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Manual Completo de Bioquimica a

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA

BIOQUIMICA MICROBIANA

MANUAL DE PRACTICAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA

INTRODUCCION

Principios fundamentales de bioquímica microbiana El termino metabolismo se utiliza para aludir a todos los procesos químicos que tienen lugar dentro de una célula .

El metabolismo de los compuestos orgánicos que contienen formas reducidas de carbono es la fuente de energía de la mayoría de los microorganismos la serie de reacciones que comprenden la oxidación de un compuesto se denomina vía bioquímica . A continuación se describe un panorama general simplificado del metabolismo celular.
Catabolismo y anabolismo • Que es el metabolismo? – Metabolismo intermediario – Ruta metabólica • Lineal • Ramificada • Cíclica • Espiral

Catabolismo • Degradación de moléculas complejas a moléculas simples como lactato, piruvato, etanol, CO2, H2O, NH3 • Reacciones de oxidación • Ganancia de energía • 12 metabolitos precursores

Etapas del catabolismo • Etapa 1. degradación de macromoléculas en sus respectivos componentes • Etapa 2. las moléculas simples se oxidan a un metabolito común • La acetil-CoA entra al ciclo CAC donde se oxida a CO2

Anabolismo FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA • Construcción de biomoléculas • Se necesita energía • Etapas principales – Biosíntesis – Polimerización – Ensamblaje

Macro y micronutrientes • Macronutrientes – C, O, H, N, P, S, K, Fe, Ca, Mg. – 95% de DW • Micronutrientes – Elementos traza • Zn, Cu, Mn, Ni,

Composición celular Elemento % DW C 50 O 20 N 14 H 8 P 3 S 1 K 1 Na 1 Ca 0.5 Mg 0.5 Fe 0.2 Cl 0.5

Requerimientos nutricios • Requerimientos de C – Fuente de energía – Elemento para síntesis de compuestos celulares – Clasificación en base a necesidades nutricionales de fuentes de C • Autótrofos – Fotoautótrofos – Quimioautótrofos • Heterótrofos – Fotoheterótrofos – Quimioheterótrofos

Requerimientos de N FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA – Necesarios para sintetizar enzimas, proteínas y aa • Requerimientos de S y P – S necesario para fabricar proteínas, coenzimas y aa – P fabricación de ácidos nucléicos, fosofolípidos, ATP

Factores de crecimiento • Aminoácidos • Purinas y pirimidinas • Vitaminas

Captación de nutrientes • Transporte pasivo – Difusión • Gradiente de concentración • Transporte activo – Requiere energía – Tras locación de grupo Medios de cultivo • Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar microorganismos específicos o facilitar la identificación de una especie en particular Medios de cultivos • Por su composición los medios se clasifican en: – Complejos • No se conoce la composición exacta del medio • Puede contener – Extractos e Infusiones vegetales o animales. – Hidrolizados pancreáticos o ácidos. – Sintéticos • Se conoce la composición química del medio Crecimiento microbiano y rendimiento • El crecimiento neto esta dado por: Y = - dX dS Eficiencia •Aerobios 50% •Anaerobios 10%

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA

Objetivo Conocer a grandes rasgos los diferentes medios de cultivo para el optimo crecimiento de los diferentes microorganismos , así como los cambios en dichos medios de acuerdo a las reacciones bioquímicas que llevan a cabo los microorganismos para obtener los nutrientes necesarios a para su crecimiento.

Pruebas de Identificación

Prueba

Descripción
Es un medio diferencial que permite distinguir entre enterobacterias que hidrolizan lactosa y las que no lo hacen. La hidrólisis de la lactosa produce ácidos orgánicos y las colonias que la hidrolizan adquieren un color rojo. Las colonias lactosas negativas permanecen incoloras aunque el medio tira a amarillo por la subida de pH que origina la utilización de las proteínas (peptona) del medio Se inoculan placas del medio y se incuban a 37 oC

Resultado

Agar MacConkey

Positivo Negativo Sin crecimiento

Agar sangre

Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son enzimas que lisan los

Hemolisis alfa Hemolisis

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA hematies. Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematies. Se siembre por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba Esta enzima hidoliza la lactosa originando glucosa y galactosa

beta Hemolisis gamma Sin crecimiento Sin resultados

Beta galactosidasa

Se añade un sustrato artificial ortocitrofenial galactósido (ONPG) que hidrolizado por la ßgalatosidasa originandose en color amarillo La catalasa es una enzima que proteje a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno. Es util para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva) La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima.

Positivo Negativo

Catalasa

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Es uno de los test del IMVIC usado para diferenciar enterobacterias. el crecimiento consume el ácido y como consecuencia se produce un incremento de pH en el medio y el indicador tira de verde a azul. El citrato es la única fuente de carbono y se realiza sembrando la bacteria en la superficie de un agar de Simmon's inclinando el tubo La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. Los Staphylococcus aureus patógenos dan una reacción postiva y los no patógenos negativa Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa. El microscopio de contraste de fases es un sistema en el que se acentúa la diferencia del índice de refracción entre las células y el medio incrementando así el contraste en células translúcidas sin uso de colorantes. Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo convierten en aminas que incrementan el pH del medio y el

Citrato

Positivo Negativo

Coagulasa

Positivo Negativo

Contraste de fases

Bacilos Cocos

Descarboxilas a

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias. Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un indicador de pH (púrpura de bromocresol) Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA

de aminoácidos

DNasa

Se hace una estría gruesa una placa conteniendo DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado.

Positivo Negativo

Las Endosporas son formadas por Bacillus y (calentamiento) Clostridium. Son Formas de resistencia, metabolicamnete inactivas que resisten la alta temperatura, la desecación y la radiación.

Esporas

Positivo Negativo

Las endosporas pueden sobrevivir al calentamiento y originan nuevas formas vegetativas en un medio de cultivo. Se inocula un tubo de caldo con una suspensión sospechosa de contener endosporas. Se calienta a 80 oC durante 10 min. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Se enfría y se incuba a temperatura adecuada. Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido carboxílico

Fenilalanina desaminasa

Se incolulan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina. Después de la incubación se añade una solución de cloruro férrico. Las bacterias anaerobias o anaerobicas facultativas a menudo fermentan carbohidratos a ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH y una campana Durham. Se pueden ensayar diferentes azúcares como sustrato para diferenciar especies sobre todo bacterias entéricas. Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequeña cantidad de peptona, un indicador de pH y una fuente de carbono fermentable al 1-2 % y se coloca dentro de los tubos una campana Durham.

Positivo Negativo

Fermentación de azucares

Acido Acido + gas Negativo Sin ácido

Gram

La tinción de Gram es la más importante de las tinciones diferenciales. Las células Gram positivas retienen el cristal violeta cuando se tratan con etanol

Bacilos Gramnegativos Bacilos Grampositivos

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA mientras que las gram negativas no lo tienen y se tiñen entonces del color rojo de la safranina. Diferencias en la estructura de la pared son las responsables de este comportamiento. Se tiñe con cristal violeta Se trata con lugol como mordiente Se decolora con etanol 96o Se añade safranina como colorante de contraste La esculina contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus. Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato férrico.

Cocos Grampositivos Cocos Gramnegativos

Hidrólisis de Esculina

Positivo Negativo

Hidrólisis de gelatina

La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer. La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteina no hidrolizada. Algunas bacterias excretan lipasas extracelulares que pueden hidrolizar lípidos grandes en sustratos de bajo peso molecular que son trasportados al interior de la célula para ser utilizados en el crecimiento. Una emulsión de lípidos y un indicador llamado Spirit Blue se incorporan en un medio sólido complejo. Los polisacaridos, como el almidón son demasiados largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligo o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer. La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

Hidrólisis de lípidos

Positivo Negativo

Hidrólisis del almidon

Positivo Negativo

Hidrólisis del hipurato

El hipurato es un compuesto orgánico aromático que puede ser hidrolizado enzimáticamente originando benzoato y glicina. Este test

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA se usa a menudo para diferenciar especies de Streptococcus. Una suspensión de bacterias se añade a una solución de hipurato y se incuba 2 horas. En ese momento se añade la nihidrina. Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias. Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptófano en indol La bacteria se crece en medios que contienen triptófano (caldo de triptoma). La presencia de indol se ensaya añadiendo dimetilaminobenzaldehído. El KCN inhibe la cadena de transporte de electrones uniéndose a los citocromos impidiendo el crecimiento microbiano. Sin embargo, algunas bacterias no son inactivadas y pueden nacer. Las bacterias se inoculan en caldo de peptona que contiene cianuro potásico.

Indol

Positivo Negativo

Inhibición por KCN

Sensible Resistente

Motilidad

La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El movimiento puede observarse en preparación en fresco con el microscopio de contraste de fase

Movil Inmovil

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Para ver la movilidad se realiza una preparación en fresco que se observa en contraste de fases. La movilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las corrientes en la preparación. En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2 gas. El oxígeno es el aceptor final de e- en el metabolismo respiratorio. en condiciones anaerobicas en ausencia de un aceptor de e- como nitrato, las bacterias sólo pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En este test se evalúa la capacidad de las bacterias para oxidar y/o fermentar (oxidación produciendo ácido que se -fermentación) detecta gracias al azul de bromotinol (indicador de pH) Es útil en la distinción de pseudomonas y enterobacterias.

O-F

Fermentativo Oxidativo Negativo

Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se recubre con aceite de parafina para aislarlo del oxígeno (tubo de fermentación) y otro no (tubo de oxidación)

Oxidasa

La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e- puede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial pfenilendiamina. Este test se

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA usa para diferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo) Se impregnan discos de papel con parafenilandiamina y se coloca en un cultivo creciendo en placas de agar nutritivo. Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato. La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un precipitado negro de FeS Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato metionina y sulfato ferroso.

Producción de sulfhídrico

Positivo Negativo

Reducción de nitrato

Algunas bacteris pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiración. el nitrato puede ser reducido a nitrito o en un paso más a gases (óxidos de nitrógeno). Las enterobacterias y pseudomonas son usualmente positivos. Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfanalfilamina y

Positivo Negativo

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA ácido sulfanílico produciendose un color rojo. Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido a más que a nitritos produciendose gas. Si al añadir zinc en polvo no hay color rojo es que no hay nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificación) Es uno de los test del IMVIC para bacterias entéricas. Algunas vias fermentativas originan ácidos orgánicos mientras otras originan productos que son neutros.

Rojo de metilo

Las bacterias se crecen en caldo de glucosaçpeptona. Si se fermenta el azúcar el pH baja por debajo de 4.3. Se añade rojo de metilo como indicar que es rojo a pH <4.3. y amarillo a pH >4.3.

Positivo Negativo

Tioglicolato

Este medio se usa para Aerobio determinar el efecto del Anaerobio oxígeno sobre el Facultativo crecimiento microbiano. Un Microaerobi tubo con medio semisólido o contiene tioglicolato para reducir el potencial redox del medio. Así sólo hay oxígeno en la superficie y no en el resto del tubo. Un indicador redox, resazurina, indica si hay oxígeno (rojo) o no (incoloro). El tubo es inoculado con un asa de punta y se incuba hasta que se produce su FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA crecimiento. Este enzima hidroliza la urea (H2N-CO-NH2) y origina amonio lo que producirá un incremento del pH que puede detectarse con un indicador. Las bacterias se inoculan en un medio con glucosapeptona y urea al 2%. Como indicador de pH se utiliza rojo fenol La mayoría, pero no todas las bacterias pueden crecer en medios simples con una única fuente de carbono. Este método permite ensayar tal habilidad y la capacidad para utilizar sustratos específicos. Las bacterias se inoculan en medios simples conteniendo diferentes sustratos orgánicos como fuentes de carbono y energía. Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las especies que llevan a caso fermentación a butanodiol de la glucosa acumulan acetoína en el medio. Las bacterias se inoculan en caldo glucosa-peptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación butanodiólica de la glucosa aumentean acetoína en el medio.

Ureasa

Positivo Negativo

Utilización Fuentes de Carbono

Positivo Negativo

VogesProskauer

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Se añade alfanaftol en medio alcalino (KOH). La acetoina se convierte en diacetilo que

Cuestionario. 1. ¿Qué es el metabolismo microbiano.? 2. ¿Cómo se divide? 3. Mencione los macronutrientes 4. ¿ cuales son los nutrientes trazas y porque se conocen con ese nombre? 5. ¿ Cual es el elemento mas importante y de mayor concentración en los metabolismos microbianos ¿

Practica 2
FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA Introducción
Las vías para la oxidación de los compuestos organicosy la conservación de la energía en el ATP se pueden dividir en 2 grupos principales la Fermentación y la respiración : FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA En ausencia de un aceptor de electrones ,muchos organismos efectuar reacciones redox balanceadas de algunos compuestos organicos, con liberación de energía a este proceso se le llama fermentación. Fermentacíon de la glucosa. Oxidación y producción de ATP . Aunque vista superficialmente parece compleja, la vía bioquimica para la degradación de la glucosa es en realidad muy simple , y se puede dividir en tres partes principalmente. La etapa I es una serie de reacciones de reacomodación preparatoria que no implica oxido – reducción y no liberan energía pero conducen a la producción de dos moléculas de un compuesto intermedio clave , el gliceraldehido-3-fosfato – En la etapa II hay oxido-reducción , se produce energía de en lace fosfato alto en energía , en forma de ATP y se forman dos moléculas de piruvato. En la etapa III ocurre una segunda reacción de oxido-reducción y se forman los productos de fermentación ( etanol , CO₂ y acido láctico. Rojo de Metilo (M) El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos organicos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato. El microorganismo en estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algún carbohidrato fermentable, el más común es la glucosa aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc, adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reacción positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de ácidos orgánico producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo) Objetivo. Empleando los medios de cultivo adecuados ver prácticamente la facultad de algunos microorganismos para fermentar la glucosa. Material • • • • Mechero bunsen Asa bacteriológica en punta Medio TSI Caldo lactosado

Material biológico • Cepas bacterianas Procedimiento

1. Cerca de la llama del mechero inocular con el asa en punta el medio de TSI y los
tubos con caldo lactosado conteniendo campana de Durhan

2. Incubar de 18 a 24 horas a una temperatura de 35-37⁰ C
3. Anote sus resultados. 4. Realizar la prueba de catalasa

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Prueba de la Catalasa Fundamento La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva. Material y Portaobjetos. H2O2 de 10 volúmenes Cultivos en fase exponencial reactivos de bacterias.Asas e hilos de siembra. Pipetas Pasteur Mátodo 1. Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur. 2. Suspender la bacteria 3.Detectar la formación de burbujas

Cuestionario 1. Explique brevemente como se lleva a cabo la fermentación de la glucosa 2. ¿Por qué cambia de color el medio? 3. Mencione algunas de las rutas empleadas por los procariotas fermentativos.

4. ¿Por qué realizamos la prueba de catalasa.? Explique
.

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Practica 3 PRUEBA DE INDOL
La prueba del indol es una prueba bioquímica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminoácido triptófano. Esta división molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa. Se genera el indol por una desaminación reductiva del triptófano via la molécula intermediaria ácido indolpirúvico. Las triptofanasas catalizan la reacción de desaminación, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molécula de triptófano. Los productos finales de la reacción son el indol, ácido pirúvico, amoníaco (NH3) y energía. Como coenzima de la reacción se requiere al fosfato de piridoxal.

Material • • • • Asa bacteriológica Mechero bunsen Medio MIO Reactivo de Kovac´s o Erlich

Material biológico • Cepas microbianas

Procedimiento
Tal como ocurre con muchas pruebas bioquímicas, los resultados de una prueba de indol se indican con el cambio de color que sigue a la reacción. El cultivo bacteriano puro debe ser sembrado en un caldo con triptofano o peptona estériles o ambos por 24 a 48 horas antes de
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realizar la prueba. Luego de la incubación, se añaden cinco gotas de reactivo Kovac (alcohol isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico concentrado al caldo del cultivo. Una variante de la prueba se realiza usando el reactivo de Ehrlich's (usando alcohol etílico en lugar del alcohol isoamilo, desarrollado por Paul Ehrlich), en especial si se tiene un organismo que no sea fermentador y en organismo anaeróbico. Los resultados positivos se muestran por la presencia de un color rojo o rojo-violeta en la superficie de la capa de alcohol en el cultivo. Un resultado negativo se muestra amarillo. Un resultado variable puede ocurrir cuando se muestra un color anaranjado. Ello es debido a la presencia de escatol, también conocido como metil-indol o indol metilado, otro posible producto de la degradación del triptófano.

Bacteria indol positiva

Resultado Positivo para prueba de Indol

Las bacterias que resultan indol positivas al romper el indol del triptófano, incluyen:
• • • • • • • • • • Aeromonas hydrophilia, Aeromonas punctata, Bacillus alvei, La mayoría de los Citrobacter spp., Edwardsiella spp., Escherichia coli, Flavobacterium spp., Haemophilus influenzae, La mayoría de los Proteus spp. (excepto P. mirabilis), Plesiomonas shigelloides, Pasturella multocida, Pasturella pneumotropica, y FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA • Vibrio spp.

Bacteria indol negativa
Las bacterias que generan un indol negativo en esta prueba, incluyen:
• • • • • • • • • • • • • • • Actinobacillus spp., Aeromonas salmonicida, Alcaligenes spp., La mayoría de los Bacillus spp., Bordtella spp., Enterobacter spp., La mayoría de los Haemophilus spp., La mayoría de los Klebsiella spp., Neisseria spp., Pasturella haemolytica, Pasturella ureae, Proteus mirabilis, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Serratia spp., Yersinia spp.

Cuestionario 1. ¿Para diferenciar que tipo de microorganismos se realiza una prueba de indol? 2. ¿Cuál es la reacción que se lleva a cabo en dicha prueba? 3. ¿ A que se debe el color del anillo formado? 4. ¿ Que es el triptófano? 5. ¿ Que tipo de reacción se lleva a cabo?

Referencias
• MacFaddin, Jean F. "Biochemical Tests for Indentification of Medical Bacteria." Williams & Wilkins, 1980, pp 173 - 183

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Practica 4

Coagulasa

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA G X50 000 (MET technique par cryofracture) S. aureus forma una cápsula de fibrina que le protege del sistema inmunológico de una vaca

La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distingir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene S. aureus.Esta proteína también es producida por Yersinia pestis.[1] La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama staphylothrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La coagulasa esta estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que esta cubierta de fibrina del Staphylococcus es capaz de resistir la fagocitosis haciendo esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor . La coagulasa Bound es parte de una familia más grande de MSCRAMM Se piensa que la toxicidad de Staphylococcua aureus es debida a la presencia de coagulasa, además de las enterotoxinas que posee. Material • • • Laminillas Tubo de ensaye Agitador de madera (palillos)

Material biológico • • Plasma de conejo con EDTA Cepas bacterianas (S.aureus)

Prueba de la coagulasa
Prueba de la Coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus aureus del coagulasenegative staphylococci. S.aureus produce 2 formas de coagualasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada también conocida como "factor de Clumping " se puede detectar mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de coagulasa de tubo.
Prueba de portaobjetos

Prueba del portaobjetos se hace conjuntamente con un control negativo para descartar auto aglutinación. Se ponen 2 gotas de solución salina en el portaobjetos microescópico rotulado con un número de muestra, Test (T) y control (C). Las 2 gotas son emulsionadas con la prueba de organismo mediante el uso de un cable de lazo, cable recto, o un palo de madera. Se pone una gota de plasma (plasma de conejo con anticoagulante (EDTA)[1] ) en la gota de
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solución salina inoculada correspondiente a la prueba y se mezcla bien con un una varilla de madera. Agitar el portaobjeto con cuidado unos 10 segundos.
• Si es positivo: Se podrá observar aglutinacion macroescopica en el plasma en los 10 segundos mientras que no se observara aglutinamiento en la gota de solucion salina. Si es negativo: No se observara aglutinamiento.

NOTA: Si la prueba de la coagulasa de portaobjetos fuera negativa, deberia hacerse una prueba de tubo como confirmación. El aglutinamiento en las dos gotas es un indicativo de auto aglutinación y por lo tanto debemos descartar la prueba de tubo.
Prueba del tubo de ensayo

coágulos formados por la reacción de la coagulasa en un tubo de ensayo

La prueba se utiliza plasma que ha sido incoculado con una colonia de staphylococcal (por ejemplo, con un coco gram positivo catalasa positivo). Luego el tubo se incuba a 37 grados Celsius en 1½ horas. Si es negativo entonces continuamos la incubacion por unas 18 horas.
• Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero coagulará,[2] dando como resultado un coágulo (a veces el coágulo esta tan desarrollado que el liquido se solidifica completamente). Si sale negativo, el plasma permanece liquido. Un resultado negativo podria indicar que se podría tratar de S. epidermidis pero solo con unas pruebas mas precisas se puede confirmar este hecho, como por ejemplo el API o métodos de BBL CRYSTAL. Lista de staphylococci coagulasa positivo : Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Staphylococcus delphini, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans.

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA • Lista de' 'staphylococci coagulasa negativo de relevancia clinica: S.saprophyticus, S.cohnii subsp. cohnii, S.cohnii subsp. urealyticum, S.captitus subsp. captitus, S.warneri, S.hominis, S.epidermidis, S.caprae.

Cuestionario.
1. 2. 3. 4. 5. ¿ Que es la coagulasa .? ¿Cómo actua? ¿ Podria emplear plasma humano en lugar de conejo en la prueba? Menciona algunas bacterias coagulasa positiva Mencione algunas bacterias coagulasa negativo

Referencias
1. ↑ A.Forbes, Betty; Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. BAILEY& SCOTT'S Diagnostic Microbiology (Tenth Edition edición). Don Ladig. pp. 430 431. ISBN 8-8151-2535-6. 2. ↑ coagulase test en el Diccionario Médico de Dorland

Practica 5
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Prueba de la Oxidasa
Principio del formulario Final del formulario

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno (ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para
• •

Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpuranegruzco intenso. Realización de la prueba:
1. Método en placa directa

• •

Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

1. Método indirecto sobre papel

• • • •

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.
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Prueba de la Fundamento

oxidasa Determina la presencia del citocromo C, El citocromo C oxida al NNN'N',tetrametil,1-4,fenilendiamina (solución acuosa al 1% (p/v). La oxidación se detecta como color azul.

Material reactivos

y Papel de filtro cortado (trozos de 3x 1 cm) ;Placas de Petri ;Reactivo de oxidasa: Solución al 1% de NNN'N', tetrametil, 1-4 fenilendiamina en agua destilada. El reactivo de oxidasa es bastante tóxico, manejar con precaución. Se altera por la luz y el oxígeno, por lo que debe ser de preparación extemporánea y protegerse envolviéndolo con papel negro 1-Poner un trozo de papel de filtro sobre una de las tapaderas de una placa de Petri. 2-Añadir una gota del reactivo de oxidasa. 3-. Depositar sobre el reactivo masa bacteriana (actuar de forma rápida y con un asa de platino nueva o con un palillo de dientes)

Método

Resultado

La reacción positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de 10 segundos La imagen muestra varias bacterias que carecen de citocromo c oxidasa terminal y dos que las poseen (posiciones sobre las 11 y sobre las 13)

Cuestionario. 1. La prueba de oxidasa, ¿Para que nos sirve? 2. ¡ Que es el citocromo C .? 3. ¿ Cuando se da como positiva .?
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Helicobacter Pylori Urease drawn from PDB 1E9Z.

Practica 6
Prueba de la Ureasa
La ureasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea a dióxido de carbono y amoníaco. La reacción ocurre de la siguiente manera:
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(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3 En 1926, James Batcheller Sumner demostró que la ureasa es una proteína. Es producida por bacteria, hongos y varias plantas superiores.

Características
• • • • • • Peso molecular: 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de frijol. Metal en el sitio activo: Niquel(II). pH óptimo : 7.2 Temperatura óptima: 50 °C Especificidad enzimática: urea e hidroxiurea. Inhibidor enzimático: metales pesados.

Diagnóstico

prueba de ureasa

Los organismos que producen ureasa tienden a ser patógenos del tracto gastrointestinal o urinario, siendo que la ureasa les permite neutralizar el ácido presente en estos medios acídicos. Los patógenos ureasa positivos, incluyen:
• • • • • Helicobacter pylori Bacterias entéricas incluyendo Proteus, Klebsiella y Serratia. Nocardia, una bacteria filamentosa. Ureaplasma urealyticum, relacionada con mycoplasma. Cryptococcus, un hongo oportunista.

Prueba de la Ureasa
Se cultiva el microorganismo en investigación en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del esterilizado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa. Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.[1][2]

Referencias
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA 1. ↑ «Prueba de la Ureasa». 2. ↑ http://www.joseacortes.com/galeriaimag/microorganismos/ureasa.jpg Obtenido de title=Ureasa&oldid=52803945» «http://es.wikipedia.org/w/index.php?

Practica 7
OF Oxidación – Fermentación
En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO₂ gas . el oxigeno es el aceptor final de electrones, en el metabolismo respiratorio,en condiciones anaerobias en ausencia de un aceptor de electrones como nitrato, las bacterias solo pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En el laboratorio empleamos el medio de OF, para el ensayo de oxidación –fermentación o medio de Hugh y Leifson para evaluar la capacidad de oxidar y fermentar produciendo acido que se detecta gracias al azul de bromotimol, como indicador, que vira a amarillo al acidificarse el medio . La degradación se estudia con aporte de aire (con lo que es posible la degradación oxidativa y fermentativa) y sin aire (solo la degradación fermentativa). Metabolismo de carbohidratos de algunas especies importantes. Microorganismo Alcalig.fecalis Ps.aeruginosa Bact.anitratum S.dysenteriae S.sonnei Vibrio comma S.enteritidis E.coli S S S S S SG SG glucosa Aero anae S S S SG SG lactosa aero S S SG anae S SG sacarosa aero S ana S -

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Significados de los signos: – = reacción neutral o alcalina S = formación de acido SG =formación de acido y gas Material. • • • • • • Material biológico • Cepas a investigar Asa bacteriológica Mechero bunsen Parafina Aceite mineral Medio OF con glucosa Estufa bacteriologica

Procedimiento 1. A partir de un cultivo de la cepa a investigación , que se encuentre lo mas posible en fase logarítmica, se siembra por picadura,hasta el fondo , dos tubos conteniendo el medio OF 2. Uno de los tubos se sella colocando una capa de aceite mineral y después una de parafina. 3. Se incuban por 48 horas 4. Anote sus resultados Cuestionario 1. Mencione brevemente como se lleva a cabo el metabolismo oxidativo 2. Mencione brevemente en que consiste un metabolismo fermentativo 3. ¿explique como funciona el medio OF .? 4. ¿ En base a que escogería el azúcar que se pondra al medio OF? 5. ¿ Cual es el objeto de sellar un tubo?

Practica 8 MOTILIDAD
Introducción.
La quimiotaxis es el movimiento que lleva a cabo un organismo para acercarse a una sustancia química o alejarse de ella. La quimiotaxis positiva se refiere a los movimientos para acercarse a dichja sustancia y se presenta cuando ésta es benéfica para ellas (ejemplo
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un nutriente) . la quimotaxis negativa es el movimiento para elejarse de una sustancia que le es perjudicial. Las sustancias químicas que inducen le quiniotaxis positiva se llaman atrayentes y las negativas repelentes. . La quimiotaxis es un fenómeno de comportamiento y sugiere cierto tuipo de respuesta nerviosa. La mayoría de los trabajos se ha llevado a cabo en dos especies, E.coli y S,typhimurium. Al analizar un gran numero de células podemos ver que el comportamiento bacteriano se divide en dos tipos de acción , que reciben el nombre de corridas y vueltas. ,el resultado final es que el microorganismo se mueve hacia el atrayente o se aleja del repelente. Y es el mecanismo sensorial químico el que controla este movimiento. Por medio de una gran cantidad de estudios bioquímicos se ha demostrado que las bacterias poseen quimioreceptores específicos, que perciben la presencia de un compouesto. estos quimioreceptores son proteínas situadas en la periferia de la célula y se unen a la substancia química. Las proteínas de enlace que participan en la quimiotaxis son, en algunos casos las mismas que participan en el transporte de los nutrientes al interior de las células. Se han identificado por lo menos 4 proteinas citoplasmáticas que participan en el proceso de emisión de señales . dos controlan la dirección de la rotación flagelar y otras dos la exitación flagelar. Obviamente la quimiotaxis es el resultado de una serie de reacciones reguladoras en cascada. El movimiento bacteriano pude ser por medio de flagelos, cilios y amiboideo. Objetivo Empleando medios de cultivo diseñados para este fin, observar la movilidad de algunas cepas bacterianas.

El medio de cultivo es un medio semisólido con tripteina , que es un digestivo pancreático de la caseína, constituye una fuente de nitrógeno, aminoacidos y carbono necesarios para favorecer el crecimiento bacteriano. Además contiene triptófano que permite la detección de triptofanasa, por liberación de indol y cloruro de sodio que permite mantener el balance osmótico del medio y agar como agente solidificante.

Material • • • • • • • Asa bacteriológica Mechero bunsen Estufa bacteriología Microscopio SSI Portaobjetos Cubreobjetos
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• •

Medio MIO o SIM Cepas a investigar.

Material biológico

Procedimiento 1. Sembrar el medio a partir de un cultivo de 18-24 horas por punción profunda en linea recta 2. Incubar de 24-48 horas 3. Montar una preparación en fresco de las diferentes cepas y observar al microscopio para determinar por examen en fresco si son miviles o no. 4. Revisar el cultivo y anotar los resultados Cepas móviles : producen turbidez que se extiende mas alla de la línea de siembra Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la lines de siembra.

Cepa Escherichia coli Klebsiella Shigella Salmonella typhimurum Proteus Cuestionario

Movilidad + + +

1. Explique a que se refiere el movimiento corridas y vueltas 2. ¿Qué es una sustancia atrayente y una repelente? 3. ¿Cuáles son los medios de que se basa una bacteria para llevar a cabo su quimotaxis?

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Practica 9 Reducción de sulfatos y producción de H₂S
Introducción
Varios compuestos inorgánicos de azufre son importantes aceptores de electrones en la respiración anaerobia.el sulfato, la forma mas oxidada de azufre, es uno de los principales aniones en el agua de mar y se utiliza por las bacterias reductoras de sulfato, grupo que esta muy ampliamente distribuido en la naturaleza. El producto final en la reducción del sulfato es H₂S, un importante producto natural que participa en muchos procesos biogeoquimicos.comprende metabolismo de asimilación cuando se reduce para usarlo como fuente de nutriente y de desasimilación cuando se usa como aceptor de electrones para el metabolismo de energía .las bacterias utilizan el sulfato como fuente de azufre para la biosíntesis., pero la capacidad de utilizar el sulfato como aceptor de electrones para los procesos de generación de energía esta restringuido a un grupo muy especial de bacterias anaerobias obligadas. En la reducción asimilativa de sulfato, el H₂S que se forma se convierte en azufre organico en forma de aminoácidos, etc., pero en la reducción desasimilativa del sulfato se excreta como H₂S. las bacterias reductoras de sulfato,son suceptibles a la toxicidad del H₂S, pero en general hay suficiente hierro en el ambiente en que viven , que todo el H₂S formado se elimina como FeS . el color negro donde se efectuar reducción de sulfatos se debe a la acumulación de FeS.+ Un medio de cultivo que nos permite observar esta reducción de sulfatos es agar XLD (xilosa-lisina-desoxicolato). Forma de actuación. La degradación a acido de la lactosa,xilosa y sacarosa produce un viraje a amarillo del rojo de fenol que tiene como indicador. El tiosulfato y la sal de hierro III (citrato de amonio y hierro III) que contiene revelan la formación de acido sulfihidrico por la precipitación de FeS negro en las colonias.las bacterias que descarboxilan la lisina, produciendo cadaverina, se reconocen por la presencia de un alo rojo-purpureo, debido al aumento de pH , alrededor de sus colonias. Colonias H₂S – – – – + + + microorganismo E.coli, Enterobacter, Aeromonas Klebsiella Citrobacter(cepas lactosa-positivas) Serratia Proteus vulgaris , P.mirabilis Salmonella
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Material • • • • • Asa bacteriológica Mechero bunsen Placas de agar XLD Estufa

Material Biologico Cepas

Procedimiento
1. Con una cepa de 18-24 horas inocular por estria cruzada placas de medio XLD 2. Incubar de 18-24 horas 3. Revisar y anotar resultados

Cuestinario
1. Describa brevemente el mecanismo para la reducción de sulfatos tanto la vía asimilativa como la desasimilativa. 2. ¿Por qué es toxico el H₂S para los organismos en general? 3. ¿Qué sucede en el interior de las minas con la presencia de H₂S y como se neutraliza este efecto?

Practica 9 Respiración anaeróbica

.

El proceso anaeróbico es un proceso biológico de oxidorreducción de monosacáridos y otros compuestos en el que el aceptor terminal de electrones es una molécula inorgánica
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distinta del oxígeno, y más raramente una molécula inorganica cadena transportadora de electrones análoga a la de la mitocondria en la respiración aeróbica.[1] No debe confundirse con la fermentación, que es un proceso también anaeróbico, pero en el que no participa nada parecido a una cadena transportadora de electrones y el aceptor final de electrones es siempre una molécula orgánica como el NAD. En el proceso anaeróbico no se usa oxígeno, sino que para la misma función se emplea otra sustancia oxidante distinta, como el sulfato o el nitrato. En las bacterias con respiración anaerobia interviene también una cadena transportadora de electrones en la que se reoxidan los coenzimas reducidos durante la oxidación de los substratos nutrientes; es análoga a la de la respiración aerobia, ya que se compone de los mismos elementos (citocromos, quinonas, proteínas ferrosulfúricas, etc.). La única diferencia, por tanto radica, en que el aceptor último de electrones no es el oxígeno. Todos los posibles aceptores en la respiración anaeróbica tienen un potencial de reducción menor que el O2, por lo que, partiendo de los mismos sustratos (glucosa, aminoácidos, triglicéridos), se genera menos energía en este metabolismo que en la respiración aerobia convencional. No hay que confundir la respiración anaeróbica con la fermentación, en la que no existe en absoluto cadena de transporte de electrones, y el aceptor final de electrones es una molécula orgánica; estos dos tipos de metabolismo tienen solo en común el no ser dependientes del oxígeno. En la siguiente tabla se muestran distintos aceptores de electrones, sus productos y algunos ejemplos de microorganismos que realizan tales procesos:

Aceptor Nitrato Sulfato Azufre CO2 Fe3+ Mn4+ Selenato Arsenato Fumarato

Producto final Nitritos, óxidos nitrógeno y N2 Sulfuros Sulfuros Metano Fe2+ Mn2+ Selenito Arsenito Succinato

Microorganismo de Pseudomonas, Bacillus Desulfovibrio, Clostridium Thermoplasma Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus Shewanella, Geobacter, Geospirillum, Geovibrio Shewanella putrefaciens Desulfotomaculum Wolinella succinogenes, Desulfovibrio, E. coli Campylobacter, Escherichia Desulfomonile FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

DMSO DMS TMAO TMA Clorobenzo Benzoato ato

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Muchas bacterias aeróbicas contienen las enzimas nitrato-reductasas que catalizan la reducción de nitrato a nitrito:[2]

NO3– + 2e– + 2H+ → NO2– + H2O

No obstante, el producto resultante (nitrito) es muy tóxico por lo que algunas especies de Pseudomonas y Bacillus pueden reducir el nitrato más allá del nivel de nitrito hasta nitrógeno molecular:
2NO3– + 10e– + 12H+ → N2 + 6H2O

El resultado final, nitrógeno, es un gas inerte y no tóxico. Este proceso se conoce como desnitrificación que, si se produce en el suelo se considera perjudicial para la agricultura ya que ocasiona la pérdida de los nitratos, necesarios para el crecimiento de las plantas.[1] Las bacterias reductoras de nitratos son anaerobias facultativas ya que el uso de nitratos y nitritos como aceptores de electrones son procesos alternativos que pueden utilizar estas bacterias para crecer en ausencia de oxígeno. En presencia de él, aunque el nitrato esté presente, la respiración procede enteramente a través de la cadena aeróbica de transporte de electrones.

Objetivo: empleando el medio de cultivo diseñado para este fin poner de manifiesto la
reducción de nittratos a nitritos.

Glucosa Nitrato Agar

.

Medio desarrollado por Casellas, para estudiar simultáneamente la reacción de oxidación o fermentación de glucosa y la reducción de nitratos a nitritos, por bacilos Gram negativos de fácil desarrollo. Esta prueba es útil para diferenciar especies bacterianas. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de carne aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, la glucosa es la fuente de energía y el azul de bromotimol es el indicador de pH. El nitrato de potasio es el sustrato de la enzima nitrato reductasa. El contenido de agar, otorga la propiedad de ser un medio semisólido, que permite determinar la movilidad y la distribución de los productos ácidos sobre la superficie o en el medio de cultivo. Algunas bacterias pueden fermentar anaeróbicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas pueden metabolizarla por ambos métodos, mientras que otras son incapaces de usarla. Asimismo, las bacterias muestran diferencias en los ciclos utilizados para esos procesos finales. Estas diferencias ayudan a la identificación bacteriana.
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La hidrólisis de la glucosa acidifica el medio, haciendo virar el azul de bromotimol de verde a amarillo Si este viraje ocurre solo en la parte superior del tubo, indica oxidación de la glucosa; si todo el medio vira al amarillo, hay reacción fermentativa, y si no vira o adquiere un color azulado,se presume que el microorganismo no utiliza glucosa. En este medio, además, puede detectarse la movilidad observando si el crecimiento se aleja de la línea de punción, enturbiando el medio. La reducción del nitrato a nitrito o gas nitrógeno por medio de la enzima nitrato reductasa, es un proceso de oxidación por el cual el nitrato proporciona oxígeno para ser usado como aceptor de electrones. El nitrito presente en el medio puede detectarse con el reactivo de Griess A (B15-501-61) y Griess B (B15-502-61) Britania, dando un compuesto diazoico coloreado. Si se observan burbujas en el medio, éstas son de gas nitrógeno, ya que el nitrito intermediario inhibe las decarboxilaciones. Fórmula (en gramos por litro) Peptona Cloruro de sodio Extracto de carne Glucosa Agar Azul de bromotimol Nitrato de potasio pH final: 7.4 ± 0.2 Siembra Por punción en profundidad con ansa recta, a partir de un cultivo puro de 24 horas. Incubación Durante 48 horas, a 35-37 ºC, en aerobiosis. Algunos microorganismos requieren hasta 4 días, y otros hasta 14 días de incubación. Resultados 1-Metabolismo de la glucosa: -Microorganismos oxidativos: color amarillo en la parte superior del tubo. -Microorganismos fermentadores: color amarillo en todo el medio de cultivo. -Microorganismos que no fermentan y no oxidan la glucosa: el medio permanece verde o adquiere un color azulado. 2-Movilidad: -Positiva: presencia de turbidez que se extiende mas allá de la línea de siembra. -Negativa: solo se observa turbidez en la línea de siembra.
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Instrucciones 10.0 5.0 3.0 10.0 4.0 0.01 1.0 Suspender 33 g de polvo por litro de agua destilada. Dejar embeber 2 minutos. Calentar a ebullición hasta disolver. Distribuir en tubos de 10 mm de diámetro, 10 ml por tubo. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Si no se usa de inmediato, hervir el medio antes de usarlo, a fin de eliminar el oxígeno. Solidificar en posición vertical.

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3-Reducción de nitratos: -Positiva: desarrollo de color rosado-rojo luego del agregado de los reactivos Griess A y B. - Negativa: ausencia de color rosado rojo luego del agregado de los reactivos Griess A y B. Notas: Los microorganismos que al reducir los nitratos a través de la enzima nitrato reductasa, liberan gas nitrógeno, producen un resultado falso negativo con la metodología detallada previamente. Por eso, ante un resultado negativo, agregar unas granallas de Zinc y observar el color desarrollado. Esto permitirá dar el resultado definitivo de la prueba de reducción de los nitratos. -Prueba Positiva: ausencia de color rosado rojo luego del agregado de Zinc. -Prueba Negativa: desarrollo de color rosado-rojo luego del agregado de Zinc.

Microorganismo Escherichia 25922 coli

Reducción nitratos ATCC ATCC + + + + -

de

K. pneumoniae 700603

P. aeruginosa ATCC 27853 S. flexneri ATCC 12022 Acinetobacter spp. O: Oxidación. F: Fermentación.

Notas: frecuentemente, en la reducción de nitratos a nitritos, los productos finales pueden ser nitritos (NO2), amoníaco (NH3), nitrógeno molecular (N2), óxido nítrico (NO), oxido nitroso (N22) o hidroxilamina (R-NH-OH).

Cuestionario.
1. ¿Cuál es la diferencia entre fermentación y respiración anaerobia? 2. escriba la reacción que sse lleva a cabo en el medio de cultivo que nos permite identificar la reducción de nnitratos.
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3. ¿ como se elimina el amoniaco,que se produce?

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Practica 10
Proyecto final
Desarrollo de baterías para identificación de microorganismos Con los conocimientos adquiridos en este laboratorio y a lo largo de la carrera el alumno podrá desarrollar baterías que comprendan las pruebas necesarias para la identificación de diversos microorganismos.

Procedimiento.
Identificar Escherichia coli de Shigella sonnei y Klebsiella pneumoniae. Identificar Proteus vulgaris de Salmonella typhimurum Identificar Staphyloccoccus aureus de Streptococcus agalactie
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Identificar Vibrio comma de Escherichia coli Identificar Haemophilus influenzae de Yersinia

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