UNIVERSIDAD PEDAGGICA Y TECNOLGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS Escuela de Ciencias Qumicas-Programa de Qumica de Alimentos Laboratorio de Bioqumica I

Anglica Mara Garca T.

9. ACTIVIDAD CATALASA (en alimentos) Fecha: 10 de enero de 2012 Material a traer por parte del estudiante: trocitos de hgado fresco, trocitos de tomate y papa (ya pelada), cuchillo, guantes y tapabocas. TRAER EL MATERIAL BIOLGICO LISTO!!! OBJETIVOS Identificar la presencia de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales. Determinar la desnaturalizacin de la catalasa y con ello la prdida de su funcin cataltica. Analizar la cintica enzimtica en funcin de la concentracin del sustrato. INTRODUCCION De todas las funciones de las protenas, la catlisis es tal vez la ms importante. La catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos animales y vegetales cuya funcin es la descomposicin del perxido de hidrgeno generado durante el metabolismo celular. 2 2 +

Qumicamente, la catalasa es una protena y por lo tanto puede sufrir desnaturalizacin por diversos factores (analizados experimentalmente en Propiedades de las Protenas), entre ellos, la temperatura. La catalasa al ser sometida a altas temperaturas pierde su estructura terciaria y por lo tanto, su funcin biolgica, es decir, la catlisis. Por otra parte, una forma de calcular la velocidad de una reaccin enzimtica es determinando la cantidad de sustrato transformado por 1 mL de enzima por 1 minuto; esta es una de las formas de indicar la actividad especfica de la enzima en donde adems se puede determinar el comportamiento michaeleano de la reaccin enzimtica y con ello los valores de Km (constante de michaeles-menten) y Vmax (velocidad mxima de la reaccin catalizada) Consulta previa a la prctica (preinforme con bibliografa includa) 1. Cules son los factores que afectan la actividad cataltica de las enzimas? 2. La Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular ha desarrollado una nomenclatura para identificar a las enzimas basada en los denominados Nmeros EC. De este modo, cada enzima queda registrada por una secuencia de cuatro nmeros precedidos por las letras "EC". Cual es la clasificacin y nomenclatura de la catalasa? 3. Cules son los efectos adversos en la deficiencia o ausencia de la enzima catalasa en el organismo? 4. A qu se refiere el concepto: cintica de Michaeles-Menten?, realice un grfico que indique sus principales constantes numricas. 5. A qu se refiere el concepto: diagrama cintico de Lineweaver-Burk?, realice un grfico que indique sus principales constantes numricas.

Nota: las anteriores preguntas sern formuladas y evaluadas por escrito como requisito previo a la prctica
MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla, 5 tubos de ensayo, 3 pipetas de 5 mL, 3 erlenmeyer o vasos de precipitados de 200 mL, 1 vaso de precipitados de 500 mL, mortero con mango, bureta, embudo de vidrio para bureta, pinzas para bureta, estufa o plancha de calentamiento, agua oxigenada 0,1M, soluciones de almidn y lugol, solucin de Fehling, cido sulfrico 6N, permanganato de potasio 0,01M, agua destilada.

PROCEDIMIENTO 1. DEMOSTRACIN DE LA PRESENCIA DE LA ENZIMA CATALASA Coloque en 3 tubos de ensayo los trocitos de hgado, tomate y papa. A cada tubo aadir 5 mL de agua oxigenada. Realice el respectivo anlisis de resultados, indicando el aspecto final de cada tubo de ensayo as como el orden de actividad de la catalasa (de mayor a menor) en cada muestra.

2.

DESNATURALIZACIN DE LA CATALASA Coloque en 3 tubos de ensayo los trocitos de hgado, tomate y papa. A cada tubo aadir agua destilada y someta a ebullicin las muestra durante 5 minutos. Retire el agua sobrante. A cada tubo aadir 5 mL de agua oxigenada. Realice el respectivo anlisis de resultados en cada muestra.

3. CINTICA ENZIMTICA 3.1. Obtencin de una solucin que contiene la enzima catalasa Triture una porcin de hgado (2g) en un mortero hasta obtener una pasta fina. Adicione 8 mL de solucin buffer fosfato pH:7,4 y continue moliendo hasta obtener una pasta homognea. Diluir la pasta con otros 8 mL de buffer fosfato pH 7,4. Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos. Decante el sobrenadante que contiene a la enzima en un tubo de ensayo e incbelo durante 15 minutos a temperatura ambiente con el fin de eliminar los sustratos prexistentes. 3.2. Actividad y cintica enzimtica Tome en un tubo de ensayo 4 mL de la solucin de enzima y someta a ebullicin durante 5 minutos. Rotule el tubo como solucin enzimtica hervida. Prepare el siguiente set de tubos: Tubos 1 2 3 4 5 6 Reactivos mL mL mL mL mL mL H2O2 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 2.5 0,1 M Agua 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.5 destilada Enzima sin 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 --hervir Enzima ----------1.0 hervida Nota: no olvidar controlar cuidadosamente el tiempo de reaccin cataltico en cada tubo con el fin que la enzima acte en iguales condiciones, por lo tanto, no adicione la enzima hasta no tener preparado y previamente agitados todos los tubos de ensayo. Adicionar al tubo 1 la solucin de enzima y agite, mida el tiempo. Transcurridos 30 segundos aada enzima al tubo 2 y as sucesivamente hasta completar el tubo 6. Transcurridos exactamente 5 minutos de reaccin en cada tubo, adicione a cada uno 2 mL de cido sulfrico 6N, agitar muy bien. Terminada la reaccin, pase el contenido de cada tubo a vasos de precipitados y titule con permanganato de potasio 0,01M (el punto final es un color rosa plido). El permanganato titula el perxido que no fue descompuesto por la catalasa. 5 + 2 5

La actividad especfica de la catalasa es la cantidad de H2O2 0,1M descompuesto por 1 mL de catalasa en un minuto.

Con base en lo expuesto anteriormente, complete el siguiente cuadro a partir del volumen de titulante utilizado as como de la cantidad de enzima y tiempo empleados: Tubos 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 6 mL

Reactivos

H2O2 No descompuesto en 5 minutos H2O2 descompuesto por 1.0 mL de enzima en 5 minutos (moles) Actividad especfica de la enzima catalasa Con base en los resultados anteriores, realice la respectiva representacin grfica de MichaelisMenten (velocidad de reaccin en las ordenadas y concentraciones iniciales de sustrato en las abscisas). A partir del grfico obtenido determinar la Vmax y Km. Realice la respectiva representacin grfica de Lineweaver-Burk (1/velocidad de reaccin en las ordenadas y 1/concentraciones iniciales de sustrato en las abscisas). A partir del grfico obtenido determinar la Vmax y Km. Qu diferencia encuentra entre los clculos de Vmax y Km en los dos tipos de representaciones grficas?. Cul es ms exacta? BIBLIOGRAFIA MIYARES CALAS, MIGUEL . Cuaderno de Trabajos Prcticos de Bioqumica I. FUD. MIGUEZ OTALORA, Jos Bernardo. Prcticas de Bioqumica. Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia. MORRISON AND BOYD. Qumica Orgnica. Editorial Fondo Educativo Internamericano. CERRETTI, Helena y Zalts, Anita. Experimentos en Contexto. Qumica . Manual de Laboratorio. Editorial Pearson. Argentina. 2000. BOHINSKI. Bioqumica . Editorial Pearson. Mxico. 1998. CAMPBELL, Mary y FARREL, Shawn . Bioqumica. Editorial Thomson. Mxico. 2004 PACHECO LEAL, Daniel. Bioqumica Medica. Editorial Limusa. Mxico. 2005