UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS ASIGNATURA HEMATOLOGIA

Métodos del laboratorio hematológico
PRIMERA PARTE

Docentes

Dra. Nilda E. Fink Dra. María Elena Chiesa Dra. Ma. Alejandra Fernández Alberti Bioq. Fernando Ventimiglia Bioq. Mariana González Bioq. José Luis Casali

La Plata, 2007

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Contenido
Página Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa Descripción de los anticoagulantes usados en hematología Recuento de hematíes Hematocrito Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina Velocidad de sedimentación globular Recuento de reticulocitos Cuantificación de hierro sérico Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls Separación electroforética de hemoglobina Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs Determinación de anticuerpos inmunes 3 5 7 12 15 21 26 29 34 42 45 47 57

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El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y. 8. 7. 10. no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo. se retira el torniquete y luego la aguja. limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol. se le indica al paciente que abra la mano. Una vez identificada la vena. tener todo el material preparado pero sin abrir. 15. Elegir una vena bien visible en el antebrazo. 5. Dejar secar perfectamente. evitando hacer espuma. localizándola visualmente y por palpación. 6. controlando el correcto funcionamiento del émbolo. se la colocará en la jeringa sin tocar con los dedos. La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes. los cuales se mantendrán puestos durante todo el procedimiento. 9. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresión del músculo no mayor a 1 mm. 13. LA AGUJA SE DESCARTARÁ EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN.Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa A) EN ADULTOS 1. 14. Una vez realizada la toma de muestra. descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin. 12. 2. En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más sangrado. 11. presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco. indicarle al paciente que abra y cierre el puño para facilitar la extracción. Antes de iniciar la toma de muestra. En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja. 4 . La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba. Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene. 4. Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. Los recipientes que contienen algodón y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirán solamente al momento de usar. Después de la toma. una vez manipulado. 3. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba). dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. Colocar el lazo y volver a palpar la vena.

en particular el brazo. 3. En el caso de niños menores de 6 meses. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante. en la zona del talón indicada en el dibujo adjunto. aclararlo en el registro de muestras. dejar evaporar y punzar con la lanceta. colocar una curita o apósito. NO REUTILIZARLOS NUEVAMENTE. Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento. 2. Secar la zona con un trozo de algodón seco y una vez que no haya sangrado. La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. 4. pidiéndole a un adulto que colabore en mantener inmóvil al niño. Desinfectar con un trozo de algodón embebido en alcohol.16. En niños mayores de 6 meses. 17. Antes de la extracción conviene calentar el talón frotándolo entre las manos para favorecer la irrigación de la zona. B) EN NIÑOS 1. Las flechas indican los lugares de punción 5 . se recomienda hacer la extracción del brazo como en adultos. se procederá a extraer la muestra del talón con una lanceta descartable.

Los anticoagulantes más utilizados son: • EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico. CITRATO TRISÓDICO. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0.3 g/L de C6H5O7Na3.1g. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos. sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. sin embargo . dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético.0. es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. HEPARINA DE LITIO.2H2O). de sangre total. El citrato sódico se utiliza a una concentración de 0. evitando así la coagulación. impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo.Descripción de los anticoagulantes usados en Hematología Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares. por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido. las tres sales afectan el tamaño del eritrocito. el tamaño eritrocitario. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares.5-2.106 mol/l (31.8+/-1. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.2H2O posee un peso molecular relativo de 404. HEPARINA SÓDICA.1-0. posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C). Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin.2 mg/ml. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro • • • 6 .2 mg) de heparina por ml de sangre. 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4. El K2EDTA . Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1. no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria. actúa impidiendo que el calcio se ionice. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos. especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes. C6H5O7Na3. actuando mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca+ + ).

9 g. 7 . La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0.volúmenes de sangre. Citrato disódico 2 g. Dextrosa 2 g. H2O destilada 120 ml.

Líquido diluyente: solución fisiológica o citrato de sodio 3. se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeños. como se muestra a continuación: 8 .8%.02 ml El recuento se realiza en la cámara de Neubauer cuyo esquema es el siguiente: El recuento de hematíes se realiza en el cuadrado central.98 ml Sangre (con pipeta automática): 0.Recuento de hematíes A) RECUENTO MANUAL Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. para lo cual se mide exactamente: Solución fisiológica o citratada: 3. La dilución empleada es de 1/200. Es un método poco usado debido al elevado error que presenta.

2. 6. D: Título de la dilución realizada (200). Falta de suficiente agitación de la sangre diluida. Se deben contar 5 de estos cuadrados. Células mal distribuidas en el fondo de la cámara. ST: Total de cuadrados pequeños en la superficie de 1 mm2 (400). sucia o mojada. el cual puede deberse a: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración.Recuadro central: Las líneas reforzadas. Hemólisis. Errores del operador al realizar el recuento. que el retículo tiene 400 cuadrados pequeños en total. luego de agitar adecuadamente en un agitador de rodillos. La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0. para llevar a 1 mm3 (10). sirven únicamente como límites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeños. el cálculo que se debe hacer es el siguiente: N x D x FC x ST = nº de glóbulos rojos/mm3 TC Donde: N: número de eritrocitos contados. La cámara puede ser cargada con un capilar. Errores al efectuar los cálculos. FC: Factor de corrección de la profundidad. Cámara cuentaglóbulos mal ajustada. Utilización de material mal calibrado. 7. 5.1 mm. 3. sucio o húmedo. 9 . TC: Total de cuadrados pequeños contados. Llenado incompleto de la cámara cuentaglóbulos. Considerando entonces. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. se carga la cámara y se cuentan los glóbulos rojos de los 80 cuadrados pequeños (zona sombreada). 8. 4. Con la dilución indicada. Empleo de cubreobjetos deformable. evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente. 1. o triples. Causas de error en el recuento en cámara cuentaglóbulos El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%. no rígido. Coagulación parcial.

es decir.1 Método de la impedancia o de la resistencia eléctrica Es el más empleado en los autoanalizadores hematológicos. Por dentro y fuera del orificio se disponen electrodos que establecen una diferencia de potencial. Como los impulsos eléctricos que van a determinar el volumen celular se generan en el orificio de apertura del sistema. Este método tiene algunas limitaciones. El diámetro del orificio de apertura: debe estar en relación al tamaño de las partículas que se analizan. se genera una resistencia entre ambos electrodos que se registra como un impulso. Es importante realizar periódicamente una limpieza de este orificio. los aparatos totalmente automatizados sólo requieren que se les suministre la muestra obtenida en condiciones apropiadas (por ejemplo: con el anticoagulante adecuado). 2. 2. El número de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular y como la amplitud del impulso es directamente proporcional al tamaño de la célula. Si es muy elevada puede dañar las células y producir interferencias originadas por ruido electrotérmico. B. Debe ser perfectamente permeable. como por ejemplo diluciones de la muestra antes de ser procesada y. Cuando una célula pasa a través del orificio. Las condiciones más importantes que deben tenerse en cuenta son: 1. 3.B) RECUENTO AUTOMATIZADO La automatización ha contribuido de manera decisiva al aumento de la rapidez y la fiabilidad del recuento de las células sanguíneas. Existen distintos tipos de instrumentos: los semiautomatizados que requieren algunos pasos previos. La concentración de la suspensión analizada: debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia. es posible determinar también el volumen celular. que varias células atraviesen el orificio al mismo tiempo. Dispersión de luz o campo oscuro. Los sistemas de recuento celular por estos medios se basan en la medida del tamaño u otras propiedades físicas de las células suspendidas en medio líquido de acuerdo con uno de los dos principios siguientes: 1. para cada población celular que se quiera estudiar se deben seleccionar las condiciones para que sean analizadas sin error. La intensidad de corriente entre ambos electrodos: debe ser lo suficientemente sensible para detectar la resistencia que genera la partícula cuando atraviesa el orificio. las células sanguíneas así diluidas se hacen pasar por un orificio de apertura con un área prefijada. por lo general poseen un monitor de visualización que permite observar su permeabilidad durante el recuento. Impedancia o resistencia eléctrica. Se basa en la propiedad de las células sanguíneas de no conducir la electricidad. 10 . La sangre total es diluida en una solución de conductividad estable.

9x1012/L D) INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 11 . será analizada por los sensores.6. f) Contaminación por arrastre de un especimen con el siguiente. d) Dilución incorrecta de la muestra por el liquido diluyente.5.0x1012/L .2x1012/L 4. En general. el error debido al propio método de recuento electrónico. proyectada sobre un campo oscuro. Las células se hacen pasar individualmente a lo largo de una cámara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz que puede ser halógena o láser. suele ser inferior al 1%.5x1012/L .5. C. cuando se realiza en óptimas condiciones.1x1012/L . que son contadas como células. g) Presencia de interferencias electrónicas y averías de los componentes electrónicos del instrumento.B. Si además. Coagulación parcial. VALORES DE REFERENCIA Edad Recién nacidos Niños (2-12 años) Adultos jóvenes (12-18 años) Adultos jóvenes (19-60 años) Sexo ambos ambos mujeres hombres mujeres hombres Intervalo de referencia 4.3x1012/L 4. e) Presencia de microburbujas. 4. c) Obstrucción de los capilares u orificios de recuento. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre. 2.5.6x1012/L .2 Método de dispersión de luz Se analiza la dispersión de luz producida por las células desde dos dimensiones gracias a sensores ubicados en ángulos diferentes. 1. Causas de error en el recuento automatizado Con el empleo de métodos automatizados se puede cometer grandes errores si se olvida el control periódico y el calibrado diario de los instrumentos. 3.3x1012/L 4.1x1012/L 4. Presencia de partículas extrañas en el diluyente. pero puede incrementarse por: Errores de extracción: dilución o hemoconcentración.1x1012/L . b) Presencia de agregados celulares a nivel del orificio de recuento.5. Cada vez que una célula se interpone en el haz de luz se produce una sombra que.5.3x1012/L 4. Uso de un diluyente incorrecto.7x1012/L . las células se someten a tinciones citoquímicas se pueden detectar midiendo la intensidad de dicha reacción los diferentes tipos de leucocitos. Defectos en el sistema electrónico de recuento: a) Lisis incompleta de los eritrocitos en el orificio de leucocitos. Hemólisis. Estos sistemas permiten medir la concentración y el volumen celulares.

12 .Un aumento de la concentración de eritrocitos con contenido hemoglobínico normal suele acompañarse de un aumento de la concentración de hemoglobina y recibe el nombre de poliglobulia. El descenso en la concentración de eritrocitos en la sangre se acompaña siempre de una disminución en la concentración de hemoglobina (anemia) y puede deberse a diferentes causas como las hemorragias. se habla de seudopoliglobulia. la cual puede acompañarse de microcitosis como en la talasemia. la hemólisis o fallas en su formación a nivel de la medula ósea. Cuando el aumento de la concentración de eritrocitos va acompañado de una disminución de la hemoglobina.

2-0. El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. Por ej. expresado como porcentaje. Por ello. puede ser normal o alto. obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados. Tanto el Hto. por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia.m. que corresponde a una fracción de la longitud original de la columna sanguínea (100 mm). Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina. La lectura del resultado se realiza extrayendo los tubos de la centrífuga y valorando la altura en milímetros de la columna eritrocitaria. 13 . Debe excluirse la columna de leucocitos y plaquetas. dentro del contexto del hemograma automatizado.3 %). es una técnica sencilla. En la actualidad. A) METODOS MANUALES A. Así. El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo).. tubo de Wintrobe con diámetro interno de 3mm . Centrifugamos durante 30 minutos a 2. Ambos métodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la acción de una fuerza centrífuga.Hematocrito DEFINICION El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión. un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. todos los autoanalizadores hematológicos suministran. Aunque también puede emplearse un tubo de Wintrobe (macrométodo). son un buen parámetro del estado de la serie eritroide. un descenso del Hto es indicativo de anemia.000-3. aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. por lo que es siempre algo inferior (0. mientras que el aumento lo es de poliglobulia. entre sus factores de error está el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura.1 Macrométodo (macrohematocrito) Utiliza 0. este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisión.6 ml de sangre entera anticoagulada con EDTA. un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración.000 r.p. Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas. barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. el Hto.

provoca que el sedimento de hematíes vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal. de longitud por 1mm. favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. produce una mezcla con los líquidos tisulares que provoca hemodilución. El llenado de los tubos se realiza por capilaridad. o con una regla milimetrada. aplicando la siguiente regla de tres: A------. Causas de error • • • • • Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. En muestras de sangre venosa.5 cm. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito.01.x x : hematocrito en tanto por ciento A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0. Hto = n° de hematíes x VCM 14 . Si se utiliza sangre capilar. muy sencilla y poderse realizar en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo. de diámetro interno. el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentración.A. METODO AUTOMATIZADO: CONTADORES HEMATOLOGICOS El método automático de determinación se basa en el cálculo matemático a partir del Volumen Corpuscular Medio (VCM) y el número de hematíes. El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota. se desechará la primera gota después de la punción. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. que nos darán el resultado directamente.2 Micrométodo (microhematocrito) Es una técnica muy utilizada. por necesitar muy poca cantidad de sangre.100 B------. Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7. dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000 rpm. Heparinizados o no. Tan pronto se detiene la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. B. La lectura no inmediata de los capilares. Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 µl). al perderse mayor proporción de células que de plasma.

42 ± 0.05 15 . Edad y sexo Recién Nacidos Niños (hasta 10 años) Mujeres (18-50 años) Embarazadas Hombres (18-50 años) Hematocrito % 54 ± 10 38 ± 5 42 ± 5 39 ± 5 45 ± 5 Fracción 0.45 ± 0.38 ± 0.54 ± 0.VALORES DE REFERENCIA ( x ± 2 DE) El valor de Hto varía con la edad y el sexo.39 ± 0.05 0.05 0.05 0.1 0.

El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la transformación de la hemoglobina en HiCN. Todo patrón de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN. ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7. Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo). Tubos: 12 x 100 mm. Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados periódicamente mediante la solución patrón de HiCN. preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) 2. 7.4) Ferricianuro potásico [K3 Fe(CN) 6] Cianuro potásico [CNK] Fosfato monopotásico [KH2PO4] Detergente no iónico* Agua destilada hasta 200 mg 50 mg 140 mg 1 ml 1000 ml Detergentes no iónicos: Tritón X-100. de forma que aquella se completa en 3 min. Puede emplearse sangre capilar. 3. Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 ml. 5. Nonic 218. Reactivo de Cianmetahemoglobina: Composición (pH 7-7. Este reactivo debe tener un color amarillo pálido. debidamente calibradas. 4. Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina. 16 . se transforman en HiCN según el siguiente proceso: Hemoglobina + Ferricianuro potásico → metahemoglobina Metahemoglobina + Cianuro potásico → cianmetahemoglobina MATERIAL 1. excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa. Nonidet/40. Pipetas automáticas: de 20 µl.Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina FUNDAMENTO Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN). 6. Los distintos compuestos de hemoglobina.5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración). Quolac Nic 218. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero.4.

según el lote y el instrumento de lectura utilizados. si la dilución ha sido de 200 veces. 3. Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio.248 y 0. El patrón primario posee un espectro de absorción característico con un pico de máxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexión a 504 nm.62. 6. 8. y a 504 nm entre 0.0) de la hemoglobina ( por ej. Mediante la micropipeta añadir 20 µl de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta. Leer la A de la solución a 540 nm. si la sangre total se ha diluido 250 veces. El patrón primario de HiCN se suministra en ampollas cerradas al vacío que contienen 10 ml de una solución de HiCN correspondiente a una concentración de hemoglobina entre 550 y 850 mg/l. La concentración exacta de hemoglobina de cada lote se indica siempre en la ampolla. Patrón primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarización y el control de calidad.1 .El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendría una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimétrica. 7. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibración (ver más adelante). significa que dicha solución patrón posee la misma absorbancia que la de una solución de hemoglobina de 143 g/l. donde también se incluye la curva del reactivo. 4. Conectar el espectrofotómetro. Así.1). Este patrón. METODO Por un lado. se efectuará el espectro de absorción de la solución de referencia internacional y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig.8. 2.404.60 y 1. si en el frasco se indica una concentración de 572 mg/l.251. la absorbancia de una solución que contenga 4 x 55.8 mg de hierro hemoglobínico por litro a 540 nm). es una solución muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y características fisicoquímicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64. El cociente A540/A504 oscila generalmente entre 1. o de 114 g/l. Agitar el tubo mediante inversión ( 4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.. 5.400 y 0. La curva de longitud de onda versus A desde λ=750 nm a λ=460 nm se observa en la Fig. Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión del tubo 20 veces.458) y el coeficiente de extinción (44. La concentración de hemoglobina también puede calcularse aplicando la siguiente fórmula: 17 . utilizando agua destilada como blanco. El valor de la A a 540 nm varía entre 0. Por otro lado se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuación: 1. Al realizar esta operación.

partiendo de la solución de HiCN más diluida (tubo 5) se leen las restantes soluciones patrón. se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene sólo reactivo (tubo 5) y se ajusta la A (100% de transmitancia).5 3 1:6 24 5 0 3.5 2. Patrón de referencia de HiCN (ml) La concentración de hemoglobina correspondiente a cada tubo se determina a partir del grado de dilución y del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN.0 0 3 0 145 2 1. Finalmente. Luego.621. 2). Para trazar este gráfico se preparan 5 soluciones de concentración de HiCN conocida y decreciente a partir del patrón de HiCN mediante diluciones sucesivas en reactivo de cianmetahemoglobina (véase tabla 1). ELABORACION DE LA CURVA DE CALIBRACION La gráfica de calibración tiene como finalidad calibrar el espectrofotómetro para una lectura determinada calculando la corrección existente entre los valores de A leídos en el aparato y los correspondientes valores de concentración de hemoglobina.5 3 1:2 72 3 1. 18 .0 3 0 0 * El valor de esta concentración dependerá del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN que se emplee en el Trabajo Práctico.Hemoglobina (g/l)= A540 (muestra) A540 (patrón) x HiCN patrón (mg/l x F 1000 Siendo A= absorbancia F= factor de dilución de la sangre total en el reactivo de Van Kampen y Zylstra (251).0 2. Reactivo de Drabkin Volumen Dilución Hb Tubo (modificado) final (ml) (g/l) (g/l)* (ml) 1 3. Una vez preparadas las soluciones patrón. la relación entre los valores de A obtenidos y los correspondientes de concentración de hemoglobina se representan en un gráfico con los valores de A en las coordenadas y la concentración de hemoglobina en las abscisas (Fig.0 3 1:3 48 4 0. La concentración de hemoglobina en milimoles por litro de sangre (mmol/l) puede calcularse multiplicando el valor en g/l por 0.5 1.

Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la Hb en HiCN Errores de la determinación: 1. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN: Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido 1. Soluciones turbias de HiCN Errores en la conservación del reactivo: 1. Empleo de anticoagulantes no recomendados 2. 2. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (>50 x 109/l). No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo 2. Cubetas sucias o deterioradas 3. Empleo de instrumentos no calibrados 2. la mayoría de las veces los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen.Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. Errores en la obtención del espécimen de sangre: Errores de extracción 1. Congelación del reactivo. No obstante. en vez de HiCN. 19 . Coagulación parcial de la sangre Errores de la dilución: Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o húmedas 1. lo que produce transformación de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y una oxidación parcial de la Hb. Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formación exclusiva de metahemoglobina. con lo que los valores de concentración de Hb obtenidos son inferiores a los reales.

Espectro de absorción de la solución de HiCN y del reactivo usado 20 .

21 .Curva de calibración elaborada a partir de una solución de cianmetahemoglobina de concentración conocida.

Viscosidad del plasma. como se mencionó más arriba. este fenómeno depende de los siguientes factores: a. Así. Dado que. cuanto más pequeños sean los agregados. b. Temperatura. 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante. pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células. Desde el punto de vista físico. c. y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis. polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia. Tamaño de los G Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma. d. MECANISMO El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado. Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico.Velocidad de sedimentación globular FUNDAMENTO El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo. Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR. ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa. por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin. linfomas y mieloma múltiple). Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. 22 . VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea. Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad η a una velocidad v: R = 6ηvr La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas". La etapa más importante es la primera o de aglutinación.

El método de Westergren es menos sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y así puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening. aunque reproducen exactamente el método de Westergren. como es la necesidad de prediluir la sangre. la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH). por el otro lado. El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. lo que explica que estas células se mantengan separadas. puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. 23 . y un bajo hematocrito causa un aumento no específico de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre los agregados en sedimentación. El método de Wintrobe. lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. METODOLOGIA Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el método de Wintrobe. De acuerdo con este mecanismo. Tradicionalmente. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina.La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación entre el plasma y los GR en la muestra. Ambos métodos poseen limitaciones. han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable. continua siendo un método poco reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. Sin embargo. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones de albúmina. Durante los últimos años. globulinas y fibrinógeno. mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta. MÉTODO DE WESTERGREN Es el método de referencia para medir la VSG. las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. La albúmina retarda la VSG. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR. pero no resultaron confiables. Estos sistemas. el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas. se diferencian de éste por su carácter cerrado (recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisión del llenado de las pipetas. Así. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias.

5 ml de anticoagulante. se mezcla por inversión repetidas veces. La misma debe estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en ella. MATERIALES. sin exposición a la luz del sol directa.05 mm) todo a lo largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. si es mantenida a 4°C. manteniéndolo exactamente 60 min. TÉCNICA B) La sangre se obtiene por punción venosa. A.55 + 0. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1°. A. D) El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25°C). 24 .2 Tubo de sedimentación Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1. A. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza.1 Anticoagulante Citrato trisódico 109 mM en solución acuosa. los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solución de citrato de sodio. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente.08 g/l.3 Gradillas Las gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición vertical inmóvil. y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. B. Algunos plásticos resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de taponamiento. Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las especificaciones. o dentro de las 6 hs. Si utiliza citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7.A. por ejemplo 2 ml de sangre en 0. El nivel de la sangre se ajusta a cero. Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua.5 mm y de un diámetro de 2. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.15 mm. libre de vibraciones y corrientes de aire. evitando contaminación con materiales utilizados para la higiene de la piel. C) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente. El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.2H2O) prepare una solución acuosa de 32.

corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora). se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas. han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica. expresado en mm.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos. 25 . C. muy utilizadas anteriormente. Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. contraconceptivos orales.E) Una vez transcurrido el tiempo. y también en el embarazo normal y el puerperio. por lo que no se recomienda su empleo. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda. VALORES DE REFERENCIA EDAD (años) Niños mayores y jóvenes Hombres adultos Mujeres adultas 0-15 17-50 51-60 61-70 17-50 51-60 61-70 X + 2 DE 5 + 10 4+3 6+3 6+4 6+3 9+5 10 + 5 Límite superior de la normalidad 15 10 12 14 12 19 20 Factores técnicos capaces de modificar la VSG Causas de aumento • Desviación de verticalidad de la pipeta • Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta • Elevación de la temperatura ambiente • Dilución de la sangre • Causas de disminución: • Reducción del diámetro de la pipeta • Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido) • Cambio de anticoagulante D. y las medicaciones (corticosteroides. el ciclo menstrual. INTERPRETACION DE RESULTADOS Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia). Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs. etc. El valor de esta distancia.

).La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia. 26 . y ocasionalmente sin causa aparente. esferocitosis hereditaria. Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG. etc. defectos cardíacos congestivos. anemia falciforme. hipofibrinogenemia. es inusual obtener falsos negativos. un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgánica. por ende. anormalidades de GR (hemoglobinopatías.

mientras que cuando el número es normal o disminuido se denomina arregenerativa. pero sobretodo a los errores de índole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito.. se toma una pequeña gota de la suspensión y se extiende sobre un portaobjetos. aproximadamente. los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3 días y terminan su maduración en 24 horas. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida. una vez ya en la sangre periférica. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. existen en la sangre en una proporción de cinco a diez por mil hematíes. En caso de valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solución colorante. Mediante una pipeta Pasteur se añaden a un tubo de hemólisis tres gotas de solución colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción. Tinción vital y microscopio óptico. MÉTODO DE LA TINCIÓN VITAL (MÉTODO DE REFERENCIA) Este método usa como colorante el azul de metileno nuevo: 1 g cada 100 ml de solución citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de ClNa 9 g/L). El recuento se efectúa contando en donde los eritrocitos estén distribuidos homogéneamente. eritrocitos inmaduros. Transcurrido este tiempo. 2.Recuento de reticulocitos Los reticulocitos. Citometría de flujo. El método manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variación >20%). La suspensión sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. dentro de las 24 primeras horas de la extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene a 4º C. Su tamaño es el de los demás hematíes y se caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando un retículo granulofilamentoso observable al ser teñido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA)y a ser posible. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula. una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersión (x1000). siendo 100-125 el número óptimo de hematíes por campo de los cuales distinguimos cuales son 27 . Cuando una anemia se acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa. Es necesario realizar el recuento sobre un mínimo de 1000 eritrocitos. En condiciones normales. lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a terapéuticas agresivas. El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea.

La mezcla sangre/colorante se incubará durante 15 minutos a 37º C. En caso de anemia intensa. Este fenómeno se caracteriza por la aparición en el examen morfológico de la extensión de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y tonalidad azulada (policromasia) Existe una relación inversa. Este valor será valido si se trata de una concentración normal de eritrocitos en sangre total.30 0. y un acortamiento de su período de maduración intramedular. Ello obedece a que la anemia se acompaña siempre de un estímulo eritropoyético compensador.8 4 7 8. Por ello.reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje. entre el hematocrito y el período de maduración periférica de los reticulocitos.35 0.25 0. siendo el cien porciento el número total de hematíes contado.5 10 3 días 10 .15 150 133 117 110 83 66 50 1 2 5 10 15 20 30 1 1.40 0. el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la siguiente fórmula: Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto del paciente Hto normal (El hematocrito normal es el que le corresponde según edad y sexo). que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la médula a la sangre periférica. De esta forma puede calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente: IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente Período de maduración en días x Hto normal Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia regenerativa). cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la anemia. aproximadamente lineal. RECUENTO AUTOMATIZADO 28 0. lo que supone un aumento del período de maduración periférica.20 0.45 0. Luego de este tiempo se realizará el extendido y se realiza el recuento como se indicó antes. el número de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneración eritroblástica. mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética (anemia arregenerativa) Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia Hematocrito Niveles de Hemoglobina (g/L) Recuento de reticulocitos (%) Recuento de reticulocitos corregido (%) Tiempo de maduración estimado Índice de reticulocitos OTRA TECNICA Utiliza como colorante Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el método de referencia.3 9 10 ± 1 día 1 2 5 5 ± 2 día 7.

VALORES DE REFERENCIA Valor relativo (%) 3.5 0. Para la tinción del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o Auramina.8 Valor absoluto (x109 /L) 110-330) 25-89 25-86 32-97 Recién nacido (sangre de cordón) Niños y adultos jóvenes de 4 a 19 años Adultos (20-50 años) Mujeres Hombres Variaciones patológicas Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Período neonatal Anemias hemolíticas Anemias posthemorrágicas Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula ósea) Mielofibrosis idiopática 29 .0 (4-19 años) 0.2 0.5-2. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitución del criterio morfológico inherente al método visual por el análisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante citometría de flujo y luz láser.2.2.Estos equipos realizan un recuento muy fiable de reticulocitos a partir de sangre total.2-6. En los equipos semiautomáticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo. mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubación previa y el análisis se realiza directamente.2-2.

La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrágicas. estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte.Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab. en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas. El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitación con carbonato de magnesio.) en las hepatopatías crónicas. INSTRUCCIONES PARA SU USO Solución saturante: lista para usar. . neoplásicas. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimétricamente según la técnica de Fer-color o Fer-color AA. Adsorbente: carbonato de magnesio granulado. Disminuye en cambio en la hemocromatosis.Tubos de Kahn. La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que está saturada. REACTIVOS NO PROVISTOS . REACTIVOS PROVISTOS Solución saturante: solución estabilizada de Fe (III). MUESTRA Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. el hierro circula como Fe (III) unido a una proteína transportadora específica: la transferrina o siderofilina. y en las grandes pérdidas proteicas del síndrome nefrótico.Cuantificación de hierro sérico Fer-color Transferrina Método colorimétrico para la determinación de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) del suero SIGNIFICACION CLINICA En el organismo humano. . se determina por su actividad fisiológica de captar Fe (III) a pH mayor que 7. nefropáticas. En el individuo normal sólo la tercera parte de la transferían se satura con hierro. en insuficiencias hepáticas y fisiológicamente en los últimos meses del embarazo.Agua destilada. y ferropénicas en general. Adsorbente: el frasco debe volver a taparse inmediatamente después de retirar las porciones necesarias para el momento. Adsorbente: listo para usar.Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". FUNDAMENTOS DEL METODO La transferrina o proteína transportadora específica del hierro.2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . CONDICIONES DE REACCION 30 . etc. Su función es captar el hierro de los sitios de absorción (mucosa intestinal) o depósito (sistema retículo endotelial) y llevarlo a los órganos hematopoyéticos donde es utilizado. La actividad fisiológica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijación de hierro (TIBC). INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.

VALORES DE REFERENCIA La literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturación de la Transferrina en personas normales: Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl.S. .29% 5.I.9 ug/dl C. Habitualmente se realiza la determinación de hierro sérico juntamente con la de transferrina.H.Zak. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes datos: Nivel 280 ug/dl 560 ug/dl D."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests". Baginski.. K.Ann.. . .000 r. 56/4:543 (1971). M. y Albarracín. Transferrina y Porcentaje de Saturación de la Transferrina. 31 .Young. puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml. Toxicol. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. 4/4:621 (1971). Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente. Clin.. En ese caso se informan tres valores: Hierro Sérico.Buenos Aires (1975).Rojkín. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. M. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas y efectuar los cálculos de la misma manera que en la determinación de hierro sérico. J. Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC. Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados. G. Epstein. no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos. Drappo. multiplicando por dos el resultado final.. . Además.Dixon.S. b) Colorimetría: seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA. Biochem.000-4. 1492002). comenzar con la Saturación de la Transferrina 30 minutos antes.m. D.p.S. que se calcula de la siguiente manera: Hierro sérico (ug/dl) Transferían (ug/dl) Saturación % = x 100 Si se desea efectuar simultáneamente la determinación de hierro sérico para el cálculo del Porcentaje de Saturación. Wiener lab. 1990.2 ug/dl +28. L. y Wiener. Por lo tanto. Clin. La agitación deberá ser vigorosa y en sentido longitudinal. Olguín de Mariani. Path. BIBLIOGRAFIA . .16% PRESENTACION Reactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) (Cód.. AACC Press.Am.Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. 3rd ed. PROCEDIMIENTO a) Saturación de la transferrina: en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solución saturante. La agitación insuficiente producirá valores falsamente aumentados de Transferrina.C.V. 10/5:127 (1973). E. E. B. La concentración de Fe (III) de la Solución saturante es 10 veces mayor que la del Standard. Centrifugar 10-15 minutos a 3.Clin. +23. hasta obtener sobrenadante límpido o con la opalescencia propia del suero. por la dilución del suero.M. 8. .. . Saturación de la Transferrina: 20-55%.S. A.III Congreso Argentino de Bioquímica . . como la medida exacta de esta solución no es crítica. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente.

wiener-lab.2000 Rosario .ar Dir.: Viviana E.com.220/00 32 . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.Rosario .Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.Argentina http://www. Nº: 1287/77 . Riobamba 2944 2000 .C.I. Téc.A.S. Disp.

contiene hierro en su grupo hemo. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de mañana) ya que las fluctuaciones fisiológicas son significativas durante el día. material de vidrio. piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta. La otra causa más común de anemia ferropénica. bazo. particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto.Fer-color Método colorimétrico para la determinación de hierro sérico sin desproteinización SIGNIFICACIÓN CLINICA El hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos. etc. el ácido mercaptoacético.7 y en presencia de un reductor. médula ósea y parénquima hepático. y otras veces a desórdenes caracterizados por una síntesis defectuosa de hemoglobina o fenómenos hemolíticos. A veces se asocian a terapia transfusional. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo PBTS: solución estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. y carcinomas de estómago y colon. indican contaminaciones ocasionales (agua. formando parte de la hemoglobina. Antes de usar llevar a 18-30oC. La anemia por pérdida de hierro representa uno de los trastornos orgánicos más frecuentemente encontrados en la clínica médica. es la pérdida de sangre a través del tracto gastrointestinal. la transferrina. MUESTRA Suero a) Recolección: debe usarse únicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reacción. Posteriormente reacciona con el reactivo de color. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". que se mide a 560 nm. pigmento más importante de las células musculares. Buffer/Reductor: en refrigerador (2-10oC) es estable durante un año a partir de la fecha de su preparación. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. hábitos alimenticios y actividad eritropoyética). Standard: listo para usar. Standard: solución de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl. Buffer succinato: solución de succinato 0. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Variaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard. sexo. La mioglobina. y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las células del sistema reticuloendotelial de hígado. Reductor: ampolla autorrompible conteniendo ácido mercaptoacético al 70 %. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo PBTS: listo para usar. FUNDAMENTOS DEL METODO El hierro sérico se libera de su unión con su proteína transportadora específica. Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia.25 mol/l para pH 3.). a veces imperceptible. Anotar en el rótulo la fecha de preparación. Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato. debida a hernia de hiato. en buffer succinato de pH 3. 33 . b) Aditivos: no se requieren. Un aumento en el valor de los Blancos indicará una contaminación con hierro. úlceras gástricas o duodenales. Ocurre con frecuencia en mujeres. Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas.7. vertiéndolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversión. edad.

O.Espectrofotómetro o fotocolorímetro. b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alícuotas de un mismo suero.5 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco de Reactivos). Si bien hemólisis ligeras no interfieren con este método. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando la misma muestra en 10 días diferentes. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . 3rd ed. se obtuvo un coeficiente de variación del 4. AACC Press.. Clin.Valores de Blanco aceptables: la determinación de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos. L. para un nivel de Fe sérico de 129 ug/dl. A. se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0. Para controlar esto último. si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0.a. CONDICIONES DE REACCION . Caso contrario. . reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0.III Congreso Argentino de Bioquímica Buenos Aires (1975). 56/4:543 (1971). El Blanco de Reactivos. es indicio de contaminación grosera de los reactivos.. A. Path.Clin. Drappo. 1492001). Y Albarracín.M.02 uOhms). debiendo ser además.Ann. y Wiener. E.Rojkín. Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinación de hierro. para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC).Volumen total de reacción: 2. B. 1990. Secar el material preferentemente a no más de 80°C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plásticos. .H.Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla o por agitación suave. Efectuar este control periódicamente. . Clin.Am.Dixon. .Temperatura de reacción: temperatura ambiente . BIBLIOGRAFIA .S. . ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cód. se recuperó entre 90 y 103%. Olguín de Mariani. S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Agua bidestilada Standard Suero 500 ul S 500 ul D 500 ul 34 . M. .Volumen de muestra: 500 ul .C.150 D.Tubos de fotocolorímetro. Por otra parte. Baginski. M. no debe ser superior a 0.. . K. J.S. C. despreciable la contribución del agua en dicho Blanco. . c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 500 ug/dl. . 10/5:127 (1973). . hiperlipemia. . No invertir para evitar contaminaciones. L. Biochem. Epstein.S..Tiempo de reacción: 10 minutos . G. .c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl. eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro. Toxicol. los cuales deberán desecharse.5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer. iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl..O. E.5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2.2%.Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.. D. el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemólisis.Young. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO .Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro.Longitud de onda: 560 nm en espectrofotómetro o 540-560 nm en fotocolorímetro con filtro verde."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".150 D. 10-15%.I.Zak. . 4/4:621 (1971).

CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas de S y D.Búfer/reductor 2 ml 2 ml 2m Mezclar.B = S corregida D .C.6 ug/dl Mujeres: 103.I. llevando el aparato a cero con agua. 2000 Rosario . Riobamba 2944 2000 .Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. 100 ug/dl S corregida Wiener lab. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos. restándoles los Blancos correspondientes: S . 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo.Rosario .A.ar Dir.Argentina http://www. Nº: 1287/77 .S.wiener-lab. se halló un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios: Varones: 114. Disp.(B + BS) = D corregida Fe (ug/dl) = D corregida x f Donde: f = METODO DE CONTROL DE CALIDAD Standatrol S-E 2 niveles. Agregar. con edades oscilando entre los 18 y 51 años.3 ug/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.198/00 35 . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. manteniendo el frasco gotero en posición vertical. VALORES DE REFERENCIA En un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos. Téc.: Viviana E. Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de Suero BS) en espectrofotómetro a 560 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Los tubos deben ser leídos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento.com.

Solución de contraste eosina (1 g/L de H2O) o safranina(1 g/L de H2O. Debe prepararse extemporáneamente mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de ferricianuro potásico al 2% en agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0. MEDICIÓN DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA La fragilidad osmótica mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio. Frotis de la médula ósea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. fijar los frotis en vapores de formol durante 30 minutos (algodón empapado de formol en el fondo de un vaso de Coplin).Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls La coloración de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de célula pudiendo ser aplicada a las células presentes en un frotis o extensión de sangre o médula ósea. Microscopio óptico. anemias por deficiencia de hierro y talasemias. La fragilidad osmótica se ve aumentada en anemias hemolíticas. Se han establecido scores para la semicuantificación de la reacción. Solución clorhídrica de ferricianuro potásico. que se observan normalmente a nivel de las zonas de abundantes macrófagos. 3. Lavar los frotis colocándolos en la solución de contraste durante 30 minutos. Normalmente. como la esferocitosis hereditaria. La tinción de Perls permite valorar también el hierro no hemínico presente en el citoplasma de los eritroblastos y determinar el número de los que presenten uno o más gránulos de hemosiderina (sideroblastos). METODO 1. 3. 36 .2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente(24ºC). 4. La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina. 2. luego del tratamiento con drogas. que se considera el resultado de la precipitación de varias moléculas desnaturalizadas de apoferritina. Introducir los frotis fijados en la solución clorhídrica durante 1 hora a temperatura ambiente. 2. mientras que se ve disminuida en la anemia con células S (sickle cells). INTERPRETACION Y EVALUACIÓN DE RESULTADOS La hemosiderina teñida mediante la tinción de Perls aparece bajo la forma de gránulos de intenso color azul. como la indometacina. MATERIAL 1. Este test ha sido muy usado experimentalmente como medida de la viabilidad del glóbulo rojo y clínicamente con fines diagnósticos. Refleja la habilidad de la eritrocitos para captar agua sin lisar. constituye el hierro no hemínico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las células del sistema mononuclear fagocítico.

Si se produce un desbalance en el equilibrio entre la producción de eritrocitos por la médula ósea y su eliminación esplénica.0.5. mide el grado de resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en función de la disminución de la concentración de ClNa en el medio. Para realizar la medición. luego de mezclar por inversión. a 2500 rpm por 15 minutos y se realizan lecturas de los sobrenadantes a 540 nm. 4. La concentración de ClNa que produce el 50 % de hemólisis puede ser determinada calculando el % de hemólisis según la siguiente ecuación: % de hemólisis = (DOs -DObl) x 100/ DOo donde: DOs= densidad óptica del sobrenadante DObl= densidad óptica del blanco DOo= densidad óptica de la solución de 1 g/L de ClNa.0. 4. diferenciadas de acuerdo a la resistencia de su membrana.0 g/L es usada como blanco. Luego se grafican las curvas de % de hemólisis vs.0.En este test se mide la capacidad de deformación o elasticidad de la membrana del glóbulo rojo. La fragilidad osmótica. Este test es por lo tanto. nos encontraremos ante la presencia de una anemia hemolítica debida. El grado de hemólisis es determinado midiendo la hemoglobina liberada a partir de las células. La forma de la curva que muestra el grado de hemólisis en función de la [ClNa] sugiere que ésta puede ser el resultado de la distribución de las poblaciones de GR. Las variaciones en la fragilidad osmótica son definidas como cambios en las curvas de hemólisis y son establecidos por determinación de la [ClNa] que produce el 50% de hemólisis. 9. posiblemente.0 y 1. La solución de 10. a alguna alteración de las proteínas del citoesqueleto de la membrana eritrocitaria.0.0. 8. Se centrifugan. 7. la cual es imprescindible para que el eritrocito pueda circular libremente. Las diluciones se realizan por duplicado.0. Si por alguna alteración del citoesqueleto. 3. el mismo es quitado de circulación. se deben mezclar 50 µl de sangre con 5 ml de soluciones con diferentes concentraciones de ClNa : 10. 5.0. [ClNa] y de las mismas se extrae el valor de [ClNa] que produce el 50% de hemólisis.0 g/L. la membrana del glóbulo rojo pierde su capacidad de deformación . fundamentalmente a través de los capilares esplénicos. 2. indicador del estado de la membrana eritrocitaria. 6.0. Para preparar las soluciones de ClNa se parte de una solución 10 g/L y se realizan diluciones de la misma. 37 .

................... En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM)... 0........ Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.... pielonefritis.... ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.............. REACTIVOS PROVISTOS Buffer: solución de buffer Tris... b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma. No congelar. tiene una gran variedad de aplicaciones clínicas.........O.... alcanza un pico entre las 48 ...... pH 7........6 mmol/l NADH .... (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo.2 conteniendo piruvato y cloruro de sodio..... c) Sustancias interferentes conocidas: las muestras con hemólisis visible o intensa pueden producir valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usadas. 1............. MUESTRA Suero o plasma a) Recolección: se debe obtener suero de la manera usual y separar del coágulo dentro de las dos horas de su obtención.800 D......800 D. debe usarse heparina como anticoagulante.... Sustrato: viales conteniendo NADH..2 mmol/l ClNa ....... También puede usarse plasma.... 200 mmol/l INSTRUCCIONES PARA SU USO Buffer: listo para usar... Concentraciones finales (según SFBC) Tris .. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada... FUNDAMENTOS DEL METODO Basado en el siguiente esquema de reacción: LDH Piiruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+ Las concentraciones del ensayo están optimizadas de acuerdo a la Sociedad Francesa de Biología Clínica (SFBC)..... Tapar y agitar suavemente por inversión hasta disolución completa....2 Piruvato ....... Sustrato: agregar el volumen de Buffer indicado en el rótulo a un vial de Sustrato...... Sustrato reconstituido: estable 21 días en refrigerador (2-10oC) o 3 días a temperatura ambiente a partir del momento de su reconstitución.. Fechar................................ La misma comienza a aumentar de 12 a 24 horas después de producido el infarto.......O............ PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro"....... la actividad de LDH total (junto con las de CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnóstico. también se registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis hepática (producida por agentes tóxicos o por infecciones agudas como la hepatitis viral) e incluso acompañando a necrosis tubular renal............ o superiores a 1........ pH 7... 80 mM..... Por otra parte.......................... 38 .....72 horas y permanece elevada hasta el séptimo o décimo día..... La LDH es estable hasta 24 horas en refrigerador. lecturas de absorbancia del Sustrato reconstituido inferiores a 0.... d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca.........LDH-P AA Método UV optimizado (SFBC) para la determinación de lactato deshidrogenasa (LDH) en suero o plasma SIGNIFICACION CLINICA La determinación de la actividad de lactato deshidrogenada (LDH) en suero..

2 y 3 minutos de la primera lectura. .253 15. luego agregar: Muestra 100 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro.La humectación es causa de deterioro del Sustrato. Utilizar este promedio para los cálculos.Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir. 30 ó 37oC. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra. restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. Leer la absorbancia inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1. repetir la determinación con muestra diluida 1/10 con solución fisiológica y multiplicar el resultado por la dilución efectuada. Esperar 30 segundos.Cronómetro. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.O. la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0. indica una muestra con muy alta actividad de LDH (que consume NADH aún antes de esta lectura). . Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (∆A/min). CONDICIONES DE REACCION (Disminución de absorbancia) . CALCULO DE LOS RESULTADOS LDH (U/l) = ∆A/min x factor En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción seleccionada (30-37oC o 25oC) y a la técnica empleada (micro o macrotécnica) como se indica en la siguiente tabla de factores: Longitud de onda 340 nm 334 nm 366 nm VALORES DE REFERENCIA Temperatura Valores (U/I) 25ºC 120-240 30ºC* 160-320 37ºC* 230-460 Temperatura I (30-37ºC) 9. Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada temperatura.Temperatura de reacción: 25. se obtienen los siguientes valores: 39 .683 9. En este caso.MATERIAL REQUERIDO (no provisto) .871 17.Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. .Espectrofotómetro.Material volumétrico adecuado. colocar: Sustrato reconstituido 3 ml Preincubar unos minutos. . . .MICROTECNICA Emplear 20 ul de muestra y 1.Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366) . PROCEDIMIENTO A) 25oC En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo. .00 (*) Calculados Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. . siguiendo el procedimiento indicado en A).Tiempo de reacción: 3 minutos y 30 segundos. II. estando el sustrato en condiciones.941 25ºC 4.095 8.Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero.0 ml de Sustrato reconstituido siguiendo el procedimiento indicado en A).921 5.Los volúmenes de muestra y reactivo se pueden reducir proporcionalmente sin que varíen los factores de cálculo.118 II (30-37ºC) 8.800 D.MACROTECNICA Emplear 50 ul de Muestra.016 9. B) 30-37oC I.

....O................ 1990........ Biol............ +5..14 U/l +7............... corrigiendo consecuentemente los resultados........ 8...095 Coef............ Si la ∆A/min es superior a 0........Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S........Argentina http://www.....C.... extinción molar (∑340) .................. Nº: 3330/97 Cert. PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Longitud de onda primaria .. 1000 U/l Factor (paso de luz 1 cm) ................V................ ∆A/min (a 340 nm y 25oC)....O.... ....... BIBLIOGRAFIA .......000 D....................................3 x 20 ml (Cód......... 1...................Societé Française de Biologie Clinique (SFBC) ... cinética Dirección de la reacción ..... De acuerdo con la sensibilidad requerida..... D..... 2000 Rosario ....S.... Comisión de Enzimas .Young... 380 nm Tipo de reacción ..Comité Científico. 40:160.. 2....................5% y semiancho de banda ≤ 8 nm... 57-61..... 1989...............O. ......I...S........ Nº: 2114/97 40 ............Rosario ..............99 U/l C.. 230 U/l Valor normal superior ....... el mínimo cambio de actividad detectable será de 5 U/l (a 340 nm y a 25oC)............. Límite de absorbancia .....17% b) Límite de detección: depende del espectrofotómetro empleado y de la longitud de onda..... repetir la determinación con muestra diluida 1/5 ó 1/10 con solución fisiológica......... para un ∆A/min de 0.. (340-334 nm y 25oC) o 0........Ann......com.001.. 1521303)...100 D.Sociedad Española de Química Clínica .200 D.... > 0......: Viviana E..ar Dir..... 37oC Relación muestra/reactivo .... ......... disminuye Temperatura de reacción .........................700 D. Clin...... 460 U/l Linealidad ..... AACC Press..... Wiener lab...O...A...................wiener-lab... 340 nm Longitud de onda secundaria (bicromática) ..........................3 [l x mmol-1 x cm-1] Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso.... Cétola Bioquímica Producto Inscripto M................S.. Riobamba 2944 2000 ..... 1:50 Tiempo de equilibrio ....17% 1. 60 segundos Absorbancia de blanco ............... 6..... con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor.Nivel 438 U/l 683 U/l D.. en espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366)... Disp. luz espuria ≤ 0................... PRESENTACION .O.. 40 segundos Tiempo de lectura ... Téc....... (366 nm y 25oC).... Valor normal inferior ... c) Rango dinámico: el rango útil de lectura se extiende hasta 0..................."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests"...... 3rd ed....Quim..... reproducibilidad ± 2 nm........ Clin.. 3 segundos Tiempo de retardo ....200 D.... 1982...............

INSTRUCCIONES PARA SU USO Desarrollador: listo para usar. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente (< 25oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Diazorreactivo: en refrigerador (2-10oC) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3 meses a partir de la fecha de su preparación. . obteniéndose valores de bilirrubina total falsamente aumentados. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. REACTIVOS PROVISTOS Desarrollador: solución acuosa de benzoato de cafeína 0. Proteger de la luz natural o artificial. la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reacción. debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción. Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo. c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis moderada o intensa inhiben la reacción directa. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". pueden ser indicio de deterioro de los mismos. es captada por el hígado para su conjugación y excreción en la bilis.17 mol/l.13 mol/l. De forma tal que.Bilirrubina Standard provisto separadamente por Wiener lab. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La presencia de sedimento y/o cambio de coloración de los reactivos. para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra. tamponada y estabilizada. FUNDAMENTOS DEL METODO La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm.07 mol/l. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma. Reactivo Sulfanílico: listo para usar. También es posible realizar la determinación en líquido amniótico. Rotular y fechar. debe usarse heparina para su obtención. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. por lo que la determinación de la bilirrubina en estos niños recién nacidos resulta sumamente importante. La eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido es una patología provocada por incompatibilidad maternofetal en la que se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. REACTIVOS NO PROVISTOS . el suero debe conservarse hasta 48 horas en el refrigerador (2-10oC) y la 41 . para efectuar la calibración periódica del equipo. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo. envolviendo el tubo con papel negro.Bilirrubina Método colorimétrico para la determinación de bilirrubina directa y total en suero y otros líquidos biológicos SIGNIFICACION CLINICA La bilirrubina. plasma o líquido amniótico a) Recolección: obtener suero o plasma de la manera usual. compuesto de degradación de la hemoglobina. Reactivo Sulfanílico: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina sérica con el consecuente riesgo de difusión del pigmento al sistema nervioso central. MUESTRA Suero. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento. Nitrito de Sodio: solución de nitrito de sodio 0.Agua destilada. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias. mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo Sulfanílico.

.Tiempo de reacción: 5 minutos . Es por tal motivo que debe protegerse cuidadosamente.Espectrofotómetro o fotocolorímetro. CALCULO DE LOS RESULTADOS Bilirrubina total (mg/l) = (T . Dividir el resultado final por 5. El líquido amniótico es conveniente mantenerlo congelado hasta el momento de efectuar el ensayo.Tubos de fotocolorímetro. Sueros ictéricos: debe emplearse la técnica descripta pero con menores cantidades de muestra.Frasco de vidrio color caramelo. D (Directa) y T (Total) colocar: B Muestra (suero) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 200 ml 2. De tal forma.5 ml 200 ul T 200 ml 2. .sangre entera no más de 24 horas en refrigerador o 12 horas a temperatura ambiente.Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.38 respectivamente.B) x f Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total .BRB directa El factor colorimétrico (f) debe calcularse con el Standard de Bilirrubina de Wiener lab. . excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos.TECNICA PARA SUERO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco). Si se lee después. habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta.Longitud de onda: 530 nm en espectrofotómetro o 520-550 nm en fotocolorímetro con filtro verde. leer en espectrofotómetro a 530 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520-550 nm).Volumen final de reacción: 2. Si se lee antes.37. en caso de ictericia moderada se usarán 50 ul de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren sólo 20 ul.Volumen de muestra: 200 ul .Reloj o timer.2 ml Proceder de la misma manera que en la técnica I.2 ml T 1 ml 1. de acuerdo a la severidad de la ictericia. . En dos tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco) y T (Total) colocar: B Muestra (líquido amniótico) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo 1 ml 1.5 ml 0.5 ml 200 ul D 200 ml 2. II.79 y 9. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . Luego de 5 minutos. CONDICIONES DE REACCION . llevando el aparato a cero con agua destilada.5 ml 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. La acción de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra.5 ml 0.B) x f Bilirrubina directa (mg/l) = (D . habrá sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. . METODO DE CONTROL DE CALIDAD 42 .9 ml PROCEDIMIENTO I.Temperatura de reacción: temperatura ambiente .TECNICA PARA LIQUIDO AMNIOTICO Se determina bilirrubina total. Multiplicar los resultados obtenidos por 3.

Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4. 43 . Si la cantidad de bilirrubina sobrepasa los 9. Los niveles por encima de 2. los niveles de bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad.7 mg/l sugieren la posibilidad de un feto afectado.7 mg/l sólo se encuentran en presencia de eritroblastosis fetal.5 mg/l la muerte fetal es inminente.Adultos: Directa: hasta 2 mg/l Total: hasta 10 mg/l . VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina en suero o plasma . Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. mientras que entre 1 y 2.Standatrol S-E 2 niveles. Bilirrubina en líquido amniótico Valores menores de 1 mg/l son considerados normales.Recién nacidos: Nacidos a término Sangre de cordón Hasta las 24 hs Hasta las 48 hs Del 3º al 5º día 25 mg/l 60 mg/l 75 mg/l 120 mg/l Prematuros 80 mg/l 120 mg/l 240 mg/l Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. dependiendo del grado de inmadurez hepática. En los prematuros.7 mg/l el feto ya se encuentra afectado y tiene probablemente algún tipo de falla circulatoria.

H. 7/6:603 (1961).47 mg/l +1. Disp. 8. se obtuvo lo siguiente: Bilirrubina directa Bilirrubina total Nivel 2.1% b) Linealidad: la reacción es lineal hasta 150 mg/l. Clin. Nobuoka. BIBLIOGRAFIA .S.Clin. . D.Rosario .Zaroda.Ichida.I.Clin. . La acción de la luz.Young.4% 4.. AACC Press.wiener-lab."Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests".Argentina http://www.18 mg/l +0.A. T. 10/3:197 (1964). es capaz de destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente. .5% 2. 1120001).Am. . tanto sobre los sueros como sobre las soluciones standard.Botwell. . PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día. Chim.com.62 mg/l +0.S. Acta 19/2:249 (1968).V. J. c) Recuperación: agregando cantidades conocidas de bilirrubina a distintos sueros. Riobamba 2944 2000 .Clin. .7% 1. . Wiener lab.: Viviana E.ar Dir. Chem. Chem.Watson.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.4a Ed.C.7 mg/l D.5347/98 44 ..S. D. (1968). R. Path. PRESENTACION Equipo para 200 determinaciones (Cód. M.0 mg/l 9. et al .8 mg/l 127. 1990. . 45/1:70 (1966). J.45 mg/l C. Harper & Row Pub .“Laboratory manual of pediatric microbiochemical techniques”. Nº: 252/75 . 2000 Rosario . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M. .O’Brien. Téc. . 3rd ed.LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. +0. se obtuvo una recuperación entre 100 y 106%. D.1 mg/l 26.

1000 ml 2) Solución colorante: Ponceau S: 0. 4) Solución deshidratante: Metanol puro............5 g en 100 ml de ácido tricloroacético 5% (dosis para 20 tiras) 3) Solución decolorante: Ácido acético 5%.6 g H2O destilada..... En este medio la HbA migra hacia el ánodo.. Sembrar las muestras con el hemolizado obtenido (ver más adelante)............. 8.. Transparentización: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos... Las tiras deben conservarse en posición vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%. 22.. Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética. a continuación se las coloca en la solución 45 . Desconectar la corriente y retirar las tiras..6).. 7. 14.. Decolorar con 3-4 baños de solución decolorante. 14 ml Glicerol .......... La HbA2 tiene una velocidad menor que la A. Operar rápidamente para evitar evaporaciones... Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos 2. 5........ durante 90 minutos.... 6..... La tira debe estar bien tiesa y plana...... La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba... Eliminar el exceso de líquido secando entre 2 papeles de filtro...... mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades)..... Determinación cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solución disolvente y agitar. 9........ hasta ver el fondo blanco de la tira. FUNDAMENTO Las diferentes hemoglobinas se separan por migrar a diferentes velocidades. La superficie de las tiras que es penetrable a las proteínas se reconoce porque es más opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro.. Las tiras secas pierden las dimensiones y las características del gel.... Colorear durante 5 minutos. queda en la HbA migrando juntas....1 g Glicina ... 1 ml 6) Solución disolvente: Ácido acético 80% Técnica: 1... Leer a 520 nm si se usó colorante Ponceau S......... 5) Solución de transparentización: Metanol . realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts. 3....Separación electroforética de hemoglobina SOPORTE Acetato de celulosa gelatinizado.. 4... REACTIVOS 1) Solución buffer: Tris..... en medio alcalino (pH= 8.. Conectar la fuente de poder. 85 ml Ácido acético .

El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatías: TIPO Normal Polo negativo Anhidrasas Carbónicas Recién nacido Anhidrasas Carbónicas Drepanocitosis homocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Drepanocitosis heterocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas Hemoglobinopatía C homocigota Anhidrasas carbónicas Hemoglobinopatía C heterocigota Anhidrasas HbC Carbónicas β-talasemia heterocigota β-talasemia homocigota Doble Heterocigota S/C Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbA2 Carbónicas Anhidrasas HbC HbS Carbónicas HbA HbC HbA HbF HbA HbA2 Polo positivo HbA ACLARACIONES HbA 98% HbA2 2% HbF 90% HbA 10% HbA2 2% HbS 98% HbA < 50% HbS > 50% HbA2 2% HbC 98% HbA2 2% HbC > 50% HbA < 50% HbA2 entre 4-8% HbA HbA2 normal % de HbF y HbA. variable según tipo de Th homocigota HbS 50% HbC 50% HbF HbA 46 .transparentadora durante 1 minuto como mínimo. hasta la transparencia completa. eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos. Así se conserva para leer en densitometría. Se colocan luego en una placa de vidrio.

usando cualquier anticoagulante.PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO Técnica 1. Se lava tres veces con solución fisiológica. 2. Obtener 5 ml de sangre por punción venosa. dejar 24 horas. 4. mediante el método de la cianmetahemoglobina. Se determina la concentración de hemoglobina en el bemolizado obtenido. desechando los sobrenadantes. Colocar en heladera (favorece la hemólisis). 47 . 3. se agrega un volumen de agua destilada igual al del paquete globular y 0. aunque se recomienda la heparina. 6. Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm.8 ml de tolueno (rompe los glóbulos blancos). agitar vigorosamente durante 1 minuto. se lleva la concentración hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada. recoger con pipeta Pasteur el infranadante y filtrar. 5.

Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke
FUNDAMENTO La hemoglobina fetal (HbF o α2γ 2) es ácido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos. REACTIVOS 1. Alcohol etílico al 80% 2. Buffer de ácido cítrico, pH 3,4 Solución A: Ácido cítrico............................ 4,2 g Agua destilada......................... 100 ml Solución B: Citrato de sodio........................ 5,9 g Agua destilada......................... 100 ml Solución Buffer pH 3,4: Solución A ................ 84 ml Solución B................. 16 ml 3. Eritrosina o eosina al 0,1 % en agua. DESARROLLO 1. Extendidos de sangre secos de no más de una hora de obtención, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etílico al 80% 2. Lavado rápido con agua y secado. 3. Inmersión en una cápsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37°C un mínimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rápidamente en agua común y secar en posición vertical. 4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solución de eritrosina o eosina. Lavar con agua y secar. RESULTADOS Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras. El análisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hematíes coloreados e incoloros.

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DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA FETAL: METODO DE SINGER FUNDAMENTO Debido a la muy semejante movilidad de la hemoglobina normal (HbA) y la hemoglobina fetal (HbF), cuando usamos los métodos electroforéticos de rutina para el estudio de hemoglobinas, es necesario valerse de la propiedad de la HbF (y la Hb Bart( de ser resistentes a la desnaturalización en medio alcalino. REACTIVOS 1. Solución de hemoglobina (véase obtención de bemolizado) 2. OHNa 1/12 N (recién preparado) 3. Reactivo precipitante SO4(NH4)2 .............................. 38 g ClH 1N ..................................... 2,5 ml H2O destilada ........................... 100 ml TÉCNICA Se preparan tres tubos: • • • • Tubo 1: Blanco: 3,2 ml de OHNa 1/12 N, agregar 6,8 ml de reactivo precipitante y filtrar. Tubo 2: Hb 100: 5 ml de agua destilada, agregar 0,02 ml de la solución de hemoglobina Tubo 3: Hb álcali-resistente: 3,2 ml de oHNa 1/12 N, agregar 0,2 ml de solución de hemoglobina y disparar en el momento un crónometro, a los 60 segundos agregar 6,8 ml de reactivo precipitente, invertir varias veces y filtrar. Leer en un espectrofotómetro a 540 nm, llevar a cero con el tubo blanco (Tubo 1).

CÁLCULO % de Hb álcali-resistente = VALOR NORMAL Menos de 2%. DO tubo 3 x 20 DO tubo 2

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Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs
A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION a) Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2 % en salina fresca (véase más abajo el apartado C. Preparación de la suspensión globular al 2%). b) Agregar una gota de la suspensión globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn. c) Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A1, B y O al 2% d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. e) Leer primero los controles y luego los problemas microscópicamente en visor y microscópicamente. f) Scores de lectura: +++ un gran aglutinato ++± varios aglutinatos grandes ++ muchos aglutinatos pequeños +± pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo + aglutinatos visibles pero solo microscópicamente aglutinatos conteniendo muy pocas células tr trazas - negativo B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO a) Tomar una muestra de suero libre de hematíes. b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los siguientes hematíes: 1) hematíes A conocidos 2) hematíes B conocidos 3) hematíes del propio individuo 4) hematíes O conocidos c) Incubar 1 hora a ta o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. d) Leer primero los controles y luego los problemas , microscópicamente en visor y microscópicamente. C. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2% Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn. a) Llenar el tubo con solución fisiológica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. b) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución fisiológica. c) Tomar una gota de culot (50 µl) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la suspensión al 2%.

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PRUEBA PARA DETECTAR Du 1 También se puede utilizar un monoclonal anti-A1 51 . Al terminar de mezclar. disparar el cronómetro. La lectura se hará microscópicamente con un visor y microscópicamente. E. Agregar una gota de anti-A absorbido1 y mezclar bien con una varilla de punta fina. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn. F. Negativa: los hematíes (Rh-rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar aglutinación.D. d) Desprenda suavemente el culot globular y lea.1 Controles a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D c) Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB. c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm. b) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra. Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados: Glóbulos rojos problema Anti A + + GR A + + Anti B + + GR B + + Anti AB + + + GR AB + + + Grupo ABO A B O AB Grupo ABO A B O AB Suero problema E.2 Reacciones • • Positiva: los hematíes D(Rho) positivos permanecerán aglutinados al querer desprender el culot globular. Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto. e) Proceda de la misma manera con los tubos controles. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA a) b) c) d) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota. E.

Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du.2 Controles utilizados Se utilizan tres controles para 1. F. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS.dado que. 5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana. 2 La detección de Du también se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du. es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti –D por suero de persona de grupo sanguíneo AB. Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs. El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparación del suero).1 Reacciones • • Positiva: los hematíes Du (Rhou) positivos permanecerán aglutinados luego de intentar desprender el culot globular. Coloque dos gotas de suero anti –D(Rho) en un tubo de Kahn2. 1) 2) 3) 4) F. Comprobar su especificidad 3. La lectura se hará macro y microscópicamente. El tercer control.Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti –D. en tales hematíes el factor D(Rho) es mas reactivo. 52 . Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C. G. Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con el antígeno E(rh”) presente . Centrifugue y elimine el sobrenadante. se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados. Probar la bondad del suero 2. 6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm. Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en salina . Negativa: los hematíes Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspenderán y no aglutinarán. Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda falsear los resultados. Para seudoaglutinación Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). desprenda suavemente el culot globular y lea.

Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. 53 .2 Prueba de Coombs directa 6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%.G. 9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. 2) Centrifugar. G. 5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de 1 hora a 37 °C. 7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica.2 4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.1 Prueba de Coombs indirecta 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes de grupo O Rh+ al 2%. 3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2 8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%. eliminando completamente el sobrenadante en el último lavado.

Anti-B o Anti-A. CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. con o sin anticoagulante. dextrosa) CPD (citrato. se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. adenina). FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A. o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos altamente reactivos en su superficie. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: . INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.Solución fisiológica . B. REACTIVOS PROVISTOS Anti-A. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.B Monoclonal Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en A. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los demás ensayos pretransfusionales. citrato.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS) .Placas . fosfato. dextrosa. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente.B monoclonal. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. Si se utilizó heparina o EDTA.Anti-A.Tubos de hemólisis . b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA. dextrosa) o CPDA-1 (citrato.Albúmina Bovina 30% de Wiener lab. ACD (ácido cítrico. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional. fosfato. B. Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. La ausencia de aglutinación en todos los casos. heparina. PROCEDIMIENTO 54 .Centrífuga . Por este motivo. Anti-B o Anti-A. También demostró que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee. Anti-B o Anti A. Las muestras recogidas con ACD.B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón. Si se emplean coágulos. implica grupo O.Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS) .Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

TECNICA EN TUBO (por sedimentación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Por esta razón deben extremarse los cuidados. 1443154). 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. Standard 57:49-59. “Int. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos. colorantes. 1443153). 2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos.Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido. I. Develop. et al.B monoclonal colocada en una placa limpia. No debe emplearse microscopio. . on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use”.Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.500 rpm. III. Anti-B o Anti-A. . 1443152). 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación. 9th Edition.Leucemias u otros desórdenes malignos.Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idéntico. compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción positiva. American Association of Blood Banks 1985. Como control.Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías. BIBLIOGRAFIA . Symp. . Chapter 8. el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica. sobre todo en los prematuros.B + + + + Grupo sanguíneo A B 0 AB Variants débiles del grupo A como Ax METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados. Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. Biol.C. . S. Anti-B o Anti-A. .En las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solución fisiológica. France.TECNICA EN TUBO (por centrifugación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A. agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones: .Widman. D. “Technical Manual”. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. 1983. F. No debe producirse aglutinación. PBS o LISS. Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la tipificación.Moore. Antisuero Anti-A + + +/Anti-B + + Anti-A. Observar aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. se coloca una gota de estas células con 2 gotas de solución fisiológica.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A. París. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cód. Anti-B o Anti-A. 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis. II.K. Anti-B: frasco x 10 ml (Cód. Washington. 55 .

Nº: 1073/89 (Anti-B) Disp. Nº: 1076/89 (Anti-A) Disp.ar Dir.wiener-lab. Nº: 1071/89 (Anti-A.B) 56 .C.Rosario . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.Argentina http://www.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Disp.: Viviana E.I. 2000 Rosario . Riobamba 2944 2000 .A. Téc.Wiener lab.S.com.

dextrosa). se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar. Cuando se sospecha esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. CPD (citrato. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes. Las muestras recogidas con ACD. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina. REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos. dextrosa. . fosfato. Si se utilizó heparina o EDTA. adenina).Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab. Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno. ACD (ácido cítrico. dextrosa) o CPDA-1 (citrato.Tubos de hemólisis . d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se emplean coágulos. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. citrato. produciendo anti-D. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.Anti-D (Rho) monoclonal Reactivo para la detección de antígeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en el laboratorio de los anticuerpos anti-D.Solución fisiológica. fosfato. Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Dependiendo de la técnica que se emplee. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho).Placa de vidrio 57 . la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. ya sea por transfusión o durante el parto. podrán ser necesarios: . Sin embargo. es el antígeno D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro". REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente: .Centrífuga . CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. EDTA. Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas.

1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód.Race .J. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. R.Landsteiner.R.Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos sensibilizados.6 th Ed. BIBLIOGRAFIA .Wiener. 1443155).Argentina 58 .. K. 6) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente. Riobamba 2944 2000 .. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3. centrifugar 20 segundos a 3500 rpm.K.Rosario .Proc. 43: 223. American Association of Blood Banks.“Technical Manual” . 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. . 4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica. II. Soc. and Sanger. A. o solución fisiológica. o solución fisiológica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis.TECNICA EN TUBO Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos.C. Med. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-50oC. mezclar. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. .. Unger. o en solución fisiológica.TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos. F.“Blood Groups in Man” . También puede emplearse sangre entera. luego centrifugar y volver a leer como se describió en 4). 1940.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos.S. Ed. 3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos.9 th. 2000 Rosario . .500 rpm. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Washington D. 1959. 3) 5) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. Oxford Blackwell Scientific Publications. La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. .S. descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las células luego de cada lavado. R.Widman. 178. Biol.JAMA 169:696. Las muestras que aún en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 1985.I. Chapter 9. . Wiener. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos. 4) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. III. pág. .A. . Wiener lab. A.. Exp. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 1975.C. L. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico).

Téc.http://www.S. Disp. Nº: 1074/89 59 . Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.: Viviana E.com.ar Dir.wiener-lab.

dextrosa) o CPDA-1 (citrato. C3bi. Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. adenina). . Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prueba Antiglobulina Indirecta . FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b. ACD (ácido cítrico. . dextrosa) CPD (citrato. De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente: .Suero Anti-humano (poliespecífico) Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs.Fenotipo de glóbulos rojos. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica. . heparina. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminación del mismo. El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a antígenos del sistema Rh.Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido. REACTIVOS NO PROVISTOS . INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar.Identificación y titulación de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. C3dg o C3d). con o sin anticoagulante. .Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro".Solución fisiológica.Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. produce una aglutinación de los glóbulos rojos visible macroscópicamente. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA. citrato.Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS). MUESTRA Glóbulos rojos a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente. . 60 .Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos. . . REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3. dextrosa. fosfato. fosfato. Prueba Antiglobulina Directa . ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS).Investigación de reacciones dudosas en una transfusión.Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glóbulos rojos.

Tiempo o temperatura de incubación inadecuados. .Centrífuga . 1945.PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I).Tubos de hemólisis PROCEDIMIENTO I.Baño de agua a 37oC . CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. 3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. A.Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados. and Race.500 rpm.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal). 61 . II. El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos. R. Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS.Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3. 7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados con IgG débiles.E. Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos. Si se utilizó heparina o EDTA. 2) Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS.R.R. 3) Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua.. 2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7) de la técnica I). Si los glóbulos provienen de coágulos. .Lavado inadecuado de las células.A.Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. 1) Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar. Mourant. 2) Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS. Descartar completamente el sobrenadante luego del último lavado. la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. R. . Finalmente preparar con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: . MATERIAL REQUERIDO (no provisto) . Las muestras recogidas con ACD. 1) En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar. . 1443156). la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extracción). no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. BIBLIOGRAFIA . ii:15.Lancet. . 4) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas. III.c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC).Coombs. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles.PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica).. . 6) Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente. Si se emplean coágulos. 1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%.Concentración inadecuada de glóbulos rojos.

C.Widman.Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S. 9th ed. Mourant.K..S. Riobamba 2944 2000 . Washington D. R. Wiener lab..Rosario .com.: Viviana E. 26:225.A. . .C. Nº: 2503/91 62 .Brit. .R.E. R. 2000 Rosario .Argentina http://www. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.R. A.ar Dir.I. 376.“Technical Manual”.Coombs. 1985. 1945. pág. Disp. J. American Association of Blood Banks.A.wiener-lab. F. Path. Exp. Téc. and Race.

c) Incubar a la temperatura apropiada . el tiempo requerido. A. b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%.1 Técnica básica de titulación A. si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16.100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2.100 ml de solución fisiológica (SF).100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. Con una pipeta Pasteur para cada dilución. d) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del suero. Luego se toman 0.1. b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O con dos gotas del suero a titular. d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta.300 ml de suero a titular en el tubo N°1.1. el título será (16+8)/2=12. a) Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de hematíes a usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes.1. c) Tomar 0. Homogeneizar y repetir la operación hasta completar las diluciones. TITULACIÓN DE ANTICUERPOS A. 63 . colocar 0. el tipo de aglutinato es tr. El grado de aglutinación se considerará según los scores anteriormente indicados.Determinación de anticuerpos inmunes A.2 Titulación a) Se toman 10 tubos de Kahn. con aglutinación. Agitar la mezcla. Por ejemplo. Preparación de diluciones madres. b) En los tubos 2 al 10. colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos. Colocar 0. el tipo de aglutinato es tr. El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación ± . Si en la última dilución. el título se determinará promediando dicha dilución con la precedente. a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario). e) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilución. numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla.

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