Mioglobina Modelo de dominios helicoidales en la mioglobina.Una imagen de difraccin decristalografa de rayos X de la protena mioglobina.

La mioglobina es una hemoprotena muscular, estructuralmente y funcionalmente muy parecida a lahemoglobina, es una protena relativamente pequea constituida por una cadena polipeptdica de 153 residuos aminoacdicos que contiene un grupo hemocon un tomo de hierro, y cuya funcin es la de almacenar y transportar oxgeno. Tambin se denomina miohemoglobina o hemoglobina muscular.Las mayores concentraciones de mioglobina se encuentran en el msculo esqueltico y en el msculo cardaco, donde se requieren grandes cantidades de O2para satisfacer la demanda energtica de las contracciones.La mioglobina fue la primera protena a la que se determin su estructura tridimensional porcristalografa de rayos X en 1957. Es una protena extremadamente compacta y globular, en la que la mayora de los aminocidos hidrofbicos se encuentran en el interior y muchos de los residuos polares expuestos en la superficie. Alrededor del 75% de la estructura secundaria tiene una conformacin de a-hlice; de hecho, existen ocho segmentos de a-hlice en la mioglobina, designados de la A a la H.Dentro de una cavidad hidrofbica de la protena se encuentra el grupo prosttico hemo. Esta unidad nopolipeptdica se encuentra unida de manera nocovalente a la mioglobina y es esencial para la actividad biolgica de unin de O2 de la protena.La mioglobina y el citocromo B562, forman parte de las protenas hmicas, que intervienen en el transporte y fijacin de oxgeno, el transporte de electrones y lafotosntesis. Estas protenas poseen como grupo prosttico un Tetrapirrol cclico o grupo Hem, o Hemo, formado por cuatro anillos de pirrol planares enlazados por puentes de alfa metileno. En el centro de este anillo existe un hierro ferroso (Fe+2). En el caso del citocromo la oxidacin yreduccin del tomo de hierro son esenciales para la actividad biolgica. Para la mioglobina y la hemoglobina la oxidacin del Fe+2 destruye su actividad biolgica.En la mioglobina no oxigenada, el hierro del Hem (grupo hemo) se encuentra aproximadamente a 0,03 nm fuera del plano del grupo en direccin a la HisF8. La oxigenacin de la mioglobina produce el movimiento del tomo de hierro, ya que el oxigeno ocupa la sexta posicin de coordinacin del hierro y desplaza el residuo HisF8 0,01nm fuera del plano del Hem.Este movimiento en el anillo Hem produce el cambio conformacional de algunas regiones de la protena, lo que favorece la liberacin de oxgeno en las clulas deficientes de oxgeno, en donde ste se requiere para la generacin de energa metablica dependiente de ATP. Unin del oxgeno al grupo hemoLa capacidad de la mioglobina y la hemoglobina para enlazar oxgeno depende de la presencia de un componente no polipeptdico, denominado grupo hemo. Este grupo confiere a la hemoglobina y a la mioglobina su color caracterstico. A las unidades no polipeptdicas que se requieren para la actividad biolgica de las protenas se les denomina grupos prostticos. A las protenas conjugadas sin su caracterstico grupo prosttico se les llama apoprotenas.El grupo hemo consta de una parte orgnica y un tomo de hierro. La parte orgnica es la protoporfirina y est formada por cuatro grupos pirrlicos. Los cuatro pirroles estn unidos por medio de puentes meteno1para formar un anillo tetrapirrlico. A este anillo estn enlazados cuatro metilos, dos vinilos y dos cadenas laterales de propionato.El tomo de hierro del hemo est ligado a los cuatro nitrgenos en el centro del anillo de la protoporfirina. El hierro puede formar otros dos enlaces, uno a cada lado del plano del hemo. Estos lugares se denominan la quinta y sexta posicin de coordinacin. La quinta posicin se coordina con un residuo de histidina en la hlice F de la hemoglobina (histidina proximal), mientras que la sexta posicin es ocupada por el oxgeno. Cerca de donde se une el oxgeno al grupo hemo, existe otra histidina (histidina distal) que previene que otras molculas de hemoglobina entren en contacto produciendo la oxidacin del Fe2+ a Fe3+ y disminuye la afinidad de la hemoglobina por el monxido de carbono (CO). El tomo de hierro del hemo puede estar en estado de oxidacin ferroso (+2) o frrico (+3). Las formas correspondientes de la hemoglobina se denominan ferrohemoglobina y ferrihemoglobina (o metahemoglobina), respectivamente. Solamente la ferrohemoglobina (+2) puede captar oxgeno.La hemoglobina es una protena alostrica. La unin del O2 a una subunidad de hemoglobina, induce cambios conformacionales que se

transmiten a otras subunidades, incrementando su afinidad por el O2. Por lo tanto, se dice que la unin del oxgeno a la hemoglobina es cooperativa. Por el contrario, la unin del O2 a la mioglobina es no cooperativa. Lo anterior se hace evidente cuando se observan las curvas de disociacin del oxgeno para ambas protenas, donde la saturacin (Y) es la fraccin de centros de unin de oxgeno ocupados y puede oscilar desde 0 (cuando todos los centros estn vacos) hasta 1 (cuando todos los centros estn ocupados); y pO2 es la presin parcial de oxgeno

Mioglobina
La mioglobina y la hemoglobina son hemoprotenas cuya importancia fisiolgica se relaciona principalmente con su capacidad de unirse al oxgeno molecular. La mioglobina es una hemoprotena monomrica encontrada principalmente en el tejido muscular donde sirve como sitio de almacenamiento intracelular para el oxgeno. Durante perodos de privacin de oxgeno la oximioglobina libera el oxgeno almacenado que se utilizara en los procesos metablicos. La estructura terciaria de la mioglobina es la de una protena tpica globular soluble en agua. Su estructura secundaria es inusual ya que contiene una alta proporcin (75%) de la estructura secundaria -helicoidal. Un polipptido de la mioglobina esta comprendido por 8 -hlices separadas, designadas de la A a la H, que estn conectadas por regiones cortas no helicoidales. Los grupos R de los aminocidos empaquetados en el interior de la molcula son predominantemente de carcter hidrofbico mientras que los expuestos en la superficie de la molcula son generalmente hidroflicos, haciendo as la molcula relativamente soluble en agua.

Estructura de la Mioglobina con Hem Cada molcula de mioglobina contiene un grupo prosttico hem insertado en la hendidura hidrofbica de la protena. Cada residuo del hem contiene un tomo central de hierro Fe 2+, en estado ferroso de oxidacin. El oxgeno llevado por las hemoprotenas est directamente unido al tomo ferroso del hierro del grupo prosttico del hem. La oxidacin del hierro al Fe 3+, estado frrico de oxidacin hace a la molcula incapaz de captar normalmente el oxgeno. Las interacciones hidrofbicas entre el anillo tetrapirrlico y los grupos R de los aminocidos hidrofbicos en el interior de la hendidura de la protena estabilizan fuertemente el conjugado hem-protena. Adems un tomo de nitrgeno de un grupo R de la histidina situado sobre el plano del anillo del hem se coordina con el tomo de hierro aumentando la

estabilidad entre el hem y la protena. En la oximioglobina el sitio de unin restante en el tomo de hierro (6ta posicin) esta ocupado por el oxgeno, cuya unin se estabiliza por un segundo residuo de histidina. El monxido de carbono tambin se une a los tomos de hierro del hem de una forma similar a la del oxgeno, pero la unin del monxido de carbono al hem es mucho ms fuerte que la del oxgeno. La unin preferencial del monxido de carbono al hierro del hem es en gran parte responsable de la asfixia que resulta del envenenamiento con monxido de carbono.

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Hemoglobina
La hemoglobina del adulto es una hemoprotena tetramtrica [(2):(2)] que se encuentra en los eritrocitos, donde es la responsable de unirse al oxgeno en los pulmones y de transportar el oxgeno al cuerpo donde es utilizado en los mecanismos metablicos aerbicos.

Estructura de la hemoglobina Para una descripcin de los diversos tipos de estructuras tetramtricas de la hemoglobina ver la seccin abajoGenes de la hemoglobina. Cada subunidad de una estructura tetramerita de la hemoglobina tiene un grupo prosttico del hem idntico al descrito para la mioglobina. Las subunidades comunes del pptido se sealan , , , y que se encuentran en las hemoglobinas funcionales comunes. Aunque la estructura secundaria y terciaria de las subunidades de la hemoglobina son similares, reflejando una extensa homologa en la composicin de los aminocidos, las variaciones que existen en la composicin de los aminocidos presentan marcadas diferencias en las propiedades de la hemoglobina para transportar oxigeno. Adems, la estructura cuaternaria de la hemoglobina permite interacciones alostricas fisiolgicas importantes entre las subunidades, una propiedad que carece la mioglobina monomrica que es de todas maneras muy similar a la subunidad de la hemoglobina. La comparacin de la capacidad para unirse oxgeno entre la mioglobina y la hemoglobina ilustran las propiedades alostricas de la hemoglobina que resulta de su estructura cuaternaria y diferencia las propiedades de la hemoglobina para captar el oxgeno de la mioglobina. La curva de saturacin de oxgeno de la hemoglobina es sigmoidal que es tpico de protenas alostricas en las que el substrato, en este caso oxgeno, es un efector homotrpico positivo. Cuando el oxgeno se une con la primera subunidad de deoxihemoglobina incrementa la afinidad de las subunidades restantes por el oxgeno. Cuando el oxigeno se une a las segunda y tercera subunidades su unin se refuerza an ms de tal forma que a la tensin de oxgeno en el alvolo pulmonar la hemoglobina esta completamente saturada con oxgeno. Mientras que la oxihemoglobina circula a los tejidos desoxigenados, el oxgeno es

progresivamente descargado y la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno se reduce. As a la tensin ms baja de oxgeno encontrada en tejidos muy activos la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno es muy baja lo que permite una mxima entrega de oxgeno a los tejidos. Al contrario la curva de saturacin de oxgeno para la mioglobina es hiperblica lo que indica la ausencia de interacciones alostricas en este proceso. Las propiedades alostricas de la hemoglobina para unirse con el oxigeno resultan de la interaccin directa del oxgeno con el tomo de hierro del grupo prosttico hem y de los efectos resultantes de estas interacciones en la estructura cuaternaria de la protena. Cuando el oxgeno se une a un tomo de hierro de la desoxihemoglobina hala el tomo de hierro hacia el plano del hem. Debido a que el hierro tambin est unido a la histidina F8, este residuo tambin es tirado hacia el plano del anillo del hem. El cambio en la conformacin en la histidina F8 es transmitido a travs del esqueleto del pptido dando como resultado un cambio significativo en la estructura terciaria de la subunidad entera. Cambios en la conformacin de la superficie de la subunidad conduce a un nuevo sistema de interacciones entre las subunidades adyacentes. Los ltimos cambios incluyen la interrupcin de los puentes de sal y la formacin de nuevos enlaces de hidrgeno y nuevas interacciones hidrofbicas, que contribuyen a la nueva estructura cuaternaria. Los ltimos cambios en la interaccin de la subunidad se transmiten, de la superficie, al sitio de unin del hem de una segunda subunidad desoxigenada, resultando un acceso ms fcil del oxgeno al tomo del hierro del segundo hem y as una mayor afinidad de la molcula de la hemoglobina para una segunda molcula de oxgeno. La configuracin terciaria de baja afinidad, la hemoglobina desoxigenada (Hb) se conoce como el estado tenso (T). Contrariamente, la estructura cuaternaria de la hemoglobina completamente oxigenada (HbO2) se conoce como el estado relajado (R). En el contexto de la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno hay cuatro reguladores primarios, cada uno de los cuales tiene un impacto negativo. stos son CO 2, in hidrgeno (H+), in cloruro (Cl), y 2,3 difosfoglicerato (2,3BPG, o BPG). Algunos textos abrevian 2,3BPG como DPB. Aunque estos pueden influenciar la afinidad del O2 en forma independiente, CO2, H+ y Cl funcionan primariamente como consecuencia uno del otro en la afinidad de la hemoglobina por el O2. Consideraremos primero el transporte de O2 de los pulmones a los tejidos. En el ambiente elevado de O2 (alto pO2) de los pulmones hay suficiente O2 para superar la naturaleza inhibitoria del estado T. Durante la alteracin inducida por la unin del O2 de las formas de T a la R varios grupos de aminocidos en la superficie de la subunidades de la hemoglobina disociarn los protones segn lo representado en la ecuacin abajo. Esta disociacin del protn desempea un papel importante en la expiracin del CO2 que llega de los tejidos (vase abajo). Sin embargo, debido al elevado pO2, el pH de la sangre en los pulmones (7.47.5) que no es suficientemente bajo para ejercer una influencia negativa en la unin de la hemoglobina al O 2. Cuando la oxihemoglobina alcanza los tejidos el pO2 es suficientemente bajo, as como tambin el pH (7.2), lo que favorece el estado T y la liberacin de O2. Si ahora consideramos qu sucede en los tejidos, es posible ver cmo CO 2, H+, y Cl ejercen un efecto negativo sobre la unin de la hemoglobina al O 2. El metabolismo celular produce CO2 el cual se difunde en la sangre y entra a los glbulos rojos circulantes (RBCs). Dentro de los RBCs el CO 2 se convierte rpidamente en cido carbnico por la accin de la anhidrasa carbnica segn se indica en la ecuacin abajo:

4O2 + Hb <> nH+ + Hb(O2)4

CO2 + H2O > H2CO3 > H+ + HCO3

El in bicarbonato producido en esta reaccin de disociacin se difunde hacia fuera de los RBC y es transportado en la sangre hacia los pulmones. Este eficaz proceso de transporte de CO2 se refiere como transporte isohdrico. Aproximadamente el 80% del CO 2 producido en el metabolismo celular se transporta a los pulmones de esta manera. Un porcentaje pequeo de CO 2 es transportado en la sangre como gas disuelto. En los tejidos, el H+disociado del cido carbnico es amortiguado (buffer) por la hemoglobina que ejerce una influencia negativa en la unin del O 2 forzando la liberacin del mismo a los tejidos. Segn lo arriba indicado, dentro de los pulmones la elevada pO2 permite una unin de O2 efectiva por parte de la hemoglobina llevando a la transicin del estado T al R y la liberacin de protones. Los protones se combinan con el bicarbonato que lleg de los tejidos formando cido carbnico que entonces

entra en los RBCs. Mediante una reaccin reversa de la anhidrasa carbnica, se produce CO 2 y H2O. El CO2 se difunde fuera de la sangre, hacia los alvolos del pulmn y se libera con la expiracin. Adems del transporte isohdrico, el 15% del CO2 es transportado a los pulmones unido a los grupos amino N-terminales de la forma T de la hemoglobina. Esta reaccin, representada abajo, forma lo que se llama comocarbamino-hemoglobina. Como se ha indicado esta reaccin tambin produce H+, de tal modo que disminuye el pH en los tejidos donde la concentracin de CO 2 es alta. La formacin de H+ conduce a la liberacin del O2 unido a los tejidos circundantes. Dentro de los pulmones, el elevado nivel de O2 lleva como resultado la unin de O2 a la hemoglobina con la concomitante liberacin de H+. Los protones liberados promueven entonces la disociacin del carbamino a la forma CO 2 la cual es liberada con la expiracin.

CO2 + Hb-NH2 <> H+ + Hb-NH-COO

Como lo demuestra discusin anterior, la conformacin de la hemoglobina y su unin al oxgeno son sensibles a la concentracin del in hidrgeno. Estos efectos de la concentracin del in hidrgeno son responsables del bien conocido efecto de Bohr en donde el incremento en la concentracin del in hidrgeno decrece la cantidad del oxgeno que se une a la hemoglobina en cualquier concentracin de oxgeno (presin parcial). Junto a la difusin del bicarbonato hacia fuera de los RBCs en los tejidos debe haber movimientos de iones hacia adentro de los RBCs para mantener la neutralidad elctrica. ste es el papel del Cl y se refiere como movimiento de cloruro. De esta manera, el Cl desempea un papel importante en la produccin y la difusin del bicarbonato y tambin influencia negativamente en la unin del O2 a la hemoglobina.

Representacin del transporte del CO2 desde los tejidos a la sangre con la entrega de O 2 a los tejidos. El proceso opuesto ocurre cuando el O 2 se toma de los alvolos pulmonares y CO2 se expele. Todos los procesos de transporte de CO2 y de O2 no se indican como por ejemplo la formacin y ionizacin del cido carbnico en el plasma. Este ltimo es el mecanismo ms importante para el transporte del CO2 a los pulmones, es decir, en el plasma como HCO3. El H+ producido en el plasma por

la ionizacin del cido carbnico es amortiguado (buffer) por el fosfato (HPO 42) y por las protenas. Adicionalmente, cerca del 15% de CO2 es transportado desde los tejidos a los pulmones como carbamato hemoglobina. RBC = de glbulos rojos (red blood cell).

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Papel del 2,3 Bisfosfoglicerato (2,3-BPG)

El compuesto 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG), que se deriva del intermediario de la gluclisis 1,3difosfoglicerato, es un potente efector alostrico en las propiedades de unin del oxgeno a la hemoglobina. La va de la sntesis del 2,3BPG se encuentra diagramada en la figura abajo.

La va de la sntesis de 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) dentro de los eritrocitos. La sntesis de 2,3BPG representa una va de reaccin importante para el consumo de glucosa en los eritrocitos. La sntesis de 2,3-BPG en los eritrocitos es crtica para controlar la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno. Obsrvese que cuando la glucosa es oxidada por este camino el eritrocito pierde la capacidad de ganar 2 moles de ATP de la oxidacin glicoltica del 1,3-BPG al 3-fosfoglicerato por la va de la reaccin de fosfoglicerato cinasa. En la forma T desoxigenada de la hemoglobina, se forma una cavidad capaz de unirse al 2,3-BPG en el centro de la molcula. 2,3-BPG puede ocupar esta cavidad estabilizando el estado T. Inversamente, cuando 2,3-BPG no est disponible, o no se une en la cavidad central, la Hb puede convertirse ms fcilmente a HbO2. As, como la concentracin creciente del in hidrgeno, la concentracin creciente de 2,3-BPG favorece la conversin de la forma Hb R a la forma Hb T y disminuye la cantidad de oxgeno que se une a la Hb en cualquier concentracin de oxgeno. Las molculas de la hemoglobina que se diferencian en la composicin de sus subunidades tienen diferentes propiedades de unin al 2,3-BPG con diferentes respuestas alostricas a 2,3-BPG. Por ejemplo, HbF (la forma fetal de hemoglobina) se une al 2,3-BPG con menor avidez que la HbA (la forma del adulto de hemoglobina) con el resultado que HbF en los fetos de mujeres embarazadas se une al oxgeno con mayor afinidad que a la HbA de las madre, dando as al feto el acceso preferencial al oxgeno llevado por el sistema circulatorio de las madres.

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Los Genes de la Hemoglobina

Las protenas de globina y contenidas en la estructura cuaternaria funcional de la hemoglobina son derivadas de grupos de genes. Los genes de la -globina estn en el cromosoma 16 y los genes de la -globina estn en el cromosoma 11. Ambos grupos de genes contienen no slo los genes principales del adulto, y , sino tambin otras secuencias que se expresan y se utilizan en diferentes estados del desarrollo. La orientacin de los genes en ambos grupos est en la misma direccin 5' a 3' con los genes expresados ms tempranamente en el extremo 5' de ambos grupos. Adems de genes funcionales, ambos grupos contienen pseudogenes no funcionales. La sntesis de la hemoglobina comienza en las primeras semanas del desarrollo embrionario dentro del saco vitelino. La hemoglobina principal en esta etapa de desarrollo es una estructura tetramrica compuesta por 2 cadenas zeta () codificadas dentro del grupo y 2 cadenas epsilon () dentro del grupo . En las semanas 6-8 de gestacin la expresin de esta versin de la hemoglobina decrece dramticamente coincidiendo con el cambio en la sntesis de la hemoglobina desde el saco vitelino al hgado. La expresin del grupo consiste en las protenas idnticas de los genes 1 y 2. La expresin de estos genes en el grupo se mantiene durante toda la vida. Dentro del grupo de -globina hay un sistema adicional de genes, los genes de -globina fetales identificados como los genes gammas (). Los 2 genes fetales llamados G y A, la derivacin de los cuales se debe a una sola diferencia de un aminocido entre los 2 genes fetales: glicina en G y alanina en A en la posicin 136. Estos genes fetales se expresan cuando los genes embrionarios dejan de ser expresados. Poco antes del nacimiento hay un cambio en la expresin del gen fetal -globina a la expresin del gen del adulto -globina. El cambio de -globina fetal a -globina del adulto no coincide directamente con el cambio de la sntesis heptica a la sntesis en la mdula sea puesto que al nacimiento se puede evidenciar sntesis tanto de como de en la mdula sea. Debido a la actividad en la expresin de los genes de globina durante el desarrollo fetal y en la vida adulta, la composicin de los tetrmeros de hemoglobina es obviamente distinta. La hemoglobina fetal se identifica como HbF e incluye tanto 2G2 como 2A2. La hemoglobina fetal tiene una afinidad levemente mayor por el oxgeno que la hemoglobina del adulto. Esto permite que el feto extraiga el oxgeno ms eficientemente de la circulacin materna. En los adultos la hemoglobina principal se identifica como HbA (ms comnmente llamada HbA1) y es una estructura tetramrica de 2 cadenas y 2 cadenas segn lo indicado anteriormente. Una hemoglobina de menor importancia del adulto, identificada como HbA 2, es una estructura tetramrica de 2 cadenas y de 2 cadenas . El gen se expresa con una sincronizacin similar al gen pero debido a que el promotor ha adquirido un nmero de mutaciones su eficacia en la transcripcin es reducida. La composicin total de la hemoglobina en un adulto normal es de aproximadamente 97.5% HbA 1, el 2% HbA2 y 0.5% HbF.

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Hemoglobinopatias
Una gran cantidad de mutaciones se han descrito en los genes de globina. Estas mutaciones se pueden dividir en dos distintos tipos: los que causan anormalidades cualitativas (ej. anemia de clulas falciformes) y los que causan anormalidades cuantitativas (ej. las talasemias). En conjunto a estas alteraciones se les conoce comohemoglobinopatias. Un tercer grupo de desrdenes de la hemoglobina incluye las enfermedades en las cuales hay una persistente expresin de la hemoglobina fetal. Estas ltimas enfermedades se conocen colectivamente como persistencia hereditaria de la hemoglobina fetal (HPFH). De las mutaciones que conducen a las alteraciones cualitativas en la hemoglobina, la mutacin sin sentido en el gen -globina que causa anemia de clulas falciformes es la ms comn. La mutacin que causa anemia de clulas falciformes es una sola substitucin del nucletido (A a T) en el codon para el aminocido 6. El cambio convierte el codon del cido glutmico (GAG) a un codon de valina (GTG). La forma de hemoglobina en personas con anemia de la clula falciformes hoz se refiere como HbS. El problema subyacente en la anemia de las clulas falciformes es que la sustitucin de la valina por el cido glutmico da lugar a que los tetrmeros de la hemoglobina se agregen luego de la

desoxigenacin en los tejidos. Esta agregacin conduce a la deformacin de los glbulos rojos hacindolos relativamente inflexibles e incapaces atravesar los lechos capilares. Los ciclos repetidos de la oxigenacin y de la desoxigenacin conducen a una enfermedad irreversible. El resultado final es el bloqueo los tubos capilares. Debido a que los huesos son particularmente afectados por la reduccin del flujo de la sangre, existe un frecuente y severo dolor seo. ste es el sntoma tpico durante una crisis de clulas falciformes. Durante largos perodo el bloqueo recurrente de los capilares sanguneos conduce al dao a los rganos internos, particularmente los riones, el corazn y los pulmones. La destruccin continua de las clulas falciformes de la sangre conduce a anemia crnica y a episodios de hiperbilirubinemia. Una mutacin adicional relativamente comn en el codon 6 es la conversin a un codon del lisina (AAG) que da lugar a la generacin de HbC. La electroforesis de las protenas de la hemoglobina de individuos sospechosos de tener anemia de clulas falciformes (o varios otros tipos de desrdenes de la hemoglobina) es una herramienta de diagnstico eficaz porque las variantes de hemoglobinas tienen diversas cargas. Un ejemplo de esta tcnica se demuestra en la figura abajo.

Patrn de electroforesis de la hemoglobina de varios individuos. Los carriles 1 y 5 son estndares de la hemoglobina. El carril 2 es un adulto normal. El carril 3 es un recin nacido normal. El carril 4 es un individuo homocigoto de HbS. Los carriles 6 y 8 son individuos heterocigotos de falciformes. El carril 7 es un individuo con la enfermedad del SC. Otra herramienta eficaz para identificar el genotipo de los individuos sospechosos de tener la enfermedad de las clulas falciformes as como para diagnostico prenatal es realizar el mapeo RFLP o el uso de PCR. Un ejemplo del uso de estas herramientas se puede considerar en la pgina Herramientas moleculares de la medicina. Se han identificado adems de las mutaciones sin sentido que conducen a HbS y a HbC, un nmero de mutaciones de sentido equivocado que conducen a las anormalidades cualitativas en la hemoglobina. Una insercin de 2 nucletidos entre los codones 144 y 145 en el gen -globina da lugar a la generacin de la hemoglobina Cranston. La insercin, que est cerca del C-terminal de la protena -globina, hace que el codon normal de pare este fuera de lugar y que la sntesis proceda hacia la regin 3'- que no se traduce hasta un codon de pare fortuito. El resultado es una protena de -globina de 157 aminocidos. En la variante de la hemoglobina Constant Spring, una mutacin en el gen -globina convierte el codon de pare (UAA) a un codon de glutamina (CAA) de modo que la protena termina siendo 31 aminocidos ms larga de lo normal. La protena resultante -globina en hemoglobina Constant Spring no slo esta alterada cualitativamente sino que es inestable por lo que esta es tambin una anormalidad cuantitativa. Debido a que los locus de los genes de globina contienen grupos de genes similares existe el potencial para que haya un entrecruzamiento desigual entre las cromtides hermanas durante la meiosis. La generacin dehemoglobina Gun Hill y hemoglobina Lepore son el resultado de eventos de entrecruzamientos desiguales. La Hemoglobina Gun Hill es el resultado de una delecin de 15 nucletidos causados por el cruce desigual entre los codones 9194 de un gen de -globina y los codones 9698 del otro. La generacin de la hemoglobina Lepore resulta del cruce desigual entre globina y los genes -globina. El gen hbrido resultante se llama Lepore y el gen hbrido se llama anti-Lepore. Segn lo indicado anteriormente, el promotor del gen -globina es ineficiente as las consecuencias de este evento de entrecruzamiento desigual son tanto cualitativas como cuantitativas.

Las talasemias son el resultado de anormalidades en la sntesis de las protenas de la hemoglobina y afecta a ambas cadenas. Las deficiencias de la sntesis de -globina resulta en -talasemias y las deficiencias en la sntesis de -globina dan lugar a las -talasemias. El trmino talasemia se deriva del griego "talaza" que significa mar y fue aplicado a estos desrdenes debido a la alta frecuencia de su ocurrencia en los individuos que viven alrededor del Mar Mediterrneo. En individuos normales una cantidad igual de protenas de - y -globina permiten que se combinen estoicomtricamente para formar los tetrameros correctos de la hemoglobina. En la -talasemia se sintetizan cantidades normales de -globina. Las protenas -globinas son capaces de formar los homo tetrmeros (4) y estos tetrameros se llaman hemoglobina H, (HbH). Un exceso de HbH en los glbulos rojos de la sangre conduce a la formacin de los cuerpos de inclusin comnmente observados en pacientes con -talasemia. Adems, los tetrmeros de HbH tienen una marcada discapacidad para transportar oxigeno. En la -talasemia, donde estn deficientes las -globinas, las -globinas estn en exceso y formarn homo tetrmeros de -globina. Los homo tetrmeros de -globina son extremadamente insolubles lo que conduce a la destruccin prematura de los glbulos rojos en la mdula y el bazo. Con las -talasemias el nivel de la produccin de -globinas puede variar de cero a niveles casi normales. Esto es debido en parte al hecho que hay 2 genes -globina idnticos en el cromosoma 16. As, las -talasemias implican la inactivacin de 1 a todos los 4 genes de -globina. Si 3 de los 4 genes de -globina son funcionales, los individuos son totalmente asintomticos. Esta situacin es identificada como estado de "portador silencioso" o como -talasemia 2. Genotpicamente esta situacin se seala / o /. Si 2 de los 4 genes estn inactivados, a los individuos se los seala como rasgo de talasemia o como -talasemia 1. Genotpicamente esta situacin se seala / . En individuos descendientes de africanos con -talasemia 1, el desorden generalmente resulta de la inactivacin de 1 gen de -globina en cada cromosoma y se seala como /. Esto significa que estos individuos son homocigotos para el cromosoma 2 de -talasemia. El fenotipo de -talasemia 1 es relativamente benigno. El volumen corpuscular medio (sealado VCM en pruebas clnicas) esta disminuido en la talasemia 1 pero los individuos son generalmente asintomticos. La situacin clnica llega a ser ms severa si solamente 1 de los 4 genes de -globina es funcional. Debido a la dramtica reduccin en la produccin de la cadena de -globina en esta ltima situacin, un alto nivel de tetrmero 4 est presente. Clnicamente esto se refiere como enfermedad de la hemoglobina H. Los individuos afectados tienen moderada a marcada anemia y su VCM es bastante bajo, pero la enfermedad no es fatal. La situacin ms severa resulta cuando no se sintetiza ninguna cadena de -globina (genotpicamente sealado / ). Esto conduce a mortalidad prenatal o a muerte neonatal temprana. La hemoglobina fetal predominante en individuos afectados es un tetrmero de cadenas- y se conoce comohemoglobina de Bart. Esta hemoglobina no tiene esencialmente ninguna capacidad de transporte de oxgeno dando como resultado ausencia de oxgeno en los tejidos fetales. Existe insuficiencia cardiaca cuando el corazn intenta bombear sangre desoxigenada a los tejidos desabastecidos de oxgeno lo que conduce a un edema marcado. Esta situacin se conoce como hidroxis fetalis. Una gran cantidad de mutaciones han sido identificadas alrededor de la disminuida o ausente produccin de las cadenas de -globina dando como resultado -talasemias. En las situaciones ms severas de mutacin de genes de -globina tanto de la madre como del padre conducen a la prdida de cantidades normales de protena de -globina. Una carencia completa de HbA se denota como 0talasemia. Si una u otra mutacin permite la produccin de una cantidad pequea de -globina funcional entonces el desorden se denota como +-talasemia. Ambas talasemias 0- y +- se conocen con el nombre de talasemia mayor, tambin llamadas Anemia de Cooley por el Dr. Thomas Cooley quien describi esta alteracin por primera ocasin. Los individuos afectados sufren de anemia severa que comienza en el primer ao de vida lo que conduce a la necesidad de transfusiones sanguneas. Como consecuencia de la anemia la mdula aumenta dramticamente la produccin de sangre. La corteza del hueso se adelgaza llevando a fracturas patolgicas y la distorsin de los huesos en la cara y el crneo. Adems, hay una marcada hepatoesplenomegalia debido a que el hgado y el bazo actan como sitios adicionales para la produccin de sangre. Sin intervencin estos individuos morirn dentro de la primera dcada de vida. Segn lo indicado, el paciente con -talasemia mayor requiere transfusiones de sangre, sin embargo, a largo plazo estas transfusiones conducen a la acumulacin de hierro en los rganos, particularmente en

el corazn, el hgado y el pncreas. La falla de estos rganos aparece y la muerte sucede en la adolescencia o cerca de los 20 aos. Las terapias de quelacin de hierro parecen mejorar la perspectiva para los pacientes con -talasemia mayor pero sta requiere la continua infusin del agente quelante. Los individuos heterocigotos para -talasemia tienen lo que se llama talasemia menor. Los individuos afectados tienen un gen normal de -globina y uno que tiene una mutacin que lleva a una ausencia o a una produccin disminuida de -globina. Individuos que no producen ninguna protena funcional de -globina a partir de 1 gen se denominan heterocigotos 0. Si la produccin de -globina se reduce a un locus, los individuos se denominan heterocigotos +. Los individuos con talasemia menor son generalmente asintomticos. El trmino talasemia intermedia se utiliza para sealar individuos con anemia significativa y quines son sintomticos pero a diferencia de la talasemia mayor no requieren transfusiones. Este sndrome da lugar a individuos donde ambos genes de -globina expresan cantidades reducidas de protena o donde un gen no produce la protena y el otro produce una cantidad ligeramente reducida de protena. Una persona quien es un heterocigoto compuesto con -talasemia y +-talasemia tambin se manifestar como talasemia intermedia La causa primaria de las -talasemias es la delecin, mientras que, para las -talasemias las mutaciones son ms comunes. En las -talasemias, se han caracterizado mutaciones puntuales en el promotor, mutaciones en el codon de iniciacin de traduccin, una mutacin en la seal de poliadenilacin y varias mutaciones que llevan a anormalidades de "splicing". Una hemoglobinopatia interesante y comn (hasta el 30% de personas del sur este asitico) que tiene tanto caractersticas cuantitativas como cualitativas se debe a la sntesis de la hemoglobina E. La hemoglobina E se presenta debido a una mutacin puntual en el codon 26 que cambia el cido glutmico (GAG) a lisina (AAG). Individuos con esta mutacin producen solamente alrededor del 60% de la cantidad normal de protena -globina. La razn de esto es que la mutacin crea un sitio crtico de ruptura de tal manera que el 40% del mRNA de la hemoglobina E es ms corto en 16 nucletidos y no da lugar a niveles detectables de protena de -globina. Hay algunos individuos en los cuales la sincronizacin del desarrollo de la produccin de globina esta alterada como consecuencia de mutaciones. Las personas con persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH), continan produciendo HbF en la vida adulta. Debido a que el sndrome es benigno la mayora de individuos ni siquiera saben que son portadores de una anormalidad de la hemoglobina. Muchos individuos HPFH tienen grandes deleciones de la regin que codifica las protenas - y -. No hay delecin de los genes globina fetales y por el mecanismo hasta ahora no caracterizado una expresin de estos genes persiste en la edad adulta. Segn lo discutido la hemoglobina funcional es un heterotetramero. Las mutaciones en los genes globina o -globina conducen a anormalidades cuantitativas y cualitativas de la hemoglobina. Por lo tanto, no es de sorprenderse que puedan existir heterocigotos complejos en la descendencia de los individuos que tengan diferentes mutaciones.

Estructura de la mioglobina
A finales de la decada de los 50 se resolvi la estructura terciaria de la mioglobina. La mioglobina es una protena globular pequea, presente en el msculo de los vertebrados, cuya funcin es el transporte de oxgeno en el msculo. Forma parte de la familia de las hemoprotenas, que son protenas que contienen un grupo hemo como grupo prosttico. En las protenas que contienen componentes diferentes a los aminocidos, la parte no aminoacdica de la protena se llama grupo prosttico. La protena sin el grupo prosttico se llama apoprotena, y el conjunto apoprotena grupo prosttico se llamaholoprotena. La mioglobina es una protena pequea de 151 aminocidos compacta formada por 8 hlices alfa que se nombran de la A a la H. En la parte derecha podemos ver la estructura de la mioglobina en representacin de cintas con cada una de las hlices coloreadas cada una de un color.

Enzimas Sricas. Introduccin En la prctica clnica el estudio de las enzimas sricas es muy importante para el diagnstico, control y comprensin de una gran variedad de patologas. Por ejemplo, la

deteccin de altos niveles de amilasa srica contribuye al diagnstico de pancreatitis o parotiditis. Las enzimas presentes en el plasma pueden tener o no funcin en ese medio. En este sentido, se las clasifica como funcionales o no funcionales.

Algunas enzimas tienen amplia distribucin tisular, tanto que otras son especficas de un determinado tejido. Esta mayor o menor especificidad es importante para el diagnstico. Una vez en el plasma cada enzima sufre un proceso de depuracin que le es caracterstico y por lo tanto resulta de gran utilidad conocer cul es su vida media. Clasificacin Las enzimas que se encuentran en el plasma pueden dividirse para su estudio en dos grupos: enzimas funcionales y enzimas no funcionales. Las enzimas funcionales tienen una funcin definida y especfica en este medio, por lo que el plasma constituye su sitio normal de accin, y su concentracin plasmtica es equivalente o mayor que la del tejido donde se producen. A este grupo pertenecen la seudocolinesterasa, ceruloplasmina, lipoproteinlipasa, as como las enzimas que intervienen en la coagulacin. La determinacin de la actividad de estas enzimas tiene inters clnico en le evaluacin tanto de la funcin propia de la enzima en el estudio como de la funcin del tejido que la sintetiza. Las enzimas no funcionales del plasma no tienen una funcin conocida en este medio, ya sea porque no dispone de la cantidad necesaria de sustratos, cofactores o activadores a nivel plasmtico porque su concentracin plasmtica es considerablemente menor que los niveles titulares. Sin embargo, normalmente existen niveles circulantes detectables de la mayora de las enzimas no funcionales debido a la renovacin celular natural o pequeos traumatismos espontneos. Su presencia en plasma en niveles ms altos de lo normal sugiere un aumento en la velocidad de destruccin celular y tisular. La determinacin de estos niveles de enzimas plasmticas puede proveer informacin valiosa para diagnstico y pronstico. Sin embargo, niveles elevados de enzimas en plasma no slo pueden ser interpretados como evidencia de necrosis celular ya que tambin la realizacin de ejercicio vigoroso libera cantidades significativas de enzimas musculares.

Estas enzimas pueden dividirse en dos grupos: enzimas de secrecin y enzimas del metabolismo intermedio. Las enzimas de secreciones se producen en glndulas excrinas, como pncreas y prstata, as como en tejidos como mucosa gstrica y hueso. En adenocarcinoma y osteosarcoma se observa un aumento importante de la actividad plasmtica de las fosfatasas cida y alcalina. Otro grupo de enzimas no funcionales son las enzimas que participan en el metabolismo intermedio. La concentracin tisular de estas enzimas es miles de veces ms alta que en el plasma. El dao puede conducir a un aumento en la permeabilidad de la membrana plasmtica con su consecuente liberacin a la circulacin general. Algunas de las enzimas que corresponden a este grupo son: aspartato amino transferasa (AST) o glutmico-oxalactico transaminasa (GOT), alanina amino transferasa (ALT) o glutmico pirvico transaminasa (GPT), lactato deshidrogenada (LDH), creatn quinasa (CK), amilasa, -glutamiltranspeptidasa (-GT), 5nucleotidasa y aldolasa (ALS). Enzimas sricas de uso clnico ms frecuente ENZIMA ORGANO O ENFERMEDAD DE INTERES Fosfatasa cida Carcinoma de prstata Fosfatasa alcalina Enfermedades hepticas y seas Amilasa Enfermedades pancreticas transaminasa glutmico-pirvico (GPT o ALAT) Enfermedades hepticas transaminasa glutmico-oxalactico (GOT o ASAT) Hepatopatas y cardiopatas lactato deshidrogenada (LDH) Hgado, corazn y eritrocito creatn quinasa (CK) Corazn, musculo y cerebro 5nucleotidasa y aldolasa (ALS) hepatopatas -glutamiltranspeptidasa (-GT), hepatopatas Aldolasa Musculo, corazn Arginasa hepatopatas Elastasa Enfermedades del colgeno Seudocolinesterasa Hgado (intoxicaciones) Plasmina cuagulopatas Lipasa pncreas Otras Glucosa -6- fosfato deshidrogenada

Glutamato deshidrogenada (GLDH) Hidroxibutiratodeshidrogeneasa (HBDH) Lactato deshidrogeneasa (LDH) Los niveles sricos aumentados de LDH se observan en muchas circunstancias como ser anemias megaloblsticas, infarto de miocardio y pulmonar, etc. El gran nmero de situaciones que aumenta la actividad de LDH hace relativa su utilidad diagnstica. Sin embargo, es muy til en el seguimiento de la quimioterapia del cncer puesto que la respuesta en la teraputica se acompaa por una disminucin del nivel srico de esta enzima. La determinacin de la actividad de LDH es til en el diagnstico del infarto de miocardio y pulmonar. Son muy caractersticos los niveles de LDH elevados en los casos de infarto de miocardio y se observan valores altos ya a las pocas horas del comienzo del aparente infarto. Por si sola, la determinacin de LDH no es determinante de lesin de ningn rgano en particular. Hay que tener en cuenta que es necesario evitar la hemlisis de la muestra de sangre, para una correcta determinacin. Transaminasas La GOT est elevada en suero en pacientes con enfermedades hepatobiliares, cardiovasculares y miopatas. La GPT est elevada en el suero de enfermos hepticos. Fosfatasas Fosfatasa alcalina: se encuentra aumentada en las enfermedades hepticas. Los nios en crecimiento y las mujeres embarazadas en el tercer trimestre presentan valores fisiolgicamente elevados de fosfatasa alcalina en suero. La determinacin de la fosfatasa alcalina es suero es til para reconocer las enfermedades seas, sobre todo la ostetis deformante, hipoparatiroidismo y neoplasias seas. La elevacin de la fosfatasa alcalina srica en algunas enfermedades hepticas puede ser distinguida mediante otras pruebas de laboratorio y por sus rasgos clnicos. Fosfatasa cida: se observan valores elevados en pacientes con carcinoma prosttico. Distribucin tisular de las enzimas. Las isoenzimas son protenas que difieren en la secuencia de aminocidos pero que

catalizan la misma reaccin, estando presentes en la misma especie. Estas enzimas poseen diferentes propiedades fsicas y qumicas determinadas genticamente (punto isoelctrico, especificidad de sustrato y cofactor, etc), suelen mostrar diferentes parmetros cinticos (i.e. diferentes valores de KM), o propiedades de regulacin diferentes. La existencia de las isoenzimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa del desarrollo. Por ejemplo, la creatina quinasa (CK) presente en el cerebro difiere fisicoqumicamente de sus isoenzimas especficas de msculo cardaco y esqueltico. Asimismo, las isoemzimas pueden tener distinta localizacin subcelular como por ejemplo la glutmico oxalactica transaminasa (GOT) presente en mitocondria difiere de la citoslica. En cambio las diferentes isoenzimas de la lctico deshidrogenada (LDH) estn presentes en compartimientos citoslicos. En trminos muy generales, las diferencias en el contenido enzimtico son puramente cuantitativas, es decir, las mismas enzimas estn presentes en su mayora en diversos tejidos, pero sus actividades relativas muestran grandes diferencias de rgano a rgano. As, el mapa enzimtico es la descripcin de un rgano en trminos de su contenido enzimtico. El mapa enzimtico tisular est constituido, por la cantidad de cada una de las distintas enzimas que contienen todas las clulas de un determinado rgano. Tanto en condiciones normales como patolgicas, esto se ve reflejado en un mapa enzimtico srico. Esto es la presencia en el suero de las enzimas presentes en un rgano. Esto es de vital importancia en la clnica, ya que facilita su determinacin por su fcil accesibilidad. La medida de los diversos mapas enzimticos sricos, por su parte, constituye el intento de lograr la especificidad bioqumica de los diferentes rganos. Cuanto mayor sea la cantidad de enzimas que se determinen ms completo ser el mapa y mejor podr determinarse el cuadro patolgico.

Aunque desde el punto de vista biolgico son muchas las enzimas objeto de atencin, el inters clnico se centra en el estudio de aquellas cuyas variaciones son patognomnicas, es decir, indicadoras de enfermedad o, por lo menos, de determinadas alteraciones funcionales. Es adecuado determinar ms de una enzima en el suero, por el hecho de no existir enzimas que sean simultneamente rganoespecficas y lo suficientemente sensibles.Determinacin de niveles sricos de enzimas. La pequea cantidad de enzima (que es una protena) presente en las clulas complica la medicin de dicha cantidad de enzima presente en un extracto tisular o fluido biolgico. Afortunadamente la actividad cataltica de una enzima provee un elemento sensible y especfico para su propia determinacin. La capacidad de transformar especficamente un gran nmero de molculas de sustrato en producto, en un perodo corto de tiempo, permite amplificar en forma muy eficiente su presencia. El nivel srico de una enzima dada se cuantifica determinando la actividad de esa enzima presente en una muestra de suero y no as su concentracin, debido a que: 1) por lo general estn presentes en cantidades muy pequeas en los lquidos biolgicos. 2) no se encuentran en estado puro, sino que se encuentran dentro de una mezcla compleja, que entre muchas otras molculas, contiene un gran nmero de otras protenas. La actividad se expresa generalmente en UI/l (UI= unidad internacional). Para que una prueba enzimtica sea vlida, debe disearse un protocolo donde la concentracin de enzima sea el nico factor limitante, es decir que el resultado refleje la cantidad de enzima y no se vea afectado por otras sustancias o circunstancias. Debe tenerse en cuenta la posible interferencia por muestras obtenidas con anticoagulantes (resultados falsamente elevados o disminuidos) por hemlisis de la muestra (se eleva falsamente la LDH por ejemplo), por opalescencia o caracterstica lechosa del suero (produce lecturas variables de absorcin de luz).

Para la determinacin de la actividad enzimtica, en algunos casos se utiliza la informacin ya conocida de la reaccin catalizada por la enzima, su requerimientos de cofactores y algunas propiedades de alguno de los sustratos o productos de la reaccin, generalmente absorbancia de la luz visible o UV por ser una determinacin sencilla, fcil y poco costosa. Ejemplos: La LDH cataliza la reduccin de piruvato a lactato y la simultanea oxidacin de NADH a NAD+ LDH Piruvato + NADH + H + Lactato + NAD + El NADH absorbe en el rango de la luz ultravioleta (340 nm), propiedad utilizada para la determinacin enzimtica. La mezcla de reaccin aporta piruvato y NADH, como sustratos, en un medio de pH adecuado (buffer). La reaccin se inicia por el agregado de muestra en estudio que contiene la LDH a dosar. Utilizando un espectrofotmetro se mide la disminucin de absorbancia a 340 nm, indicador del consumo de NADH. La velocidad de desaparicin del sustrato es proporcional a la cantidad de enzima LDH presente en la muestra. Si los sustratos o productos carecen de una propiedad espectral de fcil medicin, se utiliza el acople de la reaccin que cataliza la enzima de inters a una segunda reaccin cuyos sustratos o productos pueden determinarse por espectrofotometra. Ejemplo: Las transaminasas son enzimas que participan activamente en el metabolismo de aminocidos. Catalizan la transferencia el grupo amino de un aminocido a un cetocido con la consiguiente transformacin del aminocido original en cetocido y del cetocido inicial en aminocido. Existe una gran variedad de transaminasas de las cuales dos son

usadas frecuentemente como indicadores de dao heptico o cardaco: la glutmico pirvico transaminasa (GPT) tambin llamada alanina amintransferasas (ALT o ALAT) y la glutmico oxalactico transaminasa (GOT) tambin llamada asprtico aminotransferasas (AST o ASAT). GPT Alanina + -cetoglutarato piruvato + glutamato GOT Aspartato + -cetoglutarato oxalacetato + glutamato En estos casos ni los sustratos ni los productos absorben luz en el rango UV o visible, por lo cual la determinacin de las transaminasas se realiza travs de una reaccin acoplada que utiliza como sustrato un producto de la reaccin anterior. GPT (fosfato de piridoxal) Alanina + -cetoglutarato Piruvato + glutamato LDH Piruvato + NADH + H + Lactato + NAD + La mezcla de reaccin aporta alanina, -cetoglutarato NADH, LDH y fosfato de piridoxal (cofactor de la enzima GPT) en concentraciones no limitantes de un buffer de pH adecuado (7,3). La reaccin se inicia por el agregado de la muestra en estudio. La velocidad de la reaccin catalizada por la LDH estara determinada por la produccin de piruvato proveniente de la reaccin catalizada por la GPT. Por lo tanto la velocidad de desaparicin de NADH, determinada midiendo absorcin de luz 430 nm, ser proporcional a la actividad de GPT presente en la muestra. En la determinacin de GOT se acopla a la reaccin catalizada por la malato deshidrogenasa (MDH), con un principio idntico al descrito. GOT (fosfato de piridoxal) Aspartato + -cetoglutarato Oxalacetato + glutamato MDH Oxalacetato + NADH + H +

Malato + NAD + En otros casos la determinacin no se realiza utilizando sustratos fisiolgicos, sino compuestos similares sobre los cuales acta igualmente la enzima. Ejemplo: La determinacin de la fosfatasa alcalina (FAL) utiliza un sustrato del cual la enzima remueve el grupo fosfato liberando 4-nitrofenol, compuesto de color amarillo que absorbe luz en el rango visible. Fosfatasa alcalina (dietanolamina) Fosfato de p-nitrofenilo p-nitrofenol + Fosfato Caractersticas clnicas Se ha observado: a- en procesos inflamatorios aparecen en plasma en primer trmino enzimas de bajo e intermedio peso molecular (por ej: en las hepatitis, encima de entre 40.000 a 140.000 Da). b- En nivel de enzimas en el suero que se observa en una lesin es generalmente proporcional a la magnitud de membrana celular afectada. c- En los daos celulares mnimos, primero pasan a la sangre las enzimas citoplasmticas y en caso de dao extenso o ms intenso, lo hacen las enzimas localizadas en las membranas de las organelas (por ej: la glutmico deshidrogenasa (GLDH) mitocondrial). d- Hay factores que alteran la permeabilidad selectiva de la membrana celular y que provocan una salida al espacio extracelular de enzimas intracelulares. Los ms conocidos son: Baja concentracin de oxgeno (hipoxia) Baja de concentracin en el medio Alta concentracin en el medio Agentes qumicos (iodoacetato, cianuro, tetracloruro de carbono) Agentes fsicos (pH, temperatura osmolaridad) Algunos virus. Para los fines diagnostico, una elevacin de las enzimas celulares en el plasma es equiparable a una lesin celular. Es importante tener en cuenta que las enzimas cuyos

niveles aumentan en suero raramente derivan de una necrosis celular sino que lo hacen por un grado sucesivo de liberacin debido a que la biosntesis enzimtica se conserva mientras la clula vive. En los casos extremos de necrosis, despus de un breve lapso, las actividades en el suero disminuyen por falta de nuevos aportes debido a una biosntesis proteica considerablemente disminuida o nula. Depuracin de enzimas plasmticas no funcionales. Una vez en el plasma, la actividad de las diversas enzimas decrece con una velocidad caracterstica cada una de ellas (tiempo de vida media). Comparadas con otras protenas del suero, las enzimas sricas poseen un tiempo de vida media muy corto. Esto significa, por una parte, que sus actividades en el suero son representativas del curso temporal de la lesin que les dio origen, y por otra, que en las lesiones agudas, como por ejemplo el infarto de miocardio, las determinaciones enzimticas deben ser efectuadas segn el tiempo transcurrido luego de la lesin: Vas de eliminacin de enzimas sricas: a- Eliminacin renal: se cumple para aquellas de bajo peso molecular. Ej: amilasa y algunas fosfatasas b- Inactivacin srica: existen inactivadores o inhibidores para varias enzimas: Ej: tripsina, quimiotripsina. c- Para algunas enzimas existe recaptacin por parte de los tejidos convalecientes, al restablecerse anatmica y fisiolgicamente. Esta pequesima parte de las enzimas previamente liberadas sera utilizada, no para su funcin primitiva, sino como integrante de un pool (reservorio) de aminocidos. Localizacin del lugar de la lesin utilizando las determinaciones enzimticas. Existen tres mtodos: 1- Medida de enzimas especficas de rgano: se designa como especficas de rgano a las enzimas que se presentan con actividad relativamente alta en un determinado rgano o tejido. Por lo tanto, sus niveles sricos aumentados indican con seguridad una lesin en este rgano. Por ejemplo la CK es prcticamente especfica de msculo,

la sorbitol deshidrogenasa (SDH), y la glutamato dehidrogenasa (GLDH) son ampliamente especfica de hgado, en tanto que la lipasa lo es de pncreas. El valor informtico de la determinacin de las enzimas especficas de rgano puede aumentarse considerablemente por la determinacin simultnea de la actividad de otras enzimas. Al presentarse sntomas poco claros, sobre todo en casos de urgencia (ej: infarto de miocardio, abdomen agudo) tales mapas enzimtico sirven para un rpido diagnstico diferencial. 2- Determinacin de isoenzimas: la determinacin de la actividad de varias isoenzimas son metodolgicamente ms costosas que las medidas de la actividad total Enzima Vida media promedio transaminasa glutmico-pirvico (GPT o ALAT) 4710 horas transaminasa glutmico-oxalactico t (GOT o ASAT) 175 horas Glutamato deshidrogenasa (GLDH) 181 horas lactato deshidrogenada (LDH) 11360 horas creatn quinasa (CK) 15 horas aproximadamente Fosfatasa alcalina 3-7 dias -glutamiltranspeptidasa (-GT), 3-4 das Colinesterasa (CHE) 10 das aproximadamente Amilasa 3-6 horas Lipasa 3-6 horas de una enzima. Slo se emplea a algunos casos particulares. Por ejemplo bajo la sospecha de carcinoma prosttico, resulta de inters la determinacin de la actividad de la isoenzima de la fosfatasa cida que es inhibible por tartrato, ya que esta isoenzima es especfica de la prstata. La determinacin de la actividad de las isoenzimas de LDH es de gran valor diagnstico. ISOENZIMA SUBUNIDADES Tejidos en donde se encuentra la isoenzima mayoritariamente Niveles normales de cada isoenzima

en el adulto* LDH-1 HHHH Miocardio, eritrocito 17-27% LDH-2 HHHM Miocardio, eritrocito 27-37% LDH-3 HHMM Clulas linfoide, cerebro , rin 18-25% LDH-4 HMMM Hgado, msculo esqueltico 3-8% LDH-5 MMMM Hgado, msculo esqueltico 5% (*En estos valores puede haber ciertas diferencias por la tcnica o por criterios de normalidad propios de laboratorios concretos, a veces en el rango de valores y otras veces por las unidades a las que se hace referencia.) Las cinco isoenzimas de la LDH tienen el mismo peso molecular y difieren en la carga que contienen. Esta diferencia es el principio de la determinacin diferencial, que se realiza por separacin electrofortica. La fraccin con mayor movilidad hacia el nodo (polo negativo) es la isoenzima de tipo LDH-1 y la de menor movilidad es la LDH-5. Como la vida media de las LDH-1 (HHHH) (especfica de corazn) es diez veces mayor que la de la LDH-5 (MMMM), especfica de msculo esqueltico, despus de un infarto de miocardio se puede comprobar la preponderancia de la isoenzima cardioespecfica an cuando la actividad de LDH total retorne a los valores normales. Existen tres isoenzimas de CK cuya distribucin se muestra en la siguiente tabla % de cada isoenzima en ISOENZIMA Musculo esqueltico Miocardio cerebro CK3-MM 95 80-85 1-2 CK2-MB 2-3 15-20 1 CK1-BB 1-2 1-2 90 El hallazgo de un nivel elevado de CK total puede deberse al aumento de cualquiera de las fracciones indicadas. Es importante remarcar que traumatismos, ejercicios musculares intensos o inyecciones intramusculares pueden producir el aumento de CK

total. En este caso se trata de un aumento a expensas de la fraccin MM. La determinacin de la isoenzima cardiaca CK (CK-MB) presente en el suero permite diferencias entre un infarto de de miocardio y lesiones de la musculatura esqueltica. La determinacin de la isoenzima se realiza por inmunoinhibicin: se preincuba la muestra con anticuerpos especficos que reconocen a la subunidad B. La unin del anticuerpo a la sub-unidad B inhibe la actividad de esta isoenzima. Luego se realiza la determinacin de la actividad remanente. 3- Mapas enzimticos: La utilidad de determinar un mapa enzimtico reside no tanto en conocer el valor absoluto de la actividad de enzimas investigadas sino en considerar sus valores en trminos relativos. As, un cociente GPT/GOT mayor que uno es altamente indicativo de una lesin heptica; en el caso inverso (cociente menor que uno) es ms probable un infarto de miocardio. Es importante remarcar que las conclusiones obtenidas a partir de la medicin de un mapa enzimtico deben corroborarse con los sntomas clnicos del paciente. Cuestionario de enzimas sricas. 1 - Qu entiende por enzimas sricas? Cul es su origen? Por qu se encuentran en circulacin? 2- Cmo influye el peso molecular y la localizacin intracelular de una enzima que se encuentra aumentada en plasma? 3 Cules son las enzimas de origen heptico qu aumentaran en el plasma en: a- proceso inflamatorio agudo? b- dao celular grave? c necrosis celular? 4. - Qu importancia tiene la interpretacin de sus variaciones la vida media de una enzima srica? 5 - Qu es una enzima rgano especfica y para que sirve su determinacin en suero? Qu es un mapa enzimtico? 6.- Una determinacin aislada de enzima srica tiene valor diagnstico? 7. - Cules son las transaminasas ms comunes dosadas? Por qu? Qu reaccin catalizan?

8 - Qu reaccin catalizan la lctico deshidrogenasa (LDH)? Cuntas isoenzimas

conoce? En qu se diferencia una de la otra y en qu rgano predominan?

LAS ENSIMAS 1ra parte

PUBLICADO POR RAMON MARTINEZ ON SBADO 5 DE DICIEMBRE DE 2009 / ETIQUETAS: BIOLOGIA

LAS ENSIMAS EN EL DISNOSTICO CLINICO. EL principio de la enzimologa encuentran aplicacin prctica en el laboratorio clnico en la medicin de los niveles enzimticos de las concentraciones de sustrato en plasma y tejidos de los individuos enfermos. El fundamento racional de la medicin de actividades enzimticas en plasma se basa en la premisa de que los cambios en los niveles de enzimas plasmticas reflejan cambios que han tenido lugar en un tejido u rgano especfico. Las enzimas plasmticas son de dos tipos: un tipo est presente en su ms alta concentracin, es especfico del plasma, y tiene un papel funcional en ste, son, por tanto enzimas plasmticas funcionales; el otro tipo se encuentra presente normalmente a niveles muy bajos y no llevan a cabo funcin alguna conocida en la sangre, son las enzimas plasmticas no funcionales. En el primer grupo se incluyen las enzimas asociadas con la coagulacin de la sangre (por ej. trombina), disolucin del cogulo de fibrina (plasmina) y modificacin de quilomicrones (lipoprotena lipasa). Generalmente son sintetizadas en el hgado, pero tambin se encuentran en la sangre en concentraciones equivalentes mayores que en los tejidos. Las enzimas especficas no plasmticas son ms importantes en las enfermedades de tejidos y rganos. Normalmente, los niveles plasmticos son muy bajos o nulos. Una agresin en forma de cualquier proceso patolgico puede provocar cambios en la permeabilidad de la membrana celular o incrementar la muerte celular, dando lugar a la liberacin de enzimas intracelulares en el plasma. En el diagnstico de la implicancia de un rgano especfico en un proceso patolgico ser ideal poder identificar enzimas especficas para cada rgano. Esto es improbable, ya que el metabolismo de muchos rganos es muy parecido. La alcohol deshidrogenasa del hgado y la fosfatasa cida de la prstata son tiles para la identificacin especfica de enfermedades en estos rganos. Al margen de estos dos ejemplos, hay muy pocas enzimas que sean especficos de rganos. Sin embargo la proporcin de diferentes enzimas vara de tejido a tejido. Los valores bajos de enzimas no funcionales que se encuentran por lo general en el plasma, aparentemente tienen su origen en la destruccin rutinaria normal de los eritrocitos, leucocitos y otras clulas. Con la muerte acelerada de stas clulas, las enzimas solubles entran en la circulacin. Aunque los valores elevados de enzimas plasmticas se interpretan generalmente como prueba de necrosis celular, el ejercicio intenso tambin da por resultado la liberacin de cantidades importantes de enzimas musculares. CREATN FOSFO QUINASA CPK: Aparece en forma de dmero con dos tipos de subunidades, la M (tipo msculo) y la B (tipo cerebro). En el cerebro, ambas subunidades son, desde el punto de vista electrofortico del mismo tipo y se designan B. En el msculo esqueltico, las subunidades son ambas del tipo M. Las isoenzimas que contienen las subunidades del tipo B y del tipo M (MB) slo se encuentran en el corazn (miocardio). Otros tejidos contienen cantidades variables de las isoenzimas MM y BB. Las isoenzimas se numeran empezando por la especie que se desplaza ms rpidamente hacia el nodo en la electroforesis, y son CPK1 (BB) o rpida, CPK2 (MB) o intermedia y CPK3 (MM) lenta. La CPK2 no debe superar el 6% de la CPK total. Su actividad aumenta en miopatas congnitas, infarto de miocardio,

enfermedad cerebrovascular, hipotiroidismo, grandes quemados, etc. y disminuye en la artritis reumatoide y otros procesos reumticos inflamatorios.

LACTATO DESHIDROGENASA LDH: Es una enzima tetramrica que contiene solo dos subunidades distintas: las designadas H del corazn (miocardio) y las M del msculo. Estas dos subunidades se combinan de cinco formas diferentes: Despus de la lesin del tejido cardaco, la rotura celular libera CPK2 a la sangre dentro de las primeras 6-18 horas despus de un infarto, pero la liberacin de LDH se retrasa respecto a la aparicin de CPK2 en 1-2 das. Normalmente, la actividad de la isoenzima LDH2 es mayor que la de la LDH1. El cambio de las isoenzimas de la LDH junto a una CPK2 incrementada es diagnstico de un infarto de miocardio virtualmente en el 100% de los casos. Un aumento en la actividad de la LDH5 es un indicador de congestin heptica. De este modo, se pueden seguir complicaciones secundarias de la lesin cardiaca.+

TRANSAMINASAS AMINOTRANSFERASAS GOT AST y GPT ALT: Actualmente se determina por separado la glutmico oxalactico transaminasa o GOT , llamada tambin aspartatoaminotransferasa o AST, y la glutmico pirvico transaminasa o GPT o alann aminotransferasa o ALT. En el suero normal abunda ms la primera que la segunda. En el hepatocito, la GPT es una enzima citoplasmtica, mientras que la GOT es bilocular, se encuentra tanto el citoplasma como en las mitocondrias. El suero contiene normalmente de 8 a 20 U/lt., de estas transaminasas. Por encima de 20 U/lt debe considerarse patolgica e indica la existencia de un proceso de necrosis hstica generalmente miocrdica o heptica, con paso a la sangre circulante de transaminasa. Hoy se sabe que no es necesaria la necrosis para la liberacin de estas enzimas y que basta un trastorno reversible de la permeabilidad celular, por los menos en los aumentos de GPT, ms superficial en el hepatocito. Aumentos patolgicos de las transaminasas sricas ocurren en infarto de miocardio (a partir de las primeras 6 horas y por un lapso de 4 a 6 das, alcanzndose los valores mximos a las 36 horas), hepatitis aguda, (la GPT suele elevarse muy por encima de la GOT) esto estara en relacin con una lesin superficial o difusa de los hepatocitos. Las transaminasas se elevan no solo en las hepatitis vricas (A, B, C o D) sino tambin en las txicas o medicamentosas, y en las isquemias y/o estasis heptica. En la hepatitis alcohlica aguda hay una mayor elevacin de la GOT con respecto a la GPT. La cirrosis heptica da tambin ligeros aumentos. Tambin aumenta en las pancreatitis agudas, embolia o trombosis con infarto y necrosis hstica de cualquier localizacin, excepto, por lo general, en el cerebro, afecciones musculares (polimiositis, dermatomiositis), traumatismos musculares extensos, mioglobinurias y ejercicio muscular violento o sostenido.

Estas caractersticas tan especiales pueden ser explicadas, segn nuestro criterio, mediante, Una nueva teora acerca de las diluciones homeopticas, definimos a la Informacin como la disposicin a actuar, y de una determinada manera, que presenta un ente cualquiera en este caso, un ente biolgico-, en presencia del receptor adecuado. La Informacin latente en la compleja microestructura proteica de la enzima, representa una disposicin a actuar que solamente se puede hacer activa en presencia del receptor adecuado, que en este caso es el sustrato correspondiente. En un estado neguentrpico encontramos que hay una reaccin qumica lejos de su equilibrio. As, entonces, cuando

alguna enzima est frente a su sustrato especfico, acta constituyendo con l un complejo reversible, en el complejo enzima-sustrato. La formacin compleja representa el punto culminante de la accin catalizadora de una enzima (estado de transicin). Pues es a nivel de este complejo que se produce la "activacin" del sustrato, facilitndose as el proceso qumico catalizado. Si comparamos una misma reaccin qumica con y sin enzimas, apreciamos cmo en el primer caso la magnitud de la energa de activacin es decir, la cantidad de energa necesaria para que la reaccin se desencadene-, es mucho menor . De ah que se diga que la enzima reduce la energa de activacin requerida para acelerar cierta especfica reaccin qumica. Despus de la lesin del tejido cardaco, la rotura celular libera CPK2 a la sangre dentro de las primeras 6-18 horas despus de un infarto, pero la liberacin de LDH se retrasa respecto a la aparicin de CPK2 en 1-2 das. Normalmente, la actividad de la isoenzima LDH2 es mayor que la de la LDH1. El cambio de las isoenzimas de la LDH junto a una CPK2 incrementada es diagnstico de un infarto de miocardio virtualmente en el 100% de los casos. Un aumento en la actividad de la LDH5 es un indicador de congestin heptica. De este modo, se pueden seguir complicaciones secundarias de la lesin cardiaca.+

TRANSAMINASAS AMINOTRANSFERASAS GOT AST y GPT ALT: Actualmente se determina por separado la glutmico oxalactico transaminasa o GOT , llamada tambin aspartatoaminotransferasa o AST, y la glutmico pirvico transaminasa o GPT o alann aminotransferasa o ALT. En el suero normal abunda ms la primera que la segunda. En el hepatocito, la GPT es una enzima citoplasmtica, mientras que la GOT es bilocular, se encuentra tanto el citoplasma como en las mitocondrias. El suero contiene normalmente de 8 a 20 U/lt., de estas transaminasas. Por encima de 20 U/lt debe considerarse patolgica e indica la existencia de un proceso de necrosis hstica generalmente miocrdica o heptica, con paso a la sangre circulante de transaminasa. Hoy se sabe que no es necesaria la necrosis para la liberacin de estas enzimas y que basta un trastorno reversible de la permeabilidad celular, por los menos en los aumentos de GPT, ms superficial en el hepatocito. Aumentos patolgicos de las transaminasas sricas ocurren en infarto de miocardio (a partir de las primeras 6 horas y por un lapso de 4 a 6 das, alcanzndose los valores mximos a las 36 horas), hepatitis aguda, (la GPT suele elevarse muy por encima de la GOT) esto estara en relacin con una lesin superficial o difusa de los hepatocitos.

Las transaminasas se elevan no solo en las hepatitis vricas (A, B, C o D) sino tambin en las txicas o medicamentosas, y en las isquemias y/o estasis heptica. En la hepatitis alcohlica aguda hay una mayor elevacin de la GOT con respecto a la GPT. La cirrosis heptica da tambin ligeros aumentos. Tambin aumenta en las pancreatitis agudas, embolia o trombosis con infarto y necrosis hstica de cualquier localizacin, excepto, por lo general, en el cerebro, afecciones musculares (polimiositis, dermatomiositis), traumatismos musculares extensos, mioglobinurias y ejercicio muscular violento o sostenido. Estas caractersticas tan especiales pueden ser explicadas, segn nuestro criterio, mediante, Una nueva teora acerca de las diluciones homeopticas, definimos a la Informacin como la disposicin a actuar, y de una determinada manera, que

presenta un ente cualquiera en este caso, un ente biolgico-, en presencia del receptor adecuado. La Informacin latente en la compleja microestructura proteica de la enzima, representa una disposicin a actuar que solamente se puede hacer activa en presencia del receptor adecuado, que en este caso es el sustrato correspondiente. En un estado neguentrpico encontramos que hay una reaccin qumica lejos de su equilibrio. As, entonces, cuando alguna enzima est frente a su sustrato especfico, acta constituyendo con l un complejo reversible, en el complejo enzima-sustrato. La formacin compleja representa el punto culminante de la accin catalizadora de una enzima (estado de transicin). Pues es a nivel de este complejo que se produce la "activacin" del sustrato, facilitndose as el proceso qumico catalizado. Si comparamos una misma reaccin qumica con y sin enzimas, apreciamos cmo en el primer caso la magnitud de la energa de activacin es decir, la cantidad de energa necesaria para que la reaccin se desencadene-, es mucho menor . De ah que se diga que la enzima reduce la energa de activacin requerida para acelerar cierta especfica reaccin qumica.