Protocolo QIAGEN

1. Pesar 100 mg de la muestra. 2. Aadirle 400 l del tampn AP1, 4 l de RNasa A (100 mg/ml) y 20 l de proteinasa K. Mezclar vigorosamente. 3. Incubar la mezcla a 65C durante 2 horas. 4. Aadir 130l del tamn AP2, mezclar bien e incubar 5 minutos en hielo. 5. Centrifugar durante 5 minutos a 13000 rpm. 6. Recoger el sobrenadante y pasarlo a un tubo-columna QIAshredder y centrifugar durante 2 minutos a velocidad mxima. 7. Transferir el lquido que se ha filtrado al tubo de abajo a un tubo eppendorf nuevo, sin arrastrar ningn resto de precipitado (si lo hay). 8. Aadir 1,5 volmenes de tampn AP3/E y mezclar inmediatamente mediante pipeteo. 9. Recoger 650 l de esa mezcla, incluyendo cualquier precipitado que pueda haberse formado, a la columna DNeasy mini spin. Centrifugar durante 1 minuto a velocidad mayor a 8000 rpm (10000 rpm) y desechar el lquido filtrado. 10. Repetir el paso anterior con la muestra restante. Desechar el filtrado y el tubo colector. 11. Colocar la columna DNeasy en un tubo nuevo de recogida, aadir 500 l de tampn AW y centrifugar durante 1 minuto a 10000 rpm. Desechar el filtrado y reutilizar el tubo para el siguiente paso. 12. Aadir 500 l de tampn AW a la columna DNeasy y centrifugar durante 2 minutos a 13000 rpm para secar bien la membrana. 13. Transferir la columna DNeasy a un microtubo de 1,5 o de 2 ml y aadirle 100 l de tampn AE precalentado a 65 C directamente en la membrana DNeasy. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante 1 minuto a 10000 rpm. 14. Repetir el paso anterior. 15. Guardar la muestra obtenida en congelacin.