul de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren sólo 20 ul. de acuerdo a la severidad de la ictericia. . . D (Directa) y T (Total) colocar: B Muestra (suero) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 200 ml 2. llevando el aparato a cero con agua destilada.38 respectivamente. .Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados. . excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. Multiplicar los resultados obtenidos por 3.2 ml Proceder de la misma manera que en la técnica I.B) x f Bilirrubina directa (mg/l) = (D .BRB directa El factor colorimétrico (f) debe calcularse con el Standard de Bilirrubina de Wiener lab. El líquido amniótico es conveniente mantenerlo congelado hasta el momento de efectuar el ensayo.5 ml 0.37.79 y 9. Es por tal motivo que debe protegerse cuidadosamente. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos.5 ml 0. Sueros ictéricos: debe emplearse la técnica descripta pero con menores cantidades de muestra.5 ml 200 ul D 200 ml 2. habrá sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre.sangre entera no más de 24 horas en refrigerador o 12 horas a temperatura ambiente.

dependiendo del grado de inmadurez hepática. Los niveles por encima de 2. Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina en suero o plasma . mientras que entre 1 y 2. En los prematuros.Adultos: Directa: hasta 2 mg/l Total: hasta 10 mg/l .5 mg/l la muerte fetal es inminente.Standatrol S-E 2 niveles. Si la cantidad de bilirrubina sobrepasa los 9. los niveles de bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad. 43 .7 mg/l el feto ya se encuentra afectado y tiene probablemente algún tipo de falla circulatoria.7 mg/l sugieren la posibilidad de un feto afectado.7 mg/l sólo se encuentran en presencia de eritroblastosis fetal. Bilirrubina en líquido amniótico Valores menores de 1 mg/l son considerados normales.Recién nacidos: Nacidos a término Sangre de cordón Hasta las 24 hs Hasta las 48 hs Del 3º al 5º día 25 mg/l 60 mg/l 75 mg/l 120 mg/l Prematuros 80 mg/l 120 mg/l 240 mg/l Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento.

Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. .ar Dir.Clin. Acta 19/2:249 (1968).. .: Viviana E.Ichida. 3rd ed.I. . D. Chem. 1120001)."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".com.Zaroda. D. . es capaz de destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente. PRESENTACION Equipo para 200 determinaciones (Cód.V.Clin. 45/1:70 (1966). Chem.Argentina http://www.. Téc.4% 4. AACC Press. Disp. La acción de la luz. et al .0 mg/l 9.S.Watson. +0. tanto sobre los sueros como sobre las soluciones standard. . Path.62 mg/l +0.C.7 mg/l D. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.O’Brien.1 mg/l 26. 8. . 10/3:197 (1964). T. 1990. Wiener lab. se obtuvo lo siguiente: Bilirrubina directa Bilirrubina total Nivel 2. Harper & Row Pub . 2000 Rosario . J. J. Chim.Clin. R. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día.4a Ed.47 mg/l +1.1% b) Linealidad: la reacción es lineal hasta 150 mg/l.S. Clin. .Rosario .7% 1.18 mg/l +0.A.5347/98 44 . BIBLIOGRAFIA . .Botwell.LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.S. D. Nobuoka.8 mg/l 127. se obtuvo una recuperación entre 100 y 106%. (1968). M. H.Am.wiener-lab. Nº: 252/75 . 7/6:603 (1961).“Laboratory manual of pediatric microbiochemical techniques”. .Young.5% 2. .45 mg/l C. c) Recuperación: agregando cantidades conocidas de bilirrubina a distintos sueros. Riobamba 2944 2000 .

. Conectar la fuente de poder.. Las tiras deben conservarse en posición vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%.. Las tiras secas pierden las dimensiones y las características del gel. 22.. Leer a 520 nm si se usó colorante Ponceau S... REACTIVOS 1) Solución buffer: Tris................ 14 ml Glicerol . mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades).... durante 90 minutos. Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética.....1 g Glicina . a continuación se las coloca en la solución 45 . 5) Solución de transparentización: Metanol ....... Desconectar la corriente y retirar las tiras..... Determinación cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solución disolvente y agitar.... 3.. Operar rápidamente para evitar evaporaciones.. 4) Solución deshidratante: Metanol puro..... 85 ml Ácido acético ... Eliminar el exceso de líquido secando entre 2 papeles de filtro. en medio alcalino (pH= 8. La HbA2 tiene una velocidad menor que la A...Separación electroforética de hemoglobina SOPORTE Acetato de celulosa gelatinizado..... La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba... realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts.... 5.. Transparentización: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos..... Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos 2.. Colorear durante 5 minutos. 1 ml 6) Solución disolvente: Ácido acético 80% Técnica: 1. 9......... 7.. La superficie de las tiras que es penetrable a las proteínas se reconoce porque es más opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro.....5 g en 100 ml de ácido tricloroacético 5% (dosis para 20 tiras) 3) Solución decolorante: Ácido acético 5%..6). La tira debe estar bien tiesa y plana.. 6.. 8. FUNDAMENTO Las diferentes hemoglobinas se separan por migrar a diferentes velocidades..... Sembrar las muestras con el hemolizado obtenido (ver más adelante).. hasta ver el fondo blanco de la tira.. En este medio la HbA migra hacia el ánodo. 4.................. 1000 ml 2) Solución colorante: Ponceau S: 0.. 14...6 g H2O destilada... Decolorar con 3-4 baños de solución decolorante... queda en la HbA migrando juntas..

hasta la transparencia completa. eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos.transparentadora durante 1 minuto como mínimo. Se colocan luego en una placa de vidrio. El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatías: TIPO Normal Polo negativo Anhidrasas Carbónicas Recién nacido Anhidrasas Carbónicas Drepanocitosis homocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Drepanocitosis heterocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Hemoglobinopatía C homocigota Anhidrasas carbónicas Hemoglobinopatía C heterocigota Anhidrasas HbC Carbónicas β-talasemia heterocigota β-talasemia homocigota Doble Heterocigota S/C Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbC HbS Carbónicas HbA HbC HbA HbF HbA HbA2 Polo positivo HbA ACLARACIONES HbA 98% HbA2 2% HbF 90% HbA 10% HbA2 2% HbS 98% HbA < 50% HbS > 50% HbA2 2% HbC 98% HbA2 2% HbC > 50% HbA < 50% HbA2 entre 4-8% HbA HbA2 normal % de HbF y HbA. Así se conserva para leer en densitometría. variable según tipo de Th homocigota HbS 50% HbC 50% HbF HbA 46 .

Se determina la concentración de hemoglobina en el bemolizado obtenido. Se lava tres veces con solución fisiológica. desechando los sobrenadantes. 3.8 ml de tolueno (rompe los glóbulos blancos). agitar vigorosamente durante 1 minuto. dejar 24 horas. usando cualquier anticoagulante.PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO Técnica 1. Obtener 5 ml de sangre por punción venosa. 47 . Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm. 5. recoger con pipeta Pasteur el infranadante y filtrar. 2. se lleva la concentración hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada. 4. 6. Colocar en heladera (favorece la hemólisis). mediante el método de la cianmetahemoglobina. aunque se recomienda la heparina. se agrega un volumen de agua destilada igual al del paquete globular y 0.

Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke
FUNDAMENTO La hemoglobina fetal (HbF o α2γ 2) es ácido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos. REACTIVOS 1. Alcohol etílico al 80% 2. Buffer de ácido cítrico, pH 3,4 Solución A: Ácido cítrico............................ 4,2 g Agua destilada......................... 100 ml Solución B: Citrato de sodio........................ 5,9 g Agua destilada......................... 100 ml Solución Buffer pH 3,4: Solución A ................ 84 ml Solución B................. 16 ml 3. Eritrosina o eosina al 0,1 % en agua. DESARROLLO 1. Extendidos de sangre secos de no más de una hora de obtención, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etílico al 80% 2. Lavado rápido con agua y secado. 3. Inmersión en una cápsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37°C un mínimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rápidamente en agua común y secar en posición vertical. 4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solución de eritrosina o eosina. Lavar con agua y secar. RESULTADOS Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras. El análisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hematíes coloreados e incoloros.

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DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA FETAL: METODO DE SINGER FUNDAMENTO Debido a la muy semejante movilidad de la hemoglobina normal (HbA) y la hemoglobina fetal (HbF), cuando usamos los métodos electroforéticos de rutina para el estudio de hemoglobinas, es necesario valerse de la propiedad de la HbF (y la Hb Bart( de ser resistentes a la desnaturalización en medio alcalino. REACTIVOS 1. Solución de hemoglobina (véase obtención de bemolizado) 2. OHNa 1/12 N (recién preparado) 3. Reactivo precipitante SO4(NH4)2 .............................. 38 g ClH 1N ..................................... 2,5 ml H2O destilada ........................... 100 ml TÉCNICA Se preparan tres tubos: • • • • Tubo 1: Blanco: 3,2 ml de OHNa 1/12 N, agregar 6,8 ml de reactivo precipitante y filtrar. Tubo 2: Hb 100: 5 ml de agua destilada, agregar 0,02 ml de la solución de hemoglobina Tubo 3: Hb álcali-resistente: 3,2 ml de oHNa 1/12 N, agregar 0,2 ml de solución de hemoglobina y disparar en el momento un crónometro, a los 60 segundos agregar 6,8 ml de reactivo precipitente, invertir varias veces y filtrar. Leer en un espectrofotómetro a 540 nm, llevar a cero con el tubo blanco (Tubo 1).

CÁLCULO % de Hb álcali-resistente = VALOR NORMAL Menos de 2%. DO tubo 3 x 20 DO tubo 2

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Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs
A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION a) Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2 % en salina fresca (véase más abajo el apartado C. Preparación de la suspensión globular al 2%). b) Agregar una gota de la suspensión globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn. c) Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A1, B y O al 2% d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. e) Leer primero los controles y luego los problemas microscópicamente en visor y microscópicamente. f) Scores de lectura: +++ un gran aglutinato ++± varios aglutinatos grandes ++ muchos aglutinatos pequeños +± pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo + aglutinatos visibles pero solo microscópicamente aglutinatos conteniendo muy pocas células tr trazas - negativo B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO a) Tomar una muestra de suero libre de hematíes. b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los siguientes hematíes: 1) hematíes A conocidos 2) hematíes B conocidos 3) hematíes del propio individuo 4) hematíes O conocidos c) Incubar 1 hora a ta o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. d) Leer primero los controles y luego los problemas , microscópicamente en visor y microscópicamente. C. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2% Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn. a) Llenar el tubo con solución fisiológica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. b) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución fisiológica. c) Tomar una gota de culot (50 µl) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la suspensión al 2%.

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Al terminar de mezclar. Negativa: los hematíes (Rh-rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar aglutinación. d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados: Glóbulos rojos problema Anti A + + GR A + + Anti B + + GR B + + Anti AB + + + GR AB + + + Grupo ABO A B O AB Grupo ABO A B O AB Suero problema E.2 Reacciones • • Positiva: los hematíes D(Rho) positivos permanecerán aglutinados al querer desprender el culot globular. e) Proceda de la misma manera con los tubos controles. b) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra. E. Agregar una gota de anti-A absorbido1 y mezclar bien con una varilla de punta fina. La lectura se hará microscópicamente con un visor y microscópicamente. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA a) b) c) d) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota. c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm.D.1 Controles a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D c) Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB. Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn. F. disparar el cronómetro. E. PRUEBA PARA DETECTAR Du 1 También se puede utilizar un monoclonal anti-A1 51 .

dado que. La lectura se hará macro y microscópicamente. 5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana. desprenda suavemente el culot globular y lea. es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti –D por suero de persona de grupo sanguíneo AB. 6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm. Comprobar su especificidad 3.Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti –D. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du. 1) 2) 3) 4) F. El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparación del suero). 52 . Para seudoaglutinación Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). Probar la bondad del suero 2. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS. 2 La detección de Du también se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du. Negativa: los hematíes Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspenderán y no aglutinarán. Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en salina . Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs. F. El tercer control.1 Reacciones • • Positiva: los hematíes Du (Rhou) positivos permanecerán aglutinados luego de intentar desprender el culot globular.2 Controles utilizados Se utilizan tres controles para 1. Centrifugue y elimine el sobrenadante. Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C. en tales hematíes el factor D(Rho) es mas reactivo. se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados. G. Coloque dos gotas de suero anti –D(Rho) en un tubo de Kahn2. Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda falsear los resultados. Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con el antígeno E(rh”) presente .

1 Prueba de Coombs indirecta 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes de grupo O Rh+ al 2%. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. 3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2 8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.G. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%.2 Prueba de Coombs directa 6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%. 2) Centrifugar. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. eliminando completamente el sobrenadante en el último lavado. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica. 9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana.2 4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. 7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de 1 hora a 37 °C. G. 53 . Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm.

fosfato.B monoclonal. dextrosa. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. También demostró que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee.Placas . REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: . adenina).B Monoclonal Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en A. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. B.Albúmina Bovina 30% de Wiener lab. Las muestras recogidas con ACD. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional.Anti-A. REACTIVOS PROVISTOS Anti-A. heparina. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón. citrato. Por este motivo. Anti-B o Anti-A. dextrosa) o CPDA-1 (citrato. la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los demás ensayos pretransfusionales.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS) . dextrosa) CPD (citrato. PROCEDIMIENTO 54 . con o sin anticoagulante. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. implica grupo O. ACD (ácido cítrico. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes. fosfato. Anti-B o Anti-A. AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A.Solución fisiológica . B.Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". La ausencia de aglutinación en todos los casos. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A.Tubos de hemólisis . Si se emplean coágulos. o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos altamente reactivos en su superficie.Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS) . Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. Anti-B o Anti A. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Centrífuga . INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. Si se utilizó heparina o EDTA. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días.

55 . 9th Edition.TECNICA EN TUBO (por sedimentación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A. Standard 57:49-59. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cód. S.B + + + + Grupo sanguíneo A B 0 AB Variants débiles del grupo A como Ax METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados. 1443154). . 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica. 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. No debe emplearse microscopio. American Association of Blood Banks 1985. se coloca una gota de estas células con 2 gotas de solución fisiológica. 1983. Observar aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción positiva.500 rpm. “Int. F. Por esta razón deben extremarse los cuidados. sobre todo en los prematuros.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera. Anti-B o Anti-A. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%.B monoclonal colocada en una placa limpia. Chapter 8. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones: . colorantes. Como control. . Symp.Moore.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. Biol. . . compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. BIBLIOGRAFIA .K. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos. Anti-B o Anti-A. Anti-B o Anti-A. 1443153). III.En las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solución fisiológica. . on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use”. Develop.TECNICA EN TUBO (por centrifugación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A. D.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A. 1443152). Washington.Widman. Anti-B: frasco x 10 ml (Cód. PBS o LISS.Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. 2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. No debe producirse aglutinación. resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la tipificación. I. II. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación.Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido.Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas. France. “Technical Manual”.Leucemias u otros desórdenes malignos.Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idéntico. París.C. Antisuero Anti-A + + +/Anti-B + + Anti-A. et al. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.

Riobamba 2944 2000 .ar Dir. 2000 Rosario .C. Nº: 1073/89 (Anti-B) Disp.Wiener lab. Téc.Rosario . Nº: 1076/89 (Anti-A) Disp.wiener-lab. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. Disp.S.com.Argentina http://www.I.B) 56 .: Viviana E.A.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Nº: 1071/89 (Anti-A.

REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos. es el antígeno D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Cuando se sospecha esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. dextrosa. fosfato. EDTA. Si se emplean coágulos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). citrato.Placa de vidrio 57 . Sin embargo.Anti-D (Rho) monoclonal Reactivo para la detección de antígeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en el laboratorio de los anticuerpos anti-D. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Dependiendo de la técnica que se emplee.Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido. c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. ACD (ácido cítrico. Las muestras recogidas con ACD. . dextrosa) o CPDA-1 (citrato. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se utilizó heparina o EDTA. CPD (citrato.Solución fisiológica. adenina). MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes. ya sea por transfusión o durante el parto. Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente. INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar. dextrosa). PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro". deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente: . se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina.Tubos de hemólisis . ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. fosfato. Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno.Centrífuga . produciendo anti-D. podrán ser necesarios: .

A. American Association of Blood Banks. Biol. 1985.TECNICA EN TUBO Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos. 1940. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. Unger.. .I.R. Wiener. . 1443155). Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico). BIBLIOGRAFIA . Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos.. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. o solución fisiológica. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. También puede emplearse sangre entera.JAMA 169:696. A. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. L.C. . o solución fisiológica.6 th Ed. and Sanger.K.Race . 4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 1975. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. luego centrifugar y volver a leer como se describió en 4).C. descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las células luego de cada lavado. centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia.Widman. . K. o en solución fisiológica.. 1959.9 th. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos sensibilizados.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos. mezclar. Med.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.. .“Blood Groups in Man” .S. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. 6) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente.“Technical Manual” . 178.Proc.Landsteiner. Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-50oC.Argentina 58 .Wiener. F. Ed. 3) 5) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. Oxford Blackwell Scientific Publications. . Las muestras que aún en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du. 2000 Rosario . II.J. 4) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. Washington D. Riobamba 2944 2000 .S. R. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva.Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I. Chapter 9. III. . pág. R. La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. 43: 223. Wiener lab.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos. Soc.A. Exp.Rosario .

ar Dir.S. Nº: 1074/89 59 .: Viviana E. Téc.com.http://www. Disp.wiener-lab. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.

Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. . REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3. heparina. PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro". FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b. fosfato. . con o sin anticoagulante.Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glóbulos rojos. dextrosa) CPD (citrato. De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente: . . 60 .Suero Anti-humano (poliespecífico) Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs.Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos. fosfato. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica. . Prueba Antiglobulina Directa . El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a antígenos del sistema Rh. REACTIVOS NO PROVISTOS .Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. C3bi. .Solución fisiológica. siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prueba Antiglobulina Indirecta . dextrosa. citrato. dextrosa) o CPDA-1 (citrato.Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS). Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes.Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido.Identificación y titulación de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. MUESTRA Glóbulos rojos a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminación del mismo.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS). .Fenotipo de glóbulos rojos. INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar. C3dg o C3d). produce una aglutinación de los glóbulos rojos visible macroscópicamente.Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos.Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. ACD (ácido cítrico. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA. adenina). .

2) Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS. 6) Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente.Tiempo o temperatura de incubación inadecuados.Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados.500 rpm. 61 .. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células.E. Finalmente preparar con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%. 1443156). III. Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica). LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: . CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. .. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra.Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados. Descartar completamente el sobrenadante luego del último lavado.PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva.Concentración inadecuada de glóbulos rojos. 3) Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua. ii:15.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal). . A. . Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos. 4) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado.A.Baño de agua a 37oC . MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .R. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. R.Tubos de hemólisis PROCEDIMIENTO I. . 3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos. Las muestras recogidas con ACD.Lavado inadecuado de las células. . and Race. Si se emplean coágulos. 1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%. 1945. .R.Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. Mourant. 1) En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar. Si se utilizó heparina o EDTA.c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). BIBLIOGRAFIA . Si los glóbulos provienen de coágulos. 1) Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar.Centrífuga . El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos. II. la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extracción). PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. 7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados con IgG débiles.Coombs. R. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. 2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7) de la técnica I). 2) Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS.Lancet. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I). Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.

S.I. .C.. A. and Race.R. J.Coombs. F. 1945.K. 26:225.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A. Disp. 9th ed. .Rosario . Washington D.wiener-lab. Mourant.E.ar Dir.A.Widman.“Technical Manual”. pág. R. 2000 Rosario . Riobamba 2944 2000 . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. R. 1985. Téc.R.C. American Association of Blood Banks..: Viviana E.com. . Wiener lab. Nº: 2503/91 62 . Path.Argentina http://www. 376. Exp.Brit.

El grado de aglutinación se considerará según los scores anteriormente indicados. Preparación de diluciones madres.100 ml de solución fisiológica (SF). Por ejemplo.100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2. el tipo de aglutinato es tr. El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación ± .1. colocar 0. b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O con dos gotas del suero a titular. a) Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de hematíes a usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes.2 Titulación a) Se toman 10 tubos de Kahn. d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta.Determinación de anticuerpos inmunes A.1 Técnica básica de titulación A. el título se determinará promediando dicha dilución con la precedente. el título será (16+8)/2=12. colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos. c) Tomar 0.1. b) En los tubos 2 al 10. c) Incubar a la temperatura apropiada . Luego se toman 0. si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16.300 ml de suero a titular en el tubo N°1. 63 .1. con aglutinación. A. Si en la última dilución. numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. e) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilución. Con una pipeta Pasteur para cada dilución. el tiempo requerido.100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. d) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del suero. TITULACIÓN DE ANTICUERPOS A. a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario). el tipo de aglutinato es tr. Colocar 0. Agitar la mezcla. Homogeneizar y repetir la operación hasta completar las diluciones. b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%.

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