Deteccin de Salmonella en alimentos

Aguirre Coria Claudia Corona Leo Lizbeth Sandra Olvera Rodrguez Carlos Flores Jurez Geovani Espinosa Monsalvo Maribel

Objetivo:
Conocer las tcnicas ms comunes para la deteccin de estos microorganismos patgenos.

Medios que se utilizaran:

Agua peptonada. Caldo lisina desoxicolato XLD. Agar verde Rapapport Vassiliadis. Agar xilosa brillante.

Medios para la identificacin bioqumica.

Agar triple azcar hierro TSI. Agar lisina descarboxilasada LIA. Agar citrato de Simmons. Caldo urea.

Procedimiento

1.-Preenriquecimiento:
Transferir 25g o 25ml del matraz con 225ml de agua peptonada, incubar a 35 C durante 24 h. Agua peptonada Asegura a mantener el pH durante 24horas, lo que sumado al perodo de incubacin permite el incremento de clulas que son sensibles a la disminucin del pH. A stos medios se les puede adicionar sustancias que contrarresten las sustancias inhibidoras que estn presentes en algunos alimentos; asimismo se debe asegurar el pH que es un factor muy importante para el crecimiento de Salmonella.

2.-Enriquecimiento:
Transferir 0.1ml del cultivo anterior a un tubo con 9.9ml de caldo Rapapport Vassiliadis. Incubar 24 h a 42 C. Caldo Rapapport Vassiliadis Las peptonas proporcionan los nutrientes necesarios para el desarrollo del microorganismo. El cloruro de sodio ayuda a mantener el equilibrio osmtico. El verde de malaquita y el cloruro de magnesio, favorecen el crecimiento de Samonella. El fosfato de potasio controla el pH del medio.

3.- Aislamiento:
Sembrar por estra simple dos placas de agar XLD Y BGA. Incubar 24 h a 37 C.

Precipitado negro en el centro de las colonias agar XLD

Las colonias tpicas de Salmonella son traslcidas, ligeramente rojas a rosa con halo rojo brillante.

Agar xilosa lisina desoxicolato XLD

La presencia del desoxicolato de sodio es el agente que inhibe a los microorganismos Gram positivos. La xilosa es fermentada por casi todos los microorganismos entricos a excepcin de Shigella. La lactosa y la sacarosa inducen la produccin de cido por los coliformes. El tiosulfato de sodio y el citrato frrico de amonio constituyen el sistema indicador de la formacin de cido sulfhdrico produciendo un precipitado negro en el centro de las colonias. Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter y algunas especies Proteus pueden utilizar mas de un carbohidrato y producen colonias amarillo brillante. El gnero Salmonella desarrolla colonias rojas con centro negro por la produccin de cido sulfhdrico. Shigella, Providencia, y algunas especies Proteus no utilizan ningn carbohidrato y desarrollan colonias traslucidas. Citrobacter desarrollas colonias amarillas con centro negro.

Agar verde brillante BGA

Medio selectivo para el aislamiento de Salmonella (excepto S. Tyfhi y Shigella) La selectividad de este medio, se basa en la concentracin del verde brillante, que inhibe las bacterias Gram positivas y la gran mayora de los Gram negativos. La lactosa y la sacarosa permiten diferencia la flora acompaante lactosa positiva y lactosa negativa-sacarosa positiva, basndose en caractersticas de Salmonella de no degradar dichos carbohidratos. Las colonias tpicas de Salmonella son traslcidas, ligeramente rojas a rosa con halo rojo brillante. Los organismos fermentadores de lactosa y sacarosa que desarrollan en el medio se diferencian fcilmente por la formacin de colonias amarillo verdosas rodeadas de una zona amarillo verdosa intensa.

4.- Identificacin bioqumica:

Seleccionar al menos 2 colonias tpicas sospechosas que se encuentren bien aisladas de cada placa. Transferir con un asa cada colonia seleccionada a la siguiente serie de tubos. Agar TSI: Sembrar por picadura en el fondo y por estra en la superficie. Agar LIA: Sembrar por picadura en el fondo y por estra en la superficie. Agar Citrato de Simmons: Sembrar por picadura el fondo y por estra el la superficie. Caldo urea: Inocular el caldo.

Incubar todos los tubos de pruebas bioqumicas a 35o C por 24 h. comprobar los resultados de las pruebas con la tabla de resultados de los microorganismos enteropatgenos.

Agar triple azcar de hierro TSI Para diferenciacin de Enterobacterias basndose en las capacidad para utilizar la glucosa, lactosa y sacarosa los cual permite el reconocimiento y exclusin del genero Proteus. Se puede observar formacin de sulfuros. La fermentacin de la lactosa y sacarosa se observa en la superficie y de la glucosa en el fondo, con formacin de cido que se manifiesta por cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo. La combinacin del citrato frrico de amonio y tiosulfato de amonio permite la deteccin de sulfuro de hidrogeno por la formacin de un precipitado negro.

Agar lisina descarboxilasa LIA

La peptona de gelatina funciona como soporte de crecimiento, el extracto de levadura proporciona la fuente de vitaminas necesarias y la dextrosa el carbohidrato fermentable. En este medio se observa la fermentacin de glucosa, produccin de cido sulfhdrico, la descarboxilacin u desaminacin de la lisina. Los microorganismos tienen enzima descarboxilasa, descarboxilan el aminocido lisina a cadaverina (amina primaria, liberando CO2) , debido a la alcalinidad, el pH se modifica con los siguientes resultados: La prueba se considera POSITIVA si la coloracin en el fondo se observa morada o violeta-prpura. NEGATIVA si la coloracin en el fondo es amarilla y la superficie permanece del color del medio, ya que solo hay fermentacin de glucosa. La desaminacin de la lisina a cido cetocarbnico, este forma compuestos pardo-rojizos en el pico de flauta del medio con la sal de hierro y por la accin del oxigeno. La formacin del cido sulfhdrico da una coloracin negra debida al sulfuro de hierro producido.

Agar Citrato de Simmons

Para la identificacin de Enterobacterias, basndose en el citrato como nica fuente de carbono. El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmtico del medio. Cuando las bacterias utilizan el citrato, el medio se alcaliniza y cambia de color inicial verde (neutro), que esta dado por la presencia de azul de bromotimol a color azul (alcalino, prueba positiva) La reaccin negativa se manifiesta por la ausencia de crecimiento y no hay cambio de color.

Caldo urea
Utilizacin de urea como fuente de carbono. La enzima ureasa hidroliza la urea en amoniaco y anhdrido carbnico, ante la variacin del pH por la alcalinizacin el indicador Rojo Fenol, vira de amarillo claro a ligeramente rosado o rosa mexicano. Se utiliza solamente para la deteccin de la ureasa en especies del gnero Proteus. Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes que la bacteria muestre crecimiento no podr determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar urea. Pero si es capaz de hidrolizar la urea, pero no utilizar el amoniaco como fuente de nitrgeno, no se produce crecimiento y puede dar un falso negativo.

Caldo Rapapport Vassiliadis

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

Cloruro de magnesio hexahidratado. Peptona de casena. Cloruro de sodio. Peptona de soya. Fosfato monobsico. Verde de malaquita.

29.0 4.0 8.0 1.0 0.4 0.036

Agar xilosa lisina desoxicolato XLD

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

Agar. 13.5 Citrato frrico. 0.8 Cloruro de sodio. 5.0 Desoxicolato de Na. 2.5 Extracto de levadura 3.0 Lactosa. 7.5

L-Lisina. Rojo fenol. Sacarosa. Tiosulfato de Na. Xilosa.

5.0 0.085 7.5 6.8 3.5

Agar verde brillante BGA

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

Agar. 20.0 Cloruro de Na. 5.0 Extracto de carne.3.0 Lactosa. 10.0

Peptona especial. Rojo de fenol. Sacarosa. Verde brillante.

10.0 0.08 10.0 0.0125

Agar triple azcar de hierro TSI

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

13.0 Agar. Cloruro de Na. 5.0 Dextrosa. 1.0 Lactosa. 10.0 Peptona especial. 20.0

Rojo de fenol. 0.025 Sacarosa. 10.0 Sulfato de hierro y 0.2 amonio. Tiosulfato de Na. 0.2

Agar lisina descarboxilasa LIA

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

Agar. 13.5 Citrato frrico de amonio. 0.5 Dextrosa. 1.0 Extracto de levadura. 3.0 L-Lisina. 10.0 Peptona de gelatina. 5.0 Prpura de bromocresol. 0.02 Tiosulfato de Na. 0.04

Agar Citrato de Simmons

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

Agar. Azul de bromotimol. Citrato de Na. Cloruro de Na. Fosfato dihidrogenado de amonio. Fosfato dipotsico. Sulfato de magnesio.

15.0 0.08 2.0 5.0 1.0 1.0 0.2

Caldo urea
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

Extracto de levadura. Fosfato monopotsico. Fosfato disdico. Rojo de fenol. Urea.

0.10 9.10 9.50 0.01 20.0