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extraccION DE ADN 1[1]

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EXTRACCION DEL ADN

Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

LABORATORIO DE BIOCIENCIAS

CONTENIDO 

Generalidades sobre el ADN Muestras para extracción del ADN Condiciones sobre la remisión de muestras. Métodos de extracción del ADN - Salting out   

EL MATERIAL GENÉTICO

CROMOSOMAS
46 CROMOSOMAS 23 PARES DIPLOIDES
UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE

EL MATERIAL GENÉTICO
Es el responsable de transmitir los caracteres heredados de una generación a otra.

Está conformado por millones de unidades de nucleótidos Cada nucleótido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azúcar y grupo fosfato

EL MATERIAL GENETICO
BN

BASES NITROGENADAS
BN ADENINA BN GUANINA BN CITOSINA

P
A

BN

P

A

BN P

BN

TIMINA

A

REGIONES DEL ADN
De secuencia única (genes)

Medianamente repetitivas

Altamente Repetitivas

CROMOSOMA

ADN

p
HETEROCROMATINA

REGIONES REPETIDAS

EUCROMATINA

GEN

q

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN . 

Cantidad de material de partida 


Número de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido 



Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) Contaminantes e interferentes en el material biológico

MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN 
     

Sangre Semen Saliva Cabello Hueso Diente Tejido

MUESTRAS PARA EXTRACCION DEL ADN  

 

Sangre: derivados porfirinicos de la Hemoglobina. Manchas: secado. Residuo metanolico: Chelex. Soportes: Absorbente o no.

REMISION PARA ANALISIS DE POLIMORFISMO MOLECULAR  

La posibilidad de extraer el material genético en cualquier indicio biológico. biológico. Análisis por medio de técnicas como la PCR ,ha permitido obtener ADN a partir de indicios biológicos en cantidades escasas

REMISION DE LAS MUESTRAS PARA ANALISIS DEL ADN
NORMAS DE BIOSEGURIDAD. CADENA DE CUSTODIA. FORMATOS EN CASOS ESPECIFICOS. 

 

PROTECCION DEL PERSONAL Prevenir contacto directo  Prohibir consumo de comidas y bebidas.  Condiciones de asepsia y material desechable.  Vacunación. 

PROTECCION DE LA MUESTRA 

CONTAMINACION POR MATERIAL BIOLOGICO HUMANO. CONTAMINACION MICROBIOLOGICA. CONTAMINACION QUIMICA. TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.   

CONTAMINACION POR MATERIAL MATERIAL BIOLOGICO HUMANO

Depósito de material biológico humano sobre las muestras, con posterioridad a la toma de las mismas. mismas.

CONTAMINACION MICROBIOLOGICA
Este tipo de contaminación tiene lugar por el desarrollo de microorganismos y suele estar favorecida por la humedad y las altas temperaturas. temperaturas.

CONTAMINACION QUIMICA

Presencia de productos químicos que dificultan procesos del análisis genético, como PCR y extracción del ADN

TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.
Debido al traslado de los indicios de una localización a otra puede dar lugar a una contaminación o puede ocasionar la pérdida de la prueba. prueba.

DEGRADACION DE LAS MUESTRAS 
 

Humedad ambiental. ambiental. Fenómenos meteorológicos, acción de insectos, entre otros. otros. Recogida y envió al laboratorio de estas evidencias de una manera adecuada para evitar la proliferación bacteriana y por consiguiente la degradación del material genético

DEGRADACION DE LAS MUESTRAS 

Exponer por mucho tiempo las muestras a los rayos ultravioleta provoca daños sobre la estructura del ADN, o aplicar ciertos conservantes que puedan provocar efectos sobre la cadena del ADN. ADN.

DOCUMENTOS NECESARIOS 

Formulario de envio de muestras. Identificacion de Muestras. Cadena de Custodia.  

FORMULARIO ENVIO DE MUESTRAS    

Investigacion solicitada: Investigacion restos de sangre. Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de los hechos, lugar, fecha. Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo poblacional, causa de la muerte, relacion con el sospechoso. Datos del sospechoso:

IDENTIFICACION DE LAS MUESTRAS  

Listado de muestras de referencia: Numero, tipo de muestra, Nombre de la persona, relación con el caso. Listado de indicios biológicos: numero de referencia, tipo de muestra (toma vaginal), a quien pertenece y localización, tipo de indicio a estudiar.

CADENA DE CUSTODIA 

Nombre o identificación, firma. Fecha y hora de la recogida. Condiciones de almacenaje de las muestras hasta su envío.  

METODOS DE EXTRACCION DE ADN 

SALTING CHELEX

OUT  

FENOL - CLOROFORMO

FENOL CLOROFORMO 
  

-

Técnica Orgánica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad. Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica (Fenol), después se realiza digestión con proteinasa K. El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado. DESVENTAJAS: DESVENTAJAS: Reactivos altamente tóxicos Perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.

CHELEX 


Técnica inorgánica Previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos durante la ebullición al 5%. Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones dibenzenoiminodiacetato. los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN. DESVENTAJAS: DESVENTAJAS: El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS.   

SALTINGSALTING-OUT 
 

Técnica de tipo inorgánica Utiliza reactivos bajos en toxicidad Permite visualizar la malla del ADN. Desventajas: Requiere una mayor cantidad de muestra.

SALTING OUT
1. 2. 3. 4. Lisis Celular Extracción Precipitación Resuspensión

LISIS CELULAR
Buffer de lisis I: (lisis glóbulos rojos). (lisis rojos). - Sucrosa - MgCl2 1M - Triton x 100  Buffer de lisis II: (lisis glóbulos blancos) (lisis EDTA de Na NaCL. 

EXTRACCION  



Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas Perclorato de sodio 5M NaCl 6M

PRECIPITACION 

Isopropanol 

Etanol al 70% lava el exceso de sales.

RESUSPENSION 

Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o también se puede realizar en agua.

EXTRACCION SALTING OUT

CONCLUSIONES 

El ADN es el material genético a través del cual se transmite la información contenida en los genes de generación en generación. El ADN esta presente en los indicios biológicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc. etc. Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras. muestras. El Salting-out es uno de los métodos de extracción de SaltingADN mas utilizados por su fácil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN. ADN.   

BIBLIOGRAFIA 

MARTINEZ JARRETA, M Begoña. La prueba del ADN en medicina forense. Masson: Buenos Aires.1999. Grupo Español y portugués de la ISFG. ISFG. Recomendaciones para la recogida y envío de la muestras con fines de identificación genética. genética. Madeira, 2 de Junio 2000. 2000. MILLER S, DYKES D, POLESKY H, A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucl. Ac. Res. 16: 1215. 1988. Nucl. Ac. Res. 16: 1215. 1988.  

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