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Practica 1 Guia de Diluciones 2

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DILUCION.

ES

1.- INTRODUCCrON
EI anallsis clinico de muestras biol6gicas oel desarrollo de proyectos de investigacion en unlaboratorio, requiereque el personal del mismo este suficienlemente entrenado en Io que respects a 'a preparaci6n de soluciones y dituciones de muestras, previoa fas pruebas concretas. Obviamente, si se desea que una determinada tecnica de laboratorio lenga un desempeno optima y produzca resultados precisos, los reactivos y las muestras deben prepararse correctamenle .. Ademas, las muestras a analizar (ej. 8uero) deben diluirse casi siempre antes de las pruebas. La diluci6n consiste en anadir a un volumen de muestra biol6gica tanlos volumenes de diluyente (agua destitada, soluci6nsafina. buffer. entreotros) como sean necesarios para obtener fa dilution deseada, fa misma tienecomo consecueneia inmediata la disminucion de la cortcentraeion de los diferentes componentes de la muestra. En el laboratorio se pued'en presentar diferentes circunstancias que obligan en un momenta determinado a preparar una determinada diluci6n de una muestra. A cominua.ei6n se describiran una serie deejemplos, recomendaciones y orientaciones con el objetivo de facilitar lacomprension yrealizacion de ;la8diferentes tecnicas para preparar dtluciones -".

UNIDADES DE MEDIDA (VOLUMEN)
En la mayoria. de los casos en las preparaeiones de las diluciones se utilizan pequeiios volomenes tanto del especimencomo del diluyente, estos volumenes generalmente se encuentran enel orden de los micfolitros (1-11). Recuerde que 1 ml es igual a 1.000 IJI y que 1 pi es ;iguala 0,001 ml.jrate de familiarizarseconlas conversiones de mt a iUI y viceversa (en todo caso haga los calculos que correspondan), tal y como se muestra a confinuacien: Ul 1OI·d 151-.1J 50 U-I 100 pi 2001.11 250IJI 500 pi 750IJI 900 IJ 1.000 IJI 1.500 pi ml 0,01 ml 0,025 ml 0,05 ml 0,1 ml 0,2.mt a,25ml 0,5ml O,75,ml O,9ml

I

,

Ii

1 ml
1,5ml

I

Tenga en mente que siempre tiene que realizar sus calculos Htilizando la misma unidad de medida de volumen (Ej., pi,{) ml), en todo caso realice las eonverslones que tengsn tugar. PRINCIPIO DE LAS DILUCIONES SIMPLES Para preoarar una difuci6n, mezele un volumen especffico de la muestra 6 especsnen (ej. Suero) con un cierto volumen de un diluyente. Recuerde que para preparar la diluci6n siempre agregue primero el diluyente y seguidamentela muestra (ej. Suero}, finafmente

mezelsen forma adecuada.

En un caso simple, una parte de suero una parte igual de diluyente produciran una dlwcian de % (a 1:2). La expresion "1:2" representa ia relacion de la cantidad de partes de suero con el numero total de partes, en este caso represents una parte de suero y una parte de diluyente para un total de dos (2) partes. Una muestra pura de suero, es decir, que no contenga ninguna parte del diluyente se representaria por la relacion 1/1 (6 1.:1), es decir el total de partes es una (1) Y estcirepresentada unicamente por la muestra. Es importante tener presente 1.0 enado. ya que algunas pruebas de laboratorio (Ej.• V.D.R.L cuantitativo). la muestra del paciente se analiza en forma pura y diluida.

CALCULO DE DILUCIONES
Una dilueion de 1/100 puede prepararse mezclando 1 parte de suero eon 99 partes de diluyente; por ejemplo 1 ml + 99 ml (total de partes: 100; volumen final 100 mil. Ahora bien, si mantenemos la relacion de volumen de suero y la de dituyente necesaria para preparar una determinada dilucien (como en este ejemplo; diluci6n 1/100: 1 + 99), podemos variar los volumenes de cada uno de ellos y se obtendra la misma diluci6n. Supongamos que tenemos que preparar una dilucion 11100 y disponemos de poco suero (6 las condiciones de la tecnica implican que no hay necesidad de utilizar volumenes rnayores), en base a 10 expuesto podriamos preparar J·adiluci6n utilizando tan solo 50 microiitros (I.d) en este sentido, para caleular el volumen de suero multiplicamos 50 x 1, 10 que obviamente nos da 50 ~I de suero y para calcular el volumen de diluyente, multiplicamos 50 x 99, obteniendose como resultado 4.950 J.l1, de manera que mezclando en un tuba de ensayo 4.950 ~I de diluyente y 50 ~t de suero, obtendriamos una diluci6n 1/100, peroeneste caso el volumen final seria de 4,.95 ml. Este procedimiento se podria aplicar para preparar otras dfluciones (ej., %, 1120, 1/40, 1/320, 1/1280).
7

P"REPARACION

DE UNA DILUCION DE LA MUESTRA A UN VOLUMEN

FINAL
Con frecuencia se puede presentar la necesidad de preparar una diluci6n de la muestra a un volumen final (0 total) determinado, por ejernplo, para realizar una prueba inmunoserol6gica se requiere preparar 1.000 J.lt (1 m.) de una diluci6n 1120 de la muestra de suero de un determinado paciente, para eUo podemos proceder de tres maneras diferentes, slendola primera la siguiente: 1,.- Aplicamos la formula:

V1 x C1 = V2 x C2
Donde: V1 == 1000 (.II

C1 = 1120
V2 = Volumen de suero que tenemos que aspirar y mezelar oon un volumen determinado del dituyente para preparar la dilucion deseada. (cuyo volumen final es de 1.000 J..II) C2 = 111(Recuerde que- el suero esta puro, es decir, no diluido)

Por oonsiguiente:

1.000 ~I x 1120 = V2 x 111 1.000 ~l x 1120

= V2

V2;:;:: 1.000 ~1120 V2 ;:;:: J-It de suero 50 Como et volumen final de la diluci6n es 1.000 diluyente can 50 fJl del suero del paciente.

J.,II!, tenemos

que mezciar 950

J.,II de

2.- Otra alternativa para calcular el volumen de suero del. paciente 1.000 fJl de suero diluido 1120, serla la siguiente:
Aplicar la formula del Factor de Dilucion (FO):

necesario

para. preparar

FD = Vf
Oonde:

Vm
como una citra entera (volumen de suero

o ;:;:: Es

la dilucion preparada diluci6n (FD:20). al volumen diluyente).

(si se expresa

es el factor + volumen

de de que

Vf = Equivale
Vm

final 0 total de la difucion

= Corresponde
tenemos

volumen inicial de la muestra a diluir (en este caso, suero) que mezdar con el diluyente para preparar la dilucion al Vf deseado.

at

En nuestro ejemplo: FD (20) Vm

= 1.000

= 1.000

t111Vm; por 10 que:

J-I1/20;
que mezctar con 950 III de

Es decir 50 fJl de suero del paciente. el cuat tenemos diluyente para preparar la dilucion deseada

3.- Finalmente,

se podria aplicar una regia de tres simple:

Como se requiere preparar una diluci6n del suero 1/20, esto signffica que 1 parte de suero esta contenida en un total de 20 partes (suero + diluyente) ..Lo eitado es equivalente a decir que 1 volumen de suero sin diluir esta contenido en 20 volamenes de suero diluido (Vf suero + dUuyerrte). por 10 que:

=

1 volumen

de suero sin diluir

20volumenes

de suero diluido

(Vf)

"X" IJI de suero sin diluir

1.000 IJI de suaro dilurdo (Vf)

Oespejando

la incognita

"){" fJl de suero

X = 1.000 IJI x 1120

= 50

EI cual tenemos que mezclar con 950 tJJ de diluyente para preparar la ditucian deseada CALCULO DE DILUCION FINAL DE UNAMEZCLA DE SUERO NO DILUtDO

CON VOlUMEN DE D'llUYENTE.
Con bastante periodicidad se plantea la interrogante de calcular la diluci6n final derivada de mezclar un volumen detenninado del suero no diluido procedente de un paciente con un volumen de diluyente, par ejemplo, supongamos que en un tuba de ensayo se han agreg,ado ,400 1-11 (0,4 ml) de diluyente y posteriormente 100 III (0,1 ml) de suero puro del paciente. Elcalculo dela dilucian final obtentda se puede realizar de fa siguiente manera: Aplicar la formula de Factor de Dilucion: Vf FD=Vm Donde: Vf::: 400 IJI (60,4 ml) + 1.00 tJl (00,1 ml) Vm

= 500 ,.tI (0 0,5 mt)

= 100

i,J1(60,1 rnl)

Enet ejempto citado:
FD = 500 i,Jl J 100 pi = 5 Por 10 que Ja diJucion preparada es el inverso del FD, es decir 1/5 (6 1, :5) otra aitemativa para calcutar fa misrna diluci6n serta la siguiente: 100 jJl del suero 1 I.ft(una parte de suero) en un Vf de 500 ill, en un Vf ("X"), que es equivalente al total de partes.

Como se puede observar se trata de una regia de ires simple, as! que procedemos a despejar ta incOgnita Vf (6 "X") V{ = 500!J.l. x 1 pI -;- 100

lJl

Arrojando como resultado que el Vf = 5, es decir fa dilucion preparada es 1/5 (6 1 :.5)

CALCULO DE DILUCION FINAL DE UNA MEZCLA. (PREVIAMENTE DILUIDO) CON VOLUMEN DE DILUYENTE.

DE

SUERO

En el caso anterior, la diluci6n se calcul6 en funci6n que el suero del paciente estaba puro (no diluido), pero puede darse el caso (que de hecho se presenta con mucha frecuencia, par ejempfo, en caos de diluciones seriadas), que el suero provenga de una drluci6n previa del mismo. Supongamos que en un tubo de ensayo se han agregado 400 1.11 (0,4 ml) de diluyente y posterionnente 100 III (0,1 ml) del suero previamente diluido 112. Eso significa que hemos realizado una diluci6n 1/5 de un suero que ya estaba dlluido Yz, de rnanera que con respecto al suero pure, el suero qued6 diluido 10 veces mas, es decir,la diluci6n final seria eI producto de muttipticar dos fracciones, en estecaso: 1/5 x % = 1J10

Tenga siempre presente que la diluci6n final de un suero tiene como punto de referenda al suero puro no diluido y cada vez que tenga que calcular la diluci6n realizada en un determinado tubo de ensayo (u otro recipiente), tome en cuenta Sf el suero que se agreg6 estaba pure 6 diluido, en caso de estar diluido, la dilucion final: sertael producto de dos fracciones, una de elias seria la dj~Iucj6nrealizada y la otra la diluci6n previa del suero.
DILUCIONES SERIADAS DOBLES. las diluciones seriadas son el producto de mezclar y transferir un volumen con stante de suero en sucesivos tubos de ensayo que contienen diluyente en volumen constante 0 en volumenes variables. las mismas se realizan en casos que se desee preparar dituciones altas de una muestra, utilizando para ella volumenes pequei'iOs tanto del especimen como de diluyente 6 cuando se desea titular la presencia de un determinado anticuerpo 0 de un antigeno en una muestra biol6gica. Cuando se trabaja con diluciones seriadas. es Util expresar tadas las diluciones en terminos de fracciones. Esto hace que resolver un problema de diluciones seriadas se convierta en una cuestion de multiplicaci6n de fracciones. Par Ej., una diluci6n seriada en dos (6 1/2) a un volumen constante de diJuyente,es una dilucion en la que un volumen fijo de suero se mezcla y se traspasa en sucesivos tubos que contienen identico volumen de diluyente. Esta dilucion doble puede expresarse asi:

11 diluci6n en dos = Partes transferidas I total de partes
Un ejemplo de una diJuci6n seriada 112 (0 en dos) a unvolumen se describe en el siguiente grafico (partiendo de un suero puro). constante de difuyente

La dilucion seriada % mostrada en el graflCO produjo una drtucion flnat de 11256 (6 1:256) e involucroel uso de ,s tubos de ensayo. Utitizando un volumen constants de 100 lJl para. mezclar y transferir.

Mezcle y transfiera

Descarte

100 IJI de diluyente en cada tuba 1

2

3

4

5

6

7

8

. Cada tubo es una dilucicn de 1:2 del tuba anterior y la diluci6n final de cada tuba es un producto de dos fracciones

-x
2

1

-x
2

1

-x
2

1

-x
2

1

-x
2

1

1 _:x 2

-x

1 2

1
2

=

1

256

Multiplique las fracciones para encontrar la diluci6n final de cualquiera de los tubos 1 2 Para cada tubo del ejernplo: Partes transferidas

4

1

1 8

1

1
32

1

1

1

16

64

128

256

=

100 IJI

Total de partes = 200 iJl En este caso, una diluci6n en dos 0 dobte

=

1 Diluci6n endos

=

1
2

DILUCIONES SERIADAS CUADRUPLES~ Es posible preparar la misma diluci6n final det caso anterior, utntzando el mismo volumen de suero puro (100 I.d) y un nurnero menor de tubos de ensayo, por ejempio, sl deseamos prepararle con 4 tubos, es decir, la mitad de los tubas empleados en el ejemplo en referencia, cada tuba debe representar el equivalente ados dilucfones 1~2,es decir, Yz x Yz 1/4, par 10 que tendrlamos que hacer dilucianes seriadas % (6 en cuatro), tal y como se muestra a continuaci6n:

=

Mezcle y transfiera 100 fJl de suero en el primer tUbo(0:)~ ~ ~ ~ Descarte

3001-11 diluyente en cada tubo de 1 2

3

4

• Cada tubo es una diluciOn de 1:4 del tubo anterior Y' la diluci6n final de cada tubo es un producto de dos fracciones

-x
4

1

-x
4

1

-x
4

1

1 -x

4

=

1

256

Multiplique las fracciones para encontrar la diluci6n final de cualquiera de los tubos

Para cada tubo del ejemplo: Partes transferidas= Total de partes=

1 4

1 16

1

1

64

256

100 iJl 400 111

=

1
Diluci6n en cuatro

=

1

4

. En este caso, una dilUci6n en cuatro

En caso que deseemos preparar Ia misma ditucion (11256), utiJizando iniciaimente 100 IJI de suero puro y tan solo 2 tubos de ensayo. tendriamos que hacer diluciones seriadas 1/16 (0 en dieciseis), debido a que (siguiendo el rnisrno razonamiento) cada tubo debe representar una dilucion equivalente a cuatro diluciones 1:2, es de cir, % x % x % X % :; 1nS (6 ados diluciones 1:4.; '!4 x '!4 1116 ).

=

En base a 10 expuesto, preparariamos la diluci6n colocando 1500 1-111,5 ml) de ( diluyente en dos tubos de ensayo, le agregariamos 100 IJI de suero puro al primero de elias, se mezcla y se transfiere 1001-11 otro tubo, mezctariamos nuevamente y descartariamos 100 al 1-11, como en los ejemptos en referencia, obteniendose ta dilucion final deseada: 1/16 x 1116 = 1/256 rver siguiente grafico)

Mezcle y transfiera 100 111 de suero en el primer tubO(fV ~ ~ Descarte

1500 111 de diluyente en cada tubo Tubo N° 1

2

• Cada tuba es una diluci6n de 1:4 del tubo anterior y la dilucion final de cada tuba es un producto de dos fracciones

~·x
16

1

-x

1

16

=

1 256

Multtpfique las fracciones para encontrar la diluci6n final de cualquiera de los tubas

1
16 Para cada tubo del ejernplo: Partes transferidas

1
256

=

100 pi 1500 IJI

1 Diluci6n en 16

Total de partes =

=

1 16

, En este caso, una dikicion en cuatro

DILUCIONES SERIADAS A VOLUMEN VARIABLE. En ciertas circunstancias, las diluciones seriadas se preparan variando el volumen de diluyente (diluci6n seriada a vohJmenes variables).. Supongamos que tenemos la necesidad de preparar una diluci6n 11160 del suero obtenido de un paciente, la mismala podriamos obtener en la forma que se describe en el presente grafrco:

1

Mezcle y transfiera 100 pi de suero en el primer tUba{fVU0

U0 U0 U0 U0 U0
Descarte

Tuba N° . Va lumen de diluyente en cada tuba Diluci6n del tubo

1 400 fJl

2
100 ~I

3

4

5

6

1001-11 100 IJI

100~d 100 IJ\

-x
5 1
-

1

-x
2

1

-x
2 -

1

-x
-

1 2

-x 1 80

1 2

1 2 160
1

r--I
I

Diluci6n final

5

1 10

1 20

1 40

En esta altemativa fueron necesarios seis (6) tubos para IIegar a la diluci6n deseada. Cabe destacar, que cualquier pequeno error en el proceso de diluci6n aumenta exponencialmente con cada tubo adicionaL Por to tanto, siempre es mejor utifizar el numero minima de tubos para obtener las diluciones que deseamos preparar. A continuacion se muestra una forma mas eficiente de obtener la misma diluci6n usando cuatro (4) tubos de diluci6n:

Mezcle y transfiera 100 IJI de suero en el primer tuba Oescarte

Tuba N° Volumen de diluyente en cada tuba Diluci6n del tubo

1

2

3
100 IJI

4
100 pi

900 1-11 3001-11

-x
10
1 10

1

-x

1 4

-x
2

1

-x
2
-

1

1 =-

160

Diluci6n final

-

1

1
80

1

40

160

En resumen, al hacer diluciones seriadas:

• •

Recuerde que el volumen de suero que se utiliza para mezclar y transferir permanece constante, mientras que el volumen del diluyente puede variar 0 permanecer constante, con et fin de producir la dHucion mas apropiada. Para conservar el suero, use siempre el volumen mas pequerio posible para diluir. Si bien uti.liza el volumen mas pequeno posible para diluir, recuerde que no se recomienda utilizar menos de 50 ~I (vohJmenes finales) para las dituciones seriadas, porque un volumen menor que este seria dificil de contmlar con precision. Muchos errores se producen cuando s hacen diluciones seriadas porque se pierde el rastm de la secueneia. Esto puede evitarse utitizando dos carrifes adyacentes en la gradilla, de manera que, una vez mezclado el suero en el tubo correspondiente, este se coloque en el carril donde hemos decidido ordenar los tubos con las diluciones que vamos secuencialmente preparando. Cuando se usan placas de microtitulad6n, se puede utilizar una tapa 0 hacer una marea en la mesa de trabajo que indique et pociflo donde se va a agregar la muestra diluida y mover la placa despues de realizada cada dilucion. CALCULO DE FACTOR DE Df·LUCION EN DILUCIONES SERIADAS.

Es reeomendable familiarizarse con 10 que se denomina "factor de dilucion'" termino et cual esta asociado a la preparacion de diluciones seriadas como se muestr:a a continuacion: Supongamos que para realizar una determinada prueba semicuantitativa se requiere realizar las siguientes diluciones seriadas del suero: 1/10; 1/20; 1/40; 1/80; 1/160; 1/320. De cada dilucion se van a utilizar 100 IJI para la prueba inmunoserol6gica. Como se necesitan 100 IJIde cada dilucion, se pueden preparar 500 pl decada una de las diluciones

TUBO 1: Oiluci6n: 1110 . Factor de Diluci6n (FD): 10 Volumen de ta Dilucion (Vf): 500 Volumen inicial de la muestra (Vm): X

. . .. . Vol. tntclUl de la muestra(X)

=

Volumen final de La dilucian F d D., . , ( ) actor e 1 UClOn F D 500

Vol. inicial de la muestra(X)

= 10
puro

lJl

Vol. inicial de fa muestra(X) ::::50 liZ de suero En el tube W 1 se anaden 450

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