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  • INTRODUCCIÓN
  • HISTORIA Y DESARROLLO
  • Componentes de la reacción
  • Primers
  • Especificidad
  • Contenido de G/C
  • Secuencia de los extremos 3'
  • Temperatura de Asociación
  • Cálculo de la temperatura de fusión (Tm)
  • Programas de Diseño de Primers
  • Templado
  • La polimerasa
  • Concentración de Magnesio
  • Otros componentes de la reacción
  • Parámetros de la reacción
  • Desnaturalización
  • Alineamiento
  • Termocicladores
  • Identificación de los productos de PCR
  • RT PCR
  • PCR EN TIEMPO REAL
  • Técnicas de detección
  • SYBR greenTM
  • Hairpin probes (Molecular BeaconsTM
  • Hybridization probes
  • Scorpions
  • Cuantificación
  • Genes estándares
  • El efecto de limitar los reactivos
  • PCR competitivos cuantitativos
  • Máquinas para PCR en tiempo real
  • Ventajas del tiempo Real
  • PRIMERS DEGENERADOS
  • Uso de los primers degenerados
  • Diseño de los primers degenerados
  • Alineación de la secuencia
  • Información de la secuencia terminal de aminoácidos
  • Degeneración de primers
  • La Reacción de PCR
  • El cóctel de PCR
  • Problemas Comunes
  • Secuenciación
  • Controles
  • Aspectos Generales
  • Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600
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  • CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR
  • Clonación TA
  • Clonación de extremos romos
  • Clonación direccional a través de primers modificados
  • Clonación de fragmentos largos de DNA
  • MUTAGÉNESIS POR PCR
  • Mutagénesis con PCR-extensión solapada
  • Mutagénesis sitio dirigida
  • APLICACIONES ESPECIALES DE LA PCR
  • BIBLIOGRAFÍA

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS EN BIOTECNOLOGÍA PCR ALUMNOS: CORTAZAR MARTÍNEZ ADRIANA

SILVA RINCÓN ELSA PATRICIA JUNIO, 2004

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ÍNDICE Introducción Historia y Desarrollo Metodología básica Componentes de la reacción Nucleótidos Primers Especificidad Secuencias complementarias Contenido de G/C Secuencia de los extremos 3’ Temperatura de asociación Cálculo de la temperatura de fusión (Tm) Programas de Diseño de Primers Templado Polimerasa Concentración de Magnesio Otros componentes de la reacción Parámetros de la reacción Desnaturalización Alineamiento Extensión Número de ciclos Termocicladores Identificación de los productos de PCR RT PCR PCR en tiempo real Técnicas de detección SYBR greenTM Hydrolysis probes Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Hybridization probes Scorpions Cuantificación Genes estándares El efecto de limitar los reactivos PCR competitivos cuantitativos Máquinas para PCR en tiempo real Ventajas del tiempo Real Primers Degenerados Uso de los primers degenerados Diseño de los primers degenerados Alineación de la secuencia Información de la secuencia terminal de aminoácidos Degeneración de primers 1 2 4 4 4 5 6 6 6 6 6 7 7 8 8 9 9 9 10 10 11 11 12 13 15 16 17 17 18 18 19 20 21 24 24 25 26 27 28 28 29 29 29 29

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La reacción de PCR El cóct el de PCR Los ciclos de PCR (el termociclador) Problemas comunes Secuenciación Controles Long PCR Aspectos Generales Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 Hot Start PCR in situ Principios y Métodos Otras variantes de la PCR Multiplex PCR Nested PCR Clonación de productos de PCR Clonación TA Clonación de extremos romos Clonación direccional a través de primers modificados. Clonación de fragmentos largos de DNA Mutagénesis por PCR Mutagénesis con PCR-extensión solapada Mutagénesis sitio dirigida Aplicaciones especiales de la PCR Bibliografía

29 29 29 30 30 30 30 31 32 32 32 32 33 33 34 34 35 36 36 37 37 37 38 39 40

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INTRODUCCIÓN La biotecnología, en un sentido amplio se puede definir como la aplicación de organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y servicios. La Ingeniería Genética (I.G.), conocida como tecnología del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho. No cabe ninguna duda de que la técnica más revolucionaria de los últimos 15 años ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propia Ingeniería genética y a toda la biología molecular. Fue inventada por Kary Mullis a mediados de los años 80. Muchas de las técnicas clásicas de la Ingeniería genética estaban encaminadas a resolver el complejo problema de cómo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN. Sin embargo, esas técnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no den resultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en principio producir in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la clonación en un organismo huésped. Esencialmente la técnica permite la amplificación selectiva de cualquier segmento de ADN, conociendo las secuencias que lo flanquean. Como alguien ha dicho, "es una técnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un pajar de agujas por amplificación selectiva". Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son prácticamente ilimitadas:
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simplifica muchos experimentos de I.G. permite muchos estudios de expresión genética secuenciación directa de secuencias amplificadas detección de mutaciones seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades diagnósticos de enfermedades genéticas e infecciosas en ciencia forense: identificación de restos biológicos, determinación de paternidad, pruebas periciales en criminalística en arqueología y paleontología

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etcétera. Se trata de la reacción en cadena de la polimerasa. Este método revolucionaría en corto tiempo el conjunto de técnicas de la biología molecular. K. introducido en células en cultivo o en animales de experimentación. 2 . En 1985. Éstos son moléculas de ADN (plásmidos o ADN de bacteriófagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de multiplicarlos dentro de bacterias. En este caso se reconoce la bacteria portadora porque fabrica la proteína codificada por el fragmento de interés. animales y plantas. Una vez aislado el gen no sólo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de bases o analizar en detalle la información de la que es portador. Su uso se extendió rápidamente a miles de laboratorios. Si se conoce un pequeño tramo de la secuencia de aminoácidos de una proteína cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar). Este reconocimiento también se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la proteína resultante del gen que se desea clonar. se pueden diseñar métodos para identificar qué bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. siglas provenientes del inglés Polymerase Chain Reaction. uno de los cuales contendrá el gen de interés. lo que provocó un cambio cualitativo en la comprensión del funcionamiento de la célula. Este método se basa en la introducción de fragmentos de ADN. en vectores. ya clásicas.HISTORIA Y DESARROLLO Kary Mullis Hasta mediados de la década del ochenta. sino que también se puede estudiar su expresión (la manera en que dirige la síntesis de la proteína correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares. sino también de diagnóstico clínico. Mullis. la cual se une específicamente al anticuerpo. han permitido el aislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de microorganismos. ya muy conocida como PCR. no sólo de investigación básica. la única estrategia posible para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". inventó un método para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores y su replicación en bacterias. un investigador de la Corporación Cetus. Estas técnicas.

el término que se ha impuesto) pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El Dr. la ADN polimerasa de este microrganismo. Para replicar el ADN. Cetus anunció un acuerdo de colaborar con Hoffman-LaRoche en el desarrollo y la comercialización de productos de diagnóstico humanos in vitro y de servicios basados en tecnología de PCR. actúa eficientemente entre los 75°C y los 80°C y resiste más de dos horas a 93°C. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro. en realidad. Cuando el proceso era manual la técnica de PCR era lenta y requería de trabajo intensivo. La primera máquina termocicladora. 3 . los científicos alcanzan la primera amplificación y detección simultánea de las secuencias específicas de DNA usando un colorante fluorescente. los científicos de Cetus comenzaron a buscar las maneras de automatizar el proceso. este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplazó por su equivalente de la bacteria "termófila" Thermus aquaticus. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. La purificación de la polimerasa de Taq dio lugar a la necesidad de una máquina que realizara un ciclo más rápidamente entre diversas temperaturas. Cycle" fue creada por los ingenieros de Cetus para tratar esa necesidad de agregar la enzima fresca a cada tubo de prueba después del calentamiento y del proceso de enfriamiento. por lo cual debía agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Por lo tanto. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura requerida para desnaturalizar la doble cadena del ADN. en un principio. En efecto. Sin embargo. de la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. sino que puede ser parte de mezclas complejas. En 1989. En 1985.Esta técnica permite multiplicar ("amplificar" es. adquiere los derechos y las patentes mundiales de la PCR. poniendo el fundamento para la PCR en tiempo real o PCR "cinético" (pruebas TaqMan). En 1990. denominada Taq polimerasa. "Mr. Cetus se asoció con la corporación Perkin-Elmer e introdujo la DNA Termal Cycler. De esta manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reacción en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarán los ciclos térmicos programados. En 1991 Hoffmann-La Roche Inc. la técnica PCR hizo uso. Kary Mullis comparte el premio Nobel de Química en 1993 por inventar la tecnología de PCR.

METODOLOGÍA BÁSICA Componentes de la reacción Los nucleótidos Los nucleótidos se diluyen en agua. 4 . la solución debe ser protegida (por ejemplo con el 10mM Tris pH 7. Si no. un pH ácido promoverá la hidrólisis del dNTP en dNDP y dNMP y los hará inútiles para las reacciones de polimerización de la DNA enzimática. concentración final) . alicuotados y almacenados a -20 ºC. La estabilidad de los dNTP durante ciclos repetidos de PCR es tal que aproximadamente el 50% permanece como dNTP después de 50 ciclos.0 . Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP.7-8. Los stocks son diluidos a 10 mM.

De este paso depende el éxito en el laboratorio. un codón de inicio ATG. resultando en un bajo rendimiento del producto deseado. Los productos no específicos y los dímeros de primers son por si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por la enzima. la posición de los iniciadores debe ser relativa a los codones de inicio y terminación. Se debe decidir la mas baja concentración adecuad de dNTP para la longitud y composición de la secuencia blanco. Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5’ o “mismatches” para incorporar sitios de enzimas de restricción. Por ejemplo.6 µg de DNA o 100 pM de una secuencia de 400 bp. Es recomendable que el cebador "forward" se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia que codifica. 20 µM de cada dNTP en una reacción de 100 µl es suficiente para sintetizar 2. La selección de oligonucleótidos iniciadores es muy importante en la reacción en cadena de la polimerasa.Concentraciones entre 20 y 200 µM resultan en un balance óptimo entre rendimiento. o secuencias promotoras en la secuencia blanco. Criterios Principales Tamaño Base en el extremo 3' Tamaño ideal: 20-25 nucleótidos de longitud generalmente: 18-30 nucleótidos de longitud Debe ser una G o una C Temperaturas de fusión 50-65 ºC (Tm) contenido GC auto-complementariedad Similaridad 40-60% Debe ser evitada Para minimizar la formación de estructuras secundarias y los dimeros de primer Debe tener un 100% de apareamiento con el molde Cuando el objetivo a amplificar es un locus.5 µM. Tabla 1. especificidad y fidelidad. 5 . Las concentraciones óptimas de los primers son generalmente entre 0. En la tabla 1 se muestran los criterios principales a considerar para la selección adecuada de los primers. dNTPs y primers. Altas concentraciones de primer pueden promover “mispriming” y acumulación de producto no específico y puede incrementar la probabilidad de generar un templado independiente llamado dímero de primer. Los cuatro dNTP deben ser usados en concentraciones equivalentes para minimizar errores de incorporación de bases. Primers Los oligonucleótidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN. de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb despues de la región que codifica.1 y 0. Pueden ser usados primers degenerados para extraer genes nuevos en base a su similitud o su secuencia de aminoácidos.

Esto pondrá la Tm en la gama de 56°C . En este caso la substitución de dGTP por 7-deazo-2’deoxiGTP ha sido muy usada Especificidad La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. La inclusión de un residuo de G o de C en el extremo 3' de los primers ayuda a asegurar el correcto enlace en el extremo terminal 3' debido al enlace de hidrógeno más fuerte de los residuos G/C. Si un primer tiene tal región de homología se formarán estructuras parciales de doble cadena que interferirán con el alineamiento. Contenido de G/C La composición base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. Las regiones poliA y poliT deben también ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. prevendrá la formación del producto deseado por competición. aproximadamente. el mismo primer puede dar una sola banda si se amplifica una sola clona de una biblioteca genómica. a menudo. Esto puede bajar la eficacia de la amplificación. Existen muchos métodos para calcular la temperatura de fusión. Secuencia de los extremos 3' Es establecido que la posición terminal 3' en primers de PCR es esencial para el control del “mispriming”. Si la homología ocurre en el extremo 3' de cualquier primer. ocurrirá la formación de dímeros de primer que. También ayuda a mejorar la eficacia de la reacción reduciendo al mínimo la respiración que pudo ocurrir. Sin embargo. El primer tendrá un contenido de G/C del 50% y ~20 bases de largo. Se recomienda que se emplee como temperatura de asociación la temperatura de fusión -5ºC.62°C. Los primers deben ser elegidos de modo que tengan una secuencia única dentro del DNA que será amplificado. Temperatura de Asociación La temperatura de asociación de los primers es uno de los factores más determinantes de la reacción. La secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de poliC que pueden promover el reconocimiento no específico. 6 . Secuencias Complementarias del primer Los primers necesitan ser diseñados con menos de 3 pares de bases de homología entre ellos.Una razón menos obvia por la que los primers fallan es la presencia de estructuras secundarias en el templado de DNA. pero siempre. Un primer diseñado con una secuencia altamente repetida dará lugar a productos no deseados. después de efectuado el cálculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociación cercanas a la temperatura de fusión para determinar la temperatura óptima para cada reacción.

típica de "dot blot" y otros ensayos de hibridización A continuación tenemos otra expresión para el cálculo de Tm Tm = 81.html 7 .500/L + 16. existe la siguiente aproximación: Tm = 2ºC (A + T) + 4ºC (G + C) donde se asume una concentración de sal de 0.K-1mol-1). donde L se refiere a la longitud del oligonucleótido. Los cambios en la entalpía ( ) y la entropía ( ) de la formación del dúplex se calculan a partir de parámetros termodinámicos de vecindades.6 log[M].edu/rawprimer.wi. y C es la concentración molar del oligonucleótido. Programas de Diseño de Primers Existen programas disponibles en la red que ayudan al diseño de primers. Para secuencias de 20 bp o menos.mit. El método mas preciso para estimar la Tm de oligornucleótidos está basado en el análisis termodinámico del proceso de fusión del cual se puede mostrar que. Esta fórmulas es únicamente aplicable a secuencias polinucleotídicas largas.umn.Cálculo de la temperatura de fusión (Tm) Existen muchos métodos para estimar el valor de la temperatura de fusión.med. y [M] es la concentración de cationes monovalentes. Se puede adicionar un segundo término a la ecuación anterior para tener en cuenta el efecto estabilizante de la sal sobre el dúplex: Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los márgenes del error experimental. R es la constante molar de los gases (1.cgi http://alces.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.9M.41(%GC) . Por ejemplo: http://frodo.987 cal.5 + 0.

Tabla 2.d. Cuando se optimiza un PCR.d. n. y si es muy baja se formara una cantidad insuficiente del producto deseado. se recomienda probar rangos de concentración de enzima de 0. c Número promedio de nucleótidos adicionados antes de la disociación. d Número promedio de nucléotidos adicionados por segundo.5 unidades (SA = 20 unidades/pmol) por 100 µl de reacción cuando los otros parámetros son óptimos. Si la concentración de la enzima es muy alta se acumulan productos no específicos. los requerimientos de enzima pueden variar con respecto a la secuencia blanco o los primers. = no determinado b 8 .Templado Una de las características más atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad de la muestra de DNA sujeta a amplificación no necesita ser alta.5 a 5 unidades/100 µl. 30 c Tasa de Extensiónd 75 67 n.d. Procesividad 55 7 n. El criterio esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que abarque la región que va a ser amplificada y que las impurezas sean suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerización. 60 3’ a 5’ exo no si si no 5’ a 3’ exo si no no si Porcentaje de conversión de templado a producto por ciclo. Sin embargo. Tasa de errorb 2x10-4 4x10-5 7x10-7 n. La polimerasa Un rango de concentración recomendado para Taq polimerasa (Perkin-Elmer CETUR) es entre 1 y 2.d. Características de algunas polimerasas termoestables de DNA Enzima Taq Pol Tli Pol (Vent) Pfu Pol Ruth a Eficiencia Relativaa 88 70 60 n. Una sola célula o un lisado celular crudo o especimenes con una longitud promedio de unos pocos cientos de pares de bases son usualmente adecuadas para una amplificación exitosa.d. Frecuencia de error por pares de bases incorporadas.

05 a 0.021/ºC sin embargo el verdadero pH de una buffer 20mM de Tris (pH 8. Tris es un buffer iónico bipolar que tiene un pKa de 8. sin embargo muchos protocolos trabajan bien sin estos componentes. Esto hace posible. la formación de dímeros de primer y la actividad y fidelidad de la enzima. los primers y los dNTPs.3 a 20ºC y un _ pKa de -0. La PCR es un proceso que consta de tres pasos. NaCl a 50 mM o KCl arriba de 50 mM inhibe la actividad de la Taq polimerasa. ya que afecta: el alineamiento de los primers. Parámetros de la reacción Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicación del ADN. La presencia de EDTA u otros quelantes en el stock del primer o del templado puede alterar la concentración óptima aparente de magnesio.Concentración de Magnesio Es benéfico optimizar la concentración del ión magnesio. a través de la acción de la polimerasa. si de forma voluntaria le proponemos una pequeña fracción de oligonucleótidos que sean complementarios de una porción. tanto del templado como del producto de PCR. la temperatura de disociación de las cadenas.8 y 6.3 a 20ºC) varia entre 7. 9 . Para ello necesita al menos una pequeña fracción de cadena doble de ADN para iniciar la síntesis. La gelatina o la albúmina bovina (100 µg/ml) y detergentes no iónicos como el tween 20 o laureth 12 (0. La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unión con el templado. se unirá después de la desnaturalización de la doble cadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3´ del DNA por aposición de los nucleótidos correspondientes suministrados y. que como se sabe es la enzima que dirige la síntesis de ADN. Hasta 50 mM de KCl puede ser incluido en la mezcla de reacción para facilitar el alineamiento de los primers.8 durante las condiciones típicas del termociclador. Está basado en la acción de la polimerasa.1% ) son incluidos para ayudar a estabilizar la enzima. se hace la amplificación del fragmento deseado.8). la especificidad del producto. Otros componentes de la reacción Un buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl (pH entre 8.5 a 2. y desde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. Los PCR deben contener 0.5 mM de magnesio sobre el total de la concentración de dNTP.3 -8.

10 . Una temperatura de alineamiento óptima es 5ºC por debajo de la Tm de los primers. la extensión de los primers puede ocurrir a bajas temperaturas incluyendo el paso de alineamiento. sin embargo temperaturas más altas pueden ser apropiadas especialmente para templados ricos en G + C. Debido a que las DNA polimerasas son activas en un amplio rango de temperaturas. Las condiciones típicas de desnaturalización son 95ºC por 30 segundos. La temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers depende de la composición. La primera reacción consiste en la desnaturalización del DNA. o 97ºC por 15 segundos.Desnaturalización. separándose las dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno. La desnaturalización incompleta permite el apareamiento de las hebras de DNA y por lo tanto se reduce el rendimiento el producto. La segunda reacción consiste en la hibridación de los primers. Para ello se baja la temperatura y las condiciones serán tales que se facilitará la unión de los primers a las cadenas. Alineamiento. En contraste. los pasos de desnaturalización a altas temperaturas o por mucho tiempo provocan perdida de la actividad de la enzima. tamaño y concentración de los primers amplificadores. El rango de actividad de las enzimas varia en dos ordenes de magnitud entre 20 y 85ºC. Las temperaturas de alineamiento en el rango de 55 a 72ºC genera buenos resultados.

permite obtener. El número óptimo de ciclos dependerá principalmente de la concentración inicial del templado cuando los otros parámetros son optimizados. ya que esto puede incrementar la cantidad y complejidad de productos no específicos. como resultado de un experimento de amplificación. Pocos ciclos dan como resultado un bajo rendimiento del producto. La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR. Así. La extensión del primer se realiza tradicionalmente a 72ºC. después de N ciclos tendremos 2N. según lo demostrado en la Tabla 3. Después de cada ciclo. por ejemplo. la cantidad de DNA es dos veces la anterior.2 x 2 x 2 veces u 8 (23) veces la cantidad inicial. Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. Un tiempo de extensión de un minuto es considerado suficiente para productos de hasta 2 kb de longitud. después de 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 veces o 16 (24). La repetición de este ciclo unas 40 veces. tiempos mayores de extensión pueden ser útiles cuando la concentración del sustrato es muy pequeña o cuando la concentración del producto excede la concentración de la enzima. Las estimaciones para la tasa de incorporación de nucleótidos a 2ºC varia de 35 a 100 nucleótidos por segundo dependiendo del buffer.Extensión. concentración de sales y la naturaleza del templado. después de 3 ciclos . La tercera reacción se efectúa a 72º C. temperatura a la cual. Un error común es el de ejecutar demasiados ciclos. así que después de dos ciclos tenemos 2 x 2 veces. la polimerasa lleva a cabo su acción. 11 . insertando los diferentes nucleótidos complementarios en el orden que le va indicando la cadena que actúa como molde. Sin embargo. Número de ciclos. millones de copias del fragmento de interés. El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuencia blanco y de la temperatura. pH.

gracias al denominado sistema Peltier. y 12 . aunque las características principales son las siguientes: • Constan de un bloque térmico. Termocicladores El termociclador es el aparato que permite llevar a cabo de forma automática y reproducible la sucesión de ciclos de temperatura necesarios para la PCR. Los actuales constan.Tabla 3. básicamente. con posibilidad de programar las temperaturas y los tiempos. cuyo calentamiento y enfriamiento se produce a gran velocidad. Las rampas de subida y bajada de temperatura son importantes para trasladar los protocolos entre termocicladores. Relación entre cantidad de DNA y el número de ciclos. de un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado. Existen multitud de termocicladores en el mercado. Los primeros termocicladores eran robots que movían una gradilla de tubos entre varios baños termostáticos a tiempos preestablecidos.

tampoco es aconsejable. es decir. están diseñados mayoritariamente para tubos de 0. que actúa como soporte sólido (Southern blot). pero 15ºC también es una temperatura apta para ello. Así. lo que hace que deban ajustarse de nuevo las condiciones de tiempos y temperaturas. que se unirá al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta ser complementaria del mismo. cuya secuencia de bases esté contenida en el fragmento de interés. las rampas. una vez que la reacción ha finalizado. la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridación (unión complementaria) con una sonda marcada radiactivamente.2 ml aunque aún existen también para 0. y luego es puesto en contacto con la sonda. Respecto a llegar a 100ºC o más. El rango de temperaturas suele abarcar de 4ºC a 110ºC. También es posible colocar el ADN directamente en la membrana en forma de pequeñas manchas (dot blot) para su posterior hibridación con la 13 .uno de los factores de falta de reproducibilidad. pero es un elemento indispensable para evitar la evaporación de la muestra. • Tapa térmica: los más antiguos no la poseen. Se dice que tienen función gradiente. o cuando se necesitan realizar diversos protocolos de forma simultánea. especialmente de temperaturas de hibridación. Por otra parte. Existen bloques que permiten ajustar distintas temperaturas en función de las zonas del mismo. Cada termociclador tiene su propio software. a un proceso de separación por difusión bajo la acción de un campo eléctrico. Los 4ºC se utilizan para refrigerar muestras tras una PCR. al menos. se recomienda utilizar los de la misma marca que el fabricante. es decir. Por ello. Son muy útiles cuando se realiza ajuste continuo de programas de PCR. Software para programación de tiempos y temperaturas: se denomina programa a cada conjunto de datos térmicos y temporales de un protocolo de PCR. al contactar totalmente con la tapa del tubo. Actualmente. aunque el rango habitual debe ser de 15ºC a 95ºC. Puede ajustarse también la velocidad de subida y bajada de temperaturas. de forma habitual. En este caso se procede así: el ADN fraccionado por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon. Es importante el perfecto ajuste del tubo en el bloque.5 ml. Identificación de los productos de PCR • El hecho de que las moléculas de ADN obtenidas al finalizar la reacción en cadena correspondan efectivamente al fragmento de interés queda asegurado por la intervención de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese fragmento. Es preferible emplear termobloques para llevar a cabo esta labor. No debe sobrecargarse al aparato con temperaturas extremas para prolongar su supervivencia. el tamaño del fragmento multiplicado puede determinarse sometiendo los productos de la reacción a una electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida.

Ésta quedará fijada donde se encuentre el tramo de ADN de interés y su presencia se revelará a través de una autorradiografía (placa fotográfica sensible a la emisión radiactiva de la sonda). A: visualización directa.sonda. Al finalizar la primera. Método análogo al anterior. 14 . Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la acción de un campo eléctrico (electroforesis) migran de una manera característica que se puede visualizar por tinción (coloreado) del ADN.) B: Southern blot. El ADN es desnaturalizado (separación de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridación (unión) con una sonda radiactiva. (Carriles 1-8: productos de distintas PCRs. Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la técnica PCR. La determinación del tamaño al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos en contacto con la enzima de restricción adecuada indica que nos encontramos ante los segmentos de interés. en ambos casos. Mediante el empleo de esta metodología. los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por ciertas enzimas llamadas en endonucleasas de restricción. pero practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente desnaturalizados. una alícuota de la misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicación tras haber colocado dos primers internos. la filiación de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de que poseen tamaños previsibles. conocida como nested PCR (PCR anidada). La localización de las sondas radiactivas se logra. C: dot blot. carril M: marcadores de ADN de tamaño conocido. mediante autorradiografías Figura 1. En algunos casos.

Se adiciona una mezcla de PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa). En PCR en tiempo real. Esto elimina el mRNA permitiendo que la segunda hebra de DNA sea formada. Conversión de mRNA a cDNA por la transcriptasa reversa El cDNA se desnaturaliza a mas de 90º (~94º). Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del primer mediante la incorporación de nucleótidos complementarios. pero generalmente se encuentran a 100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real A 72ª la polimerasa extiende el DNA desde los primers. los primers específicos para el gen de interés. es necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR.RT PCR Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor. A 50 o 60º los primers específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA. los deoxinucleótidos y un buffer conveniente. PCR. Los pasos de la RT-PCR son: 1. 3. pero esta copia es DNA complementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología PCR. Transcripción reversa: Unión del primer a la secuencia de RNA objetivo. las dos hebras se separan. se utiliza generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. El mRNA es copiado a cDNA por la transcriptasa reversa usando un primer dT (los primers al azar se pueden también utilizar)(Figura 2). Figura 2. 2. Se obtienen 4 cadenas de cDNA. Fin de transcripción reversa. La transcripción reversa genera una copia de la hebra de RNA. 4. 15 . Los sitios de unión a los primers deben estar separados 400 bases.

PCR EN TIEMPO REAL La RT-PCR es solamente semicuantitativa en el mejor de los casos. El SYBR green fluoresce brillantemente solo cuando se une a DNA de doble cadena. Figura 3. El gel se tiñe con bromuro de etidio. que son mucho más fluorescentes que el bromuro de etidio. como el SYBR green. se utilizan en el PCR en tiempo real (Figura 3). Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro. Así la PCR en tiempo real fue desarrollado debido a: • • La necesidad de cuantificar diferencias en la expresión del mRNA La disponibilidad de cantidades pequeñas de mRNA en algunos procedimientos. El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de DNA intercalandose entre los pares de bases. en parte por la insensibilidad del bromuro de etidio (sin embargo. Hay una variedad de métodos para la cuantificación del mRNA. Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos permite la cuantificación ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la etapa logarítmica de amplificación.Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de cDNA. Otros colorantes. los productos de reacción son analizdos usualmente por electroforesis en gel de agarosa. hay maneras más sensibles de detectar el producto). Éstos incluyen: − − − − northern blotting análisis de protección de ribonucleasa (RPA) hibridación in situ PCR 16 . la fluorescencia no es muy brillante. Los protocolos de PCR competitivos se han desarrollado para hacer el método más cuantitativo pero son a menudo complicados. Sin embargo.

sensible. mientras que la hibridación in situ es cualitativo más que cuantitativo. Técnicas de detección La química de la detección está dada por: • • • • Agentes intercalantes fluorescentes (SYBR Green) Sondas hidrolizadas Hairpin probes (Molecular Beacons. el empleo de un termociclador que tiene acoplado un sistema de detección que es capaz de adquirir y cuantificar la señal emitida por el reportero al final de cada ciclo para cada muestra. Las técnicas tales como el northern blotting y los RPAs trabajan muy bien. Los productos de amplificación se observan a medida que transcurren los ciclos de la PCR. Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la relativa facilidad y conveniencia de su uso comparadas a algunos métodos más viejos. cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR en la reacción. Sin embargo. Scorpions) Sondas de hibridización. fácil de usar. versátil y no se necesitan sondas específicas. En contraste con la RT-PCR y el análisis de los geles de agarosa.La PCR es el método más sensible y puede discriminar entre mRNAs cercanamente relacionados. la PCR tradicional es solamente semicuantitativa en parte debido a las dificultades de observar la reacción durante la parte verdaderamente linear del proceso de la amplificación. puesto que el hecho de que la PCR implica un paso amplificación significa que es más sensible. Es simple y económico. Es una técnico simple pero es difícil conseguir resultados verdaderamente cuantitativos usando PCR convencional. El northern blotting y RPAs son patrones excelentes. Sin embargo durante la reacción de PCR puede unirse a dímeros de primers 17 . puesto que no hay amplificación implicada. SYBR greenTM Es un agente intercalante que se une al ADN de doble cadena dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR. la PCR en tiempo real da resultados cuantitativos. Los métodos de PCR son por lo tanto particularmente valiosos cuando las cantidades de RNA son bajas. Está basado en: • • la detección y cuantificación de un reportero fluorescente. pero requieren más RNA del que a veces se dispone.

Hydrolysis probes Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Estas sondas poseen secuencias repetidas invertidas (ITR) en sus extremos 5´y 3´. dirigiendo así la hibridación específica. Figura 4. la actividad exonucleasa de la Taq polimerasa corta al fotocromo reportero del resto de la sonda. Hydrolysis probes (TaqManTM) Se emplea una sonda que tiene unidos un fotocromo reportero y un fotocromo quencher. el reportero no emite señal. resultando en una sobreestimación de la concentración del DNA blanco. Cuando ambos fotocromos están unidos a la sonda. cuando la sonda hibrida con la secuencia de interés durante la reacción de PCR. Este diseño permite que se forme una estructura de horquilla (hairpin) por complementariedad de las dos regiones ITR.y a otros productos inespecíficos. Pero. permitiendo la emisión una señal fluorescente (Figura 4). 18 . La secuencia interna de la sonda es complementaria al blanco. en ausencia de la secuencia blanco. resultando en una eficiente separación del quencher y del reportero y la consecuente emisión de este último (Figura 5). Se monitorea la señal fluorescente del reportero que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR.

Se requiere de un riguroso diseño de las regiones tallo y asa de la horquilla. el extremo 3´de la sonda donadora con fluoresceína y el extremo 5´de la sonda aceptor con LC Red 640 o LC Red 705 (Figura 6).Figura 5. 19 . siendo la distancia óptima de 1 a 5 bases entre las sondas. Hybridization probes El diseño implica el uso de dos secuencias de oligonucleótidos específicos como sondas. la transferencia de energía de resonancia sólo ocurre cuando ambas sondas se hibridan al blanco muy próximas entre sí. Las dos sondas están diseñadas para hibridar en sus blancos específicos en un arreglo cabeza-cola que permite que ambos fluoróforos estén en estrecha proximidad entre sí. Así. Funcionamiento de las Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Entre sus ventajas están el que son más específicas que las sondas TaqMan (deben tener un cambio conformacional para hibridar con el blanco). comúnmente. cada una marcada con un fluoróforo diferente. permiten distinguir dos secuencias blanco muy similares entre sí y que se pueden combinar varias Molecular Beacons en una única reacción empleando diferentes compuestos fluorescentes para identificar secuencias blanco específicas distintas (Múltiplex PCR).

20 . la interacción es intermolecular. Como la cola del scorpion y del producto de PCR es ahora parte de la misma hebra de DNA. Hybridization probes En comparación con las otras dos técnicas. Durante la PCR. la secuencia de la sonda en la cola del Scorpion se enrosca para hibridarse a la secuencia blanco en el producto de PCR. Scorpions Los scorpions son primers de PCR con una cola tallo y asa ("Stem-Loop") que contiene un fluoróforo y un quencher. Esto hace que sean más fáciles de sintetizar y caracterizar.Figura 6. estas sondas están marcadas con un único fluorocromo. y que el control de calidad sea más sencillo que para las sondas doblemente marcadas. La secuencia blanco se elige típicamente para estar 3 bases dentro del extremo 3' del primer scorpion. los primers de scorpions se amplifican para formar productos de PCR. La estructura de tallo y asa es separada de la secuencia de del primer de PCR por una modificación química que evita que se copie la secuencia de tallo y asa del scorpion (Figura 7). En la etapa apropiada del ciclo de PCR (la fase de alineamiento).

Esto define la línea de fondo para el diagrama de la amplificación. Un diagrama de amplificación es una gráfica de la señal de la fluorescencia contra el número de ciclos. más pronto se observa el aumento significativo en la fluorescencia. Scorpions Cuantificación La capacidad de monitorear el progreso en tiempo real de la PCR revolucionó totalmente la manera de cuantificación basada en la PCR de DNA y de RNA. Figura 8. En los ciclos iniciales de PCR. Las reacciones son caracterizadas en el momento en el que la amplificación de un producto de PCR se detecta después de un número fijo de ciclos. Un aumento en fluorescencia sobre la línea de fondo indica la detección del producto acumulado de PCR. Diagrama de Amplificación 21 . En la figura 8 se muestra un diagrama representativo de la amplificación. hay un pequeño cambio en señal de fluorescencia. Cuanto más alto es el número de copias del blanco.Figura 7.

menor Ct medido. y de la determinación del número de copias iniciales para las muestras es realizado por el software del sistema 5700 y 7700. El Ct está determinado en la fase exponencial de la reacción y es más confiable que las mediciones en el punto final convencionales (Figura 9). El proceso entero de calcular los Cts. Ciclo Umbral (Ct) La gráfica del logaritmo del número inicial de copias del blanco para un sistema de estándares contra Ct es una línea recta (Figura 10). Figura 10. de preparar una curva estándar.Se adquieren los datos cuando la amplificación está todavía en la fase exponencial. Curva Estándar 22 . Este número de ciclo se llama ciclo umbral (Ct: threshold cycle). Figura 9. El Ct es inversamente proporcional al número de copias del DNA blanco: a mayor concentración de blanco. La cuantificación de la cantidad de blanco en muestras desconocidas es lograda midiendo Ct y usando la curva estándar para determinar el inicio del número de copias. Esto está determinado por la identificación del número de ciclo al cual la intensidad de emisión del fluoróforo aumenta con respecto al ruido de fondo (background).

La figura 11b muestra los mismos datos. y más bajo es el valor de Ct. el cambio en la fluorescencia del SYBR Green se grafica contra el número de ciclos. Cuanto más alta es la cantidad inicial de DNA genómico. usando el sistema 5700. En esta figura. El software del sistema 5700 calcula el Ct para cada reacción. Se corrieron seis réplicas para cada cantidad de DNA. pero graficando el logaritmo del cambio en la fluorescencia contra el número de ciclos. los componentes de la reacción no están limitados y las reacciones de replicación exhiben resultados reproducibles y uniformes. Estos tres diagramas ilustran los principios básicos de la cuantificación en tiempo real de PCR. del gen humano de la β-actinia en diluciones de DNA genómico. Amplificación de la β-actinia. mas pronto se detecta el producto acumulado en el proceso de PCR. Los valores de Ct son reproducibles en las réplicas porque el umbral se escoge en la fase exponencial de la PCR. En la fase exponencial. 23 .La figura 11a muestra la amplificación. Esto se demuestra en la figura 11b donde el umbral intersecta la gráfica de amplificación en la región donde hay una relación lineal entre el logaritmo del cambio en fluorescencia y el número del ciclo. Los valores de Ct se trazan contra el logaritmo de la cantidad inicial de DNA genómico para dar la curva estándar mostrada en la figura 11c Figura 11.

Esto conduce a una mayor precisión en la cuantificación del DNA y del RNA. Arbp o fosfoproteína ribosomal ácida P0. Si es posible. 24 . P0). los valores de Ct son muy reproducibles para las reacciones que comienzan con el mismo número de copias. Estándares usados comúnmente: • • • • • • mRNA de Gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa mRNA de Beta actina mRNA de MHC I (complejo de mayor histocompatibilidad I) mRNA de Ciclofilina mRNAs para ciertas proteínas ribosomales. P0. La detección de la fluorescencia de los sistemas 5700 y 7700 permite que el Ct sea observado cuando la amplificación de PCR esta aún en la fase exponencial. el estándar perfecto no existe. consecuentemente. L10E. Si los componentes de la reacción llegan a ser limitantes. el índice de la amplificación del blanco disminuye hasta que se alcanza una meseta y hay poco o nada de aumento neto en producto de PCR. que una medida de la cantidad de producto acumulado en el punto final de la PCR. se debe ser capaz de demostrar que la expresión del estándar no cambia significativamente cuando las células o tejidos son sujetos a las variables experimentales que se planean usar. 60S proteína ribosomal ácida P0. PRLP0. Por ejemplo RPLP0 (proteína ribosomal larga. proteína ribosomal L10.Genes estándares Un control interno consiste en utilizar un gen cuya expresión no cambie. También es conocida como 36B4. rRNAs 28S o 18S (RNAs ribosomales) El efecto de limitar los reactivos Los ciclos iniciales de PCR se caracterizan por un aumento exponencial en la amplificación del blanco. ninguno de los componentes de la reacción está limitado. por tanto lo que se decida usar como estándar o estándares debe ser validado para su muestra. RPPO. Debe expresarse en todas las células Un número de copias intermedio es ventajoso Sin embargo. Durante la fase exponencial. Ésta es la razón principal por la que el Ct es una medida más confiable del número de copias que comienza. Un gen que puede ser usado como “loading control” (o estándar interno) debe tener varias características: • • • El gen estándar debe tener el mismo número de copias en todas las células.

Por ejemplo. Se construye un amplicon competidor que contiene los mismos sitios de unión que el primer y tiene la misma eficiencia de amplificación que el blanco. pueden consumir los reactivos a diversos grados de tubo a tubo. que demuestra la amplificación de 96 muestras idénticas. es posible que una muestra que comienza con un número más alto de copias termine con menos producto acumulado que una muestra que comienza con un número más bajo de copias. como la formación de dímeros de primer. varía ampliamente entre las réplicas (Figura 12a). Las diferencias entre el punto final y la detección en tiempo real se ilustran gráficamente en la figura 12. durante los cuales se determinan los valores de Ct (Figura 12b). Diferencias entre el punto final y la detección en tiempo real PCR competitivos cuantitativos Para compensar los problemas con las medidas en el punto final. Esto es porque las medidas en el punto final se hacen generalmente cuando la reacción esta más allá de la fase exponencial y una diferencia leve en un componente limitante puede tener un efecto drástico en la cantidad final de producto. después el blanco y el competidor son amplificados en la misma reacción. en el ciclo 40. los diagramas de la amplificación son notablemente similares entre los ciclos 22 y 25. pero es de alguna manera distinguible del blanco. Así.Por otra parte. Si la eficiencia de amplificación del blanco y del competidor es idéntica. el cociente del blanco y el competidor seguirá siendo constante a través del proceso de PCR. las reacciones laterales. la cantidad de producto de PCR observada en el final de la reacción es muy sensible a variaciones leves en los componentes de la reacción. Figura 12. Una cantidad conocida de competidor es colocada en la muestra. se han desarrollado una variedad de técnicas de PCR competitivo cuantitativo. determinando el cociente del blanco y 25 . El cambio total en la señal del reportero. Una característica distinguible es hacer al blanco y los amplicones competidores de diferentes tamaños para poder utilizar la electroforesis en gel para discriminar los dos productos. Así. Sin embargo.

La máquina contiene una cámara fotográfica sensible que supervisa la fluorescencia en cada pozo de la placa en intervalos frecuentes durante la reacción de PCR. aunque se ajusta y se controla desde un ordenador que posee el software específico. PCR competitivo requiere la cuantificación exacta de los amplicones del blanco y del competidor. Cada pocillo tiene una forma similar a la de los tubos de 0. 26 . y preestablece un valor de Ct que puede ser modificado con posterioridad. de Applied Biosystems (antes. Esto significa que podemos mirar varias muestras simultáneamente. en cuanto a tiempos y temperaturas. la cantidad de blanco puede ser calculada. se deben probar varias diluciones para alcanzar un cociente conveniente.2 µL. pero su rango dinámica se limita a un cociente del blanco/competidor cercano de 1:10 a 10:1.del competidor en el final de la reacción y conociendo la cantidad inicial de competidor agregada. La tapa se desliza para acomodar las muestras en una placa de formato 96-pozos (96-well). que exige generalmente pasos de proceso laboriosos de post-PCR. Perkin Elmer) se basa en el empleo de placas especiales. Además. En el final de la reacción. con tapas ópticas para su adaptación al lector de fluorescencia. Incluso una diferencia leve en eficiencia compromete seriamente la exactitud de la cuantificación por PCR competitivo. La mayor exactitud es obtenida encontrando el punto de equivalencia en el cual el cociente del blanco y el competidor es 1:1. Para lograr esto. ICycler® de BioRad El sistema ABI PRISM 7700. Otra desventaja es la necesidad de construir y de caracterizar un diferente competidor para que cada blanco sea cuantificado. Se registran las emisiones de fluorescencia de forma continua. El funcionamiento es semejante al de un termociclador convencional. en función del análisis del usuario (Figura 14). se deben realizar estudios cuidadosos de la validación para verificar que las eficiencias de la amplificación del blanco y del competidor son iguales antes de que la cuantificación de muestras experimentales pueda comenzar. El que se muestra en la figura 13 es el ICycler® de BioRad. el software lo convierte posteriormente en una representación gráfica. Máquinas para PCR en tiempo real Hay muchas máquinas para PCR en tiempo real disponibles. PCR competitivo se ha utilizado con éxito para cuantificar DNA y RNA. Figura 13.

LightCycler de Roche Ventajas del tiempo Real La determinación de valores de Ct siguiendo la cinética en tiempo real de PCR elimina la necesidad de un competidor que debe de ser amplificado con el blanco. El sistema LightCycler de Roche (Figura 15).Figura14 . los protocolos de tiempos y temperaturas no son intercambiables con otros sistemas de PCR cuantitativa. ya que los capilares y otros materiales son específicos para este sistema. presenta un alto costo. Además. denominado carrusel. se basa en el empleo de capilares de vidrio para la contención de las muestras. La cuantificación se puede realizar por el método más básico que es preparar una curva estándar y determinar cantidad desconocida por comparación con curva estándar. en menos de 1 hora. el uso de los valores de Ct también amplía la gama dinámica de la cuantificación porque los datos se colectan para cada ciclo de PCR. donde se pueden identificar fácil y rápidamente los estándares y las muestras no conocidas. Sin embargo. 27 . Comparado a las medidas del punto final. y en un mecanismo de giro. lo que requiere de nuevas optimizaciones. La principal ventaja es la rapidez. y bastante caros. que permite obtener resultados.El software 7700 muestra una representación de una placa con 96 pozos. en muchos casos. Todo ello tiene ventajas e inconvenientes. El calentamiento y el enfriamiento se llevan a cabo mediante un sistema de aire. Después de una corrida de PCR el número inicial de copias se muestra para cada muestra en el pozo. similar a una centrífuga. Figura 15.

el final de esta proteína (o algunos aminoácidos) pueden ser secuenciados. Por ejemplo: 5’-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3’ Y = pirimidinas = C / T (degeneración = 2X) R = purines = A / G (degeneración = 2X) I  = inosinas  = C / G / A / T  N = nucléotido = C / G / A / T (degeneración = 4X) Uso de los primers degenerados Los primers degenerados se pueden utilizar: • • Para amplificar secuencias conservadas de un gen o de genes del genoma de un organismo. No requiere de análisis posterior a la PCR (electroforesis. La secuencia del aminoácido se puede 28 . Para conseguir la secuencia de nucleótido después de secuenciar algunos aminoácidos de una proteína de interés Hay evidencia de regiones o motivos altamente conservados de aminoácidos que se pueden diseñar utilizando primers degeneradas. Esto reduce la posibilidad de contaminación y elimina fuentes potenciales de error. Pueden entonces ser utilizadas como sondas para amplificar el gen de interés de una biblioteca geonómica (procariótica) o de una biblioteca de DNA (eucariótica).). Cuando se ha aislado exitosamente una proteína de interés.La PCR en tiempo real permite una amplificación confiable con alta especificidad y sensibilidad. Con esta técnica se tiene alta precisión y exactitud. El diseño de primers y sondas tiene que ser más exigente. Las secuencias amplificadas de esta manera se pueden secuenciar para confirmar que la secuencia esté correcta. El sistema a “tubo cerrado” sirve como control de contaminación. Las primers degeneradas se pueden utilizar para amplificar estas secuencias. Hay una alta correlación entre la señal (Ct) y la cantidad de blanco. También hay la posibilidad de PCR múltiplex. PRIMERS DEGENERADOS Son primers que tienen un número de opciones en varias posiciones en la secuencia para permitir el alineamiento y la amplificación de una variedad de secuencias relacionadas. Se puede realizar un mayor número de reacciones por día. Existe un amplio rango de aplicación. estas regiones pueden ser conservadas entre especies. El producto de PCR se cuantifica en cada ciclo.etc.

utilizar para diseñar primers degenerados. Otra alineación se puede hacer en el nivel del nucleótido si se desea. Otro factor que se toma en consideración es que conforme la degeneración de los primers aumenta. una excepción se observa para las concentraciones de primers. Las substituciones de las bases son solamente las substituciones comunes. Para conseguir la degeneración. Los primers deben tener 20-30 nucléotidos de longitud. aunque se han utilizado otras opciones dependiendo de la secuencia La Reacción de PCR El cóctel de PCR Una mezcla estándar del cóctel de PCR será un buen inicio. Si los primers usados son absolutamente degeneradas. Estas secuencias entonces se alinean. Sin embargo. se pueden utilizar 50 pmoles como punto de partida y optimizar a partir de ahí. Si una base se conserva a través de la alineación se puede suponer que esta base particular será la misma en el caso de interés. simplemente se multiplican todos los valores de la degeneración incorporados en la secuencia del primer. Información de la secuencia terminal de aminoácidos Si estos datos están disponibles pueden ser utilizados como un punto de partida para el diseño de los primers. la concentración de un primer específico disminuirá. El producto de PCR puede ser secuenciado. Un aumento de la concentración puede ser necesario para compensar la degeneración. Degeneración de primers La degeneración de los primers depende de una multiplicidad de factores incluyendo el templado. 29 . pueden ser utilizadas como sondas. Si los primers producen una secuencia truncada (del gen) o parcial. Diseño de los primers degenerados Alineación de la secuencia Las secuencias de aminoácidos de proteínas similares u homólogas se pueden recuperar de una base de datos tal como GenBank. La alineación de la secuencia también dará el tamaño previsto del producto de PCR. Por lo menos 2 bloques de aminoácidos conservados deben estar presentes para permitir el diseño de los primers de PCR. La degeneración se puede bajar con el uso de las inosinas para sustituir 4 bases “wobbles” en vez de usar las 4 substituciones de bases.

Se puede intentar la optimización de la temperatura del alineamiento o el reajuste de los primers Secuenciación Después de que la banda del tamaño previsto se haya extraído del gel de agarosa. 4-5 de los primeros ciclos de PCR se pueden correr con una temperatura de alineamiento 5-10 o C más bajo que la temperatura de alineamiento para amplificar los primers con múltiples “mismatches”. después se procede optimizando la temperatura de alineamiento del primer. esto puede ser corregido fácilmente aumentando la concentración del primer La DNA polimerasa con actividad exonucleasa 3'-5’ no debe ser utilizada ya que degradan los primers (la Taq polimerasa trabajará muy bien) Apareamiento falso o no específico debido a los primers altamente degenerados o al templado que contiene muchos sitios de alineamiento. algo de gDNA relacionado y un gDNA distante para comprobar una posible contaminación. Se comienza con 35 ciclos y se aumenta a 50 en caso de ser necesario. 30 . Problemas Comunes Algunos problemas que se pueden presentar cuando se utilizan primers degenerados son: • • • • Inhibición competitiva debido a la alta degeneración del primer (los primers se alinean al DNA correcto pero no son extendidos por la polimerasa debido a los extremos 3 ' inestables dando como resultado que los primeros ciclos de PCR sean altamente ineficaces. Esto puede ser superado aumentando ciclos de PCR o utilizando 25-30 ciclos estándares seguidos por otra reacción de 30-35 ciclos usando el primer producto como templado Concentración baja del primer específico debido a la alta degeneración. Esto debe ser hecho después de secuenciar y asegurar que se tiene la secuencia deseada haciendo un búsqueda en la base de datos (por ejemplo.Los ciclos de PCR (el termociclador) Se requiere de mucha experimentación y optimización. Se comienza con las condiciones estándar. Aunque los primers degenerados se pueden utilizar directamente para secuenciar.   Controles Si se amplifica un gen usando los primers diseñadas de un alineamiento es conveniente hacer un dot blot que consiste en un control positivo. pueden dar lugar al apareamiento no específico dependiendo del templado. Se debe considerar la viabilidad de la polimerasa para 50 ciclos. La secuenciación de los productos permite el uso de los sitios del primer situados generalmente en los flancos del vector. DNA templado. el producto se puede secuenciar o clonar directamente. BLASTX).

LONG PCR Para llevar a cabo esta técnica de manera eficiente es necesario el uso de dos polimerasas: una polimerasa principal en la reacción que no tenga actividad de proofreading. y una polimerasa que posea una actividad exonuclease 3’-5’. Long PCR Aspectos Generales Al usar la PCR para amplificar fragmentos de más de 10 kbp es esencial la preparación de muestras intactas (libre de mellas) y completamente purificadas con varios pasos de extracción y purificación. Por lo tanto. que esté presente en una concentración más baja. tal como DNA genómico humano. La eficiencia disminuye drásticamente cuando se incorporan las bases incorrectas.0 mM. La concentración óptima de los primers está en un rango de 0. El exceso de Mg2+ tiende a causar productos no específicos que se observan como un barrido de bandas en el gel. de los primers y los agentes quelantes que contenga el templado. el alineamiento no específico pueden superar la amplificación del producto deseado. 31 . Mientras que altas concentraciones se prefieren para templados de poca complejidad tales como DNA de plásmido. Figura 16. En una concentración más baja que la óptima. incluyendo concentraciones de dNTPs.1 a 1. o para cantidades limitadas de DNA templado. mientras que el Mg2+ escaso puede generar menos productos amplificados. La concentración óptima del magnesio se puede afectar por las características y propiedades de la mezcla de reacción. la amplificación de fragmentos largos de DNA puede llevarse a cabo (Figura 16). Bajas concentraciones de primer se recomiendan para DNA altamente complejo. Por otra parte. o para altas concentraciones de DNA templado. Las concentraciones del primer se pueden fijar dependiendo de las características y las cantidades de DNA. en una concentración más alta. el producto de la amplificación puede ser pobre. La actividad exonucleasa 3’-5’ elimina estos errores en las bases y hace que la reacción posterior proceda.

para desnaturalizar. Un tiempo de la desnaturalización demasiado largo o una temperatura de la desnaturalización demasiado alta puede no generar ningún producto identificable. Se recomiendan condiciones de desnaturalización de 20 segundos en 98°C o 30 segundos en 94°C. la utilidad de ISH es limitada por la sensibilidad de cerca de 20 copias del mRNA por la célula. 10 segundos. un obstáculo de la detección que pueda ahora ser superado gracias a las nuevas tecnologías. las estrategias para mejorar los límites de detección en estudios de ISH han incluido protocolos que amplifican la detección de la señal. Se pone la fracción de templado/primer en el tubo y se calienta en la máquina de PCR a 94ºC por 10 segundos. Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 • • • Inicial desnaturalizando a 94ºC durante 10-15 segundos. Cada fracción contiene la misma concentración de buffer. el resto de los componentes se incluyen en la fracción de templado/primer. 68ºC por n minutos +15 segundos/ciclo (15 veces) Los 15 segundos por ciclo para los ciclos 16-30 puede ser necesaria para solamente fragmentos más largos (20 Kb). y una fracción de la polimerasa que constituye el resto. Ciclos 1-15 94ºC 10 segundos. el buffer y agua. En años recientes. Un tiempo de la desnaturalización demasiado corto o una temperatura demasiado baja puede causar una eficiencia pobre en la amplificación. o incrementando la cantidad de sondas de hibridación usando cócteles del oligonucléotido o múltiples sondas de cRNA. Sin embargo. Después se agrega la fracción de la polimerasa durante el primer paso de alineamiento y extensión. Una tercera estrategia que emplea la PCR es la amplificación basada en las 32 . La fracción de la polimerasa contiene solamente la polimerasa.Para establecer la concentración de enzima deben ser consideradas la cantidad o la complejidad del DNA templado y de la longitud del fragmento amplificado. La reacción se divide en dos partes: una fracción de templado/primer que es 3/4 o 4/5 del volumen de la reacción. Hot Start Se puede utilizar el método de hot start para hacer una Long PCR. El número óptimo de ciclos es alrededor 25 a 30 ciclos considerando la cantidad o la complejidad del DNA templado y la longitud de los fragmentos amplificados de la DNA. 68ºC por n minutos (15 veces) Ciclos 16-30 94ºC. Exceso de la enzima puede causar reacciones no específicas. La eficacia de la amplificación puede ser disminuida cuando la concentración de la enzima es baja. La temperatura óptima de alineamiento experimental se determina en un rango de 45-68°C. PCR in situ La hibridación in situ (ISH) ha demostrado ser una herramienta molecular muy importante en diagnóstico y la investigación y ha avanzado perceptiblemente el estudio de la estructura y de la expresión del gen a nivel de células individuales.

Después de la PCR las células son citocentrifugadas sobre las laminillas de cristal con la visualización de los productos intracelulares de PCR por ISH o inmunohistoquímica. La PCR in situ en las laminillas de cristal es realizada sobreponiendo las muestras con la mezcla de PCR debajo de una tira que se sella con cera o aceite mineral para prevenir la evaporación de la mezcla de reacción. las células o las muestras del tejido fino son fijadas y permeabilizadas para preservar la morfología y permitir el acceso de los reactivos de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. La detección de los productos de PCR intracelular se realiza por dos técnicas diferentes: 1) Indirectamente por ISH con sondas específicas para el producto de PCR (PCR in situ indirecto) 2) Sin ISH con la detección directa de los nucleótidos etiquetados (digoxigenina-11dUTP. PCR in situ Las células en la mezcla de reacción de PCR son termocicladas en tubos microEppendorf usando cicladores convencionales de bloque. La amplificación de PCR de las secuencias blanco se realiza después en las células intactas en tubos micro-Eppendorf o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas de cristal (Figura 17). Un ciclo térmico se completa poniendo las laminillas de cristal sobre los bloques de calentamiento de un termociclador convencional o diseñado especialmente o usando hornos que completan un ciclo térmico. Esta estrategia fue desarrollada independientemente por varios laboratorios en 1980 Principios y métodos Los aspectos importantes para la PCR in situ incluyen la fijación y la permeabilización durante la preparación de la muestra. 3H-CTP o biotina-16-dUTP) que se han incorporado en los productos de PCR (PCR in situ directa) 33 . fluoresceina-dUTP. un mecanismo para ciclación y el material celular en la solución o en laminillas de cristal Antes de llevar a cabo la PCR in situ.secuencias de nucleótidos del blanco. Figura 17.

tiempo y gastos.OTRAS VARIANTES DE LA PCR Multiplex PCR Es una PCR en la cual hay múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Requiere una cuidadosa optimización Nested PCR Consiste en dos procesos de amplificación sucesivos. especialmente en el caso de muestras de baja calidad o con un pequeño númerode copias de la secuencia a amplificar. Figura 18. Nested PCR CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR Para conseguir una mayor eficiencia en varios usos del “downstream” (por ejemplo. Se aplica cuando se quiere mejorar la sensibilidad y especificidad de la técnica. el producto de amplificación de la primera PCR es el molde de la segunda. Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco más internamente que los primeros. Se obtiene un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers. Se usa frecuentemente en diagnóstico médico. Es decir. la expresión de genes. Éstos pueden verse como múltiples bandas en un gel de azarosa. de forma que en la segunda PCR se utilizan unos primers contenidos en la secuencia amplificada en la primera reacción (Figura 18). apareciendo un barrido. la transcripción in vitro. A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a partir de un templado complejo. 34 . secuenciación. preparación de sondas marcadas para hibridización) los productos de PCR se clonan a menudo en vectores apropiados (Figura 19). Ahorra templado.

la clonación en vectores con extremos romos (blunt end) puede ser conveniente. Las polimerasas usadas para el método de clonación TA deben exhibir actividad de transferasa terminal y carecer de actividad exonucleasa 3'-5’. como el propósito de la clonación. Clonación TA La Taq polimerasa tiene una actividad transferasa terminal que agrega preferencialmente adenina a los extremos 3' de los productos de PCR. los vectores T se pueden preparar por la adición enzimática de un solo residuo de timidilato con la transferasa terminal y el ddTTP o la Taq polimerasa y el dTTP. se han desarrollado varias técnicas. Sin embargo. el sitio de restricción de Xcm I tiene que ser introducido por inserción de un oligonucleótido sintético en el sitio de clonación. si se utiliza una polimerasa con actividad de “proofreading” para un estudio mutagénesis sitio-dirigido. Clonación de productos de PCR La clonación del DNA amplificado es a menudo un paso difícil en el análisis de los productos de PCR. Para elegir un método. Además de la Taq polimerasa. para la expresión de proteínas. varias DNA polimerasas (por ejemplo. Los vectores T pueden ser hechos usando una enzima de restricción como la XcmI. Para facilitar la clonación de los productos de PCR. Por ejemplo. Alternativamente. Por otra parte. debido a que Xcm I tiene una secuencia de reconocimiento poco común. un método que permita la clonación direccional es útil. Los productos de PCR con esa extensión del adeninas en el extremo 3' se pueden clonar en un vector que contiene timidinas 3' complementarias (clonación TA). la Tth polimerasa) tienen estas características y por lo tanto se pueden utilizar para la clonación TA. el tipo de polimerasa usado.Figura 19. se deben considerar varios factores. y la longitud del producto de PCR. 35 .

el fragmento de DNA amplificado se digiere con la enzima de restricción apropiada y se liga en un vector linearizado. Los extremos 3' de una sola cadena que resultan se pueden entonces alinear a los extremos complementarios del vector y las moléculas quiméricas de DNA que resultan se transforman sin ligación in vitro. estos productos de PCR se pueden también clonar por la ligación de extremos romos en un vector conveniente. Además. Los productos de PCR generados por estas polimerasas se pueden clonar en vectores con extremos romos. una enzima de restricción poco común se agrega a la mezcla de ligación para linearizar cualquier vector ligado a sí mismo formado durante la reacción. Después de que los residuos de dUMP sean quitados por uracil DNA glicosilasa. Existen técnicas que permiten remover una sola extensión de nucleótidos de los productos de PCR generados con la Taq polimerasa. 36 . la enzima de restricción elegida podría potencialmente reconocer y cortar los sitios dentro del producto. Por lo tanto se ha desarrollado una variación más eficiente del método de clonación de extremos romos.Clonación de extremos romos Las DNA polimerasas con actividad exonucleasa 3'-5' remueve los nucleótidos mal apareados de los extremos 3' del DNA de doble cadena y genera productos con extremos romos. los lados apirimídicos que resultan son susceptibles a ser cortados por las condiciones alcalinas. Un método común para una clonación direccional eficiente es introducir sitios de restricción adicionales en el extremo 5' de cada uno de los primers. Varios métodos de clonación requieren la modificación de los primers de PCR para mejorar la eficacia de la clonación y facilitar la clonación direccional de los productos de PCR. Después de la PCR. los extremos 5' de los primers de PCR son parcialmente complementarios a las secuencias del vector y contienen varios residuos de dUMP. Algunas enzimas de restricción no pueden cortar en las secuencias localizadas cerca de los extremos del DNA de doble cadena lineal. La incorporación de estos primers durante la PCR da lugar a la colocación selectiva de los residuos de dUMP en el extremo 5' de los productos de la amplificación. Clonación direccional a través de primers modificados. Mientras que procede la amplificación. Otro método que utiliza los primers modificados es la clonación con ligaduraindependiente En la clonación mediada por la uracil glicosilasa. En este método. estos primers se incorporan en el producto de PCR. Generalmente la clonación de extremos romos de los productos de PCR (o de cualquier DNA) en plásmidos es menos eficiente que la clonación extremos cohesivos. puesto que la secuencia del producto de PCR es a menudo desconocida.

Clonación de fragmentos largos de DNA Usando mezclas de diversas polimerasas se ha podido amplificar blancos largos de DNA. El producto modificado de PCR que resulta se puede clonar fácilmente en un vector linearizado con las bases complementarias. Mutagénesis con PCR-extensión solapada El método de extensión solapada (Figura 20) requiere 2 primers mutagénicos y otros 2. un método basado en cósmidos se ha desarrollado para clonar fragmentos de hasta 36 KB con alta eficiencia. la actividad exonucleasa 3'-5' de la Exonucleasa III se puede utilizar para degradar el producto de PCR de los extremos 3' de ambas cadenas. Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´ que se solapan. MUTAGÉNESIS POR PCR Consiste en introducir cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN.Un ejemplo de clonación direccional que no requiere primers especiales es la clonación direccional basada en la Exonucleasa III. Método de extensión solapada 37 . Ambos portan la mutación. Para la clonación de productos grandes de PCR (mayor de 10 KB) el uso de vectores basados en plásmidos es difícil porque la capacidad de clonación en vectores es limitada. Bajo condiciones controladas de reacción. Se utilizan los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa. Figura 20. Recientemente. La clonación eficiente de fragmentos largos de DNA se puede alcanzar solamente con vectores cosmidos y sistemas de empaquetado.

el aminoácido serina es codificado por seis codones diferentes. donde el conjunto de fragmentos de ADN generado por la PCR es digerido por DNasa I. Para combinar varias mutaciones deseables. La solución a este problema es usar trinucleótidos presintetizados (codones) para todos los 20 aminoácidos como bloques de construcción para la síntesis de ADN de los oligonucleótidos. El gen de interés es amplificado con una ADN polimerasa en condiciones donde la fidelidad transcripcional es baja y se introducen errores en las copias generadas. puede utilizarse la mutagénesis en cassette por PCR. La razón de esto. Este proceso se asemeja al “crossingover” que tiene lugar en los cromosomas de los organismos vivientes. 38 . El fragmento de ADN conteniendo el punto mutado es recortado en dos sitios de restricción flanqueantes. Para introducir mutaciones solamente en una región particular de un gen. En principio. la expresión del gen y la modificación del vector. por lo tanto. por ejemplo. Estos bloques pueden ser mezclados en cualquier proporción y solamente se necesita agregar aquellos trinucleótidos que el investigador desea en esta posición en la secuencia proteica (Figura 21). Varios métodos de los métodos reportados requieren de DNA de una sola cadena como templado. Este iniciador se sintetiza químicamente para llevar una mezcla al azar de nucleótidos en uno o más codones y la proteína codificada lleva. dos mutaciones favorables se acumularán en el mismo gen. Los métodos de PCR sitio-dirigidos permiten así que las mutaciones sitio-específicas sean incorporadas en cualquier plasmido de doble cadena. en lugar de utilizar los mononucleótidos convencionales. cada mutación puede ser recombinada y propagada individual e independientemente de otras mutaciones. Desafortunadamente. una enzima que corta en forma inespecífica. y se reensamblan los trozos por PCR. siendo también difícil evitar la incorporación de un codón de terminación.Mutagénesis sitio dirigida La mutagénesis sitio-dirigida in vitro es una técnica invaluable para estudiar relaciones de la estructura-función de proteínas. se utiliza un segundo método. ha sido históricamente la necesidad de separar los filamentos complementarios para evitar el realineamiento. un producto de PCR. un conjunto de aminoácidos al azar. se genera con un primer degenerado. solamente con baja probabilidad y muchas mutaciones beneficiosas serán enmascaradas por las deletéreas. un codón completamente formado al azar exhibirá una fuerte desviación hacia algunos aminoácidos que son codificados por más de un codón. que puede ligarse exactamente en estos sitios de restricción. mientras que triptofano está codificado por un solo codón). en esta posición particular. Dado que la mayoría de las mutaciones no son beneficiosas. El uso de PCR en mutagénesis sitio-dirigida logra la separación de las hebras usando un paso de desnaturalización que separa las hebras complementarias y permitiendo la polimerización eficiente de las primers de PCR. Luego.

se muestra en el panel (B) y se conoce como “mezclado de ADN”. Este “primer” o iniciador contiene una mezcla de todos los cuatro posibles nucleótidos (abreviados en la letra N) en una posición determinada o. Genere sondas de hibridación específicas para cromosoma. la PCR lo ha hecho posible: • • • • Usar las secuencias repetidas en el genoma como marcadores genéticos. generalmente. por lo tanto. mediante PCR. por lo tanto. El producto de PCR se corta en pequeños trozos. como una estrategia para la distribución no dirigida de mutaciones en un gen de interés. En el panel (A) se muestra en forma esquemática el proceso de PCR “sujeto a error”.   APLICACIONES ESPECIALES DE LA PCR Durante los últimos años. las moléculas contendrán alguna de cualquier tipo. cruzadas y los genes con el mayor número de mutaciones favorables pueden ser enriquecido por selección. Estudiar la evolución de las secuencias de un gen y los efectos de variabilidad de la secuencia en la función del cromosoma. completamente. las favorables (cuadrados) y las desfavorables (círculos). utilizando la enzima ADNasa I y se reensamblan. el efecto benéfico de las mutaciones favorables puede ser opacado. subsecuentemente. se introducen más mutaciones de cada tipo y. Las mutaciones quedan. Se muestran dos tipos de mutaciones.Figura 21. Por ejemplo. por la presencia de las desfavorables. la PCR se ha convertido en una herramienta importante para analizar el genoma humano. un grupo “randomizado” de aminoácidos en esta posición. con el fin de obtener las modificaciones localizadas o en genes enteros. Una posible solución a este problema. Amplificar e identificar las secuencias blanco in situ. Las proteínas sintetizadas a partir de este gen llevarán. Además de generar cantidades grandes de templado para secuenciar. El panel (C) muestra el principio de PCR utilizando un “primer degenerado”. alternativamente. Estrategias para mutagénesis. Así. 39 . En ciclos sucesivos de PCR. la PCR se ha utilizado para el mapeo de cromosomas y para analizar cambios grandes y pequeños en estructura cromosómica. una mezcla de codones ensamblados a partir de trinucleótidos.

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