BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos cromatográficos II
 CROMATOGRAFIA DE ADSORBCION

Fase fija: sólido

Fase móvil: líquido

Algunos materiales sólidos tienen la capacidad de retener (adsorber)

moléculas en su superficie por fuerzas de atracción débiles no iónicas
(van der Waals, puentes de H) y con distinta fuerza de interacción.

Al pasar la fase móvil, estas diferencias de atracción llevan a una

separación de los analitos.

Grupos funcionales como hidroxilos y grupos aromáticos incrementan

la interacción. Sólo los grupos específicos interactúan con el adsorbente.

Típicos adsorbentes: Sílice (posee grupos silanol Si-OH), carbón, alúmina.

 EJEMPLOS DE CROMATOGRAFIA DE ADSORBCION

Cromatografía con hidroxilapatita: cristales de fosfato de calcio.

Útiles para separación de proteínas y ácidos nucleicos. Como fase
móvil se utiliza amortiguador fosfato a distintas concentraciones.

Cromatografía de interacción hidrofóbica: Utilizada en la

purificación de proteínas basado en la presencia de grupos hidrofóbicos
en la superficie de la proteína que son expuestos al colocar la proteína
en una solución salina concentrada. Como fase estacionaria se usan
grupos alkilo o fenilo unidos a una matriz de sílice o agarosa. La elución
se logra con gradientes de concentración decreciente de sal.
Separación de una mezcla de proteínas
por cromatografía de interacción
hidrofóbica usando distintas fases
estacionarias.

Se eluye con un gradiente descendente

de sulfato de amonio en amortiguador
fosfato.
 CROMATOGRAFIA DE PARTICION

Basada en diferente coeficiente de distribución Kd de los analitos de

la mezcla por la fase fija y móvil.

Fase fija: líquida, adsorbida o unida covalentemente a un soporte

sólido.

Fase móvil: líquida o gaseosa

 TIPOS DE CROMATOGRAFIA DE PARTICION

Cromatografía líquida de fase normal:

La fase estacionaria es polar (p. ej. alkilaminas unidas a sílice), y la

fase móvil es relativamente no polar (p. ej. acetato de etilo). Se eluye
con gradiente de polaridad creciente. El analito menos polar eluye
primero. Utilizada en especial para separar analitos poco solubles en agua.

Cromatografía líquida en fase reversa:

La fase estacionaria es no polar y la fase móvil relativamente polar. La

más común utiliza grupos alkil o aril silanos: butil (C4), octil (C8), fenil
silanos unidos a sílice. La fase móvil utiliza soluciones acuosas,
metanol, acetonitrilo (CH3CN) (o mezclas). La fase fija es inerte y sólo
son posibles interacciones hidrofóbicas con los analitos. Los analitos
polares eluyen primero. HPLC de fase reversa es una forma muy usada
de cromatografía (flexibilidad y alta resolución).
 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
Se basa en la atracción entre partículas de cargas opuestas. Alta
capacidad y poder de resolución. Muy utilizada en la separación
de proteínas, péptidos y aminoácidos.

Resinas de intercambio catiónico: la fase fija (sólida) posee cargas

negativas y atrae partículas con carga positiva.

Resinas de intercambio aniónico: la fase fija (sólida) posee cargas

positivas y atrae partículas de carga negativa.

Etapas del proceso de intercambio iónico: (fase móvil líquida)

- Difusión del ión de la fase móvil a la superficie del intercambiador.
- Difusión del ión por la estructura de la matriz al sitio de intercambio.
- Intercambio de iones en el sitio de intercambio.
- Difusión del ión intercambiado a la superficie.
- Desorbción y difusión a la fase móvil.
EJEMPLOS DE
RESINAS DE
INTERCAMBIO
USO DE UNA RESINA DE INTERCAMBIO CATIONICO
 ALGUNAS CARACTERISTICAS DE LA CROMATOGRAFIA
DE INTERCAMBIO IONICO

Capacidad de intercambio: número de miliequivalentes de iones

intercambiables por unidad de volumen o peso de resina.

Elección de intercambiador: dependerá de la estabilidad de los

analitos (proteínas).

Elución: Para que se una el analito a la resina, el pH debe estar al menos

1 unidad por encima o debajo del pI. Se usan amortiguadores cuya forma
cargada sea igual a la de la resina: (catiónicos, p. ej. Tris con
intercambiadores aniónicos y acetato o fosfato con catiónicos); si los iones
del amortiguador tienen carga opuesta a la resina, participan en el proceso
de intercambio y producen variaciones locales de pH. La elución se realiza
en general por gradiente (de pH, o de preferencia, fuerza iónica).
A: DEAE celulosa (intercambio aniónico)
B: SP (sulfopropil) Sepharose (intercambio catiónico)
C: Q-Sepharose (amina cuaternaria) (intercambio aniónico)
 CROMATOENFOQUE

Se utiliza una resina de intercambio aniónico (con carga +). Se pre-

equilibra la columna con un amortiguador a pH alto (p. ej. 9) y se la
lava con un amortiguador anfotérico (con capacidad tamponante en un
rango de pH, p. ej. 9 a 6) ajustado a pH 6.

El cromatoenfoque utiliza la capacidad amortiguadora del amortiguador

anfotérico y de los grupos cargados de la resina para generar un
gradiente de pH. El eluido de la columna va a ser inicialmente de pH 9
e irá descendiendo a medida que se lava con el amortiguador a pH 6.

Al agregar una proteína a la columna avanzará por el gradiente hasta

alcanzar el pH que corresponde a su pI; allí se focaliza y eluye a ese
pH.
 pH bajo

pH bajo pH alto

pH alto
ex