INTEGRANTES: ESTEVEZ GLORIA ESTRADA MARIA CRISTINA ESTRELLA KATHERINE GAYBOR NANCY GOMEZ DANIEL

TCNICAS DE INSERCIN GNICA

La introduccin del gen normal en las clulas humanas puede realizarse por medios fsicos, qumicos o utilizando virus como vectores:
Microinyecci Microinyeccin Mtodos fsicos f Electroporaci Electroporacin Microproyectiles Fosfato clcico c Policationes Mtodos qumicos qu Lpidos Liposomas Membranas derivadas de eritrocitos

Retrovirus Vectores virales Adenovirus o virus asociados (AAV) Herpetovirus

La introduccin de un ADN extrao en bacterias, ya sea de forma natural o por vectores, se llama transformacin. Si el vector es un virus, la transformacin se llama transduccin. Si se hace en eucarionte se llama transfeccin, y si se inserta en las clulas germinales de estos se llama transgnesis y los descendientes de estos organismos, transgnicos o modificados genticamente (OMG). Por ejemplo, uno de los vectores ms utilizados en plantas es la bacteria Agrobacterium tumafaciens, y en clulas animales, el virus SV40.

Una vez que las bacterias se han transformado, se las pasa a un medio de cultivo para que se multipliquen. Al mismo tiempo se replican los vectores de clonado y as se obtienen mltiples copias del gen deseado. Cada grupo de bacterias que procedan de una sola, llevarn ese vector y ese gen, constituye un clon. As se obtienen tantos clones como fragmentos de ADN se hayan insertado en las bacterias

La transformacin gentica se puede definir como la transferencia de genes forneos especficos, aislados de distintos organismos (plantas, virus, bacterias o animales) a un nuevo contexto gentico. PASOS PARA LA TRANSFERENCIA DE GENES: 1.Identificacin del gen o genes de inters en la especie donadora 2.Aislamiento del gen o genes 3.Multiplicacin en un vector de clonacin adecuado 4.Insercin en un vector de transferencia adecuado 5.Transferencia a la especie receptora 6.Integracin en el genoma de la especie receptora 7.Regeneracin de la planta 8.Expresin biolgica de los genes introducidos (transgenes)

SISTEMAS QUMICOS Se empez a usar esta tcnica en los aos 60, pero fue en 60, los 70 cuando se empez a desarrollar suficientemente para tener buenas eficacias de transfeccin. Se basa en la transfeccin. precipitacin del DNA exgeno y los iones de calcio, provocando que la clula, mediante endocitosis, introduzca el DNA en su interior. La eficacia de transfeccin puede interior. llegar al 10% de las clulas, aunque suele ser transitoria. 10% transitoria. No es una tcnica que provoque toxicidad en las clulas pero la expresin del transgen es muy pequea. nicamente pequea. se usa en cultivos celulares, y por lo tanto su aplicacin es "ex vivo". vivo".

Microinyeccin Consiste en colocar el DNA mediante una inyeccin en el ncleo de las clulas. Al introducirlo directamente all, evitamos la degradacin citoplasmtica y lisosomal. Se realiza mediante un micromanipulador, microscopio invertido que permite la visualizacin. Las clulas que sobreviven y han insertado el material gentico presentan una alta eficacia de expresin del mismo. La tcnica es muy laboriosa y necesita clulas aisladas para su realizacin. Este sistema se suele utilizar "ex vivo". En el caso de inyeccin en embriones se denomina terapia gnica germinal siendo un mtodo "in vivo".

Se introduce la construccin gnica mediante un choque elctrico a las clulas que provoca la formacin de poros en sus membranas , por donde entra el transgn. Est especialmente indicado para clulas con una alta tasa de proliferacin. Sin embargo, muchas clulas mueren al no soportar el choque elctrico por lo que muchas veces no es la forma ms indicada en algunos tipos celulares.

Consiste en la introduccin del DNA en una solucin salina o srica, normalmente mediante inyeccin intramuscular, para conseguir la expresin del transgn. Se ha transgn. observado actualmente expresin en timo, piel, msculo cardaco y msculo esqueltico. esqueltico. No se conoce el mecanismo por el que llega a entrar a la clula aunque se postula que es a travs del complejo del poro nuclear. nuclear. Tiene un bajo porcentaje de clulas transfectadas, no hay integracin en el genoma y una vez inyectado no hay replicacin en el genoma. Este es un genoma. sistema utilizado para la realizacin de la terapia gnica "in vivo". vivo".

En 1965 se descubri que los liposomas (bolsas rodeadas de una membrana lipdica a semejanza de una clula eucariota animal) eran capaces de hacer entrar DNA en la clula, pero hasta 1980 no se consigui una eficacia de transfeccin adecuada. Existen adecuada. dos tipos de liposomas: liposomas: liposomas catinicos y liposomas aninicos. aninicos.

Se encuentran cargados positivamente por lo que interaccionan con la carga negativa del DNA. DNA. Existen muchos lpidos que se usan para formar estos liposomas e incluso se estn probando mezclas de estos. Son recomendables en estos. transfecciones "in vitro". vitro".

Las ventajas de los liposomas es que protegen de la degradacin al transgn hasta su llegada al ncleo. La talla ncleo. del DNA introducido en ellos no tiene lmite. Podemos lmite. hacerlos llegar a tejidos especficos incluyendo receptores en la capa lipdica. lipdica. Sin embargo como desventaja presentan la baja eficacia de transfecin, una expresin transitoria, cierto grado de toxicidad celular y pueden ser inhibidos por componentes sricos. sricos.

Consiste en el bombardeo de los tejidos con partculas de oro o tungsteno que llevan adheridas a ellas el DNA. El bombardeo se DNA. realiza mediante una descarga con helio como si fuera una pistola (de all el nombre de la tcnica). tcnica). La capacidad de penetracin es limitada usndose en lneas celulares, epidermis, msculo e hgado. Su expresin es transitoria hgado. y en la zona de descarga se produce una gran muerte celular. Esta tcnica puede realizarse celular. "ex vivo" (en el caso de clulas animales) e "in vivo" (en el caso de clulas vegetales). vegetales).

Esta metodologa comienza en 1968 cuando se demuestra que los virus son capaces de infectar clulas de mamfero. El desarrollo en 1989 de las mamfero. clulas empaquetadoras (aportan la composicin proteica que necesitan los virus para su funcionalidad ya que sta ha sido eliminada del genoma viral) supuso un avance importante en esta metodologa al aumentar la titulacin en virus no patgenos. patgenos.

En todos los casos vamos a eliminar el mayor nmero de genes y secuencias al virus para que pueda captar el DNA exgeno. Los vectores virales exgeno. pueden ser utilizados tanto "in vivo" como "ex vivo". vivo". Hasta el momento los virus ms utilizados en terapia gnica son los siguientes: siguientes:

Son virus ARN que tienen capacidad para integrar genes teraputicos relativamente grandes (un mximo de 8 Kb). Necesitan de clulas Kb). empaquetadoras para su obtencin. Se transfiere el DNA del virus obtencin. mediante la tcnica del fosfato de calcio a las clulas empaquetadoras. empaquetadoras. Posteriormente se realiza una segunda transduccin en la cual introducimos la construccin gnica de inters. inters.

Los virus inyectados en el husped integran su DNA en el genoma del husped expresando as el gen que le hemos aadido. Como las protenas aadido. del virus no son expresadas por el husped, no tenemos una respuesta inmunitaria. inmunitaria. Tienen una alta eficacia de transduccin y tambin de expresin, siendo un sistema bien estudiado. estudiado.

Sin embargo, nicamente sirven para infectar clulas del husped que se encuentran en divisin. Adems los ttulos de virus obtenidos hasta ahora divisin. son bajos y la integracin en el genoma es al azar. azar. Existen tambin vectores basados en el virus del SIDA (HIV), cuyo genoma es ms complejo pero con un funcionamiento similar al que hemos visto. visto. Son los denominados lentivirus. lentivirus.

Son una familia de virus ADN que causan infecciones en el tracto respiratorio humano. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5 humano. Kb. Kb. de DNA exgeno. Normalmente en terapia gnica se utiliza el exgeno. serotipo 5, aunque existen hasta 42 serotipos diferentes que infectan a humanos. humanos.

En este caso no se necesita la integracin del material hereditario del virus en el del husped para su replicacin, por lo tanto tampoco el transgn ser introducido en el genoma de la clula. Y por tanto tampoco necesitan que las clulas infectadas estn dividindose para su replicacin.

La gran ventaja de usar un adenovirus como vector es la alta eficacia de transduccin, al igual que la expresin de la construccin gnica introducida, sin embargo sta es transitoria (pocas semanas). Esto ltimo obligara a tratamientos peridicos lo cual es un inconveniente ya que los adenovirus producen respuesta inmune celular e inflamatoria.

Son parvovirus, contienen DNA como material gentico, y requieren la coinfeccin con un adenovirus para multiplicarse. Son multiplicarse. vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los adenovirales. adenovirales. Su capacidad de integrar DNA exgeno es pequea, slo de 5 Kb. Kb.

principales ventajas son que los virus adenoasociados integran su DNA en la clula durante la replicacin, por lo que la transduccin (la cual es altamente eficaz) es estable en la clula diana. Adems pueden infectar tanto a clulas en divisin como a las que no lo estn (de gran importancia para la terapia gnica "in vivo"). Los vectores AAV no estn implicados en ningn tipo de enfermedad humana. Adems el riesgo de una respuesta inmune est minimizado ya que no produce protenas vricas.

Las

 

Herpesvirus Son virus DNA cuyas clulas diana son las neuronas. neuronas. Su complejidad y lo poco que todava conocemos de esta familia de virus dificulta su utilizacin. utilizacin.

La gran ventaja es el gran tamao de su DNA , que les permite aceptar varios genes teraputicos, incluso podran ir con sus propias regiones reguladoras. reguladoras. Uno de los inconvenientes es que habra que eliminar las secuencias que codifican para las protenas lticas del virus que causan la muerte de las clulas a las que infectan. infectan.