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Preparacin y tincin de muestras

Fijacin Es el proceso por el cual se preservan y se fijan en una posicin las estructuras internas y externas de los microorganismos. Se inactivan las encimas que podran alterar la morfologa celular y endurece las estructuras de manera que no se alteren durante la tincin y la observacin.

Fijacin por calor: } El frotis se calienta suavemente pasando el portaobjetos por una llama. } Preserva la morfologa global pero no las estructuras intracelulares. } Observacin de Procariotas.

Fijacin qumica:

fijadores penetran en la clula y reaccionan con los componentes celulares para inactivarlos. } Protege las subestructuras celulares finas. } Contienen etanol, acido actico, cloruro de mercurio, formaldehido y glutaraldehido.
} Los

Tincin simple
colorantes contienen grupos cromoforos y se unen a la clula por medio de enlaces inicos, covalentes o hidrfobos. } Tincin negativa: La clula no se tie, solo el fondo.
} Los

Colorantes bsicos: } Se unen a molculas cargadas negativamente (cidos nucleicos, protenas y superficies de procariotas). } Azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta, safranina, verde de malaquita.

Colorantes cidos: } Se unen a estructuras cargadas positivamente. } Eosina, rosa de bengala, fucsina acida.

Tincin diferencial
Tincin de Gram: } Procedimientos que se utilizan para diferenciar organismos en base a sus caractersticas de tincin. } Gram negativos y Gram positivos. Se tie con cristal violeta 2. Aplicar solucin yodada (mordiente) 3. Lavar con acetona o etanol (Gram positivas: retienen el cristal violeta) 4. Aplicar safranina (Tincin de contraste) Gram positivas: Coloracin de rosa a rojo, Gram negativas: Coloracin morado oscuro
1.

Tincin de estructuras especificas de capsula: Revela la presencia de capsulas y redes de polisacridos. } Es una tincin negativa. } Se mesclan las clulas con tinta china o nigrosina y se extiende una capa fina sobre el portaobjetos.
} Tincin

} Tincin

de endosporas (Schaeffer Fulton): Las bacterias se calientan en presencia de verde de malaquita el cual puede penetrar las endosporas, posteriormente se lava con agua y se realiza una tincin de contraste con safranina.

} Tincin

de flagelos: El grosor de los flagelos se incrementa recubrindolos con mordientes (acido tnico y alumbre de potasio) posteriormente de tien con pararosanilina (mtodo de Leifson) o fucsina bsica (mtodo de Gray).

Microscopia electrnica
MET:
} Utiliza

un haz de electrones para iluminar y crear imagen, su longitud de onda es de 0.005nm y es 1000 veces superior que el microscopio ptico. se pueden observa cortes extremadamente finos de 20nm a 100nm.

} Solo

negativa: Acido fosfotungstico o acetato de uranilo, para virus, vacuolas de gas bacterianas. } Sombreado: Capa de platino evaporado sobre la muestra en un Angulo de 45*, el lado cubierto por el metal aparece obscuro. Estudio de virus, flagelos, y DNA. } Crio sublimacin: Se congela en nitrgeno liquido y se mantiene a temperatura de -100 C* en una cmara de vaco, se fractura con una cuchilla a -196 C*, posteriormente de recubre de platino y carbono para formar una replica de la superficie que es analizada en el MET.
} Tincin

MEB:
} Produce

una imagen a partir de los electrones liberados por los tomos de la superficie de un objeto. } Las muestras se recubren con una capa de metal para prevenir cargas elctricas.
} La

muestra se barre con un haz de electrones que es interpretado por un detector. reas elevadas aparecen mas brillantes mientras que las depresiones son oscuras.

} Las