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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS ASIGNATURA HEMATOLOGIA

Mtodos del laboratorio hematolgico


PRIMERA PARTE

Docentes

Dra. Nilda E. Fink Dra. Mara Elena Chiesa Dra. Ma. Alejandra Fernndez Alberti Bioq. Fernando Ventimiglia Bioq. Mariana Gonzlez Bioq. Jos Luis Casali

La Plata, 2007

Contenido
Pgina Instructivo para la obtencin de sangre perifrica por puncin venosa Descripcin de los anticoagulantes usados en hematologa Recuento de hemates Hematocrito Determinacin de hemoglobina: mtodo de la cianmetahemoglobina Velocidad de sedimentacin globular Recuento de reticulocitos Cuantificacin de hierro srico Tincin histoqumica de hierro: coloracin de Perls Separacin electrofortica de hemoglobina Deteccin histoqumica de hemoglobina fetal: reaccin de Kleihauer-Betke Grupos sanguneos ABO y Rh: pruebas de Coombs Determinacin de anticuerpos inmunes 3 5 7 12 15 21 26 29 34 42 45 47 57

Instructivo para la obtencin de sangre perifrica por puncin venosa


A) EN ADULTOS 1. Durante la toma de muestra deben guardarse las ms estrictas normas de higiene. 2. El material descartable a usar se abrir slo al momento de su utilizacin y, una vez manipulado, no podr guardarse nuevamente an cuando se lo considere nuevo. 3. Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin. 4. Los recipientes que contienen algodn y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirn solamente al momento de usar. 5. Al momento de hacer la extraccin colocarse los guantes desechables, los cuales se mantendrn puestos durante todo el procedimiento. 6. Antes de iniciar la toma de muestra, tener todo el material preparado pero sin abrir. 7. Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizndola visualmente y por palpacin. Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y cierre el puo para facilitar la extraccin. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresin del msculo no mayor a 1 mm. 8. Una vez identificada la vena, limpiar el rea circundante con algodn empapado en alcohol. Dejar secar perfectamente. 9. En este momento se romper el sello de garanta de la aguja, se la colocar en la jeringa sin tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del mbolo. 10. La aguja se insertar en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el mbolo. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba). 11. Despus de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete y luego la aguja, presionando el lugar de la puncin con un trozo de algodn seco. 12. LA AGUJA SE DESCARTAR EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN. 13. La sangre que est en la jeringa se descargar en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma. 14. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. 15. En el sitio de la puncin se pondr un apsito despus de controlar que no haya ms sangrado.

16. La persona que hace la extraccin deber quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. NO REUTILIZARLOS NUEVAMENTE. 17. Si hay algn dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro de muestras. B) EN NIOS 1. En nios mayores de 6 meses, se recomienda hacer la extraccin del brazo como en adultos, pidindole a un adulto que colabore en mantener inmvil al nio, en particular el brazo. 2. En el caso de nios menores de 6 meses, se proceder a extraer la muestra del taln con una lanceta descartable. Antes de la extraccin conviene calentar el taln frotndolo entre las manos para favorecer la irrigacin de la zona. 3. Desinfectar con un trozo de algodn embebido en alcohol, dejar evaporar y punzar con la lanceta, en la zona del taln indicada en el dibujo adjunto. 4. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante. Secar la zona con un trozo de algodn seco y una vez que no haya sangrado, colocar una curita o apsito.

Las flechas indican los lugares de puncin

Descripcin de los anticoagulantes usados en Hematologa


Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las caractersticas morfolgicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las clulas sanguneas a estudiar se encuentren en el estado ms parecido al fisiolgico, como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguneo. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los leucocitos, el tamao eritrocitario, no producir hemlisis e impedir la agregacin plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el mximo perodo de conservacin de la muestra (generalmente no ms de 24 horas incluso refrigerada a 4 C). Los anticoagulantes ms utilizados son: EDTA (C10H16N2O8) o sal disdica, dipotsica o tripotsica del cido etilendiaminotetraactico, actuando mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca+ + ), impidiendo el proceso de la coagulacin al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realizacin de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite adems la realizacin del hematocrito y del frotis sanguneo hasta dos horas despus de la extraccin de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinacin de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio, por ser ms fcilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto slido, sin embargo , las tres sales afectan el tamao del eritrocito, especialmente despus del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotsica como anticoagulante para recolectar muestras sanguneas destinadas al recuento y caracterizacin del tamao celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibracin de los contadores automticos. El K2EDTA .2H2O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio inico y el pH para una solucin al 1% es de 4.8+/-1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/ml. de sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulacin y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. HEPARINA SDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiolgico que acta impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacrido cido. Los frotis realizados con muestras sanguneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panpticas un color azulado y una pseudovacuolizacin celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporcin adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre. CITRATO TRISDICO, C6H5O7Na3, acta impidiendo que el calcio se ionice, evitando as la coagulacin. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporcin sangre: anticoagulante 9:1; as como para la velocidad de eritrosedimentacin en una proporcin sangre: anticoagulante 4:1. El citrato sdico se utiliza a una concentracin de 0.106 mol/l (31,3 g/L de C6H5O7Na3.2H2O). ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metablicos eritrocitarios por permitir una buena conservacin de los hemates. Se utiliza en una proporcin de un volumen de ACD por cada cuatro

volmenes de sangre. La proporcin de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Ctrico 0.9 g, Citrato disdico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 ml.

Recuento de hemates
A) RECUENTO MANUAL Consiste en hacer el recuento en una dilucin de sangre entera anticoagulada. Es un mtodo poco usado debido al elevado error que presenta. Lquido diluyente: solucin fisiolgica o citrato de sodio 3,8%. La dilucin empleada es de 1/200, para lo cual se mide exactamente: Solucin fisiolgica o citratada: 3,98 ml Sangre (con pipeta automtica): 0,02 ml El recuento se realiza en la cmara de Neubauer cuyo esquema es el siguiente:

El recuento de hemates se realiza en el cuadrado central, se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeos, como se muestra a continuacin:

Recuadro central:

Las lneas reforzadas, o triples, sirven nicamente como lmites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeos. Se deben contar 5 de estos cuadrados. La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm. Con la dilucin indicada, luego de agitar adecuadamente en un agitador de rodillos, se carga la cmara y se cuentan los glbulos rojos de los 80 cuadrados pequeos (zona sombreada). La cmara puede ser cargada con un capilar, evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente. Considerando entonces, que el retculo tiene 400 cuadrados pequeos en total, el clculo que se debe hacer es el siguiente: N x D x FC x ST = n de glbulos rojos/mm3 TC Donde: N: nmero de eritrocitos contados. D: Ttulo de la dilucin realizada (200). FC: Factor de correccin de la profundidad, para llevar a 1 mm3 (10). ST: Total de cuadrados pequeos en la superficie de 1 mm2 (400). TC: Total de cuadrados pequeos contados. Causas de error en el recuento en cmara cuentaglbulos El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a: Errores de extraccin: dilucin o hemoconcentracin. Coagulacin parcial. Hemlisis. Mala homogeneizacin por agitacin insuficiente de la sangre. 1. Utilizacin de material mal calibrado, sucio o hmedo. 2. Falta de suficiente agitacin de la sangre diluida. 3. Cmara cuentaglbulos mal ajustada, sucia o mojada. 4. Llenado incompleto de la cmara cuentaglbulos. 5. Empleo de cubreobjetos deformable, no rgido. 6. Clulas mal distribuidas en el fondo de la cmara. 7. Errores del operador al realizar el recuento. 8. Errores al efectuar los clculos.

B) RECUENTO AUTOMATIZADO La automatizacin ha contribuido de manera decisiva al aumento de la rapidez y la fiabilidad del recuento de las clulas sanguneas. Existen distintos tipos de instrumentos: los semiautomatizados que requieren algunos pasos previos, como por ejemplo diluciones de la muestra antes de ser procesada y, los aparatos totalmente automatizados slo requieren que se les suministre la muestra obtenida en condiciones apropiadas (por ejemplo: con el anticoagulante adecuado). Los sistemas de recuento celular por estos medios se basan en la medida del tamao u otras propiedades fsicas de las clulas suspendidas en medio lquido de acuerdo con uno de los dos principios siguientes: 1. Impedancia o resistencia elctrica. 2. Dispersin de luz o campo oscuro. B.1 Mtodo de la impedancia o de la resistencia elctrica Es el ms empleado en los autoanalizadores hematolgicos. Se basa en la propiedad de las clulas sanguneas de no conducir la electricidad. La sangre total es diluida en una solucin de conductividad estable, las clulas sanguneas as diluidas se hacen pasar por un orificio de apertura con un rea prefijada. Por dentro y fuera del orificio se disponen electrodos que establecen una diferencia de potencial. Cuando una clula pasa a travs del orificio, se genera una resistencia entre ambos electrodos que se registra como un impulso. El nmero de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular y como la amplitud del impulso es directamente proporcional al tamao de la clula, es posible determinar tambin el volumen celular. Este mtodo tiene algunas limitaciones. Como los impulsos elctricos que van a determinar el volumen celular se generan en el orificio de apertura del sistema, para cada poblacin celular que se quiera estudiar se deben seleccionar las condiciones para que sean analizadas sin error. Las condiciones ms importantes que deben tenerse en cuenta son: 1. La intensidad de corriente entre ambos electrodos: debe ser lo suficientemente sensible para detectar la resistencia que genera la partcula cuando atraviesa el orificio. Si es muy elevada puede daar las clulas y producir interferencias originadas por ruido electrotrmico. 2. El dimetro del orificio de apertura: debe estar en relacin al tamao de las partculas que se analizan. Debe ser perfectamente permeable, por lo general poseen un monitor de visualizacin que permite observar su permeabilidad durante el recuento. Es importante realizar peridicamente una limpieza de este orificio. 3. La concentracin de la suspensin analizada: debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia, es decir, que varias clulas atraviesen el orificio al mismo tiempo.

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B.2 Mtodo de dispersin de luz Se analiza la dispersin de luz producida por las clulas desde dos dimensiones gracias a sensores ubicados en ngulos diferentes. Las clulas se hacen pasar individualmente a lo largo de una cmara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz que puede ser halgena o lser. Cada vez que una clula se interpone en el haz de luz se produce una sombra que, proyectada sobre un campo oscuro, ser analizada por los sensores. Estos sistemas permiten medir la concentracin y el volumen celulares. Si adems, las clulas se someten a tinciones citoqumicas se pueden detectar midiendo la intensidad de dicha reaccin los diferentes tipos de leucocitos. Causas de error en el recuento automatizado Con el empleo de mtodos automatizados se puede cometer grandes errores si se olvida el control peridico y el calibrado diario de los instrumentos. En general, el error debido al propio mtodo de recuento electrnico, cuando se realiza en ptimas condiciones, suele ser inferior al 1%, pero puede incrementarse por: Errores de extraccin: dilucin o hemoconcentracin. Coagulacin parcial. Hemlisis. 1. Mala homogeneizacin por agitacin insuficiente de la sangre. 2. Uso de un diluyente incorrecto. 3. Presencia de partculas extraas en el diluyente. 4. Defectos en el sistema electrnico de recuento: a) Lisis incompleta de los eritrocitos en el orificio de leucocitos. b) Presencia de agregados celulares a nivel del orificio de recuento. c) Obstruccin de los capilares u orificios de recuento. d) Dilucin incorrecta de la muestra por el liquido diluyente. e) Presencia de microburbujas, que son contadas como clulas. f) Contaminacin por arrastre de un especimen con el siguiente. g) Presencia de interferencias electrnicas y averas de los componentes electrnicos del instrumento. C. VALORES DE REFERENCIA Edad Recin nacidos Nios (2-12 aos) Adultos jvenes (12-18 aos) Adultos jvenes (19-60 aos) Sexo ambos ambos mujeres hombres mujeres hombres Intervalo de referencia 4,7x1012/L - 6,3x1012/L 4,0x1012/L - 5,3x1012/L 4,1x1012/L - 5,1x1012/L 4,5x1012/L - 5,3x1012/L 4,1x1012/L - 5,2x1012/L 4,6x1012/L - 5,9x1012/L

D) INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

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Un aumento de la concentracin de eritrocitos con contenido hemoglobnico normal suele acompaarse de un aumento de la concentracin de hemoglobina y recibe el nombre de poliglobulia. Cuando el aumento de la concentracin de eritrocitos va acompaado de una disminucin de la hemoglobina, se habla de seudopoliglobulia, la cual puede acompaarse de microcitosis como en la talasemia. El descenso en la concentracin de eritrocitos en la sangre se acompaa siempre de una disminucin en la concentracin de hemoglobina (anemia) y puede deberse a diferentes causas como las hemorragias, la hemlisis o fallas en su formacin a nivel de la medula sea.

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Hematocrito
DEFINICION El hematocrito (Hto) es la relacin existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre, expresado como porcentaje. Est directamente relacionado con la concentracin de hemoglobina, por lo que su determinacin constituye el procedimiento ms simple para el diagnstico de anemia. As, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el aumento lo es de poliglobulia. El mtodo de referencia para la determinacin del Hto es la centrifugacin de sangre total en tubo capilar (micromtodo), es una tcnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. Aunque tambin puede emplearse un tubo de Wintrobe (macromtodo), este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisin. Ambos mtodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la accin de una fuerza centrfuga. Por ello, entre sus factores de error est el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura. En la actualidad, todos los autoanalizadores hematolgicos suministran, dentro del contexto del hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un clculo electrnico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentracin de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrnicamente difiere del obtenido por centrifugacin en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes clulas sanguneas, por lo que es siempre algo inferior (0,2-0,3 %). Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugacin o por mtodos automatizados, son un buen parmetro del estado de la serie eritroide. El Hto refleja la concentracin y no la masa total de glbulos rojos. Por ej., un paciente en estado de shock acompaado de hemoconcentracin, el Hto. puede ser normal o alto, an cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la prdida de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco despus de una hemorragia o una transfusin. A) METODOS MANUALES A.1 Macromtodo (macrohematocrito) Utiliza 0,6 ml de sangre entera anticoagulada con EDTA, tubo de Wintrobe con dimetro interno de 3mm . Centrifugamos durante 30 minutos a 2.000-3.000 r.p.m. La lectura del resultado se realiza extrayendo los tubos de la centrfuga y valorando la altura en milmetros de la columna eritrocitaria, que corresponde a una fraccin de la longitud original de la columna sangunea (100 mm). Debe excluirse la columna de leucocitos y plaquetas.

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A.2 Micromtodo (microhematocrito) Es una tcnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, muy sencilla y poderse realizar en gran nmero de muestras a la vez y en muy poco tiempo. Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm. de longitud por 1mm. de dimetro interno. Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechar la primera gota despus de la puncin. Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 l). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellndolo a la llama del mechero. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrfuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000 rpm. Tan pronto se detiene la centrfuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito, que nos darn el resultado directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres: A------- 100 B------- x x : hematocrito en tanto por ciento A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular

La determinacin del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01. Causas de error Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminucin en el valor, al perderse mayor proporcin de clulas que de plasma. El uso de anticoagulantes lquidos provoca un error por dilucin de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los lquidos tisulares que provoca hemodilucin. En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentracin. La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hemates vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posicin horizontal.

B. METODO AUTOMATIZADO: CONTADORES HEMATOLOGICOS El mtodo automtico de determinacin se basa en el clculo matemtico a partir del Volumen Corpuscular Medio (VCM) y el nmero de hemates. Hto = n de hemates x VCM

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VALORES DE REFERENCIA ( x 2 DE) El valor de Hto vara con la edad y el sexo. Edad y sexo Recin Nacidos Nios (hasta 10 aos) Mujeres (18-50 aos) Embarazadas Hombres (18-50 aos) Hematocrito % 54 10 38 5 42 5 39 5 45 5 Fraccin 0,54 0,1 0,38 0,05 0,42 0,05 0,39 0,05 0,45 0,05

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Determinacin de hemoglobina: mtodo de la cianmetahemoglobina


FUNDAMENTO Este mtodo tiene como fundamento la transformacin previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color caracterstico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparndola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrn de referencia (curva de calibracin). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa, se transforman en HiCN segn el siguiente proceso: Hemoglobina + Ferricianuro potsico metahemoglobina Metahemoglobina + Cianuro potsico cianmetahemoglobina MATERIAL 1. Espectrofotmetro o fotocolormetro: Estos instrumentos deben ser calibrados peridicamente mediante la solucin patrn de HiCN, preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) 2. Tubos: 12 x 100 mm. 3. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1,5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). Puede emplearse sangre capilar. 4. Pipetas volumtricas: de vidrio y de 5 ml. 5. Pipetas automticas: de 20 l, debidamente calibradas. 6. Reactivo de Cianmetahemoglobina: Composicin (pH 7-7,4) Ferricianuro potsico [K3 Fe(CN) 6] Cianuro potsico [CNK] Fosfato monopotsico [KH2PO4] Detergente no inico* Agua destilada hasta 200 mg 50 mg 140 mg 1 ml 1000 ml

Detergentes no inicos: Tritn X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218. El detergente no inico facilita la solubilizacin de protenas insolubles y acelera la transformacin de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3 min. Este reactivo debe tener un color amarillo plido, ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Para su conservacin utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el fro modifica el color del reactivo). 7. Patrn de referencia (solucin comercial): Es una solucin de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentracin de hemoglobina. Todo patrn de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrn primario de HiCN. 16

8. Patrn primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarizacin y el control de calidad. Este patrn, es una solucin muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y caractersticas fisicoqumicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64,458) y el coeficiente de extincin (44,0) de la hemoglobina ( por ej. la absorbancia de una solucin que contenga 4 x 55,8 mg de hierro hemoglobnico por litro a 540 nm). El patrn primario de HiCN se suministra en ampollas cerradas al vaco que contienen 10 ml de una solucin de HiCN correspondiente a una concentracin de hemoglobina entre 550 y 850 mg/l. La concentracin exacta de hemoglobina de cada lote se indica siempre en la ampolla.- El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendra una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimtrica. As, si en el frasco se indica una concentracin de 572 mg/l, significa que dicha solucin patrn posee la misma absorbancia que la de una solucin de hemoglobina de 143 g/l, si la sangre total se ha diluido 250 veces, o de 114 g/l, si la dilucin ha sido de 200 veces. El patrn primario posee un espectro de absorcin caracterstico con un pico de mxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexin a 504 nm. La curva de longitud de onda versus A desde =750 nm a =460 nm se observa en la Fig.1 , donde tambin se incluye la curva del reactivo. El valor de la A a 540 nm vara entre 0,400 y 0,404, y a 504 nm entre 0,248 y 0,251, segn el lote y el instrumento de lectura utilizados. El cociente A540/A504 oscila generalmente entre 1,60 y 1,62. METODO Por un lado, se efectuar el espectro de absorcin de la solucin de referencia internacional y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig.1). Por otro lado se determinar la concentracin de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuacin: 1. Conectar el espectrofotmetro. 2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitacin suave con un sistema automtico (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mnimo de 5 min o manualmente por inversin del tubo 20 veces. 3. Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio. 4. Mediante la micropipeta aadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operacin, es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta. 5. Agitar el tubo mediante inversin ( 4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mnimo de 5 min para que se produzca la hemlisis total y se complete la transformacin de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina. 6. Leer la A de la solucin a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco. 7. Para calcular la concentracin de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibracin (ver ms adelante). 8. La concentracin de hemoglobina tambin puede calcularse aplicando la siguiente frmula: 17

Hemoglobina (g/l)=

A540 (muestra) A540 (patrn)

x HiCN patrn (mg/l x

F 1000

Siendo A= absorbancia F= factor de dilucin de la sangre total en el reactivo de Van Kampen y Zylstra (251). La concentracin de hemoglobina en milimoles por litro de sangre (mmol/l) puede calcularse multiplicando el valor en g/l por 0,621. ELABORACION DE LA CURVA DE CALIBRACION La grfica de calibracin tiene como finalidad calibrar el espectrofotmetro para una lectura determinada calculando la correccin existente entre los valores de A ledos en el aparato y los correspondientes valores de concentracin de hemoglobina. Para trazar este grfico se preparan 5 soluciones de concentracin de HiCN conocida y decreciente a partir del patrn de HiCN mediante diluciones sucesivas en reactivo de cianmetahemoglobina (vase tabla 1). Reactivo de Drabkin Volumen Dilucin Hb Tubo (modificado) final (ml) (g/l) (g/l)* (ml) 1 3,0 0 3 0 145 2 1,5 1,5 3 1:2 72 3 1,0 2,0 3 1:3 48 4 0,5 2,5 3 1:6 24 5 0 3,0 3 0 0 * El valor de esta concentracin depender del valor indicado en la ampolla del patrn de HiCN que se emplee en el Trabajo Prctico. Patrn de referencia de HiCN (ml) La concentracin de hemoglobina correspondiente a cada tubo se determina a partir del grado de dilucin y del valor indicado en la ampolla del patrn de HiCN. Una vez preparadas las soluciones patrn, se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene slo reactivo (tubo 5) y se ajusta la A (100% de transmitancia). Luego, partiendo de la solucin de HiCN ms diluida (tubo 5) se leen las restantes soluciones patrn. Finalmente, la relacin entre los valores de A obtenidos y los correspondientes de concentracin de hemoglobina se representan en un grfico con los valores de A en las coordenadas y la concentracin de hemoglobina en las abscisas (Fig. 2).

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Causas de error en la determinacin de la concentracin de hemoglobina La determinacin de hemoglobina est sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. Algunos de ellos obedecen a caractersticas peculiares del espcimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (>50 x 109/l). No obstante, la mayora de las veces los errores se deben a defectos tcnicos en la manipulacin y el anlisis del espcimen. Errores en la obtencin del espcimen de sangre: Errores de extraccin 1. Empleo de anticoagulantes no recomendados 2. Coagulacin parcial de la sangre Errores de la dilucin: Empleo de pipetas automticas descalibradas u otras pipetas sucias o hmedas 1. No eliminacin del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo 2. Dilucin incompleta de la sangre en el reactivo Errores de la transformacin de la hemoglobina en HiCN: Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido 1. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformacin de la Hb en HiCN Errores de la determinacin: 1. Empleo de instrumentos no calibrados 2. Cubetas sucias o deterioradas 3. Soluciones turbias de HiCN Errores en la conservacin del reactivo: 1. Congelacin del reactivo, lo que produce transformacin de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y una oxidacin parcial de la Hb. 2. Conservacin del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formacin exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de concentracin de Hb obtenidos son inferiores a los reales.

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Espectro de absorcin de la solucin de HiCN y del reactivo usado

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Curva de calibracin elaborada a partir de una solucin de cianmetahemoglobina de concentracin conocida.

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Velocidad de sedimentacin globular


FUNDAMENTO El test de velocidad de sedimentacin globular (VSG) mide la sedimentacin de eritrocitos en su plasma nativo. VSG es un test no especfico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crnicas como los procesos inflamatorios crnicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumtica y tuberculosis) o la respuesta a la terapia, por ejemplo con citostticos (enfermedad de Hodgkin, linfomas y mieloma mltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests ms utilizados como screening en el laboratorio clnico. Se trata de un mtodo sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. MECANISMO El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentacin no est completamente dilucidado, pero parece obedecer a interacciones electrostticas entre la superficie de los GR y diversas protenas del plasma que favorecen (fibringeno y globulinas) o disminuyen (albmina) la agregabilidad de estas clulas. Desde el punto de vista fsico, este fenmeno depende de los siguientes factores: a. b. c. d. Tamao de los G Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma, Viscosidad del plasma. Temperatura.

Estos factores se hallan relacionados entre s a travs de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relacin entre la resistencia R que encuentra una partcula esfrica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad a una velocidad v: R = 6vr La sedimentacin ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinacin de los GR con formacin de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un perodo durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentacin se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. La etapa ms importante es la primera o de aglutinacin, ya que de ella depender la velocidad de todo el proceso. As, cuanto ms pequeos sean los agregados, ms lentamente se producir la sedimentacin y viceversa. Dado que, como se mencion ms arriba, el test tambin est influenciado por la forma y el tamao de los GR, ste resulta poco confiable como un ndice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.

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La velocidad de sedimentacin se incrementa por las altas concentraciones de fibringeno y otras protenas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albmina retarda la VSG. El mecanismo por el cual el fibringeno y las globulinas facilitan la aglutinacin de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actan disminuyendo la fuerza de repulsin que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que estas clulas se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composicin proteica del plasma y especialmente de la relacin entre las concentraciones de albmina, globulinas y fibringeno. As, mientras la albmina tiende a aumentar el potencial zeta, las globulinas y sobre todo el fibringeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto el fibringeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformacin menos esfrica que la albmina, lo que aumenta la constante dielctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminucin del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de stos a agregarse y formar las llamadas pilas de moneda. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales protenas plasmticas. METODOLOGIA Existen dos mtodos comnmente utilizados para medir la VSG: el mtodo de Westergren y el mtodo de Wintrobe. Ambos mtodos poseen limitaciones. El mtodo de Westergren es menos sensible a pequeos aumentos de los factores que causan la sedimentacin de los GR y as puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening. El mtodo de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. Ambos mtodos son altamente sensitivos a la relacin entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no especfico de la VSG probablemente acelerando la agregacin y reduciendo las fuerzas de friccin entre los agregados en sedimentacin. Se trataron de aplicar factores de correccin para anemias, pero no resultaron confiables. Tradicionalmente, la VSG se ha determinado ms frecuentemente por el mtodo de Westergren que fue propuesto como mtodo de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH). Durante los ltimos aos, han aparecido sistemas semiautomticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plstico desechable. Estos sistemas, aunque reproducen exactamente el mtodo de Westergren, se diferencian de ste por su carcter cerrado (recogida de los especmenes en tubos al vaco que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisin del llenado de las pipetas. MTODO DE WESTERGREN Es el mtodo de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un mtodo poco reproducible y sometido a diversas variables difciles de controlar, como es la necesidad de prediluir la sangre.

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A. MATERIALES. A.1 Anticoagulante Citrato trisdico 109 mM en solucin acuosa. Si utiliza citrato trisdico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) prepare una solucin acuosa de 32,08 g/l. A.2 Tubo de sedimentacin Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseados de una longitud de 300 + 1.5 mm y de un dimetro de 2.55 + 0.15 mm. El dimetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm) todo a lo largo del tubo y ste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comits de Estandarizacin en los diferentes pases. Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza. Tubos plsticos descartables: Se fabrican tubos plsticos descartables segn las especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plsticos resultan inadecuados pues unen GR siendo as ms susceptibles a los problemas de taponamiento. Otros tubos plsticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre. A.3 Gradillas Las gradillas o dispositivos de sostn estn diseados para sostener los tubos en una posicin vertical inmvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posicin de los tubos sea vertical dentro de un lmite de 1. La misma debe estar construida de modo tal que no existan prdidas de sangre cuando el tubo est colocado en ella. B. TCNICA B) La sangre se obtiene por puncin venosa, evitando contaminacin con materiales utilizados para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporcin de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solucin de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en 0,5 ml de anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs. si es mantenida a 4C. C) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversin repetidas veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero. D) El tubo es colocado en la gradilla en posicin estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25C), sin exposicin a la luz del sol directa, libre de vibraciones y corrientes de aire, mantenindolo exactamente 60 min.

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E) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora). C. VALORES DE REFERENCIA EDAD (aos) Nios mayores y jvenes Hombres adultos Mujeres adultas 0-15 17-50 51-60 61-70 17-50 51-60 61-70 X + 2 DE 5 + 10 4+3 6+3 6+4 6+3 9+5 10 + 5 Lmite superior de la normalidad 15 10 12 14 12 19 20

Factores tcnicos capaces de modificar la VSG Causas de aumento Desviacin de verticalidad de la pipeta Incremento de la longitud y el dimetro de la pipeta Elevacin de la temperatura ambiente Dilucin de la sangre Causas de disminucin: Reduccin del dimetro de la pipeta Utilizacin tarda de la sangre (especimen envejecido) Cambio de anticoagulante D. INTERPRETACION DE RESULTADOS Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varan fundamentalmente con el sexo y en cierto grado tambin con la edad (ver valores de referencia), el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos orales, etc.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos. Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente, han demostrado ser poco fiables y de escasa significacin clnica, por lo que no se recomienda su empleo. Existen numerosas patologas con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las protenas de fase aguda, y tambin en el embarazo normal y el puerperio. Un 10% de los nios normales tambin presentan VSG aumentadas.

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La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, anormalidades de GR (hemoglobinopatas, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.), hipofibrinogenemia, defectos cardacos congestivos, y ocasionalmente sin causa aparente. Adems de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgnica.

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Recuento de reticulocitos
Los reticulocitos, eritrocitos inmaduros, existen en la sangre en una proporcin de cinco a diez por mil hemates. Su tamao es el de los dems hemates y se caracteriza por contener una pequea cantidad de ARN (ribosomas) formando un retculo granulofilamentoso observable al ser teido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto ms madura es la clula. El recuento de reticulocitos es la tcnica ms simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoytica de la mdula sea. Cuando una anemia se acompaa de un elevado nmero de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa, mientras que cuando el nmero es normal o disminuido se denomina arregenerativa. En condiciones normales, los reticulocitos permanecen en la mdula durante 2-3 das y terminan su maduracin en 24 horas, aproximadamente, una vez ya en la sangre perifrica. El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA)y a ser posible, dentro de las 24 primeras horas de la extraccin cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene a 4 C, el recuento puede realizarse hasta 48 horas despus de la extraccin. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. Tincin vital y microscopio ptico. 2. Citometra de flujo. El mtodo manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variacin >20%), lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a teraputicas agresivas, pero sobretodo a los errores de ndole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito. MTODO DE LA TINCIN VITAL (MTODO DE REFERENCIA) Este mtodo usa como colorante el azul de metileno nuevo: 1 g cada 100 ml de solucin citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de ClNa 9 g/L). Mediante una pipeta Pasteur se aaden a un tubo de hemlisis tres gotas de solucin colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. En caso de valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solucin colorante. La suspensin sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transcurrido este tiempo, se toma una pequea gota de la suspensin y se extiende sobre un portaobjetos., una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersin (x1000). Es necesario realizar el recuento sobre un mnimo de 1000 eritrocitos. El recuento se efecta contando en donde los eritrocitos estn distribuidos homogneamente. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida, siendo 100-125 el nmero ptimo de hemates por campo de los cuales distinguimos cuales son 27

reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje, siendo el cien porciento el nmero total de hemates contado. Este valor ser valido si se trata de una concentracin normal de eritrocitos en sangre total. Por ello, cuando disminuye el nmero de eritrocitos como suele suceder en la anemia, el valor porcentual debe corregirse segn el hematocrito empleando la siguiente frmula:
Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto del paciente Hto normal

(El hematocrito normal es el que le corresponde segn edad y sexo). En caso de anemia intensa, el nmero de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneracin eritroblstica. Ello obedece a que la anemia se acompaa siempre de un estmulo eritropoytico compensador, que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la mdula a la sangre perifrica, y un acortamiento de su perodo de maduracin intramedular, lo que supone un aumento del perodo de maduracin perifrica. Este fenmeno se caracteriza por la aparicin en el examen morfolgico de la extensin de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y tonalidad azulada (policromasia) Existe una relacin inversa, aproximadamente lineal, entre el hematocrito y el perodo de maduracin perifrica de los reticulocitos. De esta forma puede calcularse otra magnitud de inters clnico denominada ndice de produccin reticulocitaria (IPR) aplicando la frmula siguiente: IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente Perodo de maduracin en das x Hto normal

Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoytica medular (anemia regenerativa), mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoytica (anemia arregenerativa) Relacin entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia Hematocrito Niveles de Hemoglobina (g/L) Recuento de reticulocitos (%) Recuento de reticulocitos corregido (%) Tiempo de maduracin estimado ndice de reticulocitos OTRA TECNICA Utiliza como colorante Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el mtodo de referencia. La mezcla sangre/colorante se incubar durante 15 minutos a 37 C. Luego de este tiempo se realizar el extendido y se realiza el recuento como se indic antes. RECUENTO AUTOMATIZADO 28 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 150 133 117 110 83 66 50 1 2 5 10 15 20 30 1 1,8 4 7 8,3 9 10 1 da 1 2 5 5 2 da 7,5 10 3 das 10

Estos equipos realizan un recuento muy fiable de reticulocitos a partir de sangre total. En los equipos semiautomticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo, mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubacin previa y el anlisis se realiza directamente. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitucin del criterio morfolgico inherente al mtodo visual por el anlisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante citometra de flujo y luz lser. Para la tincin del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o Auramina. VALORES DE REFERENCIA Valor relativo (%) 3,2-6,0 (4-19 aos) 0,2-2,2 0,2- 2,5 0,5-2,8 Valor absoluto (x109 /L) 110-330) 25-89 25-86 32-97

Recin nacido (sangre de cordn) Nios y adultos jvenes de 4 a 19 aos Adultos (20-50 aos) Mujeres Hombres

Variaciones patolgicas Disminucin de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblstica y ferropnica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Perodo neonatal Anemias hemolticas Anemias posthemorrgicas Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltracin neoplsica en la mdula sea) Mielofibrosis idioptica

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Cuantificacin de hierro srico

Fer-color Transferrina
Mtodo colorimtrico para la determinacin de la Capacidad Total de Fijacin de Hierro (Transferrina) del suero SIGNIFICACION CLINICA En el organismo humano, el hierro circula como Fe (III) unido a una protena transportadora especfica: la transferrina o siderofilina. Su funcin es captar el hierro de los sitios de absorcin (mucosa intestinal) o depsito (sistema retculo endotelial) y llevarlo a los rganos hematopoyticos donde es utilizado. En el individuo normal slo la tercera parte de la transferan se satura con hierro, estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte. La actividad fisiolgica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijacin de hierro (TIBC). La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrgicas, y ferropnicas en general, en insuficiencias hepticas y fisiolgicamente en los ltimos meses del embarazo. Disminuye en cambio en la hemocromatosis, en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas, neoplsicas, nefropticas, etc.) en las hepatopatas crnicas, y en las grandes prdidas proteicas del sndrome nefrtico. FUNDAMENTOS DEL METODO La transferrina o protena transportadora especfica del hierro, se determina por su actividad fisiolgica de captar Fe (III) a pH mayor que 7,2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso. El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitacin con carbonato de magnesio. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimtricamente segn la tcnica de Fer-color o Fer-color AA. La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que est saturada. REACTIVOS PROVISTOS Solucin saturante: solucin estabilizada de Fe (III). Adsorbente: carbonato de magnesio granulado. REACTIVOS NO PROVISTOS - Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab. - Agua destilada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Solucin saturante: lista para usar. Adsorbente: listo para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Adsorbente: el frasco debe volver a taparse inmediatamente despus de retirar las porciones necesarias para el momento. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. MUESTRA Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. - Tubos de Kahn. CONDICIONES DE REACCION

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Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. PROCEDIMIENTO a) Saturacin de la transferrina: en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solucin saturante. Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC. Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente. Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente. La agitacin deber ser vigorosa y en sentido longitudinal. Centrifugar 10-15 minutos a 3.000-4.000 r.p.m. hasta obtener sobrenadante lmpido o con la opalescencia propia del suero. b) Colorimetra: seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas y efectuar los clculos de la misma manera que en la determinacin de hierro srico, multiplicando por dos el resultado final, por la dilucin del suero. Habitualmente se realiza la determinacin de hierro srico juntamente con la de transferrina. En ese caso se informan tres valores: Hierro Srico, Transferrina y Porcentaje de Saturacin de la Transferrina, que se calcula de la siguiente manera: Hierro srico (ug/dl) Transferan (ug/dl)

Saturacin % =

x 100

Si se desea efectuar simultneamente la determinacin de hierro srico para el clculo del Porcentaje de Saturacin, comenzar con la Saturacin de la Transferrina 30 minutos antes. VALORES DE REFERENCIA La literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturacin de la Transferrina en personas normales: Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl. Saturacin de la Transferrina: 20-55%. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. La agitacin insuficiente producir valores falsamente aumentados de Transferrina. La concentracin de Fe (III) de la Solucin saturante es 10 veces mayor que la del Standard. Por lo tanto, no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos. Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados. Adems, como la medida exacta de esta solucin no es crtica, puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se obtuvieron los siguientes datos: Nivel 280 ug/dl 560 ug/dl D.S. +23,2 ug/dl +28,9 ug/dl C.V. 8,29% 5,16%

PRESENTACION Reactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijacin de Hierro (Transferrina) (Cd. 1492002). BIBLIOGRAFIA - Dixon, K. - Ann. Clin. Biochem. 10/5:127 (1973). - I.C.S.H. - Am. J. Clin. Path. 56/4:543 (1971). - Zak, B.; Baginski, E.S.; Epstein, E. y Wiener, L.M.- Clin. Toxicol. 4/4:621 (1971). - Rojkn, M.; Olgun de Mariani, M.; Drappo, G. y Albarracn, A. - III Congreso Argentino de Bioqumica - Buenos Aires (1975). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Wiener lab.
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2000 Rosario - Argentina


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Fer-color
Mtodo colorimtrico para la determinacin de hierro srico sin desproteinizacin SIGNIFICACIN CLINICA El hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos, formando parte de la hemoglobina. La mioglobina, pigmento ms importante de las clulas musculares, contiene hierro en su grupo hemo, y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las clulas del sistema reticuloendotelial de hgado, bazo, mdula sea y parnquima heptico. Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas, edad, sexo, hbitos alimenticios y actividad eritropoytica). La anemia por prdida de hierro representa uno de los trastornos orgnicos ms frecuentemente encontrados en la clnica mdica. Ocurre con frecuencia en mujeres, particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto. La otra causa ms comn de anemia ferropnica, es la prdida de sangre a travs del tracto gastrointestinal, a veces imperceptible, debida a hernia de hiato, lceras gstricas o duodenales, y carcinomas de estmago y colon. Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia. A veces se asocian a terapia transfusional, y otras veces a desrdenes caracterizados por una sntesis defectuosa de hemoglobina o fenmenos hemolticos. FUNDAMENTOS DEL METODO El hierro srico se libera de su unin con su protena transportadora especfica, la transferrina, en buffer succinato de pH 3,7 y en presencia de un reductor, el cido mercaptoactico. Posteriormente reacciona con el reactivo de color, piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta, que se mide a 560 nm. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo PBTS: solucin estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l. Standard: solucin de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl. Buffer succinato: solucin de succinato 0,25 mol/l para pH 3,7. Reductor: ampolla autorrompible conteniendo cido mercaptoactico al 70 %. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo PBTS: listo para usar. Standard: listo para usar. Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato, vertindolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversin. Anotar en el rtulo la fecha de preparacin. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Buffer/Reductor: en refrigerador (2-10oC) es estable durante un ao a partir de la fecha de su preparacin. Antes de usar llevar a 18-30oC. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Variaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard, indican contaminaciones ocasionales (agua, material de vidrio, etc.). Un aumento en el valor de los Blancos indicar una contaminacin con hierro. MUESTRA Suero a) Recoleccin: debe usarse nicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reaccin. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de maana) ya que las fluctuaciones fisiolgicas son significativas durante el da. b) Aditivos: no se requieren.

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c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl, hiperlipemia, iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl. Si bien hemlisis ligeras no interfieren con este mtodo, el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemlisis. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro o fotocolormetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados. - Tubos de fotocolormetro. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Valores de Blanco aceptables: la determinacin de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos. El Blanco de Reactivos, ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones, no debe ser superior a 0,150 D.O. debiendo ser adems, despreciable la contribucin del agua en dicho Blanco. Para controlar esto ltimo, se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0,5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2,5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer. Caso contrario, reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0,02 uOhms). Por otra parte, si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0,150 D.O. es indicio de contaminacin grosera de los reactivos, los cuales debern desecharse. Efectuar este control peridicamente. - Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla o por agitacin suave. No invertir para evitar contaminaciones. - Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro, para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p.a. 10-15%, eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro. Secar el material preferentemente a no ms de 80C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plsticos. Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinacin de hierro. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando la misma muestra en 10 das diferentes, se obtuvo un coeficiente de variacin del 4,2%, para un nivel de Fe srico de 129 ug/dl. b) Recuperacin: agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alcuotas de un mismo suero, se recuper entre 90 y 103%. c) Linealidad: la reaccin es lineal hasta 500 ug/dl. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cd. 1492001). BIBLIOGRAFIA - Dixon, K. - Ann. Clin. Biochem. 10/5:127 (1973). - I.C.S.H. - Am. J. Clin. Path. 56/4:543 (1971). - Zak, B.; Baginski, E.S.; Epstein, E. y Wiener, L.M.- Clin. Toxicol. 4/4:621 (1971). - Rojkn, M. L.; Olgun de Mariani, M. C.; Drappo, G. A. Y Albarracn, A. - III Congreso Argentino de Bioqumica Buenos Aires (1975). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990. CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 560 nm en espectrofotmetro o 540-560 nm en fotocolormetro con filtro verde. - Temperatura de reaccin: temperatura ambiente - Tiempo de reaccin: 10 minutos - Volumen de muestra: 500 ul - Volumen total de reaccin: 2,5 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco de Reactivos), S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Agua bidestilada Standard Suero 500 ul S 500 ul D 500 ul

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Bfer/reductor

2 ml

2 ml

2m

Mezclar. Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de Suero BS) en espectrofotmetro a 560 nm o en fotocolormetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua. Agregar, manteniendo el frasco gotero en posicin vertical, 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos, llevando el aparato a cero con agua. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Los tubos deben ser ledos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas de S y D, restndoles los Blancos correspondientes: S - B = S corregida D - (B + BS) = D corregida Fe (ug/dl) = D corregida x f Donde: f = METODO DE CONTROL DE CALIDAD Standatrol S-E 2 niveles. VALORES DE REFERENCIA En un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos, con edades oscilando entre los 18 y 51 aos, se hall un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios: Varones: 114,6 ug/dl Mujeres: 103,3 ug/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. 100 ug/dl S corregida

Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 1287/77 - 198/00

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Tincin histoqumica de hierro: coloracin de Perls


La coloracin de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de clula pudiendo ser aplicada a las clulas presentes en un frotis o extensin de sangre o mdula sea. La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina, que se considera el resultado de la precipitacin de varias molculas desnaturalizadas de apoferritina. Normalmente, constituye el hierro no hemnico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las clulas del sistema mononuclear fagoctico. MATERIAL 1. Frotis de la mdula sea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. 2. Solucin clorhdrica de ferricianuro potsico. Debe prepararse extemporneamente mezclando dos volmenes iguales de una solucin acuosa de ferricianuro potsico al 2% en agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0.2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente(24C). 3. Solucin de contraste eosina (1 g/L de H2O) o safranina(1 g/L de H2O. 4. Microscopio ptico. METODO 1. fijar los frotis en vapores de formol durante 30 minutos (algodn empapado de formol en el fondo de un vaso de Coplin). 2. Introducir los frotis fijados en la solucin clorhdrica durante 1 hora a temperatura ambiente. 3. Lavar los frotis colocndolos en la solucin de contraste durante 30 minutos. INTERPRETACION Y EVALUACIN DE RESULTADOS La hemosiderina teida mediante la tincin de Perls aparece bajo la forma de grnulos de intenso color azul, que se observan normalmente a nivel de las zonas de abundantes macrfagos. La tincin de Perls permite valorar tambin el hierro no hemnico presente en el citoplasma de los eritroblastos y determinar el nmero de los que presenten uno o ms grnulos de hemosiderina (sideroblastos). Se han establecido scores para la semicuantificacin de la reaccin. MEDICIN DE LA FRAGILIDAD OSMTICA La fragilidad osmtica mide el grado de resistencia de los glbulos rojos a la lisis en funcin de la disminucin de la concentracin de ClNa en el medio. Refleja la habilidad de la eritrocitos para captar agua sin lisar. Este test ha sido muy usado experimentalmente como medida de la viabilidad del glbulo rojo y clnicamente con fines diagnsticos. La fragilidad osmtica se ve aumentada en anemias hemolticas, como la esferocitosis hereditaria, luego del tratamiento con drogas, como la indometacina; mientras que se ve disminuida en la anemia con clulas S (sickle cells), anemias por deficiencia de hierro y talasemias.

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En este test se mide la capacidad de deformacin o elasticidad de la membrana del glbulo rojo, la cual es imprescindible para que el eritrocito pueda circular libremente, fundamentalmente a travs de los capilares esplnicos. Si por alguna alteracin del citoesqueleto, la membrana del glbulo rojo pierde su capacidad de deformacin , el mismo es quitado de circulacin. Si se produce un desbalance en el equilibrio entre la produccin de eritrocitos por la mdula sea y su eliminacin esplnica, nos encontraremos ante la presencia de una anemia hemoltica debida, posiblemente, a alguna alteracin de las protenas del citoesqueleto de la membrana eritrocitaria. Este test es por lo tanto, indicador del estado de la membrana eritrocitaria. La fragilidad osmtica, mide el grado de resistencia de los glbulos rojos a la lisis en funcin de la disminucin de la concentracin de ClNa en el medio. El grado de hemlisis es determinado midiendo la hemoglobina liberada a partir de las clulas. Las variaciones en la fragilidad osmtica son definidas como cambios en las curvas de hemlisis y son establecidos por determinacin de la [ClNa] que produce el 50% de hemlisis. La forma de la curva que muestra el grado de hemlisis en funcin de la [ClNa] sugiere que sta puede ser el resultado de la distribucin de las poblaciones de GR, diferenciadas de acuerdo a la resistencia de su membrana. Para realizar la medicin, se deben mezclar 50 l de sangre con 5 ml de soluciones con diferentes concentraciones de ClNa : 10,0; 9,0; 8,0; 7,0; 6,0; 5,0; 4,5; 4,0; 3,0; 2,0 y 1,0 g/L. Las diluciones se realizan por duplicado. Se centrifugan, luego de mezclar por inversin, a 2500 rpm por 15 minutos y se realizan lecturas de los sobrenadantes a 540 nm. La solucin de 10,0 g/L es usada como blanco. Para preparar las soluciones de ClNa se parte de una solucin 10 g/L y se realizan diluciones de la misma. La concentracin de ClNa que produce el 50 % de hemlisis puede ser determinada calculando el % de hemlisis segn la siguiente ecuacin: % de hemlisis = (DOs -DObl) x 100/ DOo donde: DOs= densidad ptica del sobrenadante DObl= densidad ptica del blanco DOo= densidad ptica de la solucin de 1 g/L de ClNa. Luego se grafican las curvas de % de hemlisis vs. [ClNa] y de las mismas se extrae el valor de [ClNa] que produce el 50% de hemlisis.

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LDH-P
AA
Mtodo UV optimizado (SFBC) para la determinacin de lactato deshidrogenasa (LDH) en suero o plasma SIGNIFICACION CLINICA La determinacin de la actividad de lactato deshidrogenada (LDH) en suero, tiene una gran variedad de aplicaciones clnicas. En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM), la actividad de LDH total (junto con las de CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnstico. La misma comienza a aumentar de 12 a 24 horas despus de producido el infarto; alcanza un pico entre las 48 - 72 horas y permanece elevada hasta el sptimo o dcimo da. Por otra parte, tambin se registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis heptica (producida por agentes txicos o por infecciones agudas como la hepatitis viral) e incluso acompaando a necrosis tubular renal, pielonefritis. FUNDAMENTOS DEL METODO Basado en el siguiente esquema de reaccin: LDH Piiruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+

Las concentraciones del ensayo estn optimizadas de acuerdo a la Sociedad Francesa de Biologa Clnica (SFBC). REACTIVOS PROVISTOS Buffer: solucin de buffer Tris, pH 7,2 conteniendo piruvato y cloruro de sodio. Sustrato: viales conteniendo NADH. Concentraciones finales (segn SFBC) Tris ............................................................... 80 mM, pH 7,2 Piruvato ............................................................... 1,6 mmol/l NADH .................................................................. 0,2 mmol/l ClNa .................................................................... 200 mmol/l INSTRUCCIONES PARA SU USO Buffer: listo para usar. Sustrato: agregar el volumen de Buffer indicado en el rtulo a un vial de Sustrato. Tapar y agitar suavemente por inversin hasta disolucin completa. Fechar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Sustrato reconstituido: estable 21 das en refrigerador (2-10oC) o 3 das a temperatura ambiente a partir del momento de su reconstitucin. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotmetro ha sido llevado a cero con agua destilada, lecturas de absorbancia del Sustrato reconstituido inferiores a 0,800 D.O. o superiores a 1,800 D.O. (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo. MUESTRA Suero o plasma a) Recoleccin: se debe obtener suero de la manera usual y separar del cogulo dentro de las dos horas de su obtencin. Tambin puede usarse plasma. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, debe usarse heparina como anticoagulante. c) Sustancias interferentes conocidas: las muestras con hemlisis visible o intensa pueden producir valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usadas. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. La LDH es estable hasta 24 horas en refrigerador. No congelar.

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MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados. - Material volumtrico adecuado. - Bao de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir. - Cronmetro. CONDICIONES DE REACCION (Disminucin de absorbancia) - Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 366) - Temperatura de reaccin: 25, 30 37oC. Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada temperatura. - Tiempo de reaccin: 3 minutos y 30 segundos. - Los volmenes de muestra y reactivo se pueden reducir proporcionalmente sin que varen los factores de clculo. PROCEDIMIENTO A) 25oC En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo, colocar: Sustrato reconstituido 3 ml Preincubar unos minutos, luego agregar: Muestra 100 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultneamente el cronmetro. Esperar 30 segundos. Leer la absorbancia inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1, 2 y 3 minutos de la primera lectura. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (A/min), restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. Utilizar este promedio para los clculos. B) 30-37oC I- MACROTECNICA Emplear 50 ul de Muestra, siguiendo el procedimiento indicado en A). II- MICROTECNICA Emplear 20 ul de muestra y 1,0 ml de Sustrato reconstituido siguiendo el procedimiento indicado en A). CALCULO DE LOS RESULTADOS LDH (U/l) = A/min x factor En cada caso deber emplearse el factor de clculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reaccin seleccionada (30-37oC o 25oC) y a la tcnica empleada (micro o macrotcnica) como se indica en la siguiente tabla de factores: Longitud de onda 340 nm 334 nm 366 nm VALORES DE REFERENCIA Temperatura Valores (U/I) 25C 120-240 30C* 160-320 37C* 230-460 Temperatura I (30-37C) 9.683 9.871 17.941

25C 4.921 5.016 9.118

II (30-37C) 8.095 8.253 15.00

(*) Calculados Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero, la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0,800 D.O. estando el sustrato en condiciones, indica una muestra con muy alta actividad de LDH (que consume NADH an antes de esta lectura). En este caso, repetir la determinacin con muestra diluida 1/10 con solucin fisiolgica y multiplicar el resultado por la dilucin efectuada. - La humectacin es causa de deterioro del Sustrato. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultneamente replicados de una misma muestra, se obtienen los siguientes valores:

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Nivel
438 U/l 683 U/l

D.S. +5,14 U/l +7,99 U/l

C.V. 1,17% 1,17%

b) Lmite de deteccin: depende del espectrofotmetro empleado y de la longitud de onda. De acuerdo con la sensibilidad requerida, en espectrofotmetro a 340 nm (Hg 334 366), con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor, reproducibilidad 2 nm, luz espuria 0,5% y semiancho de banda 8 nm, para un A/min de 0,001, el mnimo cambio de actividad detectable ser de 5 U/l (a 340 nm y a 25oC). c) Rango dinmico: el rango til de lectura se extiende hasta 0,200 D.O. A/min (a 340 nm y 25oC). Si la A/min es superior a 0,200 D.O. (340-334 nm y 25oC) o 0,100 D.O. (366 nm y 25oC), repetir la determinacin con muestra diluida 1/5 1/10 con solucin fisiolgica, corrigiendo consecuentemente los resultados. PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Longitud de onda primaria ...................................... 340 nm Longitud de onda secundaria (bicromtica) .......... 380 nm Tipo de reaccin ..................................................... cintica Direccin de la reaccin .................................... disminuye Temperatura de reaccin ............................................ 37oC Relacin muestra/reactivo .......................................... 1:50 Tiempo de equilibrio ......................................... 3 segundos Tiempo de retardo ......................................... 40 segundos Tiempo de lectura .......................................... 60 segundos Absorbancia de blanco .................................. > 0,700 D.O. Lmite de absorbancia ....................................... 2,000 D.O. Valor normal inferior ................................................ 230 U/l Valor normal superior .............................................. 460 U/l Linealidad ............................................................... 1000 U/l Factor (paso de luz 1 cm) ......................................... 8.095 Coef. extincin molar (340) ................ 6,3 [l x mmol-1 x cm-1] Para las instrucciones de programacin consulte el manual del usuario del analizador en uso. PRESENTACION - 3 x 20 ml (Cd. 1521303). BIBLIOGRAFIA - Societ Franaise de Biologie Clinique (SFBC) - Ann. Biol. Clin. 40:160, 1982. - Sociedad Espaola de Qumica Clnica - Comit Cientfico, Comisin de Enzimas - Quim. Clin. 57-61, 1989. - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 3330/97 Cert. N: 2114/97

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Bilirrubina
Mtodo colorimtrico para la determinacin de bilirrubina directa y total en suero y otros lquidos biolgicos SIGNIFICACION CLINICA La bilirrubina, compuesto de degradacin de la hemoglobina, es captada por el hgado para su conjugacin y excrecin en la bilis. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias. La eritroblastosis fetal o anemia hemoltica del recin nacido es una patologa provocada por incompatibilidad maternofetal en la que se produce una destruccin excesiva de glbulos rojos. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina srica con el consecuente riesgo de difusin del pigmento al sistema nervioso central, por lo que la determinacin de la bilirrubina en estos nios recin nacidos resulta sumamente importante. FUNDAMENTOS DEL METODO La bilirrubina reacciona especficamente con el cido sulfanlico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimtricamente a 530 nm. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reaccin. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafena al medio de reaccin. REACTIVOS PROVISTOS Desarrollador: solucin acuosa de benzoato de cafena 0,13 mol/l, tamponada y estabilizada. Nitrito de Sodio: solucin de nitrito de sodio 0,07 mol/l. Reactivo Sulfanlico: solucin de cido sulfanlico 29 mmol/l y cido clorhdrico 0,17 mol/l. REACTIVOS NO PROVISTOS - Agua destilada. - Bilirrubina Standard provisto separadamente por Wiener lab. para efectuar la calibracin peridica del equipo. INSTRUCCIONES PARA SU USO Desarrollador: listo para usar. Reactivo Sulfanlico: listo para usar. Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo, mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo Sulfanlico. Rotular y fechar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente (< 25oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Diazorreactivo: en refrigerador (2-10oC) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3 meses a partir de la fecha de su preparacin. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La presencia de sedimento y/o cambio de coloracin de los reactivos, pueden ser indicio de deterioro de los mismos. MUESTRA Suero, plasma o lquido amnitico a) Recoleccin: obtener suero o plasma de la manera usual. Proteger de la luz natural o artificial, envolviendo el tubo con papel negro. Tambin es posible realizar la determinacin en lquido amnitico. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, debe usarse heparina para su obtencin. c) Sustancias interferentes conocidas: hemlisis moderada o intensa inhiben la reaccin directa, obtenindose valores de bilirrubina total falsamente aumentados. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento, el suero debe conservarse hasta 48 horas en el refrigerador (2-10oC) y la

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sangre entera no ms de 24 horas en refrigerador o 12 horas a temperatura ambiente. El lquido amnitico es conveniente mantenerlo congelado hasta el momento de efectuar el ensayo. La accin de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra. Es por tal motivo que debe protegerse cuidadosamente. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro o fotocolormetro. - Micropipetas y pipetas capaces de medir los volmenes indicados. - Frasco de vidrio color caramelo. - Tubos de fotocolormetro. - Reloj o timer. CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 530 nm en espectrofotmetro o 520-550 nm en fotocolormetro con filtro verde. - Temperatura de reaccin: temperatura ambiente - Tiempo de reaccin: 5 minutos - Volumen de muestra: 200 ul - Volumen final de reaccin: 2,9 ml PROCEDIMIENTO I- TECNICA PARA SUERO En tres tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco), D (Directa) y T (Total) colocar: B Muestra (suero) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanlico Diazorreactivo 200 ml 2,5 ml 200 ul D 200 ml 2,5 ml 200 ul T 200 ml 2,5 ml 200 ul

Mezclar de inmediato cada tubo por inversin. Luego de 5 minutos, leer en espectrofotmetro a 530 nm o en fotocolormetro con filtro verde (520-550 nm), llevando el aparato a cero con agua destilada. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. Si se lee antes, habr subvaloracin de los resultados por reaccin incompleta. Si se lee despus, habr sobrevaloracin porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre. Sueros ictricos: debe emplearse la tcnica descripta pero con menores cantidades de muestra, de acuerdo a la severidad de la ictericia. De tal forma, en caso de ictericia moderada se usarn 50 ul de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren slo 20 ul. Multiplicar los resultados obtenidos por 3,79 y 9,38 respectivamente. II- TECNICA PARA LIQUIDO AMNIOTICO Se determina bilirrubina total. En dos tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco) y T (Total) colocar: B Muestra (lquido amnitico) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanlico Diazorreactivo 1 ml 1,5 ml 0,2 ml T 1 ml 1,5 ml 0,2 ml

Proceder de la misma manera que en la tcnica I. Dividir el resultado final por 5,37.

CALCULO DE LOS RESULTADOS Bilirrubina total (mg/l) = (T - B) x f Bilirrubina directa (mg/l) = (D - B) x f Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total - BRB directa El factor colorimtrico (f) debe calcularse con el Standard de Bilirrubina de Wiener lab. METODO DE CONTROL DE CALIDAD

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Standatrol S-E 2 niveles. VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina en suero o plasma - Adultos: Directa: hasta 2 mg/l Total: hasta 10 mg/l - Recin nacidos: Nacidos a trmino Sangre de cordn Hasta las 24 hs Hasta las 48 hs Del 3 al 5 da 25 mg/l 60 mg/l 75 mg/l 120 mg/l Prematuros 80 mg/l 120 mg/l 240 mg/l

Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. En los prematuros, los niveles de bilirrubina tardan ms en alcanzar la normalidad, dependiendo del grado de inmadurez heptica. Bilirrubina en lquido amnitico Valores menores de 1 mg/l son considerados normales, mientras que entre 1 y 2,7 mg/l sugieren la posibilidad de un feto afectado. Los niveles por encima de 2,7 mg/l slo se encuentran en presencia de eritroblastosis fetal. Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4,7 mg/l el feto ya se encuentra afectado y tiene probablemente algn tipo de falla circulatoria. Si la cantidad de bilirrubina sobrepasa los 9,5 mg/l la muerte fetal es inminente. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

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LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. La accin de la luz, tanto sobre los sueros como sobre las soluciones standard, es capaz de destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da, se obtuvo lo siguiente: Bilirrubina directa Bilirrubina total Nivel 2,1 mg/l 26,0 mg/l 9,8 mg/l 127,7 mg/l D.S. +0,18 mg/l +0,62 mg/l +0,47 mg/l +1,45 mg/l C.V. 8,5% 2,4% 4,7% 1,1%

b) Linealidad: la reaccin es lineal hasta 150 mg/l. c) Recuperacin: agregando cantidades conocidas de bilirrubina a distintos sueros, se obtuvo una recuperacin entre 100 y 106%. PRESENTACION Equipo para 200 determinaciones (Cd. 1120001). BIBLIOGRAFIA - Botwell, J. H. - Clin. Chem. 10/3:197 (1964). - Watson, D. - Clin. Chem. 7/6:603 (1961). - Ichida, T.; Nobuoka, M. - Clin. Chim. Acta 19/2:249 (1968). - Zaroda, R. - Am. J. Clin. Path. 45/1:70 (1966). - OBrien, D. et al - Laboratory manual of pediatric microbiochemical techniques, Harper & Row Pub - 4a Ed. (1968). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

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Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 252/75 - 5347/98

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Separacin electrofortica de hemoglobina


SOPORTE Acetato de celulosa gelatinizado, en medio alcalino (pH= 8,6). Las tiras deben conservarse en posicin vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%. Las tiras secas pierden las dimensiones y las caractersticas del gel. La superficie de las tiras que es penetrable a las protenas se reconoce porque es ms opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro. FUNDAMENTO Las diferentes hemoglobinas se separan por migrar a diferentes velocidades. En este medio la HbA migra hacia el nodo, mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeas cantidades), queda en la HbA migrando juntas. La HbA2 tiene una velocidad menor que la A. REACTIVOS 1) Solucin buffer: Tris........................ 14,1 g Glicina .................. 22,6 g H2O destilada......... 1000 ml 2) Solucin colorante: Ponceau S: 0,5 g en 100 ml de cido tricloroactico 5% (dosis para 20 tiras) 3) Solucin decolorante: cido actico 5%. 4) Solucin deshidratante: Metanol puro. 5) Solucin de transparentizacin: Metanol ......................... 85 ml cido actico ................ 14 ml Glicerol ........................... 1 ml 6) Solucin disolvente: cido actico 80% Tcnica: 1. Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos 2. Eliminar el exceso de lquido secando entre 2 papeles de filtro. 3. Extender las tiras sobre el puente de la cmara electrofortica. La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba. La tira debe estar bien tiesa y plana. Operar rpidamente para evitar evaporaciones. 4. Sembrar las muestras con el hemolizado obtenido (ver ms adelante). 5. Conectar la fuente de poder, realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts, durante 90 minutos. 6. Desconectar la corriente y retirar las tiras. 7. Colorear durante 5 minutos. 8. Decolorar con 3-4 baos de solucin decolorante, hasta ver el fondo blanco de la tira. 9. Determinacin cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solucin disolvente y agitar. Leer a 520 nm si se us colorante Ponceau S. Transparentizacin: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos, a continuacin se las coloca en la solucin 45

transparentadora durante 1 minuto como mnimo. Se colocan luego en una placa de vidrio, eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos, hasta la transparencia completa. As se conserva para leer en densitometra. El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatas: TIPO Normal Polo negativo Anhidrasas Carbnicas Recin nacido Anhidrasas Carbnicas Drepanocitosis homocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbnicas Drepanocitosis heterocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbnicas Hemoglobinopata C homocigota Anhidrasas carbnicas Hemoglobinopata C heterocigota Anhidrasas HbC Carbnicas -talasemia heterocigota -talasemia homocigota Doble Heterocigota S/C Anhidrasas HbA2 Carbnicas Anhidrasas HbA2 Carbnicas Anhidrasas HbC HbS Carbnicas HbA HbC HbA HbF HbA HbA2 Polo positivo HbA ACLARACIONES HbA 98% HbA2 2% HbF 90% HbA 10% HbA2 2% HbS 98% HbA < 50% HbS > 50% HbA2 2% HbC 98% HbA2 2% HbC > 50% HbA < 50% HbA2 entre 4-8% HbA HbA2 normal % de HbF y HbA, variable segn tipo de Th homocigota HbS 50% HbC 50%

HbF HbA

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PREPARACIN DEL HEMOLIZADO Tcnica 1. Obtener 5 ml de sangre por puncin venosa, usando cualquier anticoagulante, aunque se recomienda la heparina. 2. Se lava tres veces con solucin fisiolgica, desechando los sobrenadantes. 3. se agrega un volumen de agua destilada igual al del paquete globular y 0,8 ml de tolueno (rompe los glbulos blancos), agitar vigorosamente durante 1 minuto. 4. Colocar en heladera (favorece la hemlisis), dejar 24 horas. 5. Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm, recoger con pipeta Pasteur el infranadante y filtrar. 6. Se determina la concentracin de hemoglobina en el bemolizado obtenido, mediante el mtodo de la cianmetahemoglobina, se lleva la concentracin hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada.

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Deteccin histoqumica de hemoglobina fetal: reaccin de Kleihauer-Betke


FUNDAMENTO La hemoglobina fetal (HbF o 2 2) es cido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elucin cida ser arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloracin de estos ltimos. REACTIVOS 1. Alcohol etlico al 80% 2. Buffer de cido ctrico, pH 3,4 Solucin A: cido ctrico............................ 4,2 g Agua destilada......................... 100 ml Solucin B: Citrato de sodio........................ 5,9 g Agua destilada......................... 100 ml Solucin Buffer pH 3,4: Solucin A ................ 84 ml Solucin B................. 16 ml 3. Eritrosina o eosina al 0,1 % en agua. DESARROLLO 1. Extendidos de sangre secos de no ms de una hora de obtencin, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etlico al 80% 2. Lavado rpido con agua y secado. 3. Inmersin en una cpsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37C un mnimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rpidamente en agua comn y secar en posicin vertical. 4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solucin de eritrosina o eosina. Lavar con agua y secar. RESULTADOS Los hemates con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacas y aparecen como sombras. El anlisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hemates coloreados e incoloros.

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DETERMINACIN DE HEMOGLOBINA FETAL: METODO DE SINGER FUNDAMENTO Debido a la muy semejante movilidad de la hemoglobina normal (HbA) y la hemoglobina fetal (HbF), cuando usamos los mtodos electroforticos de rutina para el estudio de hemoglobinas, es necesario valerse de la propiedad de la HbF (y la Hb Bart( de ser resistentes a la desnaturalizacin en medio alcalino. REACTIVOS 1. Solucin de hemoglobina (vase obtencin de bemolizado) 2. OHNa 1/12 N (recin preparado) 3. Reactivo precipitante SO4(NH4)2 .............................. 38 g ClH 1N ..................................... 2,5 ml H2O destilada ........................... 100 ml TCNICA Se preparan tres tubos: Tubo 1: Blanco: 3,2 ml de OHNa 1/12 N, agregar 6,8 ml de reactivo precipitante y filtrar. Tubo 2: Hb 100: 5 ml de agua destilada, agregar 0,02 ml de la solucin de hemoglobina Tubo 3: Hb lcali-resistente: 3,2 ml de oHNa 1/12 N, agregar 0,2 ml de solucin de hemoglobina y disparar en el momento un crnometro, a los 60 segundos agregar 6,8 ml de reactivo precipitente, invertir varias veces y filtrar. Leer en un espectrofotmetro a 540 nm, llevar a cero con el tubo blanco (Tubo 1).

CLCULO % de Hb lcali-resistente = VALOR NORMAL Menos de 2%. DO tubo 3 x 20 DO tubo 2

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Grupos sanguneos ABO y Rh: pruebas de Coombs


A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION a) Preparar una suspensin de hemates de grupo sanguneo desconocido, al 2 % en salina fresca (vase ms abajo el apartado C. Preparacin de la suspensin globular al 2%). b) Agregar una gota de la suspensin globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn. c) Simultneamente controlar cada antisuero contra hemates A1, B y O al 2% d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. e) Leer primero los controles y luego los problemas microscpicamente en visor y microscpicamente. f) Scores de lectura: +++ un gran aglutinato ++ varios aglutinatos grandes ++ muchos aglutinatos pequeos + pequeos aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo + aglutinatos visibles pero solo microscpicamente aglutinatos conteniendo muy pocas clulas tr trazas - negativo B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO a) Tomar una muestra de suero libre de hemates. b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensin al 2%, de los siguientes hemates: 1) hemates A conocidos 2) hemates B conocidos 3) hemates del propio individuo 4) hemates O conocidos c) Incubar 1 hora a ta o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. d) Leer primero los controles y luego los problemas , microscpicamente en visor y microscpicamente. C. PREPARACIN DE LA SUSPENSIN GLOBULAR AL 2% Separar los hemates del plasma y trasvasar una porcin de los mismos a un tubo de Kahn. a) Llenar el tubo con solucin fisiolgica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. b) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces ms, teniendo la precaucin de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solucin fisiolgica. c) Tomar una gota de culot (50 l) y agregarle 0,5 ml de solucin fisiolgica. Se tendr as la suspensin al 2%.

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D. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA a) b) c) d) Colocar una cantidad de sangre total igual a de gota. Agregar una gota de anti-A absorbido1 y mezclar bien con una varilla de punta fina. Al terminar de mezclar, disparar el cronmetro. Rotar la placa en forma circular y observar la aparicin de aglutinacin dentro del minuto.

Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados: Glbulos rojos problema Anti A + + GR A + + Anti B + + GR B + + Anti AB + + + GR AB + + + Grupo ABO A B O AB Grupo ABO A B O AB

Suero problema

E. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn. b) Adicione una gota pequea de suspensin de glbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra. c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm. d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se har microscpicamente con un visor y microscpicamente. e) Proceda de la misma manera con los tubos controles. E.1 Controles a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D c) Control de seudoaglutinacin: muestras de sangre + plasma de persona AB. E.2 Reacciones Positiva: los hemates D(Rho) positivos permanecern aglutinados al querer desprender el culot globular. Negativa: los hemates (Rh-rh) se suspendern nuevamente sin evidenciar aglutinacin.

F. PRUEBA PARA DETECTAR Du

Tambin se puede utilizar un monoclonal anti-A1

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Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti D. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du. Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs. Coloque dos gotas de suero anti D(Rho) en un tubo de Kahn2. Agregue 1 gota de una suspensin sangunea al 2% en salina . Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37C. Lave los hemates 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Centrifugue y elimine el sobrenadante. 5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana. 6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm, desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se har macro y microscpicamente. 1) 2) 3) 4) F.1 Reacciones Positiva: los hemates Du (Rhou) positivos permanecern aglutinados luego de intentar desprender el culot globular. Negativa: los hemates Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspendern y no aglutinarn.

F.2 Controles utilizados Se utilizan tres controles para 1. Probar la bondad del suero 2. Comprobar su especificidad 3. Para seudoaglutinacin Para el primer control positivo deben emplearse hemates Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). Es aconsejable usar esos hemates y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con el antgeno E(rh) presente ,dado que, en tales hemates el factor D(Rho) es mas reactivo. El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecficas para el antgeno en cuestin (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparacin del suero). Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es especfico y no posee ningn contaminante que pueda falsear los resultados. El tercer control, es de seudoaglutinacin y para ello se reemplaza el suero anti D por suero de persona de grupo sanguneo AB, se lo enfrenta con los hemates que estn siendo tipificados.

G. COMPROBACIN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS.


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La deteccin de Du tambin se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du.

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G.1 Prueba de Coombs indirecta 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensin de hemates de grupo O Rh+ al 2%. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el perodo de incubacin de 1 hora a 37 C. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solucin fisiolgica y 2 gotas de suspensin de hemates O Rh+ al 2%. 2) Centrifugar, quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solucin fisiolgica, eliminando completamente el sobrenadante en el ltimo lavado. 3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2 4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscpicamente con visor y microscpicamente. G.2 Prueba de Coombs directa 6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensin al 2% de hemates problema. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensin de hemates O Rh+ sensibilizados al 2%. 7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2 8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscpicamente con visor y microscpicamente.

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Anti-A, Anti-B o Anti A,B


Monoclonal
Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el ao 1900 Landsteiner descubri que los glbulos rojos humanos podan ser clasificados en A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antgenos altamente reactivos en su superficie. Tambin demostr que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfgenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antgeno presente en sus propios glbulos rojos pero s contra los que no posee. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la prctica transfusional. Por este motivo, la tipificacin de los grupos sanguneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los dems ensayos pretransfusionales. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antgenos correspondientes, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. La ausencia de aglutinacin en todos los casos, implica grupo O. REACTIVOS PROVISTOS Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por lneas celulares de hibridomas de ratn. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la tcnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica - Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfatos (PBS) - Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS) - Albmina Bovina 30% de Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos o sangre entera a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Centrfuga - Tubos de hemlisis - Placas - Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". PROCEDIMIENTO

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En las siguientes tcnicas la suspensin de glbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solucin fisiolgica, PBS o LISS. I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensin de glbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una suspensin al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una placa limpia, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos. 2) Mezclar el Reactivo y los glbulos con un palillo descartable cubriendo un rea circular de 2 cm de dimetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar aglutinacin visible microscpicamente hasta los 2 minutos. No debe emplearse microscopio. II- TECNICA EN TUBO (por centrifugacin) 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemlisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al 3-5%. III- TECNICA EN TUBO (por sedimentacin) 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemlisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al 3-5%. 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. 3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la aglutinacin. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas utilizadas) indica una reaccin positiva. Antisuero Anti-A + + +/Anti-B + + Anti-A,B + + + +

Grupo sanguneo A B 0 AB Variants dbiles del grupo A como Ax

METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glbulos rojos tipificados. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones dbiles pueden observarse en las siguientes situaciones: - Neonatos: los antgenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recin nacido. Por esta razn deben extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros. - Leucemias u otros desrdenes malignos. - Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idntico. - Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificacin de los grupos sanguneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes, compuestos qumicos o con partculas de slica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. - Aglutininas fras: en presencia de aglutininas fras, el lavado de los glbulos rojos 4-6 veces con solucin fisiolgica, resulta generalmente suficiente para obtener clulas aptas para la tipificacin. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de estas clulas con 2 gotas de solucin fisiolgica. No debe producirse aglutinacin. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cd. 1443152). Anti-B: frasco x 10 ml (Cd. 1443154). Anti-AB: frasco x 10 ml (Cd. 1443153). BIBLIOGRAFIA - Moore, S. et al. Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use. Pars, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59. - Widman, F.K. Technical Manual. 9th Edition, Washington, D.C. American Association of Blood Banks 1985. Chapter 8. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

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Anti-D (Rho)
monoclonal
Reactivo para la deteccin de antgeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clnica de la deteccin en el laboratorio de los anticuerpos anti-D. Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antgeno D y son fcilmente estimulados cuando reciben este antgeno, ya sea por transfusin o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemoltica del recin nacido. Existen muchos otros antgenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antgeno D el que posee mayor importancia en la clnica despus del sistema ABO. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocito el antgeno correspondiente, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solucin de anticuerpos monoclonales humanos. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la tcnica empleada puede requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica. - Suero Anti-humano (poliespecfico) provisto separadamente por Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos o sangre entera a) Recoleccin: obtener la sangre en forma asptica con o sin anticoagulantes. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). c) Sustancias interferentes conocidas: los glbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha esta situacin deber realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Dependiendo de la tcnica que se emplee, podrn ser necesarios: - Centrfuga - Tubos de hemlisis - Placa de vidrio

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- Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensin de glbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica. Tambin puede emplearse sangre entera. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar. 3) Mezclar el antisuero y los glbulos rojos con un palillo descartable en un rea de 2 cm de dimetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

II- TECNICA EN TUBO Preparar una suspensin de glbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autlogos, o en solucin fisiolgica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 4) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos, luego centrifugar y volver a leer como se describi en 4). Las muestras que an en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antgeno Du. III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensin al 3-5% de glbulos rojos en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.

3) 5)

Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos.

4) Lavar las clulas 3-4 veces con solucin fisiolgica, descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las clulas luego de cada lavado. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico), mezclar, centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. 6) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. La prueba para tipificacin de antgeno D (Rho) de glbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. La determinacin del Du no puede efectuarse sobre glbulos rojos sensibilizados. Pueden obtenerse resultados ms rpidos y mejor visualizacin precalentando la placa a 45-50oC. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cd. 1443155). BIBLIOGRAFIA - Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940. - Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959. - Widman, F.K. - Technical Manual - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of Blood Banks, Chapter 9, 1985. - Race , R.R. and Sanger, R. - Blood Groups in Man - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific Publications, pg. 178, 1975.

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Suero Anti-humano
(poliespecfico)
Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores mtodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente haca referencia a antgenos del sistema Rh. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la deteccin de anticuerpos en casi todos los grupos sanguneos de importancia clnica, siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prueba Antiglobulina Indirecta - Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. - Pruebas de compatibilidad previas a la transfusin. - Fenotipo de glbulos rojos. - Identificacin y titulacin de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. Prueba Antiglobulina Directa - Diagnstico de laboratorio de anemia hemoltica y enfermedad hemoltica del recin nacido. - Investigacin de reacciones dudosas en una transfusin. - Investigacin de enfermedades autoinmunes que involucran la unin de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glbulos rojos. FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecfico) a glbulos rojos que estn cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinacin de los glbulos rojos visible macroscpicamente. REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecfico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3. REACTIVOS NO PROVISTOS - Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos. De acuerdo a la tcnica a emplear puede requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica. - Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfato (PBS). - Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS). INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero Anti-humano (poliespecfico): listo para usar. PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab.

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c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. Cuando se efectan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extraccin). Si los glbulos provienen de cogulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Centrfuga - Bao de agua a 37oC - Tubos de hemlisis PROCEDIMIENTO I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin salina de fuerza inica normal). 1) En un tubo de hemlisis colocar 2 gotas del suero a probar. 2) Agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS.

3)

Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.

4) Lavar los glbulos 3 veces con PBS teniendo la precaucin de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente el sobrenadante luego del ltimo lavado. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico) al botn de clulas. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm. 6) Resuspender las clulas por agitacin y observar macroscpicamente. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones dbiles. 7) Los resultados negativos deben confirmarse por adicin de glbulos rojos sensibilizados con IgG dbiles. II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin fisiolgica de baja fuerza inica). El empleo de esta solucin permite reducir el tiempo de incubacin a 15 minutos. Los glbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con esta solucin una suspensin de glbulos rojos al 3%. 1) Colocar en un tubo de hemlisis 1 gota de suero a probar. 2) Agregar 1 gota de glbulos rojos a probar al 3% en LISS. 3) Mezclar e incubar a 37C durante 15 minutos en bao de agua. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la tcnica I). III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorcin in vivo de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glbulos rojos. 1) Preparar una suspensin de glbulos rojos a probar en PBS al 3%. 2) En un tubo de hemlisis colocar 1 gota de esta suspensin y continuar con los pasos 4) a 7) de la tcnica I). INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: - Contaminacin qumica o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. - Lavado inadecuado de las clulas. - Tiempo o temperatura de incubacin inadecuados. - Tiempo o velocidad de centrifugacin inadecuados. - Concentracin inadecuada de glbulos rojos. - Agitacin excesiva para despegar los glbulos rojos aglutinados. Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cd. 1443156). BIBLIOGRAFIA - Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945.

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- Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945. - Widman, F.K. - Technical Manual. 9th ed. Washington D.C. American Association of Blood Banks, pg. 376, 1985.

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Determinacin de anticuerpos inmunes


A. TITULACIN DE ANTICUERPOS A.1 Tcnica bsica de titulacin A.1.1. Preparacin de diluciones madres. a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el nmero de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario). b) En los tubos 2 al 10, colocar 0,100 ml de solucin fisiolgica (SF). Colocar 0,300 ml de suero a titular en el tubo N1. c) Tomar 0,100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N2. d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Luego se toman 0,100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N3. Homogeneizar y repetir la operacin hasta completar las diluciones. A.1.2 Titulacin a) Se toman 10 tubos de Kahn, numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. Con una pipeta Pasteur para cada dilucin, colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos. b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensin de hemates al 2%. Agitar la mezcla. c) Incubar a la temperatura apropiada , el tiempo requerido. d) Simultneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinacin y de especificidad del suero. e) Leer los resultados macro y microscpicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilucin. El grado de aglutinacin se considerar segn los scores anteriormente indicados. El ttulo es la recproca de la dilucin ms alta donde se observa aglutinacin . Si en la ltima dilucin, con aglutinacin, el tipo de aglutinato es tr, el ttulo se determinar promediando dicha dilucin con la precedente. Por ejemplo, si en el tubo N 5 cuya dilucin es 1/16, el tipo de aglutinato es tr, el ttulo ser (16+8)/2=12. a) Control de autoaglutinacin: consiste en enfrentar dos gotas de suspensin de hemates a usarse con dos gotas del suero del dador de hemates. b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hemates O con dos gotas del suero a titular.

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