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Sintesis de Rna en Eucariotas 2011

Sintesis de Rna en Eucariotas 2011

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SINTESIS DE RNA EN EUCARIOTAS

Blga. Roxana Mestas Valdivia Profesor Asociado Tiempo Parcial 20 Horas Departamento de Biología Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Universidad Nacional de San Agustín

 En la célula eucariota, la transcripción tiene lugar en el núcleo y la traducción en el citoplasma.  En eucariotas la cromatina que contiene la secuencia promotora tiene que ser accesible a la maquinaria de transcripción.  En eucariotas la transcripción la realizan 3 tipos de RNA polimerasas  La célula eucariota tiene una regulación de la transcripción mas compleja, en la que participan numerosos factores de transcripción.  El RNA eucariota sufre un extenso proceso de procesamiento y maduración.

La transcripción y la traducción son procesos simultáneos.

La transcripción y la traducción no son procesos simultáneos.

Las RNAs polimerasas
Múltiples subunidades: 8 -12 3 RNA polimerasas: De los procariontes De Bacteria Central ’  ’ ’’  De Archea Central A’/A’’ B D L K [+ otras 6] RNAP I (Pol I) RPA1 RPA2 RPC5 RPC9 RPB6 [+ otras 9] De los eucariontes RNAP II (Pol II) RPB1 RPB2 RPB3 RPB11 RPB6 [+ otras 7] RNAP III (Pol III) RPC1 RPC2 RPC5 RPC9 RPB6 [+ otras 11]

Desde el punto de vista estructural, estas polimerasas son similares entre sí Desde el punto de vista funcional, son bastante distintas.

En eucariotas la transcripción la realizan 3 tipos de RNA polimerasas

Polimerasa
RNA polimerasa I RNA polimerasa II

Localización
Nucleólo Núcleo

Genes transcritos
Genes de RNA ribosómico (rRNA) 28S; 18S y 5.8S Genes que codifican proteínas (mRNA), genes de la mayoría de los RNA nucleares pequeños (snRNA: U1,U2,U4,U5), genes de micro-RNA (miRNA) Genes de RNA de trasnferencia (tRNA), rRNA 5S,snRNA U6, RNA nucleolares pequeños (snoRNA)

RNA polimerasa III

Núcleo

Cada una trabaja sobre un grupo diferentes de genes, sin posibilidad de intercambio.

Transcripción de los genes de clase I

El promotor de la RNA pol I se localiza en la región anterior al
punto de inicio.
 Promotor central o core. Rico en GC + región conservada rica en AT en Inr. Unión de factor SL1 (TBP + 3 Prot.) Posicionamiento RNA pol I UCE (elemento de control corriente arriba) Unión de factor UBF Aumento de frecuencia de iniciación

Ensamblaje del complejo de preiniciación:
 UBF se une a UCE  SL1 se une a las dos regiones del promotor  La RNA polI se une al elemento central

Posible esquema para la terminación de la transcripción de la RNA pol I
Reb1p / TTF-1, se une al DNA en una secuencia de reconocimiento localizada de 12 a 20 pb corriente abajo de la terminación de la transcripción. PTRF (factor de liberación de pol I y transcrito) induce la disociación de la polimerasa y el transcrito del DNA molde

Reb1p en Saccharomyces cerevisiae TTF-1 en ratones

Transcripción de los genes de clase III

Los promotores de la RNA pol III

 Tipo 1:genes del rRNA 5S  Tipo 2: genes de tRNA  Tipo 3: genes de algunos snRNA

Transcripción de los genes de clase II

RNA polimerasa II

Dominio CTD: dominio carboxilo terminal de RPB1 con múltiples repeticiones de la secuencia

YSPTSPS, regulable por fosforilación. Participan en el reconocimiento de señales de activación y en la iniciación de la Transcripción.  CTD no fosforilado, RNApol II puede iniciar la transcripción pero no puede elongar  CTD fosforilado, RNApol II puede elongar pero no iniciar

Los promotores de la RNA pol II se localizan en el lado 5’ del
centro de iniciación de la transcripción:
    BRE (elemento de reconocimiento para TFIIB) TATA (caja TATA) Inr (elemento iniciador) DPE (elemento promotor corriente a bajo)

La RNA polimerasa II no es capaz de reconocer a los promotores. Necesita factores de transcripción para la iniciacion: TFII (A, B, C, D, ..) Los factores de transcripción se unen primero a una secuencia especifica del DNA, y luego se unen entre ellos y a la RNA polimerasa.

Factores de transcripción generales (GTF)
Cantidad de subunidades
2 1 1 11 2 3 9

GTF
TFIIA (factor de tarnscripción para la polimerasa II A) TFIIB (factor de tarnscripción para la polimerasa II B) TFIID (factor de tarnscripción para la polimerasa II D) TBP (proteína de unión a TATA) TAF (factores asociados a la proteína de unión a TATA) TFIIE (factor de tarnscripción para la polimerasa II E) TFIIF (factor de tarnscripción para la polimerasa II F) TFIIH (factor de tarnscripción para la polimerasa II H)

Las cantidades indicadas corresponden a las levaduras, pero son similares en otros eucariontes, incluidos los seres humanos.

GTF
TFIIA

Función
Se une corriente arriba del sitio de unión del factor TFIID y aparentemente estabiliza la unión TFIID-DNA, además parece poseer una actividad antirepresora. Junto con TFIIA permiten la unión de la RNA polimerasa la cual está asociada al TFIIF, se une corriente abajo del sitio de unión de TFIID. El TFIIF aumenta la afinidad de la RNA polimerasa por el promotor y estabiliza su interacción con el DNA. Influye en la selección del punto de inicio de la transcripción, también parece poseer una actividad helicasa.

TFIIB

TFIID

TBP TAF

Define el sitio de inicio de la transcripción. Reconocimiento de la secuencia TATA y, posiblemente, la secuencia Inr, forma una plataforma par la unión de TFIIB Reconocimiento del promotor central; regulación de la unión de TBP Recluta a TFIIH y modula su actividad helicasa y posiblemente favorece la desnaturalización del promotor. Suprime las uniones no específicas de DNA y estabiliza el complejo de preinicialización . Actúa como helicasa y como quinasa. Como helicasa contribuye a la apertura de la doble hélice durante la transcripción, y como quinasa fosforila el extremo carboxi-terminal de la RNA pol II.

TFIIE TFIIF TFIIH

Eventos generales de la transcripción del DNA por la RNA polimerasa II
 Ensamblaje: Construcción secuencial y ordenada del complejo de inciación
Hasta el complejo de preiniciación

1. Reconocimiento del promotor 2. Unión de la RNApol II (CTD desfosforilado)

 Iniciación: Desenrollado del molde y activación de la polimerización.
1. Apertura del complejo 2. Activación de la RNApol II 3. Fosforilación del CTD

Hasta el desalojo del promotor

 Elongación: Crecimiento del trascrito por polimerización de NTPs sobre el molde.
1. Disociación de GTF 2. Reclutamiento de factores de elongación 3. Reclutamiento por CTD de RNPs para procesado

Mientras no termina

 Terminación: Acoplamiento de corte y poliadenilación con terminación.

 Reclutamiento del complejo de poliadenilación  Corte y liberación del transcrito (desactivación de la RNApol)  Poliadenilación 3’

ENSAMBLAJE DE LA RNApol II SOBRE EL PROMOTOR
1. Unión del factor TFIID al compartimento TATA. 2. Unión consecutiva de los factores TFIIA, IIB al compartimento TATA. 3. Reclutamiento de RNApol II unida a TFIIF. 4. Formación del complejo cerrado de transcripción mediante la unión de TFIIE y de TFIIH.

In vivo, el Inicio de la Transcripción requiere proteínas adicionales

Figura 1: La maquinaria transcripcional de levaduras El esquema representa la región del inicio del gen (línea negra). El promotor (flecha negra) recluta factores generales de transcripción (GTFs, óvalos rosas). El complejo mediador (óvalos celestes, rojos y amarillos) actúa de puente entre los coactivadores que recluta el enhancer (óvalos verdes) y los GTFs. Esto permite a la RNA polimerasa II reconocer a la región promotora del gen e iniciar la transcripción. Adaptado de (1).

En eucariotas los nucleosomas reprimen la transcripción de todos los genes. Solo los genes activados son transcritos. Los activadores de la transcripción unidos a sitios cercanos al gen reclutan complejos modificadores y remodelares de los nucleosomas y el complejo mediador, que en conjunto forman el complejo de pre-iniciación.

Iniciación de la transcripción por la RNA pol II
CTD desfosforilado y unido a los mediadores y componentes del Aparato Básico de Transcripción. Tras la apertura del promotor se inicia la transcripción.

Apertura del promotor
TFIIH

 Abre la doble helice (helicasa)  Fosforila CTD (quinasa)  Promueve la separación de la RNApol del promotor para iniciar la transcripción

La fosforilación del CTD promueve la separación de la RNApol II del promotor. La elongación del RNA naciente continua.

Fosforilación de CTD

CTD (dominio carboxi terminal) constituido por repeticiones en támden (mamíferos 52 repeticiones) de la secuencia consenso heptapéptica (tyr-ser-pro-treo-ser-pro-ser ) rica en Ser

Elongación y Terminación de la transcripción por la RNA pol II

Después de la fosforilación del CTD y lejos del promotor, se reclutan los componentes para el splicing del pre-mRNA.

La RNA polimerasa II alcanza las señales de terminación y factores requeridos para el clivaje y poliadenilación.

Factores de elongación
 El TFIIS impide la detención (suspensión completa de la elongación).  La elongina, TFIIS, CSB y ELL suprimen la pausa de la RNA polimerasa II, que puede aparecer cuando la enzima transcribe una región donde se pueden formar pares de bases intracatenarios (por ejemplo una horquilla).  El factor de elongación FACT que facilitan la producción de transcritos largos de RNA mediante la modificación de las histonas (H2A y H2B) próximas al promotor.  El Elongator se une a moléculas de RNA polimerasa II con CTDs altamente fosforilados. Es un factor de elongación que contiene actividad histona acetiltransferasa; que podría cambiar el estado de acetilación de las regiones activamente transcritas.

Poliadenilación y terminación

CPSF: Factor de especificidad de poliadenilación y
escisión interactúa con el factor FTIID CstF: Factor estimulante de la escisión PADP: Proteína de unión a poliadenilato

Secuencia de la señal poli(A):

localizada 10 a 30 nt corriente arriba del sitio de poliadenilación Dinucleótido 5’-CA-3’ Región rica en GU

Maduración de los RNA

Maduración de los RNA Ribosómicos y de Transferencia

Eliminación de intrones del pre-mRNA nuclear
El pre-ARN mensajero está formado por secuencias codificantes denominadas exones separados por secuencias no codificantes denominadas intrones.

El proceso de eliminación de los intrones se realiza en el núcleo, mediante un mecanismo muy complejo denominado splicing.

TIPO DE INTRON
Intrones GU-AG Intrones AU-AC Grupo I Grupo II Grupo III Intrones gemelos Intrones de pre-tRNA

LOCALIZACION
Pre-mRNA nuclear eucarionte Pre-mRNA nuclear eucarionte Pre-rRNA nuclear eucarionte, RNA de órganulos, pocos RNA bacterianos RNA de orgánulos, algunos RNA procariontes RNA de orgánulos RNA de orgánulos Pre-tRNA nuclear eucarionte

Intrones GU-AG

Todos los intrones poseen una secuencia interna importante que se denomina centro de ramificación. Esta secuencia se sitúa entre 20 y 50 nucleótidos secuencia arriba del sitio de empalme 3´. Los puntos de corte y empalme se especifican mediante las secuencias situadas en los extremos de los intrones

El grupo 2’-OH de un nucleótido dentro del intrón ataca el enlace fosfodiéster que liga el primer exón con el intrón El grupo 3’-OH libre del exón 1 ataca el enlace fosfodiéster entre el intrón y el exón 2

Complejo de compromiso

Mecanismo de Splicing
Complejo de compromiso inicia una actividad de corte y empalme. Comprende:  U1-snRNP  SF1, U2AF35, U2AF65 Complejo pre-empalmosoma comprende:  El complejo de compromiso  U2-snRNP  La asociación entre U1-snRNP y U2-snRNP acerca el sitio de corte y empalme 5’ al punto de ramificación Empalmosoma se forma cuando se unen U4/U6snRNP y U5-snRNProteína de unión al punto de ramificación

Complejo pre-empalmosoma

Empalmosoma

Proteínas SR, importantes en la elección del sitio de corte y empalme ESE (Potenciadores de corte y empalme exónico), interactúa con SR ESS (Silenciadores de corte y empalme exónico), homólogos a ESE CASP (proteínas de tipo SR asociadas con CTD) SCAF (factores de tipo SR asociados con CTD) Establecen conexión física entre el empalmosoma y el CTD del complejo de transcripción del la RNA pol II, actuándo como eslabón entre la elongación y el procesamiento del transcrito

Mecanismo de Splicing alternativo

Regulación del corte y empalme durante la expresión de genes involucrados en la determinación del sexo de

Drosophila

En machos, el mRNA contiene todos los exones, pero esto implica que se produce una proteína truncada, porque el exón 3 contiene un codón de terminación. En las hembras se saltea el exón 3, lo que da origen a una proteína SXL funcional.

En las hembras, SXL bloque el sitio de corte y empalme 3’ del primer intrón del pre-mRNA de tra. U2AF65 es incapaz de localizar este sitio y, en cambio, dirige el corte y empalme a un sitio críptico del exón 2. Esto da como resultado un mRNA que codifica una proteína TRA funcional. En los machos, no hay SXL, de manera que el sitio de corte de empalme 3’ no resulta bloqueado y se produce un mRNA disfuncional.

Degradación de los RNA Eucariontes
Procesos de Degradación
1. Complejo multiproteico denominado exosoma. Degrada transcritos en dirección 3’  5’ y contiene nucleasas relacionadas con las enzimas del degradosoma. 2. Desencapuchamiento dependiente de desadenilación. Eliminación de cola de poli(A). Escisión de la caperuza 5’ por la enzima Dcp1p. 3. Degradación del RNA mediada por mutaciones terminadoras (NMD) o Vigilancia del mRNA.

Transporte de RNA dentro de la Célula Eucarionte

1. Se movilizan usando los complejos de poros nucleares 2. Proteínas receptoras Carioferinas Exportinas Importinas 3. Necesitan energía, proporcionada por la proteína Ran (GTP en GDP).

Inhibidores de la transcripción
Rifamicina B (Streptomyces
Antibiótico que inhibe la RNA polimerasa procariota pero no la eucariota. Bloquea la elongación por unión a la subunidad  e impide el desalojo del promotor.
mediterranei).Rifampicina (derivado semisintetico).

-Amanitina.

Toxina contenida en la seta Amanita phalloides (octapéptido). Inhibe predominantemente la RNA polimerasa II. Forma con ella un complejo e impide la elongación.

Cordicepina (hongo Cordyceps).

Antibiótico antitumoral terminador de cadena de la transcripción. Se incorpora a la cadena en crecimiento y la detiene, ya que carece del grupo 3‘-OH a partir del cual puede continuar la elongación.

Actinomicina D (Streptomyces).

Se une al DNA de doble hélice de forma específica. Inhibe la transcripción y la replicación. Además de su uso como antibiótico también se usa en carcinoterapia.

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