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Coloracion de Gram

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Tinción de Gram

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Tinción de Gram
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.

Metodologia
• • • • Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral. Dejar secar a temperatura ambiente. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) • Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura. • Enjuagar con agua. • Agregar lugol y esperar entre 1 minuto. • Enjuagar con agua. • Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion) • Enjuagar con agua. • Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. • Enjuagar con agua. Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión. Explicación El cristal violeta(colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra liquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.

de

potasio),

el

cual

está

y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de Gram. y el color no se modifica al añadir éste. sirve para realizar la decoloración. y la letra B. La reacción de Gram no es infalible ni constante. por consiguiente.Tinción de Gram 2 presente para solubilizar el yodo. como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas. y el tinte más ligero. puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. aún después de tratarlos con un decolorante. las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas. 3B. En realidad. 2B. y toman el segundo. en la reacción Gram. Los que fijan el violeta. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. B. podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. que se deja actuar durante un lapso determinado. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta. se califican de grampositivos. haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega. por ejemplo. sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Al término del protocolo. La letra R indica matices rojos. etc. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste. después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. fucsina fenicada diluida. Habitualmente es un colorante de color rojo. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo. la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo. Los nombres violeta de metilo 3R. safranina). de los tres grupos. tonos azules. se refieren al número de grupos metilo contenidos. violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. no es crucial para la técnica. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. Una tinción Gram en la que observamos un mezclado de Staphylococcus aureus (Coco Gram positivo) y Escherichia coli (bacilo Gram negative) La safranina puede o no utilizarse. y actúa de mordiente. R. mientras que los Gram negativos sí lo hacen. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración. los mohos se tiñen con cierta irregularidad.. pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. los gránulos de micelios propenden retener el colorante. . Basándonos pues. pardo Bismarck. de gramnegativos. Los organismos Gram positivos no se decoloran. ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente. el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal). El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula. que se deja durante el mismo tiempo que la anterior. mientras que las Gram positivas permanecen azules. En este método de tinción. se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó. y quizá por otras causas. la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo. otros pierden con facilidad el primer tinte. como safranina. 2R.

su efecto. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Libenson y Mcllroy. en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. y. gracias a sus grupos amino y carboxilo. Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo. El mismo microorganismo. esto es. sobre todo. y forma una barrera que la laca no puede atravesar. El alcohol o la acetona empleados para aclarar. De igual manera. • Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad. tratados con mordiente. deducen las siguientes conclusiones: • Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. Por el contrario. • En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos. lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases. y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo. reaccionan con los ácidos. se vuelve gram negativo. los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de . de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar. los microorganismos grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos. • Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez. para invertir la reacción. si sufre daño de la pared por una u otra causa. ese punto no tiene un valor preciso y definido. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular. en general. • El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente: El colorante básico entra al microorganismo. Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros.Tinción de Gram 3 Teorías Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico. han comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular. • Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples. Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. en soluciones ácidas. estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros. sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte. a base de sus datos experimentales. Algunos autores objetan esta teoría. los lípidos de la pared (más abundantes que en las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento. En las células gramnegativas. Como los microorganismos contienen más de una proteína. Según Stern y Stearn. al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en medio alcalino. • Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias. pero es indudable la importancia general de la pared celular. • La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos. consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas. Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram.

Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C. y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona. Sin embargo. flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco. a diferencia de la de los gramnegativos. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal. Enjuague Al transcurrir el minuto. puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar.Tinción de Gram retener el colorante primario y toman negativamente el Gram. teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama). tengamos como producto una espiral en la parte media de la lámina.. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia abajo. como para lograr cubrirla por completo. se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra. son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración. la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona. Para realizar el lavado. se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano. :) Es por eso que las bacterias se visten de colores :) 4 Técnica de la coloración gram Fijar un frotis • Con la ayuda de un mechero. El chorro debe ser un chorro delgado. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas. se recomienda sea al 1% . ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo. proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina. violeta de genciana. La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. dentro de la célula. de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente.. la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. y el libre acceso del disolvente al complejo constituido. hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos. • Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra. • Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra. la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa. parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste esencialmente en la formación. La pared celular de los microorganismos grampositivos. • Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos. azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra. sería prácticamente impermeable al violeta cristal. aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal. de tal forma que al terminar la extensión. por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular. La solución de cristal violeta. • Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa). Tinción Con violeta cristal.

Formas L (pérdida ocasional de la pared). Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. hasta que ya no escurra más líquido azul. Utilidades En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones: • Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección. ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. De esta manera.Tinción de Gram 5 Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación. o agruparse de manera irregular (Estafilococos). Bacterias resistentes a la tinción Gram La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva. respectivamente). hasta que ya no escurra más líquido azul. se aplica como mordiente yodo o lugol durante 3 minuto más. Mycoplasmas (no tienen pared). que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas. se procede a enjuagar la lámina con agua. Tinción de contraste Una vez que la lámina ya secó. formar cadenas (Estreptococos). . procedemos a teñir nuevamente. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente. Si por el contrario. Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared. dejar actuar durante 1 minuto. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada. etanol al 95 %. hasta lograr que éste salga totalmente transparente. • Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante. A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. tiñen como gramnegativas: • • • • Mycobacterias (están encapsuladas). poseen forma de "coma". También pueden distinguirse los espirales. aparecer por pares (Diplococos). pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina. Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos). entonces se los designa vibrios. o curvados. Los bacilos poseen forma alargada. el frotis se decolora con etanol al 75 %. es decir. se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. Decoloración Pasado el minuto de haber actuado el mordiente. acetona o alcohol-acetona.

2° edición. Noel R. Krieg. Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed. Nørgaard M. Por lo tanto. la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada. Martinko J. Sneath (1994). David H. este método debe ser valorado con precaución. Causas que alteran la tinción de Gram • I: Edad de la bacteria. ISBN 0-683-00603-7. no son susceptibles a la acción del solvente orgánico. . Holt. J Clin Microbiol 45: 1113. ISBN 0-13-066271-2. además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática.). al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos. lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo. se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos. Ciencia y diseño de formas farmacéuticas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración. las Gram positivas. como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona.A. ya que la reacción puede variar según la edad de las células y la técnica empleada. fosfolípido y lipopolisacárido. "First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". Elsevier España. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed. La membrana exterior está hecha de proteína. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente. sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos. y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. • Bergey. • III: Uso de antibióticos A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. • Søgaard M.. Lippincott Williams & Wilkins. Peter H. • Madigan. se encuentra el ácido lipoteicoico. La clave es el peptidoglicano.). MT. Ed. por ella junto a la muestra deben teñirse controles con grampositivas y gramnegativas. Fuentes Bibliografía • Aulton Michael E. Schønheyder H (2007). Pero por el contrario.. ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína) Por el contrario. 2004. y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. perdiéndose la coloración azul-violácea. y más en la superficie. y manteniendo la coloración azul-violácea.Tinción de Gram 6 Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano. Lippincott Williams & Wilkins. y por lo tanto este complejo se escapa. John G. • II: Errores del operador. ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana.

Eloy.wikipedia.jpg  Licencia: GNU Free Documentation License  Contribuyentes: Y tambe Licencia Creative Commons Attribution-Share Alike 3. Natrix. Rosarinagazo.jpg  Fuente: http://es. Maldoror.0/ . José M. Huhsunqu.jpg  Fuente: http://es.wikipedia. Camilo. Javicaci. Laura Fiorucci. Erodrigufer. Victorhugorandon. Angel GN. Roberpl.jpg  Licencia: GNU Free Documentation License  Contribuyentes: Y_tambe Archivo:Clostridium perfringens. Snakeyes.php?oldid=49657749  Contribuyentes: Aleator. Fernando Estel. El Moska. Folkvanger. Ascánder. Díaz Espiñeira. Manwë. Maleiva. CaStarCo.php?title=Archivo:Clostridium_perfringens. Ppefelipe.php?title=Archivo:Escherichia_coli_Gram. Gurgut. Neodop.org/w/index. Tirithel. Rickynoram. Kojie. Deft. BlueMonday.org/w/index.php?title=Archivo:Gram_Stain_Anthrax. Qwertyytrewqqwerty. Karina Téllez. Xvazquez. Spirit-Black-Wikipedista.php?title=Archivo:Gram_stain_01. Manuelt15. Diegusjaimes. Eduardozazueta.0 Unported //creativecommons. Vitamine. Ramjar.jpg  Fuente: http://es. Fran4004.jpg  Licencia: Public Domain  Contribuyentes: Content Providers(s): CDC/Don Stalons Image:Gram Stain Anthrax. Maulucioni. 189 ediciones anónimas Fuentes de imagen. Licencias y contribuyentes Archivo:Escherichia coli Gram. Humberto. Javierito92. Wilfredor.org/w/index. Alhen. Pedro Felipe. TheSensei. Netito777.jpg  Fuente: http://es. HUB.prox08.Fuentes y contribuyentes del artículo 7 Fuentes y contribuyentes del artículo Tinción de Gram  Fuente: http://es.wikipedia. RoyFocker.mon.org/w/index.org/licenses/by-sa/3. EKhan.wikipedia.org/w/index. Omega. Muro de Aguas. Diego 5397. MiguelAngel fotografo. Roto2esdios. Santiperez.jpg  Licencia: Public Domain  Contribuyentes: Image:Gram stain 01. SuperNeuronas. Riosortiz.wikipedia. Matdrodes.

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