聚 合 酶 連 鎖 反 應 (PCR)

第八組 四生三甲、郭家甫、931242008

一、目的
利用聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)的方法，重複複製特定序列

DNA 片段，以達到足夠的量可提供後續的實驗進行。PCR 是能將微量 DNA 放大的方法，

是生物科技領域的一項大突破。

二、原理
PCR 主要的三個反應步驟：

變性（denature）：藉由高溫 94℃將雙股 DNA 變性成為單股 DNA。

黏合（annealing）：降低溫度至 40~60℃(由 Tm 值而定)，使 primer 黏合到模

板 DNA

上面。

延伸（extension）：提升溫度至 72℃，以利 Taq DNA polymerase 合成新股

DNA，合

成速率 1kb/min。

不斷重複以上三個步驟，以達到 DNA 片段放大的效果。

模版 DNA 可能為：動植物染色體、細菌及真菌染色體、病毒 DNA、質體 DNA。

PCR 的應用及延伸：基因選殖、基因診斷、親緣鑑定(RFLP)、Reverse Transcription

PCR、 Real-Time PCR etc.

三、材料
0.2 ml microfuge tube
10× PCR buffer
dNTP(4mM)
Taq DNA polymerase
Forward primer：(25μM)
Reverse primer：(25μM)
Template DNA：
Positive control(＋)：pBHR-CTC
Negative control(－)：pBluescript
Thermal cycler (TOUCHGENE TECHNE)
Centrifuge、Pipette、Tip

四、方法和步驟
一、PCR 反應
1. 將 Table-1 的試劑依序加入到 1.5ml eppendorf 內，再分裝到兩管 0.2 PCR 塑膠

管(每管 24μl)
2. 兩管 0.2 PCR 塑膠管內分別加入模板 pBHR-CTC(+)和 pBluescript(-)。

3. 於 PCR 機器上，設定反應條件，將兩塑膠管(25μl)放到 PCR thermal cycler 的

well 中反應約 1~2hr。

4. 反應完，即為 PCR 產物。

二、PCR 產物除去鹽類(Desalting)

1. 取 20μl 的 Positive control DNA product 加入 8μl 的 5M NaCl(終濃度 0.2M)。

2. 再加入總體積 2.4 倍 95% EtOH(終濃度約 70%)，靜置 15~20 分鐘後，離心

12,000rpm 10 分鐘。

3. 除去上層酒精，再加入 500μl 70% EtOH。

4. 再次靜置 15~20 分鐘，離心 12,000rpm 10 分鐘。

5. 除去上層酒精，並靜置待酒精完全蒸發。
6. 加入 TE buffer(或 1x TAE)復溶 DNA。

三、PCR 和 Desalting 的產物跑電泳

1. 將反應完的 PCR 產物和 Desalting 的產物，分別注入 Agarose gel 中。

2. 跑電泳約 30 分鐘後，泡 EtBr 中 5 分鐘後，照 UV 燈。

2. 比較 Positive control、Negative control 和 Desalting control 的電泳結果。

3. 並繪製回歸曲線，估算出 PCR 產物片段大小。

五、結果

1. 由 Marker 分子量得回歸曲線公式 y = -0.2153x + 5.3583

2. PCR 產物移動距離代入 x 值，得 y=1.977。

3. 再將 y 值 antilog 後，求得 PCR 產物大小約 95 bp。(101.977=95)

 約 95bp

六、討論

1. 由電泳圖的 Negative control 仍可看到兩個 band，推測為雜 band，若為模板

DNA
的話，應該三管都會有。(每組都有這兩個 band，排除 DNA 受污染的可能)