La Biotecnologa Moderna en la Generacin de Biocombustibles

Combustibles Biolgicos Renovables Bio-Energas de Segunda Generacin

Bio-Energa Sustentable

ESTADO DEL ARTE EN LA PRODUCCIN DE ETANOL A PARTIR LIGNOCELULOSA Alfredo Martnez Jimnez
Dpto. Ingeniera Celular y Biocatlisis Instituto de Biotecnologa UNAM

alfredo@ibt.unam.mx http://pbr322.ibt.unam.mx/~alfredo/
Mxico, D.F. Jun. 4, 2008

El Petrleo en Mxico y los Combustibles Fsiles

Acumulacin de CO2 Cambio Climtico Calentamiento Global del Planeta

El Petrleo

Agotamiento Incrementos en Precios Contaminacin - Derrames Emisiones Dependencia Econmica Energtica Nacional (Automviles, transporte de carga, E. Elctrica domestica e Ind)
+Acumulacin de Productos NO Biodegradables 2020, SENER, SHCP, Presidencia: 2015
Martnez et al. 2006

Tecnologas Maduras Produccin de Etanol Carburante

En Brasil: 30 aos de experiencia Ms de 15 mil millones de L/ao (41 millones litros/da) Azcar de Caa + Levaduras Etanol

En EUA: 20 aos de experiencia 2006: Ms de 41 millones litros/da (ms que Brasil) Almidn de Maz + Amilasas Glucosa Glucosa + Levaduras Etanol

Tecnologas Maduras Produccin de Etanol Carburante

En Colombia: ~2 aos de experiencia 1 milln litros/da Azcar de Caa + Levaduras Etanol

Y Mxico Qu?

Caso Mxico y otos Pases: Etanol Carburante

Costo Gasolina 8 - 9 pesos/L Glucosa Sacarosa 2 Etanol + 2 CO2 4 Etanol + 4 CO2

Rendimiento Terico: 0.51 gETANOL / g(GLC o SAC) 0.64 LEtOH/kg

Sustrato

Costo (pesos/kg)

Costo Prod. Et-OH debido al Sustrato pesos/L

Glucosa Sacarosa

7-11.0 7-11.0

Maz: Importaciones 18 millones ton Excedentes sacarosa: Mercado Alimentos Costos - Tierra Buscar Alternativas Biotecnolgicas

Produccin de lignocelulosa, acondicionamiento e hidrlisis, construccin de microorganismos que conviertan eficientemente azcares en bio-combustibles, eficiencia energtica en la purificacin de combustibles, reduccin de emisiones nocivas, reciclamiento de CO2.

2da Generacin de Biocombustibles

Produccin sustentable
Fijacin de CO2 y Energa Combustin

Ciclo Artificial CO2

Nitrgeno

CO2 2 Bio-Combustible
Hidrlisis

Azcares
Azcares Azcares Almidn Almidn Lignocelulosa Lignocelulosa

Martnez et al. 2006

Bio-Transformacin

Lignocelulosa Bagazo Caa Azcar

Hemicelulosa (xil, ara, man, gluc, gal) 20-40%

Lignina (aromaticos) 10-20%

Pentosas 85% + Hexosas 15% (Xil + Ara) + (Gluc+Man+Gal) + Acetato + Acido Glucurnico Jarabes 100 g/L azcares 85% Xil
Martnez et al. 2000

Celulosa (glucosa) 20-50%

Otros (8%) Pectina (Poligalacturonato) 2-20%

Ingram et al., 1998

Biomasa Lignocelulosa Materia Prima del Futuro

Productos Hidrlisis de Hemicelulosa

O OH OH OH OH
CH2OH O OH OH OH

OH

OH

O OH OH

Xilosa 5-carbones

OH

Glucosa 6-carbones

Arabinosa 5-carbones

Se requieren otros microorganismos para la produccin de etanol carburante?

Las levaduras (Saccharomyces) y las bacterias (Zymomonas mobilis) etanolognicas NO fermentan arabinosa o xilosa, y tampoco hidrolizan celulosa o hemicelulosa

Dien et al, 2003

Dos estrategias: Pentosas Etanol Ingeniera de Vas Metablicas

A: Microorganismo productor de etanol
Extender el intervalo de sustratos metabolizables Zymomonas mobilis
Etanol

s osa Hex

Pentosas
Pen t

B: Microorganismo NO Productor de Etanol

Complementar vas para producir etanol

osa

Escherichia coli
l tano E

Pentosas Hexosas

Etan

ol

Ingeniera de vas metablicas Modificacin y/o introduccin de nuevas reacciones bioqumicas para el mejoramiento directo de propiedades celulares mediante tecnologa de ADNr
Propsitos - Aplicaciones:
Mejorar rendimientos Extender el intervalo de sustratos metabolizables Extender el espectro de productos complementacin de vas Obtener productos nuevos en la clula husped Dirigir o reducir el flujo hacia una ramificacin deseada Mejorar productividad (volumtrica o especfica)

Mediante:
Re-estructurar redes metablicas Alterar la distribucin de flujos Amplificar, inhibir o eliminar, transferir o des-regular genes o enzimas
Stephanopoulos 1998 y 1999; Bailey 1991; Lee y Papoutsakis 1999; Nielsen 2001

Escherichia coli Etanolognica: 1ra Generacin

HEXOSES (Glc, Fru, Gal, Man etc.) + PENTOSES (Xyl, Ara, Rib, Xylu, etc.)

Embden-Meyerhof-Parnas

Entner-Doudoroff

Pentose Pathway

FRD

Succinate
LDH (Km = 7 mM)

PYRUVATE
PFL (Km = 2 mM)

Lactate Acetyl-CoA

Formate

Acetate

Ethanol

CO2

H2

Otha et al., 1991

994rx 177t 873m

EcoCyc, Nucleic Acids Res. 28(1):56 2000

Escherichia coli Etanolognica: 1ra Generacin

HEXOSES (Glc, Fru, Gal, Man etc.) + PENTOSES (Xyl, Ara, Rib, Xylu, etc.)

Embden-Meyerhof-Parnas

Entner-Doudoroff

Pentose Pathway

FRD

KO11
PYRUVATE
PFL (Km = 2 mM)

Succinate

frd-, pfl::pdc adhB cat

L. Ingram University of Florida

LDH (Km = 7 mM)

pfl: strong promoter

Pyruvate Decarboxylase (PDC) (Km = 0.4mM)

Lactate Acetyl-CoA

Formate

CO2
Acetaldehyde Alcohol Dehydrogenase II (ADHII) (Km = 0.012mM )

Acetate Ethanol CO2

H2

Otha et al., 1991; Patente 5,000,000 EUA

Ethanol

Ingeniera Metablica (Una forma de Ingeniera Gentica)

Gene 1

Gene 2

Gene 3

DNA

Enzima 1

Enzima 2

Enzima 3

Eliminar Interrumpir Genes

Gene 1

Gene 2

Gene 3

DNA

Enzima 1

Enzima 2

Enzima 3

D X X

Adicionar Genes

Gene 1

Gene 2

Gene 3

DNA

Enzima 1

Enzima 2

Enzima 3

Adicionar Genes

Gene 1

Gene 2

Gene 3

Gene 4

DNA

Enzima 1

Enzima 2

C
Enzima 4

Enzima 3

Cmo se hacen los cambios?

1. Poner al gene de inters en un acarreador estable (vector), un pedazo de ADN circular llamado plsmido 2.
Gene 4

plsmido

Cmo se hacen los cambios?

1. Poner al gene de inters en un acarreador estable (vector), un pedazo de AND circular llamado plsmido 2.
Gene 4

plsmido

Cmo se hacen los cambios?

1. Poner al gene de inters en un acarreador estable (vector), un pedazo de AND circular llamado plsmido 2.
Gene 4

Gene 4

plsmido

Cmo se hacen los cambios?

1. Poner al gene de inters en un acarreador estable (vector), un pedazo de AND circular llamado plsmido 2.

Gene 4

plsmido

1.

Cmo se hacen los cambios?

2. Poner al plsmido dentro de la clula y favorecer la recombinacin

Gene 1

Gene 2

Gene 3

ADN
Gene 4

1.

Cmo se hacen los cambios?

2. Poner al plsmido dentro de la clula y favorecer la recombinacin

Gene 1

Gene 2

ADN

Gene 3 Gene 4

1.

Cmo se hacen los cambios?

2. Poner al plsmido dentro de la clula y favorecer la recombinacin

Gene 1

Gene 2

Gene 3 4

ADN

Mini-fermentadores (Fleakers) Volumen de trabajo 200 ml Medio mineral (P, NH4, Mg, Ca) Glucosa Xilosa 40 g/l T: 35C, 100 rpm, pH: 7.0 KOH 2N

Evaluacin

Fermentacin de Xilosa 100 g/L

Ec B
100 80 60 2 40 20 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96

Medio Rico, 35oC, 100 rpm, pH 7.0

4 100 80 60

KO11
Cell mass (g/l)

Xylose (g/l) Cell mass (g/l)

Ethanol (g/l) Xylose (g/l) Acids (g/l)

Acids (g/l) Ethanol (g/l)

1 0

40 20 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 1 0

Time (h)

Time (h)

Clulas: : qS: (gXyl/gDCWh) QEtOH (gEt-OH/l h)

Rendimiento Terico = 0.51 gEt-OH/gGlc or Xyl

KO11 > EcB (34%) KO11 > EcB (30%) KO11 > EcB (30%) KO11 = 1.0

Rendimiento 94.0%
Tao et al., 2001, Martnez et al., 1999

Jarabes de Hidrolizados y Reduccin de Nutrientes Medio Mineral - Xilosa

50

Ethanol (g/L)

40 30 20 10 0 0 24 48 72 96

LB 5.0%CSL 3.5%CSL 3.5%CSL+M 2.5% CSL 1.0%CSL+M

Time (h)

Martnez et al., 1999

Ciclo de la Ingeniera de Vas Metablicas Sntesis

Modificaciones Genticas Biologa Molecular Tecnologa recADN - Clonacin - Transformacin

Diseo
Ms Modificaciones

Nielsen 2001 Romero et al., 2007

Anlisis
Caracterizacin Metablica

Interpretacin del anlisis Sugerencias para otras modificaciones

Optimizar procesos industriales de fermentacin y/o mejorar cepas industriales usando herramientas genticas modernas. Acercamiento ms racional para el mejoramiento de cepas, en lugar de mutagnesis y seleccin.

Fermentacin / Fisiologa Anlisis de vas metablicas Tcnicas analticas - Niveles de metabolitos - Anlisis del flux - Anlisis de protenas - Anlisis de expresin

GLC

GalPEc - Alterar la distribucin de flujos. - Dirigir o reducir flujos hacia una ramificacin deseada. - Mejorar el rendimiento? PgkEc PykBs
PYR

PfkEc

Cul vlvula se debe abrir ms? Caso evaluado: Abrir una vlvula a la vez y no cerrar otra(s) (Sobre-expresin individual) Actico, CO2, Frmico y Etanol

Lctico PdcZm ETANOL y CO2

GLC

galP
G6P ATP ADP F6P glk

Estrategia experimental

pfkA
F1,6dP fbaA Ga3P gapA Ga1,3dP

Transformar KO11 con derivados de pTrc99A (inducible por IPTG) Plmidos Referencia

DhaP NAD+ + Pi NADH+ + H+ ADP ATP

tpiA

pgk
Ga3P yib Ga2P eno

- pgalPEc Hernndez-Montalvo et al, 2003 - ppfkEc Emmerling et al, 1999 - ppgkEc Este trabajo - ppykBs Emmerling et al, 1999 - ppdcZm Este trabajo - ppdcZmadhZm Este trabajo
NADH+ + H+ AcAld NAD+

ADP ATP

PeP PyR

pykF

CO2

pdc

adhII

Etanol

Rendimientos en Medio Mineral con Xilosa Plsmido Sin pgalPEc ppfkEc ppgkEc ppykBs ppdcZm ppdcZmadhZm Rendimiento (% respecto al terico) 71 58 71 69 71 85 85.5
Huerta-Beristain et al., 2008

Actividades Enzimticas de Pdc y Adh: KO11 y CCE14

Fase Exponencial
2.5
IU/mg de protena

1.5

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

PDC
1.0 0.5 0.0

ADH

KO11 CCE14

Orencio-Trejo et al. 2008

Fase Estacionaria
2.5
IU/mg de protena

1.5

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

PDC
1.0 0.5 0.0

ADH

KO11 CCE14

Produccin de etanol
Produccin de etanol a la hora 28 con 40 g/l de glucosa en Medio Mineral
20 18 16

Rendimiento de conversin de etanol respecto al terico mximo en condiciones no aireadas

Rendimiento etanol/glucosa (%) 40 g/l

g/l de etanol

14 12 10 8 6 4 2 0

E coli B KO11 CCE14

E coli B KO11 CBE14

20 70 90

Rendimiento terico mximo =0.51 g etOH/g glc

Orencio-Trejo et al. 2008

2da Generacin de E. coli Etanolognicas

HEXOSAS (Glucosa) + PENTOSAS (Xilosa)

Embden-Meyerhof-Parnas

Entner-Doudoroff

Va de las Pentosas

No Crece pdc-adh+ nica forma de Crecer

Lactato

ldh-, frd-,pta-ack-, pfl-

PEP

PIRUVATO

Interrumpir vas de produccin de cidos Orgnicos Incrementar actividad de PDC & ADH
Piruvato Descarboxilasa

Succinato

X X

X
Formato ADH Etanol

Acetaldehdo +CO2
Acetil-CoA Alcohol Deshidrogenasa

Yomano et al., 2007 Martnez et al., 2007 Acetato Utrilla et al., 2008 Fernndez et al., 2008

ETANOL

Produccin de Etanol en Medio Mineral: Xilosa Glucosa

Cell Mass (g DCW /L)
3.2 2.4 1.6 0.8 0.0 50 1.0

Ethanol (moles/L)

Ethanol (g/L)

40 30 20 10 0 0 24 48 72 96

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

Time (h)

Yomano et al., 2007 Martnez et al., 2007

Se requieren otros microorganismos para la produccin de etanol carburante?

Las levaduras (Saccharomyces) y las bacterias (Zymomonas mobilis) etanolognicas NO fermentan arabinosa o xilosa, y tampoco hidrolizan celulosa o hemicelulosa

Dien et al, 2003

B. subtilis - Ethanol
NAD+H+ NAD+

Acetaldehyde
Pyruvate Decarboxylase PdcZm
Fermentative conditions NAD+ NADH+H+ Pyruvate Lactate

Ethanol
Alcohol Dehydrogenase II AdhIIZm
Redox balanced Fermentative conditions

NAD+ NADH+H+

Butanediol

Acetoin
Romero et al, 2007

Oxygen limited conditions

Distribucin de Carbono Bacillus subtilis

Cepa silvestre 14.8% CO2 29.6% Butanodiol alsS udhA+ ldh::pdcZM-adhBZm 33% CO2 0% Butanodiol

Piruvato

Piruvato

55.6% Lactato

0% Etanol

0% Lactato

66% Etanol
Romero et al, 2007

Etanol a partir de Glucosa con B. subtilis

(alsS udhA+ ldh::pdcZM-adhBZm)

1 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Glucose, ethanol (g/L)

Cell mass (g/L)

0.1

0.01

Time (days)
Romero et al, 2007

Evolutionary engineering of xylosefermenting Saccharomyces cerevisiae

Kuyper et al 2005 Pronk and coworkers 2006

Esquema del Proceso

Residuo Agroindustrial Lignocelulosa
Hidrlisis de hemicelulosa Jarabe de Hemicelulosa Detoxificacin Fermentacin (pentosas)
CO2 Etanol diluido (>40 g/L) Slidos Lignina Destilacin Etanol 95% Deshidratacin

Celulasas
Hidrlisis enzimtica y fermentacin
CO2 Combustible para producir energa para la planta (Vapor y Electricidad)

Celulosa y Lignina

Microorganismos modificados para producir etanol

Martnez et al. 2006

Etanol 100%

Agradecimientos
CONACyT Proyectos Z-003 SAGARPA 2004-C01-224 Estado de Morelos 2004-C02-48 PAPIIT DGAPA - UNAM

Estudiantes

Colaboraciones
Instituto de Biotecnologa University of Florida

Potencial de Produccin con caa

Jugos 75 L/Ton x 100 Ton / ha 7,500 L/ha Bagazo (300 kg/Ton, 50% humedad) 55 L/Ton x 100 Ton / ha 5,500 L/ha

Jugos + Bagazo 130 L/Ton x 100 Ton / ha 13,000 L/ha + Rastrojo (Copersur Brasil) 300 kg/Ton, ~20% humedad + 70 L/Ton x 100 Ton / ha => Uso Integral de Caa: ~ 20,000 L de Etanol por Ha

Fuentes de materia prima

Aserrn y Viruta

Pastos de crecimiento rpido Azcar Bagazo de caa Desechos Bosques

Papel Rastrojo de maz

Estimated Production Costs

Fuel Ethanol
NREL-DOE Corn Stover: NREL-California Lumber:

(dol/gal) Pesos/Liter 1.44 4.20 1.07 3.10

Sugar Cane Bagasse Mexico Production Cost $3.7 / Liter From Molasses (2001) Production Cost $2.3 /Liter Cabrera, Gmez & Quintero 2001 Brazil Prices March 2005 ($/L) (R/L) Alcohol: 5.9 1.3 Gasoline: 10.4 2.3

Whats Important for Ethanol Producer

High Ethanol Yield High Ethanol Tolerance High Ethanol Productivity Broad sugars substrate range Compatibility w/ Cellulase
For Trichoderma, pH 4.5 & 60C

Hardiness Phenotypic Stability HMF, Furfural, Acetic Acid, etc Tolerance

Dien et al. 2003

Low pH Tolerance (< 5.0) Preferable

1. 2.

3. 4.

Still not a clear winner Many opportunities remains to optimize ethanologenic biocatalyst Raw materials (lignocellulose) is different for each country or region. So process development is case specific. Thermochemical (pre-treatments and distillation) need to be energy efficient Enzymatic hydrolysis of cellulose needs to be optimized

Wyman. Trends in Biotechnol. 2007.

Poltica agropecuaria: Autosuficiencia en alimentos. No competir con los alimentos para producir energa. Manejo sustentable de la produccin de la biomasa. Importancia de Impactos Sociales, Rurales, Ambientales.