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CINÉTICA+..[1]

CINÉTICA+..[1]

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1Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica.

Instituto Tecnológico de Morelia


Velocidad de reacción afectada por pH, temperatura y concentración de sustrato

La acción de las enzimas es modificada por cambios en el pH, por aumento de
temperatura y por la concentración del sustrato.
Efecto del pH sobre la velocidad de reacción
El pH tiene una influencia marcada sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas.
Característicamente, para cada enzima hay un valor de pH al cual la velocidad
es óptima y a cada lado del óptimo la velocidad es inferior. Esto se debe a que los
sitios activos de la enzima se componen a menudo de grupos ionizables que deben
encontrarse en la forma iónica adecuada, con el fin de mantener la conformación del
sitio activo, unir los sustratos o catalizar la reacción. Además, uno o más de los
sustratos pueden contener grupos ionizables y sólo una forma iónica del sustrato
puede unirse a la enzima y experimentar la catálisis. La relación pH-actividad de la
enzima depende del comportamiento ácido-básico de la enzima y del sustrato. La
disminución de la actividad enzimática podría deberse a la formación de una forma
iónica incorrecta del sustrato o de la enzima, o de ambos. El pH óptimo de la
enzima y el pH de su entorno celular no siempre es el mismo; de tal manera que, en
ocasiones, la regulación intracelular de su actividad es el pH.



FIGURA 2.13

Velocidad frente al pH, un modelo monoprótico sencillo
Considerar un sistema en el que el sustrato es un ácido débil, HA, pero sólo la forma
ionizada A
-
se une a la enzima. El verdadero sustrato es entonces A
-
. Para una
concentración total fija de ácido débil, la proporción que se encuentra en la forma
iónica apropiada se calcula con la ecuación de Henderson-Hasselbalch.
Cuando el pH es superior en una unidad al pK
a
10/11 del total se encuentran
como A
-
. Cuando el pH = pK
a
+ 2, 100/101 del total se encuentran como A
-
. Cuando el
pH es una unidad menor que el pK
a
1/11 se encuentran como A
-
; así podemos esperar
que la velocidad aumente a medida que se in-cremente el pH, como se muestra en la
2Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


figura 2.14 donde el pK
a
del sustrato se supone que es 4. Se supone también que el
sitio activo de la enzima contiene un grupo básico B que deberá estar protona-do, BH
+
,
para unirse al sustrato A
-
. La proporción de concentración total de enzima en la forma
iónica adecuada BH
+
disminuye al aumentar el pH, como se ilustra en la figura 2.14
donde el pK
a
del sitio ac-tivo se supone es 7. La actividad máxima teórica se dará a un
pH en el que toda la enzima se encuen-tra como BH
+
y todo el sustrato como A
-
. Sin
embargo, los dos valores de pK
a
se diferencian sólo en tres unidades y, por lo tanto, la
combinación máxima de BH
+
y A
-
se dará a un pH de 5.5 en el que el 97% del sustrato
total y enzima total estarán en la forma iónica adecuada.
















FIGURA 2.14
Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción
Muchas reacciones químicas transcurren a una velocidad mayor si la temperatura
aumenta. Un aumento en la T comunica más energía cinética a las moléculas del
reactivo, dando más colisiones eficaces por unidad de tiempo. Las reacciones
catalizadas enzimáticamente se comportan análogamente hasta cierto punto. Las
enzimas son moléculas proteicas complejas; su actividad catalítica se debe a una
estructura terciaria altamente ordenada y exacta que da lugar a la formación de sitios
estereoespecíficos de unión del sustrato con el centro catalítico. La estructura terciaria
de una enzima se conserva por un gran número de enlaces débiles no covalentes; por
lo tanto, una enzima es una estructura frágil y muy delicada. Si la enzima absorbe
demasiada energía, la estructura terciaria se rompe y la enzima se des-naturaliza y
pierde su actividad catalítica. Así, al elevarse la temperatura, el aumento esperado en
velo-cidad debido al incremento de colisiones E+S es anulado por el aumento de la
velocidad de desna-turalización; por lo tanto, una representación de actividad catalítica
frente a T generalmente muestra un pico que se conoce como temperatura óptima.
3Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


Las enzimas de peso molecular bajo compuestas de cadenas polipeptídicas sencillas y
que poseen puentes disulfuro son, generalmente, más estables al calor que las de
peso molecular alto como las enzimas oligoméricas.



FIGURA 2.15
La curva que presentan las reacciones catalizadas por enzimas se debe:

• Al incremento habitual de la reacción por aumento de la temperatura.
• Desnaturalización de la enzima que se lleva a cabo entre 45 - 60º C.

Como se mencionó anteriormente, la relación entre la constante de velocidad k, y la
energía de activa-ción E
a
viene dada por la ecuación de Arrhenius
RT
E
-
a
Ae = k

que también se puede expresar



[y = m x + b]

La forma integrada de la ecuación de Arrhenius es:

O bien

A log
T
1
R 303 . 2
E
k log
a
+ − =
1 2
1 2 a
1
2
T T
T T
R 303 . 2
E
k
k
log

=
1
2
1 2
1 2
a
k
k
log
T T
T RT 303 . 2
E

=
4Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


Donde k
1
y k
2
son las constantes específicas de velocidad de reacción a dos
temperaturas diferentes, t
1
y t
2,
respectivamente.
En un sistema sencillo de equilibrio rápido, V
max
/[E]
t
= k
p
, constante de
velocidad de primer or-den. Así, una representación de log V
max
/[E]
t
frente a 1/T da E
a

para el proceso catalítico. En la práctica sólo puede representarse log V
max
, ya que la
V
max
de una preparación dada es proporcional a k
p
.
El efecto de temperatura sobre la velocidad de reacción se expresa
frecuentemente en térmi-nos de un coeficiente de temperatura, Q
10
, que es el factor
en que aumenta la velocidad al incre-mentar la temperatura 10°C.



Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción
La velocidad de una reacción catalizada por una enzima se incrementa al aumentar la
concentración de sustrato hasta un punto en el cual ya no hay incremento, aun con la
adición de más sustrato. En esta fase, el sustrato ha saturado los sitios activos de la
enzima y se ha logrado la velocidad máxima de la reacción, la cual depende de la
afinidad de la enzima y el sustrato correspondiente.


FIGURA 2.16

Cinética enzimática
Para que una reacción química se lleve a cabo es necesario:
• Que las moléculas se reconozcan químicamente; es decir, que tengan una
orientación espacial óptima.
• Que posean la suficiente energía para alcanzar un estado de transición en el
cual la probabilidad de establecer o romper un enlace sea elevada. Este
10
Q log T RT 303 . 2
E
10 1 2
a
=
5Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


estado de transición se encuentra en la barrera de energía que separa
reactivos y productos. Se puede esquematizar de la siguiente manera:


Energía de activación
Es la energía necesaria para llevar las moléculas de un mol de sustancia al estado de
transición.
Energía de activación y catálisis
Se sabe que los procesos espontáneos transcurren con disminución de la energía
libre. La energía adi-cional que hay que suministrar al sustrato para que se transforme
en producto recibe el nombre de energía de activación, como se había mencionado.
La energía de activación está relacionada con la constante de velocidad de la reacción
química, como se indica:

S P
k
÷ → ÷


k = -
dS
dt
=
dP
dt


k = constante de velocidad

V = k[S]

La energía de activación y la constante de velocidad están relacionadas por la
ecuación de Arrhe-nius


en donde
A = número de moléculas que tienen la suficiente energía para reaccionar
e = base de logaritmo natural
R = 1.99 cal/ºK·mol
T = 273 + ºC

RT
E
-
a
Ae = k
6Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


Sacando logaritmo natural a los dos miembros de la ecuación, tenemos que

RT
E
- ln A e ln ln A = k ln
a RT
E
-
a
=
(
¸
(

¸

Sustituyendo ln A = B.
ln k = B -
E
RT
a


Esta ecuación permite deducir que la velocidad de cualquier reacción química será
mayor al aumentar la temperatura de la reacción y disminuir la energía de activación.
Se sabe que por cada 10º de elevación de temperatura la velocidad de
reacción se duplica. Precisamente, los catalizadores disminuyen la energía de
activación y en consecuencia aumentan considerablemente la velocidad de la
reacción catalizada.
Llamamos k a la constante de velocidad de la reacción espontánea, y k’ a la
catalizada:
ln k = B -
E
RT
y ln k' = B -
E
RT
a a
'


Restando mutuamente, tenemos

2.303 RT
' E - E
=
k
k'
log , bien o ,
RT
' E - E
=
k
k'
ln
a a a a


Esta relación nos indica cuantas veces es más rápida una reacción catalizada de una
no catalizada.
Principios de la cinética enzimática
La cinética es el estudio de las velocidades de reacción y el conocimiento de los
principios que rigen dichas reacciones. Vamos a relacionar la velocidad de la reacción
con la concentración de los reactivos mediante la expresión

V = k[ ]
Sea la reacción


en donde,
k
f
= constante de formación
k
r
= constante de reversibilidad

A B + C A B + C
k
k
f
r
÷ → ÷ ← ÷ ÷
7Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia



V = k
f
[A] V = k
r
[B][C]


Sobre una base cinética, las reacciones químicas se pueden clasificar por el orden de
reacción en: de primer orden, de segundo orden, de tercer orden y de orden cero.
Reacciones de primer orden
Son aquéllas cuya velocidad depende de la concentración de un reaccionante.
A P →

La velocidad de reacción en cualquier tiempo t está dada por:




V = k[A]

Puesto que V = mol/seg, y [A] = mol, despejando k tenemos

k = seg
-1


La forma integrada de esta ecuación, que es más útil para la realización de cálculos
cinéticos, es



En las reacciones de primer orden, la mitad del tiempo está dada por:



Reacciones de segundo orden
Son aquéllas cuya velocidad es proporcional a la concentración de dos reaccionantes

A + B P →


La velocidad de esta reacción se puede expresar como








si [A] = [B] V = k [A]
2


V = -
d[A]
dt
=
d[P]
dt
V = -
d[A]
dt
= -
d[B]
dt
=
d[P]
dt
303 . 2
kt
] A [
] A [
log
o
=
k
693 . 0
t
2
1
=
| |
| | A k =
dt
A d
- = V
| |
k[A][B] =
dt
A d
- = V
8Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


] B ][ A [
] A ][ B [
log
] B [ ] A [ k
303 . 2
t
o
o
o

=
despejando k tenemos
k = (seg • mol)
-1


La forma integrada de la expresión de segundo orden es





en donde
[A
o
] y [B
o
] son las concentraciones iniciales
[A] y [B] son las concentraciones en el tiempo t

En las reacciones de segundo orden, cuyas concentraciones de los reaccionantes son
iguales, el tiempo mitad es igual a



en donde
C
o
= concentración inicial de los reaccionantes
k = constante de velocidad de segundo orden
Reacciones de tercer orden
Son aquéllas cuya velocidad es proporcional a la concentración de tres reaccionantes

A + B + C P →

La velocidad de esta reacción se puede expresar como








si [A] = [B] = [C] V = k [A]
3

despejando k tenemos

k = (seg • mol )
2 -1

Reacciones de orden cero
Son independientes de la concentración de cualquiera de los reaccionantes. La
velocidad puede de-pender de la concentración del catalizador
V = -
d[A]
dt
= -
d[B]
dt
= -
d[C]
dt
=
d[P]
dt
k C
1
t
o
2
1
=
| |
k[A][B][C] =
dt
A d
- = V
9Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


| |
V= -
d A
dt
= k[A] = k
o


despejando k
k = mol/seg


Obsérvese que la velocidad es una constante a lo largo del tiempo que dura la
reacción.
Los principios generales de cinética de las reacciones químicas son aplicables
a las reacciones enzimáticas, pero éstas tienen una característica que no se observa
en las reacciones químicas no enzimáticas y es la saturación con el sustrato.
Los primeros conocimientos sobre el comportamiento enzimático se deben a V.
Henri y más tarde a L. Michaelis y Maud L. Menten. El modelo de acción enzimática de
Michaelis-Menten ha sido la base de la cinética enzimática. Su trabajo experimental se
realizó con un extracto de levaduras ricas en invertasa (hidroliza la sacarosa). Se
recopilaron los datos de dos experimentos independientes, los cuales se indican a
continuación.

1) Mientras la concentración del sustrato se mantuvo constante, en tanto se
hacía variar la con-centración de enzima, se observó lo siguiente:



FIGURA 2.5

2) El experimento inverso, cuando la concentración de enzima se mantuvo
constante y la concentración de sustrato se hizo variar, se observó lo
siguiente:



10Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


Este último comportamiento se explica suponiendo que:

• A concentraciones muy bajas de sustrato [S] < 0.01 K
m
la representación de V
frente a [S] es prácticamente lineal. Esta es la región de cinética de primer
orden.
• A medida que aumenta la [S], la velocidad disminuye y deja de ser
proporcional a la [S]; en esta zona la reacción es de orden mixto.
• Al aumentar la [S], [S] > 100 K
m
, la velocidad es prácticamente independiente
de la [S]. Esta es la región de cinética de orden cero.
• Cuando la [S] está entre 0.1 K
m
y 10 K
m
, la cinética que muestra es la
cinética clásica de Michaelis-Menten.







Eleonor Michaelis Maud Menten
En 1913, Michaelis-Menten explicaron de manera sencilla este comportamiento.
Supusieron que la enzima podía combinarse de modo reversible con el sustrato para
formar un complejo intermedio enzima-sustrato (ES), el cual se descompone para
formar los productos y la enzima queda libre en su forma original.



La velocidad de formación del complejo ES
V
f
ES = V
f
= k
1
[E][S]

la velocidad de disociación del complejo ES
V
D
ES = V
D
= K
3
[ES] + k
2
[ES]

cuando se alcanza el equilibrio para ES
V
f
= V
D
11Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


k
1
[E][S] = K
3
[ES] + k
2
[ES]

simplificando

k
1
[E][S] = (k
2
+ K
3
) [ES]

Si [E] = [E
T
] - [ES]. Sustituyendo [E] tenemos, E
T
= Enzima total


k
1
( [E
T
] - [ES] ) [S] = (k
2
+ K
3
) [ES]

despejando las k tenemos
[ES]
[S] ) [ES] - ] [E (
=
k
k + k
T
1
3 2

en donde
. Michaelis) de (constante K =
k
k + k
m
1
3 2

Sustituyendo

[ES]
[S] ) [ES] - ] [E (
= K
T
m


simplificando
[ES]
) [S] [ES] ( - ) [S] ] [E (
= K
T
m





[S] -
[ES]
[S] ] [E
= K
T
m












La velocidad de formación del producto es V =
k
3
[ES]; esta velocidad la podemos llamar
velocidad inicial (V
o
);
entonces
[ES] = V
o
/ k
3

sustituyendo [ES]
[ES]
[S] ] [E
= [S] + K
T
m
[S] + K
[S] ] [E
= [ES]
m
T
12Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


[S] + K
[S] ] [E
=
k
V
m
T
3
o


despejando V
o

[S] + K
[S] ] [E
k = V
m
T
3 o


Si V
o
= k
3
[ES] la velocidad máxima (V
max
) se
alcanzará cuando toda la enzima está unida
al sustrato;
entonces
V
max
= k
3
[E
T
]
sustituyendo k
3
[E
T
]




Esta es la ecuación cinética clásica de Michaelis-Menten y corresponde a una
hipérbola con V
o
y [S] como coordenadas, y con la constante V
max
como asíntota.
Cuando V
o
= V
max
los sitios activos de la enzima están ocupados y toda la
enzima está como ES y no hay enzima libre; esta condición se llama saturación al
100%. Cuando la saturación es al 50%

Vo = ½ V
max


sustituyendo V
o
en la ecuación de Michaelis-Menten:

V
2
=
V [S]
K +[S]
max max
m




simplificando

K
m
+ [S] = 2 [S]

K
m
= 2 [S] - [S]

K
m
= [S]

[S] + K
[S] V
= V
m
max
o
13Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


K
m
= [S], a la que se alcanza la mitad de la máxima velocidad. Esto habla de la
especificidad de
la enzima. Mientras más pequeña es la K
m
, mayor es la especificidad de la enzima por
ese sustrato.




La fracción de sitios unidos a una determinada concentración de sustrato puede ser
calculada por:
[S] + K
[S]
=
V
m max
V
f
ES
=

La aproximación del estado estacionario
En 1925, Briggs y Haldane establecieron una hipótesis. Estos autores señalaron una
importante cir-cunstancia que se muestra en la figura siguiente















Este diagrama muestra cómo tienden a variar las concentraciones de los distintos
componentes de una reacción enzimática en el curso de la misma.

14Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


De acuerdo con esto, después de un primer momento transitorio [S] y [P] cambian
mucho más rápida-mente en términos absolutos que [E] y [ES]. Si la enzima está
presente en cantidades catalíticas; es decir, [S] >> [E
T
], entonces, inmediatamente
después de mezclar E y S se alcanza un estado estacio-nario en el que [ES]
permanece, prácticamente, constante con el tiempo. Cabe considerar cero la velocidad
de cambio de [E] y [ES] respecto al tiempo, en comparación con la velocidad de
cambio con [S] y [P]. Esta suposición de Briggs y Haldane se conoce como
aproximación del estado estacionario. De esto puede deducirse una ecuación de
velocidad de forma similar a la descrita por Michaelis-Menten.
Cinética de primer orden
La relación lineal entre V y [S] cuando [S] << K
m
, la K
m
puede deducirse a partir de la
ecuación de Michaelis-Menten.




Cuando [S] << K
m
la [S] en el denominador se desprecia y la ecuación se reduce a:

] S [
K
V
= V
m
max
o
o V = k[S]
Donde

k = constante de velocidad de primer orden para la reacción total (min
-1
)

Cinética de orden cero
La relación lineal entre V y [S] cuando [S] >> K
m
, la K
m
puede deducirse a partir de la
ecuación de Mi-chaelis-Menten.
Cuando [S] >> K
m
, la K
m
en el denominador se deprecia y la ecuación se
reduce a:

[S]
[S] V
= V
max
o
, simplificando V
o
= V
max


Para efectos prácticos, la velocidad es constante e independiente de [S].
Cuando la [S] está entre 0.1 K
m
y 10 K
m
, la cinética que muestra es la
cinética clásica de Michaelis-Menten.
Determinación de K
m
y V
max
por representación doble directa
[S] + K
[S] V
= V
m
max
o
15Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


Conocidos dos o más puntos de la hipérbola Michaeliana, de coordenadas individuales
(x
1
, y
1
), se pue-den trazar todas las rectas que pasen por los puntos (x
1
,0) y (0, y
1
),
obteniéndose así un haz que con-fluye en el punto de coordenadas (-K
m
, V
max
) como
muestra la figura:











Transformación de la ecuación de Michaelis-Menten
Representación de Lineweaver-Burk

De
V =
V [S]
K +[S]
o
max
m

El recíproco de esta ecuación es
1
V
=
K +[S]
V [S]
o
m
max



Simplificando
1
V
=
K
V
1
[S]
+
1
V
o
m
max max



[y = m x + b] Ecuación de una recta

FIGURA 2.9
16Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


Representación de Eadie-Hofstee
La ecuación de Michaelis-Menten se transforma en la ecuación que corresponde a una
recta.
V= - K
V
[S]
+ V
m max


[y = m x + b]




FIGURA 2.11
Representación de Dixon
La ecuación de Michaelis-Menten puede también generar una recta al expresarla en la
forma

max
m
max
V
K
+
V
[S]
=
V
[S]


[y = m x + b]


FIGURA 2.12


17Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


Índice de recambio
El término índice de recambio puede utilizarse de dos formas. Una, que ha sido
definida como activi-dad molecular, es el número de moles de sustrato
transformados por minuto por mol de enzima en condiciones óptimas. Otra,
considerando que muchas enzimas son oligómeros que contienen n subunidades, es
el número de moles de sustrato transformados por minuto por mol de subuni-
dad activa o centro catalítico en condiciones óptimas. Esta última definición de
poder catalítico se llama actividad de centro catalítico.





Inhibición enzimática
Cualquier sustancia que reduzca la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamente se puede considerar como un inhibidor. Tanto la velocidad máxima
como la K
m
pueden verse afectadas de diferentes maneras. La inhibición de la
actividad enzimática es uno de los mecanismos de regulación de las células vivas y
uno de los procedimientos más importantes de diagnóstico enzimático.
En la vida cotidiana, los inhibidores enzimáticos pueden encontrarse en sustancias
como dro-gas, antibióticos, conservadores, venenos y toxinas.
Inhibición irreversible
En primer lugar, se reconoce la inhibición irreversible que supone una unión
covalente enzima-inhibidor que lesiona o suprime la actividad enzimática, sin
posibilidad de regeneración. Así, por ejemplo, el iodoacetato o el
diisopropilfluorofosfato pueden bloquear a los aminoácidos cisteína o serina del centro
activo de la enzima inutilizándola como catalizador
Cys—SH + I—CH
2
—COOH

Cys—S—CH
2
—COOH + HI



| |
t
max
p
E
V
k =
18Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


Inhibición reversible
En la inhibición reversible, la unión enzima-inhibidor (EI) suele ser no covalente y,
por tanto, temporal. El complejo (EI) se podrá formar y destruir de acuerdo con las
leyes de los equilibrios químicos. Se describen tres tipos fundamentales de inhibición
reversible: inhibición competitiva; inhibición no competitiva a) pura y b)mixta; e
inhibición acompetitiva.
Inhibición competitiva
Un inhibidor competitivo es una sustancia que se combina con la enzima libre, de
forma que impide la unión con el sustrato. Es decir, el inhibidor y el sustrato se
excluyen mutuamente. Un inhibidor competitivo puede ser un análogo no
metabolizable, un derivado del verdadero sustrato, otro sustrato para la enzima o un
producto de reacción. Esta inhibición se puede compensar aumentando la
concentración de sustrato lo que permite alcanzar la misma velocidad máxima. El
efecto aparente del inhibidor es disminuir la afinidad de la enzima por el sustrato.

El ácido malónico es un ejemplo clásico de un verdadero inhibidor competitivo. Inhibe
la succinato deshidrogenasa que cataliza la oxidación del ácido succínico a ácido
fumárico.




El ácido malónico se parece al ácido succínico lo suficiente como para combinarse con
la enzima en el sitio activo

19Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia




Esta inhibición se diagnostica midiendo V
o
contra [S] en ausencia y en presencia de
inhibidor. Sus representaciones gráficas son:

Inhibición competitiva



De
V =
V [S]
K +[S]
o
max
m

En esta inhibición se ve afectada la K
m
por el factor (1 + [I]/K
I
), el cual puede
considerarse como un factor estadístico dependiente de la [I], que indica la distribución
de enzima entre las formas E y EI. Así, tenemos que





|
|
.
|

\
|
I
m m
K
[I]
+ 1 K = ' K


La constante de Michaelis aparente (K
m
’) aumenta.
La ecuación se transforma en la ecuación correspondiente a una recta

[S] +
K
[I]
+ 1 K
[S] V
= V
I
m
max
o
|
|
.
|

\
|
20Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia








[ y = m x + b ]


Como ejemplos de esta inhibición están los antibióticos, insecticidas, herbicidas y
medicamentos contra el cáncer, por mencionar algunos.
Modelos de inhibición competitiva
















El modelo 1 ilustra la inhibición competitiva clásica en la que un inhibidor compite con
el sustrato por un sitio único de unión. Los modelos 2-4 representan otras formas en
las que un inhibidor y un sustrato se excluyen mutuamente: impedimento estérico
(modelo 2); impedimento estérico o competición por un grupo de unión común
(modelo 3) y sitios de unión superpuestos (modelo 4).

Inhibición no competitiva
Inhibición no competitiva pura

El inhibidor no se fija en el centro activo, sino en otro punto de la molécula enzimática,
modificando la eficacia catalítica de ésta. La unión del inhibidor a la enzima no es
excluyente para el sustrato, pero el complejo ternario ESI no origina productos de
reacción.
Esta inhibición no afecta a la constante de Michaelis de la enzima, pero disminuye la
velocidad máxima. El resultado aparente es que hay menos moléculas enzimáticas
dispuestas a actuar sobre el sustrato. El efecto de inhibición no se contrarresta al
| |
| |
max I max
m
V
1
S
1
K
I
1
V
K
V
1
+
|
|
.
|

\
|
+ =
21Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


aumentar la concentración de sustrato; la inhibi-ción depende sólo de la concentración
del inhibidor.









Sus representaciones gráficas son:



De
V =
V [S]
K +[S]
o
max
m


En esta inhibición se ve afectada la velocidad por el factor (1 + [I]/K
I
), así:

) [S] + K (
K
[I]
+ 1
[S] V
= V
m
I
max
o
|
|
.
|

\
|


K
[I]
+ 1
V
= ' V
I
max
max
|
|
.
|

\
|



La V
max
aparente disminuye
Ecuación de Lineweaver-Burk afectada:

22Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


| |
|
|
.
|

\
|
+ +
|
|
.
|

\
|
+
I I
K
I
V K
1
1
S
1 I
1
V
K
=
V
1
max max
m
o



[ y = m x + b ]
Como ejemplos de esta inhibición tenemos enzimas que tienen como cofactores
metales y son inhibi-os reversiblemente por EDTA o enzimas que tienen grupos
tiólicos (-SH) que reaccionan reversible-mente con metales pesados, como Pb
++
, Hg
++

y Ag
+
.
Inhibición no competitiva mixta


En la cinética de la inhibición no competitiva mixta, tanto la V
max
como la K
m
se ven
afectadas. En la figura se representan las características de esta inhibición




De
V =
V [S]
K +[S]
o
max
m


En esta inhibición el factor (1 + [I]/K
I
) afecta de la siguiente manera:

23Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


[S] +
K
[I]
+ 1 K
[S]

K
[I]
+ 1
V
= V
I
m
I
max
o
|
|
.
|

\
|
|
|
.
|

\
|




K
[I]
+ 1
V
= ' V
I
max
max
|
|
.
|

\
|
La V
max
aparente disminuye
|
|
.
|

\
|
I
m m
K
[I]
+ 1 K = ' K

La constante de Michaelis aparente (K
m
’) aumenta.

Ecuación de Lineweaver-Burk afectada:

| |
|
|
.
|

\
|
+ +
|
|
.
|

\
|
+
I max I
K
I
V K
1
1
S
1 I
1
V
K
=
V
1
max
m
o


[ y = m x + b ]
Inhibición acompetitiva
El inhibidor sólo se une al complejo enzima-sustrato, y no a la enzima libre. El
complejo ternario ESI tampoco origina producto final. Como resultado, la velocidad
máxima disminuye (ya que no todos los complejos ES van a producir reacción) pero la
constante de Michaelis aparente disminuye: aumenta la estabilidad del complejo ES
por la presencia del inhibidor.










24Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia



La gráfica registra las características de este tipo de inhibición



FIGURA 2.21

De
V =
V [S]
K +[S]
o
max
m



En esta inhibición el factor (1 + [I]/K
I
) afecta de la siguiente manera:


[S] +

K
[I]
+ 1
K

[S]

K
[I]
+ 1
V
= V
I
m
I
max
o
|
|
.
|

\
|
|
|
.
|

\
|


Sacando común denominador

|
|
.
|

\
|
|
|
.
|

\
|
|
|
.
|

\
|


K
[I]
+ 1

K
[I]
+ 1 [S] + K

[S]

K
[I]
+ 1
V
= V
I
I
m
I
max
o


Por ley de la herradura
25Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia



K
[I]
+ 1 [S] + K

K
[I]
+ 1 [S]

K
[I]
+ 1
V
= V
I
m
I
I
max
o
|
|
.
|

\
|
|
|
.
|

\
|
|
|
.
|

\
|



Eliminando términos


Finalmente


K
[I]
+ 1 [S] + K
[S] V
= V
I
m
max
o
|
|
.
|

\
|



K
[I]
+ 1
V
= ' V
I
max
max
|
|
.
|

\
|

La V
max
aparente disminuye

K
[I]
+ 1
K
= ' K
I
m
m
|
|
.
|

\
|
La constante de Michaelis aparente (K
m
’) disminuye.

Ecuación de Lineweaver-Burk afectada:

| |
|
|
.
|

\
|
+ +
I max
K
I
V
1
1
S
1
V
K
=
V
1
max
m
o



[ y = m x + b ]

26Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


Ejemplos. La inhibición acompetitiva es rara en sistemas unirreactivos. Sin embargo
merece la pena considerarla porque es un ejemplo sencillo de adición secuencial de
los ligandos enzimáticos en un orden obligado. La inhibición acompetitiva es común en
sistemas multirreactivos.

Cinética de las enzimas alostéricas
La cinética que se ha estudiado (de tipo hiperbólico) no resulta aplicable a la totalidad
de las enzimas. Existen muchas enzimas de estructura oligomérica cuyas subunidades
se influyen mutuamente; es decir, la actuación de una de ellas repercute en el
comportamiento de las demás. Como consecuencia de este fenómeno, la cinética de
estas enzimas suele ser más compleja: en general, de tipo sigmoideo.

Cooperatividad: Ecuación de Hill
La concentración de sustrato puede influir en la velocidad de reacción de las enzimas
reguladoras, dando lugar a la mencionada cinética sigmoidea.


















El efecto cooperativo se atribuye a que la enzima presenta varios centros activos (uno
por cada monómero), ya que puede adoptar dos conformaciones espaciales distintas:
la forma R (relajada) más activa, y la forma T (tensa) menos activa, en equilibrio
dinámico. La presencia del sustrato puede despla-zar el equilibrio, favoreciendo la
adopción de una de ellas, de acuerdo con el esquema siguiente:




27Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia

















La ecuación simplificada de Hill explica matemáticamente la cinética sigmoidea al
suponer la capaci-dad preferente de la enzima para unirse simultáneamente a n
moléculas de sustrato, según la ecuación





Por un razonamiento análogo al seguido con la deducción de la ecuación de Michaelis
se llega a lo si-guiente:

| |
| | S Km
S V
Vo
+
=
max



El sentido químico de K
0.5
(análogo al descrito para K
m
) es el de aquella concentración
de sustrato que permite a la enzima trabajar a la mitad de la máxima velocidad. Al
operar matemáticamente la ecuación tenemos
















P E + → ↔ +
n
ES S n E
n n
0.5
n
max
[S] K
[S] V
V
+
=
( ) | | S V [S] K V
n
max
n
0.5
n
= +
| | S V V[S] VK
n
max
n
0.5
n
= +
| | V[S] - S V VK
n
n
max
0.5
n
=
[S] V) - (V VK
n
max
0.5
n
=
n n
0.5
n
max
[S] K
[S] V
V
+
=
28Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia














Al aplicar logaritmos se obtiene








A n se le denomina coeficiente de Hill. Si su valor es 1, no existe cooperatividad; si es
mayor que 1, hay cooperatividad positiva; y si es menor que 1, la cooperatividad es
negativa. Sus valores habituales en las enzimas reguladoras oscilan entre 2 y 3








Efectores alostéricos
Las enzimas alostéricas modifican su actividad catalítica al fijar determinados ligandos
sobre el centro activo: sustrato natural, sustrato análogo, inhibidores competitivos,
entre otros. Estos ligandos se podrían denominar ligandos homotrópicos, pero con
frecuencia estos u otros compuestos pueden fijarse a centros diferentes del centro

V
[S] V) - (V
K
n
max
0.5
n
=

V
V) - (V

S
K
max
n
0.5
n
=
n
K
S
V
(
¸
(

¸

=

5 . 0 max

V
V
5 . 0
max
log log
V
V
log k n S n
V
− =

b mx Y − =
29Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia


catalítico, llamados centros alostéricos. Estos ligandos serán heterotrópicos y
también son capaces de modificar la actividad catalítica de las enzimas reguladoras.
Los inhibidores alostéricos disminuyen o anulan la actividad catalítica de la enzima y
los activadores alostéricos la aumentan.
La activación o inhibición puede afectar a diversos parámetros de la cinética
enzimática. Entre los modelos clásicos se consideran los sistemas K en los que se ve
afectada la K
0.5
y los sistemas V, en los que resulta alterada la velocidad máxima.
En el esquema A es activador o modulador positivo e I es modulador negativo o
inhibidor.














En la figura anterior se representan las modificaciones cinéticas producidas por un
activador (A) o un inhibidor (I) en los dos sistemas considerados.





figura 2.14 donde el pKa del sustrato se supone que es 4. Se supone también que el sitio activo de la enzima contiene un grupo básico B que deberá estar protona-do, BH+, para unirse al sustrato A-. La proporción de concentración total de enzima en la forma iónica adecuada BH+ disminuye al aumentar el pH, como se ilustra en la figura 2.14 donde el pKa del sitio ac-tivo se supone es 7. La actividad máxima teórica se dará a un pH en el que toda la enzima se encuen-tra como BH+ y todo el sustrato como A-. Sin embargo, los dos valores de pKa se diferencian sólo en tres unidades y, por lo tanto, la combinación máxima de BH+ y A- se dará a un pH de 5.5 en el que el 97% del sustrato total y enzima total estarán en la forma iónica adecuada.

FIGURA 2.14 Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción Muchas reacciones químicas transcurren a una velocidad mayor si la temperatura aumenta. Un aumento en la T comunica más energía cinética a las moléculas del reactivo, dando más colisiones eficaces por unidad de tiempo. Las reacciones catalizadas enzimáticamente se comportan análogamente hasta cierto punto. Las enzimas son moléculas proteicas complejas; su actividad catalítica se debe a una estructura terciaria altamente ordenada y exacta que da lugar a la formación de sitios estereoespecíficos de unión del sustrato con el centro catalítico. La estructura terciaria de una enzima se conserva por un gran número de enlaces débiles no covalentes; por lo tanto, una enzima es una estructura frágil y muy delicada. Si la enzima absorbe demasiada energía, la estructura terciaria se rompe y la enzima se des-naturaliza y pierde su actividad catalítica. Así, al elevarse la temperatura, el aumento esperado en velo-cidad debido al incremento de colisiones E+S es anulado por el aumento de la velocidad de desna-turalización; por lo tanto, una representación de actividad catalítica frente a T generalmente muestra un pico que se conoce como temperatura óptima.

2Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia

Como se mencionó anteriormente. y la energía de activa-ción Ea viene dada por la ecuación de Arrhenius k = Ae que también se puede expresar - Ea RT log k = − [y = Ea 1 + log A 2.60º C. generalmente. • Desnaturalización de la enzima que se lleva a cabo entre 45 . Instituto Tecnológico de Morelia . la relación entre la constante de velocidad k.15 La curva que presentan las reacciones catalizadas por enzimas se debe: • Al incremento habitual de la reacción por aumento de la temperatura.303R T2 T1 2.Las enzimas de peso molecular bajo compuestas de cadenas polipeptídicas sencillas y que poseen puentes disulfuro son. más estables al calor que las de peso molecular alto como las enzimas oligoméricas.303R T m x + b] La forma integrada de la ecuación de Arrhenius es: log O bien Ea k2 T2 − T1 = k 1 2.303 RT2 T1 T2 − T1 k2 k1 Ea = log 3Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. FIGURA 2.

• Que posean la suficiente energía para alcanzar un estado de transición en el cual la probabilidad de establecer o romper un enlace sea elevada. que es el factor en que aumenta la velocidad al incre-mentar la temperatura 10° C. una representación de log Vmax/[E]t frente a 1/T da Ea para el proceso catalítico. FIGURA 2. el sustrato ha saturado los sitios activos de la enzima y se ha logrado la velocidad máxima de la reacción.16 Cinética enzimática Para que una reacción química se lleve a cabo es necesario: • Que las moléculas se reconozcan químicamente. la cual depende de la afinidad de la enzima y el sustrato correspondiente. El efecto de temperatura sobre la velocidad de reacción se expresa frecuentemente en térmi-nos de un coeficiente de temperatura.Donde k1 y k2 son las constantes específicas de velocidad de reacción a dos temperaturas diferentes.303 RT2 T1 log Q 10 10 Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción La velocidad de una reacción catalizada por una enzima se incrementa al aumentar la concentración de sustrato hasta un punto en el cual ya no hay incremento. Así. Q10. En un sistema sencillo de equilibrio rápido. constante de velocidad de primer or-den. t1 y t2. En esta fase. Ea = 2. Vmax/[E]t = kp. En la práctica sólo puede representarse log Vmax. Este 4Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. es decir. respectivamente. Instituto Tecnológico de Morelia . ya que la Vmax de una preparación dada es proporcional a kp. aun con la adición de más sustrato. que tengan una orientación espacial óptima.

La energía adi-cional que hay que suministrar al sustrato para que se transforme en producto recibe el nombre de energía de activación. como se había mencionado.99 cal/ºK·mol T = 273 + ºC 5Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. La energía de activación está relacionada con la constante de velocidad de la reacción química.estado de transición se encuentra en la barrera de energía que separa reactivos y productos. como se indica: S k → P  k = k = constante de velocidad V = k[S] La energía de activación y la constante de velocidad están relacionadas por la ecuación de Arrhe-nius dS dP = dt dt k = Ae en donde - Ea RT A = número de moléculas que tienen la suficiente energía para reaccionar e = base de logaritmo natural R = 1. Se puede esquematizar de la siguiente manera: Energía de activación Es la energía necesaria para llevar las moléculas de un mol de sustancia al estado de transición. Instituto Tecnológico de Morelia . Energía de activación y catálisis Se sabe que los procesos espontáneos transcurren con disminución de la energía libre.

y k’ a la catalizada: ln k = B Restando mutuamente.303 Esta relación nos indica cuantas veces es más rápida una reacción catalizada de una no catalizada. Se sabe que por cada 10º de elevación de temperatura la velocidad de reacción se duplica. Principios de la cinética enzimática La cinética es el estudio de las velocidades de reacción y el conocimiento de los principios que rigen dichas reacciones. k RT log Ea . Vamos a relacionar la velocidad de la reacción con la concentración de los reactivos mediante la expresión V = k[ ] Sea la reacción en donde.E a ' = . Llamamos k a la constante de velocidad de la reacción espontánea.Ea ' k' = k RT 2. tenemos Ea RT y ln k' = B - Ea ' RT ln k' E a . los catalizadores disminuyen la energía de activación y en consecuencia aumentan considerablemente la velocidad de la reacción catalizada. o bien.RT    = ln A - Ea RT ln k = B - Ea RT Esta ecuación permite deducir que la velocidad de cualquier reacción química será mayor al aumentar la temperatura de la reacción y disminuir la energía de activación. Precisamente. kf = constante de formación kr = constante de reversibilidad A k f → B + C  A ← k r B + C  6Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia .  Ea   .Sacando logaritmo natural a los dos miembros de la ecuación. tenemos que ln k = ln A ln e Sustituyendo ln A = B.

Reacciones de primer orden Son aquéllas cuya velocidad depende de la concentración de un reaccionante.693 k Reacciones de segundo orden Son aquéllas cuya velocidad es proporcional a la concentración de dos reaccionantes A + B →P La velocidad de esta reacción se puede expresar como V = - d[P] d[B] d[A] = = dt dt dt d[A ] = k[A][B] dt V = k [A]2 V=si [A] = [B] 7Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. A→P La velocidad de reacción en cualquier tiempo t está dada por: V = d[A] d[P] = dt dt V=- d[A ] = k[A ] dt V = k[A] Puesto que V = mol/seg. y [A] = mol. que es más útil para la realización de cálculos cinéticos. despejando k tenemos k = seg -1 La forma integrada de esta ecuación. de segundo orden. las reacciones químicas se pueden clasificar por el orden de reacción en: de primer orden. es log [Ao ] kt = [ A ] 2. de tercer orden y de orden cero.303 En las reacciones de primer orden. la mitad del tiempo está dada por: t1 = 2 0.V = kf [A] V = kr [B][C] Sobre una base cinética. Instituto Tecnológico de Morelia .

La velocidad puede de-pender de la concentración del catalizador 8Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica.despejando k tenemos k = (seg • mol) -1 La forma integrada de la expresión de segundo orden es t= [B ][A] 2. cuyas concentraciones de los reaccionantes son iguales. el tiempo mitad es igual a t1 = 2 en donde Co = concentración inicial de los reaccionantes k = constante de velocidad de segundo orden 1 Cok Reacciones de tercer orden Son aquéllas cuya velocidad es proporcional a la concentración de tres reaccionantes A + B + C →P La velocidad de esta reacción se puede expresar como V = - d[P] d[C] d[B] d[A] = = = dt dt dt dt V=- d[A ] = k[A][B][C] dt V = k [A]3 si [A] = [B] = [C] despejando k tenemos k = (seg • mol 2 ) -1 Reacciones de orden cero Son independientes de la concentración de cualquiera de los reaccionantes.303 log o k[A o ] − [B] [A o ][B] en donde [Ao] y [Bo] son las concentraciones iniciales [A] y [B] son las concentraciones en el tiempo t En las reacciones de segundo orden. Instituto Tecnológico de Morelia .

Los principios generales de cinética de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones enzimáticas. El modelo de acción enzimática de Michaelis-Menten ha sido la base de la cinética enzimática. pero éstas tienen una característica que no se observa en las reacciones químicas no enzimáticas y es la saturación con el sustrato. Su trabajo experimental se realizó con un extracto de levaduras ricas en invertasa (hidroliza la sacarosa). Los primeros conocimientos sobre el comportamiento enzimático se deben a V. Se recopilaron los datos de dos experimentos independientes. se observó lo siguiente: 9Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. los cuales se indican a continuación.V=- d[A ] = k[A]o = k dt despejando k k = mol/seg Obsérvese que la velocidad es una constante a lo largo del tiempo que dura la reacción. Instituto Tecnológico de Morelia . Michaelis y Maud L. se observó lo siguiente: FIGURA 2. cuando la concentración de enzima se mantuvo constante y la concentración de sustrato se hizo variar. Menten. en tanto se hacía variar la con-centración de enzima.5 2) El experimento inverso. 1) Mientras la concentración del sustrato se mantuvo constante. Henri y más tarde a L.

la velocidad disminuye y deja de ser proporcional a la [S].Este último comportamiento se explica suponiendo que: • A concentraciones muy bajas de sustrato [S] < 0.01 Km la representación de V frente a [S] es prácticamente lineal. • Cuando la [S] está entre 0. el cual se descompone para formar los productos y la enzima queda libre en su forma original. Esta es la región de cinética de primer orden. la velocidad es prácticamente independiente de la [S]. [S] > 100 Km. la cinética que muestra es la cinética clásica de Michaelis-Menten. en esta zona la reacción es de orden mixto. • Al aumentar la [S]. Supusieron que la enzima podía combinarse de modo reversible con el sustrato para formar un complejo intermedio enzima-sustrato (ES). La velocidad de formación del complejo ES Vf ES = Vf = k1[E][S] la velocidad de disociación del complejo ES VD ES = VD = K3[ES] + k2[ES] cuando se alcanza el equilibrio para ES Vf = VD 10Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica.1 Km y 10 Km. Michaelis-Menten explicaron de manera sencilla este comportamiento. Eleonor Michaelis Maud Menten En 1913. Instituto Tecnológico de Morelia . Esta es la región de cinética de orden cero. • A medida que aumenta la [S].

k1 Km = Sustituyendo ( [E T ] .[S] [ES] K m + [S] = [E T ] [S] [ES] [ES] = [E T ] [S] K m + [S] La velocidad de formación del producto es V = k3 [ES].[ES] ) [S] = k1 [ES] en donde k 2 + k3 = K m (constante de Michaelis). esta velocidad la podemos llamar velocidad inicial (Vo). entonces [ES] = Vo / k3 sustituyendo [ES] 11Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica.k1[E][S] = K3[ES] + k2[ES] simplificando k1[E][S] = (k2 + K3) [ES] Si [E] = [ET] .[ES] ) [S] [ES] simplificando Km = ( [E T ] [S] ) . Sustituyendo [E] tenemos.[ES].( [ES] [S] ) [ES] Km = [E T ] [S] . ET = Enzima total k1 ( [ET] . Instituto Tecnológico de Morelia .[ES] ) [S] = (k2 + K3) [ES] despejando las k tenemos k 2 + k 3 ( [E T ] .

entonces Vmax = k3 [ET] sustituyendo k3 [ET] Vo = Vmax [S] K m + [S] Esta es la ecuación cinética clásica de Michaelis-Menten y corresponde a una hipérbola con Vo y [S] como coordenadas.Vo [E T ] [S] = k 3 K m + [S] despejando Vo Vo = k 3 [E T ] [S] K m + [S] Si Vo = k3 [ES] la velocidad máxima (Vmax) se alcanzará cuando toda la enzima está unida al sustrato. Cuando Vo = Vmax los sitios activos de la enzima están ocupados y toda la enzima está como ES y no hay enzima libre. Instituto Tecnológico de Morelia .[S] Km = [S] 12Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. y con la constante Vmax como asíntota. esta condición se llama saturación al 100%. Cuando la saturación es al 50% Vo = ½ Vmax sustituyendo Vo en la ecuación de Michaelis-Menten: Vmax V [S] = max 2 K m +[S] simplificando Km + [S] = 2 [S] Km = 2 [S] .

Instituto Tecnológico de Morelia .Km = [S]. mayor es la especificidad de la enzima por ese sustrato. Mientras más pequeña es la Km. Esto habla de la especificidad de la enzima. a la que se alcanza la mitad de la máxima velocidad. Briggs y Haldane establecieron una hipótesis. Estos autores señalaron una importante cir-cunstancia que se muestra en la figura siguiente Este diagrama muestra cómo tienden a variar las concentraciones de los distintos componentes de una reacción enzimática en el curso de la misma. 13Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. La fracción de sitios unidos a una determinada concentración de sustrato puede ser calculada por: f ES = [S] V = Vmax K m + [S] La aproximación del estado estacionario En 1925.

prácticamente. Cabe considerar cero la velocidad de cambio de [E] y [ES] respecto al tiempo. Cuando la [S] está entre 0. la velocidad es constante e independiente de [S]. Cuando [S] >> Km. la cinética que muestra es la cinética clásica de Michaelis-Menten. constante con el tiempo. Esta suposición de Briggs y Haldane se conoce como aproximación del estado estacionario. en comparación con la velocidad de cambio con [S] y [P]. [S] Vo = simplificando Vo = Vmax Para efectos prácticos. De esto puede deducirse una ecuación de velocidad de forma similar a la descrita por Michaelis-Menten. entonces.De acuerdo con esto. [S] >> [ET]. después de un primer momento transitorio [S] y [P] cambian mucho más rápida-mente en términos absolutos que [E] y [ES]. Determinación de Km y Vmax por representación doble directa 14Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. inmediatamente después de mezclar E y S se alcanza un estado estacio-nario en el que [ES] permanece. la Km en el denominador se deprecia y la ecuación se reduce a: Vmax [S] . Instituto Tecnológico de Morelia . Si la enzima está presente en cantidades catalíticas. es decir. Cinética de primer orden La relación lineal entre V y [S] cuando [S] << Km. Vo = Vmax [S] K m + [S] Cuando [S] << Km la [S] en el denominador se desprecia y la ecuación se reduce a: Vo = Vmax [S] Km o V = k[S] Donde k = constante de velocidad de primer orden para la reacción total (min-1) Cinética de orden cero La relación lineal entre V y [S] cuando [S] >> Km. la Km puede deducirse a partir de la ecuación de Michaelis-Menten.1 Km y 10 Km. la Km puede deducirse a partir de la ecuación de Mi-chaelis-Menten.

y1).9 Transformación de la ecuación de Michaelis-Menten Representación de Lineweaver-Burk De El recíproco de esta ecuación es Vo = Vmax [S] K m +[S] 1 K m +[S] = Vmax [S] Vo Simplificando 1 Km 1 1 = + • Vo Vmax [S] Vmax [y = m x + b] Ecuación de una recta 15Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. se pue-den trazar todas las rectas que pasen por los puntos (x1. Instituto Tecnológico de Morelia . y1). Vmax) como muestra la figura: FIGURA 2.0) y (0.Conocidos dos o más puntos de la hipérbola Michaeliana. obteniéndose así un haz que con-fluye en el punto de coordenadas (-Km. de coordenadas individuales (x1.

11 Representación de Dixon La ecuación de Michaelis-Menten puede también generar una recta al expresarla en la forma [S] [S] K = + m V Vmax Vmax [y = m x + b] FIGURA 2.Representación de Eadie-Hofstee La ecuación de Michaelis-Menten se transforma en la ecuación que corresponde a una recta. Instituto Tecnológico de Morelia . V = .Km [y = m V + Vmax [S] x + b] FIGURA 2.12 16Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica.

Vmax kp = [E]t Inhibición enzimática Cualquier sustancia que reduzca la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente se puede considerar como un inhibidor.Índice de recambio El término índice de recambio puede utilizarse de dos formas. por ejemplo. es el número de moles de sustrato transformados por minuto por mol de subunidad activa o centro catalítico en condiciones óptimas. los inhibidores enzimáticos pueden encontrarse en sustancias como dro-gas. Instituto Tecnológico de Morelia . el iodoacetato o el diisopropilfluorofosfato pueden bloquear a los aminoácidos cisteína o serina del centro activo de la enzima inutilizándola como catalizador Cys—SH + I—CH2—COOH ↔ Cys—S—CH2—COOH + HI 17Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. sin posibilidad de regeneración. En la vida cotidiana. Así. Una. considerando que muchas enzimas son oligómeros que contienen n subunidades. se reconoce la inhibición irreversible que supone una unión covalente enzima-inhibidor que lesiona o suprime la actividad enzimática. antibióticos. es el número de moles de sustrato transformados por minuto por mol de enzima en condiciones óptimas. Otra. conservadores. La inhibición de la actividad enzimática es uno de los mecanismos de regulación de las células vivas y uno de los procedimientos más importantes de diagnóstico enzimático. Tanto la velocidad máxima como la Km pueden verse afectadas de diferentes maneras. Inhibición irreversible En primer lugar. que ha sido definida como activi-dad molecular. venenos y toxinas. Esta última definición de poder catalítico se llama actividad de centro catalítico.

Instituto Tecnológico de Morelia . el inhibidor y el sustrato se excluyen mutuamente. de forma que impide la unión con el sustrato. El ácido malónico es un ejemplo clásico de un verdadero inhibidor competitivo. otro sustrato para la enzima o un producto de reacción. El complejo (EI) se podrá formar y destruir de acuerdo con las leyes de los equilibrios químicos. El ácido malónico se parece al ácido succínico lo suficiente como para combinarse con la enzima en el sitio activo 18Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. un derivado del verdadero sustrato. e inhibición acompetitiva. Esta inhibición se puede compensar aumentando la concentración de sustrato lo que permite alcanzar la misma velocidad máxima. Inhibición competitiva Un inhibidor competitivo es una sustancia que se combina con la enzima libre. Es decir. El efecto aparente del inhibidor es disminuir la afinidad de la enzima por el sustrato. la unión enzima-inhibidor (EI) suele ser no covalente y.Inhibición reversible En la inhibición reversible. temporal. por tanto. Se describen tres tipos fundamentales de inhibición reversible: inhibición competitiva. inhibición no competitiva a) pura y b)mixta. Un inhibidor competitivo puede ser un análogo no metabolizable. Inhibe la succinato deshidrogenasa que cataliza la oxidación del ácido succínico a ácido fumárico.

Instituto Tecnológico de Morelia . que indica la distribución de enzima entre las formas E y EI. el cual puede considerarse como un factor estadístico dependiente de la [I]. Sus representaciones gráficas son: Inhibición competitiva De Vo = Vmax [S] K m +[S] En esta inhibición se ve afectada la Km por el factor (1 + [I]/KI ). La ecuación se transforma en la ecuación correspondiente a una recta 19Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Así.Esta inhibición se diagnostica midiendo Vo contra [S] en ausencia y en presencia de inhibidor. tenemos que Vo = Vmax [S]  [I]   + [S] Km  1 +  KI     [I]   K m ' = K m 1 +  KI    La constante de Michaelis aparente (Km’) aumenta.

Inhibición no competitiva Inhibición no competitiva pura El inhibidor no se fija en el centro activo. Modelos de inhibición competitiva El modelo 1 ilustra la inhibición competitiva clásica en la que un inhibidor compite con el sustrato por un sitio único de unión. insecticidas. herbicidas y medicamentos contra el cáncer. El efecto de inhibición no se contrarresta al 20Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. modificando la eficacia catalítica de ésta. pero disminuye la velocidad máxima. La unión del inhibidor a la enzima no es excluyente para el sustrato. Los modelos 2-4 representan otras formas en las que un inhibidor y un sustrato se excluyen mutuamente: impedimento estérico (modelo 2). por mencionar algunos. Instituto Tecnológico de Morelia . impedimento estérico o competición por un grupo de unión común (modelo 3) y sitios de unión superpuestos (modelo 4). El resultado aparente es que hay menos moléculas enzimáticas dispuestas a actuar sobre el sustrato.1 Km = V Vmax [ y =  [I]  1 + 1 1 +   K  [S] V I  max  m x + b ] Como ejemplos de esta inhibición están los antibióticos. sino en otro punto de la molécula enzimática. Esta inhibición no afecta a la constante de Michaelis de la enzima. pero el complejo ternario ESI no origina productos de reacción.

aumentar la concentración de sustrato. así: Vo = Vmax [S]  [I]  1+  KI  Vmax ' =   ( K m + [S] )   Vmax  [I]  1 +  K    I  La Vmax aparente disminuye Ecuación de Lineweaver-Burk afectada: 21Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Sus representaciones gráficas son: De Vo = Vmax [S] K m +[S] En esta inhibición se ve afectada la velocidad por el factor (1 + [I]/KI ). la inhibi-ción depende sólo de la concentración del inhibidor. Instituto Tecnológico de Morelia .

como Pb++. Instituto Tecnológico de Morelia . Inhibición no competitiva mixta En la cinética de la inhibición no competitiva mixta. Hg++ y Ag+.1 K  I  1 1  I   + 1 + = m 1 +   K  [S] V  K  Vo Vmax  I  I  max  [ y = m x + b ] Como ejemplos de esta inhibición tenemos enzimas que tienen como cofactores metales y son inhibi-os reversiblemente por EDTA o enzimas que tienen grupos tiólicos (-SH) que reaccionan reversible-mente con metales pesados. En la figura se representan las características de esta inhibición De Vo = Vmax [S] K m +[S] En esta inhibición el factor (1 + [I]/KI) afecta de la siguiente manera: 22Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. tanto la Vmax como la Km se ven afectadas.

y no a la enzima libre. Ecuación de Lineweaver-Burk afectada:     K 1 = m Vo Vmax Inhibición acompetitiva  I  1 1  1 + +  K I  [S] Vmax   m x + b  I   1 +  KI    ] [ y = El inhibidor sólo se une al complejo enzima-sustrato. Instituto Tecnológico de Morelia . 23Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. El complejo ternario ESI tampoco origina producto final. Como resultado. la velocidad máxima disminuye (ya que no todos los complejos ES van a producir reacción) pero la constante de Michaelis aparente disminuye: aumenta la estabilidad del complejo ES por la presencia del inhibidor.Vo = Vmax  [I]  1+  KI      • [S]  [I] Km  1 +  KI  Vmax  [I]   1 +  K  I     + [S]   Vmax ' = La Vmax aparente disminuye  [I] K m ' = K m 1 +  K I  La constante de Michaelis aparente (Km’) aumenta.

Instituto Tecnológico de Morelia .La gráfica registra las características de este tipo de inhibición FIGURA 2.21 De Vmax [S] Vo = K m +[S] En esta inhibición el factor (1 + [I]/KI) afecta de la siguiente manera: Vo = Vmax  [I]  1+  KI      • [S] Km  [I]  1+  KI      + [S] Sacando común denominador Vo = Vmax  [I]  1+  KI      • [S]  [I] K m + [S] 1 +  KI   [I]   1+   KI        Por ley de la herradura 24Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica.

Instituto Tecnológico de Morelia .Vo = Vmax  [I]    1+  KI     [I]   [S]  1 +  KI    •  [I] K m + [S] 1 +  KI      Eliminando términos Finalmente Vo = Km Vmax [S]  [I] + [S] 1 +  KI  Vmax  [I]   1 +  K  I      Vmax ' = La Vmax aparente disminuye Km ' = Km  [I]  1 +   KI    La constante de Michaelis aparente (Km’) disminuye. Ecuación de Lineweaver-Burk afectada: K 1 1 1 = m + Vo Vmax [S] Vmax [ y = m x + b  I   1 +  KI    ] 25Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica.

Como consecuencia de este fenómeno.Ejemplos. la cinética de estas enzimas suele ser más compleja: en general. El efecto cooperativo se atribuye a que la enzima presenta varios centros activos (uno por cada monómero). la actuación de una de ellas repercute en el comportamiento de las demás. dando lugar a la mencionada cinética sigmoidea. ya que puede adoptar dos conformaciones espaciales distintas: la forma R (relajada) más activa. Cooperatividad: Ecuación de Hill La concentración de sustrato puede influir en la velocidad de reacción de las enzimas reguladoras. favoreciendo la adopción de una de ellas. Sin embargo merece la pena considerarla porque es un ejemplo sencillo de adición secuencial de los ligandos enzimáticos en un orden obligado. La inhibición acompetitiva es rara en sistemas unirreactivos. Instituto Tecnológico de Morelia . Existen muchas enzimas de estructura oligomérica cuyas subunidades se influyen mutuamente. es decir. en equilibrio dinámico. de acuerdo con el esquema siguiente: 26Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. de tipo sigmoideo. Cinética de las enzimas alostéricas La cinética que se ha estudiado (de tipo hiperbólico) no resulta aplicable a la totalidad de las enzimas. La presencia del sustrato puede despla-zar el equilibrio. y la forma T (tensa) menos activa. La inhibición acompetitiva es común en sistemas multirreactivos.

5 (análogo al descrito para Km) es el de aquella concentración de sustrato que permite a la enzima trabajar a la mitad de la máxima velocidad.La ecuación simplificada de Hill explica matemáticamente la cinética sigmoidea al suponer la capaci-dad preferente de la enzima para unirse simultáneamente a n moléculas de sustrato. Al operar matemáticamente la ecuación tenemos V K n 0.5 = (Vmax .5 + [S] n = Vmax [S] ( Vmax [S] n V = n K 0.V) [S] n 27Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica.5 + [S] n El sentido químico de K 0.5 = Vmax [S] . Instituto Tecnológico de Morelia . según la ecuación E + n S ↔ ES n → E + P Por un razonamiento análogo al seguido con la deducción de la ecuación de Michaelis se llega a lo si-guiente: V max [S ] Vo = Km + [S ] Vmax [S] n V = n K 0.V[S] n n VK n 0.5 + V[S] n = Vmax [S] n VK n 0.5 + [S] n ) n VK n 0.

5 Vmax − V Y = mx − b A n se le denomina coeficiente de Hill.5 (Vmax . no existe cooperatividad. Si su valor es 1.5 = V K n 0. si es mayor que 1.5  Al aplicar logaritmos se obtiene log V = n log S − n log k 0. Estos ligandos se podrían denominar ligandos homotrópicos. hay cooperatividad positiva. pero con frecuencia estos u otros compuestos pueden fijarse a centros diferentes del centro 28Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Instituto Tecnológico de Morelia .V) [S] n K 0. inhibidores competitivos. Sus valores habituales en las enzimas reguladoras oscilan entre 2 y 3 Efectores alostéricos Las enzimas alostéricas modifican su actividad catalítica al fijar determinados ligandos sobre el centro activo: sustrato natural.V) n Sn = V n  S  V =  Vmax − V  K 0. y si es menor que 1. la cooperatividad es negativa. sustrato análogo. entre otros.(Vmax .

en los que resulta alterada la velocidad máxima. llamados centros alostéricos. En la figura anterior se representan las modificaciones cinéticas producidas por un activador (A) o un inhibidor (I) en los dos sistemas considerados. Instituto Tecnológico de Morelia .catalítico. Entre los modelos clásicos se consideran los sistemas K en los que se ve afectada la K0. La activación o inhibición puede afectar a diversos parámetros de la cinética enzimática. Los inhibidores alostéricos disminuyen o anulan la actividad catalítica de la enzima y los activadores alostéricos la aumentan. 29Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernández Profesora de Bioquímica. Estos ligandos serán heterotrópicos y también son capaces de modificar la actividad catalítica de las enzimas reguladoras.5 y los sistemas V. En el esquema A es activador o modulador positivo e I es modulador negativo o inhibidor.

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