UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS ASIGNATURA HEMATOLOGIA

Métodos del laboratorio hematológico
PRIMERA PARTE

Docentes

Dra. Nilda E. Fink Dra. María Elena Chiesa Dra. Ma. Alejandra Fernández Alberti Bioq. Fernando Ventimiglia Bioq. Mariana González Bioq. José Luis Casali

La Plata, 2007

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Contenido
Página Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa Descripción de los anticoagulantes usados en hematología Recuento de hematíes Hematocrito Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina Velocidad de sedimentación globular Recuento de reticulocitos Cuantificación de hierro sérico Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls Separación electroforética de hemoglobina Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs Determinación de anticuerpos inmunes 3 5 7 12 15 21 26 29 34 42 45 47 57

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Dejar secar perfectamente. El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y. localizándola visualmente y por palpación. se retira el torniquete y luego la aguja. controlando el correcto funcionamiento del émbolo.Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa A) EN ADULTOS 1. no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo. Una vez identificada la vena. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresión del músculo no mayor a 1 mm. una vez manipulado. LA AGUJA SE DESCARTARÁ EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba). 6. limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol. Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene. presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco. 3. 9. Colocar el lazo y volver a palpar la vena. Antes de iniciar la toma de muestra. En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja. La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba. dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. indicarle al paciente que abra y cierre el puño para facilitar la extracción. 5. 14. 2. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. 15. Elegir una vena bien visible en el antebrazo. los cuales se mantendrán puestos durante todo el procedimiento. 10. 11. 7. se la colocará en la jeringa sin tocar con los dedos. 4. 13. 4 . evitando hacer espuma. descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin. En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más sangrado. 8. Los recipientes que contienen algodón y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirán solamente al momento de usar. Después de la toma. 12. se le indica al paciente que abra la mano. La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes. tener todo el material preparado pero sin abrir. Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables. Una vez realizada la toma de muestra.

se recomienda hacer la extracción del brazo como en adultos. pidiéndole a un adulto que colabore en mantener inmóvil al niño. En el caso de niños menores de 6 meses. colocar una curita o apósito. NO REUTILIZARLOS NUEVAMENTE. 3. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante. En niños mayores de 6 meses. Antes de la extracción conviene calentar el talón frotándolo entre las manos para favorecer la irrigación de la zona. aclararlo en el registro de muestras. se procederá a extraer la muestra del talón con una lanceta descartable. Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento. en la zona del talón indicada en el dibujo adjunto. 4.16. Secar la zona con un trozo de algodón seco y una vez que no haya sangrado. dejar evaporar y punzar con la lanceta. Las flechas indican los lugares de punción 5 . B) EN NIÑOS 1. 17. en particular el brazo. Desinfectar con un trozo de algodón embebido en alcohol. La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. 2.

evitando así la coagulación. dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético. el tamaño eritrocitario.2H2O).1-0.2H2O posee un peso molecular relativo de 404. por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido.1g. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos. C6H5O7Na3. ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes. sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. sin embargo . HEPARINA DE LITIO. especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares.8+/-1. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos. El K2EDTA .Descripción de los anticoagulantes usados en Hematología Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares.5-2. posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C).0. impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio. como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin.106 mol/l (31. así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1. las tres sales afectan el tamaño del eritrocito. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico. de sangre total. es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. El citrato sódico se utiliza a una concentración de 0. actuando mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca+ + ). Los anticoagulantes más utilizados son: • EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica.3 g/L de C6H5O7Na3.2 mg/ml. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro • • • 6 .2 mg) de heparina por ml de sangre. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0. HEPARINA SÓDICA. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares. CITRATO TRISÓDICO. actúa impidiendo que el calcio se ionice. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1. no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria.

Citrato disódico 2 g. Dextrosa 2 g.volúmenes de sangre. La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0. H2O destilada 120 ml. 7 .9 g.

Es un método poco usado debido al elevado error que presenta.Recuento de hematíes A) RECUENTO MANUAL Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. Líquido diluyente: solución fisiológica o citrato de sodio 3. La dilución empleada es de 1/200. para lo cual se mide exactamente: Solución fisiológica o citratada: 3.8%. se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeños. como se muestra a continuación: 8 .98 ml Sangre (con pipeta automática): 0.02 ml El recuento se realiza en la cámara de Neubauer cuyo esquema es el siguiente: El recuento de hematíes se realiza en el cuadrado central.

Falta de suficiente agitación de la sangre diluida. 4. La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0. FC: Factor de corrección de la profundidad.Recuadro central: Las líneas reforzadas. 8. Cámara cuentaglóbulos mal ajustada. ST: Total de cuadrados pequeños en la superficie de 1 mm2 (400). Utilización de material mal calibrado. que el retículo tiene 400 cuadrados pequeños en total. TC: Total de cuadrados pequeños contados. Errores del operador al realizar el recuento. luego de agitar adecuadamente en un agitador de rodillos. o triples. 9 . 5. Células mal distribuidas en el fondo de la cámara. La cámara puede ser cargada con un capilar. D: Título de la dilución realizada (200). el cálculo que se debe hacer es el siguiente: N x D x FC x ST = nº de glóbulos rojos/mm3 TC Donde: N: número de eritrocitos contados. Coagulación parcial. evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente. el cual puede deberse a: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. 1. 2. Considerando entonces. 3. Hemólisis. se carga la cámara y se cuentan los glóbulos rojos de los 80 cuadrados pequeños (zona sombreada). 7. sucia o mojada. no rígido. sirven únicamente como límites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeños. Errores al efectuar los cálculos. Llenado incompleto de la cámara cuentaglóbulos. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre.1 mm. Se deben contar 5 de estos cuadrados. Causas de error en el recuento en cámara cuentaglóbulos El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%. Con la dilución indicada. sucio o húmedo. para llevar a 1 mm3 (10). 6. Empleo de cubreobjetos deformable.

Este método tiene algunas limitaciones. Las condiciones más importantes que deben tenerse en cuenta son: 1. El diámetro del orificio de apertura: debe estar en relación al tamaño de las partículas que se analizan. Como los impulsos eléctricos que van a determinar el volumen celular se generan en el orificio de apertura del sistema. Por dentro y fuera del orificio se disponen electrodos que establecen una diferencia de potencial. Impedancia o resistencia eléctrica. La concentración de la suspensión analizada: debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia. para cada población celular que se quiera estudiar se deben seleccionar las condiciones para que sean analizadas sin error. como por ejemplo diluciones de la muestra antes de ser procesada y. Cuando una célula pasa a través del orificio. se genera una resistencia entre ambos electrodos que se registra como un impulso. 2. Dispersión de luz o campo oscuro. 2. La sangre total es diluida en una solución de conductividad estable. Debe ser perfectamente permeable. El número de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular y como la amplitud del impulso es directamente proporcional al tamaño de la célula. las células sanguíneas así diluidas se hacen pasar por un orificio de apertura con un área prefijada. 10 . Se basa en la propiedad de las células sanguíneas de no conducir la electricidad. es posible determinar también el volumen celular.1 Método de la impedancia o de la resistencia eléctrica Es el más empleado en los autoanalizadores hematológicos. los aparatos totalmente automatizados sólo requieren que se les suministre la muestra obtenida en condiciones apropiadas (por ejemplo: con el anticoagulante adecuado). 3. por lo general poseen un monitor de visualización que permite observar su permeabilidad durante el recuento. La intensidad de corriente entre ambos electrodos: debe ser lo suficientemente sensible para detectar la resistencia que genera la partícula cuando atraviesa el orificio. Existen distintos tipos de instrumentos: los semiautomatizados que requieren algunos pasos previos. Es importante realizar periódicamente una limpieza de este orificio. Los sistemas de recuento celular por estos medios se basan en la medida del tamaño u otras propiedades físicas de las células suspendidas en medio líquido de acuerdo con uno de los dos principios siguientes: 1. es decir.B) RECUENTO AUTOMATIZADO La automatización ha contribuido de manera decisiva al aumento de la rapidez y la fiabilidad del recuento de las células sanguíneas. B. Si es muy elevada puede dañar las células y producir interferencias originadas por ruido electrotérmico. que varias células atraviesen el orificio al mismo tiempo.

5.1x1012/L .5. pero puede incrementarse por: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. 2.B. Causas de error en el recuento automatizado Con el empleo de métodos automatizados se puede cometer grandes errores si se olvida el control periódico y el calibrado diario de los instrumentos.2 Método de dispersión de luz Se analiza la dispersión de luz producida por las células desde dos dimensiones gracias a sensores ubicados en ángulos diferentes. 1.5. las células se someten a tinciones citoquímicas se pueden detectar midiendo la intensidad de dicha reacción los diferentes tipos de leucocitos.5. Coagulación parcial. 3.6x1012/L .3x1012/L 4.3x1012/L 4.2x1012/L 4. C. Estos sistemas permiten medir la concentración y el volumen celulares.9x1012/L D) INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 11 . Si además.0x1012/L . Cada vez que una célula se interpone en el haz de luz se produce una sombra que. c) Obstrucción de los capilares u orificios de recuento. e) Presencia de microburbujas. En general. 4. Presencia de partículas extrañas en el diluyente. d) Dilución incorrecta de la muestra por el liquido diluyente. f) Contaminación por arrastre de un especimen con el siguiente.7x1012/L .1x1012/L 4. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. suele ser inferior al 1%.5x1012/L . proyectada sobre un campo oscuro. cuando se realiza en óptimas condiciones. será analizada por los sensores.5. Las células se hacen pasar individualmente a lo largo de una cámara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz que puede ser halógena o láser. que son contadas como células.1x1012/L . Uso de un diluyente incorrecto. b) Presencia de agregados celulares a nivel del orificio de recuento. el error debido al propio método de recuento electrónico.6. g) Presencia de interferencias electrónicas y averías de los componentes electrónicos del instrumento. Hemólisis.3x1012/L 4. Defectos en el sistema electrónico de recuento: a) Lisis incompleta de los eritrocitos en el orificio de leucocitos. VALORES DE REFERENCIA Edad Recién nacidos Niños (2-12 años) Adultos jóvenes (12-18 años) Adultos jóvenes (19-60 años) Sexo ambos ambos mujeres hombres mujeres hombres Intervalo de referencia 4.

la hemólisis o fallas en su formación a nivel de la medula ósea. se habla de seudopoliglobulia.Un aumento de la concentración de eritrocitos con contenido hemoglobínico normal suele acompañarse de un aumento de la concentración de hemoglobina y recibe el nombre de poliglobulia. 12 . la cual puede acompañarse de microcitosis como en la talasemia. Cuando el aumento de la concentración de eritrocitos va acompañado de una disminución de la hemoglobina. El descenso en la concentración de eritrocitos en la sangre se acompaña siempre de una disminución en la concentración de hemoglobina (anemia) y puede deberse a diferentes causas como las hemorragias.

son un buen parámetro del estado de la serie eritroide. es una técnica sencilla. Por ej.2-0. La lectura del resultado se realiza extrayendo los tubos de la centrífuga y valorando la altura en milímetros de la columna eritrocitaria. por lo que es siempre algo inferior (0. el Hto.Hematocrito DEFINICION El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre. tubo de Wintrobe con diámetro interno de 3mm .. mientras que el aumento lo es de poliglobulia.p. A) METODOS MANUALES A. En la actualidad. Ambos métodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la acción de una fuerza centrífuga. este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisión. aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. Tanto el Hto.6 ml de sangre entera anticoagulada con EDTA. dentro del contexto del hemograma automatizado. Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina. que corresponde a una fracción de la longitud original de la columna sanguínea (100 mm).000-3. Debe excluirse la columna de leucocitos y plaquetas. El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo). Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas. 13 .m. Así. expresado como porcentaje.1 Macrométodo (macrohematocrito) Utiliza 0. Centrifugamos durante 30 minutos a 2. un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. Por ello. Aunque también puede emplearse un tubo de Wintrobe (macrométodo). todos los autoanalizadores hematológicos suministran.3 %).000 r. entre sus factores de error está el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura. barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. un descenso del Hto es indicativo de anemia. un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración. puede ser normal o alto. por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión. obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados.

de longitud por 1mm. En muestras de sangre venosa. Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7.000 rpm. produce una mezcla con los líquidos tisulares que provoca hemodilución. que nos darán el resultado directamente.A. favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentración. se desechará la primera gota después de la punción.01. de diámetro interno. o con una regla milimetrada. por necesitar muy poca cantidad de sangre.2 Micrométodo (microhematocrito) Es una técnica muy utilizada. provoca que el sedimento de hematíes vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal. El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota. METODO AUTOMATIZADO: CONTADORES HEMATOLOGICOS El método automático de determinación se basa en el cálculo matemático a partir del Volumen Corpuscular Medio (VCM) y el número de hematíes. Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 µl). aplicando la siguiente regla de tres: A------. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. Se centrifugan durante cinco minutos a 12. Heparinizados o no.100 B------. Tan pronto se detiene la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Hto = n° de hematíes x VCM 14 . La lectura no inmediata de los capilares. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito.x x : hematocrito en tanto por ciento A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0. B. dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar).5 cm. Si se utiliza sangre capilar. Causas de error • • • • • Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor. al perderse mayor proporción de células que de plasma. El llenado de los tubos se realiza por capilaridad. muy sencilla y poderse realizar en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo.

VALORES DE REFERENCIA ( x ± 2 DE) El valor de Hto varía con la edad y el sexo.54 ± 0.05 0.05 0.45 ± 0.39 ± 0.42 ± 0.1 0.38 ± 0.05 0. Edad y sexo Recién Nacidos Niños (hasta 10 años) Mujeres (18-50 años) Embarazadas Hombres (18-50 años) Hematocrito % 54 ± 10 38 ± 5 42 ± 5 39 ± 5 45 ± 5 Fracción 0.05 15 .

El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la transformación de la hemoglobina en HiCN.4) Ferricianuro potásico [K3 Fe(CN) 6] Cianuro potásico [CNK] Fosfato monopotásico [KH2PO4] Detergente no iónico* Agua destilada hasta 200 mg 50 mg 140 mg 1 ml 1000 ml Detergentes no iónicos: Tritón X-100. 16 . ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7. se transforman en HiCN según el siguiente proceso: Hemoglobina + Ferricianuro potásico → metahemoglobina Metahemoglobina + Cianuro potásico → cianmetahemoglobina MATERIAL 1. Tubos: 12 x 100 mm. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1. Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina. Puede emplearse sangre capilar. Los distintos compuestos de hemoglobina. 3. 7. que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración). Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados periódicamente mediante la solución patrón de HiCN. Pipetas automáticas: de 20 µl. excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa. Todo patrón de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN. 6. Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo).5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml).Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina FUNDAMENTO Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN). Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 ml. Quolac Nic 218. de forma que aquella se completa en 3 min. debidamente calibradas.4. 5. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Este reactivo debe tener un color amarillo pálido. Nonidet/40. Nonic 218. preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) 2. 4. Reactivo de Cianmetahemoglobina: Composición (pH 7-7.

Mediante la micropipeta añadir 20 µl de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio. El patrón primario de HiCN se suministra en ampollas cerradas al vacío que contienen 10 ml de una solución de HiCN correspondiente a una concentración de hemoglobina entre 550 y 850 mg/l. La concentración exacta de hemoglobina de cada lote se indica siempre en la ampolla. 7. El cociente A540/A504 oscila generalmente entre 1.1 .8. Patrón primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarización y el control de calidad. 2.62. 6. si la dilución ha sido de 200 veces. 8. significa que dicha solución patrón posee la misma absorbancia que la de una solución de hemoglobina de 143 g/l. METODO Por un lado. La concentración de hemoglobina también puede calcularse aplicando la siguiente fórmula: 17 . es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta.248 y 0. 3. El patrón primario posee un espectro de absorción característico con un pico de máxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexión a 504 nm.8 mg de hierro hemoglobínico por litro a 540 nm). la absorbancia de una solución que contenga 4 x 55.60 y 1. Conectar el espectrofotómetro. según el lote y el instrumento de lectura utilizados.404. La curva de longitud de onda versus A desde λ=750 nm a λ=460 nm se observa en la Fig.458) y el coeficiente de extinción (44. Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión del tubo 20 veces. El valor de la A a 540 nm varía entre 0. Agitar el tubo mediante inversión ( 4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina. Leer la A de la solución a 540 nm. 4. si en el frasco se indica una concentración de 572 mg/l. es una solución muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y características fisicoquímicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64. utilizando agua destilada como blanco.El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendría una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimétrica. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibración (ver más adelante).1). Este patrón.400 y 0.0) de la hemoglobina ( por ej. donde también se incluye la curva del reactivo. Al realizar esta operación. si la sangre total se ha diluido 250 veces. se efectuará el espectro de absorción de la solución de referencia internacional y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig. 5.251. y a 504 nm entre 0. Por otro lado se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuación: 1. Así.. o de 114 g/l.

Hemoglobina (g/l)= A540 (muestra) A540 (patrón) x HiCN patrón (mg/l x F 1000 Siendo A= absorbancia F= factor de dilución de la sangre total en el reactivo de Van Kampen y Zylstra (251). Reactivo de Drabkin Volumen Dilución Hb Tubo (modificado) final (ml) (g/l) (g/l)* (ml) 1 3. Patrón de referencia de HiCN (ml) La concentración de hemoglobina correspondiente a cada tubo se determina a partir del grado de dilución y del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN. 18 .0 3 0 0 * El valor de esta concentración dependerá del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN que se emplee en el Trabajo Práctico. Para trazar este gráfico se preparan 5 soluciones de concentración de HiCN conocida y decreciente a partir del patrón de HiCN mediante diluciones sucesivas en reactivo de cianmetahemoglobina (véase tabla 1). Finalmente.0 0 3 0 145 2 1. ELABORACION DE LA CURVA DE CALIBRACION La gráfica de calibración tiene como finalidad calibrar el espectrofotómetro para una lectura determinada calculando la corrección existente entre los valores de A leídos en el aparato y los correspondientes valores de concentración de hemoglobina. se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene sólo reactivo (tubo 5) y se ajusta la A (100% de transmitancia).5 3 1:6 24 5 0 3.0 2. Una vez preparadas las soluciones patrón.0 3 1:3 48 4 0. 2). partiendo de la solución de HiCN más diluida (tubo 5) se leen las restantes soluciones patrón. La concentración de hemoglobina en milimoles por litro de sangre (mmol/l) puede calcularse multiplicando el valor en g/l por 0.5 2.5 3 1:2 72 3 1.5 1. la relación entre los valores de A obtenidos y los correspondientes de concentración de hemoglobina se representan en un gráfico con los valores de A en las coordenadas y la concentración de hemoglobina en las abscisas (Fig. Luego.621.

No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo 2. lo que produce transformación de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y una oxidación parcial de la Hb. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN: Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido 1. 2. Empleo de anticoagulantes no recomendados 2. Empleo de instrumentos no calibrados 2. la mayoría de las veces los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen. No obstante. Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formación exclusiva de metahemoglobina. Congelación del reactivo. en vez de HiCN.Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. Cubetas sucias o deterioradas 3. Errores en la obtención del espécimen de sangre: Errores de extracción 1. Soluciones turbias de HiCN Errores en la conservación del reactivo: 1. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (>50 x 109/l). 19 . Coagulación parcial de la sangre Errores de la dilución: Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o húmedas 1. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la Hb en HiCN Errores de la determinación: 1. con lo que los valores de concentración de Hb obtenidos son inferiores a los reales.

Espectro de absorción de la solución de HiCN y del reactivo usado 20 .

21 .Curva de calibración elaborada a partir de una solución de cianmetahemoglobina de concentración conocida.

Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa. el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR. Viscosidad del plasma. VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea. Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. c. éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis. La etapa más importante es la primera o de aglutinación. 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante. y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin. Temperatura. cuanto más pequeños sean los agregados. Así. como se mencionó más arriba. Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad η a una velocidad v: R = 6ηvr La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas".Velocidad de sedimentación globular FUNDAMENTO El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo. pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células. Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico. ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. Desde el punto de vista físico. polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia. d. Dado que. 22 . Tamaño de los G Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma. linfomas y mieloma múltiple). este fenómeno depende de los siguientes factores: a. MECANISMO El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado. b.

Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación entre el plasma y los GR en la muestra. por el otro lado. Tradicionalmente. aunque reproducen exactamente el método de Westergren. Durante los últimos años. Estos sistemas. globulinas y fibrinógeno. MÉTODO DE WESTERGREN Es el método de referencia para medir la VSG. el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias. han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable. Ambos métodos poseen limitaciones. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones de albúmina. lo que explica que estas células se mantengan separadas. se diferencian de éste por su carácter cerrado (recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisión del llenado de las pipetas. Así. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR. continua siendo un método poco reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar. las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH). 23 . METODOLOGIA Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el método de Wintrobe. El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. La albúmina retarda la VSG. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina. pero no resultaron confiables. De acuerdo con este mecanismo. y un bajo hematocrito causa un aumento no específico de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre los agregados en sedimentación. como es la necesidad de prediluir la sangre. puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. El método de Westergren es menos sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y así puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening. El método de Wintrobe. lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. Sin embargo.La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas.

5 ml de anticoagulante.A. los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países. La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solución de citrato de sodio. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza.2 Tubo de sedimentación Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1.08 g/l. El nivel de la sangre se ajusta a cero. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre. o dentro de las 6 hs. sin exposición a la luz del sol directa. A.15 mm. TÉCNICA B) La sangre se obtiene por punción venosa. evitando contaminación con materiales utilizados para la higiene de la piel. La misma debe estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en ella. Si utiliza citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7. Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua.05 mm) todo a lo largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm.2H2O) prepare una solución acuosa de 32. A. se mezcla por inversión repetidas veces. y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. por ejemplo 2 ml de sangre en 0. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente.3 Gradillas Las gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición vertical inmóvil. MATERIALES. 24 . si es mantenida a 4°C.1 Anticoagulante Citrato trisódico 109 mM en solución acuosa. D) El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25°C). Algunos plásticos resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de taponamiento. El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0. A. Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las especificaciones. manteniéndolo exactamente 60 min. B.5 mm y de un diámetro de 2. libre de vibraciones y corrientes de aire. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1°.55 + 0. C) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente.

corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora). expresado en mm. y las medicaciones (corticosteroides. por lo que no se recomienda su empleo.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos. INTERPRETACION DE RESULTADOS Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia). el ciclo menstrual. Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. 25 . se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. contraconceptivos orales. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda. etc. Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs. C. El valor de esta distancia. VALORES DE REFERENCIA EDAD (años) Niños mayores y jóvenes Hombres adultos Mujeres adultas 0-15 17-50 51-60 61-70 17-50 51-60 61-70 X + 2 DE 5 + 10 4+3 6+3 6+4 6+3 9+5 10 + 5 Límite superior de la normalidad 15 10 12 14 12 19 20 Factores técnicos capaces de modificar la VSG Causas de aumento • Desviación de verticalidad de la pipeta • Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta • Elevación de la temperatura ambiente • Dilución de la sangre • Causas de disminución: • Reducción del diámetro de la pipeta • Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido) • Cambio de anticoagulante D. han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica. muy utilizadas anteriormente. y también en el embarazo normal y el puerperio. Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas.E) Una vez transcurrido el tiempo.

La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia. por ende. defectos cardíacos congestivos. 26 . anormalidades de GR (hemoglobinopatías. esferocitosis hereditaria. Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG. es inusual obtener falsos negativos. etc. y ocasionalmente sin causa aparente. anemia falciforme.). un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgánica. hipofibrinogenemia.

lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a terapéuticas agresivas. El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA)y a ser posible. se toma una pequeña gota de la suspensión y se extiende sobre un portaobjetos. MÉTODO DE LA TINCIÓN VITAL (MÉTODO DE REFERENCIA) Este método usa como colorante el azul de metileno nuevo: 1 g cada 100 ml de solución citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de ClNa 9 g/L).. dentro de las 24 primeras horas de la extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. El recuento se efectúa contando en donde los eritrocitos estén distribuidos homogéneamente. Su tamaño es el de los demás hematíes y se caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando un retículo granulofilamentoso observable al ser teñido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. una vez ya en la sangre periférica. Mediante una pipeta Pasteur se añaden a un tubo de hemólisis tres gotas de solución colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3 días y terminan su maduración en 24 horas. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula. El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida. aproximadamente. La suspensión sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. Cuando una anemia se acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa. mientras que cuando el número es normal o disminuido se denomina arregenerativa. Transcurrido este tiempo. una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersión (x1000). pero sobretodo a los errores de índole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito. 2. En condiciones normales. eritrocitos inmaduros. Tinción vital y microscopio óptico. Si se mantiene a 4º C. El método manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variación >20%). el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. Es necesario realizar el recuento sobre un mínimo de 1000 eritrocitos. siendo 100-125 el número óptimo de hematíes por campo de los cuales distinguimos cuales son 27 . En caso de valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solución colorante. existen en la sangre en una proporción de cinco a diez por mil hematíes. Citometría de flujo.Recuento de reticulocitos Los reticulocitos.

La mezcla sangre/colorante se incubará durante 15 minutos a 37º C. lo que supone un aumento del período de maduración periférica.3 9 10 ± 1 día 1 2 5 5 ± 2 día 7. En caso de anemia intensa. el número de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneración eritroblástica.8 4 7 8.45 0. el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la siguiente fórmula: Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto del paciente Hto normal (El hematocrito normal es el que le corresponde según edad y sexo).40 0. siendo el cien porciento el número total de hematíes contado. De esta forma puede calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente: IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente Período de maduración en días x Hto normal Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia regenerativa).25 0. que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la médula a la sangre periférica. Este fenómeno se caracteriza por la aparición en el examen morfológico de la extensión de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y tonalidad azulada (policromasia) Existe una relación inversa.reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje. cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la anemia. RECUENTO AUTOMATIZADO 28 0.5 10 3 días 10 . Por ello. Ello obedece a que la anemia se acompaña siempre de un estímulo eritropoyético compensador. y un acortamiento de su período de maduración intramedular. mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética (anemia arregenerativa) Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia Hematocrito Niveles de Hemoglobina (g/L) Recuento de reticulocitos (%) Recuento de reticulocitos corregido (%) Tiempo de maduración estimado Índice de reticulocitos OTRA TECNICA Utiliza como colorante Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el método de referencia. Luego de este tiempo se realizará el extendido y se realiza el recuento como se indicó antes.35 0.30 0.15 150 133 117 110 83 66 50 1 2 5 10 15 20 30 1 1. aproximadamente lineal. entre el hematocrito y el período de maduración periférica de los reticulocitos.20 0. Este valor será valido si se trata de una concentración normal de eritrocitos en sangre total.

2.8 Valor absoluto (x109 /L) 110-330) 25-89 25-86 32-97 Recién nacido (sangre de cordón) Niños y adultos jóvenes de 4 a 19 años Adultos (20-50 años) Mujeres Hombres Variaciones patológicas Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Período neonatal Anemias hemolíticas Anemias posthemorrágicas Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula ósea) Mielofibrosis idiopática 29 . El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitución del criterio morfológico inherente al método visual por el análisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante citometría de flujo y luz láser.5 0. mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubación previa y el análisis se realiza directamente. VALORES DE REFERENCIA Valor relativo (%) 3. Para la tinción del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o Auramina.Estos equipos realizan un recuento muy fiable de reticulocitos a partir de sangre total. En los equipos semiautomáticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo.2-2.0 (4-19 años) 0.2 0.2-6.5-2.2.

CONDICIONES DE REACCION 30 .Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. En el individuo normal sólo la tercera parte de la transferían se satura con hierro. INSTRUCCIONES PARA SU USO Solución saturante: lista para usar.Tubos de Kahn. en insuficiencias hepáticas y fisiológicamente en los últimos meses del embarazo. etc. La actividad fisiológica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijación de hierro (TIBC). Adsorbente: listo para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Adsorbente: carbonato de magnesio granulado. Su función es captar el hierro de los sitios de absorción (mucosa intestinal) o depósito (sistema retículo endotelial) y llevarlo a los órganos hematopoyéticos donde es utilizado. Adsorbente: el frasco debe volver a taparse inmediatamente después de retirar las porciones necesarias para el momento. REACTIVOS NO PROVISTOS . La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que está saturada. el hierro circula como Fe (III) unido a una proteína transportadora específica: la transferrina o siderofilina. . se determina por su actividad fisiológica de captar Fe (III) a pH mayor que 7. y en las grandes pérdidas proteicas del síndrome nefrótico. en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrágicas. nefropáticas. neoplásicas. Disminuye en cambio en la hemocromatosis.Agua destilada. y ferropénicas en general. REACTIVOS PROVISTOS Solución saturante: solución estabilizada de Fe (III).2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso. .Cuantificación de hierro sérico Fer-color Transferrina Método colorimétrico para la determinación de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) del suero SIGNIFICACION CLINICA En el organismo humano.Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. MUESTRA Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . FUNDAMENTOS DEL METODO La transferrina o proteína transportadora específica del hierro. estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte. El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitación con carbonato de magnesio.) en las hepatopatías crónicas. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimétricamente según la técnica de Fer-color o Fer-color AA.

L. Biochem. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. La concentración de Fe (III) de la Solución saturante es 10 veces mayor que la del Standard. Por lo tanto. .Dixon. Baginski. D.C. . Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC.p..Rojkín. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. 56/4:543 (1971). 10/5:127 (1973)..S. Drappo. . E.I. +23. no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos. 1492002).000 r. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes datos: Nivel 280 ug/dl 560 ug/dl D."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". En ese caso se informan tres valores: Hierro Sérico.Young. Wiener lab. PROCEDIMIENTO a) Saturación de la transferrina: en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solución saturante. Saturación de la Transferrina: 20-55%.. BIBLIOGRAFIA . multiplicando por dos el resultado final.S.Am.III Congreso Argentino de Bioquímica . M...Clin. Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente. . K. E. . Centrifugar 10-15 minutos a 3. b) Colorimetría: seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA.Zak.2 ug/dl +28. como la medida exacta de esta solución no es crítica. que se calcula de la siguiente manera: Hierro sérico (ug/dl) Transferían (ug/dl) Saturación % = x 100 Si se desea efectuar simultáneamente la determinación de hierro sérico para el cálculo del Porcentaje de Saturación. VALORES DE REFERENCIA La literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturación de la Transferrina en personas normales: Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl. Epstein. 31 . Path. La agitación deberá ser vigorosa y en sentido longitudinal.Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente. Clin.M. y Wiener. AACC Press. 4/4:621 (1971). 8.000-4.Buenos Aires (1975). 1990.V. Toxicol. La agitación insuficiente producirá valores falsamente aumentados de Transferrina. Olguín de Mariani. J. 3rd ed.Ann. Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados. M. hasta obtener sobrenadante límpido o con la opalescencia propia del suero. . CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas y efectuar los cálculos de la misma manera que en la determinación de hierro sérico. puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml. y Albarracín. G. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.H. . Habitualmente se realiza la determinación de hierro sérico juntamente con la de transferrina.29% 5.16% PRESENTACION Reactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) (Cód.. Transferrina y Porcentaje de Saturación de la Transferrina. Clin.S. A. Además.m. B. por la dilución del suero. comenzar con la Saturación de la Transferrina 30 minutos antes.S.9 ug/dl C. .

wiener-lab.Argentina http://www.A. Disp. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.C.ar Dir. Riobamba 2944 2000 .: Viviana E. Téc.S.I.Rosario .com.2000 Rosario .Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Nº: 1287/77 .220/00 32 .

formando parte de la hemoglobina. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. hábitos alimenticios y actividad eritropoyética). particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto. edad. contiene hierro en su grupo hemo. bazo. la transferrina.). PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". La otra causa más común de anemia ferropénica.25 mol/l para pH 3. Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo PBTS: listo para usar. que se mide a 560 nm. Un aumento en el valor de los Blancos indicará una contaminación con hierro. Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas. 33 . Standard: solución de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl. b) Aditivos: no se requieren.Fer-color Método colorimétrico para la determinación de hierro sérico sin desproteinización SIGNIFICACIÓN CLINICA El hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos. médula ósea y parénquima hepático. debida a hernia de hiato. Buffer succinato: solución de succinato 0. pigmento más importante de las células musculares. Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Variaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo PBTS: solución estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l. el ácido mercaptoacético. sexo. indican contaminaciones ocasionales (agua. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de mañana) ya que las fluctuaciones fisiológicas son significativas durante el día. y otras veces a desórdenes caracterizados por una síntesis defectuosa de hemoglobina o fenómenos hemolíticos. Reductor: ampolla autorrompible conteniendo ácido mercaptoacético al 70 %. y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las células del sistema reticuloendotelial de hígado. etc. piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta. y carcinomas de estómago y colon. Standard: listo para usar. a veces imperceptible.7 y en presencia de un reductor. A veces se asocian a terapia transfusional. vertiéndolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversión. úlceras gástricas o duodenales. Buffer/Reductor: en refrigerador (2-10oC) es estable durante un año a partir de la fecha de su preparación. MUESTRA Suero a) Recolección: debe usarse únicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reacción. Ocurre con frecuencia en mujeres. en buffer succinato de pH 3. Anotar en el rótulo la fecha de preparación. material de vidrio. Antes de usar llevar a 18-30oC. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. Posteriormente reacciona con el reactivo de color. FUNDAMENTOS DEL METODO El hierro sérico se libera de su unión con su proteína transportadora específica. La anemia por pérdida de hierro representa uno de los trastornos orgánicos más frecuentemente encontrados en la clínica médica.7. La mioglobina. es la pérdida de sangre a través del tracto gastrointestinal.

despreciable la contribución del agua en dicho Blanco. hiperlipemia.02 uOhms). .Dixon.a. 1990. .c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl. 10-15%. Path. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando la misma muestra en 10 días diferentes.Espectrofotómetro o fotocolorímetro. Por otra parte. Efectuar este control periódicamente.Temperatura de reacción: temperatura ambiente .. D. si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0. . .Tiempo de reacción: 10 minutos .C. el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemólisis. Secar el material preferentemente a no más de 80°C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plásticos.O. eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro. A. Epstein. 1492001). BIBLIOGRAFIA . Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.Valores de Blanco aceptables: la determinación de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos. .S. Olguín de Mariani. para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p. No invertir para evitar contaminaciones..S.M.Volumen total de reacción: 2. los cuales deberán desecharse.I. es indicio de contaminación grosera de los reactivos. Drappo. . .Longitud de onda: 560 nm en espectrofotómetro o 540-560 nm en fotocolorímetro con filtro verde. c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 500 ug/dl.Clin. El Blanco de Reactivos. .Zak.5 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco de Reactivos). . C. 3rd ed. b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alícuotas de un mismo suero. se obtuvo un coeficiente de variación del 4. 4/4:621 (1971).H. B. Para controlar esto último. K. Toxicol..5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2. M. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC).Volumen de muestra: 500 ul . MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cód. iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl. Biochem. y Wiener. Baginski. se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0..O.Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro.Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla o por agitación suave.III Congreso Argentino de Bioquímica Buenos Aires (1975). Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinación de hierro.2%. Si bien hemólisis ligeras no interfieren con este método. J. 10/5:127 (1973). AACC Press. se recuperó entre 90 y 103%. .Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. CONDICIONES DE REACCION .S.Ann.5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". .150 D. debiendo ser además.. Clin. E. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO . ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones.Rojkín. Caso contrario.Tubos de fotocolorímetro. no debe ser superior a 0. Y Albarracín.150 D. A. L. G. . para un nivel de Fe sérico de 129 ug/dl. E. 56/4:543 (1971). M. Clin. S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Agua bidestilada Standard Suero 500 ul S 500 ul D 500 ul 34 . .Young. reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0. L.Am.

Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. 2000 Rosario . restándoles los Blancos correspondientes: S . 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo.A.: Viviana E. Nº: 1287/77 .198/00 35 .wiener-lab. 100 ug/dl S corregida Wiener lab. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Los tubos deben ser leídos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.Argentina http://www.com.B = S corregida D . CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas de S y D. Riobamba 2944 2000 .6 ug/dl Mujeres: 103. llevando el aparato a cero con agua. Agregar.Búfer/reductor 2 ml 2 ml 2m Mezclar.S. Disp. Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de Suero BS) en espectrofotómetro a 560 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua.3 ug/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.Rosario .C. VALORES DE REFERENCIA En un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos. Téc. manteniendo el frasco gotero en posición vertical.I.(B + BS) = D corregida Fe (ug/dl) = D corregida x f Donde: f = METODO DE CONTROL DE CALIDAD Standatrol S-E 2 niveles. se halló un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios: Varones: 114. con edades oscilando entre los 18 y 51 años. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos.ar Dir.

MEDICIÓN DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA La fragilidad osmótica mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio. INTERPRETACION Y EVALUACIÓN DE RESULTADOS La hemosiderina teñida mediante la tinción de Perls aparece bajo la forma de gránulos de intenso color azul. La tinción de Perls permite valorar también el hierro no hemínico presente en el citoplasma de los eritroblastos y determinar el número de los que presenten uno o más gránulos de hemosiderina (sideroblastos). Se han establecido scores para la semicuantificación de la reacción. 3. METODO 1. Lavar los frotis colocándolos en la solución de contraste durante 30 minutos. luego del tratamiento con drogas. Este test ha sido muy usado experimentalmente como medida de la viabilidad del glóbulo rojo y clínicamente con fines diagnósticos. 4. que se observan normalmente a nivel de las zonas de abundantes macrófagos. La fragilidad osmótica se ve aumentada en anemias hemolíticas. como la esferocitosis hereditaria. anemias por deficiencia de hierro y talasemias. Microscopio óptico. como la indometacina.Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls La coloración de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de célula pudiendo ser aplicada a las células presentes en un frotis o extensión de sangre o médula ósea. fijar los frotis en vapores de formol durante 30 minutos (algodón empapado de formol en el fondo de un vaso de Coplin). MATERIAL 1. Refleja la habilidad de la eritrocitos para captar agua sin lisar. constituye el hierro no hemínico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las células del sistema mononuclear fagocítico. mientras que se ve disminuida en la anemia con células S (sickle cells). 3. Frotis de la médula ósea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. que se considera el resultado de la precipitación de varias moléculas desnaturalizadas de apoferritina. 2. 36 . La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina. Normalmente. Solución clorhídrica de ferricianuro potásico.2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente(24ºC). 2. Debe prepararse extemporáneamente mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de ferricianuro potásico al 2% en agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0. Solución de contraste eosina (1 g/L de H2O) o safranina(1 g/L de H2O. Introducir los frotis fijados en la solución clorhídrica durante 1 hora a temperatura ambiente.

4. a 2500 rpm por 15 minutos y se realizan lecturas de los sobrenadantes a 540 nm. 5.0. 7. Luego se grafican las curvas de % de hemólisis vs.0. Si se produce un desbalance en el equilibrio entre la producción de eritrocitos por la médula ósea y su eliminación esplénica. Este test es por lo tanto. 6.0. 4. La fragilidad osmótica. El grado de hemólisis es determinado midiendo la hemoglobina liberada a partir de las células. luego de mezclar por inversión. indicador del estado de la membrana eritrocitaria. Se centrifugan. Para preparar las soluciones de ClNa se parte de una solución 10 g/L y se realizan diluciones de la misma. La forma de la curva que muestra el grado de hemólisis en función de la [ClNa] sugiere que ésta puede ser el resultado de la distribución de las poblaciones de GR. posiblemente. 9. 37 .5. mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio. el mismo es quitado de circulación. la membrana del glóbulo rojo pierde su capacidad de deformación . Para realizar la medición.0 y 1.0.0. se deben mezclar 50 µl de sangre con 5 ml de soluciones con diferentes concentraciones de ClNa : 10.En este test se mide la capacidad de deformación o elasticidad de la membrana del glóbulo rojo. diferenciadas de acuerdo a la resistencia de su membrana. 2. a alguna alteración de las proteínas del citoesqueleto de la membrana eritrocitaria. Las variaciones en la fragilidad osmótica son definidas como cambios en las curvas de hemólisis y son establecidos por determinación de la [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. 8.0 g/L. Si por alguna alteración del citoesqueleto.0. La concentración de ClNa que produce el 50 % de hemólisis puede ser determinada calculando el % de hemólisis según la siguiente ecuación: % de hemólisis = (DOs -DObl) x 100/ DOo donde: DOs= densidad óptica del sobrenadante DObl= densidad óptica del blanco DOo= densidad óptica de la solución de 1 g/L de ClNa. 3. la cual es imprescindible para que el eritrocito pueda circular libremente.0.0 g/L es usada como blanco. fundamentalmente a través de los capilares esplénicos.0. [ClNa] y de las mismas se extrae el valor de [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. nos encontraremos ante la presencia de una anemia hemolítica debida. Las diluciones se realizan por duplicado. La solución de 10.

........... pH 7.. debe usarse heparina como anticoagulante...... c) Sustancias interferentes conocidas: las muestras con hemólisis visible o intensa pueden producir valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usadas. Tapar y agitar suavemente por inversión hasta disolución completa......... pH 7. o superiores a 1..... REACTIVOS PROVISTOS Buffer: solución de buffer Tris..2 conteniendo piruvato y cloruro de sodio......800 D....... MUESTRA Suero o plasma a) Recolección: se debe obtener suero de la manera usual y separar del coágulo dentro de las dos horas de su obtención......2 mmol/l ClNa ....... la actividad de LDH total (junto con las de CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnóstico.. Por otra parte......... d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca................ Sustrato: agregar el volumen de Buffer indicado en el rótulo a un vial de Sustrato............ FUNDAMENTOS DEL METODO Basado en el siguiente esquema de reacción: LDH Piiruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+ Las concentraciones del ensayo están optimizadas de acuerdo a la Sociedad Francesa de Biología Clínica (SFBC)............ Sustrato: viales conteniendo NADH....... Sustrato reconstituido: estable 21 días en refrigerador (2-10oC) o 3 días a temperatura ambiente a partir del momento de su reconstitución............. 38 .....O...... (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo....LDH-P AA Método UV optimizado (SFBC) para la determinación de lactato deshidrogenasa (LDH) en suero o plasma SIGNIFICACION CLINICA La determinación de la actividad de lactato deshidrogenada (LDH) en suero... Fechar........ También puede usarse plasma..... Concentraciones finales (según SFBC) Tris .. pielonefritis.... alcanza un pico entre las 48 ..... La LDH es estable hasta 24 horas en refrigerador.. 1........ La misma comienza a aumentar de 12 a 24 horas después de producido el infarto.......72 horas y permanece elevada hasta el séptimo o décimo día. En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM). tiene una gran variedad de aplicaciones clínicas. 80 mM.800 D..... b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma........................... ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja........ PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". lecturas de absorbancia del Sustrato reconstituido inferiores a 0.....6 mmol/l NADH .. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada........... también se registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis hepática (producida por agentes tóxicos o por infecciones agudas como la hepatitis viral) e incluso acompañando a necrosis tubular renal..... 0.. No congelar.............. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método........2 Piruvato .. 200 mmol/l INSTRUCCIONES PARA SU USO Buffer: listo para usar...............O..

118 II (30-37ºC) 8. Esperar 30 segundos.871 17.O. estando el sustrato en condiciones.00 (*) Calculados Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. .016 9.MICROTECNICA Emplear 20 ul de muestra y 1.MACROTECNICA Emplear 50 ul de Muestra. En este caso. B) 30-37oC I. restando cada lectura de la anterior y promediando los valores.095 8. . . PROCEDIMIENTO A) 25oC En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo. se obtienen los siguientes valores: 39 .Cronómetro. luego agregar: Muestra 100 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro.253 15.800 D.683 9. II. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (∆A/min). 30 ó 37oC. . CALCULO DE LOS RESULTADOS LDH (U/l) = ∆A/min x factor En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción seleccionada (30-37oC o 25oC) y a la técnica empleada (micro o macrotécnica) como se indica en la siguiente tabla de factores: Longitud de onda 340 nm 334 nm 366 nm VALORES DE REFERENCIA Temperatura Valores (U/I) 25ºC 120-240 30ºC* 160-320 37ºC* 230-460 Temperatura I (30-37ºC) 9. Utilizar este promedio para los cálculos. . 2 y 3 minutos de la primera lectura. CONDICIONES DE REACCION (Disminución de absorbancia) .Material volumétrico adecuado. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. siguiendo el procedimiento indicado en A). la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0. .0 ml de Sustrato reconstituido siguiendo el procedimiento indicado en A). indica una muestra con muy alta actividad de LDH (que consume NADH aún antes de esta lectura).Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir. Leer la absorbancia inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra.Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. repetir la determinación con muestra diluida 1/10 con solución fisiológica y multiplicar el resultado por la dilución efectuada.La humectación es causa de deterioro del Sustrato.Tiempo de reacción: 3 minutos y 30 segundos.921 5.Temperatura de reacción: 25.Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero.Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366) .Los volúmenes de muestra y reactivo se pueden reducir proporcionalmente sin que varíen los factores de cálculo. . .Espectrofotómetro. Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada temperatura.MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . colocar: Sustrato reconstituido 3 ml Preincubar unos minutos.941 25ºC 4.

... Comisión de Enzimas ..............Ann........3 x 20 ml (Cód........"Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests"... 2.... +5.... PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Longitud de onda primaria ...........17% 1. con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor.. 3 segundos Tiempo de retardo ... Disp........A....Rosario ...... 2000 Rosario ................ el mínimo cambio de actividad detectable será de 5 U/l (a 340 nm y a 25oC).............................. 1521303)........ 340 nm Longitud de onda secundaria (bicromática) .... 40:160.Argentina http://www.200 D...........Quim.... disminuye Temperatura de reacción ..... 1990..... 3rd ed. ∆A/min (a 340 nm y 25oC)... 1989....095 Coef.5% y semiancho de banda ≤ 8 nm. 57-61... Si la ∆A/min es superior a 0...99 U/l C......S... Wiener lab............. 1:50 Tiempo de equilibrio ......... Clin...Comité Científico... De acuerdo con la sensibilidad requerida.001. Riobamba 2944 2000 .................... repetir la determinación con muestra diluida 1/5 ó 1/10 con solución fisiológica.......Societé Française de Biologie Clinique (SFBC) .. ....... Valor normal inferior .... (366 nm y 25oC)...... 37oC Relación muestra/reactivo ...... Límite de absorbancia .200 D.000 D...................... cinética Dirección de la reacción . extinción molar (∑340) ............... PRESENTACION ..... ..........100 D.... luz espuria ≤ 0........ 230 U/l Valor normal superior .: Viviana E. Biol......S....... Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.3 [l x mmol-1 x cm-1] Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso............. c) Rango dinámico: el rango útil de lectura se extiende hasta 0..... 1000 U/l Factor (paso de luz 1 cm) .. 60 segundos Absorbancia de blanco ............. ...O.......... 40 segundos Tiempo de lectura ..Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.........17% b) Límite de detección: depende del espectrofotómetro empleado y de la longitud de onda................... Nº: 3330/97 Cert.14 U/l +7........ AACC Press............ar Dir.............Young.......... reproducibilidad ± 2 nm....C.........O. 380 nm Tipo de reacción ...... Téc....S....O.. 6................I. Nº: 2114/97 40 ...... en espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366)......V.......... > 0........................ 1...................wiener-lab............. corrigiendo consecuentemente los resultados.........Sociedad Española de Química Clínica ......................O.............. (340-334 nm y 25oC) o 0. para un ∆A/min de 0............ 1982..Nivel 438 U/l 683 U/l D...........O......... BIBLIOGRAFIA .... 460 U/l Linealidad ...com......... D.. Clin... 8..................700 D....

Nitrito de Sodio: solución de nitrito de sodio 0. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". para efectuar la calibración periódica del equipo. c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis moderada o intensa inhiben la reacción directa. Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. REACTIVOS PROVISTOS Desarrollador: solución acuosa de benzoato de cafeína 0. debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción. es captada por el hígado para su conjugación y excreción en la bilis.Bilirrubina Método colorimétrico para la determinación de bilirrubina directa y total en suero y otros líquidos biológicos SIGNIFICACION CLINICA La bilirrubina. De forma tal que. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente (< 25oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. plasma o líquido amniótico a) Recolección: obtener suero o plasma de la manera usual. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento. obteniéndose valores de bilirrubina total falsamente aumentados. por lo que la determinación de la bilirrubina en estos niños recién nacidos resulta sumamente importante. También es posible realizar la determinación en líquido amniótico. .17 mol/l. pueden ser indicio de deterioro de los mismos. La eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido es una patología provocada por incompatibilidad maternofetal en la que se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos.Agua destilada. Rotular y fechar. para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra.13 mol/l. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca.07 mol/l. la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reacción. el suero debe conservarse hasta 48 horas en el refrigerador (2-10oC) y la 41 . MUESTRA Suero. Diazorreactivo: en refrigerador (2-10oC) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3 meses a partir de la fecha de su preparación. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo. Reactivo Sulfanílico: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0. REACTIVOS NO PROVISTOS . compuesto de degradación de la hemoglobina.Bilirrubina Standard provisto separadamente por Wiener lab. FUNDAMENTOS DEL METODO La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La presencia de sedimento y/o cambio de coloración de los reactivos. Reactivo Sulfanílico: listo para usar. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina sérica con el consecuente riesgo de difusión del pigmento al sistema nervioso central. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma. mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo Sulfanílico. tamponada y estabilizada. Proteger de la luz natural o artificial. envolviendo el tubo con papel negro. INSTRUCCIONES PARA SU USO Desarrollador: listo para usar. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias. debe usarse heparina para su obtención.

Volumen final de reacción: 2. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. habrá sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre. . CALCULO DE LOS RESULTADOS Bilirrubina total (mg/l) = (T .2 ml Proceder de la misma manera que en la técnica I. De tal forma. Si se lee antes. de acuerdo a la severidad de la ictericia. Sueros ictéricos: debe emplearse la técnica descripta pero con menores cantidades de muestra.38 respectivamente.TECNICA PARA LIQUIDO AMNIOTICO Se determina bilirrubina total. Es por tal motivo que debe protegerse cuidadosamente. Luego de 5 minutos.5 ml 0.B) x f Bilirrubina directa (mg/l) = (D .Temperatura de reacción: temperatura ambiente . . . en caso de ictericia moderada se usarán 50 ul de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren sólo 20 ul. llevando el aparato a cero con agua destilada. METODO DE CONTROL DE CALIDAD 42 . habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta.9 ml PROCEDIMIENTO I. En dos tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco) y T (Total) colocar: B Muestra (líquido amniótico) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 1 ml 1.Frasco de vidrio color caramelo. El líquido amniótico es conveniente mantenerlo congelado hasta el momento de efectuar el ensayo. La acción de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra. Si se lee después.Longitud de onda: 530 nm en espectrofotómetro o 520-550 nm en fotocolorímetro con filtro verde.Espectrofotómetro o fotocolorímetro.79 y 9. Dividir el resultado final por 5.Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.Volumen de muestra: 200 ul . . excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos.Reloj o timer. CONDICIONES DE REACCION .5 ml 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión.TECNICA PARA SUERO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco). .5 ml 200 ul D 200 ml 2.B) x f Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total .2 ml T 1 ml 1.37.sangre entera no más de 24 horas en refrigerador o 12 horas a temperatura ambiente. D (Directa) y T (Total) colocar: B Muestra (suero) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 200 ml 2.5 ml 0.Tubos de fotocolorímetro.Tiempo de reacción: 5 minutos .BRB directa El factor colorimétrico (f) debe calcularse con el Standard de Bilirrubina de Wiener lab. leer en espectrofotómetro a 530 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520-550 nm). II. Multiplicar los resultados obtenidos por 3.5 ml 200 ul T 200 ml 2.

Bilirrubina en líquido amniótico Valores menores de 1 mg/l son considerados normales. mientras que entre 1 y 2.Standatrol S-E 2 niveles. dependiendo del grado de inmadurez hepática. En los prematuros. VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina en suero o plasma .Adultos: Directa: hasta 2 mg/l Total: hasta 10 mg/l . Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.7 mg/l sólo se encuentran en presencia de eritroblastosis fetal.7 mg/l el feto ya se encuentra afectado y tiene probablemente algún tipo de falla circulatoria. Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4.7 mg/l sugieren la posibilidad de un feto afectado. los niveles de bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad.Recién nacidos: Nacidos a término Sangre de cordón Hasta las 24 hs Hasta las 48 hs Del 3º al 5º día 25 mg/l 60 mg/l 75 mg/l 120 mg/l Prematuros 80 mg/l 120 mg/l 240 mg/l Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. Si la cantidad de bilirrubina sobrepasa los 9.5 mg/l la muerte fetal es inminente. Los niveles por encima de 2. 43 .

R.4% 4.. Riobamba 2944 2000 . Wiener lab.0 mg/l 9. .C.Zaroda. c) Recuperación: agregando cantidades conocidas de bilirrubina a distintos sueros. J. PRESENTACION Equipo para 200 determinaciones (Cód.S.O’Brien. .5347/98 44 .S. .: Viviana E."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". J. Nobuoka. se obtuvo lo siguiente: Bilirrubina directa Bilirrubina total Nivel 2. D. et al . Harper & Row Pub . 8.LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Acta 19/2:249 (1968).wiener-lab. 7/6:603 (1961).62 mg/l +0. +0. 1990. es capaz de destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente.Clin. M. tanto sobre los sueros como sobre las soluciones standard.Young. .Rosario . AACC Press.7 mg/l D. D. 1120001).A.Watson.7% 1. Path. .1 mg/l 26.8 mg/l 127.Clin.Argentina http://www. Chem. (1968). Nº: 252/75 . 2000 Rosario .Am.Botwell.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. BIBLIOGRAFIA . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.47 mg/l +1. . La acción de la luz. H. Chim. se obtuvo una recuperación entre 100 y 106%. . PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día.V. D. Clin. Téc.S. .18 mg/l +0.com.1% b) Linealidad: la reacción es lineal hasta 150 mg/l. Chem.4a Ed. 45/1:70 (1966).45 mg/l C.Clin.I. 10/3:197 (1964). Disp.5% 2. . 3rd ed. .ar Dir.“Laboratory manual of pediatric microbiochemical techniques”.. T.Ichida.

. realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts. Desconectar la corriente y retirar las tiras. La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba. REACTIVOS 1) Solución buffer: Tris... 6... 22. 9..Separación electroforética de hemoglobina SOPORTE Acetato de celulosa gelatinizado..... Decolorar con 3-4 baños de solución decolorante. La superficie de las tiras que es penetrable a las proteínas se reconoce porque es más opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro... Determinación cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solución disolvente y agitar. 3.................... 8...... 5) Solución de transparentización: Metanol ..... Colorear durante 5 minutos....... La HbA2 tiene una velocidad menor que la A. 4) Solución deshidratante: Metanol puro.6 g H2O destilada. Las tiras secas pierden las dimensiones y las características del gel... 1 ml 6) Solución disolvente: Ácido acético 80% Técnica: 1. a continuación se las coloca en la solución 45 ... 85 ml Ácido acético . Conectar la fuente de poder. Las tiras deben conservarse en posición vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%.5 g en 100 ml de ácido tricloroacético 5% (dosis para 20 tiras) 3) Solución decolorante: Ácido acético 5%.. FUNDAMENTO Las diferentes hemoglobinas se separan por migrar a diferentes velocidades.. Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética..1 g Glicina . Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos 2.. hasta ver el fondo blanco de la tira. Transparentización: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos.. 7........ queda en la HbA migrando juntas.... En este medio la HbA migra hacia el ánodo.6)... 14... 4.. Leer a 520 nm si se usó colorante Ponceau S...... 14 ml Glicerol .. Operar rápidamente para evitar evaporaciones.... durante 90 minutos...... La tira debe estar bien tiesa y plana. mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades)....... en medio alcalino (pH= 8. Eliminar el exceso de líquido secando entre 2 papeles de filtro............ Sembrar las muestras con el hemolizado obtenido (ver más adelante)........ 1000 ml 2) Solución colorante: Ponceau S: 0.. 5.....

Se colocan luego en una placa de vidrio.transparentadora durante 1 minuto como mínimo. Así se conserva para leer en densitometría. El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatías: TIPO Normal Polo negativo Anhidrasas Carbónicas Recién nacido Anhidrasas Carbónicas Drepanocitosis homocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Drepanocitosis heterocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Hemoglobinopatía C homocigota Anhidrasas carbónicas Hemoglobinopatía C heterocigota Anhidrasas HbC Carbónicas β-talasemia heterocigota β-talasemia homocigota Doble Heterocigota S/C Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbC HbS Carbónicas HbA HbC HbA HbF HbA HbA2 Polo positivo HbA ACLARACIONES HbA 98% HbA2 2% HbF 90% HbA 10% HbA2 2% HbS 98% HbA < 50% HbS > 50% HbA2 2% HbC 98% HbA2 2% HbC > 50% HbA < 50% HbA2 entre 4-8% HbA HbA2 normal % de HbF y HbA. hasta la transparencia completa. eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos. variable según tipo de Th homocigota HbS 50% HbC 50% HbF HbA 46 .

47 . aunque se recomienda la heparina.8 ml de tolueno (rompe los glóbulos blancos). 3. Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm. Obtener 5 ml de sangre por punción venosa.PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO Técnica 1. mediante el método de la cianmetahemoglobina. agitar vigorosamente durante 1 minuto. Se determina la concentración de hemoglobina en el bemolizado obtenido. recoger con pipeta Pasteur el infranadante y filtrar. Colocar en heladera (favorece la hemólisis). 5. Se lava tres veces con solución fisiológica. 6. 2. usando cualquier anticoagulante. se agrega un volumen de agua destilada igual al del paquete globular y 0. desechando los sobrenadantes. se lleva la concentración hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada. dejar 24 horas. 4.

Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke
FUNDAMENTO La hemoglobina fetal (HbF o α2γ 2) es ácido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos. REACTIVOS 1. Alcohol etílico al 80% 2. Buffer de ácido cítrico, pH 3,4 Solución A: Ácido cítrico............................ 4,2 g Agua destilada......................... 100 ml Solución B: Citrato de sodio........................ 5,9 g Agua destilada......................... 100 ml Solución Buffer pH 3,4: Solución A ................ 84 ml Solución B................. 16 ml 3. Eritrosina o eosina al 0,1 % en agua. DESARROLLO 1. Extendidos de sangre secos de no más de una hora de obtención, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etílico al 80% 2. Lavado rápido con agua y secado. 3. Inmersión en una cápsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37°C un mínimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rápidamente en agua común y secar en posición vertical. 4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solución de eritrosina o eosina. Lavar con agua y secar. RESULTADOS Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras. El análisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hematíes coloreados e incoloros.

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DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA FETAL: METODO DE SINGER FUNDAMENTO Debido a la muy semejante movilidad de la hemoglobina normal (HbA) y la hemoglobina fetal (HbF), cuando usamos los métodos electroforéticos de rutina para el estudio de hemoglobinas, es necesario valerse de la propiedad de la HbF (y la Hb Bart( de ser resistentes a la desnaturalización en medio alcalino. REACTIVOS 1. Solución de hemoglobina (véase obtención de bemolizado) 2. OHNa 1/12 N (recién preparado) 3. Reactivo precipitante SO4(NH4)2 .............................. 38 g ClH 1N ..................................... 2,5 ml H2O destilada ........................... 100 ml TÉCNICA Se preparan tres tubos: • • • • Tubo 1: Blanco: 3,2 ml de OHNa 1/12 N, agregar 6,8 ml de reactivo precipitante y filtrar. Tubo 2: Hb 100: 5 ml de agua destilada, agregar 0,02 ml de la solución de hemoglobina Tubo 3: Hb álcali-resistente: 3,2 ml de oHNa 1/12 N, agregar 0,2 ml de solución de hemoglobina y disparar en el momento un crónometro, a los 60 segundos agregar 6,8 ml de reactivo precipitente, invertir varias veces y filtrar. Leer en un espectrofotómetro a 540 nm, llevar a cero con el tubo blanco (Tubo 1).

CÁLCULO % de Hb álcali-resistente = VALOR NORMAL Menos de 2%. DO tubo 3 x 20 DO tubo 2

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Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs
A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION a) Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2 % en salina fresca (véase más abajo el apartado C. Preparación de la suspensión globular al 2%). b) Agregar una gota de la suspensión globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn. c) Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A1, B y O al 2% d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. e) Leer primero los controles y luego los problemas microscópicamente en visor y microscópicamente. f) Scores de lectura: +++ un gran aglutinato ++± varios aglutinatos grandes ++ muchos aglutinatos pequeños +± pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo + aglutinatos visibles pero solo microscópicamente aglutinatos conteniendo muy pocas células tr trazas - negativo B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO a) Tomar una muestra de suero libre de hematíes. b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los siguientes hematíes: 1) hematíes A conocidos 2) hematíes B conocidos 3) hematíes del propio individuo 4) hematíes O conocidos c) Incubar 1 hora a ta o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. d) Leer primero los controles y luego los problemas , microscópicamente en visor y microscópicamente. C. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2% Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn. a) Llenar el tubo con solución fisiológica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. b) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución fisiológica. c) Tomar una gota de culot (50 µl) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la suspensión al 2%.

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e) Proceda de la misma manera con los tubos controles. Negativa: los hematíes (Rh-rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar aglutinación. Al terminar de mezclar. F. Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto. E.1 Controles a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D c) Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA a) b) c) d) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota. Agregar una gota de anti-A absorbido1 y mezclar bien con una varilla de punta fina. d) Desprenda suavemente el culot globular y lea.D. PRUEBA PARA DETECTAR Du 1 También se puede utilizar un monoclonal anti-A1 51 . TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn. E. Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados: Glóbulos rojos problema Anti A + + GR A + + Anti B + + GR B + + Anti AB + + + GR AB + + + Grupo ABO A B O AB Grupo ABO A B O AB Suero problema E. b) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra. La lectura se hará microscópicamente con un visor y microscópicamente.2 Reacciones • • Positiva: los hematíes D(Rho) positivos permanecerán aglutinados al querer desprender el culot globular. c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm. disparar el cronómetro.

F. El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparación del suero). COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS.dado que. Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda falsear los resultados. se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados. Probar la bondad del suero 2.Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti –D. El tercer control. en tales hematíes el factor D(Rho) es mas reactivo. G.2 Controles utilizados Se utilizan tres controles para 1. Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con el antígeno E(rh”) presente . 52 . Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du. Coloque dos gotas de suero anti –D(Rho) en un tubo de Kahn2.1 Reacciones • • Positiva: los hematíes Du (Rhou) positivos permanecerán aglutinados luego de intentar desprender el culot globular. es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti –D por suero de persona de grupo sanguíneo AB. 6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm. Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C. Centrifugue y elimine el sobrenadante. 5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana. desprenda suavemente el culot globular y lea. 1) 2) 3) 4) F. Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en salina . Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs. 2 La detección de Du también se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du. La lectura se hará macro y microscópicamente. Negativa: los hematíes Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspenderán y no aglutinarán. Para seudoaglutinación Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). Comprobar su especificidad 3. Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo).

Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%.1 Prueba de Coombs indirecta 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes de grupo O Rh+ al 2%. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%. 7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de 1 hora a 37 °C. 5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. 9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica. G.2 4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 2) Centrifugar.2 Prueba de Coombs directa 6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. eliminando completamente el sobrenadante en el último lavado. 53 .2 8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.G. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm.

fosfato. implica grupo O. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: . b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS) .Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS) . Anti-B o Anti-A. B. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. dextrosa. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional. Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. adenina). INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar.Solución fisiológica . MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes. Anti-B o Anti-A. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente. fosfato.Albúmina Bovina 30% de Wiener lab. dextrosa) o CPDA-1 (citrato. La ausencia de aglutinación en todos los casos. citrato. PROCEDIMIENTO 54 . B. la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los demás ensayos pretransfusionales. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Las muestras recogidas con ACD. Por este motivo. con o sin anticoagulante. dextrosa) CPD (citrato.B Monoclonal Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en A. También demostró que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee.Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".Anti-A. AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A. ACD (ácido cítrico. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A. heparina.Centrífuga .Placas . Si se emplean coágulos. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). REACTIVOS PROVISTOS Anti-A.B monoclonal.Tubos de hemólisis . CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días.B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón. Si se utilizó heparina o EDTA. o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos altamente reactivos en su superficie. Anti-B o Anti A.

compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. Por esta razón deben extremarse los cuidados.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A. 1443153). .Leucemias u otros desórdenes malignos. 2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. Anti-B o Anti-A. . colorantes.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%.500 rpm.B monoclonal colocada en una placa limpia. I.TECNICA EN TUBO (por sedimentación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A. PBS o LISS. et al. se coloca una gota de estas células con 2 gotas de solución fisiológica. París. 1443152). 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Symp. Observar aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. No debe emplearse microscopio. Como control.Moore. Chapter 8. Biol. Anti-B o Anti-A.K. “Int. Develop. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación. resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la tipificación. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción positiva. II. Anti-B: frasco x 10 ml (Cód. 55 .Widman. Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera. Washington.B + + + + Grupo sanguíneo A B 0 AB Variants débiles del grupo A como Ax METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados. III.Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías. . 9th Edition.En las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solución fisiológica. sobre todo en los prematuros. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use”. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. Anti-B o Anti-A.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. Standard 57:49-59. 1983. No debe producirse aglutinación. el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica. 1443154). BIBLIOGRAFIA . S.TECNICA EN TUBO (por centrifugación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A.C. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cód. France. . American Association of Blood Banks 1985. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. . D.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones: . Antisuero Anti-A + + +/Anti-B + + Anti-A. “Technical Manual”.Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos. F.Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idéntico.

com.C.A. Nº: 1073/89 (Anti-B) Disp. Téc.S.B) 56 .ar Dir.: Viviana E.Rosario . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.wiener-lab.I.Wiener lab.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Disp. Riobamba 2944 2000 . 2000 Rosario .Argentina http://www. Nº: 1076/89 (Anti-A) Disp. Nº: 1071/89 (Anti-A.

INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Cuando se sospecha esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. CPD (citrato. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente. REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes.Anti-D (Rho) monoclonal Reactivo para la detección de antígeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en el laboratorio de los anticuerpos anti-D. fosfato. c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas.Centrífuga . dextrosa). EDTA. dextrosa.Solución fisiológica. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. podrán ser necesarios: . FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho).Placa de vidrio 57 . REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente: . Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. . ya sea por transfusión o durante el parto. Si se emplean coágulos. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. Sin embargo. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro". Las muestras recogidas con ACD. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido. produciendo anti-D. ACD (ácido cítrico. es el antígeno D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO. fosfato.Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab. citrato. adenina). Si se utilizó heparina o EDTA. Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC).Tubos de hemólisis . dextrosa) o CPDA-1 (citrato. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Dependiendo de la técnica que se emplee. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días.

1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. pág.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Ed.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. A. Biol. Riobamba 2944 2000 .R.Landsteiner.I. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico). LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las células luego de cada lavado.. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. Med.“Blood Groups in Man” . 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis.500 rpm.J. L. 4) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. .Widman. A. 1940. American Association of Blood Banks. mezclar. 2000 Rosario . 4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica.TECNICA EN TUBO Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos. Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-50oC. .. . Las muestras que aún en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du.Argentina 58 . 1443155). centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos.Rosario . o solución fisiológica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. o en solución fisiológica. o solución fisiológica. and Sanger. Oxford Blackwell Scientific Publications. 1959. Soc.Wiener.C. Chapter 9. F. . 6) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente. 3) 5) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. Wiener lab. . 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. 43: 223. luego centrifugar y volver a leer como se describió en 4).A.S. Unger. 3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. II.Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I.S.K. Wiener. 178.C.Proc.Race .9 th. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.“Technical Manual” .JAMA 169:696. K. Washington D. También puede emplearse sangre entera. R. BIBLIOGRAFIA . 1975. Exp. 1985.. R. . La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos sensibilizados. .PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos..6 th Ed. III.

Disp. Nº: 1074/89 59 .S.wiener-lab.http://www. Téc. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.ar Dir.: Viviana E.com.

C3bi. produce una aglutinación de los glóbulos rojos visible macroscópicamente. . . Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica. ACD (ácido cítrico. De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente: .Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos. heparina. .Investigación de reacciones dudosas en una transfusión.Fenotipo de glóbulos rojos. C3dg o C3d). .Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS). El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a antígenos del sistema Rh.Solución fisiológica. citrato. MUESTRA Glóbulos rojos a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS). adenina). Prueba Antiglobulina Directa . fosfato. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminación del mismo. . dextrosa. PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro". con o sin anticoagulante. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar.Suero Anti-humano (poliespecífico) Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs. REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3. dextrosa) CPD (citrato.Identificación y titulación de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. dextrosa) o CPDA-1 (citrato. fosfato. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA.Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. REACTIVOS NO PROVISTOS . Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prueba Antiglobulina Indirecta . 60 . Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. . FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b. .Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glóbulos rojos.Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido.

Tiempo o temperatura de incubación inadecuados.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal). . No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. 1) Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar..c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). . . Si se emplean coágulos.Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. . Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.Lavado inadecuado de las células. II. la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extracción). 1443156).PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos. Descartar completamente el sobrenadante luego del último lavado.Tubos de hemólisis PROCEDIMIENTO I.A. III. 1) En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar. Si se utilizó heparina o EDTA. 2) Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS. Finalmente preparar con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%.Lancet. 2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7) de la técnica I). LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: . 61 . 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra.500 rpm.R. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. 1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%.Coombs.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica). Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles. 2) Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS. 6) Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente. R. A. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. ii:15.Centrífuga . 1945..Concentración inadecuada de glóbulos rojos. Mourant. BIBLIOGRAFIA . 3) Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua.Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados. Las muestras recogidas con ACD. 3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos. Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas. R. . .E. 4) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos.R. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I). Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva.Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados. and Race. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. Si los glóbulos provienen de coágulos.Baño de agua a 37oC . Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos. 7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados con IgG débiles.

1985.Argentina http://www.S.A. A.Rosario .C.Widman.“Technical Manual”. Disp. Riobamba 2944 2000 .Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Exp. .. J. 376.C.R.A. R.Brit.Coombs.I. . 9th ed. . 26:225. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.K. Nº: 2503/91 62 . pág.wiener-lab.: Viviana E.com..R. American Association of Blood Banks. Washington D. Wiener lab. 1945. 2000 Rosario . F.E. Mourant. Téc.ar Dir. Path. R. and Race.

TITULACIÓN DE ANTICUERPOS A.300 ml de suero a titular en el tubo N°1. el título será (16+8)/2=12. 63 . con aglutinación. b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%.100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2. el tipo de aglutinato es tr. b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O con dos gotas del suero a titular. Colocar 0. e) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilución. d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Preparación de diluciones madres. numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. el título se determinará promediando dicha dilución con la precedente. el tipo de aglutinato es tr. a) Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de hematíes a usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes.100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación ± . colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos. Por ejemplo.1. Con una pipeta Pasteur para cada dilución.1. si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16. a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario). colocar 0. Agitar la mezcla. b) En los tubos 2 al 10.2 Titulación a) Se toman 10 tubos de Kahn.1. El grado de aglutinación se considerará según los scores anteriormente indicados. Si en la última dilución. c) Tomar 0. A.Determinación de anticuerpos inmunes A. c) Incubar a la temperatura apropiada . Homogeneizar y repetir la operación hasta completar las diluciones.100 ml de solución fisiológica (SF). el tiempo requerido. Luego se toman 0. d) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del suero.1 Técnica básica de titulación A.

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