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CAPITULO

Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana


8-1 Naturaleza dinmica del sistema endomembrana 8-2 Algunas tcnicas para el estudio de las citomembranas H-3 Retculo endoplsmico i-4 El complejo de Golgi 8-5 Lisosomas 8-6 Vacuolas de clulas vegetales La perspectiva humana: Enfermedades producidas por defectos de la funcin lisosmica 8-7 Captacin celular de partculas y rnacromolculas La va experimental: Endocitosis mediada por receptores

FIGURA 8-A. En esta micrografa se indican varios elementos del sistema endomembrana de un par de clulas epiteliales cultivadas, teidas con anticuerpos fluorescentes para mostrar la presencia del retculo endoplsmico (verde) y de os endosomas (rojo). El ncleo aparece en azul. (Cortesa de Katrina Alien, Man/ Rycoiuski y ]ean Wilson, Universidad de Arizona.)

bservado con microscopio de luz, el citoplasma de casi todas las clulas vivientes parece relativamente desprovisto de estructura. Incluso antes que empezara el siglo XX, el examen de cortes de tejido teidos indicaba la existencia de una extensa red membranosa dentro del citoplasma. Sin embargo, no fue sino hasta el desarrollo del microscopio electrnico, en el decenio de 1940, que los bilogos comenzaron a apreciar las diversas disposiciones de las estructuras membranosas presentes en el citoplasma de la mayor parte de las clulas eucariotas. Los primeros investigadores en microscopa electrnica observaron vesculas rodeadas de membrana de dimetros diferentes que contenan materiales de diversa densidad electrnica; largos canales enlazados por membranas que se ramifican a travs del citoplasma para formar una red interconectada de conductos, y pilas de sacos aplanados rodeados de membranas llamadas cisternas. De los primeros estudios con microscopa electrnica y de las investigaciones bioqumicas que siguieron cada vez fue ms evidente que el citoplasma de las clulas eucariotas estaba gubdividido en varios compartimientos rodeados por barreras membranosas. A medida que se examinaron ms tipos de clulas se demostr que las estructuras membranosas del citoplasma formaban distintos organelos identificables en diversas clulas, desde levaduras hasta plantas y animales evolutivamente desarrollados. Lo extenso de las estructuras membranosas que ocupan el citoplasma de una clula eucariota se ilustra en la micrografa de una clula de la raz de una planta de maz mostrada en la figura 8-1.

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FIGURA !-1. Organelos membranosos citoplsmicos. El citoplasma de esta clula de la cubierta de la raz de una planta de maz tiene diversa disposicin de organelos membranosos. En este captulo examinaremos la estructura y funcin de muchos de estos organelos. (Cortesa de Hton H. MoUenhauer.)

En el presente captulo estudiaremos la estructura y las funciones del retculo endoplsmico, el complejo de Golgi, los endosomas, lisosomas y vacuolas. Considerados en conjunto, estos organelos membranosos forman un sistema de endomembranas estructural y funcionalmente interrelaconadas.1 Otros organelos membranosos del citoplasma, la mitocondria, los peroxisomas y los cloroplastos, fueron tema de los captulos precedentes.

8-1 Naturaleza dinmica del sistema endomembrana


Aunque el microscopio electrnico puede suministrar imgenes exquisitamente detalladas de las partes de una clula, inevitablemente son figuras congeladas en el tiempo. Las clulas ejecutan procesos dinmicos, pero el microscopio electrnico slo capta escenas estticas. Por consiguiente, debemos tratar de poner en accin a los organelos de la clula en nuestra propia imaginacin. Muchos estudios, algunos de los cuales se analizan en este captulo, muestran que casi todos los organelos membranosos del citoplasma forman parte de una red dinmica integrada en la cual se intercambian materiales de una parte de la clula a otra en ambos sentidos. En la mayor parte de los casos, los vehculos que llevan materiales entre los organelos, por ejemplo
1 La envoltura nuclear tambin puede considerarse parte del sistema endomembrana, ya que se contina con el retculo endopisrnico y es sitio de sntesis de protenas de membrana. Sin embargo, la envoltura nuclear no es un organelo citoplsmica y su principal papel es regular el flujo de material entre el ncleo y el citoplasma. En consecuencia, su estructura y funcin se revisan en el captulo 12.

del retculo endoplsmico al complejo de Golgi, son minsculas vesculas de transporte que se forman por gemacin a partir de un compartimiento membranoso. Estas vesculas se mueven a travs del citoplasma de manera dirigida, con frecuencia a lo largo de vas formadas por elementos del citoesqueleto, y luego se fusionan con la membrana de un compartimiento diferente que acepta tanto la carga soluble de la vescula como su envoltura membranosa (fig. 8-2, V). Ciclos repetidos de gemacin y fusin desplazan materiales a lo largo de las vas a travs de la clula. Se han identificado diversas vas en el citoplasma (fig. 8-2). Se puede notar una va biosinttica en la cual se sintetizan materiales en el retculo endoplsmico o en el complejo de Golgi, se modifican durante su paso a travs del complejo de Golgi y se transportan en el citoplasma a diferentes destinos, como la membrana plasmtica, un lisosoma, o la vacuola ms grande de una clula vegetal. Esta ruta se conoce como la va secretoria, pues gran parte de los materiales sintetizados en el retculo endoplsmico o en el complejo de Golgi estn destinados a ser descargados (secretados) hacia afuera de la clula. La va biosinttica secretoria incluye flujo de lpidos, carbohidratos y protenas. En la primera parte del captulo slo consideraremos sntesis y transporte de protenas (fig. 8-2) y ms tarde volveremos al ensamblado y desplazamiento de ciertos carbohidratos y lpidos de membrana. Las actividades secretorias de la clula se pueden dividir en dos tipos: elemental y regulada. Durante la secrecin elemental se transportan materiales desde su sitio de sntesis y se descargan en el espacio extracelular de manera continua, no regulada. La mayor parte de las clulas participan en la secrecin elemental, proceso que contribuye no slo a la formacin de matriz extracelular (seccin 7-1), sino tambin a la formacin de la propia membrana plasmtica. Durante la secrecin regulada se secretan y almacenan materiales en granulos secretorios rodeados de membrana en las regiones perifricas del citoplasma y slo se descargan en respuesta a un estmulo apropiado. La secrecin regulada ocurre, por ejemplo, en clulas que producen y liberan hormonas o enzimas digestivas y en clulas nerviosas que liberan sustancias neurotransmisoras. . En tanto que la va secretoria desplaza materiales hacia afuera de la clula, la va endoctica opera en direccin opuesta llevando materiales del exterior de la clula (y desde la superficie de la membrana celular) a compartimientos como los endosomas y lisosomas localizados en el interior de la clula (fig. 8-2). El movimiento de vesculas y de los materiales encerrados en ellas a lo largo de diferentes vas dentro de una clula es anlogo a los movimientos de vehculos de carga que llevan diferentes tipos de carga a lo largo de las calles de una ciudad. Ambos tipos de transporte requieren normas definidas de trfico para garantizar que los materiales destinados a diferentes localidades sean entregados con precisin en los sitios apropiados. Por ejemplo, el trfico de protenas al interior de una clula de la glndula salival requiere que las protenas del moco salival, elaboradas en el retculo endoplsmico, se dirijan especficamente hacia las vesculas secretorias; en tanto que las enzimas lisosmicas, tambin elaboradas en el retculo endoplsmico, se enven

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CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana FIGURA 8-2. Las vas biosinttica y endoctica unen a las endomembranas en una red dinmica interconectada. a) La va biosinttica describe el flujo de materiales {especialmente protenas) del retculo endoplsmico a travs del complejo de Golgi hacia diferentes sitios, incluyendo lisosomas, endosomas, vesculas secretorias, vacuolas y la membrana plasmtica. La va endoctica mueve materiales desde la superficie de la clula al interior de la misma por medio de endosomas y isosomas, donde en general son desdoblados por las enzimas lisosmicas. La va endoctica incluye el desplazamiento de protenas de membrana y materiales extracelulares. Los carbohidratos y los lpidos pueden seguir rutas semejantes, segn se describe al final del captulo, b) Diagrama que ilustra el proceso de transporte vesicular mediante el cual los materiales son llevados desde un compartimiento donador a un compartimiento receptor. Las vesculas se forman por gemacin de la membrana, durante la cual las protenas de la membrana donadora se pueden incorporar a la vescula membranosa y las protenas solubles en el compartimiento donador pueden quedar encerradas en la luz de la vescula. Cuando posteriormente la vescula de transporte se fusiona, las protenas de la vescula de la membrana entran a formar parte de la membrana receptora y las protenas solubles quedan secuestradas en la luz del compartimiento receptor.

Exocitosis

Exterior

Endocitosis-

especialmente a los lisosomas. Las protenas se dirigen a destinos celulares predeterminados empleando las "direcciones" especficas o seales seleccionadoras que llevan las propias protenas. La clasificacin de protenas con diferente direccin se facilita por receptores residentes en las paredes de la vescula de transporte que reconocen protenas destinadas a sitios particulares. En el ltimo decenio se ha avanzado mucho en el mapeo de los patrones de trfico de clulas eucariotas al identificar direcciones especficas y receptores que gobiernan el flujo de trfico y al dilucidar el mecanismo que garantiza la entrega fsica de los materiales en los sitios apropiados del interior de la clula. En las siguientes pginas se analizarn en detalle estos temas. Primero consideraremos algunos de los ms importantes mtodos experimentales gracias a los cuales se lograron estos avances.

8-2 Algunas tcnicas para el estudio de las citomembranas


(a)

Fusin con el 49)O/^ iompartimiento V**X * receptor A(

Los primeros estudios con microscopa electrnica suministraron a los bilogos una descripcin detallada del citoplasma de las clulas con muy poca atencin a las funciones que desempeaban las estructuras observadas. Para definir las funciones de los organelos citoplsmicos fue necesario desarrollar nuevas tcnicas y efectuar experimentos innovadores. Los primeros esfuerzos en este campo fueron recompensados en 1974 con el Premio Nobel para tres bilogos celulares: Christian De Duve, de la University of Louvain, en Blgica, y Albert Claude y George Palade, de la Rockefeller University. Los mtodos experimentales descritos en las siguientes secciones son particularmente tiles para suministrar bases de conocimiento sobre las cuales se basa la investigacin actual acerca de membranas ctoplsmicas.

Informacin obtenida por autorradiografa


Entre los cientos de diferentes clulas del cuerpo, las clulas acinares del pncreas poseen uno de los sistemas endomem-

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brana ms desarrollados. Las principales funciones de estas clulas son sintetizar y secretar enzimas digestivas. Estas enzimas se envan a travs de los conductos pancreticos, donde fueron elaboradas, hacia el intestino delgado, donde desdoblan los alimentos ingeridos. Dnde se sintetizan las protenas secretorias de las clulas acinares del pncreas y cmo llegan a la superficie de las clulas donde sern descargadas? Estas preguntas son intrnsecamente difciles de responder porque todos los pasos del proceso de secrecin normalmente ocurren de manera simultnea dentro de la clula. Para seguir los pasos de un ciclo desde el principio hasta el final, o sea, desde la sntesis de una protena secretoria hasta su salida de la clula, James Jamieson y George Palade utilizaron la tcnica de autorradiografa. Segn se analiza con detalle en el captulo 17, la autorradiografa suministra una manera de visualizar un proceso bioqumico al permitir al investigador ubicar materiales marcados con istopos radiactivos dentro de una clula. En esta tcnica, con una delgada capa de emulsin fotogrfica se cubren cortes de tejido que contienen el istopo radiactivo, que as se expone a la radiacin que emana del tejido. Los sitios de las clulas que contienen radiactividad se manifiestan como granos plateados bajo el microscopio luego de revelar la emulsin que los cubre (fig. 8-3). Para determinar los sitios donde se sintetizan protenas secretorias, Palade y Jamieson incubaron durante un breve periodo pedazos de tejido pancretico en solucin con aminocidos radiactivos. En este periodo los aminocidos marcados fueron captados por las clulas vivientes e incorporados a las enzimas digestivas conforme se ensamblan en los ribosomas. Los tejidos se fijaron de inmediato, y las protenas sintetizadas durante la incubacin con aminocidos marcados se determinaron mediante autorradiografa. Esta tcnica revel que el retculo endoplsmico es el sitio donde se sintetizan las protenas secretorias (fig. 8-3, a). Para determinar la va que siguen las protenas secretorias dentro de la clula desde su sitio de sntesis hasta donde se descargan, Palade y Jamieson efectuaron un nuevo experimento. Despus de incubar el tejido por un breve periodo con aminocidos radiactivos, lo lavaron de inmediato para liberarlo del exceso de istopos y lo transfirieron a un medio que slo contena aminocidos no marcados. Los experimentos de este tipo se denominan "de seguimiento de pulsos". Pulso se refiere al breve periodo de incubacin con material radiactivo durante el cual se incorporan aminocidos marcados a la protena. Seguimiento indica el periodo durante el cual se expone el tejido al medio con aminocidos no marcados, tiempo durante el cual las protenas se sintetizan utilizando aminocidos no radiactivos. Cuanto ms largo el seguimiento, ms lejos viajarn las protenas elaboradas con istopos radiactivos durante el pulso a partir del sitio donde se sintetizaron dentro de la clula. En condiciones ideales, con esta tcnica se pueden seguir los movimientos de molculas recin sintetizadas observando la onda de material radiactivo que se desplaza a travs del citoplasma de la clula de un sitio al siguiente, en tanto concluye el proceso. Los resultados de estos experimentos, que definieron por primera vez la va biosinttica secretoria y reunieron algunos compartimientos membranosos aparentemente separados en una unidad funcional integrada,

se resumen en la figura 8-3, b-e, y se analizan con amplitud al final del captulo. Informacin obtenida por aislamiento de fracciones subcelulares La microscopa electrnica y la autorradiografa proporcionan informacin sobre la estructura y funcin de los organelos celulares, pero no suministran datos acerca de la composicin bioqumica de estas estructuras. Las tcnicas para fragmentar (homogeneizar) clulas y aislar tipos particulares de organelos fueron desarrolladas en los decenios de 1950 y 1960 por Albert Claude y Christian De Duve. Cuando se fragmenta una clula por homogeneizacin, las membranas citoplsmicas se rompen y los extremos de los fragmentos de membrana se fusionan para formar vesculas esfricas menores de 100 nm de dimetro (fig. 8-4, a). Las vesculas derivadas de diferentes organelos membranosos (ncleos, mitocondrias, membrana plasmtica, retculo endoplsmico, etc.) tienen diferentes propiedades que permiten separarlas entre s, mtodo denominado fraccionamiento celular. Entre los diferentes tipos de vesculas membranosas, las del sistema endomembrana (principalmente retculo endoplsmico y complejo de Golgi) forman un grupo heterogneo de vesculas de tamao similar conocidas como microsomas. En la figura 8-4, a, se muestran los resultados de una purificacin rpida (muy burda) de la fraccin microsmica de una clula. Dicha fraccin microsmica puede fragmentarse todava ms mediante las tcnicas estudiadas en la seccin 17-6. Por ejemplo, se pueden aislar vesculas derivadas de las diferentes partes del complejo de Golgi o se pueden separar vesculas con cubierta de protena de las vesculas que carecen de dicha cubierta. Las vesculas aisladas de la fraccin microsmica retienen un notable grado de su actividad original en la clula. Por consiguiente, no slo se puede determinar su composicin bioqumica, sino tambin muchas de sus capacidades funcionales, como su actividad enzimtica o su capacidad para segregar protena recin sintetizada. Por ejemplo, se observ que las vesculas derivadas de diferentes partes del complejo de Golgi poseen enzimas capaces de aadir diferentes azcares al extremo de una cadena de carbohidratos en crecimiento de una glucoprotena o de un glucolpido. Una vez aislada determinada enzima se puede utilizar como antgeno para preparar anticuerpos especficos contra dicha enzima. A continuacin se pueden unir los anticuerpos a materiales como partculas de oro, visibles con el microscopio electrnico, y comprobar la ubicacin de la enzima en el compartimiento membranoso de las clulas. Estos estudios precisaron el papel del complejo de Golgi en el ensamblado gradual de los carbohidratos complejos. Informacin obtenida por estudio de muanles genticos Un mulante es un organismo (o clulas cultivadas) cuyos cromosomas contienen uno o ms genes que codifican pro-

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ductos diferentes de los que se encuentran en la mayor parte de los organismos (o clulas) dentro de la poblacin. Si el producto de un gen muante no puede efectuar su funcin normal, la clula con esta mutacin muestra una deficiencia caracterstica. Al determinar la naturaleza precisa de la deficiencia se obtiene informacin acerca de la funcin del producto del gen normal. El estudio de las bases genticas de la secrecin se efectu principalmente en clulas de levaduras en el laboratorio de Randy Schekman, de la Universidad de California, en Berkeley. Las levaduras son particularmente adecuadas para estudios genticos, ya que tienen un nmero relativamente pequeo de genes (en comparacin con otros tipos de eucariotes); son organismos unicelulares relativamente pequeos que pueden crecer en cultivo y se desarrollan como clulas hapoides. Una mutacin en un solo gen de una clula haploide de levadura produce un efecto observable, puesto que las clulas carecen de una segunda copia del gen para enmascarar la presencia de un gen anormal. En el transcurso de casi dos decenios, los investigadores aislaron docenas de diferentes mulantes en los cuales prcticamente se han fraccionado todos los pasos de la va secretoria. Muchos de los genes encargados de estos efectos fueron clonados y las protenas codificadas, aisladas y secuenciadas. El aislamiento de protenas de las levaduras motiv investigaciones exitosas de protenas homologas en sistemas de mamferos. Una de las lecciones ms importantes que se aprendieron a partir del empleo de todas estas tcnicas es que las actividades dinmicas en las que participan elementos de los sistemas endomembrana son muy persistentes. Clulas de levaduras, plantas y el cerebro humano no slo ejecutan procesos similares, sino que tambin emplean protenas notablemente semejantes. Es evidente que la diversidad estructural de las clulas oculta su similaridad molecular subyacente. En muchos casos, protenas de especies muy divergentes son intercambiables. Por ejemplo, sistemas in vitro derivados de clulas de mamferos, en condicones tpicas son capaces de utilizar protenas de levaduras para facilitar el transporte de las vesculas. A la inversa, clulas de levaduras con deficiencias genticas que interrumpen alguna fase de la va biosinttica pueden "curarse" en experimentos de ingeniera gentica empleando genes de mamferos.

8-3 Retculo endoplstnico


El retculo endoplstnico (RE) se divide en dos categoras muy amplias: retculo endoplsmico rugoso (RER) y retculo endoplsmico liso (REL) (fig. 8-5). Ambos tipos de RE (constituyen un sistema de membranas que encierran un \espacio. En consecuencia, el contenido lquido del citoplasma est dividido por el RE en dos compartimientos: un espacio encerrado dentro de sus membranas, denominado espacio luminal o cisterna!, y la regin situada por fuera de las membranas, que es el espacio citoslico. La distincin morfolgica entre RER y REL consiste en la presencia de ribosomas unidos en el primero y ausencia de los mismos en el ltimo. Cuando estn presentes, los

FIGURA 8-3. Empleo de la autorradiografa para revelar los sitios de sntesis y el transporte subsecuente de las protenas secretorias. a) Corte de una clula acinar pancretica incubada durante tres minutos con aminocidos radiactivos, fijada y preparada de inmediato para autorradiografa (vase seccin 17-4 para el anlisis de esta tcnica). Los granulos plateados que aparecen en la emulsin despus de revelada se localizan sobre el retculo endoplsmico. Esta fue la primera indicacin clara de que el retculo endoplsmico es el sitio de sntesis de las protenas secretorias (se estudia con detalle en la pgina 283). b-d) Diagrama de una secuencia de autorradiografas que muestran el movimiento de las protenas secretorias marcadas (representadas por granulos plateados en rojo) a travs de una clula acinar pancretica. Si la clula es un pulso marcado para tres minutos y fijado de inmediato (como se muestra en a), la radiactividad se localiza en el retculo endoplsmico (b). Despus de un pulso de tres minutos y un seguimiento de 17 minutos, las partculas marcadas se concentran en el complejo de Golgi y vesculas adyacentes (c). Luego de un pulso de tres minutos y un seguimiento de 117 minutos, la radiactividad se concentra en los granulos secretorios y comienza a ser liberada en los conductos pancreticos (d). e) Resumen de la cintica de marcado de los diferentes compartimientos de la clula acinar pancretica en el experimento descrito antes, (a: Cortesa de James D. Jameson y George Palade.)

ribosomas siempre se encuentran en la superficie que enfrenta el espacio citoslico. El RER aparece como un organelo membranoso extenso compuesto principalmente de sacos aplanados (cisternas) separados por un espacio citoslico como se muestra en la figura 8-6, a-c. Las micrografas electrnicas muestran el espacio cisternal del RER dividido en compartimientos separados (p. ej., fig. 8-6, b),

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Luz

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Granulos

Complejo de Golgi Retculo endoplsmico Ncleo Mitocondria

5 min

20 min

40 min

(b)
100 r

(c)

(d)

Retculo endoplsmico rugoso

gran cantidad de protenas, como las del pncreas o de las glndulas salivales/ poseen extensas regiones de RER (fig. 8-6, d). En breve volveremos a la funcin del RER, pero primero describiremos las actividades del REL. Retculo endoplsmico liso El REL est muy desarrollado en algunos tipos de clulas, incluyendo las de msculo esqueltico, tbulos renales y glndulas endocrinas productoras de esteroides (fig. 8-7, a). Las protenas especficas del REL varan de una clula a otra segn las funciones particulares del organelo, e incluyen:

20 -

3 10

20

40

60

Tiempo de seguimiento (min)


(e)
FIGURA 8-3. (Continuacin.)

pero se cree que todas las cisternas RER se comunican entre s y que el espacio cisternal es continuo entre ellas. Los elementos membranosos del REL son tpicamente tubulares (figs. 8-5 y 8-7) y forman un sistema interconectado de tuberas que se incurvan a travs del citoplasma en el cual se presentan. Cuando las clulas son homogeneizadas, los fragmentos REL forman vesculas de superficie lisa, en tanto que las vesculas formadas por fragmentos RER son de superficie rugosa (fig. 8-4, b,c). Los dos tipos de vesculas poseen porosidad diferente y pueden separarse con facilidad; por lo tanto, el contenido de protenas y lpidos de cada tipo de RE est bien caracterizado. Diferentes tipos de clulas tienen cantidades notablemente distintas de un tipo de RE o del otro, segn las actividades de la clula. Por ejemplo, las clulas que secretan

Sntesis de hormonas esteroides en clulas endocrinas de las gnadas y la corteza suprarrenal. Destoxicacin en el hgado de gran variedad de compuestos orgnicos, incluyendo, por ejemplo, barbitricos y etanol. La destoxicacin se efecta mediante un sistema de enzimas que transfieren oxgeno (oxigenasas), entre las cuales se incluye el citocromo P450. Es digno de mencionar que dada su falta de especificidad para sustrato, estas enzimas tienen capacidad de oxidar miles de diferentes compuestos hidrfobos y convertirlos en sustancias ms hidrfilas y ms fciles de excretar. Los efectos no siempre son positivos; el compuesto benzo[fl]pireno relativamente poco nocivo (formado al tostar carne sobre una parrilla) se convierte en un potente carcingeno por accin de las enzimas "destoxicantes" del REL. Liberacin de glucosa a partir de la glucosa 6-fosfato en clulas hepticas mediante la enzima glucosa 6-fosfatasa. Grandes reservas de glucgeno se encuentran almacenadas en el hgado en forma de granulos unidos a la superficie externa de las membranas del retculo endoplsmico liso (fig. 8-7, V). Cuando se requiere energa qumica, el glucgeno se desdobla por accin de la enzima fosforilasa y forma glucosa 1-fosfato, que a continuacin se convierte en glucosa 6-fosfato en el citoplas-

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O
Homogeneizacin

El hqmogenado contiene varios tipos de vesculas membranosas


Clulas completas

Sobrenadante posnuclear
0

Centrifugar a 20 000 g durante 20 minutos

Homogenado

Clulas completas, ncleos, mitocondrias, peroxisomas

/ Transferir el L/ sobrenadante posnuclear

.*.:/*;!
Centrifugar a 50 000 g durante dos horas . .*"* . '

'"**" A
****** ,**.* **

Sobrenadante posmcrosmico

.v****

iXMhfli

Microsomas
0.3 Hm

FIGURA 8-4. Aislamiento de una fraccin microsmica por centrifugacin diferencial, a) Cuando se fragmenta una clula por homogeneizacin mecnica (paso 1), los diferentes organelos membranosos se rompen y forman vesculas membranosas esfricas. Las vesculas derivadas de diferentes organelos pueden separarse por distintas tcnicas de centrifugacin. En el procedimiento que aqu se muestra, 51 homogeneizado celular primero se someti a centrifugacin a baja velocidad para formar esferas de las partculas ms densas y de mayor tamafi0, dejando las vesculas ms pequeas (microsomas) en el sobrenadante (paso 2). Los microsomas se pueden quitar del sobrenadante por cp^trifugacin a mayor velocidad durante periodos ms prolongados (paso 3). Una fraccin microsmica cruda de este tipo se puede fraccioi-)a- e n diferentes tipos de vesculas en pasos subsecuentes, b) Micrografa electrnica de una fraccin microsmica lisa en el cual las vesculas membranosas carecen de ribosomas. c) Micrografa electrnica de una fraccin microsmica rugosa que contiene membranas tachonadas de ribosomas. (b-c: cortesa de ].A. Higgins y R.J. Barnett.)

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conducto cuando llega la seal apropiada. La polaridad de los organelos de estas clulas epiteliales glandulares refleja el flujo de productos secretorios a travs de la clula desde su sitio de sntesis hasta el de descarga.
Sntesis de protenas en rbosonias enlazados por membranas en comparacin con ribosomas "libres"

Retculo endoplsmico liso

Retculo endoplsmico rugoso

El papel del retculo endoplsmico rugoso como sitio de sntesis de las protenas secretorias en el pncreas fue demostrado por Jamieson y Palade, segn se describi antes (pg. 280). Se han observado resultados similares en otros tipos de clulas secretorias, incluyendo las clulas caliciformes del intestino que secretan mucoprotenas, clulas endocrinas que secretan hormonas p_plipeptdicas, clulas plasmticas que secretan anticuerpos y clulas hepticas que secretan prpt_enas_s_r_ieas^ Nuevos experimentos han revelado que las protenas se pueden dividir en dos clases, segn el sitio donde se ensamblen en la clula. 1. Un tipo de polipptido se ensambla en los ribosomas unidos a la superficie externa (citoslica) de las membranas RER. Este tipo incluye: a) protenas secretadas por la clula; b) protenas integrales de membrana, y c) protenas de ciertos organelos, incluyendo complejo de Golgi, lisosomas, endosomas y vacuolas de plantas. 2. El otro tipo de protenas se ensambla en ribosomas "libres" y posteriormente se libera en el citoplasma. Este tipo incluye: a) protenas destinadas a permanecer en el citoplasma (como las enzimas glucolticas o las protenas del citoesqueleto); b) protenas perifricas de la superficie interna de la membrana plasmtica (como espectrinas y anquirinas, que slo se unen dbilmente a la superficie de la membrana), y c) protenas que normalmente se encuentran en corpsculos microscpicos, cloroplastos y mitocondrias. Este ltimo grupo de protenas se sintetizan en el citoplasma y luego se importan totalmente formadas (es decir, despus de traduccin) a travs de la membrana al interior del organelo apropiado. Cmo pueden identificar las clulas estos dos tipos de protena y delimitar sus sitios de sntesis? En 1971, Gunter Blobel y David Sabatini, de la Rockefeller University, propusieron que la sntesis de una protena en un ribosoma rodeado de membrana o en un ribosoma libre depende de la informacin contenida en la porcin N terminal del polipptido, que es la primera parte que surge del ribosoma durante la sntesis de protena. Sugirieron que las protenas secretorias contienen una secuencia de seales especial en el N terminal que provoca la unin del ribosoma con una membrana del RE y el desplazamiento del polipptido naciente al interior del espacio cisternal del RE. Esta hiptesis, conocida como hiptesis de la seal, ha sido apoyada por numerosas pruebas experimentales. Sntesis de una protena secretoria o lisosmica en ribosomas enlazados a membrana Las etapas que ocurren durante la sntesis de una protena secretoria o lisosmica se muestran en la figura 8-9. La sin-

FIGURA 8-5. Retculo endoplsmico. Micrografa electrnica de una parte de la clula pancretica de murcilago que muestra el retculo endoplsmico liso y rugoso. (Cortesa de Keith R. Porter.)

ma. En tanto el azcar permanezca en estado fosforilado, no puede dejar la clula heptica; la membrana plasmtica es impermeable a los azcares fosfato. La glucosa 6-fosfatasa de las membranas REL elimina el grupo fosfato y genera molculas de glucosa que finalmente se desplazan hacia la corriente sangunea, donde se transportan a los tejidos del cuerpo. Secuestro de iones calcio dentro del espacio cisternal. La liberacin regulada de Ca2+ de las membranas REL desencadena respuestas celulares especficas, incluyendo contraccin de clulas musculares esquelticas (fig. 9-63). Retculo endoplsmico rugoso Las primeras investigaciones acerca de la funcin del RER se efectuaron en clulas que secretan gran cantidad de protenas, como las clulas acinares del pncreas (fig. 8-3) o las clulas secretorias de moco del revestimiento del conducto digestivo (g. 8-8). A partir del esquema y la micrografa de la figura 8-8 es evidente que los organelos internos de estas clulas tienen marcada polaridad sobre el eje longitudinal de la clula, o sea, de su extremo basal al apical. El ncleo y la extensa regin de cisternas RER se localizan cerca de la superficie basal de la clula que se enfrenta al riego sanguneo. El complejo de Golgi se localiza en la regin central de la clula. El extremo apical de la misma, que se enfrenta a la luz del conducto, contiene materiales secretorios envueltos en membranas cuyo contenido se libera con facilidad en el

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Ribosoma

Cisternas del retculo endoplsmico

(a)

0.3/m

5/m

FIGURA 8-6. Retculo endoplsmico rugoso (RER). a) Diagrama que muestra las pilas de cisternas aplanadas que constituyen el retculo endoplsmico rugoso. La superficie citoslica de ia membrana contiene ribosomas enlazados, que confieren a la cisterna su aspecto rugoso, b) Micrograia electrnica por transmisin de una porcin del RER de una clula acinar pancretica. Es evidente la divisin del RER en espacio cisternal (desprovisto de ribosomas) y espacio citoplsmico. c) Gammagrafa electrnica del RER en una clula acinar pancretica, d) Visualizaron del RE mediante gammagrafa confocal en una clula tota! cultivada. El RE (colores naranja y blanco) se concentra en la regin que rodea el ncleo (N). (b: Cortesa de S. lio; c: segn K. Tanaka, Int. Rev. Cytol. 68:W, 1980; d: segn Ayynppan K. Rnjiseknnm y coh. }. Cell Biol. 105:342, 1993; con permiso de The Company of Biologists Ltd.)

tesis del polipptido se inicia luego que un RNA mensajero se enlaza a un ribosoma libre, o sea, no unido a la membrana citoplsmica. En realidad, los ribosomas empleados para sintetizar protenas integrales de membrana, secretorias o lisosmicas provienen de la misma poblacin (reserva) que los utilizados para producir protenas que permanecen en el citoplasma. Segn predijeron Blobel y Sabatini, los polipptidos ensamblados en ribosomas enlazados a la membrana contienen una secuencia de seales, que incluye un

tramo de seis a 20 aminocidos no polares, que orienta el polipptido naciente hacia la membrana del RE y conduce a la compartamentalizacin del polipptido en la luz del retculo endoplsmico. (Un polipptido naciente es el que se halla en proceso de sntesis y por lo tanto no est todava completamente ensamblado.) Aunque el pptido de seal de ordinario se localiza en el N terminal o cerca del mismo, puede ocupar una posicin interna en alguno de los polipptidos.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

285

fl-7. Retculo endoplsmko liso (REL). a) Micrografa electrnica de una clula de Leydig de los testculos que muestra el RE liso extenso donde se sintetizan hormonas esteroides. b) Micrografa electrnica de una clula heptica de rata mostrando la continuidad entre las membranas del RE rugoso y del liso (flechas grandes), y tambin la estrecha relacin de los granulos de glucgeno con el RE liso, (a: Segn Don W. Faivcett; b: segn Albert L. Jones y Douglas L. Schmucker, Gastroenterology 73:847, 1977.)

Conforme surge del ribosoma, la secuencia de seales ser reconocida por una partcula para reconocimiento de seales (PRS), que consta de seis polipptidos distintos y una pequea molcula de RNA denominada RNA 7SL. La PRS se enlaza a la secuencia de seales (paso 1, fig. 8-9) y detiene la sntesis del polipptido, evitando que el terminal sufra plegamiento anormal prematuro. El cese de la traduccin despus del enlace de la PRS da tiempo al complejo para encontrar una membrana RE a la cual pueda unirse, de otro modo el polipptido podra ser sintetizado en el citoplasma. La PRS enlazada acta como "etiqueta", que permite a todo el complejo (PRS-ribosoma-polipptido naciente) enlazarse a un receptor de PRS localizado en la superficie citoplsmica de la membrana del retculo endoplsmico (paso 2, fig. 8-9). Se cree que la fijacin del complejo ribosoma-PRS a la membrana del RE conduce a la liberacin de la PRS de la secuencia de seales; al enlace de la secuencia de seales a un componente de la membrana del RE (paso 3, fig. 8-9), el cual prepara el polipptido naciente para penetrar a la membrana; a la liberacin de la PRS del receptor de la PRS dentro del citoplasma; al desplazamiento (translocacin) del polipptido naciente a travs del canal revestido de protena que atraviesa la membrana (paso 4), y finalmente a la liberacin del ribosoma enlazado a la membrana. La liberacin de la PRS de la secuencia de seales requiere el enlace de GTP a la protena enlazada a GTP, en tanto que la liberacin de la PRS del receptor de la PRS, que permite el inicio de la translocacin, requiere la hidrlisis del GTP enlazado. Como estudiaremos en detalle en el captulo 15, las protenas enlazadas a GTP (o protenas G)

desempean un papel regulador clave en muchos procesos celulares. Debido a que existen en dos conformaciones alternas, una forma enlazada a GTP y otra enlazada a GDP, las protenas G pueden actuar como interruptores moleculares que inician o detienen procesos especficos. En el presente ejemplo, el enlace a GTP y la hidrlisis garantizan que el ribosoma participe de manera apropiada en el mecanismo de la membrana para translocacin antes de continuar la sntesis del polipptido. En la actualidad se puede estudiar in vtro todo el proceso de sntesis de protena enlazada a la membrana empleando vesculas artificiales o vesculas celulares aisladas en diferentes combinaciones de protenas purificadas. Por ejemplo, recientemente se confirm la existencia de un canal revestido de protena en la membrana del RER, sospechado durante largo tiempo, mediante experimentos electrofisiolgicos efectuados en vesculas aisladas del RER que sintetizan protenas. Estos experimentos revelan la presencia de canales de conductividad elevada a iones que sirven como vas de paso para polipptidos en proceso de translocacin. La abertura de estos canales depende de los ribosomas enlazados; cuando se libera el ribosoma, la compuerta del canal se cierra. Conforme el polipptido naciente penetra en la cisterna del RER, es conducido por diferentes enzimas localizadas en la membrana o en la luz del RER. El polipptido naciente elimina la porcin N terminal que contiene el pptido de seal mediante una enzima proteoltca, la peptidasa de seal. Una oligosacariltransferasa, otra protena integral de membrana del RER (estudiada ms adelante), aade carbohidratos a la protena naciente.

286

CAPITULO 8 * Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana

Lisosorna

RE rugoso

Granulos mucgenos Complejo de Golgi

(b)

\.5]im

RER

FIGURA 8-8. Estructura polarizada de una clula secretoria, a) Dibujo de una clula caliciforme secretoria de moco del colon de rata, b) Micrografa electrnica de baja resolucin de una clula secretoria de moco de la glndula de Brunner del intestino delgado del ratn. Ambos tipos de clula muestran polarizacin distinta de los organelos, que refleja su papel en la secrecin de grandes cantidades de mucoprotena. El extremo basa! de las clulas contiene el ncleo y el RE rugoso. Las protenas sintetizadas en el RE rugoso se desplazan hacia el complejo de Golgi ntimamente relacionado y desde all al interior de las vesculas, en las cuales se concentra el producto secretorio final. Las regiones apicales de las clulas estn llenas de granulos secretorios que contienen mucoprotenas listas para ser liberadas, (a: Segn Moran Neutra y C.P. Leblond }. Cell Biol. 30:119, 3966, con permiso de Rockcfeller University Press; b: segn Alaiti Rambourg e Yves Clcrmont, Eur. J. Cell Biol. 51:196, 1990.)

(a)

La luz del RER contiene una elevada concentracin de protenas cuyo papel es garantizar que las protenas recin sintetizadas sufran las reacciones apropiadas de plegamiento para alcanzar su estructura funcional terciaria y cuaternaria. En estas protenas se incluye la enzima proteindisulfiro somerasa que cataliza la formacin y reordenamiento de enlaces disulfuro entre residuos de cistena de la cadena del polipptido, as como con numerosos chaperones moleculares (pg. 72) que evitan la formacin de agregados o plegamientos errneos de polipptidos. De alguna manera, la clula reconoce las protenas plegadas o ensambladas de manera incorrecta y las retiene en el RE, donde pueden ser destruidas. Este proceso, conocido como control de calidad, ayuda a garantizar que las protenas anormales no se transporten a otras partes de la clula. Un ejemplo de este proce-

so se observa en algunos casos graves de fibrosis qustica, donde la protena mulante RTFQ no puede llegar a la superficie de la clula (pg-153). La estructura del retculo endoplsmico es ideal para cumplir su papel como sitio de entrada a la va biosinttica de la clula. Su membrana proporciona una gran superficie sobre la cifal se pueden fijar muchos ribosomas (unos 13 millones por cada clula Viviente). La luz del RE proporciona un ambiente local que favorece plegamiento y ensamblado correctos de las protenas y un compartimiento donde pueden separarse protenas secretorias, lisosmicas y vacuolares de otras protenas recin sintetizadas. Como se mencion antes, las clulas deben tener capacidad para determinar dnde debe residir una protema recin sintetizada, sea fuera de la clula, en uno de los organelos membranosos del

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana dtoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana RNAm RNAt

287

Pptido de seal del polipptido naciente Citoplasma

o
Receptor
de la PRS

Ribosoma receptor

Membrana del RE
Luz del RE

Translocador de protena FIGURA 8-9. Modelo para la sntesis de protenas secretorias (o una enzima lisosmica) en un rbosoma enlazado a la membrana del RE rugoso. La sntesis del polipptido se inicia en un ribosoma libre. Conforme la secuencia seal (mostrada en rojo) emerge del ribosoma, se enlaza a la partcula para reconocimiento de seales (1), que detiene la traduccin en tanto se pone en contacto con la membrana del RE rugoso. La fijacin del ribosoma a la membrana del retculo endoplsmico (2) es mediada por un receptor para la partcula para reconocimiento de seales y un receptor separado del ribosoma. En los pasos subsecuentes (3 y 4), la PRS se libera del pptido de seal y luego del receptor de la PRS (pasos que requieren GTP y protena enlazada a GTP), el pptido de seal se une a un componente de la membrana RE (indicada aqu donde se une a la superficie interna de! conducto) y el resto del polipptido se transloca a travs del conducto. Luego que el polipptido naciente pasa al interior de la luz del RE, una protena de membrana (la peptidasa de seal) separa la seal del pptido. Una vez en la luz, el polipptido interacta con las protenas que garantizan un plegamiento apropiado (pg. 73) y promueven la formacin de enlaces disulfuro.

citoplasma o dentro del citoplasma. El asilamiento de protenas recin sintetizadas en las cisternas del RE prcticamente las elimina del citoplasma y permite enviarlas a su destino final. Este proceso es un claro ejemplo del papel de las membranas en la compartamentalzacin del espacio dentro de la clula de modo que puedan separarse los diferentes tipos de actividades. Biosntesis de membranas en el retculo endoplsmico Las membranas no se originan de novo, o sea, entidades nuevas procedentes de las reservas de protenas y lpidos; ms bien, slo se originan a partir de membranas preexistentes. Las protenas y lpidos recin sintetizados se introducen continuamente a las membranas ya existentes, proceso que en su mayor parte ocurre en el retculo endoplsmico. Como veremos a continuacin, los elementos de la membrana se desplazan del RE a casi todos los otros compartimientos de la clula. Conforme la membrana se desplaza a travs de la clula, las enzimas que residen en los diferentes compartimientos de la clula modifican su composicin de diferente manera. Por lo tanto/ aunque la membrana puede fluir por medio de vesculas desde el RE a travs del complejo de Golgi hacia la membrana plasmtica, las membranas que constituyen cada uno de estos compartimientos tienen su propia composicin nica y mantienen su identidad propia distintiva (cuadro 4-1). Recordemos que las membranas celulares son asimtricas; las dos superficies de una membrana tienen una estructura muy diferente (pg. 125). Esta asimetra se establece inicialmente en el retculo endoplsmico conforme lpidos y protenas se incorporan a la bicapa, y se mantiene a medida que la membrana pasa por los procesos de gemacin y fu-

sin de un compartimiento al siguiente. Como resultado, los componentes situados en la superficie cisternal de la membrana del RE se pueden identificar en la superficie luminal de las vesculas de transporte, la superficie luminal de la cisterna de Golgi y la superficie externa (exoplsmica) de la membrana plasmtica (fig. 8-10). Sntesis de protenas integrales de membrana en los ribosomas enlazados a la misma. Las protenas integrales de membrana, como glucoforina y banda 3 de la membrana plasmtica del eritrocito (fig. 4-31) se ensamblan de manera muy similar a las protenas secretorias y lisosmicas ya estudiadas. Se sintetizan en los ribosomas enlazados a la membrana y se translocan a travs de la membrana del RE conforme el polipptido se alarga. A diferencia de las protenas secretorias y isosmicas, que atraviesan por completo la membrana, las protenas integrales contienen uno o ms tramos de aminocidos hidrfobos que sirven como secuencia para detener la transferencia, las cuales impiden movimientos adicionales de la protena dentro de la cmara cisternal. Se ha postulado que la translocacin de la secuencia que detiene la transferencia en la protena que reviste el canal abre lateralmente dicho canal y permite que la parte hidrfoba del polipptido naciente penetre a la bicapa de lpidos. La figura 8-11 muestra la sntesis del tipo ms sencillo de protena integral, la que slo contiene un segmento transmembrana, cuyo N terminal se localiza en el lado cisternal de la membrana del RE y cuyo C terminal se encuentra en el lado citoplsmico. Hay numerosos ejemplos en que la "misma" protena aparece en dos versiones (soformas), una soluble y la otra enlazada a la membrana. Estas protenas tienen la misma secuencia de seales y la misma secuencia primaria, excepto

288

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana FIGURA 8-10. Mantenimiento de la asimetra de la membrana. A medida que las protenas se sintetizan en el RE rugoso, entran a la bicapa de lpidos en una orientacin predecible determinada por su secuencia de aminocidos. Esta orientacin persiste por todo el trayecto del sistema endomembrana, segn se ilustra en la figura. Las cadenas de carbohidratos se aaden primero al RE y constituyen una manera conveniente de evaluar la lateralidad de la membrana, ya que siempre aparecen sobre el lado cisterna! de las membranas citoplsmicas, que se transforman en el lado exoplsmico de la membrana plasmtica luego que se fusionan de vesculas con dicha membrana (paso mostrado en la figura 8-27).

Exterior

por la presencia de un tramo transmembrana hidrfobo en la protena de membrana, ausente en la forma soluble. Esta pequea diferencia determina si la protena forma parte de la membrana o ser secretada al espacio extracelular. Las protenas que rodean varias veces la membrana tienen un nmero de tramos hidrfobos que corresponden a los dominios transmembrana respectivos (como en la figura 4-16). Sntesis de lpidos de membrana. Casi todos los lpidos de la membrana se sintetizan en el retculo endoplsmico; las principales excepciones son esfingomielina y glucolpidos, cuya sntesis comienza en el RE y concluye en el complejo de Golgi. Las enzimas implicadas en la sntesis de fosfolpidos son protenas integrales de membrana del RE con sus sitios activos enfrentando al citoplasma. Los fosfolpidos recin sintetizados se introducen en la mitad de la bicapa que enfrenta al citoplasma. Algunas de estas molculas lpidas se desplazan ms tarde hacia la hoja opuesta ayudadas por protenas (flipasas) que translocan activamente las molculas de los lpidos a travs de la bicapa. El hecho de que las membranas de diferentes organelos posean composicin lpida notablemente diferente (cuadro 4-2) indica que los cambios tienen lugar conforme la mem-

Secuencia para detener la transferenci Citoplasma

Luz del RE

FIGURA f-11. Modelo de la sntesis de una protena integral de membrana que contiene un solo segmento transmembrana y una secuencia de seales cerca del N terminal del polipptido naciente. La PRS y los diferentes componentes de la membrana mostrados en la figura 8-9 tambin participan en la sntesis de protenas integrales, pero se omiten para mayor sencillez. El polipptido naciente se transloca al canal revestido de protena, igual que si fuera una protena secretoria (1-3), pero la entrada de la secuencia que detiene la transferencia hidrfoba al interior del poro (4) abre el canal lateralmente y la hlice hidrfoba se introduce en la bicapa (5-6). Se asume que en este momento el ribosoma se libera de la membrana y la sntesis de la porcin restante del polipptido (la porcin C terminal) ocurre conforme el ribosoma se libera en el citoplasma (como en el paso 5). Los polipptidos que tienen ms de un segmento transmembrana poseen una secuencia hidrfoba adicional que ayuda a introducirlos en la bicapa.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana coplstnica: estructura, funcin y trfico de membrana FIGURA 8-12. Modificacin de la composicin de los lpidos de la membrana, a) Histograma que indica el porcentaje de cada uno de los tres fosfolpidos (fosfatidilcolina, fosfatidilserina y esfingomielina) en tres diferentes tipos de membrana celular (retculo endoplsrnico, complejo de Golgi y membrana plasmtica). El porcentaje de cada especie de lpido aparentemente cambia de manera gradual conforme la membrana fluye desde el RE a las membranas de Golgi y plasmtica, b) Diagrama que muestra tres mecanismos distintos para explicar cmo puede ser diferente la composicin de fosfolpidos de una membrana del sistema endomembrana en comparacin con otra membrana del sistema, aunque los compartimientos de membrana sean continuos espacial y temporalmente. 1) En la cabeza de los fosfolpidos de la bicapa, los grupos se modifican enzimticamente; 2) la membrana de una vescula en formacin tiene fosfolpidos de composicin diferente a los de la membrana a partir de la cual se forma por gemacin; 3) los fosfolpidos se pueden eliminar fsicamente de una membrana e introducir a otra membrana mediante intercambio de protenas por fosfolpidos.
(a)

289

PC

PS

SM

tu 50% -

RE

CG

1
MP RE

1
CG MP

,il
RE CG MP

RE = retcul endoplsmico CG = ccmpl o de Golgi MP = memb rara plasmtica del eritrocito

PC - fcsfatidilcolina
PS - osfatidilserina SM = esfingomielina

brana fluye a travs de la clula. Hay varios factores que contribuyen a dichos cambios (fig. 8-12). 1. La mayor parte de los organelos poseen la capacidad de modificar los lpidos ya presentes en una membrana, convirtiendo un tipo de fosfolpido (como la fosfatidilseridina) en otro (p. ej., fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina). 2. Cuando las vesculas se forman por gemacin de un compartimiento (como en la figura 8-2, b), algunos tipos de fosfolpidos pueden ser incluidos de manera preferencial en la membrana de la vescula en formacin, en tanto que otros tipos no se incluyen. 3. Las clulas contienen protenas para intercambiar con fosfolpidos cuya funcin es transportar fosfolpidos especficos a travs del citoplasma acuoso de un tipo de compartimiento de membrana a otro. Estas enzimas pueden facilitar el desplazamiento de fosfolpidos especficos desde el RE a otros organelos, incluyendo mitocondrias y cloroplastos.
Glucosllacin en el retculo endoplsmico rugoso

Casi todas las protenas producidas en ribosomas enlazados a la membrana, ya sean componentes integrales de membrana, enzimas lisosmicas o vacuolares, o partes de la matriz extracelular, se convierten en glucoprotenas. Como se indic en la figura 4-12, b, las cadenas de carbohidratos pueden fijarse a una protena mediante uniones N (al tomo de nitrgeno de un residuo asparagina) o uniones O (al tomo de oxgeno de un residuo serina o treonina [o un residuo hidroxicolina en la colgena]). Hay diferencias en las dimensiones promedio, composicin del azcar y va de sntesis entre estos dos tipos de oligosacridos, pero comparten ciertas propiedades. De mayor importancia es que las secuencias de azcares que componen ambos tipos de oligosacridos son altamente especficas; si se aislan los oligosacridos de una protena purificada, las secuencias son consistentes y predecibles. Cmo se determina la secuencia de azcares? Las macromolculas ms conocidas que poseen una secuencia ordenada de bloques de construccin son los cidos nucleicos y las protenas. La secuencia de cidos nu-

cleicos y protenas se genera por medio de una plantilla, o sea, una molcula preexistente que contiene la secuencia. En las glucoprotenas, la secuencia de carbohidratos se ge-

290

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citaplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana

CrLOH O. H O O CH

CH,OH

/V-acetilglucosamina transferasa

OPOPO

NH

=0
CH,

o-

Q-

/ H

<;H2OH
OH OH

O (Enlace j31, 2)

/V-acetilglucosamina

Difosfato de uridina

Maosa aceptora en el extremo en crecimiento del oligosacrido

UDP-A/-acetlglucosamina FIGURA 8-13. Ejemplos de una reaccin catalizada por una glucosiltransferasa. Esta gran familia de enzimas transfiere azcares desde un portador de azcar nucletido (en este caso UDP-N-acetilglucosamina) al extremo en crecimiento de una cadena de oligosacridos (que en este caso contiene un residuo maosa en su extremo). Aqu se muestra la reaccin particular segn ocurre en el complejo de Golgi.

era sin el empleo de plantillas. La adicin de azcares a la cadena creciente de oligosacrido es catalizada por un grupo de enzimas enlazadas a la membrana denominadas glucostransferasas, enzimas que transfieren un monosacrido especfico procedente de un azcar donador apropiado a un azcar aceptor apropiado (fig. 8-13). La molcula donadora siempre es un azcar nucletido. Los ejemplos de azcares nucletdos donadores implicados en la construccin de cadenas de oligosacridos son cido silico-CMP, manosa-GDP, fucosa-GDP, galactosa-UDP y UDP-N-acetilglucosamina (fig. 8-13). La molcula aceptora, que recibe el azcar transferido, es el extremo en crecimiento de la cadena de carbohidratos. La secuencia de azcares ensamblada a un oligosacrido depende de la secuencia particular de glucostransferasas que participa en su construccin, la cual, a su vez, en ocasiones depende de la disposicin de las enzimas en la membrana y su especificidad por el sustrato. En la figura 8-14 se muestran los pasos iniciales para aadir azcares a oligosacridos formados por enlaces N unidos a protenas solubles e integrales de membrana. El segmento basal, o ncleo, de cada cadena de carbohidrato no se ensambla en la propia protena, sino que se coloca de manera independiente sobre un transportador lpido y luego se transfiere, en bloque, al residuo asparagina especfico del polipptido. Este portador lpido, denominado dolicol fosfato, es una molcula hidrfoba construida con ms de 20 unidades isopreno
CH3

mamferos se inicia con la transferencia de N-acetglucosamina 1-fosfato seguida por la transferencia de otra Nacetglucosamina y a continuacin de nueve unidades maosa y tres de glucosa en el patrn preciso indicado en la figura 8-14. A continuacin, la enzima oligosacariltransferasa del portador lpido transfiere este bloque de azcares al polipptido naciente conforme dicho polipptido se transloca a la luz del retculo endoplsmco. Aunque algunos polisacridos, particularmente de eucariotes inferiores, permanecen prcticamente como se muestra en la figura 8-14, la evolucin de organismos ms complejos se acompa de la diversificacin de grupos carbohidrato unidos a las protenas. La modificacin del ncleo oligosacrido se inicia en el RE al eliminar los residuos terminales de glucosa mediante glucosidasas. Los pasos restantes ocurren en la ruta hacia el complejo de Golgi y dentro del mismo como una etapa subsecuente en la va biosinttica (pg. 299). Primer paso en el transporte vesicular En condiciones tpicas, las cisternas RER son cavidades amplias y aplanadas que actan como conductos de transporte para desplazar protenas de membrana y luminales desde su sitio de sntesis a los extremos apicales del RER. La superficie del borde apical de las cisternas RER de ordinario es lisa, o sea, desprovista de ribosomas (fig. 8-7, b). Estas partes del RE se conocen como elementos de transicin, los cuales son sitios para formar el primer grupo de vesculas de transporte en la va biosinttica, vesculas que son dirigidas hacia el complejo de Golgi.

H2C=CC=CH2 H
Isopreno

integrada a la bicapa de lpidos de la membrana. Los azcares se aaden a la molcula de dolicol fosfato, una a la vez, en el orden apropiado que indican las glucostransferasas enlazadas a la membrana. Esta parte del proceso de N glucosilacin es prcticamente invariable; en las clulas de

8-4 El complejo de Golgi


En 1898, el bilogo italiano Camilo Golgi, al trabajar con tejido nervioso que haba impregnado durante varios das en un colorante con osmio, decubri una red de color amarillo oscuro localizada cerca del ncleo de la clula. Esta

CAPITUL 8 Sistemas de la membrana toplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana 3UDP 3UDP-

291

Polipptido naciente Ribosoma mRNA

4GDP

Membrana del retculo endoplsmico

Citoplasma

13
CDP 1 UDP 1UMP
2

UDP-

CTP Dolicol

= Glucosa = A/-acetilglucosamna (NAG)

= Maosa AVW P = Dolicol fosfato

FIGURA 8-4. Pasos en la sntesis de la porcin central de un oligosacrido N unido en el RE rugoso. Los primeros siete azcares (cinco residuos de maosa y dos de NAG) se transfieren uno cada vez al dolicol-PP sobre el lado citoplsmico de la membrana del RE (pasos 1 y 2). En esta etapa, el dolicol con su oligosacrido unido al parecer pasa a travs de la membrana (paso 3), y los azcares restantes (cuatro residuos de maosa y tres de glucosa) se unen en el lado luminal de la membrana. Estos ltimos azcares se fijan, uno a la vez, al lado citoplsmico de la membrana, al extremo de la molcula dolicol fosfato (como en los pasos 4 y 7), que entonces viaja a travs de la membrana (pasos 5 y 8) y dona su azcar al extremo en crecimiento de la cadena de oligosacrido (pasos 6 y 9). Una vez que el oligosacrido est completamente ensamblado, se transfiere a un residuo asparagina del polipptido naciente (paso 10). El dolico-PP regresa a travs de la membrana (paso 11) y est listo para iniciar la aceptacin de azcares una vez ms (pasos 12 y 13).

red, que posteriormente se identific en otros tipos de clulas, se denomin complejo de Golgi y ayud a su descubridor a que se le otorgara el premio Nobel en 1906. Durante decenios, el complejo de Golgi fue motivo de controversia entre quienes crean que el organelo realmente exista en las clulas vivientes y aquellos que pensaban que era un artefacto, estructura artificialmente formada durante la preparacin del tejido para la observacin con microscopio. Slo cuando se identific claramente el complejo de Golgi en muestras no fijadas obtenidas mediante fractura por congelacin se comprob su existencia dentro de la clula viviente ms all de toda duda razonable. El complejo de Golgi tiene morfologa caracterstica que consiste en cisternas aplanadas, discoides, con rebordes

amplios relacionados con vesculas y tbulos (figs. 8-15 y 8-16). Las cisternas, cuyos dimetros de ordinario son de 0.5 a 1.0 m, se disponen en pilas ordenadas, muy parecidas a pastelillos apilados e incurvadas de manera parecida a una copa poco profunda.2 Tpicamente, la pila de Golgi contiene menos de ocho cisternas; una clula individual puede contener desde unas cuantas hasta varios miles de pilas, segn el tipo de clula. Puesto que las membranas del complejo de Golgi estn desprovistas de ribosomas, se clasifican como membranas lisas, y luego de hpmogeneizacin aparecen en la fraccin microsmica lisa (pg. 282).
2 En las clulas vegetales, una sola pila de Golgi casi siempre se denomina dictiosoma.

292

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica; estructura, funcin y trfico de membrana

Retculo endoplsrnico con ribosomas

Vesculas de Golgi

Cisternas de Golgi

(a)
trans

FIGURA H-15. Complejo de Golgi. a) Micrografa electrnica de parte de una sola pila de Golgi mostrando vesculas cercanas a la cara cis y la gemacin de vesculas secretorias mayores a partir de los extremos de la cisterna de la cara trans. b) Micrografa electrnica de una parte de clula de la cubierta de una raz de tabaco mostrando 3a diferenciacin de la cisterna de un extremo de la pila de Golgi al otro (ilustrada adems en las siguientes figuras), (a: Cortesa de O. Kiermayer; b: cortesa de Tlwmas H. Giddings.)

(b)

RTG

Cisterna trans

Cisterna media

Cisterna cis

F I G U R A 8-16. D i b u j o de una parte del complejo de Golgi de una clula epitelial del conducto reproductor de la rata macho. Los elementos cis estn interrumpidos para poder visualizar el compartimiento medio. Los elementos del compartimiento trans con frecuencia son discontinuos y aparecen como redes tubulares. (Segn A. Rambourg y Y. Clermont, Eur. J. Cell Biol. 52: 195, 1990.)

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

293

fe)

0.15 jim

FIGURA 8-17. Diferencias regionales en la composicin de la membrana a travs de las pilas de Golgi. a) El tetrxido de osmio reducido impregna de manera preferencial las cisternas cis del complejo de Golgi. b) La enzima manosidasa II, que participa en la nivelacin de los residuos maosa de la parte central del oligosacrido, segn se describe en el texto, se localiza de preferencia en las cisternas medias, c) La enzima nuclesido difosfatasa, que procesa azcares nucletidos, se localiza de preferencia en las cisternas trans. (a y c: Segn Robert S. Decker, ]. Cell Biol. 61:603, 1974; b: segn ngel Velasco y cois. }. Cell Biol. 122:41, 1993; todas con permiso de Rockefeler Unversity Press.)

Las cisternas que constituyen las pilas de Golgi estn polarizadas; las ms prximas al RE se consideran en la cara cis, en tanto que las cisternas del extremo opuesto de la pila se encuentran en la cara trans (figs. 8-15, b, y 8-16). Estudios con diferentes tcnicas demuestran que el complejo de Golgi no tiene composicin uniforme de un extremo al otro. Por ejemplo, el osmio impregna de manera preferencial la cara cis (fig. 8-17, a). La enzima manosidasa II, concentrada en la cisterna meda (fig. 8-17, b), elimina los residuos de maosa, en tanto que la difosfatasa de nuclesido, una enzima que desdobla dmucletidos (p. ej., UDP), luego que dona sus azcares se observa preferencialmente en la cara trans (fig. 8-17, c). Las vesculas membranosas derivadas de diferentes porciones del complejo de Golgi tienen una densidad lo bastante diferente para separarlas entre s mediante gradientes de densidad (seccin 17-6). Segn estos y otros datos, el complejo de Golgi se divide en cuatro compartimientos funcionalmente distintos; las cisternas cis, media y trans; y la red trans de Golgi (RTG) (fig. 8-16). Las diferencias en la composicin de los compartimientos de la membrana de la cara cis respecto de la cara trans reflejan polaridad en las funciones del aparato de Golgi. Las protenas de la membrana, secretorias y lisosmicas, recin sintetizadas abandonan el RE y penetran al complejo de Golgi a travs de su cara ds y luego atraviesan la pila hacia la cara trans. El complejo de Golgi es principalmente una planta procesadora. Las protenas recin sintetizadas, que primero

fueron ensambladas en el RER, se modifican de manera secuencial especfica conforme atraviesan la pila de Golgi: las enzimas proteolticas recortan parte de su longitud; los aminocidos pueden modificarse (p. ej., por hidroxilacin de los aminocidos de una molcula de colgena) y cambiar gradualmente su contenido de carbohidratos mediante una serie de reacciones enzimticas (estudiadas ms adelante). Una vez que las protenas alcanzan la red trans de Golgi en el lado trans del organelo estn listas para ser clasificadas y enviadas a su destino final dentro o fuera de la clula. Desde hace tiempo se estableci claramente que hay movimiento de materiales a travs del complejo de Golgi, pero hay dos puntos de vista contrastantes respecto de la va donde ocurre. Hasta mediados del decenio de 1980 se pensaba que las cisternas de Golgi eran estructuras transitorias; se supuso que se formaban en la cara cis de la pila por fusin de las vesculas del RE y que cada cisterna se desplazaba fsicamente desde el extremo cis al extremo trans de la pila cambiando su composicin conforme avanzaba. Este modelo se conoce como de maduracin, puesto que propone que cada cisterna cis "madura" para convertirse en una cisterna trans. Se supone que cuando una cisterna alcanza la cara trans se fragmenta en vesculas que llevan los materiales a otros destinos. Aunque los defensores del modelo de maduracin del complejo de Golgi no lo abandonaron por completo, fue reemplazado principalmente por un modelo alterno que sostiene que las cisternas de una pila de

294

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana Fraccin "donadora" que contiene et complejo de Golgi de un mulante infectado con VSV
Compartimiento donador

porte (fig. 8-18). En estos estudios, efectuados por James Rothman y Lelio Orci, se prepararon dos muestras de fracciones de membrana derivadas del complejo de Golgi de clulas cultivadas de ovario de cobayo chino (OCC). Una fraccin ("fraccin donadora") se obtuvo de clulas infectadas con virus de la estomatitis vesicular, patgeno cuya informacin gentica codifica una protena integral de membrana (VSV-G) sintetizada en el RER y glucosilada en el complejo de Golgi de las clulas infectadas. Las clulas infectadas que suministraron la fraccin donadora eran mutantes genticos que carecan de la enzima que transfiere el azcar N-acetilglucosamina transferasa, normalmente residente en la cisterna media del complejo de Golgi que cataliza la reaccin mostrada en la figura 8-13. La otra fraccin ("fraccin aceptora") se obtuvo de clulas tipo nativo no infectadas que s contenan la enzima que transfiere el azcar. Cuando las dos fracciones se mezclaron con todos los factores solubles y tambin N-acetilglucosamina marcada con istopos radiactivos en las condiciones requeridas para la formacin y transferencia de vesculas, se observ aparicin de radiactividad en el dominio luminal de la protena VSV-G por adicin progresiva de N-acetilglucosamina. Esto slo puede ocurrir si las membranas donadoras que contienen VSV-G son transportadas a membranas aceptoras que contienen N-acetilglucosamina transferasa (fig 8-18). Consideraremos ahora con mayor detalle el mecanismo de transporte de vesculas.

Protena VSV-G

COOH

Tr'asa de GIcNAc suprimida

COOH

Fraccin "aceptora" que contiene el complejo de Golgi de clulas tipo nativo no infectadas

COOH

COOH

FIGURA 8-lS. Diseo de un experimento que apoya la hiptesis de que los materiales se desplazan entre los compartimientos de Golgi por medio de vesculas de transporte. La fraccin donadora que contiene membranas de Golgi se prepara a partir de clulas mutantes (que carecen de la enzima N-acetilglucosamina transferasa) infectadas con virus de la estomatitis vesicular (VSV). La protena G codificada por el genoma viral se sintetiza y glucoliza en el RE rugoso, pero no puede haber la segunda vuelta de glucolisacin que normalmente ocurre en el complejo de Golgi. Cuando se incuban estas membranas con una fraccin aceptora que tambin contiene membranas de Golgi, pero preparada a partir de clulas nativas no infectadas (clulas que poseen N-acetilglucosamina transferasa), la protena G de a fraccin donadora es glucosilada. La glucosilacin puede observarse incubando el donador mezclado con fracciones aceptoras en presencia de UDP-N-acetilglucosamina marcada con istopos radiactivos (indicada por el crculo rojo). Esta reaccin slo puede ocurrir si las vesculas de la fraccin donadora se fusionan con las membranas de la fraccin aceptora, de modo que la protena G no concluida pueda entrar en contacto con la transferasa presente en la luz de las membranas aceptoras. (Segn ].E. Rothman y L. Ora, FASEB J. 4:1463, 1990.)

Viaje desde el retculo endoplsmico hasta el complejo de Golgi a travs de los compartimientos de Golgi
Con el microscopio electrnico se observa que las vesculas formadas por gemacin del RE o de las cisternas cis y meda del complejo de Golgi estn revestidas en su superficie externa por una "cubierta vellosa" ms bien indiferenciada. Si las clulas se tratan con molculas de estructura similar a GTP (anlogos GTP), pero que a diferencia del GTP no se hidrolizan, estas vesculas revestidas se acumulan dentro de la clula (fig. 8-19) y pueden aislarse de clulas homogeneizadas mediante gradientes de densidad (seccin 17-6). Las vesculas revestidas se acumulan en presencia de un anlogo GTP no hidrolizable debido a que la cubierta contiene la protena enlazada a GTP llamada factor de adenosacin de ribosa (FAR), que debe hidrolizar al GTP enlazado antes que el revestimiento pueda desensamblarse. La hidrlisis de GTP y el desensamblado del revestimiento normalmente ocurren antes de la fusin de vesculas con una membrana especfica, lo que sugiere que FAR participa en el proceso de reconocimiento entre la membrana vesicular y su objetivo especfico (pg. 297). S hay coincidencia apropiada entre las dos membranas se presume que la hidrlisis de GTP acta como interruptor para despejar la va para la fusin de la membrana. Adems del FAR, la vescula contiene un complejo de siete protenas de revestimiento, distintas pero relacionadas,

Golgi permanecen en su sitio como entidades estables reunidas por un armazn de protenas. En este ltimo modelo, los materiales se desplazan a travs de la pila de Golgi, desde la cara cis a la red trans de Golgi mediante vesculas formadas por gemacin de un compartimiento de la membrana que se fusionan con un compatimiento vecino por fuera de la pila, como se muestra en la figura 8-2. Las pruebas citadas con mayor frecuencia para apoyar este ltimo modelo provienen del empleo de sistemas de clulas aisladas donde se reconstituyen las vesculas de trans-

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

295

para: 1) ser retenida en el compartimiento donde reside o 2) ser derivada (dirigida especficamente) a un destino particular diferente de la membrana plasmtica, como el lisosoma o una vescula secretoria regulada. En las siguientes seccio-

PIGURA Jl-J 9. Acumulacin de vesculas recubiertas de protena no clatrina. Las micrografas muestran el complejo de Golgi de una clula permeabilizada mediante tratamiento con un anlogo GTP no hidrolizable (GTPyS). Se observan numerosas vesculas recubiertas derivadas del complejo de Golgi y de yemas recubiertas sobre las membranas de Golgi. El recubrimiento de estas membranas contiene algunas protenas denominadas de revestimiento, que se distinguen de otro grupo de vesculas recubiertas (vesculas recubiertas de clatrina), descritas al final del captulo. (Segn ]ames E. Rothman y Lelio Ora, FASEB }. 4:1467, 1990.)

aisladas de organismos tan diversos como mamferos y levaduras. Las vesculas recubiertas con protenas de revestimiento se conocen como vesculas no recubiertas con clatrina, para distinguirlas de otro tipo de vesculas recubiertas que estudiaremos con detalle posteriormente. Las vesculas revestidas con protenas de revestimiento al parecer no son selectivas porque incluyen cualquier protena en su membrana y transportan cualquier carga soluble que no tenga restricciones especficas para abandonar el compartimiento donador. Muchas pruebas indirectas sugieren que las vesculas con protenas de revestimiento (u otras vesculas no revestidas con clatrina) participan en un proceso de flujo en masa, en el cual las vesculas desplazan continuamente membrana, materiales y lquidos de un compartimiento a otro, desde el RE a travs del complejo de Golgi y finalmente a la membrana plasmtica (fig. 8-20, a). En la figura 8-20, b, se muestra el ensamblado de la vescula recubierta con protenas de revestimiento. Segn este punto de vista del transporte de vesculas, una protena localizada en la membrana, en la luz del RE o en el complejo de Golgi "automticamente" ser transportada de un compartimiento al siguiente y con el tiempo a la superficie de la clula, a menos que contenga informacin

Revestimiento de protema no clatrina

Elemento de transicin del RE Vescula

Retculo endopsmico rugoso


!-- X*^"

(a)
COPs Yema revestida Vescula revestida

l'li;i:i \. Flujo en masa entre los compartimientos membranosos mediado por vesculas recubiertas de protena no clatrina. a) Las vesculas de transporte mostradas en este diagrama son iguales a las presentadas en la figura 8-19. Estas vesculas estn cubiertas en su superficie externa por un revestimiento de protenas no clatrina (p. ej.: protenas de revestimiento}. Se cree que las vesculas de este tipo transportan membranas y cargas soiubles de manera indiscriminada desde un compartimiento al siguiente a travs de la clula, b) Dibujo esquemtico del ensamblado de una vescula recubierta por protenas de revestimiento.

GTP

FAR

(b)

296

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplasmica: estructura, funcin y trfico de membrana

nes consideraremos con mayor detalle cada uno de estos factores.


Protenas retenidas en el RE

Si las vesculas se encuentran en gemacin continua dentro de los compartimientos de la membrana, cmo retiene cada compartimiento su composicin nica?. Por ejemplo, qu determina si una protena dada presente en la membrana del RE debe permanecer en ste o proseguir hacia la cisterna de Golgi? Las protenas que normalmente residen en la luz del RER (como la proteindisulfuro isomerasa y los chaperones moleculares) poseen como C terminal una secuencia de aminocidos que provoca su retencin dentro del compartimiento (fig. 8-21). Si una protena del retculo endoplsmico carece de la secuencia lis-asp-glu-leu (o KDEL, en la nomenclatura de una sola letra) no ser retenida en el compartimiento del RE, sino transportada a lo largo de la va biosinttica en vesculas de transporte (como en la figura 8-20). Cuando se efectan manipulaciones de ingeniera gentica sobre una clula para que exprese una protena no de RE que contenga un C terminal KDEL, dicha protena permanece en el RE en vez de ser enviada a su destino apropiado. Las protenas de la membrana del RE tienen una seal diferente (KKXX, donde K es lisina y X es cualquier aminocido), que de manera similar asegura su reten-

cin dentro del organelo. Cada compartimiento de membrana en la va biosinttica puede tener seales propias de retencin, lo que ayuda a explicar cmo cada compartimiento puede mantener su dotacin de protenas nicas frente al movimiento continuo de vesculas hacia adentro y afuera de esa regin. Los datos sugieren que las protenas residentes en el retculo endoplsmico que "accidentalmente" escapan del RE no se alejan mucho de la va biosinttica, sino que son recicladas a partir de la cisterna d$ de Golgi de regreso al RE (fig. 8-21). Esta observacin indica que el trfico de membrana ocurre no slo del RE al complejo de Golgi (la llamada va antergrado), sino tambin en la direccin opuesta (retrgrada). A partir del tratamiento de las clulas con brefeldin A (BFA), frmaco obtenido de clulas de hongos, se derivaron datos adicionales para el transporte retrgrado. El tratamiento con BFA conduce a la desaparicin del complejo de Golgi y desplazamiento de las protenas de Golgi residentes al interior del retculo endoplsmico. El brefeldin A acta al impedir la formacin de vesculas revestidas, al bloquear el trfico de membrana del RE al de Golgi, pero no a la inversa. En ausencia de trfico antergrado, se puede esperar que el movimiento retrgrado de las vesculas genere transporte de la membrana de Golgi hacia la membrana del retculo endoplsmico.
Orientacin de las vesculas hacia un compartimiento particular

Cisterna meda de Golgi

Protenas residentes del RE

Receptor KDEL

FIGURA 8-21. Retencin de protenas del retculo endoplsmico. Las protenas residentes del RE contienen una secuencia de aminocidos (KDEL) que provocan su retencin dentro del compartimiento. Se cree que la retencin ocurre conforme las protenas RE se unen de manera especfica a un receptor KDEL. Las protenas con una secuencia KDEL que escapan del RE en una vescula de transporte, al parecer regresan de los compartimientos cis de Golgi mediante un mecanismo de recidamiento.

La mayor parte de los factores aislados que participan en el transporte de vesculas desempean un papel inespecfico en el proceso, pero hay pruebas de que la fusin de la vescula es especfica. Por ejemplo, las vescculas del RE se fusionan con la cisterna cs de Golgi y no con la cisterna media. De manera similar, las vesculas de la cisterna media de Golgi slo se fusionan con la cisterna trans. La fusin selectiva es uno de los factores que garantiza un flujo altamente orientado a travs de los compartimientos membranosos de la clula. Se han aislado protenas, particularmente de clulas nerviosas, que median la fusin de membranas especficas. Por ejemplo, la membrana plasmtica de una neurona presinptica contiene una protena denominada sintaxina, que se une especficamente a una protena denominada protena de membrana relacionada con vesculas (PMRV, tambin conocida como sinaptobrevina) localizada en la membrana de las vesculas sinpticas. Se cree que la interaccin entre estas dos protenas media la fusin de la membrana y la liberacin del neurotransmisor (pg. 159). Aunque levaduras y mamferos estn separados por ms de mil millones de aos de evolucin y las clulas de las levaduras no efectan ninguna actividad anloga a la transmisin sinptica, estas primitivas clulas eucariotas contienen familias de genes que codifican protenas muy similares a sintaxina y protenas de membrana relacionadas con vesculas. Se ha propuesto que estas protenas son miembros de un par de familias de protenas que median el transporte vesicular en todas las clulas eucariotas. Las protenas similares a las protenas de membrana relacionadas con vesculas son miembros de la familia v-SNARE y se ubican en las membranas de vesculas de transporte. Protenas similares

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana toplstnica: estructura, funcin y trfico de membrana FIGURA 8-22. Se piensa que la especificidad del encuentro y fusin de las vesculas se logra a travs de interacciones especificas entre protenas sobre la membrana vesicular y protenas complementarias sobre la membrana del compartimiento al cual se dirigen, a) Se ha postulado que las protenas de la membrana vesicular son miembros de una familia v-SNARE, en tanto que las protenas del compartimiento al cual se dirigen de manera especfica son miembros de una familia t-SNARE. Conforme las vesculas de la membrana se forman por gemacin a partir de un compartimiento donador, recogen las protenas especficas v-SNARE que les permiten encontrarse con la membrana especfica apropiada que contiene una membrana complementaria t-SNARE. b) Diagrama de un ciclo de gemacin y encuentro. Adems de contener una v-SNARE, la vescula en gemacin del compartimiento donador est cubierta por un revestimiento de protena no clatrina. El revestimiento se desensambla antes del encuentro con la membrana especfica. Para el proceso de encuentro tambin se requieren algunas otras protenas (marcadas como SNAP y NSF).

297

a la sintaxna son miembros de la familia t-i y se localizan en la membrana aceptara (especfica). Se cree que interacciones especficas entre t-SNARE y v-SNARE (fig. 8-22) gobiernan el encuentro y la fusin de las vesculas. En esta hiptesis, por ejemplo, una v-SNARE de una vescula derivada del RE se une a t-SNARE en una cisterna cis de Golgi, pero no a t-SNARE en una membrana lisosmica. Orientacin de las protenas de la va biosinttica A pesar de todos los comentarios de las vesculas de transporte, an debemos explicar cmo una protena particular sintetizada en el RE se secreta en una vescula particular. Es importante que una clula tenga capacidad para distinguir entre los diferentes materiales que elabora. Por ejemplo, una clula pancretica tiene que separar enzimas digestivas recin sintetizadas y destinadas a ser secretadas de enzimas lisosmicas recin sintetizadas destinadas al lisosoma. Se cree que esta especie de proceso de clasificacin para separar protenas marcadas hacia diferentes destinos en vesculas diferentes ocurre en los ltimos compartimentos de Golgi, o sea, la red trans de Golgi (RTG). El microscopio electrnico revela que la RTG por lo general se compone de elementos tubulares interconectados en la vecindad de la cisterna trans ms interna (fig. 8-16). En la RTG se originan dos tipos de vesculas: 1. Vesculas no selectivas, no recubiertas de clatrina (fig. 8-20, a), que llevan materiales (como colgena y fibronectina) secretados continuamente por las clulas (o sea, secrecin elemental) y tambin protenas integrales de membrana que continuamente se aaden a la membrana plasmtica. 2. Vesculas selectivas recubiertas de clatrina que llevan cargas seleccionadas, como productos secretorios regulados y enzimas lisosmicas marcadas para sitios especficos. Ya analizamos la estructura y actividades de las vesculas no recubiertas de clatrina; ahora retornaremos a la variedad recubierta de clatrina. Estructura y Juncin de las vesculas recubiertas de clatrina de la red trans de Golgi La estructura de las vesculas recubiertas de clatrina se describe con detalle en la pgina 313. El revestimiento de estas
Sin revestimiento X

= v-SNARE para el RE cis de Golgi fr = t-SNARE para el RE ds de Golgi ^ = v-SNARE para la membrana plasmtica rrans de Golgi ^ = t-SNARE para la membrana plasmtica trans de Golgi

Retculo endoplsmico

(O)

Cisterna B

Sin revestimiento

Cisterna A

,.

298

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana, citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Clatrina ^ Receptor con ligando A Adaptador

t
vescula con protenas de revestimiento que contiene material inespecfico de la RTG Formacin de la vescula revestida de clatrina que contiene material seleccionado
de la RTG

\n de la

Red trans de Golgi

Clatrina Adaptador (consta de dos sublimidades de adaptina) Dominio citoplsmco del receptor de membrana

Dominio transmembrana del receptor de membrana Material seleccionado para ser transportado

(W

FIGURA 8-23. Formacin en la RTG de fosillas que contienen adaptina y estn recubiertas de clatrina. a) Se pueden observar cuando menos dos tipos distintos de vesculas recubiertas en gemacin sobre la membrana de la red trans de Golgi. Las vesculas recubiertas por protena no clatrina no muestran selectividad respecto de la carga que transportan, en tanto que las vesculas recubiertas de clatrina transportan materiales capaces de enlazarse a receptores especficos de membrana. Los receptores de membrana se incorporan selectivamente en las vesculas recubiertas de clatrina como consecuencia de una unin especfica entre los extremos de las protenas de membrana y la capa ce adaptadores que los rodean (mostrada en el recuadro). Los adaptadores, a su vez, poseen sitios de enlace para la red ms externa de molculas de clatrina. b) Como se analiza posteriormente en el captulo, se pueden distinguir dos tipos de vesculas recubiertas de clatrina, un tipo formado por gemacin de la red trans de Golgi de ias pilas de Golgi, y el otro que se forma por gemacin a partir de la membrana plasmtica. Estos dos tipos de vescula se distinguen por los tipos de molculas de adaptina que componen los adaptadores. Las vesculas formadas por gemacin de la RTG contienen y-adaptina, cuya localizadn en estas clulas se revela por anticuerpos fluorescentes rojos. Las vesculas formadas por gemacin de la membrana plasmtica contienen er-adaptina, cuya localizacin se revela por anticuerpos fluorescentes verdes, (b: Segn Margaret S. Robinson, Trends in Cell Biol. 2:294, 1992.)

vesculas contiene: 1) una estructura externa parecida a un panal de abejas compuesto por la protena clatrina que forma un bastidor estructural, y 2) una cubierta interna compuesta de complejos protenicos llamados adaptadores, que cubren la superficie de la membrana vesicular enfrentada al citoplasma (fig. 8-23, a). La masa de cada adaptador consta de un par de protenas llamadas adaptinas, cuya localizacin dentro de la regin de la red trans de Golgi se muestra en la figura 8-23, b. Se piensa que las adaptinas proporcionan parte de la informacin requerida para la clasificacin de protenas. Los extremos C terminal de las molculas de adaptina forman un par de "orejas" proyectadas desde el cuerpo del complejo adaptador. Se cree que stas prolongaciones semejantes a orejas pueden enlazarse a las colas de los receptores de membrana. A su vez, los receptores se enlazan a ligandos especficos dentro de la luz de la vescula (fig. 8-23). Como resultado de estas interacciones, los materiales especficos dentro de la vescula se concentran en vesculas no cubiertas de clatrina.

Clasificacin de las protenas lisosmicas. La clasificacin de las protenas lisosmicas ilustra la manera de operar de algunos componentes de una vescula recubierta de clatrina. Las protenas lisosmicas se ensamblan a ribosomas enlazados a la membrana del RE y se transportan a la cisterna as de Golgi junto con otros tipos de protenas. Sin embargo, ya en la cisterna de Golgi, las enzimas que aaden un grupo fosfato a los azcares maosa de las cadenas de carbohidrato unidas por enlaces N reconocen a las protenas lisosmicas (fig. 8-24, u). Por lo tanto, a diferencia de otras glucoprotenas clasificadas en la red trans de Golgi, las enzimas lisosmicas poseen residuos maosa fosforilados que actan como seales de reconocimiento. Las enzimas lisosmicas que llevan esta seal son reconocidas y "capturadas" por los receptores maosa 6-fosfato, los cuales son protenas integrales de membrana de la red trans de Golgi (fig. 8-24, b). Este aspecto del mecanismo de clasificacin est bien establecido, pero la demostracin para el resto del cuadro es ms circunstancial.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana toplsmca: estructura, juncin y trfico de membrana FIGURA -2-J. Mecanismo para enviar las enzimas lisosmicas a los lisosomas. a) Las enzimas lisosmicas son reconocidas por una enzima en la cisterna as que transfiere una N-acetilglucosamina fosforilada desde un azcar nucletido donador a uno o ms residuos maosa de oligosacridos N unidos. A continuacin se elimina la porcin glucosamina en un segundo paso mediante una segunda enzima que deja residuos de manosa-bsfato como parte de la cadena del oligosacrido. b) Diagrama que muestra las vas seguidas por: 1) una protena (rojo) secretada de manera elemental (como la fibronectina), y 2) una enzima lisosmica (negro). Los residuos maosa de la enzima lisosmica se fosforilan en las cisternas de Golgi (paso 1) y luego se incorporan selectivamente en una vescula recubierta por clatrina en la RTG (paso 2). Se cree que los receptores maosa 6-fosfato tienen un doble papel: interactan de manera especfica con las enzimas lisosmicas en el lado luminal de la vescula y tambin especficamente con adaptinas sobre la superficie ctoplsmica de la vescula (paso 3). Los receptores maosa 6-fosfato al parecer se separan de las enzimas antes de la formacin del lisosoma (paso 4) y regresan al complejo de Golgi (paso 5). Los receptores maosa 6-fosfato tambin estn presentes en la membrana plasmtica, donde pueden capturar enzimas lisosmicas secretadas en el espacio extracelular y retornarlas a una va- que las dirige hacia el lisosoma (paso 6).

299

:'J - 3 c c 1 1 1 g I u c o s a m i n a [osfotransferasa

F o sf odi es terglucosidasa

i t i A los i \ lisosomas
2UMP

- Maosa - GIcNAc

(e)
Exocitosis

O
<\a de <] clasificacin Disociacin de la enzima lisosmica del receptor 6-fosfato de maosa Q ^ Vescula del transporte 0

Se cree que los receptores maosa 6-fosfato de la RTG pueden tener sitios de enlace en ambos lados de la membrana de la red trans de Golgi. Aunque una parte del receptor se proyecta a la luz de la RTG y se enlaza a una enzima lisosmica, otra parte se proyecta al interior del citoplasma y se enlaza a una molcula de adaptina en uno de los complejos adaptadores ensamblados en la superficie de la membrana de la red trans de Golgi (fig. 8-24, b). Una vez formada, la vescula de clatrina recubierta que surge por gemacin de la RTG debe orientarse a un destino particular. Por ejemplo, las vesculas recubiertas contienen enzimas lisosmicas que deben orientarse a un lisosoma (o a un endosoma que posteriormente se convertir en un lisosoma, pgina 311). Presumiblemente, cada vescula de transporte que sufre un proceso de gemacin en la membrana lleva consigo protenas especficas derivadas de la membrana donadora capaces de fijarse a receptores especficos sobre la membrana aceptora para iniciar la fusin. En la figura 8-22 se muestran las v-SNARE y t-SNARE que pueden mediar este proceso. Glucosilacin en el complejo de Golgi La funcin definida con mayor claridad del complejo de Golgi es el ensamblado de carbohidratos. El complejo de Golgi es el sitio donde se concluye el ensamblado de oligosacridos a glucoprotenas y glucolpidos. El complejo de Golgi tambin es sitio de sntesis de la mayor parte de los complejos polisacridos de la clula, incluyendo, por ejemplo, los glucosaminoglicanos observados en la matriz extracelular de clulas animales o las pectinas y la hemicelulosa que se encuentran en las paredes celulares de las plantas (fig, 7-35, c). El papel del complejo de Golgi en la glucosilacin se demostr por primera vez mediante autoradiografa en clulas caliciformes intestinales que secretan grandes cantidades de mucina, una protena con alto contenido de azcar. Cuando se expone esta clula a azcares marcados con istopos radiactivos se observa que priProtena secretoria

Reciclamiento del receptor 6-fosfato para maosa

Receptor maosa 6-fosfato

Red trans de Golgi

Fosforilacin de la enzima lisosmica Enzima lisosmica

Retculo endoplsmico rugoso

(b)

mero se incorporan al interior del complejo de Golgi (fig. 8-25). El complejo de Golgi es una estacin principal de procesamiento a lo largo de la va biosinttica (fig. 8-2). Cuan-

300

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Luz del intestino

Exocitosis: etapa terminal de la secrecin Las clulas que participan en la secrecin regulada, como las que se muestran en la figura 8-8, tpicamente contienen un gran nmero de vesculas secretorias (tambin llamadas granulos secretorios) apiadas cerca de sus superficies apicales. Los granulos secretorios se originan de vesculas recubiertas de clatrina que sufren gemacin en la red trans de Golgi. Conforme las vesculas secretorias se desplazan a la superficie apical de la clula, el contenido de las vesculas se concentra cada vez ms a medida que el agua sale de las vesculas hacia el citoplasma. En las clulas nerviosas, las vesculas que contienen sustancias neurotransmisoras sufren gemacin de la RTG localizada cerca del ncleo de la clula y a continuacin se transportan al extremo del axn, distancia que puede ser de varios metros en un vertebrado de gran tamao. Para que un granulo secretorio descargue su contenido es necesario que la membrana del granulo y la membrana plasmtica suprayacente entren en contacto y en seguida se fundan, generando as una abertura a travs de la cual se puede liberar el contenido del granulo (fig. 8-27, a,b). Este proceso de fusin de membranas y descarga del contenido, que se denomina exocitosis, de ordinario se desencadena cuando la concentracin local de iones calcio aumenta. Por ejemplo, en la pgina 159 se hizo notar que la llegada de un impulso nervioso al botn terminal de una neurona incrementa el flujo hacia adentro de Ca2+ con la subsecuente descarga de molculas de neurotransmisor mediante exocitosis. La inyeccin de soluciones de calcio dentro de las clulas que participan en la secrecin regulada provoca la descarga total del producto secretorio. Las etapas de la exocitosis (o de cualquier tipo de fusin regulada de membranas) son un proceso todava no bien comprendido. El contacto entre la membrana de una vescula secretoria y la membrana plasmtica es mediado por algunas de las llamadas "protenas de fusin" situadas en la superficie y dentro de la membrana. La funcin aparente de estas protenas es establecer contactos a corta distancia entre membranas especficas destinadas a ntractuar y fusionarse. Se cree que el contacto entre las membranas puede causar la formacin de un pequeo "poro de fusin" revestido de protena (fig. 8-27, b) que rpidamente se dilata para formar una abertura para descarga. Cualquiera que sea el mecanismo de fusin de la membrana, cuando una vescula citoplsmica se fusiona con la membrana plasmtica, la superficie interna de la membrana vesicular entra a formar parte de la superficie externa de la membrana plasmtica, en tanto que la superficie externa de la membrana vesicular formar parte de la superficie interna de la membrana plasmtica (fig. 8-10).

FIGURA 8-25. Sntesis de poiisacridos complejos en el complejo de Golgi. Diagrama de una clula caliciforme del colon de rata mostrando la ubicacin de los granos plateados (rojo) en autorradiografas de clulas fijadas inmediatamente despus de incubacin con 3H-glucosa. El complejo de Golgi se muestra intensamente radiactivo, lo que indica su papel en la incorporacin de residuos de azcar a las cadenas de carbohidrato que constituyen la masa de la secrecin mucosa. La incorporacin de azcares en el complejo de Golgi contrasta con la incorporacin de aminocidos en el RE rugoso. (Basado en el trabajo realizado por Manan Neutra y C.P. LeUond.)

do tratamos en la pgina 290 el tema de la formacin de cadenas de carbohidratos N unidas, los residuos de glucosa acababan de s2er eliminados de los extremos del oligosacrido central. Conforme las glucoprotenas solubles y de membrana recin sintetizadas pasan a travs de las cisternas cis y media de la pila de Golgi, tambin se pierden la mayor parte de los residuos maosa de los oligosacridos centrales y se aaden secuencialmente otros azcares mediante diferentes glucosiltransferasas (fig. 8-26). La organizacin final de los azcares en un oligosacrido determinado al parecer es determinada por la disposicin espacial de diferentes glucosiltransferasas que entran en contacto con la protena recin sintetizada conforme se desplaza a travs de las cisternas membranosas del complejo de Golgi. Por ejemplo, la enzima sialiltransferasa, que coloca un cido silico en la posicin terminal de la cadena en clulas animales, se encuentra en el extremo trans de la pila de Golgi, como sera de esperar si las glucoprotenas recin sintetizadas se desplazaran continuamente hacia esta parte del organelo. En contraste, las protenas'residentes del RER carecen de azcares que normalmente se aaden en las cisternas de Golgi media y trans, como ocurrira a protenas que nunca alcanzan esta parte de la pila de Golgi. A diferencia de los oligosacridos N unidos, los que se fijan a protenas por uniones O se ensamblan por completo en el complejo de Golgi.

8-5 Lisosomas
Los lisosomas actan como organelos digestivos de la clula. Dentro de un lisosoma tpico se encuentra confinado un grupo de casi 50 enzimas hidrolticas diferentes (cuadro 8-1) sintetizadas en el RE rugoso y enviadas a esos organelos. En conjunto, las enzimas lisosmicas son capaces de

CAPITULO 8 Sistemas de a membrana citoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana

301

cis de Golgi

cis de Golgi media de Golgi V Maosa

media de Golgi

meda de Golgi

media de Golgi trans de Golgi

trans de Golgi

frans de Golgi

/V-acetilglucosamina

Galactosa

Acido silico 4 Fucosa

FIGURA 8-26. Etapas en la glucosilacin de oligosacridos de mamfero N enlazados en el complejo de Gogi. Luego de eliminar los tres residuos de glucosa, a continuacin se quitan varios residuos maosa, en tanto que algunos azcares (N-acetilglucosamina, galactosa, fucosa y cido silico) se aaden al oligosacrido mediante la accin de glucosiltransferasas especficas. En la luz de las cisternas de Golgi y los dominios luminales de las protenas integrales de las membranas de Golgi se aaden cadenas similares de azcares a ambas protenas solubles.

(a)
FIGURA 8-27. Exocitosis. a) Micrografa electrnica que muestra un granulo secretorio luego de concluir la fusin con la membrana, b) Modelo de un poro de fusin formado durante la exocitosis por interaccin de una protena integral multimrica de la vescula y la membrana plasmtica. 1) Las protenas de las dos membranas entran en contacto; 2) las protenas forman un poro cerrado que abraza las dos bicapas, y 3) el poro se dilata conforme las molculas de lpido difunden a lo largo de las superficies hidrfobas dispuestas entre las subunidades de fusin de los poros, (a: Cortesa de Susan o Bunven.)

302

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana CUADRO 8-': Muestra de enzimas lisosmicas Enzima Fosfatasas Sustrato

diante un transportador de protones (una H+-ATPasa) presente en la membrana que limita al organelo. Las membranas lisosmicas contienen dos grupos de protenas acidas integrales altamente glucosiladas llamadas Igp-A y Igp-B,

fosfatasa acida fosfodiesterasa acida Nudeasas ribonucleasa acida desoxirribonucleasa acida Proteasas catepsna colagenasa

fosfomonosteres fosfodisteres

RNA DNA

protenas colgena Enzimas que hidrolizan GAC

iduronato sulfatasa /3-galactosidasa heparan N-suifatasa tr-N-acetilglucosaminidasa

dermatansulfato queratansulfato heparansulfato heparansulfato

Polisacaridasas y oligosacaridasas a-glucosidasa fucosidasa a-manosidasa sialidasa glucgeno fucosil oligosacridos manosil oligosacridos sialil oligosacridos Enzimas que hidrolizan esfingolpidos ceramidasa glucocerebrosidasa /?-hexosaminidasa arilsulfatasa A ceramida glucosilceramida ganglisido C-M2 galactosilsulftido Enzimas que hidrolizan lpidos lipasa acida fosfolipasa triacilgliceroles fosfolpidos

(a)

hidrolizar prcticamente cualquier tipo de macromolcula biolgica para convertirla en productos de bajo peso molecular que puedan ser transportados a travs de la membrana lisosmica al interior del citoplasma. Las enzimas de un lisosoma comparten una propiedad importante: todas tienen actividad ptima a pH cido: son hidrolasas acidas. El pH de estas enzimas se correlaciona con el pH bajo del compartimiento lisosmico, que es alrededor de 4.6. La elevada concentracin interna de protones se mantiene me-

FIGTiRA 8-28. Lisosomas. a) Micrografa de un macrfago de mdula sea cultivado cuyos lisosomas contienen materiales ingeridos y teidos con el colorante fluorescente amarillo lucifer. Los lisosomas de estas clulas inicialmente son tubulares e interconectados para formar una red reticular corno la que se observa en la fotografa. Los isosomas muestran una conformacin ms vesicular luego de participar en la fagocitosis, b) Porcin de una clula de Kupffer del hgado (fagocitaria) que muestra cuando menos 10 lisosomas de tamao muy variable, (a: Segn Philip E. Knapp y Joel A. Swanson, J. Cell Sci. 95:433, 1990; con permiso de Tlie Company of Biologists; b: segn Hans Glaitmann y cois. J. Cell Biol. 67:887, 1975, con permiso de Rockefeller University Press.)

(b)

0.3 fjm

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana Acrosoma

303

FIGURA -29. Reaccin acrosmca. a) El acrosoma del espermatozoide del erizo marino se sita en el extremo anterior, justo frente al ncleo, b) Cuando la membrana plasmtica del espermatozoide entra en contacto con los materiales que rodean al vulo ocurre una reaccin que libera enzimas lisosmicas almacenadas en el acrosoma, que digieren un trayecto que conduce hacia la superficie del huevo. (Cortesa de Cien L. Decker, D.B. Joseph y William }. Lennarz.)

(a)

cuya funcin puede ser proteger a la membrana contra el ataque de las enzimas que encierra. Aunque los lisosomas alojan un grupo conocido de enzimas, en las micrografas electrnicas su apariencia no es distintiva, ni siquiera uniforme. Por ejemplo, el tamao

FIGURA. 8-30. Lisosomas y autofagia. Micrografa electrnica de la clula de una porcin de tbulo renal de ratn que muestra numerosos lisosomas. La presencia de enzimas lisosmicas en estos organelos se demuestra por tcnicas citoqumicas mediante la precipitacin de fosfato de plomo procedente del fosfato inorgnico liberado por actividad de a fosfatasa acida (como en LI). El lisosoma marcado 1.2 se fusiona con una mitocondria enlazada a la membrana para formar una vacuola autofgica. (Segn Viuianne Maggi, en E.E. Bittar, ed., Cell Biology in Medicine, Wiiey, 1973.)

de los lisosomas oscila desde estructuras relativamente grandes (mayores de 1 fim de dimetro) hasta vesculas muy pequeas (25 a 50 nm de dimetro). La variacin en la morfologa lisosmica es ms evidente en los macrfagos, clulas especializadas en ingerir partculas extraas mediante un proceso de fagocitosis, que se estudia a profundidad en la seccin 8-7. Cuando se diferencian macrfagos en cultivo, sus lisosomas inicalmente son organelos tubulares interconectados que forman una red reticular (fig. 8-28, a). Una vez que el macrfago cultivado comienza a fagocitar materiales, sus lisosomas se transforman en vesculas ms tpicas. La figura 8-28, b, muestra una pequea porcin de: un clula de Kupffer, una clula fagocitaria del hgado encargada de ingerir eritrocitos envejecidos. Los lisosomas mostrados en la figura 8-28, b, tienen forma irregular y densidad electrnica variable, lo que ilustra la dificultad para identificar estos organelos con base slo en su morfologa. De ordinario, para identificar un organelo como lisosoma hay que demostrar la presencia de la enzima fosfatasa acida (fig. 8-30). Esto se efecta por mtodos citoqumicos incubando cortes de tejido con un sustrato adecuado para la enzima en presencia de una sal soluble de plomo, como el citrato de plomo. Cuando la fosfatasa acida separa el fosfato inorgnico del sustrato se forma un precipitado insoluble de fosfato de plomo en el sitio, el cual puede identificarse directamente en el microscopio electrnico. Aunque es evidente que los lisosomas aparecen estticos en una micrografa electrnica, se ha demostrado que son organelos dinmicos capaces de efectuar fusin y fisin con rapidez. La presencia dentro de una clula de esta verdadera bolsa de enzimas destructoras sugiere algunas posibles funciones. La funcin mejor estudiada de los lisosomas es el desdoblamiento de materiales que llegan a las clulas procedentes del ambiente extracelular. Muchos organismos unicelulares ingieren partculas nutrientes que son desensambladas en el lisosoma por las enzimas. Los nutrientes pasan al interior del citoplasma a travs de la membrana lisosmica. En mamferos, las clulas fagocitarias, como los macrfagos y los neutrfilos, funcionan como carroeros

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CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

que ingieren desperdicios o microorganismos potencialmene peligrosos. En general, estos materiales se inactivan al pH bajo del lisosoma y luego son digeridos por las enzimas. Se estima que un macrfago participa intensamente en la fagocitosis y puede contener ms de mil lisosomas. No todas las bacterias ingeridas por clulas f agocitarias son destruidas. Algunas especies, como Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis, penetran al citoplasma de un macrfago mediante fagocitosis, pero la vescula (fagosoma) donde quedan encerrados no se fusiona con un lisosoma. De alguna manera, el microorganismo inhibe la fusin que conducira a su destruccin, y en lugar de eso se multiplica dentro de la clula. En contraste, la bacteria causante de la fiebre Q, Coxiella burnet, queda incluida en un fagosoma que se funde con un lisosoma, pero ni el ambiente cido ni las enzimas del lisosoma son capaces de destruir al patgeno. Un tercer paso es el que toma Listeria monocytogenes, bacteria capaz de causar meningitis. Este microorganismo produce una fosfolipasa que destruye la integridad de la membrana lisosmica y permite que la bacteria escape hacia el interior del citoplasma de la clula. Durante la fertilizacin se observa una actividad lisosmica poco habitual. La cabeza del espermatozoide con-

tiene un paquete de enzimas lisosmicas denominado acrosoma. Cuando el espermatozoide alcanza la vecindad de un vulo, la membrana que rodea el acrosoma se fusiona con la membrana plasmtica suprayacente y libera las enzimas lisosmicas almacenadas (fig. 8-29). Las enzimas digieren una va a travs de la cubierta externa del vulo y dejan un "agujero" por el cual avanza el espermatozoide, que entonces puede alcanzar la membrana plasmtica del vulo. Los lisosomas no slo estn implicados en la destruccin de materiales que penetran a la clula desde el medio externo. Tambin desempean un papel clave en el recambio del organelo, o sea, la destruccin y sustitucin de organelos. Durante este proceso, denominado autofagia, un organelo como la mitocondria, mostrado en la figura 8-30, se rodea de una membrana donada por el retculo endoplsmico. A continuacin, la membrana que rodea al organelo se fusiona con un lisosoma formando una vacuola autofgica. Cuando se examina una micrografa electrnica no es raro observar una mitocondria u otro organelo atrapado en una vacuola autofgica. Se calcula que en una clula heptica de mamfero, una mitocondria sufre autofagia cada 10 minutos, aproximadamente. El nmero de vacuolas autofgicas observadas en una clula puede variar segn el estado -

Fagoctosis Exocitosis

Vacuola fagocitaria (fagosoma)

Granulo de pigmento de lipofuscina

Vacuola autofgica (citolisosoma) Complejo de Golgi

Mitocondria

FIGURA 8-31. Resumen de las vas dei sistema lisosmico.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

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siolgico de la misma. Si se priva a una clula de nutrientes se observa un marcado incremento de la autofagia. En estas condiciones, la autofagia suministra a la clula la energa para mantenerse viva mediante la canibalizacin de sus propios organelos. El papel de los lisosomas en dos funciones principales, fagocitosis y autofagia, se resume en la figura 8-31; el papel de estos organelos digestivos en una tercera actividad (endocitosis) se analiza en la pgina 313. Se ha demostrado que los lisosomas primarios, o sea, lisosomas que an no tienen funciones en la digestin celular, se fusionan con vesculas fagocitarias que contienen materiales extraos, como bacterias, o con vesculas autofgicas que contienen organelos celulares, como mitocondrias. En cualquier caso, una vez concluido el proceso digestivo, el organelo se denomina corpsculo residual. Segn el tipo de clula, el contenido del corpsculo residual puede eliminarse de la clula por exocitosis, o quedar retenido indefinidamente en el citoplasma como granulo de lipofuscina. Los granulos de lipofuscina aumentan de nmero conforme un individuo envejece; su acumulacin es particularmente notable en clulas de vida prolongada, como las neuronas, donde estos granulos se consideran una caracterstica principal del proceso de

envejecimiento. El papel de los lisosomas en diversas enfermedades se analiza en La perspectiva humana, en este captulo.

8-6 Vacuolas de clulas vegetales


Ms de 90% del volumen de muchas clulas vegetales se encuentra ocupado por una sola vacuola llena de lquido y rodeada por una membrana (fig. 8-32). Aunque de estructura sencilla, las vacuolas de las plantas efectan una amplia gama de funciones esenciales. Sirven como almacn transitorio para muchos solutos de la clula y de macromolculas, incluyendo iones, azcares, aminocidos, protenas y polisacridos. Las vacuolas tambin pueden almacenar algunos compuestos txicos. Estos compuestos (como los glucsidos que contienen cianuro y los glucosinolatos) forman parte de un arsenal qumico de armas liberadas cuando la clula es lesionada por un herbvoro o por hongos. Otros compuestos txicos son simplemente subproductos de reacciones metablicas; puesto que las plantas carecen de sistemas de tipo excretorio, como los observados en animales, utilizan sus vacuolas como medio para elimi-

(b)

FIGURA 8-32. Vacuolas de clulas vegetales, a) Cada una de las clulas cilindricas de las hojas de la planta acutica Elodea contiene una gran vacuola central rodeada por una capa de citoplasma que contiene los cloroplastos visibles en la micrografia. b) Micrografa por transmisin electrnica de una clula cortical de frijol de soya que muestra la gran vacuola central y la delgada capa de citoplasma que la rodea, (a: Segn M.l. Walker/Photo Researchers; b: segn M..F. Brown/Visuals Unlimited.)

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CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

LA PERSPECTIVA HUMANA
Enfermedades producidas por defectos de la funcin lisosmica
Si consideramos que las enzimas hidrolticas de un lisosoma pueden digerir todo el contenido de una clula, no es sorprendente que los trastornos de la funcin lisosmica tengan un profundo efecto sobre la salud humana. Por ejemplo, la enfermedad de los mineros conocida como silicosis se debe a la captacin de fibras de slice por las clulas fagocitarias de los pulmones. Las fibras quedan encerradas' en los lisosomas, pero no pueden digerirse; en vez de esto, provocan fugas en la membrana lisosmica, derrame del contenido de enzimas digestivas dentro de la clula y dao al tejido pulmonar. Ocurre algo similar cuando las clulas carroeras captan fibras de asbesto y ocasionan la enfermedad llamada asbestosis. Ambos padecimientos pueden ser debilitantes e incluso causar la muerte. Ciertos tipos de enfermedades inflamatorias, como la artritis reumatoide, se deben en parte a la liberacin de enzimas lisosmicas procedentes de clulas inmunolgicas en el espacio extracelular, daando los materiales intraarticulares. La comprensin de los mecanismos para enviar protenas hacia organelos particulares se inici con el descubrimiento de que los residuos maosa 6-fosfato de las enzimas lisosmicas actan como "direccin postal" para entregar protenas a los lisosomas. El descubrimiento de la "direccin" del lisosoma ocurri en estudios de pacientes con una rara enfermedad heriditaria conocida como enfermedad de la clula I, en la cual muchas clulas del cuerpo contienen lisosomas inundados de materiales no degradados. Los materiales se acumulan en los lisosomas de estos pacientes por la falta de enzimas hidrolticas. Cuando se estudiaron cultivos de fibroblastos de estos pacientes se observ que las enzimas lisosmicas se sintetizan en concentracin normal, pero que en vez de entrar a los lisosomas de la clula son secretadas al medio externo. Estudios subsecuentes revelaron que las enzimas secretadas carecen de residuos maosa fosfato presentes en las enzimas correspondientes de las clulas de individuos normales. Pronto se demostr que el defecto de la clula I era una deficiencia de la enzima (N-acetilglucosamina fosfotransferasa) necesaria para la fosforilacin de la maosa (fig. 8-24). En 1965, W.G. Hers, de la Universidad de Louvain, en Blgica, postul una hiptesis para explicar cmo la ausencia de una enzima lisosmica aparentemente sin importancia, la a-glucosidasa, poda provocar la aparicin de una enfermedad hereditaria mortal conocida como enfermedad de Pompe. Hers sugiri que en ausencia de a-glucosdasa el glucgeno no digerido se acumula en los lisosomas causando inflamacin de esos organelos y dao irreversible a clulas y tejidos. Enfermedades de este tipo, caracterizadas por la deficiencia de una enzima lisosmica y acumulacin del correspondiente sustrato no desdoblado (fig. PH 8-1), se denominan enfermedades por almacenamiento lisosmico; hasta ahora se han descrito ms de 30 (cuadro PH 8-1). Los sntomas de las enfermedades por almacenamiento lisosmico van desde enfermedades muy graves hasta padecimientos difciles de determinar, segn el grado de actividad de la enzima a pesar de la presencia de una mutacin gentica. La mayor parte de las enfermedades por almacenamiento lisosmico son hereditarias autosmicas recesivas y por lo tanto los individuos afectados heredan el gen defectuoso de ambos progenitores. Dos de estas enfermedades (la de Fabry y la de Hunter) son causadas por genes presentes en el cromosoma X y ,son mucho ms frecuentes en los hijos

Fipiira PH 8-1. Trastornos del almacenamiento lisosmico. Micrografa electrnica de un corte transversal de una porcin de glndula sudorpara en un paciente con enfermedad de Hunter, padecimiento por almacenamiento lisosmico caracterizado por incapacidad para descomponer glucosaminoglicanos. De los tres tipos de clulas mostradas, rnioepiteliales (ME), clulas claras (CC) y clulas oscuras (DC), las dos ltimas se caracterizan por la presencia de numerosas vacuolas ausentes en las mismas clulas de un individuo normal. En estas vacuolas se observan enzimas lisosmicas teidas y glucosaminoglicanos, lo que indica acumulacin de glucosaminoglicanos no digeridos en esos lisosomas. (Cortesa de S.S. Spicer.)

varones, quienes heredan el alelo imitante de la madre. Entre las enfermedades por almacenamiento lisosmico mejor estudiadas se encuentra la enfermedad de TaySachs, resultante de una deficiencia de la enzima /-N-hexosaminidasa A, en-

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana ciioplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

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CUADRO PH 8-1. Enfermedades por almacenamiento de esfingolpidos


Principal sustancia almacenada

Enfermedad

Deficiencia enzimtica

Consecuencias

Gangliosidosis GMI Enfermedad Tay-Sachs Enfermedad de Fabry Enfermedad de Sandhoff Enfermedad de Gaucher Enfermedad Niemann-Pick Lipogranulomatosis de Farber Enfermedad de Krabbe Sulfatidolipidosis

jS-galactosidasa GMi Hexosaminidasa A a-galactosidasa A Hexosaminidasas A y B Glucocerebrsido Esfingomielinasa Ceramidasa Galactocerebrosidasa Arilsulfatasa A

Ganglisido GMI Ganglisido GMI Trihexosiceramida Ganglisido G^2 y globsido Glucocerebrsido Esfingomielina Ceramida Galactocerebrsido Sulftido

Retraso mental, hepatomegalia, afeccin del esqueleto, muerte cerca de los dos aos de edad Retraso mental, ceguera, muerte cerca de los tres aos de edad Erupcin cutnea, insuficiencia renal, doior en las extremidades inferiores Similar a la enfermedad Tay-Sachs, pero de evolucin ms rpida Hepatomegalia y esplenomegalia, erosin de huesos largos, retraso mental slo en la forma infantil Hepatomegalia y esplenomegalia, retraso mental Dolor y deformacin progresiva de las articulaciones, nodulos cutneos, muerte en los primeros pocos aos Prdida de la mielina, retraso mental, muerte a la edad de dos aos Retraso mental, muerte en el primer decenio de vida

zima requerida para desdoblar el ganglisido GM2 (ig. 4-6), componente comn de la membrana de clulas cerebrales. En su forma ms grave, que ataca durante la infancia, la enfermedad se caracteriza por retraso mental y motor progresivo, y tambin por anomalas esquelticas, cardiacas y respiratorias. La enfermedad es muy rara en la poblacin general, pero alcanza una tasa mayor de 1 en 3 600 nacimientos entre descendientes de judos de Europa oriental. En aos recientes, la ocurrencia de la enfermedad descendi de manera espectacular en esta poblacin tnica como consecuencia de la identificacin de portadores, consejo gentico a progenitores en riesgo, y diagnstico prenatal por amniocentesis. En realidad, todas las enfermedades conocidas por almacenamiento lisosmico

se pueden diagnosticar antes del nacimiento. En los ltimos aos han mejorado mucho las perspectivas del tratamiento de las enfermedades por almacenamiento lisosmico con la demostracin de que los sntomas de la enfermedad de Gaucher, causada por deficiencia de la enzima lisosmica glucocerebrosidasa, se pueden aliviar parcialmente sustituyendo la enzima. Los lactantes con enfermedad de Gaucher acumulan grandes cantidades de glucocerebrsidos en los lisosomas de sus macrfagos. Los intentos iniciales para corregir la enfermedad inyectando en la corriente sangunea una solucin de la enzima humana normal no tuvieron xito debido a que la enzima era captada por las clulas hepticas, no afectadas gravemente por la enfermedad.

Para orientar especficamente a los macrf agos, la glucocerobrosidasa purificada se trat con enzimas que eliminan los azcares terminales de las cadenas de oligosacridos al exponer los residuos maosa subyacentes. Luego se inyect en la corriente sangunea esta enzima modificada, que fue reconocida por los receptores situados en la superficie de los macrfagos y captada con rapidez por endocitosis mediada por receptor (estudiada en la pgina 309). Puesto que los lisosomas son el objetivo natural de los materiales llevados al interior del macrfago por endocitosis, las enzimas fueron entregadas con eficiencia en los sitios precisos de la clula donde se manifestaba la deficiencia. Todava no se sabe si esta tcnica se aplicar extensamente.

nar estos subproductos del resto de la clula. Algunos de estos compuestos, como la digital, han demostrado tener un valor clnico importante. En la pgina 000, se hizo notar que las clulas vegetales conservan una presin de lquido elevada (turgencia) que empuja la pared celular hacia afuera y conserva la forma de la clula. La presin por turgencia es generada por la elevada presin osmtica de la vacuola. La membrana que rodea la vacuola, denominada tonoplasto, contiene algunos siste-

mas de transporte activo que bombean iones al interior del compartimiento de la vacuola hasta alcanzar una concentracin mucho ms alta que la del lquido extracelular. Debido a la elevada concentracin inica, el agua penetra a la vacuola por osmosis. La presin ejercida por turgencia en la vacuola no slo suministra apoyo mecnico a los tejidos blandos de una planta, sino tambin proporciona la fuerza necesaria para estirar la pared celular y permitir que las clulas vegetales aumenten de volumen.

308

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana ciioplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Las vacuolas de las plantas tambin son sitios de digestin intracelular no muy diferentes de los lisosomas de una clula animal. En realidad, las vacuolas de las plantas poseen algunas hidrolasas acidas iguales a las que se encuentran en los Hsosomas; el pH de la vacuola se mantiene a un valor bajo mediante una H+-ATPasa dentro del tonoplasto que bombea protones al interior del lquido vacuolar. Otra caracterstica que comparten las vacuolas vegetales con los lisosomas es su participacin como punto final en la va biosinttca de la clula. Igual que las protenas del lisosoma, muchas protenas de una vacuola vegetal se sintetizan en ribosomas enlazados a membranas del RER, son transportadas a travs del complejo de Golgi y clasificadas en la cara tmns de dicho complejo antes de ser enviadas hacia la vacuola. En algunas clulas, como las del parnquima del almacn de semillas en desarrollo, ms de 50% de las protenas recin sintetizadas son enviadas a la vacuola para almacenamiento.

teriales demasiado grandes para penetrar su membrana independientemente de sus propiedades de permeabilidad? Para satisfacer esta necesidad evolucionaron mecanismos que captan materiales del medio extracelular dentro de vesculas derivadas de pliegues, o invaginaciones, de la membrana plasmtica. La captacin de materiales extracelulares en vesculas ctoplsmicas se divide en dos categoras separadas, fagocitosis y endocitosis, que ocurren por mecanismos diferentes. La fagocitosis es la captacin de partculas materiales y la endocitosis es la captacin de lquidos, solutos disueltos y macromolculas suspendidas.3 Las vesculas formadas por fagocitosis son tpicamente casi 10 veces ms grandes (1 a 2 m de dimetro) en comparacin con las formadas por endocitosis (0.1 a 0.2/m de dimetro).

8-7 Captacin celular de partculas y macromolculas


En un captulo previo se consider el movimiento de solutos de bajo peso molecular directamente a travs de la membrana plasmtica, pero cmo pueden las clulas captar ma-

3 En anos recientes, la terminologa sufri cambios en este campo. En 1963, Chrstian de Duve introdujo el termino endocitosis para incluir dos tipos de actividades, la ingestin de partculas (fagocitosis) y la captacin de lquidos y solutos (pinocitosis). Puesto que ltimamente se demostr con claridad que fagocitosis y pinocitosis son actividades fundamentalmente diferentes, el trmino pinocitosis cay en desuso (excepto para describir la captacin de lquido por protistas). En la actualidad, endocitosis se usa comnmente para describir la captacin tanto de lquidos como de molculas disueltas o suspendidas, y debe distinguirse de la fagocitosis.

Lisosomas que contienen enzimas digestivas Captacin Engullimiento Absorcin

Seudpodos

Alimento

Vacuola con alimento

Alimento digerido

Alimento absorbido

(a)

FI<;iJKA -3.'. Fagocitosis, a) Diagrama de las etapas de engullimiento, digestin y absorcin de materiales llevados al interior de una amiba por fagocitosis, b) Se ilustra el proceso de engullimiento efectuado por un leucocito polimorfo nuclear que ingiere una partcula de levadura, (b: Segn J. Boy/es y Dorothy F. Bainton, Cell 24:906, 1981; con permiso de Cell Press.)

15 pm

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

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Fagocitosis La fagocitosis ("clulas que comen") es ejecutada extensamente por unos pocos tipos de clulas especializadas en captar partculas materiales del ambiente y entregarlas al lisosoma. Los organismos heterotrofos unicelulares, como amibas y ciliados, se mantienen vivos atrapando partculas nutrientes y organismos ms pequeos, y aprisionndolos en pliegues de la membrana plasmtica. Los pliegues se fusionan para formar una vacuola (ofagosoma) que se desprende de la membrana plasmtica (fig 8-33, a). El fagosoma se fusiona con un lisosoma y as el material se digiere en el interior de la clula. En casi todos los animales evolutivamente desarrollados, la fagocitosis es un mecanismo protector y no una manera de alimentarse. Los mamferos poseen varias clulas fagocitarias, incluyendo macrfagos y neutrfilos, cuya funcin es vagar por la sangre y los tejidos fagocitando organismos invasores, clulas daadas, eritrocitos envejecidos y desperdicios. La actividad contrctil de microfilamentos subyacentes a la membrana plasmtica que contiene actina controla el engullimiento de partculas materiales por fagocitosis. El proceso de engullimiento de partculas se ilustra en la figura 8-33, b. Los pasos en la digestin del material engullido se muestran en la figura 8-31. Endocitosis La endocitosis se puede dividir de manera muy general en dos categoras: endocitosis a granel y endocitosis mediada por receptores. La endocitosis a granel consiste en la captacin de lquidos extracelulares que la superficie de la membrana no reconoce. Cualquier molcula, grande o pequea, incluida en el lquido tambin penetra a la clula. Esta endocitosis se puede visualizar aadiendo sustancias al medio de cultivo, como el colorante amarillo luciferina o la enzima peroxidasa de rbano silvestre, que son captadas por las clulas de manera inespecfica. La endocitosis a granel puede ocurrir de manera continua en muchos tipos de clulas y su funcin primaria puede centrarse en la recuperacin de membrana plasmtica luego de periodos de secrecin o durante el ingreso de lquido extracelular. La endocitosis mediada por receptores (EMR) consiste en la captacin de macromolculas extracelulares especficas (ligandos) luego de unirse a receptores en la superficie exterior de la membrana plasmtica. La endocitosis mediada por receptores se estudia ms adelante y en La va experimental, al final de este captulo. Tanto la endocitosis a granel como la mediada por receptores pueden ocurrir a una tasa notablemente rpida: en un periodo tan breve como 15 minutos puede entrar a la clula hasta la mitad de la superficie de la membrana. A pesar del rpido movimiento de la membrana plasmtica hacia adentro, la superficie celular no se arruga ni hay necesidad inmediata de sintetizar nuevos componentes de la membrana; simplemente se rdela la membrana en una y otra direccin en la superficie interior de la clula, de modo que se aade membrana a la superficie tan rpidamente como se elimina.

Endosamos El material captado por endocitosis de ordinario se descarga en una red de tbulos y vesculas que en conjunto se conocen como endosomas. Los endosomas adems se dividen en dos compartimientos, los endosomas tempranos, tpicamente localizados cerca de la regin perifrica de la clula, y los endosomas tardos, que de ordinario se localizan en alguna parte ms interior de la clula, ms cerca del ncleo (fig. 8-34). Los endosomas tempranos y tardos se pueden distinguir entre s segn sus propiedades, como su densidad flotante (que permite aislarlos en fracciones diferentes en un gradiente de densidad), pH y contenido enzimtico. Los materiales captados por endocitosis en la superficie de la clula primero se transportan a los compartimientos endosmicos tempranos, que se cree que actan como una rea de clasificacin. Algunos materiales que penetran a los endosomas tempranos son enviados a los endosomas tardos (fig. 8-35), otros retornan a la membrana plasmtica e incluso algunas sustancias pueden ser enviadas hacia el complejo de Golgi. Se cree que los endosomas tardos reciben enzimas lisosmicas sintetizadas en el RER y clasificadas en la RTG, adems de recibir el material de los endosomas tempranos. Los endosomas tardos pueden imaginarse como un "compartimiento prelisosmico" que tiene pH cido y una concentracin baja de enzimas lisosmicas. Los materiales pasan del endosoma tardo al interior de los lisosomas, donde sufren un procesamiento adicional, segn se analiza en La va experimental, al final del captulo. Endocitosis mediada por receptor y papel de las fosittas revestidas La endocitosis mediada por receptor proporciona un medio para la captacin selectiva y eficiente de macromolculas que pueden estar presentes en concentraciones relativamente bajas dentro del lquido extracelular. Las clulas poseen receptores para captar muchos tipos diferentes de sustancias, incluyendo hormonas, factores de crecimiento, enzimas y protenas plasmticas. Los ligandos que entran a la clula por medio de EMR se unen a los receptores que se agrupan en regiones especializadas de la membrana plasmtica, conocidos como fosillas revestidas. Algunos receptores se agrupan en las fosillas revestidas en concentracin equivalente a 100 veces la del resto de la membrana plasmtica. Las fosillas revestidas (fig. 8-36, a) se reconocen en el microscopio electrnico como sitios donde la superficie est indentada y la membrana plasmtica cubierta en su cara citoplsmica por una capa de material velludo electrnicamente denso constituida por la protena clatrina, la misma protena que participa en la formacin de vesculas revestidas de clatrina en la red trans de Golgi (pg. 298). Una fosilla revestida sobre la membrana plasmtica se invagina al interior del citoplasma (fig. 8-36, b) y forma una vescula revestida que adelgaza su tallo para liberarse de la membrana plasmtica que la cubre (fig. 8-36, c,d). Al examinar la estructura del recubrimiento y de las molculas que las componen se puede tener un mejor conocimiento del proceso de formacin de las vesculas revestidas. La figura 8-37 muestra una fosilla revestida como se observa en las superficies extracelular y citoplsmica de la membrana plasmtica de una clula que participa en

310

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, juncin y trfico de membrana

endocitosis mediada por receptor. Observada desde su superficie citoplsmica (fig. 8-37, b), se nota que la cubierta velluda contiene una red de polgonos parecida a un panal de abejas. La construccin geomtrica de la cubierta se deriva de la estructura de sus bloques de construccin de catrina. Cada molcula de clatrina se compone de tres cadenas pesadas y tres cadenas ligeras reunidas para formar un ensamblado de tres extremidades denominado trisquelion (fig. 8-38). Un trisquelion constituye un mdulo notablemente adaptable con el cual una clula puede construir rejillas poligonales. Durante la invaginacin, el enrejado relativamente plano de la fosilla revestida se incurva rodeando la vescula en formacin. La figura 8-37, c, muestra la estructura de una fosilla revestida que sufre invaginacin y se aproxima a la etapa donde se desprende para formar una vescula revestida. Una rejilla compuesta de trisqueliones es una estructura muy adecuada para sufrir el tipo de redisposicin estructural requerida para transformar una rejilla plana en una estructura en forma de caja (fig. 8-39, a). En realidad, los trisqueliones purificados de clatrina se autoensamblan para formar cajas vacas similares a las encerradas en una vescula revestida. En la figura 8-39, b, se muestra la disposicin de trisqueliones de tres extremida-

des de clatrina superpuestos en la pared de una vescula revestida. Igual que las vesculas revestidas de clatrina formadas por gemacin de la RTG (pg. 298), las vesculas revestidas formadas durante la endocitosis tambin contienen una capa de complejos adaptadores situada entre la rejilla de clatrina y la superficie de la membrana vesicular que enfrenta el citoplasma. Lo mismo que en las vesculas revestidas de la RTG, los adaptadores son los que especficamente se unen a los receptores de la membrana plasmtica (fig. 8-40). Se cree que la unin ocurre entre adaptadores y "seales especficas de endocitosis" localizadas en las colas citoplsmicas de los receptores que deben llevarse al interior. Estos enlaces aseguran que los receptores (y sus ligandos enlazados) queden incluidos dentro de la vescula revestida en formacin y

Membrana plasmtica

Endosomas perifricos tempranos Vescula de J transporte

Los receptores de la membrana son reciclados haca la membrana plasmtica

Lisosoma

(a)

(c)

FIGURA 8-34. La va endosmica. a) Diagrama que muestra el desplazamiento de materiales procedentes del espacio extracelular hacia los endosomas tempranos, donde se cree que tiene lugar la clasificacin. Con frecuencia los receptores de membrana son enviados de regreso hacia la membrana plasmtica, en tanto que los materiales dentro de la vescula se transfieren a los endosomas tardos y luego al lisosoma. b-c) Se incubaron clulas cultivadas con transferrina fluorescente marcada y una protena que las clulas captan por endocitosis. b) Poco despus de la endocitosis se observan los materiales marcados en endosomas tempranos, punteados, ampliamente distribuidos, c) En la etapa final, la transferrina marcada se libera en el compartimiento endosmico tardo y se concentra ms cerca del ncleo celular, (b-c: Cortesa de Satyajit Mayor, Kenneth W. Dunn y Fred Maxfield.)

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmca: estructura, funcin y trfico de membrana

311

(b)
FIGURA 8-35. Demostracin experimental del desplazamiento de materiales del endosoma temprano al endosoma tardo, a) Clula de cobayo cultivada incubada durante cinco minutos con la enzima peroxidasa de rbano, que la clula lleva a su interior por endocitosis y que puede localizarse mediante microscopa electrnica cioqumica. El producto de la reaccin con la peroxidasa de rbano ingerida se observa como precipitado electrnicamente denso de forma y tamao variables, restringido a los endosomas tempranos (flechas), b) Clula incubada con peroxidasa de rbano durante 25 minutos, tiempo suficiente para que la enzima ingerida se desplace a los endosomas vesiculares de mayor tamao formados tardamente (flechas ms grandes). En estas clulas particulares, los endosomas tardos de ordinario se muestran llenos de estructuras vesiculares ms pequeas (P, membrana plasmtica). (Cortesa de G. Griffiths, R. Back y M. Marsh.)

0.1 um

FIGURA 8-36. Endocitosis mediada por receptor. Esta secuencia de micrografas muestra las etapas de captacin de lipoprotenas vitelinas por el oocito de gallina, a) Las protenas que la clula lleva a su interior se concentran en la superficie externa de una regin indentada de la membrana plasmtica, llamada fosilla revestida. La superficie interna de la membrana plasmtica de la superficie revestida est cubierta por una capa de material velloso electrnicamente denso que contiene clatrina. b) La fosilla revestida se hunde para formar un pliegue de membrana plasmtica todava recubierto en su superficie interna por clatrina. c) La membrana plasmtica a punto de separarse en forma de una vescula que contiene protena de yema de huevo sobre su superficie uminal y clatrna sobre su superficie citoplsmica. d) Vescula revestida separada de la membrana plasmtica. El siguiente paso del proceso es liberar la cubierta de clatrina. (Segn M.M, Pernj y A.B, Gilbcrt, }. Cell Science 39:257, 1979, con permiso de Tlie Company of Bidogists Ltd.)

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CAPITULO 8 Sistemas de la membrana ctopSsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Cadena pesada Cadena ligera

(b)

FIGURA R-38. Trisqueliones de clatrina. Micrografa electrnica de una preparacin sombreada con metal de trisqueiones de clatrina. En el recuadro se muestra el trisquelin compuesto de tres cadenas pesadas. La "extremidad" interna de cada cadena pesada se une a una cadena ligera ms pequea. (Fotografa segn Ernst Ungewickell y Daniel Branton, reproducida con permiso de Nature, vol. 289, p. 421, 1981, copyright 1981, Macmilian Magazines Limited.)

0.1 nm

FIGURA 8-37. Fosilfas revestidas, a) Micrografa electrnica de una rplica tomada de la superficie extracelular de un fibroblasto completo congelado en seco e incubado con LDL y colesterol. Se observan partculas de LDL y colesterol como gotas presumiblemente fijas a receptores localizados sobre la superficie extracelular de la fosilla revestida, b) Micrografa electrnica de una rplica tomada de la swperfide citoplsmica de una fosilla revestida de fibroblasto. Las fosillas revestidas se componen de una red poligonal relativamente aplanada y en relacin con la superficie interna de la membrana plasmtica, c) Micrografa electrnica de la superficie citoplsmica mostrando la membrana plasmtica invagnada y rodeada por una red de clatrina que adopta forma hemisfrica. (Segn ohn Heuser y Louise Evans, ]. Cell Biol. 84:568, 1980; con permiso de Rockefeller University Press.)

no permanezcan en la membrana plasmtica. Las molculas de adaptina empleadas en la membrana plasmtica para formar vesculas revestidas son diferentes de las incorpora-

das en las vesculas revestidas formadas por gemacin a partir de la red trans de Golgi. En la micrografa por fluorescencia de la figura 8-23, b, es evidente la diferente distribucin de estos dos grupos de adaptinas. Al minuto de su formacin, la vescula endoctica revestida pierde su cubierta de clatrina y se convierte en una vescula de superficie lisa que de ordinario se fusiona con un endosoma temprano (pg. 310). En la mayor parte de los casos, el pH bajo del compartimiento endosmico temprano provoca la liberacin del ligando de su receptor. Se cree que la mayor parte de los receptores no enlazados se concentran en una porcin de la membrana que los separa del endosoma y retorna los receptores a la membrana plasmtica (fig. 8-41), donde pueden participar en otro turno de endocitosis. En algunos casos, igual que con la captacin del factor de crecimiento epidrmico (FCE), tanto el receptor como el ligando pueden transportarse al lisosoma para su desdoblamiento. En estos sistemas, la endocitosis sirve como medio para re-

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana toplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

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Rosilla revestida de ctatrina

Lquido extraceluiar

Vescula revestida de clatrina

(a)
FIGURA 8-39. Ensamblado molecular de una vescula revestida, a) Esquema de la incorporacin de triesqueliones en la red externa de clatrina de una vescula revestida, b) Modelo que muestra el empacamiento propuesto de las subunidades de trisquelion. Dos trisqueliones aparecen superpuestos dentro de la red. Cada extremidad de un trisquelion se extiende desde un vrtice a lo largo de los bordes de dos polgonos vecinos y luego retorna al interior con su dominio terminal formando la capa interna observada en esta reconstruccin, (b: Segn G.P.A. Vigers, R.A. Crowther y B.M.F. Pearse, EMBO J. 5:533, 1986, con permiso de Oxford niversity Press.)

guiar el nmero de molculas del receptor localizadas en la superficie de la clula. La vescula revestida (y la vescula no revestida que se origina de ella) se puede imaginar como un sistema de entrega que transporta un ligando especfico desde el espacio extraceluiar a un sitio particular dentro de la clula. En la mayor parte de los casos, el ligando finalmente se entrega a un lisosoma para procesamiento metablico adicional, pero como se ilustra en el siguiente ejemplo, ste no siempre es el caso. Los mamferos recin nacidos dependen de la leche de su madre, que les suministra anticuerpos contra posibles patgenos. Estos anticuerpos se captan en el conducto digestivo donde se enlazan a receptores localizados en f osillas

revestidas situadas en la superficie apical del epitelio intestinal. En vez de ser transportados a un endosoma, las vesculas revestidas que contienen anticuerpos se transportan a travs de toda la longitud de la clula epitelial, donde se

Fosilla revestida

FIGURA 8-40. Las rosillas revestidas facilitan la captacin selectiva de protenas integrales de membrana con sus respectivos ligandos. La captacin de receptores especficos de membrana en la membrana plasmtica ocurre por un mecanismo similar al descrito en la figura 8-23 para el transporte de materiales en vesculas revestidas de clatrina de la red trans de Golgi. La clatrina se ensambla sobre la superficie exterior de la capa de adaptadores que tienen doble funcin: se enlazan a molculas de clatrina sobre la superficie externa y a los extremos citoplsmicos de receptores especficos de membrana sobre su superficie interna. Los receptores de membrana, a su vez, se unen a igandos especficos. Como resultado de estas diferentes interacciones, los complejos de receptor especfico-ligando se incorporan a una vescula recubierta y son transportados al interior de la clula, en tanto que otras protenas de membrana incapaces de enlazarse a los adaptadores permanecen en la membrana plasmtica.

Clatrina ^ Receptor con ligando A Adaptador

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CAPITULO 8 Sistemas de la membrana dtoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana Ester colesterilo Fosfolpdo Colesterol no esterificado Apolipoprotena B-100

FIGURA 8-42. Las LDL de colesterol consisten en casi 1 500 molculas de ster colesterilo rodeadas por una recubierta antiptica de casi 800 fosfolpidos, 500 molculas de colesterol y una sola molcula de apolipoprotena B (peso molecular, 550 kD) que interacta especficamente con el receptor LDL que se proyecta a partir de la membrana plasmtica. Endosoma tardo

Usosoma

FIGURA 8-41. Reciclamiento de receptores de la membrana plasmtica. En el modelo que aqu se muestra, los receptores de la membrana plasmtica se separan de su ligando en un endosoma temprano. Los receptores se renen dentro de una vescula membranosa y retornan a la membrana plasmtica.

fusionan con la membrana plasmtica basal y liberan los anticuerpos en el torrente sanguneo del lactante. LDL y metabolismo del colesterol. Entre muchos ejemlos de endocitosis mediada por receptor, la primera estu-

diada y mejor comprendida es la que suministra colesterol exgeno a las clulas. El colesterol es una molcula hidrfoba que no puede transportarse en la sangre en estado libre. En vez de ello, se transporta como un complejo gigante denominado lipoprotena de baja densidad (LDL), La partcula LDL mostrada en la figura 8-42 contiene un ncleo central de casi 1 500 molculas de colesterol esterificado para formar cidos grasos de cadena larga. Este ncleo est rodeado por una capa de fosfolpidos y sus protenas relacionadas. Los receptores LDL son transportados a la membrana plasmtica, donde se concentran en las fosillas revestidas, incluso en ausencia de ligando. Como consecuencia, los receptores estn "a la espera" sobre la superficie de la clula para captar estas partculas de Hpoprotenas en el momento que estn disponibles. Una vez que las partculas LDL se unen a una fosilla revestida, la fosilla se invagina para formar una vescula revestida, el recubrimeinto de

LA VIA E X P E R I M E N T A L

Endocitosis mediada por receptores


De ordinario, el desarrollo embrionario se inicia con la fusin de un minsculo espermatozoide y un vulo mucho mayor. El vulo se desarrolla a partir de oocitos, que en condiciones tpicas acumulan materia vitelina sintetizada en otra parte del cuerpo de la mujer. Cmo penetran las protenas de peso molecular elevado del material vitelino al oocito? En 1964, Thomas Roth y Keith Porter de la Universidad de Harvard publicaron un trabajo acerca del mecanismo mediante el cual las protenas del material vitelino pueden ser captadas al interior del oocito de mosquito.1 Observaron que durante las etapas de crecimiento rpido del oocito (luego que el animal ingiere sangre) hay incremento espectacular del nmero de depresiones similares a fosillas observadas en la superficie del oocito. Las fosillas formadas por .invaginacin de la superficie de la

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana Clula de msculo liso Macrfago

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=>

Clula endotelial

Lesin al endotelio

Leucocito

Clula espumosa que contiene LDL

Formacin de una placa

FIGURA 8-43. Placa aterosclertica. El proceso causante de la aterosclerosis an no es bien comprendido. En la actualidad se piensa que la formacin de una placa se inicia con la aparicin de una forma oxidada de LDL que atrae clulas de msculo liso y macrfagos. Al parecer, estas clulas ingieren LDL y se depositan como clulas espumosas en la pared de la arteria. E depsito adicional de LDL, combinado con el crecimiento de las clulas de msculo liso en la pared arterial, conduce a la oclusin del vaso.

clatrina se desensambla y los receptores LDL son reciclados de vuelta a la membrana plasmtica (como se muestra en la figura 8-41). Mientras tanto, las partculas LDL se liberan en los lisosomas donde se descompone el componente protenico y se libera colesterol para emplear en la clula en el ensamblado de la membrana o en otros procesos metablicos (p. ej., sntesis de hormonas esteroides). El nmero de receptores LDL presentes en determinada clula es modulado por las necesidades metablicas de la clula. Si sta crece activamente y sintetiza grandes cantidades de membrana o produce hormonas esteroides, la cantidad de receptores aumenta y es mayor el nmero de partculas LDL captadas del medio que las rodea. Los pasos que condujeron al descubrimiento de la endocitosis mediada por receptor y el paso al interior de las LDL se describen con detalle en La va experimental: Endocitosis mediada por receptores. La concentracin de LDL (o el contenido de colesterol) en la sangre guarda estrecha correlacin con el desarrollo de aterosclerosis, padecimiento caracterizado por reduccin del calibre de las arterias. La oclusin arterial es consecuencia de un proceso complejo y mal comprendido que incluye

depsito de placas que contienen LDL en la pared interna de los vasos {fig. 8-43). Adems de reducir el flujo sanguneo, las placas aterosclerticas actan como sitios para la formacin de cogulos sanguneos que pueden impedir por completo el flujo de sangre a travs de un vaso. Los cogulos sanguneos formados en las arterias coronarias son la causa principal de infarto al miocardio (ataque cardiaco). Las LDL no son el nico agente que transporta colesterol en la sangre. Las HDL (lipoprotenas de alta densidad) poseen una estructura similar pero contienen protenas diferentes y desempean un papel fisiolgico distinto en el cuerpo. En tanto las LDL sirven principalmente para llevar molculas de colesterol del hgado, donde son empacadas, a travs de la sangre hacia las clulas del cuerpo, las HDL transportan colesterol en direccin opuesta, desde las clulas del cuerpo hacia el hgado, donde es captado por endocitosis y excretado como parte de la bilis. As como las concentraciones elevadas de LDL se relacionan con mayor riesgo de ataque cardiaco, las concentraciones altas de HDL se asocian a menor riesgo. Las HDL tienen este efecto debido a que permiten al hgado eliminar colesterol de la sangre.

membrana plasmtica estaban cubiertas en su superficie interna por un revestimiento velloso. En una afirmacin proftica, Roth y Porter sugirieron que las rosillas eran "superficies diferenciadas dedicadas exclusivamente a captar protenas y transportarlas al interior del oocito". Postularon que las protenas del material vitelino eran adsorbidas especficamente sobre la superficie externa de la membrana de las fosilfas recubiertas que a continuacin se invaginan para formar vesculas revestidas . Las vesculas revestidas pierden su cubierta vellosa y se fusionan entre s para formar los grandes corpsculos vitelinos enlazados a la membrana caractersticos del oocito maduro. Las primeras observaciones acerca de la estructura de las vesculas revestidas fueron obtenidas en 1969 por Toku Kanaseki y Ken Kadota, de la Universidad de Osaka.2 El examen

con microscopio electrnico de una fraccin vesicular cruda aislada de cerebro de cobayo revel que las vesculas revestidas estaban cubiertas por una redecilla poligonal (fig. VE 8-1). Estos investigadores sugirieron que el revestimiento era un mecanismo para controlar el plegamiento de la membrana plasmtica durante la formacin de vesculas. Los primeros estudios de la naturaleza bioqumica de la vescula revestida fueron publicados en 1975 por Barbara Pearse, del Medical Research Counc en Cambridge, Inglaterra.3 Pearse desarroll un procedimiento mediante el cual las vesculas de membranas del cerebro de cerdo fueron centrifugadas a travs de una sucesin de gradientes de densidad de sacarosa hasta obtener una fraccin purificada de vesculas revestidas. La protena de estas vesculas se solubiliz y fraccion por

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CAPITULO 8 Sistemas de a membrana toplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana

FIGURA VE 8-1. a) Modelo manual de una "canastilla vaca" que forma la red superficial de una vescula revestida, b) Micrografa de alta resolucin electrnica de una canastilla vaca. Los nmeros 5 y 6 representan un pentgono y un hexgono, respectivamente. (Segn Toku Kanaseki y Ken Kadota, J. Cell Biol. 42:226, 1969, con permiso de RockefeUer University Press.)

(a)

electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (EGPA-DSS, seccin 17-7). Los resultados indicaron que el revestimiento contiene una especie predominante de protenas con peso molecular de unos 180 000 daltons (fig. VE 8-2); Pearse denomin clatrna a esta protena. Encontr la misma protena (segn el peso molecular y el mapeo de pptidos) en preparaciones de vesculas revestidas aisladas de diferentes tipos de clulas obtenidas de varas especies de animales.4 Conforme se desarrollaba la investigacin descrita, en 1973 se iniciaba una lnea de estudio aparentemente independiente en los laboratorios de Michael Brown y Joseph Goldstein, en la University of Texas Medical School, en Dallas. Brown y Goldstein se interesaron en la enfermedad hereditaria hipercolesterolemia familiar (HF). Las personas homocigotas para el gen defectuoso (alelo HF) mostraban concentraciones muy elevadas de colesterol en el suero (800 mg/100 mi en comparacin con 200 mg/100 mi para una persona normal), invariablemente desarrollaban obstruccin grave de arterias (aterosclerosis) y en general moran de ataque cardiaco antes de cumplir 20 aos de edad. En aquel tiempo se saba muy poco acerca de los defectos fisiolgicos o bioqumicos fundamentales de esta enfermedad. Brown y Goldstein iniciaron sus estudios de la HF examinando el metabolismo del colesterol en fibroblastos cultivados derivados de la piel de individuos normales e individuos afectados por hipercolesterolemia familiar. Observaron que las lipoprotenas que contienen colesterol (como las LDL) presentes en el medio inhiben la enzima que controla la tasa de biosntesis de colesterol, reductasa HMG-CoA (fig. VE 8-3).5 Por lo tanto, la adicin de LDL al medio de cultivo donde crecan los fibrobastos normales produjo disminucin del nivel de actividad de reductasa HMG-CoA y la correspondiente disminucin de la sntesis de colesterol en los fibroblastos. Cuando se midi la concentracin de reductasa HMG-CoA en fibroblastos derivados de HF se observ que eran 40 a 60 veces mayor que la de fibroblastos en cultivos testigo.6 Adems, la actividad de las enzimas en los fibroblastos de HF no era afectada en absoluto por la presencia de LDL en el medio (fig. VE 8-4). Brown y Goldstein concluyeron que "la anomala gentica primaria no implica al gen estructural de la propia enzima,

180 kD

FIGURA VE 8-2. Electroforesis en gel de poiacrilamida con dodecilsulfato de sodio de varias fracciones obtenidas de cerebro de cerdo. Las primeras tres columnas representan fracciones tomadas de: 1) extracto crudo de tejido cerebral; 2) sobrenadante de una muestra del extracto centrifugado a baja velocidad, y 3) granulo obtenido por centrifugacin de una preparacin cruda que contiene vesculas revestidas. Las ltimas cuatro columnas representan protenas obtenidas de preparaciones purificadas del extracto. Las preparaciones purificadas contienen una especie de protena predominante con peso molecular de 180 000 daltons, a la cual Pearse denomin clatrina. (Segn B.M.F. Pearse, J. Mol. Biol. 97:96, 1975.)

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica; estructura, fundn y trfico de membrana

317

I roo I-

10

20

30

.01 .05.1

10

M HORAS

FRACCIN DEL SUERO (% del vol)

CONCENTRACIN DE PROTEINA (mo/ml)

FIGURA VE 8-3. Actividad de la reductasa HMG-CoA medida luego de aadir la fraccin lipoprotenica de suero de ternera (cuadros claros), suero de ternera no fraccionado (crculos oscuros), o la fraccin no lipoprotenica del suero de ternera (tringulos claros). Es evidente que las lipoprotenas deprimen mucho la actividad de la enzima, en tanto que la fraccin no lipoprotenica tiene poco efecto. (Segn M.S. Brown y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 70:2266, 1973.)

pero se requiere un gen hasta ahora no identificado cuyo producto es necesario para la mediacin del control por retroalimentacin [de reductasa HMG-CoA] por lipoprotenas". Cmo la presencia de lipoprotenas en el medio puede afectar la actividad de una enzima en el citoplasma de clulas cultivadas? Para encontrar la respuesta a esta pregunta, Brown y Goldstein realizaron estudios para determinar la naturaleza de la interaccin entre clulas y lipoprotenas. Comenzaron aadiendo LDL radiactivas a un plato de cultivo que contena una sola capa de fibroblastos derivados de HF o de sujetos humanos normales.7 En tanto los fibroblastos normales se enlazaban con afinidad y especificidad elevadas a molculas de LDL marcadas, las clulas mutantes prcticamente no mostraron capacidad para enlazarse a estas molculas de lipoprotena (fig. VE 8-5). Las pruebas indicaron que las clulas normales poseen un receptor altamente especfico para LDL y que este receptor era defectuoso en las clulas de pacientes con HF. El siguiente paso fue determinar qu ocurre a las LDL despus de enlazarse al receptor. Algunos datos sugirieron que las partculas de LDL enlazadas al receptor eran introducidas a la clula y entregadas a los lisosomas, donde las protenas de las LDL se desdoblaban y se liberaban molculas de colesterol libre para utilizar en el ensamblado de la membrana. Por ejemplo, la prueba del papel de los lisosomas en el procesamiento de LDL se obtuvo utilizando fibroblastos de un paciente con un trastorno por almacenamiento lisosmico (pg. 306) caracterizado por acumulacin de esteres colesteril en sus lisosomas.8 La enfermedad resulta de una deficiencia de la enzima lisosmica lipasa acida, que normalmente separa las molculas de colesterol de los cidos grasos con los cuales se esterifican. En la figura 8-42 se muestra en qu forma se empacan las molculas de colesterol dentro de las partculas de lipoprotenas de baja densidad. A diferencia de los fibroblastos normales, las clulas derivadas

FIGURA VE 8-4. Clulas de fibroblastos de sujetos testigo (crculos oscuros) o de pacientes homocigotos para HF (crculos claros) desarrollados en platos de cultivo que contenan 10% de suero de ternera fetal. Al sexto da (que corresponde a la hora cero de la grfica) se sustituy el medio por un medio fresco que contena 5% de plasma humano deficiente en lipoproteina. Al momento indicado se prepararon los extractos y se midi la actividad de la reductasa HMG-CoA. Considerando a las clulas testigo, es evidente que al inicio del periodo de observacin la enzima tiene muy poca actividad en estas clulas, y la razn es que en el medio hay una cantidad suficiente de lipoprotenas que contienen colesterol que las clulas no necesitan sintetizar por s mismas. Cuando se cambia el medio por plasma deficiente en lipoprotenas, las clulas ya no pueden usar el colesterol procedente del medio y por lo tanto aumenta la cantidad de enzima dentro de la clula. En contraste, las clulas de pacientes iF no respondieron a la presencia ni a la ausencia de lipoprotenas en el medio. (Segn ].L. Goldstein y M.S. Brown, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 70:2805, 1973.)

de un paciente con deficiencia de esta enzima no tienen capacidad para utilizar el colesterol presente en las partculas de LDL aadidas al medio de cultivo (fig. VE 8-6). En consecuencia, las concentraciones de reductasa HMG-CoA se mantuvieron muy elevadas en estas clulas a pesar de la adicin de LDL al medio de cultivo. Estos datos suministran fuertes pruebas de que los esteres externos de colesteril que penetran a la clula como parte de las LDL son suministrados a los lisosomas para liberar colesterol. Para visualizar el proceso de enlace al receptor y el paso al interior, Brown y Goldstein colaboraron con Richard Anderson, quien haba estudiado la estructura celular con el microscopio electrnico. El grupo incub fibroblastos de sujetos normales y enfermos de HF con LDL que presentaban uniones covalentes con la protena ferritina que contiene hierro. Debido a los tomos de hierro, las molculas de ferritina pueden dispersar un rayo de electrones y por lo tanto visualizarse directamente en el microscopio electrnico. Cuando se incubaron fibroblastos normales con LDL y ferritina a 4C, temperatura a la cual los ligandos se pueden enlazar a la superficie celular, pero no pueden ser llevados al interior, las partculas de LDL y ferritina aparecieron enlazadas a la superficie celular. Un examen ms detallado revel que fas partculas de LDL no se distribuyeron al azar sobre la superficie de la clula, sino se localizaron en segmentos cortos (0.5 mm) de la membrana plasmtica,

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30 25

NORMAL

HOMOC1GOTO

Hidrlisis del linoleato colesterilo


40 Normal

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300 450 600 PHI CI-LDL (jg protena/ml)

o 3 4 0 i 2 3 HORAS 4

FIGURA VE 8-5. Tiempo de curso de las LDL radiactivas marcadas con 1251 enlazadas a clulas de un sujeto normal (crculos) y un homocigoto con HF (tringulos) a 4C y 37C. Las clulas se incubaron en un amortiguador que contena 5/tg/mI de 125I-LDL en presencia (crculos y tringulos claros) y ausencia (crculos y tringulos oscuros) de 250/g/ml de LDL no radiactivas. Es evidente que en ausencia de LDL no radiactivas, las clulas normales unen cantidades significativas de LDL marcadas, en tanto que las clulas de pacientes HF no lo hacen. El mismo resultado se observ con ambas temperaturas, lo que indica que el enlace no depende de energa (puesto que a 4C no se forma ATP). El enlace de LDL marcadas se reduce mucho en presencia de LDL no radiactivas, lo que indica que las lipoprotenas no marcadas compiten con las marcadas por los sitios de enlace, y por tanto el enlace de la lipoprotina a las clulas es especfico (o sea, no es resultado de un enlace inespecco). (Segn M.S. Broum y ].L. Goldstein, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 71:790, 1974.)

FIGURA VE 8-6. Ester es colesterilo enlazados a LDL aadidos a extractos de clulas prepa radas a partir de fibroblastos normales (cros de pacientes con enfermedad por almacenamiento lisosmico (tr ngulos oscuros) que carecen de la enzima lisosmica requerida para iberar el colesterol de su forma esterificada. Se indica la tasa de hidr lisis del ster. Los resultados de este tipo implicaron a los lisosomas en la liberacin de colesterol de las partculas de LDL. (Segn j.L. Go dstein y cois. ]. Biol. Chem. 250:8490, 1975.)

donde sta presentaba indentaciones y estaba recubierta por material "velloso" (fig. VE 8-7).9 Estos segmentos de la membrana corresponden a las fosillas recubiertas originalmente descritas por Roth y Porter y encontradas desde entonces en varios tipos de clulas. Aunque se observ que las clulas de pacientes con HF tenan un nmero similar de rosillas recubiertas sobre su superficie, las LDL-ferritina no se enlazaron a estas clulas mutantes. Los resultados apoyan la hiptesis de que el alelo HF mutante codifica un receptor que no puede enlazarse a lipoprotenas de baja densidad. Estudios subsecuentes de microscopa electrnica acerca del paso al interior de las LDL y ferritina revelaron la va endoctica para llevar al interior estas partculas de lipoprotenas, como se describe en el texto.10 Segn estos resultados, el grupo postul que el rpido paso al interior de las LDL enlazadas al receptor depende estrictamente de la localizacin de los receptores de LDL en las fosillas revestidas. De este postulado se deduce que si un receptor de LDL no se localiza dentro de una fosilla revestida, no

tiene capacidad para entregar su ligando enlazado a los lisosomas celulares, y por lo tanto ser incapaz de afectar la biosntesis de colesterol en la clula. En esa poca se descubri un receptor de LDL con una mutacin de tipo diferente. Los receptores de LDL que poseen este defecto (conocido como mutacin J.D., por el paciente en quien se observ) pueden enlazarse a cantidades normales de LDL marcadas con istopo radiactivo, aunque la lipoprotina enlazada al receptor no pase al interior y por consiguiente no pueda llegar a los lisosomas citoplsmicos para su procesamiento.11 Anderson y sus colaboradores postularon que el receptor de LDL es una protena transmembrana que normalmente se localiza en las fosillas revestidas debido a que su dominio citoplsmico se enlaza especficamente a un componente de dichas fosillas revestidas, tal vez clatrina (pero ms tarde se identific como adaptina). Debido al defecto en su dominio citoplsmico, el receptor mutante J.D. no tiene capacidad para ubicarse en las fosillas revestidas de la clula. Las personas con esta mutacin muestran el mismo fenotipo que los pacientes cuyos receptores son incapaces de enlazarse a lipoprotenas de baja densidad. Estudios subsecuentes determinaron que el receptor de LDL normal es una glucoprotena transmembrana de 839 aminocidos; los 50 aminocidos situados sobre el extremo C terminal de la protena se extienden al interior de la membrana como un dominio citoplsmico. El anlisis del receptor mutante J.D. muestra que en esta protena slo hay una sustitucin de aminocido en el dominio citoplsmico; un residuo tirosina localizado normalmente en la posicin 807 es sustituido por una cistena.12 Esta sola alteracin en la secuencia de aminocidos oblitera totalmente la capacidad de la protena para concentrarse en las fosillas revestidas.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

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estos receptores quiz compartan una estructura secundaria similar que servira para que fueran reconocidos por el mismo complejo adaptador de la rosilla revestida (pg. 313). Esta hiptesis ha sido probada en algunos laboratorios que sintetizaron partculas pequeas (por ejemplo, cuatro a nueve aminocidos) correspondientes a las secuencias observadas en las colas citoplsmicas de los receptores que pasan al interior por medio de fosillas recubiertas. Cuando se analizan por espectroscopia de resonancia magntica nuclear, estos pptidos de secuencias diversas adoptan una conformacin muy similar caracterizada por un giro fi apretado con el residuo tirosina esencial localizado en un extremo (fig. VE 8-8).13-14 Las estructuras de este tipo pueden actuar como "anzuelos" que las protenas dejan colgando en las fosillas revestidas conforme las molculas del receptor se mueven entre la bicapa lquida de la membrana plasmtica. FIGURA VE 8-7. Micrografa electrnica que muestra el enlace de las LDL a rosillas revestidas de fibroblastos humanos. Las LDL se hicieron visibles conjugndolas con partculas de ferritina que contienen hierro electrnicamente denso. La barra equivale a 100 nm. (Segn R.G.W. Anderson, M.S. Brown y .L. Goldstein, Cell 10:356, 1977, con permiso de Cell Press.) BIBLIOGRAFA 1. Roth, T.F. y Porter, K.R. 1964. Yolk protein uptake in trie oocyte of the mosquito Aedes aegypti. J. Cell Biol. 20:313-332. 2. Kanaseki, T. y Kadota, K. 1969. The "vesicle in a basket". /. Cell Biol. 42:202-220. 3. Pearse, B.M.F. 1975. Coated vesicles from pig brain: Purification and biochemical characterization. /. Mol Biol. 97:93-96. 4. Pearse, B.M.F. 1976. Clathrin: A unique protein associated with the intracelluar transfer of membrane by coated vesicles. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 73:1255-1259. 5. Brown, M.S., Dana, S.E. y Goldstein, J.L. 1973. Regulaton of HMG CoA reductase activity in human fibroblasts by lipoproteins. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 70:2162-2166. 6. Goldstein, J.L. y Brown, M.S. 1973. Familial hypercholesterolemia: Identification of a defect n the regulation of HMG CoA reductase activity associated with overproduction of cholesterol. Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 70:2804-2808. 7. Brown, M.S. y Goldstein, J.L. 1974. Familial hypercholesterolemia: Detective binding of lipoproteins to cultured fibroblasts associated with impaired regulation of HMG CoA reductase activity. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.'71:7S8-792. 8. Goldstein, J.L. y cois. 1975. Role of lysosomal acid lipase in the metabolism of plasma low density lipoprotein. /. Biol Chem. 250:8457-8495. 9. Anderson, R.G.W., Goldstein, J.L. y Brown, M.S. 1976. Localzation of low density lipoprotein receptors on plasma membrane of normal human fibroblasts and their abscence in cells from a familial hypercholesterolema homozygote. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 73:2434-2438. 10. Anderson, R.G.W., Brown, M.S. y Goldstein, J.L. 1977. Role of the coated endocytic vesicle in the uptake of recept-or-bound low density lipoprotein in human fibroblasts. Cell 10:351-364. 11. Anderson, R.G. W., Goldstein, J.L, y Brown, M.S. 1977. A mutacin that impairs the ability of lipoprotein receptors to localise in coated pits on the cell surface of human fibroblasts. Nature 270:695-699. 12. Davis, C.G. y cois. 1986. The J.D. mutation in familial hypercholesterolema: Arnino acid substitution in cytoplasmic domain impedes internalization of LDL receptors. Cell 45:15-24. 13. Bansal, A. y Gierasch, L.M. 1991. Internalization signal of the LDL receptor adopts a reverse-turn conformation. Cell 67:1195-1201. 14. Eberle, W. y cois. 1991. The essential tyrosine of the internalization signal in lysosomal acid phosphatase is part of a /? turn. Cell 67:1203-1209.

Cuando se hizo esta determinacin en 1986 ya se haba demostrado que algunos otros ligandos penetran a la clula por endocitosis mediada por receptor. Se volvi la atencin a las secuencias de aminocidos de las colas ctoplsmicas de otros receptores localizados en las fosillas revestidas. Haba una "seal comn de paso al interior"? Aunque se encontr que estos receptores no comparten una secuencia comn de aminocidos, muchos de ellos contienen un residuo trosina esencial. Se sugiri que aunque las secuencias pueden diferir,

FIGURA VE 8-8. Ocho tetrapptidos diferentes variantes de una secuencia observada en el dominio citoplsmico de la transferrina y de receptores de LDL. Todos los pptidos aqu mostrados adoptan una conformacin similar de vueltas cerradas que coloca las cadenas laterales de tirosina en posicin similar proyectndose desde el plano hacia la vuelta cerrada, (b: Segn james F. Collawn y cois. Cell 63:1066, 1990, con permiso de Cell Press.)

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CAPITULO 8 Sistemas de a membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

SINOPSIS
El citoplasma de las clulas eucariotas contiene un sistema de organelos membranosos, incluyendo retculo endoplasmico, complejo de Golgi y lisosomas que funcional y estructuralmente se relacionan entre s y con la membrana plasmtica. Estos diferentes organelos membranosos son parte de una red dinmica integrada en la cual se intercambiam materiales en una y otra direccin como parte de vesculas de transporte que se forman por gemacin en un compartimiento y se fusionan con otro. Las membranas y los materiales que encierran se desplazan a travs de la clula en vesculas de transporte a lo largo de vas definidas. Una va biosinttica secretoria lleva protenas desde su sitio de sntesis en el RE a travs del complejo de Golgi a su destino final (un organelo, la membrana plasmtica o el espacio extracelular), en tanto que una va endoctica desplaza material en direccin opuesta desde la membrana plasmtica o el espacio extracelular al interior de la clula. Las vesculas y la carga que encierran son enviadas a su destino apropiado mediante seales especficas que poseen las propias protenas (p, 277), El retculo endoplsmico (RE) es un sistema de tbulos, cisternas y vesculas que dividen el citoplasma en un espacio luminal dentro de las membranas del RE y un espacio citoplsmico por fuera de ellas. El RE se divide en dos tipos muy amplios, el RE rugoso (RER), que de ordinario se presenta como cisternas aplanadas y cuyas membranas tienen ribosomas unidos, y el RE liso (REL), que en condiciones tpicas se muestra como compartimientos tubulares y cuyas membranas carecen de ribosomas. Las funciones del REL varan de una clula a otra e incluyen la sntesis de hormonas esferoides, destoxicacin de una gran variedad de compuestos orgnicos, movilizacin de glucosa a partir de glucosa 6-fosfato, y secuestro de iones calcio. Las funciones del RER son similares en diferentes tipos de clulas; incluyen sntesis de protenas que sern secretadas, protenas lisosmicas, protenas integrales de membrana y lpidos de membrana (p. 280). Las protenas sintetizadas en los ribosomas enlazados a la membrana del RER pueden reconocerse por una secuencia de seales hidrfoba que de ordinario se sita cerca del Nterminal del polipptido naciente. Conforme surge la secuencia de seales del ribosoma, se enlaza a una partcula para reconocimiento de seales (PRS) que detiene la sntesis y acta como etiqueta para mediar el enlace del complejo a un receptor de la PRS presente slo en la membrana del retculo endoplsmico rugoso. Luego del enlace, la PRS se libera de la membrana y el polipptido naciente pasa a travs de un agujero revestido de protena en la membrana del RE hacia el interior de la luz del retculo endoplsmico. Las protenas lisosmicas y secretorias se translocan al interior de la luz del RE en su totalidad, en tanto que las protenas de membrana se integran a la bicapa de lpidos gracias a una o ms secuencias que detienen la transferencia de partculas hidrfobas. Una peptidasa de seal enlazada a la membrana elimina el pptido de seal del polipptido y la protena sufre plegamiento y formacin de enlaces disulfuro con ayuda de protenas que residen en la luz del retculo endoplsmico. Las protenas que no se pliegan correctamente son reconocidas y destruidas. Una vez que la protena recin sintetizada se sita en la luz o en la membrana del RER, puede desplazarse desde ese sitio hasta su destino especfico a lo largo de la va biosinttica (p. 283). La mayor parte de los lpidos de una membrana celular tambin se sintetizan en el RE y se desplazan desde este sitio a diferentes destinos. Los fosfolpidos se sintetizan en la cara citoslica del RE y se introducen en la hoja citoslica de la membrana del retculo endoplsmico. Algunas de estas molculas son transportadas subsecuentemente a la hoja opuesta. La composicin lpida de las membranas est sujeta a modificaciones de varios tipos. Por ejemplo, una protena intercambiadora de fosfolpidos pueden eliminar selectivamente fosfolpidos de la membrana de un organelo y transportarlos a travs del citoplasma, o los grupos ceflicos de lpidos especficos pueden sufrir modificaciones por medios enzimticos (p. La adicin de azcares (glucosilacin) a los residuos asparagina de protenas se inicia en el RE rugoso y contina en el complejo de Golgi. Las secuencias de azcares de las cadenas de oligosacridos de las glucoprotenas son determinadas por el tipo y localizacin de los miembros de una gran familia de glucosiltransferasas, enzimas que transfieren un azcar especfico desde un azcar nucletido donador hasta el aceptor especfico. Las cadenas de carbohidrato se ensamblan en el RE por transferencia de un azcar cada vez al dolicol fosfato, una larga molcula hidrfoba integrada a la membrana. Despus de ensamblado, el oligosacrido central se transfiere en bloque desde el transportador dolicol a un residuo asparagina de polipptido. Casi tan pronto como es transferido el bloque de carbohidratos, se inicia su modificacin, primero eliminando los residuos glucosa terminales. Las vesculas de la membrana, con su carga incluida, sufren un proceso de gemacin en los bordes del RE y se dirigen hacia el complejo de Golgi (p. 289). El complejo de Golgi funciona como una planta de procesamiento, modificando los componentes de la membrana y la carga sintetizada en el RE antes de enviarlos a su destino. El complejo de Golgi tambin es sitio de sntesis de los complejos polisacridos que constituyen la matriz de la pared de clulas vegetales. Cada complejo de Golgi consta de una pila de cisternas aplanadas en forma de placa con rebordes dilatados y relacionadas con vesculas y tbulos. Los materiales entran a la pila en la cara cis y se mueven por transporte vesicular hacia la cara opuesta, o trans. Conforme se desplazan, las glucositransferasas localizadas en las cisternas de Golgi particulares aaden azcares, con frecuencia los aminocidos se modifican y pueden ser eliminadas porciones de polipptidos. Una vez que las protenas alcanzan la red trans de Golgi (RTG) en el extremo de la pila, estn listas para ser clasificadas y enviadas a su destino final celular o extracelular (p. 290). Las vesculas producidas por gemacin del RE y de las cisternas de Golgi estn cubiertas por un revestimiento de protenas (protenas no clatrmas) que se cree desplazan membra-

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as y protenas de manera inespecfica. Se piensa que estas vesculas participan en un proceso de flujo en bloque en el cual membranas, materiales y lquidos se desplazan como partes constitutivas a travs de la clula. Segn este punto de vista, una protena localizada en !a membrana, en la luz del RE o en el complejo de Golgi se transporta "automticamente" de un compartimiento al siguiente y finalmente a la membrana plasmtica, excepto cuando contiene informacin que indica que debe ser retenida en el compartimiento donde reside o cuando se deriva (enva) hacia un destino especfico distinto de la membrana plasmtica, como el lisosoma (p. 294). Las protenas pueden ser retenidas en un compartimiento particular debido a que poseen una seal especfica de retencin, o ser enviadas a un compartimiento ms alejado a lo largo de las vas porque poseen una seal de destino especfico. Las seales de retencin mejor estudiadas operan para mantener protenas solubles o de membrana en el RE. Si estas protenas escapan del RE y alcanzan la cisterna cis de Golgi, son devueltas a su compartimiento apropiado por un mecanismo de reciclamiento mediado por receptor. Se piensa que las yemas vesiculares de un compartimiento donador poseen protenas especficas en sus membranas (miembros de la familia de v-SNARE) que reconocen una protena complementaria {miembros de una familia de t-SNARE) localizadas en el compartimiento especfico (del aceptor). El encuentro de las dos membranas es mediado por las SNARE, en tanto que la fusin de la membrana aparentemente se desencadena por un cambio de conformacin de las protenas enlazadas a GTP luego de la hidrlisis del mismo (p. 296). La clasificacin de protenas en la va biosinttica ocurre sobre todo en os ltimos compartimientos de Golgi, la red trans de Golgi. En el compartimiento de la RTG se originan dos tipos de vesculas: 1) vesculas cubiertas con protenas no clatrina, como las protenas de revestimiento, que mueven material de manera no selectiva y son materiales constitutivos de la membrana plasmtica, y 2) vesculas recubiertas de clatrina que contienen una protena de membrana particular que dirige la vescula a un destino especfico. Las vesculas recubiertas de clatrina transportan cargas especficas en virtud de adaptadores que forman una capa entre la recubierta externa de clatrina y la membrana de la vescula. Una parte del adaptador se enlaza especficamente a la recubierta de clatrina y la otra se enlaza tambin especficamente al extremo citoplsmico de las protenas de membrana, que a su vez se unen a sus correspondientes ligandos dentro de la luz de la vescula (p. 297). Las enzimas lisosmicas producidas en el RER se clasifican en la RTG y son transportadas a su destino por los lisosomas gracias a residuos maosa fosforilados que se encuentran

entre sus cadenas de oligosacridos. Conforme pasan a travs de las cisternas de Golgi, varias enzimas lisosmicas son reconocidas por enzimas que aaden fosfato de glucosamina a ciertos residuos maosa en el centro del oligosacrido. A continuacin la glucosamina es eliminada, dejando residuos maosa fosfato reconocibles por los receptores de membrana en la RTG, que causa que las enzimas se empaquen en las vesculas que se dirigen al lisosoma (p. 299). Los lisosomas son organelos enlazados a la membrana que contienen disposicin diferente de hidrolasas acidas capaces de digerir casi todo tipo de macromolculas biolgicas. Morfolgicamente, los lisosomas muestran un aspecto diverso que refleja la gran variedad de materiales que pueden digerir. Entre sus numerosas funciones, los lisosomas descomponen materiales, como bacterias y desperdicios, que llegan a la clula por fagocitosis; desdoblan organelos citoplsmicos envejecidos por un proceso denominado autofagia y digieren las macromolculas entregadas a travs de los endosomas por un proceso de endoctosis mediado por receptor. En muchos protistas unicelulares, los lisosomas digieren materiales nutrientes ingeridos por fagocitosis, en tanto que en los mamferos y otros animales los lisosomas desempean un papel clave en la defensa inmunolgica (p. 300). Las vacuolas vegetales realizan diversas actividades. Las vacuolas sirven como almacn transitorio para solutos y macromolculas; contienen compuestos txicos empleados para la defensa; suministran un recipiente para desperdicios celulares; mantienen un compartimiento hipertnico que ejerce presin por turgencia contra la pared celular, y son sitios de digestin intracelular mediada por hidrolasas acidas (p. 305). Muchas clulas poseen mecanismos que captan materiales del ambiente extracelular en vesculas citoplsmicas derivadas por invaginacin de la membrana plasmtica. La fagocitosis es la captacin de partculas materiales y la endocitosis es la captacin de lquido, solutos disueltos y macromolculas suspendidas. La fagocitosis puede servir como mecanismo de alimentacin o como un sistema celular de defensa. En la endocitosis mediada por receptor, los ligandos especficos se enlazan a los receptores que se proyectan desde la superficie externa de la membrana plasmtica. Los receptores se renen en fosillas recubiertas de la membrana sobre la superficie citopsmica por un armazn poligonal formada por molculas de clatrina de tres extremidades. La redisposicin de la rejilla de clatrina facilita la formacin de vesculas recubiertas que contienen os materiales llevados al interior. Las vesculas pierden su cubierta, se fusionan con los endosomas y entregan su contenido al lisosoma (p. 308).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Mencionar los organelos que componen la va biosinttica en comparacin con los que forman parte de la va endoctica. 2. Describir las diferencias en una autorradiografa de clulas pancreticas incubada con aminocidos marcados durante cinco minutos y fijadas de inmediato en comparacin

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con una clula marcada y luego seguida durante 40 minutos. Cules son las principales diferencias morfolgicas entre RER y REL? Las principales diferencias en sus funciones? Describir los pasos entre el momento en que un ribosoma se une a un RNA mensajero que codifica una protena secretoria y el momento en que la protena abandona el retculo endoplsmico rugoso. Cmo se introducen a la membrana las protenas integrales recin sintetizadas? Cmo se introducen los lpidos recin sintetizados? Describir algunas de las formas mediante las cuales algunos de los organelos membranosos pueden mantener su composicin nica a pesar del trfico continuo de membranas y materiales que los atraviesan. Describir los pasos que ocurren conforme una protena secretoria soluble, como la enzima digestiva de una clula pancretica, se desplaza desde el RER a la cisterna cis de Golgi. Desde la cisterna cis a la red trans de Golgi. Desde la red trans de Golgi a la membrana plasmtica. Cul es papel del dolicol fosfato en la sntesis de glucopro-

tenas de la membrana? Cul es la secuencia de azcares unidos a la protena determinada? 9. Describir de qu manera el experimento mostrado en la figura 8-18 es un argumento contra el modelo de maduracin para la formacin del complejo de Golgi. 10. Describir la diferencia del papel de las vesculas recubiertas de clatrina y las recubiertas por protenas no de clatrina que se forman en la red trans de Golgi. 11. Qu determina la especificidad de interaccin entre una vescula de transporte y el compartimiento de la membrana con la cual se fusiona? 12. Describir los pasos que aseguran que una enzima Hsosrnica se dirija a un lisosoma y no a una vescula secretoria. 13. En qu difiere el proceso de glucosilacin en el complejo de Golgi del que ocurre en el retculo endoplsmico rugoso? 14. Describir tres funciones distintas de los lisosomas. De vacuolas vegetales 15. Describir los pasos que ocurren entre el enlace de una partcula de LDL a la membrana plasmtica de una clula y la entrada de las molculas de colesterol al citoplasma.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Cul de los siguientes polipptidos, si es que alguno, sera de esperar que careciera de una seal pptida: anticuerpos (IgG, pg. 63), fosfatasa acida, hemoglobina, protenas ribosmicas, glucoforina, protenas del tonoplasto. 2. Supongamos que usted sospecha que un paciente puede sufrir la enfermedad de clula I. Cmo podra decidir si este diagnstico es correcto empleando clulas cultivadas del paciente? 3. En qu compartimiento celular se esperara que una glucoprotena tuviera su mayor contenido de maosa? Es mayor el contenido de N-acetilglucosamina? Es mayor el contenido de cido silico? 4. El sulfato de condroitina es un glucosaminoglicano. Esperara usted encontrar este material en la luz del RER? Por qu si o por qu no? 5. Cules son las tres protenas que se esperara encontrar como componentes integrales de la membrana RER y que estaran ausentes de la REL? Cules son las dos protenas del REL que no estn presentes en el retculo endoplsmico rugoso? 6. Supongamos que se quiere estudiar el proceso de secrecin regulada en una clula que carece de granulos secretorios maduros, o sea, vesculas que contienen material secretorio listo para ser descargado. Cmo se obtendra una clula que careciera de dichos granulos? 7. Qu tipo de anticuerpo se podra emplear para distinguir entre vesculas recubiertas aisladas formadas en la RTG de aqullas formadas en la membrana plasmtica? 8. La autorradiografa depende de partculas emitidas por tomos radiactivos que inciden sobre una emulsin fotogrfica situada en la parte superior de un corte de tejido. Cuando se revela la emulsin, el sitio donde la partcula incide sobre la emulsin aparece como granulo plateado, como en la figura 8-3, a. Cmo piensa usted que el espesor del corte podra afectar la resolucin de la tcnica, o sea, la capacidad para localizar el sitio preciso en a clula donde se incorpora la radiactividad? 9. En qu parte de una clula sera de esperar que se incorporaran primero los siguientes compuestos: 3H-leucina,3Hcido silico, 3H-manosa, 3H-colina, 3H-cido glucurnico (como precursor de GAG),3H-pregnenolona (precursor de hormonas esferoides), 3H-ramosa en una clula vegetal (la ramosa es un precursor de pectinas)? 10. Cul de las siguientes clulas se esperara que participaran de manera ms intensa en la endocitosis a granel: a) un eritrocito; b) una clula acinar pancretica; c) un macrfago? Por qu? 11. Sera de esperar que las propiedades del lado cisternal de las membranas de Golgi sean ms similares al lado extracelular o al lado citoplsmico de la membrana plasmtica? Por qu? 12. Qu compartimiento(s) de una clula se relaciona ms con cada una de las siguientes: clatrina, iones calcio en una clula muscular esqueltica, dolicol fosfato, ribonucleasa y lipasa, digital, receptores de LDL, protenas de revestimiento, partculas para reconocimiento de seales no enlazadas? 13. Si se incuba una rebanada de tejido pancretico con 3Hleucina durante dos horas continuas, en qu parte de las clulas acinares esperara usted que se incorporara la radiactividad? 14. Si usted aadiera un frmaco que interfiere con la capacidad de los ribosomas para enlazarse al RNAm, qu efecto

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana ctoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

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esperara que tuviera sobre la estructura del retculo endoplsmico rugoso? 15. Una de las mejores maneras de estudiar la secuencia de acontecimientos a lo largo de la va biosinttica es infectar una clula con un virus, como el virus de la estomatitis vesicular. Por qu piensa que una infeccin viral se presta a este tipo de estudio? En qu se parece esta tcnica al empleo de un radioistopo?

16. No todos los receptores que contienen endocitosis mediada por receptores se localizan en las fosilas recubiertas antes de enlazarse al ligando, pero se concentran en las fosilas recubiertas antes de ser llevadas al interior. Cmo se supone que el enlace de un ligando al receptor provocara su concentracin en una fosilla recubierta?

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CAPITULO 8 Sistemas de la membrana toplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana Fagocitosis y endocitosis Anderson, R.G.W. 1993. Potocytosis of small molecules and ions by caveolae. Trends Cell Biol. 3:60-72. Brown, M.S. 1984. How LDL receptors influence cholesterol and atherosclerosis. Sci. Am. 251:58-66 (nov.). Rabinovitch, M. y cois. 1995. Phagocytosis. Trends Cell Biol. 5:85-142. Ross, R. 1993. Atherosclerosis: A defense mechanism gone awry. Am. ]. Pathol 143:987-1002. Vaux, D. 1992. The structure of an endocytosis signal. Trends Cell Biol. 2:189-192.

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