UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS CITOGENTICA

MANUAL DE PRCTICAS DE CITOGENETICA COMPILADORES: Principal: Guillermo Bojrquez Rangel, Colaboradores: Nayeli Vera Ramrez y Margarita Carrillo Saucedo

Ciudad Jurez, Chihuahua Universidad Autnoma de Ciudad Jurez 2011 68 p.

M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa

Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas

M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011

INDICE PRCTICA 1......................................................................................................... Anlisis de la heterocromatina en clulas epiteliales de la mucosa oral y microncleos ...................................................................................................... 5 PRCTICA 2......................................................................................................... Anlisis de microncleos en clulas epiteliales de la mucosa oral de fumadores y no fumadores ................................................................................................... 10 PRCTICA 3......................................................................................................... Observacin de dao gentico en clulas de habas 16 PRCTICA 4......................................................................................................... Nucleo y Heterocromatina .20 PRACTICA 5. Mitosis26. PRCTICA 6......................................................................................................... Meiosis ............................................................................................................. 35 PRCTICA 7 ........................................................................................................ Obtencin de Cromosomas mediante cultivo de linfocitods humanos ............. 36 PRCTICA 8 ........................................................................................................ Cariotipo I ......................................................................................................... 45 PRCTICA 9 ...................................................................................................... Tcnicas de bandeo cromosmico .................................................................. 53 PRACTICA 10....................................................................................................... Electrofresis Unicelular.. ................................................................................... 57 PRACTICA 11......................................................................................................
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Cultivo de linfocitos y observacion de mitosis (parte 2).. .................................. 64 PRACTICA 12....................................................................................................... Cromosomas Politnicos.. ................................................................................ 71

PRCTICA 1 OBSERVACION DE CLULAS EPITELIALES DE LA MUCOSA ORAL Y MICRONCLEOS

Introduccin: Los microncleos representan pequeos fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que no segregaron adecuadamente, quedando varados para posteriormente formar su propia membrana nuclear y posicionarse dentro

del citoplasma y guardando propiedades similares a las del ncleo principal. Se han reconocido como un producto de dao gentico y han sido utilizados como una prueba de monitoreo de dao gentico en una amplia gama de clulas y organismos. La utilizacin de clulas epiteliales de la mucosa oral como biomarcador de riesgo gentico visualizando microncleos ha sido bien documentada desde los aos ochenta. Luego de varios estudios, los investigadores postularon que este sistema puede ser utilizado para el estudio de efectos genotxicos. Esta prueba es un mtodo no invasivo, fcil de realizar adems de su bajo costo, lo que permite llevar a cabo estos estudios en distintas especies incluyendo plantas y animales.

Objetivo: Que el estudiante conozca y lleve a cabo preparaciones mucosa oral. Que el estudiante reconozca y se familiarice con la identificacin de microde clulas de la

ncleos en clulas de descamacin bucal.

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Materiales: Clulas de la mucosa oral Hisopos estriles Porta objetos cubreobjetos y Cajas de Couple Pinzas Mechero alcohol Etiquetas de Cerillos Colorante de Giemsa Solucin de Acido Actico-Metanol (1:3)

Procedimiento 1. Antes de tomar la muestra, la persona deber enjuagarse la boca 2 veces con agua. 2. Con un asa cubierta de algodn estril, se realiza un raspado en la parte interior de cada una de las mejillas. 3. Las clulas colectadas de cada mejilla, se frotarn suavemente sobre los portaobjetos, una por cada portaobjetos. Se etiquetan los portaobjetos. 4. El material colectado se fija en una solucin de cido actico-metanol (1:3) colocada en una caja de couple y se seca a la flama en un mechero de alcohol metlico. 5. Una vez secadas las preparaciones se tien durante 8 minutos con colorante de Giemsa. ANLISIS DE LAS MUESTRAS 1. Teidas las muestras se coloca el cubreobjetos y se observan al microscopio para conocer su morfologa.

2. Una vez familiarizados con la morfologa de estas clulas, se procede a hacer un conteo rpido de 100 clulas anotndose en un cuadro la presencia de clulas con uno, dos, tres o ms microncleos. CRITERIOS PARA EVALUAR MICRONCLEOS a. La tincin tanto del ncleo principal como en los microncleos es del mismo color. b. Los bordes estn claramente definidos, indicando la presencia de una membrana nuclear. c. Los objetos son redondos y separados del ncleo principal. d. Tanto los microncleos como el mismo plano ptico. e. Los microncleos estn contenidos dentro del citoplasma del ncleo principal. Actividades: 1.- Una vez teida y colocada la laminilla al microscopio, identificar clulas, dibujarlas y fotografiarlas. ncleo principal se encuentran en el

2.- Identificar microncleos bajo los criterios indicados, dibujarlos, fotografiarlos y comentar en observaciones los problemas asociados a su identificacin.
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Observaciones_____________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _____________________________________________________ RESULTADOS:

PRCTICA 2 OBSERVACION DE CLULAS EPITELIALES DE LA MUCOSA ORAL EN PERSONAS FUMADORAS Y NO FUMADORAS

Introduccin El anlisis de microncleos es una prueba utilizada extensamente para el monitoreo de dao gentico en una amplia gama de clulas animales y vegetales. Agencias como la EPA, (Enviromental Protection Agency) de los Estados Unidos utilizan algunas variantes de esta tcnica con fines de evaluar el potencial mutagnico de diversas sustancias qumicas incluyendo cosmticos, frmacos, solvente. Adems se han utilizado para monitorear personas expuestas a contaminantes ambientales como pesticidas, hidrocarburos (trabajadores de gasolineras), metales pesados entre otros. Especies vegetales son tambin utilizadas para investigar el potencial muta- gnico de aguas y suelos contaminados. Poblaciones con estilos de vida que potencializan dao gentico como fumadores y bebedores frecuentes, tienden a incrementar la frecuencia de este tipo de alteraciones con los consiguientes riesgos a la salud. El hbito de fumar sigue siendo una prctica frecuente entre jvenes y adultos, y las clulas de la mucosa oral son las directamente expuestas a los productos de combustin del tabaco, por lo que en ocasiones es comn ver incrementado la frecuencia de microncleos en personas fumadoras y por lo tanto representa una buena aproximacin para enfrentar los problemas tcnicos que este tipo de
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estudios representa. Por otro lado se crea conciencia entre fumadores de los sujetos de estudio (fumadores voluntarios informados) de los riesgos que implican ciertos hbitos. Objetivo: Que el estudiante conozca los procedimientos de consentimiento informado y su importancia en la realizacin de trabajos de monitoreo de dao gentico en personas expuestas al huma de cigarro. El estudiante realizar un anlisis de la frecuencia de microncleos en clulas del epitelio bucal entre fumadores y no fumadores, siguiendo los pasos cientfico y elaborara sus propias conclusiones. del mtodo

Materiales: Clulas de la mucosa oral de personas fumadoras Hisopos estriles Porta objetos y cubreobjetos

Cajas de Couple Pinzas

Cerillos Colorante de Giemsa

Etiquetas Mechero de alcohol Solucin de Acido Actico-Metanol (1:3)

Procedimientos: 1. Se seleccionaran 10 individuos fumadores y no fumadores para el estudio, siguiendo los criterios explicados por el conductor del laboratorio y se les informara del tipo de estudio, de los anlisis que se realizaran y mostraran conformidad en mismo de acuerdo a los procedimientos para tal fin.

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2. Se tomarn muestras de la mucosa oral de acuerdo al protocolo seguido en la prctica anterior, una vez tomadas las muestras se analizarn al microscopo. 3. Se contaran 500 clulas para cada individuo muestreado y se anotarn los datos en las tablas de resultados. 4. Se obtendrn las frecuencias de clulas con microncleos y se contrastaran los resultados utilizando pruebas estadsticas adecuadas.

Resultados: 1. Completa la tabla # de # Individuo 1 2

clulas

que Total de Clulas Frecuencia de con MN Mas MN

presentaron: 3 4 5

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Control (1)

Control (2)

Fumador Moderado

Fumador Moderado

Fumador Excesivo

Fumador Excesivo

2. Realiza un histograma de frecuencias de los resultados obtenidos y realiza la estadstica descriptiva bsica (medias, variazas, errores estndar, etc.). 3. Elaborar una grfica donde se muestre el promedio del nmero de clulas que presentaron 1, 2, 3, 4, 5 o mas de 5 MN para cada grupo de estudio.

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4. Escoge imgenes que muestren la presencia de microncleos en clulas de la mucosa oral de los diferentes grupos estudiados. Preguntas: 1. Qu grupo de estudio obtuvo la mayor frecuencia de microncleos? A qu crees que se deba este resultado? 2. Cul grupo de estudio obtuvo clulas con un nmero MAYOR de microncleos? Por qu crees que esto es posible? 3. Cul grupo de estudio obtuvo clulas con un nmero MENOR de microncleos? Por qu crees que esto es posible? 4. Cul es el mecanismo que hace que las clulas presenten mas de 3 microncleos?

Conclusiones: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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PRCTICA 3 OBSERVACIN DE DAO GENTICO EN CLULAS DE HABAS

Introduccin Dentro del campo de la mutagnesis ambiental se han desarrollado diversos sistemas de monitoreo mediante la utilizacin de bioindicadores que permiten evaluar los riesgos de contaminantes ambientales sobre la informacin gentica de los organismos vivos. Las habas (Vicia faba), entre otras especies de plantas, ha sido muy utilizada para tales fines debido a que es una organismo que permite obtener meristemos radiculares en cortos tiempos, pueden ser mantenidos en espacios pequeos a bajo costo y son fciles de trabajar para la observacin de clulas en divisin, posee poco y grandes cromosomas y por lo tanto permite visualizar danos asociados a material gentico con relativa facilidad. Entre las alteraciones citogenticas que se pueden evaluar en clulas de raz de habas expuestas a contaminantes se encuentran alteraciones en el ndice, la formacin de microncleos y la presencia de mitosis atpicas. Debido a lo anterior es posible realizar experimentos a corto plazo donde se ponga a prueba el potencial mutagnico o gentxico de un gran nmero de sustancias qumicas como pesticidas, frmacos y cosmticos, entre otras muchas.

Objetivo: Que el estudiante observe, reconozca qumicos en distintas y analice de la daos asociados mitosis en a

contaminantes

etapas

clulas

meristemticas de habas (Vicia faba).

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Materiales: Microscopio Races frescas de cebolla Navaja

Mechero de alcohol Pinzas de relojero Orcena A

Cerillos Tijeras Lpiz con goma

Procedimientos 1. Con una semana de anticipacin poner en una caja de petri algodn

humedecido con agua y colocar semillas desinfectadas de habas. Colocar el recipiente en un lugar templado y oscuro. 2 Una vez que aparezcan las raicillas (3 o 4 das), agregar dentro de la caja de petri una sustancia de su eleccin con sospecha de ser daino al genoma y dejar que crezcan uno o dos das mas. 3 Con ayuda de unas tijeras cortar 1 cm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj. 4 Previamente, el vidrio de reloj deber ser llenado con orcena A. 5 Con ayuda de las pinzas, tomar el vidrio de reloj y calentar suavemente a la llama del mechero de 6 a 8 minutos, evitando la ebullicin, hasta la emisin de vapores tenues. 6 Pasado el tiempo, con ayuda de las pinzas de relojero tomar el pice o extremo de las raicillas y colocarla en un portaobjetos. 7 Una vez en el portaobjetos cortar, con la navaja, solo la punta (1 a 3 mm) de la raz. Desechar la raz sobrante. 8 Colocar encima del pice de la raz un cubreobjetos.
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9 Envolver la preparacin con una servilleta y con mucho cuidado con la goma del lpiz ejercer presin hasta disgregar el tejido. 10 Observar al microscopio. Resultados: 1. Elabora un esquema de las diferentes fases de la mitosis bajo condiciones normales
Profase Prometafase Metafase Anafase Telofase

2. Toma fotografas de campos en los que se observe claramente los diversos estados de la mitosis.

3. Realiza esquemas de los diferentes tipos de alteraciones que observes en relacin al estado normal que deben guardar cada fase de la mitosis.

4. Realiza un anlisis de microncleos en los diversos experimentos que hayas llevado a cabo. 5. Realiza los procedimientos estadsticos bsicos y concluye.

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Resultados

Conclusiones __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________________________________________ Bibliografa consultada

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PRCTICA 4 NCLEO Y HETEROCROMATINA

Introduccin El ncleo de las clulas contiene tres componentes principales que incluyen al ADN, el ARN y las protenas. Dentro de esta estructura los tres elementos presentan un comportamiento complejo y al observarlo al microscopio ptico teido con colorantes convencionales podemos reconocer una cromatina con caractersticas diferentes en donde se distinguen claramente la fraccin eucromtica y la heterocromatina propiamente dicha. Esta ltima se divide en dos tipos diferentes: la heterocromatina propiamente dicha y la heterocromatina facultativa (parte importante representada por la cosntitutiva) y la otra formada por la heterocromatina facultativa. La primera se encuentra distribuida a lo largo y ancho del nucle formando las tpicas regiones heteropicnoticas del ncleo y la segunda constituye un pequeo punto intensamente heterocromatica,

frecuentemente observado en la periferia nuclear y la cual representa un cromosoma X inactivado de acuerdo a los principios de la hiptesis de Lyon. En linfocitos humanos la heterocromatina facultativa ha sido reconocida y como un pequeo fragmento con frecuencia esfrico con frecuencia separado del ncleo principal a manera de un palillo de tambor que se ha denominado corpsculo de Barr en honor a su descubridor. La heterocromatina constituye una fraccin del genoma que se encuentra inactivada como producto de fenmenos naturales, pero frecuentemente un incremento en la heterocromatizacin es el resultado de alteraciones de la
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informacin gentica, por lo que distinguir estados normales de aquellos que han sido alterados (ncleos carriorcticos o reticulados, clulas apotticas o necrticas) es de gran utilidad en el anlisis citogentico. Objetivos Que el alumno observe y reconozca la evidencia citolgica de la presencia a heterocromatina constitutiva y facultativa as como estados alterados del nucleo incluyendo carriorexis, nucleos reticulados clulas apoptticas y necrticas en preparaciones de clulas de descamacin de la mucosa oral y en linfocitos de sangre perifrica tratados con frmacos y luz ultravioleta. Que el alumno entienda los procesos que resultan en la formacin de diferentes tipos de la heterocromatina y otros estados que puede presentar el ncleo eucariota. Que el alumno entienda las manifestaciones fenotpicas de la inactivacin del cromosoma X Que el alumno describa la relacin entre el nmero de cromosomas X presentes en el genoma y la heterocromatina del cromosoma Y Materiales Abatelenguas o hisopo Papel absorbente estril Portaobjetos Cubreobjetos Vasos de plstico Mechero Solucin aceto-orceina Giemsa, 2% o Microscopio ptico Material biolgico:

clulas del epitelio de descamacin mucosa perifrica oral. de la

Sangre

acetocarmin al 2% Aceite de inmersin

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Procedimiento Preparacin de clulas de la mucosa oral 1.-Enjuagarse la boca repetidas veces con agua potable y con un isopo previamente humedecido con agua, raspar cuidadosamente la parte interna de la mejilla. 2.-Hacer un frotis del raspado sobre un portaobjetos 3. Exponer las clulas a luz ultravioleta por periodos de 5, 10 y 15 min. 4.- Posteriormente fijar al calor cuidando no sobrecalentar. 5.- agregar giemsa preparado al 2% en solucin amortiguadora de sorensen y teir durante 8-12 minutos. 6.- posteriormente eliminar el colorante con agua destilada y secar al aire. 7.-Observar al microscopio ptico con el objetivo de 10x hasta encontrar un campo en donde se localicen clulas. Observar despus de 40x y finalmente a 100x usando aceite de inmersin para identificar el corpsculo de Barr el cual se aprecia como una mancha obscura adherida a la membrana nuclear que se tie ms intensamente. Preparacin del frotis sanguneo 1.- Desinfectar el dedo anular frotando alcohol etlico con una gasa y dejar secar. 2.-con una lanceta pinchar el dedo para la obtencin de la muestra de sangre. 3.-Eliminar la primera gota de sangre y la segunda colocarla en el extremo de un portaobjetos perfectamente limpio. 4.-realizar el frotis sanguneo desplazando la muestra de sangre

homogneamente sobre el portaobjetos. 5.- proceder de acuerdo a los pasos del 3 al 7 del procedimiento anterior.
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Bibliografa Peguero, J. cromosoma X Pontifica Universidad Catlica Madre y Maestra (http://www.pucmmsti.edu.do/cienciasfisiologicas. Febrero de 2009) Rodrguez, A. R., et al. Manual de prcticas de gentica y cuaderno de trabajo.UNAM. 2005 Actividades 1. Localiza y dibuja el ncleo de las clulas de acuerdo a sus propiedades en relacin a la tincin que adopta en cada uno de los siguientes estados:
H. facultativa H. cosntitutiva Apoptosis Necrosis

N. reticulado

N. carriorxico

Microncleos

Celulas binucleadas

2. Toma fotografas y reportalas sealando a que corresponde cada situacin.

Resultados

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Cuestionario 1. Define los conceptos de heterocromatina constitutiva y heterocromatina facultativa?

2. Qu diferencias se observan entre perifrica?

clulas de la mucosa oral y sangre

2. En qu fase del ciclo celular son visibles los corpsculos de Barr?

3. Qu diferencias morfolgicas existen entre apotosis y necrosis? 4. Qu diferencias hay entre ncleos carriorxicos y y reticulados importante enjuagarse la boca antes de tomar la muestra?

5. Explicar el mecanismo de inactivacin de un cromosoma X

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9. Cuntos corpsculos de Barr esperara encontrar en los siguientes organismos? Condicin gentica XY XX XXX XO XXXY XXXX XXY # de corpsculos de Barr por clula

Conclusiones

Bibliografa consultada.

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PRCTICA 5 MITOSIS
Introduccin La mitosis es un proceso biolgico en el que una clula eucariota

origina otras dos que son cuantitativa y cualitativamente iguales y por lo tanto la informacin gentica contenida en sus cromosomas se conserva. El fenmeno de la mitosis ha sido objeto de estudio desde finales del siglo XVIII y en la actualidad sigue siendo de inters para muchos investigadores, debido a que, a pesar de el desarrollo de la biologia molecular, persisten muchas dudas sobre el fenomeno. Por otro lado el anlisis de la mitosis permite hacer inferencias sobre los efectos que el ambiente tiene sobre este proceso. Es asi que se han convertido en herramientas de estudio para evaluar los efectos mutagnicos o genotxicos de las sustancias quimicas, fsicas o bilogicas que se encuentran en el medio. Tradicionalmente la mitosis ha sido dividido en cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase, sin embargo no es un proceso esttico, sino contino y que puede ser observado con relativa facilidad en clulas vegetales, sobre todo en tejidos proliferativos como las races o en los meristemos apicales. Especies

como la cebolla y las habas presentan pocos cromosomas y muy grandes, los que los hace los objetos preferidos para observar y analizar el fenmeno de la mitosis. En animales es mucho mas complicado y no existen procedimientos lo suficientemente prcticos para su visualizacin.

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Objetivos Que el alumno comprenda la importancia gentica de la mitosis Que el alumno observe las diferentes y diferencie las diferentes etapas de la mitosis Que el alumno reconozca la importancia de la determinacin del ndice mittico para fines prcticos en el cultivo de clulas y estudios de genotoxicidad.

Materiales portaobjetos cubreobjetos lpiz con goma mechero de alcohol navaja de bistur pinzas tijeras recipientes de vidrio o tubos homeopticos papel secante vidrio de reloj Aceite de inmersin Alcohol etlico Barniz transparente Aceto-orceina 2% Acido actico al 45% Acido clorhdrico 1N de uas Fijador de Carnoy (3 partes de metanol: 1 parte de acido actico) Microscopio compuesto Material Races de biolgico: cebolla

(Allium cepa) Races de ajo (Allium sativum)

Procedimiento 1.-Germinar las races de cebolla y los bulbos de ajo. Para el crecimiento de las races, colocar los bulbos en tubos o frascos con agua de la llave, evitando que las races toquen el agua, de esta manera crecern ms rpido. Dejar que las races crezcan durante tres das.

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2.-Posteriormente cortar aproximadamente 1 cm de las races y colocarlas en un vidrio de reloj con aceto-orceina 2%, y con cuidado pasarlas al fuego de una lmpara de alcohol para realizar la hidrlisis durante 15 minutos. Evite que se seque el colorante agregando cuanto sea necesario. 3.-Transcurridos 15 minutos colocar cada raz en un portaobjetos y con la ayuda de las agujas de diseccin desprenda las capas de clulas de la raz, cuide de no eliminar los primeros dos milmetros del extremo de la raz (que corresponde a la regin meristematica). 4.-finalmente coloque el cubreobjetos y realice el extendido de las clulas

(squash) con la finalidad de obtener una sola capa para facilitar la revisin al microscopio. Para esto las preparaciones se colocan en una superficie plana y con ayuda de un lpiz nuevo, golpee el cubreobjetos en forma de espiral. Sellar las preparaciones con barniz de uas transparente. 5.-Observar al microscopio ptico a un aumento de 10X para localizar las zonas que contienen clulas en mitosis. El anlisis se realiza a 100X, cuantificando el nmero de clulas en mitosis

Bibliografa Peguero, J. cromosoma X Pontifica Universidad Catlica Madre y Maestra

(http://www.pucmmsti.edu.do/cienciasfisiologicas. Febrero de 2009) Rodrguez, A. R., et al. Manual de prcticas de gentica y cuaderno de trabajo. UNAM. 2005 Resultados Observe y dibuj las diferentes fases de mitosis (profase, anafase, metafase, telofase) en ajo y cebolla anotando de qu fase se trata.

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Llenar el siguiente cuadro indicando el nmero de clulas que estn en cada fase y calcular el ndice mittico.

Fase Interface Profase Metafase Anafase Telofase

No. de clulas

Cuestionario 1. Por qu es importante determinar el ndice mittico?

2. Qu diferencias existen entre la eucromatina y la heterocromatina?

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3. Para cada uno de los eventos descritos abajo describir el nombre del evento en la lnea en blanco y ordnalos cronolgicamente. Nombre evento El citoplasma se divide y el contenido celular se separa en dos clulas Los cromosomas se alinean a lo largo de la placa ecuatorial de la clula. Ocurre la replicacin de los cromosomas La migracin de las cromatidas, hermanas a los polos se completa. Los cromosomas y replicados a ser comienzan visibles bajo a el del Orden evento del

condensarse microscopio

llegan

Las cromatidas hermanas migran hacia los polos de la clula. Conclusiones

Bibliografa consultada

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PRCTICA 6 MEIOSIS
La meiosis es un mecanismo de divisin celular, caracterizado por la presencia de dos divisiones consecutivas que tiene como objetivo reducir del nmero de cromosomas, asi como establecer reestructuraciones en los cromosomas homlogos mediante la recombinacin gentica que es la responsable de generar nuevas combinaciones de secuencias y se presenta en clulas sexuales durante la formacin de los gametos. La primera divisin, es reduccional y la segunda se dice es una divisin ecuacional al final de el proceso y a diferencia de la mitosis la meiosis produce cuatro clulas hijas cualitativa y cuantitativamente diferentes de la clulas progenitora. Es decir que al final se obtienen cuatro gametos con la mitad del nmero de cromosomas. Las fases de la meiosis I se denomina profase I, metafase I, anafase I y Telofase I. La profase I es la fase ms larga, en ella se da la recombinacin y la reduccin de el estado diploide a haploide y consta de varias subfases: leptoteno, cigoteno, paquiteno, dipliteno y diacinesis Objetivos Observar e identificar las diferentes fases de la meiosis en clulas de grillos y roedores.

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Materiales Portaobjetos Cubreobjetos Agujas de diseccin Papel absorbente Pinzas Nitrato de Plata Estereoscopio Microscopio Aceto-orceina al 2% Alcohol etlico al 70% ter o cloroformo Ac. Frmico Ratones Material biolgico Adultos de saltamontes, grillos, chinches saginella, chapulines, (Stenomarca Sphenarium

purpurascus)

Procedimiento 1 (Hompteros) Prctica 6a 1.- Sacrificar por exceso de ter o cloroformo a los organismos y colocarlos en alcohol etlico al 70%, con unas pinzas retirar el exceso de cutcula del abdomen para descubrir las gnadas, las cuales en los machos se observan como dos grandes sacos blancos a ambos lados, adheridos a la cutcula internamente. Se separan las gnadas. 2.-Con una navaja cortar en segmentos pequeos las gnadas (de cada gnada se obtiene material para 4 reparaciones). Colocar el material en un portaobjetos y adicionar unas gotas de colorante, dejar reposar durante 15 minutos. Posteriormente se coloca el cubreobjetos y se realiza un squash para disgregar el material 3.-Sellar la preparacin con barniz de uas 4.-Observar al microscopio en 100X. Distinguir las diferentes fases de la meiosis en la que se encuentran las clulas. Cromosomas de Saltamontes 1.-Sacrificar por exceso de ter a los organismos y colocarlos en alcohol etlico al 70%, con unas pinzas retirar la cutcula del abdomen para descubrir os
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testculos, separar un tbulo seminfero, colocarlo en un portaobjetos y fijarlo en etanol: acido actico 3:1 durante 15 minutos. 2.-Agregar dos gotas de colorante durante 15 minutos, colocar el tbulo un cubreobjetos y con una presin muy suave dispersar el material. 3.-Realizar el squash presionando fuertemente con el pulgar sobre una superficie plana. Sellar con barniz de uas trasparente. Observar al microscopio ptico a 100X. Distinguir las diferentes fases de la meiosis en las que se encuentran las clulas. Procedimientos 2 (roedores) Prctica 6b 1.- Dos horas antes de la prctica inyectar a los roedores con colchicina intraperitonealmente a una concentracin de 0.01 gr/peso. 2.- Reposar a las ratas en un lugar aislado y evitando estrs. 3.-Transcurrido el tiempo sacrificar al individuo por mtodos adecuados (ya sea descerebracin o inyeccin letal). 4.- Disectar las gonadas, cortarlas en pequeos trozos macerarlas ligeramente, luego colocarlas en un tubo limpio. 5.- Agragar KCl al 0.075M, y agitar vigorosamente el tubo durante cinco minutos. 6.- Centrifugar a 10,000 rpm y descartar el sobrenadante. 7.- Fijar el precipitado en acido actico metanol (1:3) durante 10 min. 8.- Repetir la centrifugacin, bajo las mismas condiciones, eliminar el sobrenadante y volver a fijar el material otros 10 min. 9.- Repetir los pasos 6 y siete una vez mas. 10 Hacer cuatro preparaciones por cada tubo mediante goteo y fijado al calor. 11.- Teir alternativamente con Giemsa de manera convencional (1ml. de
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con el bistur y

colorante, 1 de sol. Amortiguadora de Sorensen y 18 de agua) y otras mas con

tincin argntica (0.1 gr de Nitrato de Plata en 1ml. de agua destilada ajustada a pH 3.2 con acido frmico). Bibliografa Rodrguez, A. R., et al. Manual de prcticas de gentica y cuaderno de trabajo. UNAM. 2005 Curtis, H., N. Barnes, (2001). Biologa 6 ed, Ed. panamericana,Mxico,pp 1199. Espermatogenesis en invertebrados (ortpteros). Universidad Autnoma de Madrid. (Revisado en 2009. http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practicas.htm). Actividades 1.- Localizar y fotografiar cada una de las diversas etapas de la profase 1 de meiosis, fotografiarla y reportarla sealando a que fase corresponde.

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Resultados

Cuestionario 1. Cul es la importancia gentica de la meiosis?

2. Mencione las diferencias entre cigoteno y paquiteno

3. Mencione cual es significado biologico de el complejo sinaptonmico

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4. Llenar el siguiente cuadro con las diferencias entre mitosis y meiosis MITOSIS Clula en las que ocurre Numero de cromosomas Numero de fases S por divisin celular Entrecruzamiento Apareamiento homlogos Numero celulares Nmero de clulas hijas Las clulas hijas de divisiones de MEIOSIS

genticamente son

5. Las figuras de la siguiente pgina representan en forma desordenada clulas en distintas etapas de la meiosis. Recorte las diferentes fases y ordene en orden cronolgico e indique el nombre de la etapa y las caractersticas ms importantes.

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LEPTOTENO,

CIGOTENO,

PAQUITENO,

DIPLOTENO,

DIACINESIS,

METAFASE I, ANAFASE TEMPRANA I, ANAFASE I, TELOFASE I, INTERFASE I, PROFASE II, METAFASE II, ANAFASE II, TELOFASE II, TETRADAS, CELULAS JOVENES. Conclusiones

Bibliografa consultada

PRCTICA 7 OBTENCIN DE CROMOSOMAS MEDIANTE CULTIVOS DE

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LINFOCITOS HUMANOS
Introduccin. Los linfocitos son las clulas responsables de las respuestas inmunitarias (inmune, del latn, 'estar libre de carga'). Se desarrollan a partir de progenitores linfoides inmaduros y se dividen en dos grandes grupos, linfocitos B y linfocitos T, segn que estos progenitores linfoides maduren en la mdula sea (B) o en el timo (T), respectivamente. Los linfocitos B estn especializados en la produccin de anticuerpos. Los linfocitos T son responsables de las respuestas inmunes mediadas por clulas, as como de funciones de cooperacin para que se desarrollen todas las formas de respuestas inmunes, incluida la respuesta de anticuerpos por los linfocitos B. Los linfocitos han sido intensamente estudiados y desde hace muchos aos son utilizados para una gran diversidad de investigaciones biolgicas. En el campo de la gentica los linfocitos han sido de gran utilidad, particularmente para la obtencin de cromosomas mitticos, cuyo estudio representan la parte

fundamental de la citogentica. El cultivo de linfocitos, por lo tanto es una prctica rutinaria en un gran nmero de laboratorios de gentica. Las tcnicas para cultivar linfocitos se basan en la capacidad que tienen estas clulas para proliferar en presencia de agentes inductores de la divisin celular (mitgenos) y el desarrollo de un gran nmero de medios de cultivos (RPMI-1650. MEM, McCoy 5A, etc.).

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Objetivos Que el alumno conozca y se familiarice con el procedimiento para la obtencin de cromosomas a partir de linfocitos de sangre perifrica. Materiales Torundas de algodn humedecidas con alcohol Liga de torniquete Jeringa desechable Tapones de hule Pinzas Cajas petri Papel parafilm Vaso de precipitado Pipetas de 3ml Mecheros de alcohol Medio modificado Penicilina/estreptomicina Colchicina [ ] 10g/l Cloruro de Potasio 0.075 M a 37 C Acido actico Metanol tinta Campana laminar Incubadora Bomba de vacio Centrifuga Tubos de ensayo Gradilla de flujo Mc Coy 5A

estril de 3ml Jeringa desechable

estril de insulina de Pipetas pasteur 1ml 2 jeringas desechables estriles de 5 ml con aguja verde Mecheros de alcohol Encendedor o cerillos Portaobjetos Guantes de ltex Marcador indeleble Alcohol de caa Etanol Heparina Fitohemaglutinina con

Procedimiento Obtencin de la muestra 1.-Con una jeringa de 5 ml heparinizada se toma una muestra de 4ml de sangre
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perifrica Esterilizacin 2.-Se limpia la campana de flujo laminar con etanol, se coloca dentro de la campana las cajas de petri, las jeringas limpias, el medio Mc Coy 5 A, la fitohemaglutinina, la penicilina-estreptomicina, los corchos se colocan dentro de un vaso de precipitado con etanol. Finalmente se enciende la campana de flujo laminar y se roca el material con etanol. Siembra 1.-En condiciones estriles, utilizando guantes, se colocan los tubos de ensayo en una gradilla, de manera que queden verticalmente y se preparan con 1ml de medio Mc Coy 5 A, o.o2 ml de fitohemaglutinina, una gota de penicilinaestreptomicina. 2.- A cada tubo se le agregan 8 gotas de sangre (sin aguja). A cada tubo se coloca un corcho de plstico (previamente flameado), se coloca papel parafilm alrededor. 3.- Finalmente se aprieta el corcho y se etiquetan (moviendo lo menos posible los tubos). Los cultivos se mantienen en una incubadora a 37C durante 72 horas. Cosecha 1.-En ambiente estril, y con guantes, se sacan los tubos de la incubadora y se colocan en una gradilla dentro de la campana de flujo laminar. 2.-a cada tubo se le agregan 0.2ml (3 gotas) de colchisina [10g/ml] y se dejan incubar a 37C durante 20 minutos 3.-posteriormente se centrifuga a 800rpm, 8 minutos. Transcurrido el tiempo se colocan en una gradilla. 4.- a cada tubo se le retira el sobrenadante, tratando de no romper el paquete celular.
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5.- se adicionan 5 ml de KCl a 37C. Inclinando suavemente los tubos. 6.-Se vuelven a incubar a 37C durante 20 minutos. Transcurrido el tiempo se centrifuga a 800rpm por 8 minutos 7.-se elimina nuevamente el sobrenadante y se adiciona 1ml de metanol acido actico 3:1, y se resuspende rpidamente, se adiciona mas metanol acido

actico hasta obtener 5ml aproximadamente y mezclar. 8.-se centrifugan los tubos a 800rpm/ 8 minutos 9.- se desecha el sobrenadante, nuevamente se agrega fijador y se vuelve a centrifugar a 800rpm/ 8 minutos. Este paso se repite hasta que el sobrenadante quede transparente Preparacin de laminillas 1.-Par realizar las preparaciones eliminar el sobrenadante dejando

aproximadamente 1 ml de fijador 2.-se resuspende el paquete celular y se dejan caer 2 o 3 gotas sobre una laminilla limpia, fra y hmeda 3.- se secan a la flama (evitando sobrecalentar las laminillas) 4.- Teir las laminillas y observar al microscopio de campo claro. 5.- Localizar cromosoma e identificar los diversos tipos de cromosomas. 6.- En el caso de cromosomas acrocntricos identificar los tallos y satlites y ralizar repeticiones de las observaciones para comprobar la constancia en la posicin cromosmica. Bibliografa Verma, R.S., y Babu, A.1995. Human Chromosomes. Principles and

Techniques. 2 Ed. Mc Graw-Hill. Estados Unidos. 419p.

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Resultados

Cuestionario Qu funcin cumplen los siguientes reactivos en el cultivo de linfocitos?:

Heparina:

Estreptomicina-Penicilina

Fitohemaglutinina

Cloruro de potasio al 0.075M

Medio Mc Coy 5 modificado

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Explique por qu se debe incubar los linfocitos por 72 horas

En qu estado del ciclo celular se encuentran los linfocitos

Mencione por lo menos 3 tipos utilizado para el cultivo de linfocitos

de medios de cultivo celular adems del

Que se necesita para que un cariotipo de cualquier especie sea publicado?

Mencione las reglas o criterios bsicos para elaborar un cariotipo.

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Conclusiones

Bibliografa consultada

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PRACTICA 8 CARIOTIPO 1
Introduccin Los cromosomas son observados solo durante la divisin celular, lo cual es extremadamente difcil hacer en cualquier tipo de clula eucariota. Cierto tipos de tejido son proliferativos, como la mdula sea, pero no es un tejido del que se pueda disponer fcilmente. En algunas especies diferentes de la humana es

posible encontrar tejidos como las branquias en peces y moluscos o como los tejidos meristemticos en plantas y facilitar su observacin. Las clulas

humanas que se utilizan frecuentemente para anlisis de cromosomas son las sanguneas y los fibroblastos. Sin embargo es necesario disponer de tcnicas de cultivos celulares que faciliten obtener cantidades suficientes de clulas en mitosis y poder facilitar su estudio. Las tcnicas que permitieron obtener cromosomas y

estudiarlos en laboratorio, fueron desarrolladas por diversos investigadores en diversos laboratorios durante la segunda dcada del siglo pasado y permitieron establecer con firmeza las caractersticas cariolgicas del ser humano a finales de los aos sesentas. Por consecuencia otras muchas especies pudieron ser caracterizadas rpidamente a partir de ese momento. La clave para disponer

de cromosomas suceptibles de estudio radican en tres hechos: obtener suficientes clulas en divisin para poder hacer anlisis fiables; obtenerlos en la fase de mitosis y finalmente que estos se encuentren lo suficientemente dispersos para su poder contar y visualizar claramente forma y estructuras. Adicionalmente, durante

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los aos setentas aparecieron las llamadas tcnicas de bandeo cromosmico que permitieron identificar pares homlogos. En base a estos avances el anlisis

de cariotipo se convirti en una potente herramienta taxonmica, de diagnstico de mltiples patologas y para el estudio de diversos procesos evolutivos entre otras cosas. Objetivos Que el alumno aprenda a elaborar cariotipos con base a la morfologa, tamao y patrn de bandas de los cromosomas obtenidos del cultivo de linfocitos Que el alumno conozca los diferentes tipos y mecanismos de formacin de aberraciones cromosmicas numricas y estructurales Que el alumno el alumno realice un cariotipo a partir de una fotografa, realice un anlisis y diagnostico citogentico en base a las caractersticas del cariotipo elaborado Materiales Tijeras Pegamento Foto de cromosomas humanos Mechero Pinzas Portaobjetos Pipeta pasteur material biolgico Tubos con el cultivo de linfocitos Buffer sorensen pH 7 Fosfato de potasio monobsico (KH2PO4) 5.26 gr Fosfato de sodio di bsico (Na2HPO4) 8.65 gr Giemsa Alcohol metlico Glicerina 25cc(ml) Aceite de inmersin Centrifuga Microscopio Bomba de vacio Agua destilada 1Lt

Procedimiento Preparacin de laminillas

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1.-Para realizar las preparaciones se elimina el sobrenadante del cultivo de linfocitos, dejando solo aproximadamente 1ml de fijador. 2.-Se resuspende el paquete celular y se dejan caer 2 o 3 gotas sobre una laminilla limpia, fra y hmeda. 3.- Se secan a la flama y posteriormente se analizan en contraste de fase para monitorear la dispersin de los cromosomas en la metafase y el ndice mittico. Tincin 1.-Las laminillas se introducen en un vaso Koplin con colorante Giemsa al 4% por 10 minutos (tincin de rutina) posteriormente se pasa a otro vaso Koplin el cual contiene agua de la llave para un lavado rpido. 2.-Se deja secar al aire. 3.-Localizar una metafase a 100x y contar el numero de cromosomas de cada grupo. Tomar fotografa para su anlisis Elaboracin de cariotipos 1.-Una vez obtenida la fotografa, elaborar los cariotipos en los cuales los cromosomas se ordenaran por parejas considerando: su tamao, posicin de centromero, y el patrn de bandas. 2.- Recortar los cromosomas de la metafase y colocar sobre una hoja de papel los cromosomas identificados y ordenados. Bibliografa Rodrguez, A. R., et al.2003. Manual de prcticas de gentica y cuaderno de trabajo.UNAM. Strachan, T., y Read, P.A. 2006. Gentica Humana. 3 ed. Mc Graw-Hill. Mxico. 676 p. Verma, R.S., y Babu, A.1995. Human Chromosomes. Principles and Techniques. 2 Ed. Mc Graw-Hill. Estados Unidos. 419p.
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Resultados

Cuestionario 1.-Mencione y describa algunas de las tcnicas de bandeo ms utilizadas

2.-Mencione y describa cada una de las diferentes alteraciones cromosmicas segn su clasificacin.

3.- Cuales son las causas por las que se originan las aberraciones numricas?

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4.- Cuales son las causas por las que se originan las aberraciones estructurales?

5.- Elaborar los cariotipos otorgados por su profesor, ordene los cromosomas por parejas considerando las reglas bsicas para la elaboracin de dicho anlisis. Para los cariotipos con bandas G identificar cada cromosoma por su patrn de bandas. Puede ayudarse de la siguiente figura, En el caso de que haya ms de 46 cromosomas, buscar a qu grupo pertenece el sobrante, colocarlo all y sealar el sndrome a que da lugar esta anomala. En caso de que el nmero de cromosomas sea inferior a 46 sealar el cromosoma que falta as como el sndrome al que da lugar esta anomala. Describir las

caractersticas de la anomala.

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Conclusiones

Bibliografa consultada

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PRCTICA 9 TCNICAS DE BANDEO CROMOSMICO

En los aos setentas se desarrollaron una serie de tcnicas citogenticas que consistan en tratamientos con soluciones amortiguadoras, colorantes, pHs y temperaturas diversas, y que permitan la tincin diferencial de diferentes regiones de los cromosomas. Estos procedimientos fueron llamados Tcnicas de Bandas Cromosmicas y representaron un avance significativo en el estudio y caracterizacin de los cromosomas, ya que entre otras cosas permitieron identificar de manera especfica cada para cromosmica Entre las tcnicas de bandas mas utilizadas se encuentran las Bandas Q y G, las cuales forman bandas a lo largo de todo el cromosoma. Los cromosomas homlogos de cada especie se tien de la misma forma en cada individuo, lo que ha permitido estudiar rearreglos pequeos que se evidencian por cambios en las posiciones de las bandas. Tambin ha sido de gran utilidad para estudios evolutivos. Las Bandas Q y G son esencialmente las mismas, diferenciandose solo por el colorante utilizado. En el rpimer caso (Bandas Q) se utiliza Quinacrina, mientras que para las Bandas G se utiliza colorante de Giemsa. Otras tcnicas importantes son las Bandas C, las cuales tien especficamente los centrmeros y las bandas NORs, las cuales tien las Regiones Organizadoras del Nucleolo. Existen otras muchas s como las Bandas R, T, Cd pero son menos utilizadas que las mencionadas anteriormente. En la actualidad estas tcnicas son indispensables y de uso rutinario en cualquier laboratorio de citogentica, son parte fundamental en el estudio de los genomas y en citogentica molecular representan un paso previo para un anlisis efectivo.

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Objetivo 1.- Aplicar tcnicas de bandas Q y G con el fin de identificar cromosomas homlogos, tomar microfotografa y elaborar cariotipos 2.-Aplicar tcnicas de Bandas C y NORs para la identificacin de la heterocromatina constitutiva y la ubicacin de los genes ribosomales.

Laminillas con cromosomas Estufa Portaobjetos Cubreobjetos Vasos coplin Agua destilada NaCl cido ctrico Procedimiento

NaOH 10N Quinacrina Solucin Salina amortiguadora de fosfato (PBS) 10X HCl Giemsa Tris 0.1M Buffer McIlvaine

Borato de Sodio Acido borico Tripsina Etano 70% Etanol 90% Bao mara Hidrxido de bario Amortiguador de Sorensen

Bandas G 1. Disponer de dos laminillas con cromosomas no teidos 2. Teir la laminilla cubriendo con la siguiente Mezcla el total de su superficie: (1ml. De colorante Giemsa en 19 ml de solucin amortiguadora de tris al 0.1M ajustado a un pH de 9. 3. Mantener las preparaciones cubiertas durante 9 minutos. 4. Transcurrido el tiempo enjuagar con agua destilada y observar al microscopio.

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Bandas Q 1. Teir las laminillas correspondientes con Quinacrina durante 10 min en la oscuridad 2. Transcurrido el tiempo, enjuagar con agua destilada y eliminar el exceso de Quinacrina. 3. Colocar la laminilla en buffer de McIlvaine por 1 min. 4. Colocar la laminilla al microscopio de fluorescencia y observar con filtros adecuados para longitud de onda de 450 a 500 nm. Bandas NORs 1. Preparar una solucin de Nitrato de plata al 100% en aguas destilada 2. Preparar una solucin de formalina al 3.5 % y ajustar el pH a 2.6 con cido frmico. 3. De la solucin del paso 1, tomar 1 ml. Y mezclar con 0.2 ml de la solucin 2. 4. A partir de esta solucin, colocar una gota sobre el portaobjetos, cubrirla con un cubreobjetos e incubar durante 15 min. 5. Monitorear cada tres minutos la laminilla, y si vira al color dorado, retirarla y observar al microscopio con campo claro. Bandas C 1. Colocar las laminillas en una caja couplin y anadir HCL 0.2 N y reposar durante 20 min. 2. Lavar con agua desilada 3. Colocar las laminillas en una solucin de Hidroxido de Bario al 0.1M e incubar durante 7 min. a 37 C. 4. Lavar con agua destilada 5. Colocar las laminillas en una solucin 2 XSSC durante dos horas a 60 C.
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6. Lavar nuevamente con agua destilada 7. Teir con Giemsa al 2% diluida en solucin amortiguadora de Sorensen. 8. Observar al microscopio.

Actividades Identificar metafases con cada una de las tcnicas utilizadas, describir el patrn de bandeo y tomar fotografas para cada caso.

Biblografa Verma, R., y A. Babu, 1995. Human Chromosomes: principles and techniques. 2a. ed. McGraw- Hill. New York.

Resultados

Conclusiones __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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PRCTICA 10 ENSAYO COMETA

Introduccin El ensayo cometa, tambin conocido como electroforesis en unicelular, es capaz de estimar el aumento en el nivel de fragmentaciones en la molcula de ADN de clulas eucariotas individuales de cualquier organismo, como resultado de la exposicin a sustancias genotxicas, como las radiaciones radiaciones UV y dao oxidativo producto de radicales libres o agentes oxidantes. .Originalmente este ensayo fue desarrollado para llevarse a cabo en clulas de mamferos, sin embargo se ha utilizado en una amplia gama de organismos y clulas. Esta tcnica consiste en preparar laminillas embebiendo clulas en agarosa para darles soporte, posteriormente tratarlas con una solucin de lisis, con alto contenido de detergentes y sales y tratarlas con soluciones amortiguadoras por un determinado tiempo. Finalmente las laminillas se exponen a una corriente elctrica y se tien con un flurocromo (bromuro de etidio) y son colocadas al microscopio de fluorescencia. Dependiendo del dao o fragmentacin del ADN, se observara una mayor o menor migracin del mismo. El ADN fragmentado migra al sentido

opuesto a la corriente electica, por ello las clulas, al ser observadas al microscopio, asemejan un cometa, con la cabeza altamente fluorescente (ADN

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altamente enrollado) y una cola (ADN fragmentado) que incrementa su longitud dependiendo del dao presente. La clasificacin de dao del ADN, se estableci con base a la distancia que migra el ADN hacia fuera del ncleo de la clula, formando una cola como la de un cometa Es un mtodo que puede ser utilizado rutinariamente en clulas obtenidas de organismos en laboratorio o in situ, debido a su sencillez y rapidez, es un mtodo que se utiliza para probar la genotoxicidad de nuevos compuestos, detectar la presencia de contaminantes genotoxicos en el ambiente, para el biomonitoreo humano y epidemiologia molecular, as como investigacin bsica del dao del ADN y sus sistemas de reparacin Objetivos El alumno aprender el procedimiento para realizar la tcnica del ensayo cometa El alumno conocer las diversas aplicaciones de esta tcnica para anlisis de dao de ADN

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Materiales Micropipetas Algodn Guantes Termmetro Portaobjetos Cubreobjetos Vasos coplin Microtubos de 1.5ml NaOH 10N Cuarto obscuro iluminacin amarilla con

EDTA disodico 200mM, pH 10 Placa con agitador Tris-base 0.4M, pH 7.5 Tritn x-100 Agarosa normal Cmara electroforesis Fuente de poder de

Bao maria Agarosa de bajo punto Refrigerador de fusin (LMA)

Solucin Salina Balanza amortiguadora de fosfato Lancetas o jeringas de (PBS) 10X Filtro de microscopio 3ml o 5ml para detectar una longitud de onda de 600 a 660nM HCl Agua destilada DMSO NaCl Procedimiento Preparar la agarosa regular as como la de bajo punto de fusin, a 90C,

colocar cada tipo de agarosa en una caja coplin y mantenerlas a 37C, para evitar solidifiquen. 1.- Preparacin de laminillas con agarosa normal (Primera capa de agarosa) Limpiar con etanol, el nmero de laminillas a utilizar, una vez limpias de una en una sumergirlas en la caja coplin de agarosa regular, al sacarlas colocarlas horizontalmente para cubrir toda la superficie, es importante notar que si la agarosa no se mantiene extendida homogneamente en toda la laminilla, esto indica que se est enfriando o est demasiado caliente. Colocar la laminilla con agarosa en una charola en forma horizontal y secarla en

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una estufa, de preferencia a 40C durante 15 minutos mnimo Una vez deshidratada la agarosa, se rotulan las laminillas con un lpiz del lado donde se encuentra esmerilado, para as indicar la superficie donde se encuentra colocada la agarosa. Las laminillas pueden ser usadas de inmediato o pueden guardarse en una caja para protegerla del polvo y humedad*

2.-Preparar la solucin de lisis, as como el buffer de electroforesis y colocarlas en el refrigerador

3.-Preparar la muestra (segunda capa de agarosa) Extraer un mililitro de sangre con heparina de un donador. Colocar 500ul de sangre en un microtubo de 1.5ml y adicionarle 1 ml de PBS 1x, homogenizar y centrifugar a 2000rpm durante 10 minutos. Posteriormente retirar el sobrenadante. Obtener 20ul de muestra y adicionar 75ul de agarosa de bajo punto de fusin (LMA), homogenizar la muestra rpidamente y colocar en la laminilla con la agarosa previamente deshidratada (1), colocar un cubreobjetos, evitando formar burbujas. Colocar las laminillas en el refrigerador a 4C entre 5 y 10 minutos, hasta que la agarosa solidifique. 4.-Tercera capa de agarosa Una vez solidificada la muestra, retirar el cubreobjetos con el dedo pulgar. Posteriormente sumergir las laminillas con cuidado de no daar la muestra en la agarosa de bajo punto de fusin, para colocar una tercera capa de agarosa, al sacar la laminilla colocar un cubreobjetos y colocar nuevamente en el refrigerador para solidificar la muestra.
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5.-Ya que la ultima capa de agarosa solidifique, retire el cubreobjetos. Una vez preparadas las laminillas, puede dar algn tratamiento (5A) qumico o fsico para inducir algn dao a las clulas o seguir el procedimiento Opcional: Tratamiento Se colocan en tratamiento como sigue: H2O2. 100,200 y 300uM en PBS1x por 5 minutos 1, 2, 3,5, y 7 minutos en exposicin a la luz ultravioleta tipo C Todos con controles negativos sin exposicin, en obscuridad. 6.- sumergirla en la solucin de lisis Con unas pinzas tomar la laminilla del lado esmerilado para sumergirla en forma vertical en la solucin de lisis, previamente fra en los vasos coplin, por lo menos durante 1 hora a 4C: es necesario tener mucha precaucin de que no se vaya a pegar el lado donde se encuentra la agarosa de una laminilla con otra o que se vaya a golpear con la esquina d alguna laminilla al meterla al vaso, porque la muestra que va inmersa en la agarosa puede desprender o rasgar 7.- Solucin de electroforesis Sacar las laminillas de la solucin de lisis, escurrir y trasferir a la cmara de electroforesis colocndola en forma horizontal, cuidando que el esmeril quede de un mismo lado Dejar las muestras en la solucin de desenrollamiento y electroforesis durante 20 minutos a 4C Al trmino de los 20 minutos conectar la cmara a la fuente de poder y corroborar un voltaje de 20-25 V y que la corriente sea de 300mA Encender la fuente de poder e iniciar un conteo de 5 minutos, evitar que la solucin se caliente, apagar la fuente de poder, retirar las laminillas

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cuidadosamente colocndolas en una charola en forma horizontal con la agarosa hacia arriba 1. Solucin de neutralizacin Agregar cuidadosamente 1 ml de solucin amortiguadora Tris base a ph7.5 sobre la agarosa de las laminillas, dejarlas con la solucin durante 5 minutos escurrir la solucin Tris base y volver a colocar 1 ml ms de la misma solucin sobre las laminillas, dejar otros 5 minutos, esta solucin neutraliza el pH alcalino. Escurrir la solucin amortiguadora de la laminilla. Si no se van a analizar con una piceta agregar cuidadosamente etanol al

100%, dejar reposar durante 10 minutos para deshidratar la agarosa, colocar las laminillas recargadas en forma vertical sobre una pared o un escurridor hasta que sequen completamente, una vez secas, guardar as laminillas en una caja hasta su evaluacin

9.- tincin Usando bata y guantes agregar 20ul de solucin de bromuro de etidio1x sobre las laminillas y se coloca un cubreobjetos Leer las laminillas en un microscopio con una lmpara de fluorescencia 20X y 40X las fotos pueden tomarse en un ocular 60X Colocar las laminillas en la platina, abrir el filtro de fluorescencia que detecta el bromuro de etidio y enfocar las laminilla con la ayuda del macro y micromtrico

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Bibliografa Ramrez, R.P., y Mendoza, C. A. Ensayos toxicolgicos para la evaluacin de sustancias qumicas en agua y suelo. La experiencia en Mxico. SEMARNAT. INE. Mxico. 2008. Dhawan A. et al., for rapid protocol for the single cell gel electrophoresis/comet assay

genotoxiciti assessment. ITCR: The SCGE/COMET ASSAY

PROTOCOL. (1-10) Sinht et al. 2002.DNA single strand breaks by Alkaline microgel electrophoresis. Exp. Eye Res. 75:555-560. Resultados

Cuestionario Mencione cual es la utilidad del ensayo cometa

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Conclusiones

Bibliografa consultada

PRCTICA 12 CULTIVOS DE LINFOCITOS HUMANOS Y OBSERVACIN DE METAFASES (Parte 2)

OBJETIVO: Que el estudiante realice el anlisis de ndice mittico en cromosomas humanos y que compare sus resultados con sus compaeros. Que el estudiante tome fotografas de metafases en 100 X y elabore un cariotipo a partir de una de las fotografas. MATERIALES Y MTODOS: Preparaciones cromosomas Pegamento ACTIVIDADES: 1. Observar al microscopio e identificar clulas con metafases completas. Tomar fotografas. con Cmara fotogrfica Hojas blancas Tijeras Marcadores

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Nmero Cromosomas:________________

de

Frmula cromosmica:_______________

2. Identificar las diferentes etapas de la mitosis en linfocitos y obtener fotografas

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3. Obtener el ndice mittico de cada cultivo de linfocitos y comparar los resultados con los de sus compaeros, analizar lo observado. Contar 1000 clulas.

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4. De las fotografas que obtuvo de metafases completas, seleccionar una de estas (la que est completa y con los cromosomas dispersos), aumentar la foto hasta tamao carta, sacarle varias copias y en una hoja con el formato siguiente, elaborar el cariotipo. Instrucciones para la elaboracin del cariotipo: 1. Recortar los cromosomas 2. Calcular el ndice centromrico (IC) para ello se debe medir la longitud total de cada cromosoma y la de cada brazo IC = 100 s, donde s= longitud del brazo corto y c = longitud total del cromosoma. 3. Confeccionar el cariograma agrupando los pares homlogos de acuerdo a la longitud total y al ndice centromrico, clasificndolos segn la siguiente nomenclatura (Levan 1964). Ver Tabla 1. 4. Elaborar los cariotipos en los cuales los cromosomas se ordenaran por parejas considerando: su tamao, posicin de centrmero. 5. Recortar los cromosomas de la metafase y colocar sobre una hoja de papel los cromosomas identificados y ordenados.

POSICION CENTROMERO Punto mediano Regin mediana Regin submediana Regin subterminal Regin terminal Punto terminal

DEL IC

TIPO DE CROMOSOMA

50.00

M metacntrico M

37.50 25.00 12.50 0.00

sm submetacentrico st acrocentrico T T telocentrico

Tabla 1. Nomenclatura de Levan, 1964.

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PRCTICA 13 CROMOSOMAS POLITENICOS

Objetivos Conocer y aprender la tcnica de aislar y teir los cromosomas politenicos a partir de glndulas salivales de larvas de Drosophila Que el alumno observe el bandeo natural y las secuencias gnicas de los cromosomas Que el alumno identifique las estructuras de los cromosomas politcnicos, as como el nmero de cromosomas visibles en la preparacin

Materiales Agujas de diseccin, jeringas de insulina o alfileres entomolgicos Toallas de papel Pinceles Lpiz con goma portaobjetos Procedimiento Seleccin de la larva 1.-Coloque una gota de agua destilada, suero fisiolgico o NaCl 7%. Frote la superficie de un portaobjetos con su dedo pulgar, esto permitir que se forme una gota. 2.-En un cultivo de Drosophila sp. seleccione una larva en tercer estadio de
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suero fisiolgico al 0.7 % o NaCl al 7% agua destilada aceite de inmersin aceto-orceina o acetocarmin al 2%

microscopio estereoscopio microscopio compuesto cultivo de Drosophila sp. con larvas de 3er estadio

desarrollo, utilice una aguja de diseccin, coloque la larva en el centro del portaobjetos con la solucin y observe bajo el estereoscopio. RECOMENDACIONES: La solucin en la que coloque la larva no debe

secarse, agregue cada vez que sea necesario. Si la solucin se le seca, abandone la diseccin y comience de nuevo.

Diseccin de la larva y obtencin de las Glndulas Salivales 1.-Comience la diseccin localizando primero el extremo anterior (cabeza) de su larva podr ver las mandbulas las cuales se distinguen por su forma y color negro. Las glndulas podr visualizarlas entre el tercer o cuarto segmento. 2.-Con una mano coloque una aguja de diseccin aproximadamente entre el tercer y cuarto segmento de la larva y sostngala firmemente. 3.-Con la otra mano coloque la aguja de diseccin justamente atrs de los ganchos bucales de color negro. 4.-Mueva la aguja de diseccin que se encuentra atrs de los ganchos bucales lentamente en direccin opuesta a la otra aguja a manera de estirar la larva, las glndulas generalmente se quedan adheridas a la regin mandibular. Adems generalmente tienen un cuerpo graso, largo, delgado unido a ellas. 5.-Para el paso siguiente puede seguir trabajando en el mismo portaobjetos, sin embargo retire todos rganos, trozos de cutcula, deje solamente las glndulas, cuidando de los arrastrarlas junto con los dems rganos y coloque una gota de aceto-orceina o acetocarmin sobre las glndulas. O bien puede colocar una gota pequea de colorante en el centro de un portaobjetos limpio y trasferir las glndulas a la gota de colorante. Utilice las agujas de diseccin para hacer esta transferencia, una vez en el colorante las glndulas deben caerse de las agujas. RECOMENDACIONES: si se saca completamente el extremo de la cabeza de la larva o si los rganos internos salen desordenadamente o si se rompe la
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cutcula muy lejos de la cabeza, es preferible abandonar la diseccin y empezar con una nueva larva. Si solo es posible localizar una glndula, transfirala sola. No es necesario hacer una diseccin completamente limpia de las glndulas de otro tejido, este no interfiere con la preparacin.

Colocacin del cubreobjetos 1.-Tome un cubre objetos por la orilla para evitar dejar huellas en el. Sostenga la otra orilla del cubreobjetos con su aguja de diseccin y suavemente bjelo sobre la solucin de aceto-orceina o acetocarmin Deje reposar la preparacin durante observe al microscopio. aproximadamente cinco minutos y

Aplastado de las glndulas salivales 1.-Despus de visualizar las glndulas en el microscopio, coloque la preparacin en una superficie lisa, coloque sobre el montaje papel secante, absorbente, o simplemente con su dedo pulgar colquelo sobre el cubreobjetos. Sin mover el cubreobjetos presione lo ms fuerte posible. Si utiliza dos toallas de papel dobladas es muy difcil que rompa el cubreobjetos.

Observacin de cromosomas 1.-Observe el montaje contra luz y localice las glndulas salivales aplastadas, coloque el montaje sobre el microscopio con la glndula aplastada bajo el objetivo 10x

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2.-.-Localice el condensador de su microscopio y la palanca que controla el diafragma. Abra el diafragma hasta 2/3 partes de la abertura total. 3.-Observe en el microscopio y mueva el condensador hacia arriba y abajo hasta obtener una iluminacin brillante y homognea en todo el campo 4.-Lentamente mueva el enfoque macromtrico hasta que su montaje este enfocado. Asegrese de que el enfoque sea del material biolgico y no del cubreobjetos. Ajuste el enfoque con el tornillo micromtrico 5.-Busque lentamente hasta encontrar un ncleo. Los cromosomas deben de poderse observar claramente aun a bajo poder. Rastree todo el montaje hasta encontrar un ncleo con los cromosomas bien extendidos. 6.-Cambie a alto poder y observe la preparacin a 40x, o 100x (utilice aceite de inmersin), tenga cuidado de no sobrepasar demasiado el punto de enfoque o puede quebrar su montaje y daar el objetivo.

Bibliografa Castillo, H., Prcticas de Laboratorio Gentica General. Universidad de San Carlos de Guatemala. 2002 Rodrguez, A. R., et al. Manual de prcticas de gentica y cuaderno de trabajo. UNAM. 2005

Resultados Observe la larva, identifique y dibuje sus estructuras

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Una vez obtenidos los cromosomas politenicos, identifique tantas regiones (puff o anillos de Balbiani, cromocentro, centromero, brazos cromosmicos, rearreglos cromosmicos) como le sea posible y esquematice.

Cuntos brazos cromosmicos tiene Drosophila sp.? Haga un dibujo y cuente los extremos libres. Aun cuando un cromosoma fue arrancado del cromocentro, es posible reconocer el extremo libre debido a que parte del material queda adherido.

NOTA: Como podr darse cuenta, el patrn de bandas de cada cromosoma es especfico y puede utilizarse para su identificacin. Sin embargo esto requiere de alguna experiencia y estudio.

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Cuestionario 1. Qu importancia tuvo esta prctica para usted?

2. Menciona brevemente la importancia de los cromosomas politenicos para la investigacin gentica

3. Mencione por lo menos tres descubrimientos importantes relacionados con cromosomas politenicos

4. Explica cmo se forman los cromosomas politenicos

5. Menciona las caractersticas de los cromosomas politenicos

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6. Investiga el origen de los rearreglos cromosmicos y cul es su importancia en el estudio de la gentica de poblaciones.

7. En que otros organismos diferentes de Drosophila es posible encontrar cromosomas politenicos.

Conclusiones

Bibliografa consultada

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